SU1576565A1

SU1576565A1 - Способ получени эндонуклеазы-рестриктазы, расщепл ющей последовательность нуклеотидов 5 @ =G @ CGC=3 @

Info

Publication number: SU1576565A1
Application number: SU884431491A
Authority: SU
Inventors: Лайма Генриковна Лазарявичюте; Аудроне Миколовна Падегимене; Эляна-Лева Юозовна Кюдулене; Витаутас Стяпонович Лаучис; Юрате Брониславовна Битинайте; Ирина Мироновна Грубер; Вера Михайловна Поляченко; Игорь Дмитриевич Горбачев; Викторас Витаутович Буткус; Эугениюс-Арвидас Андревич Янулайтис
Original assignee: Научно-производственное объединение "Фермент"; Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова
Priority date: 1988-05-24
Filing date: 1988-05-24
Publication date: 1990-07-07

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промышленности. Рестриктаза может быть использована дл исследовани первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Цель изобретени - повышение выхода и улучшение качества целевого продукта. Способ заключаетс в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют штамм ВКПМ В-4275. Культивирование провод т в услови х аэрации при 37°С на питательной среде, содержащей, л:сердечно-мозговой экстракт 37,0

НАД 2,0

гемин 10,0, PH 7,0-7,2 до достижени оптической плотности суспензии клеток 2,2-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и провод т очистку фермента из полученного бесклеточного экстракта путем хроматографии на фосфоцеллюлозе, гепаринсефарозе и голубой сефарозе в калий-фосфатном буфере, PH 7,4-7,5. Элюцию фермента провод т градиентом NACL 0,1-0,8 М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,0 М при хроматографии на гепаринсефарозе и голубой сефарозе. При использовании способа получают высокий выход высокоочищенной рестриктазы HIN61, расщепл ющей последовательность нуклеодитов 5Ъ-G @ CGC-3Ъ.

Description

диентом NaCl при изменении концент рации от 0,1 до 0,8М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и градиентом 0,0-1,ОМ при хроматографии на гепа- ( ринсефарозе и голубой сефарозе.

Используемый штамм Haemophilus in fluenzae JIFL 6 обладает следующими морфологическими, физиологическими и культуральными признаками.

Коккобацилл рные клетки. Грамм- отрицательные, неподвижные, бескап- сульные: требует дл роста X и Y факторов; на плотных средах формируют прозрачные мелкие колонии; гемолиз отсутствует. Штамм образует уреазу, расщепл ет ксилозу, образует индол, не имеет л-галактоэидазы и не утилизирует орнитин.

На агаризованном экстракте мозга и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при 37°С образует мелкие, круглые, с ровными кра ми колонии . Колонии гладкие, блест щие, с агаром не срастаютс В м со-ментонном бульоне культура не размножаетс . Оптимальна температура роста 37 С.

Затем провод т очистку рестрикта- зы Hin-61 путем хроматографии на фосфоцеллюлозе , гепаринсефарозе и голубой сефарозе в 10 мМ калийфосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, с элюцией фермента градиентом NaCl О,1-0,8М при хроматографии на фосфоцеллюлозе и 0,0-1,ОМ NaCl при хромато графии на гепаринсефарозе и голубой сефарозе Апробированы четыре способа получени рестриктазы: фосфоцеллю- лоза, гепаринсефароза} фосфоцеллюло- за, голуба сефароза; фосфоцеллюло- за, гепаринсефароза, ДЭАЭ-целлншоза; фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза, голуба сефароза. Только в последнем случае при использовании голубой се- фарозы на третьей стадии очистки до- стигаетс наиболее эффективна очистка рестриктазы, а полученный ферментный препарат по качеству и стабиль- нс сти удовлетвор ет всем требовани м, предъ вл емым к ферментам как знали- тическим реагентам.

Пример 1. Последовательность операций: культивирование штамма и получение биомассы, выделение и очистка рестриктазы:разрушение клеток, хромотографи на фосфоцеллюлозе, хро- мотографи на гепаринсефарозе и хроматографи на голубой сефарозе.

0

D

Q

г

5

35 40 45 50

55

0

Дл размножени и культивировани штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Brain Heart Infusion Dif- co) с добавлением X и Y факторов. Питательна среда в своем составе содержит 3,7% экстракта мозга и сердца теленка, 0,02% никотинамидадениндину- клеотида (НАД) и 0,1% гемина, рН 7,0. Сердечно-мозговой экстракт стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин, раствор гемина - при 70 С в течение 1 ч, раствор НАД - стерилизуемой фильтрацией .

Штамм Н. influenzae RFL поддерживают в лиофильно высушенном виде при 4вС. Криозащитную среду дл хранени культуры готов т отдельно следующим образом: раствор сахарозы и желатины стерилизуют при 0,9 атм в течение 30 мин два раза через сутки и перед приготовлением бактериальной суспензии в приготовленный стерильный раствор в асептических услови х добавл ют такое же количество бычьей сыворотки.

Дл оживлени культуры в две пробирки с питательной средой (сердечно- мозговой экстракт, НАД и гемин) и две пробирки с м со-пептонным бульоном (дл контрол чистоты культуры) перенос т лиофильно высушенную культуру. Пробирки инкубируют 18 ч при 37°С. Затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и м со- пептонным бульоном и помещают на круговые качалки при 80-100 об/мин. Через 18-20 ч культивировани провод т третий пассаж - дл непосредственного засева ферментера: по 0,25-0,30 мл таким образом полученной суспензии клеток добавл ют в две колбы с 0,25 мл каждой среды. Инокул т выращивают на термостатированных круговых качалках при 200 об/мин, 37°С в течение 18-20 ч. Оптическа плотность суспензии инокул та при длине волны 540 нм составл ет 2,5-3,0 оптических единиц. Так полученный инокул т засевают в лабораторный ферментер Биолафит , содержащий 10 л питательной среды. Культуру Н, influenzae RFL 6 выращивают при 37°С, рН 7,0-7,2 со скоростью перемешивани в первый час культивировани 150 об/мин и далее до 250 об/мин, а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в первый час роста культуры, с постепенным увеличением до 5 л/мин на 6-м часу

роста. Заданный рН во врем выращивани культуры поддерживают добавлением насыщенного раствора бикарбоната натри .

Во врем культивировани периодически отбирают пробы и измер ют оптическую плотность суспензии клеток. Культивирование штамма провод т до поздней логарифмической фазы роста - оптическа плотность суспензии клеток составл ет 2,2-2,5 о.е. (длина волны 540 нм).

Культуральную жидкость охлаждают до 4°С и центрифугируют на проточной центрифуге типа ЦЕПА при 2,5 40 об/мин Полученную биомассу хран т при -20°С. Выход сырой биомассы 2,5-3,0 г/л куль туральной жидкости.

При разрушении и хроматографии используют буферный раствор (Б): 10 мМ калийфосфатный буфер, рН

7.4,содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанола.

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага л мбда с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агароз- ном геле. Реакционна смесь дл гидролиза ДНК фага л мбда рестриктазой Hin61 содержит 10 мМ трис-HCl, рН

8.5,50 мМ NaCl,J мМ MgClt, 100мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага л мбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию провод т при 37°С 10 мин. Электрофорез провод т в 0,1 М натрийборатном буфере, рН 8,2 с 2 мМ ЭДТА в течение 2 ч при напр жении

100 В и силе тока 100 мА. Окрашенные этидийбромидом (.1 мкг/мл) гели просматривают в УсЬ-свете.

За условную единицу активности принимаетс то количество фермента, которое в оптимальных услови х за 1 ч полностью расщепл ет 1 мкг ДНК фага л мбда.

Все операции по выделение и очистке фермента провод т при 4 С.

Разрушение клеток.

20 г биомассы, полученной при культивировании H.influenzae RFL 6, суспендируют в 60 мл буфера Б, содержащего О, 1 М NaCl, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т в течение 10 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж- 21Ц, ротор ЖА-20.

Хромотографи на фосфоцеллюлозе

5

0

Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 30 мл/ч нанос т на колонку 2,5x10 см с фосфоцеллюлозой, уравновешенной буфером Б, содержащим 0,1 KNaCl. Колонку промывают 120 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом NaCl от 0,1 до 0,8 М в 500 мл буфере Б.ракции, элюируемые при 0,52-0,62JI NaCl, содержат основную часть активности. Их объедин ют и диализуют в течение 16 ч против 2,5 л буфера Б.

Хроматографи на гепаринсефароэе.

После диализа раствор фермента центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж-21Ц, ротор ЖА- 20.

Полученный супернатант со скоростью 20 мл/ч нанос т на колонку размером 1,5-10 см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером Б, промывают этим ке буфером (40 мл) и элюируют линейным градиентом концентрации 5 NaCl от 0,0-до 1,0 М в 180 мл буфера Б. Фракции, элюируемые при 0,74-0,86 М NaCl, содержат основную часть рест- риктазной активности. Их объедин ют и диализуют в течение 16ч против 1 л буфера Б.

Хроматографи на голубой сефароэе.

Ферментный раствор после диализа со скоростью 20 мл/ч нанос т на колонку размером 1, см с голубой сефарозой , уравновешенной буфером Б, про- мывают 40 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации NaCl от 0,0 до 1,0 М в 160 мл буфера Б. Фракции, элюируемые при 0,5- 0,6 М NaCl, объедин ют и ферментный препарат концентрируют путем диализа против буфера Б, содержащего 0,1 М NaCl и 50% глицерина (по объему). Ферментный препарат хран т при -20 С. Из биома ссы получают 15000 ед. актив0

0

5

0

5

Claims

ности рестриктазы Hin61. Формула изобретени

Способ получени эндонуклеазы-рест- риктазы, расщепл ющей последовательность нуклеотидов 5 -G CGC-3 предус- Натривающий культивирование продуцента , разрушение клеток, с последующей постадийной хроматографической очисткой , отличающийс тем, что с целью повышени выхода и качества целевого фермента, в качестве микроорганизма - продуцента используют

1576565 78

штамм Haemophilus influenzae ВКПМ В-ществл ют на гепаринсефарозе в том же 4275, первую стадию хроматографичес-буфере с элюцией фермента градиентом кой очистки провод т на фосфоцеллю-NaCl 0,0-1 ,ОМ, а окончательную очист-| лозе 111 в калийфосфатном буфере,ку провод т в том же буфере на голу- рН 7,4-7,5, с элюцией фермента гра-бой сефарозе с элюцией фермента градиентом NaCl 0,1-0,8 м, вторую осу-диентом NaCl , 0,0-1,0 М.