CN115052990A - 由重组微生物生产乙烯的方法和组合物 - Google Patents

由重组微生物生产乙烯的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN115052990A
CN115052990A CN202080095327.5A CN202080095327A CN115052990A CN 115052990 A CN115052990 A CN 115052990A CN 202080095327 A CN202080095327 A CN 202080095327A CN 115052990 A CN115052990 A CN 115052990A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
native
efe
recombinant microorganism
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080095327.5A
Other languages
English (en)
Inventor
塔赫莱·卡里米
长友·阮
米盖尔·欧金尼奥·奎瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kenvita Factory Co
Original Assignee
Kenvita Factory Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kenvita Factory Co filed Critical Kenvita Factory Co
Publication of CN115052990A publication Critical patent/CN115052990A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1294—Phosphotransferases with paired acceptors (2.7.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01041—Isocitrate dehydrogenase (NAD+) (1.1.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03001—Citrate (Si)-synthase (2.3.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/09—Phosphotransferases with paired acceptors (2.7.9)
    • C12Y207/09002—Pyruvate, water dikinase (2.7.9.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01042—Isocitrate dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.42)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

本发明涉及具有改进的乙烯生产能力的重组微生物、其生产方法以及生产乙烯的方法。本文公开的重组微生物和方法的益处可包括来自微生物培养物的乙烯生产增加。另一个益处是可使用二氧化碳来生产生物乙烯，该生物乙烯可用作生产塑料、纺织品和化学材料的原料，以及用于其它应用中。本文公开的方法和系统的另一个益处可包括减少来自环境的过量二氧化碳。

Description

由重组微生物生产乙烯的方法和组合物
交叉引用
本申请要求于2019年12月3日提交的美国临时申请第62/942,895号的权益，通过引用将其并入本文。
技术领域
本发明涉及具有改进的乙烯生产能力的重组微生物、其生产方法以及从此类重组微生物收集乙烯的方法。本文公开的重组微生物和方法的益处可包括微生物培养物的乙烯生产增加。另一个益处是可使用二氧化碳来生产生物乙烯，该生物乙烯可用作生产塑料、纺织品和化学材料的原料，以及用于其它应用中。本文公开的方法和系统的另一个益处可包括减少来自环境的过量二氧化碳。
背景技术
全球对电力的需求增加导致燃烧化石燃料(诸如石油和天然气)产生过量二氧化碳，这在很大程度上导致了许多人所称的全球变暖危机。工业界迫切希望阻止二氧化碳进入大气，以至于他们不得不从废气流和大气中隔离二氧化碳。然后，他们将二氧化碳储存在地下环境中。然而，所有当前已知的方法只是通过将二氧化碳储存在地下来除去大气中的二氧化碳。他们实际上并没有将二氧化碳转化为任何其它有用的材料。
石油的有限供应及其对环境的有害影响促进了燃料和化学品的可再生资源的发展。乙烯是世界上生产最广泛的有机化合物，可用于广泛的行业，包括塑料、溶剂和纺织品。目前通过蒸汽裂解化石燃料或使乙烷脱氢来生产乙烯。然而，随着每年生产数百万吨乙烯，此类工艺会产生太过多的二氧化碳，从而极大地增加全球碳足迹。因此，通过可再生方法生产乙烯将有助于满足能源和化学工业的巨大需求，同时也有助于保护环境。
由于乙烯是一种潜在的可再生原料，因此人们对开发从可再生资源(诸如二氧化碳和生物质)生产乙烯的技术产生了极大的兴趣。目前使用从玉米或甘蔗中提取的乙醇来生产生物乙烯。包括细菌和真菌在内的多种微生物会自然产生少量乙烯。已经在几种微生物物种中证明了生产乙烯的酶的异源表达，其中宿主已经能够利用各种碳源，包括木质纤维素和二氧化碳。
基于现代历史，公平地说，直到减少二氧化碳具有效益，大气中的过量二氧化碳才会被减少。为了以商业规模生产乙烯，仍然需要改进微生物式生物乙烯系统和工艺。仍然需要通过更有效的可再生技术来生产碳氢化合物。仍然需要从大气中除去过量的二氧化碳。仍然需要改进的方法来从可再生原料生产乙烯用于工业和商业应用。
发明内容
本文的实施方案涉及具有改进的乙烯生产能力的重组微生物，其中所述重组微生物通过表达非天然EFE表达核苷酸序列，来表达至少一种乙烯形成酶(EFE)蛋白，该EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1(参见附件)至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量。在一个实施方案中，所述重组微生物还通过表达非天然AKGP表达核苷酸序列，来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶(AKGP)蛋白，该AKGP蛋白具有与SEQ ID NO：2(参见附件)至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的AKGP蛋白的量大于缺乏非天然AKGP表达核苷酸序列的对照微生物生产的AKGP蛋白的量。在一个实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约5％至约200％或更多。
在各种实施方案中，重组微生物包括蓝藻(Cyanobacteria)、聚球藻(Synechococcus)、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)、Synechococcusleopoliensis、集胞藻(Synechocystis)、鱼腥藻(Anabaena)、假单胞菌(Pseudomonas)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、萨瓦氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)、衣藻(Chlamydomonas)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、埃希氏菌(Escherichia)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、土细菌(Geobacteria)、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，或植物细胞。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、高拷贝数细菌载体质粒、具有诱导型启动子的细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPRCAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3(参见附件)至少95％同一性的核苷酸序列，并且非天然EFE表达核苷酸序列插入到衣藻属细菌的载体质粒中。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、高拷贝数细菌载体质粒、具有诱导型启动子的细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4(参见附件)至少95％同一性的核苷酸序列，并且非天然EFE表达核苷酸序列和AKGP表达核苷酸序列插入到埃希氏菌属细菌的载体质粒中。
在一个实施方案中，重组微生物还包括非天然AKGP表达核苷酸序列，其中非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5(参见附件)至少95％同一性的组合氨基酸序列。非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。在另一个实施方案中，重组微生物还包括非天然AKGP表达核苷酸序列，其中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6(参见附件)至少95％同一性的组合氨基酸序列，并且非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然PEP表达核苷酸序列，来表达至少一种磷酸烯醇式丙酮酸合酶(PEP)蛋白，该PEP蛋白具有与SEQ ID NO.15至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的PEP蛋白的量大于缺乏非天然PEP表达核苷酸序列的对照微生物生产的PEP蛋白的量，并且其中由重组微生物生产的AKG的量大于对照微生物生产的AKG的量。在某些此类实施方案中，重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然PEP表达核苷酸序列，来表达至少一种磷酸烯醇式丙酮酸合酶(PEP)蛋白，该PEP蛋白具有与SEQ ID NO.15至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的PEP蛋白的量大于缺乏非天然PEP表达核苷酸序列的对照微生物生产的PEP蛋白的量，并且其中由重组微生物生产的AKG的量大于对照微生物生产的AKG的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列，来表达至少一种柠檬酸合酶蛋白，该柠檬酸合酶蛋白具有与SEQ ID NO.17至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量大于缺乏非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然IDH表达核苷酸序列，来表达至少一种异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白，该IDH蛋白具有与SEQ ID NO.20至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的IDH蛋白的量大于缺乏非天然IDH表达核苷酸序列的对照微生物生产的IDH蛋白的量，并且其中由重组微生物生产的AKG的量大于对照微生物生产的AKG的量。
在某些实施方案中，重组微生物在葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶表达核苷酸序列中含有缺失，其中，由重组微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量小于缺乏所述缺失的对照微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列，来表达至少一种蔗糖通透酶蛋白，该蔗糖通透酶蛋白具有与SEQ ID NO.24至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量大于缺乏非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列，来表达至少一种蔗糖通透酶蛋白，该蔗糖通透酶蛋白具有与SEQ ID NO.24至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量大于缺乏非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列，来表达至少一种蔗糖通透酶蛋白，该蔗糖通透酶蛋白具有与SEQ ID NO.24至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量大于缺乏非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达编码至少一种蛋白的非天然核苷酸序列，来表达选自由以下项组成的组的所述至少一种蛋白：具有与SEQ ID NO.26至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白、具有与SEQ ID NO.28至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖-6-磷酸酶蛋白、具有与SEQ ID NO.30至少95％同一性的氨基酸序列的糖原磷酸化酶蛋白，以及具有与SEQ ID NO.32至少95％同一性的氨基酸序列的UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶，其中，由重组微生物生产的至少一种蛋白的量大于缺乏编码所述至少一种蛋白的非天然核苷酸序列的对照微生物生产的至少一种蛋白的量，其中，由重组微生物生产的蔗糖的量大于对照微生物生产的蔗糖的量。
在某些实施方案中，重组微生物在至少一个核苷酸序列中含有至少一个缺失，其中至少一个核苷酸序列编码选自以下的至少一种蛋白：具有与SEQ ID NO.34至少95％同一性的氨基酸序列的转化酶蛋白、具有与SEQ ID NO.36至少95％同一性的氨基酸序列的葡萄糖基甘油-磷酸合酶蛋白，以及具有与SEQ ID NO.38至少95％同一性的氨基酸序列的糖原合酶蛋白，其中，由重组微生物生产的至少一种蛋白的量低于缺乏至少一个缺失的对照微生物生产的至少一种蛋白的量。
本文的实施方案涉及生产具有改进的乙烯生产能力的重组微生物的方法。在一个实施方案中，该方法包括通过将非天然EFE表达核苷酸序列，或组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到微生物的细菌质粒中，来生产重组微生物，其中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少95％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.7(参见附件)至少95％同一性的核苷酸序列。
在各种具体实施方法中，微生物包括：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcusleopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，或植物细胞。
在本文方法的一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列，并且微生物是衣藻属细菌。在另一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列，并且微生物是埃希氏菌属细菌。在另一个实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少95％同一性的氨基酸序列，并且微生物是聚球藻属细菌。在另一个实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列，并且微生物是聚球藻属细菌。
本文实施生产乙烯的方法。此类方法的一个实施方案包括：提供具有改进的乙烯生产能力的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然EFE表达核苷酸序列，来表达至少一种乙烯形成酶(EFE)蛋白，该EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量；在足以在生物反应器培养容器中生产乙烯的条件下，在生物反应器培养容器中培养重组微生物；以及从生物反应器培养容器收集乙烯。
在本文生产乙烯的方法的实施方案中，重组微生物含有插入到微生物的细菌质粒中的非天然EFE表达核苷酸序列，或组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列，其中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQID NO.6至少95％同一性的氨基酸序列。
在本文生产乙烯的各种实施方案中，重组微生物包括蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，或植物细胞。
生产乙烯的方法的实施方案还包括：通过向位于生物反应器培养容器内的含有重组微生物的培养物中加入至少一种活化剂，来增加乙烯生产量。在一个实施方案中，此类方法包括：以约100ml/分钟至约500ml/分钟的速率向生物反应器培养容器内含有的培养气氛中加入CO2。在一个实施方案中，此类方法还包括：通过从位于生物反应器培养容器内的含有重组微生物的细胞培养物中除去至少一个分子开关，来减少乙烯生产量。在一个实施方案中，此类方法还包括：当培养重组微生物时，通过增加或减少至少一种营养物的浓度或至少一种刺激物的量，来控制由微生物培养物生产的乙烯的量。在一个实施方案中，在微生物培养物中，至少一种营养物的浓度与至少一种刺激物的量的比率为约0.5-1.5g/l至约0.1mM。在一个实施方案中，此类方法还包括：通过将乙烯从气态冷凝成液态来除去由微生物培养物生产的乙烯量，或者其中回收的乙烯量为约0.5ml至约10ml/升/小时。
本文的实施方案涉及一种具有改进的α-酮戊二酸(AKG)生产能力的重组微生物。在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然PEP表达核苷酸序列，来表达至少一种磷酸烯醇式丙酮酸合酶(PEP)蛋白，该PEP蛋白具有与SEQ ID NO.15至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的PEP蛋白的量大于缺乏非天然PEP表达核苷酸序列的对照微生物生产的PEP蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然IDH表达核苷酸序列，来表达至少一种异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白，该IDH蛋白具有与SEQ ID NO.20至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的IDH蛋白的量大于缺乏非天然IDH表达核苷酸序列的对照微生物生产的IDH蛋白的量，其中，由重组微生物生产的AKG的量大于对照微生物生产的AKG的量。
在某些实施方案中，重组微生物通过表达非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列，来表达至少一种柠檬酸合酶蛋白，该柠檬酸合酶蛋白具有与SEQ ID NO.17至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量大于缺乏非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物在葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶表达核苷酸序列中含有缺失，其中，由重组微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量小于缺乏所述缺失的对照微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量。
在某些实施方案中，重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前面的发明内容以及下面的具体实施方式。为了说明的目的，在附图中示出了一些优选的实施方案。应当理解，所描述的实施方案不限于所示的精确细节。除非另有说明，附图不按比例绘制。
图1是描述本文生产乙烯的方法的实施方案的流程图。
图2是根据本文实施方案的用于表达乙烯形成酶(EFE)蛋白的载体质粒的图示。
图3A是显示根据本文实施方案的EFE蛋白表达的SDS-PAGE凝胶的照片。
图3B是显示根据本文实施方案的EFE蛋白表达的Western印迹的照片。
图4A是显示根据本文实施方案的大肠埃希氏菌BL 21PUC19 EFE的生长速率随时间变化的曲线图。
图4B是显示根据本文实施方案的大肠埃希氏菌BL21 PUC19 EFE培养物的乙烯生产量随时间变化的曲线图。
图5A是显示根据本文实施方案的细菌菌落生长的照片。
图5B是显示根据本文实施方案的细菌菌落生长的照片。
图6是Southern印迹照片，显示了根据本文实施方案的AKG和蔗糖生产的克隆实验的结果。
图7A是Southern印迹的照片，显示了根据本文实施方案的蔗糖生产的克隆实验的结果。
图7B是根据本文实施方案的烧瓶细菌培养物的照片。
图8A是Southern印迹的照片，显示了根据本文实施方案的乙烯生产的克隆实验的结果。
图8B是Southern印迹的照片，显示了根据本文实施方案的乙烯生产的克隆实验的结果。
图9A是Southern印迹的照片，显示了根据本文实施方案的AKG生产的克隆实验的结果。
图9B是根据本文实施方案的烧瓶细菌培养物的照片。
具体实施方式
除非另有说明，所有测量值均以标准度量单位计。
除非另有说明，词语“一个(a)”、“一种(an)”、“the(该)”的所有实例可以是指一个或多个它们所修饰的词。
除非另有说明，短语“至少一个(种)”是指一个或多个对象。例如，“至少一种营养物”是指一种营养物、多种营养物，或其任意组合。
除非另有说明，术语“约”是指所述非百分数的±％，舍入到最接近的整数。例如，约100ml/分钟包括90至110ml/分钟。除非另有说明，术语“约”是指百分数的±5％。例如，约95％包括90％至100％。当就范围而言提及术语“约”时，则该术语是指小于下限而大于上限的适当量。例如，约100至约500ml/分钟包括90至550ml/分钟。
除非另有说明，本文所述的可测量特性(高度、宽度、长度、比率等)应理解为平均测量值。
除非另有说明，术语“提供(provide)”、“提供(provided)”或“提供(providing)”是指本文任意实施方案的任意物质组成、方法或系统的任意元素、量、组分、试剂、数量、测量或分析的供应、生产、购买、制造、组装、形成、选择、配置、转换、引入、添加或并入。
本文将序列同一性定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。通常，在所比较的序列的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，视情况而定，由这些序列串之间的匹配来确定。通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代基与第二个多肽的序列进行比较，来确定两个氨基酸序列之间的“相似性”。可以通过本领域技术人员已知的各种方法而容易地计算“同一性”和“相似性”。在一个实施方案中，通过比较本文所鉴定的序列的全长来确定序列同一性。
确定同一性的示例性方法被设计成给出所测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编译在公共可用的计算机程序中。确定两个序列之间同一性和相似性的示例性计算机程序方法包括例如BestFit、BLASTP(蛋白基本局部比对搜索工具)、BLASTN(核苷酸基本局部比对搜索工具)和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))，可从NCBI和其它来源公开获得(BLAST.RTM.Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLMNIH Bethesda,Md.20894)。使用的最典型算法是EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套件)。使用EMBOSS进行氨基酸序列比较的示例性参数是gap open 10.0、gap extend 0.5、Blosum矩阵。使用EMBOSS进行核酸序列比较的示例性参数是gap open10.0、gap extend 0.5、DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。在实施方案中，可以使用在线数据，诸如基因库(Gene bank)、KEG、BLAST和Ensemble，比较不同物种之间的DNA/蛋白序列以确定序列的同源性。
任选地，在确定氨基酸相似度时，本领域技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中所公开的序列中的至少一个残基已被除去且在其位置插入了不同残基的那些。优选地，氨基酸变化是保守的。每种天然氨基酸的优选保守取代如下：Ala对Ser；Arg对Lys；Asn对Gln或His；Asp对Glu；Cys对Ser或Ala；Gln对Asn；Glu对Asp；Gly对Pro；His对Asn或Gln；Ile对Leu或Val；Leu对Ile或Val；Lys对Arg；Gln或Glu；Met对Leu或Ile；Phe对Met、Leu或Tyr；Ser对Thr；Thr对Ser；Trp对Tyr；Tyr对Trp或Phe；以及Val对Ile或Leu。
除非另有说明，术语“适合(adapted)”或“密码子适合”是指本文公开的多核苷酸的“密码子优化”，该多核苷酸的序列可以是天然的或非天然的，或者可以适合于在其它微生物中表达。密码子优化使编码多肽的密码子使用适合于该多肽在其中表达的生物体的密码子偏向。密码子优化通常有助于提高宿主细胞中编码多肽的生产水平。
由于使用化石燃料而产生的二氧化碳排放在全球范围内继续升高。大气二氧化碳水平的降低是缓解或逆转气候变化的关键。碳捕获和储存(CCS)是从大气中除去工业二氧化碳的一种重要技术；据估计，从精炼及其它工业过程中捕获的超过20亿吨的二氧化碳可以被运输并储存在各种类型的地下环境或储罐中。尽管与其它目前可用的方法相比，CCS是一种减少二氧化碳排放的成本有效且经济适用的方法，但是问题仍在于二氧化碳仅仅储存于地下直到其逸出。因此，CCS方法不能提供减少大气中过量二氧化碳的可持续解决方案。此外，对于将二氧化碳泵入地下环境的工业来说，几乎没有经济激励，除非它们被迫受环境法规的约束，或者作为他们商业模式的一部分，他们得到报酬。可以说，由于产生二氧化碳比处理二氧化碳更有利润可图，全球变暖是一个危机。
仍然需要以更有效且可持续的方式从大气中除去过量的二氧化碳。仍然需要能够控制二氧化碳过量以制备有用产品的技术，以及对工业和环境有益的其它应用。
石油供应有限的挑战，以及石油作业对环境的有害影响，促使人们越来越重视使现有资源的输出最大化，以及开发能够使环境影响最小化的燃料和化学品的可再生来源。由于乙烯是潜在的可再生原料，因此人们对开发从可再生来源(诸如二氧化碳和生物质)生产乙烯的技术极为感兴趣。乙烯是世界上最广泛生产的有机化合物，可用于包括塑料、溶剂和纺织品的广泛工业中。目前通过蒸汽裂解化石燃料或乙烷脱氢来生产乙烯。然而，随着每年生产数百万吨乙烯，此类工艺会产生太过多的二氧化碳，从而极大地增加全球碳足迹。因此，通过可再生方法生产乙烯将有助于满足能源和化学工业的巨大需求，同时也有助于保护环境。
已开发出使用来自玉米或甘蔗的乙醇来生产生物乙烯的常规方法。然而，由生物质(例如玉米和甘蔗)来生产生物乙烯是一种耗时且成本高昂的方法，需要土地、运输和消化生物质。例如，玉米和甘蔗的生长和运输非常低效，这本身导致CO2排放。包括细菌和真菌在内的多种微生物天然地少量生产乙烯。此类微生物利用乙烯形成酶(EFE)。一种乙烯途径(诸如在丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和指状青霉菌(Penicillium digitatum)中发现的)在由乙烯形成酶催化的反应中使用α-酮戊二酸(AKG)和精氨酸作为底物。乙烯形成酶提供了一个有希望的靶标，因为单个基因的表达对于乙烯生产是足够的。已经在几种微生物物种中确认了利用EFE异源表达的技术，其中微生物宿主能够在卡尔文(Calvin)循环中利用多种碳源，包括木质纤维素和二氧化碳。此外，成本有效的高通量基因测序技术的最新发展使得对微生物基因表达的理解增强。然而，目前可用的技术不能通过微生物活性来生产工业上相关量的乙烯。仍然需要改进能够以商业规模生产乙烯的微生物型生物乙烯生产。仍然需要使用二氧化碳原料来生产用于工业及其它应用的乙烯的方法。
本发明的实施方案不仅可以提供从环境中除去二氧化碳的益处，还可以提供生产有价值的能够商业销售的有机化合物的益处。因此，本发明的实施方案可以通过使用重组微生物技术将二氧化碳转化为乙烯作为有用的有机化合物，提供常规二氧化碳储存的可再生替代方案。本发明的实施方案的一个益处是该方法可以使石油或天然气公司从环境中除去二氧化碳在经济上受益。石油公司或其协约方可以使用二氧化碳作为重组微生物培养物的碳源，以成本有效的方式将二氧化碳转化为乙烯，而不是将二氧化碳泵入地下环境或将被螯合的二氧化碳留在地下。此外，由于该方法可以在现场实施，或者预计消耗的二氧化碳比它所产生的二氧化碳更多，因此可以避免许多由运输生产的二氧化碳。
保护环境的最有效方法是人们实际使用的那些方法。这些方法的收益越大；人们越有可能使用它们。本文公开的方法的一个益处是使用生物反应器系统的成本效益。本发明的实施方案可以通过调整相关代谢信号途径以工业规模生产乙烯来提供工程化光合乙烯生产微生物的益处。此类实施方案可以使从大气中除去二氧化碳以及被动地生产有价值的有机化合物是有益的，而微生物在以前无法想象的规模上发挥作用。
如果将二氧化碳转化为有价值的有机化合物变得更有益，或者就像最初产生二氧化碳一样有益，那么全球变暖危机将会发生什么？本发明公开的方法可以使能源生产者从全球变暖公司转变为全球变冷公司。
本发明涉及具有改进的乙烯生产能力的重组微生物。本发明涉及生产乙烯的方法，包括提供根据本文各种实施方案的具有改进的乙烯生产能力的重组微生物。作为本文所公开的方法的一般概述，参照图1，该方法包括：提供根据本文所公开的实施方案的表达至少一种EFE蛋白的重组微生物102；在足以在生物反应器培养容器中生产乙烯的条件下，在生物反应器培养容器中培养重组微生物104；通过向生物反应器培养容器内的培养物中加入至少一种活化剂或向生物反应器培养容器内的培养气氛中加入二氧化碳，来增加乙烯生产量106；通过从细胞培养物中除去至少一个分子开关，来减少乙烯生产量108；当培养重组微生物时，通过增加或减少至少一种营养物的浓度或至少一种刺激物的量，来控制由微生物培养物生产的乙烯的量110；以及通过将乙烯从气态冷凝成液态，来除去从微生物培养物中生产的乙烯的量112。作为根据本文实施方案的表达EFE蛋白的载体质粒的图示，参照图2，将非天然EFE表达核苷酸序列插入到衣藻属细菌的载体质粒中。作为本文中具有改进的乙烯生产能力的重组微生物的图示，参见图3A中SDS-PAGE凝胶的图示以及图3B中Western印迹的图示，EFE蛋白是从埃希氏菌属细菌的载体质粒表达的，该载体质粒具有插入载体质粒中的非天然EFE表达核苷酸序列，如箭头所示。
重组微生物的实施方案
本发明涉及具有改进的乙烯生产能力的重组微生物。在此类实施方案中，重组微生物通过表达非天然EFE表达核苷酸序列，来表达至少一种乙烯形成酶(EFE)蛋白，该EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列编码萨瓦氏假单胞菌的EFE。在一个实施方案中，EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少98％同一性的氨基酸序列。在各种实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量。在一些实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约5％至约200％或更多。在一些实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约50％至约150％或更多。在一些实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约75％至约100％或更多。
在一个实施方案中，重组微生物还通过表达非天然AKGP表达核苷酸序列，来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶(AKGP)蛋白。在一个实施方案中，AKGP蛋白具有与SEQ ID NO：2至少95％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，AKGP蛋白具有与SEQ ID NO：2至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，AKGP蛋白具有与SEQ ID NO：2至少98％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SEQ ID NO：2的原始序列来自AKGP，该AKGP来自丁香假单胞菌，但是进行了序列创新以提高该序列在细长聚球藻中的表达。在各种实施方案中，由重组微生物生产的AKGP蛋白的量大于缺乏非天然AKGP表达核苷酸序列的对照微生物生产的AKGP蛋白的量。在一些实施方案中，由重组微生物生产的AKGP蛋白的量比缺乏非天然AKGP表达核苷酸序列的对照微生物生产的AKGP蛋白的量大了约5％至约200％或更多。在一些实施方案中，由重组微生物生产的AKGP蛋白的量比缺乏非天然AKGP表达核苷酸序列的对照微生物生产的AKGP蛋白的量大了约50％至约150％或更多。在一些实施方案中，由重组微生物生产的AKGP蛋白的量比缺乏非天然AKGP表达核苷酸序列的对照微生物生产的AKGP蛋白的量大了约75％至约100％或更多。
在各种实施方案中，重组微生物包括蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcusleopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，或植物细胞。在一些实施方案中，重组微生物可以包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和烟草。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列。非天然EFE表达核苷酸序列插入到衣藻属细菌的载体质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在衣藻属细菌中表达的密码子。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列，并且非天然EFE表达核苷酸序列和AKGP表达核苷酸序列插入到埃希氏菌属细菌的载体质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ IDNO.4至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在埃希氏菌属细菌中或在大肠埃希氏菌中表达的密码子。
在一个实施方案中，重组微生物还包括非天然AKGP表达核苷酸序列。在一些此类实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5至少95％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6至少95％同一性的组合氨基酸序列。在此类实施方案中，组合氨基酸序列可以包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括His-TEV序列；在一个实施方案中，His-TEV序列包括SEQ ID NO.10。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少90％同一性的组合氨基酸序列。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少98％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在蓝藻中表达的密码子。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在聚球藻属细菌的细菌质粒中。
生产重组微生物的方法的实施方案
本文的实施方案涉及生产具有改进的乙烯生产能力的重组微生物的方法。在一个实施方案中，该方法包括通过将非天然EFE表达核苷酸序列插入到微生物的细菌质粒中来生产重组微生物。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列编码萨瓦氏假单胞菌的EFE。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在衣藻属细菌中表达的密码子。在一个实施方案中，衣藻属细菌包括莱茵衣藻。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ IDNO.4至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在埃希氏菌属细菌中表达的密码子。在一个实施方案中，埃希氏菌属细菌包括大肠埃希氏菌。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列包括N-末端NdeI克隆位点(SEQ IDNO.8(参见附件))。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括C-末端的组氨酸标签，随后是终止密码子和HindIII克隆位点(SEQ ID NO.9(参见附件))。
在一个实施方案中，该方法包括通过将组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到微生物的细菌质粒中，来生产重组微生物。在一个此类实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ IDNO.5至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6至少95％同一性的组合氨基酸序列。在此类实施方案中，组合的氨基酸序列可以包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括His-TEV序列；在一个实施方案中，His-TEV序列包括SEQ ID NO.10(参见附件)。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少90％同一性的组合氨基酸序列。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少98％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在蓝藻中表达的密码子。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在聚球藻属细菌中表达的密码子。
在各种具体实施方法中，所述微生物包括蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，或植物细胞。在一些实施方案中，重组微生物可以包括酿酒酵母、恶臭假单胞菌、绿色木霉、里氏木霉和烟草。
在本文方法的实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列。非天然EFE表达核苷酸序列插入到衣藻属细菌的载体质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在衣藻属细菌中表达的密码子。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列。非天然EFE表达核苷酸序列和AKGP表达核苷酸序列插入到埃希氏菌属细菌的载体质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQID NO.4至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在埃希氏菌属细菌中或在大肠埃希氏菌中表达的密码子。
在一个实施方案中，重组微生物还包括表达非天然AKGP的核苷酸序列。在一些此类实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ IDNO.5至少95％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6至少95％同一性的组合氨基酸序列。在此类实施方案中，组合氨基酸序列可以包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括His-TEV序列；在一个实施方案中，His-TEV序列包括SEQ ID NO.10。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少90％同一性的组合氨基酸序列。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.6至少98％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在蓝藻中表达的密码子。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在聚球藻属细菌中表达的密码子。
生产乙烯的方法的实施方案
本文实施生产乙烯的方法。此类方法的一个实施方案包括提供具有改进的乙烯生产能力的重组微生物。在一个实施方案中，重组微生物通过表达非天然EFE表达核苷酸序列，来表达至少一种乙烯形成酶(EFE)蛋白，该EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量；在足以在生物反应器培养容器中生产乙烯的条件下，在生物反应器培养容器中培养重组微生物；以及从生物反应器培养容器收集乙烯。
在生产乙烯的方法的一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列编码萨瓦氏假单胞菌的EFE。在一个实施方案中，EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少80％或至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，EFE蛋白具有与SEQ ID NO：1至少98％同一性的氨基酸序列。在各种实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量。在一些实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约5％至约200％或更多。在一些实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约50％至约150％或更多。在一些实施方案中，由重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约75％至约100％或更多。
在生产乙烯的方法的实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQID NO.3至少80％或至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在衣藻属细菌中表达的密码子。在一个实施方案中，衣藻属细菌包括莱茵衣藻。
在本文方法的一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ IDNO.4至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在埃希氏菌属细菌中表达的密码子。在一个实施方案中，埃希氏菌属细菌包括大肠埃希氏菌。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列包括N-末端NdeI克隆位点(SEQ ID NO.8)。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括C-末端的组氨酸标签，随后是终止密码子和HindIII克隆位点(SEQ ID NO.9)。
在一个实施方案中，生产乙烯的方法包括：通过将组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到微生物的细菌质粒中，来生产重组微生物。在一个此类实施方案中，组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6至少95％同一性的组合氨基酸序列。在此类实施方案中，组合氨基酸序列可以包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括His-TEV序列；在一个实施方案中，His-TEV序列包括SEQ ID NO.10。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少90％同一性的组合氨基酸序列。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少98％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在蓝藻中表达的密码子。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在聚球藻属细菌中表达的密码子。
在各种实施方法中，微生物包括蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcusleopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，或植物细胞。在一些实施方案中，重组微生物可以包括酿酒酵母、恶臭假单胞菌、绿色木霉、里氏木霉和烟草。
在本文方法的实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列。非天然EFE表达核苷酸序列插入到衣藻属细菌的载体质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在衣藻属细菌中表达的密码子。
在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列。非天然EFE表达核苷酸序列和AKGP表达核苷酸序列插入到埃希氏菌属细菌的载体质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQID NO.4至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列是适合于在埃希氏菌属细菌中或在大肠埃希氏菌中表达的密码子。
在一个实施方案中，重组微生物还包括非天然AKGP表达核苷酸序列。在一些此类实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5至少95％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6至少95％同一性的组合氨基酸序列。在此类实施方案中，组合氨基酸序列可以包括一个或多个纯化标签；在一个实施方案中，纯化标签包括组氨酸标签。在一个实施方案中，纯化标签包括His-TEV序列；在一个实施方案中，His-TEV序列包括SEQ ID NO.10。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少90％同一性的组合氨基酸序列。在其它实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6至少98％同一性的组合氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列包括与SEQ ID NO.7至少98％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在蓝藻中表达的密码子。在一个实施方案中，非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列是适合于在聚球藻属细菌中表达的密码子。
本文生产乙烯的实施方案包括：在足以在生物反应器培养容器中生产乙烯的条件下，在生物反应器培养物中培养重组微生物。根据具体实施方法的生物反应器培养物可以包括一种或多种合适的试剂或生长培养基，用于支持重组微生物培养物的生长。这些试剂或培养基可以包括水、一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸或氨基酸衍生物、一种或多种缓冲液、海水、Luria肉汤、Luria Bertani肉汤、BG-11培养基、二氧化碳、光、温度、电，或其组合。
生产乙烯的方法的实施方案包括：通过向位于生物反应器培养容器内的含有重组微生物的培养物中加入至少一种活化剂，来增加乙烯生产量。加入此类活化剂可以包括：增加由重组微生物培养物表达的EFE酶的一种或多种底物的浓度。此类底物可以包括α-酮戊二酸酯或精氨酸，或其组合，以及其它碳源，诸如甘油和葡萄糖。在其它实施方案中，加入至少一种活化剂可以包括加入分子开关。在一些实施方案中，加入至少一种活化剂可以包括在EFE基因上游插入诱导型启动子；一种此类启动子包括IPTG启动子。在此类实施方案中，IPTG可以作为分子开关加入到培养基中。在一些实施方案中，加入至少一种活化剂可以包括：向培养物中加入一种或多种营养物或刺激物。此类营养物或刺激物可以包括一种或多种碳水化合物、一种或多种氨基酸或氨基酸衍生物、一种或多种EFE底物、琥珀酸盐、二氧化碳、光、温度、电、甘油、糖，或其组合。在此类实施方案中，向培养物中加入至少一种活化剂可以提供控制乙烯生产循环和提高乙烯生产速率的益处。在一些实施方案中，可以在生产时从生物反应器培养容器中除去生产的乙烯。在此类实施方案中，乙烯的除去可以包括：将作为气体生产的乙烯冷凝成液体形式，以用于从生物反应器培养容器中将其除去。
在一个实施方案中，生产乙烯的方法包括：以约100ml/分钟至约500ml/分钟的速率向生物反应器培养容器内含有的培养气氛中加入CO2。在一个实施方案中，该方法包括以约150ml/分钟至约450ml/分钟的速率向生物反应器培养容器内含有的培养气氛中加入CO2。在一个实施方案中，该方法包括以约250ml/分钟至约350ml/分钟的速率向生物反应器培养容器内含有的培养气氛中加入CO2。此类实施方案可以提供增强或控制生物反应器培养容器中乙烯生产速率的益处，以及提供将CO2转化为有用产物的益处。
在一个实施方案中，生产乙烯的方法包括：通过从位于生物反应器培养容器内的含有重组微生物的微生物培养物中除去至少一个分子开关，来减少乙烯生产量。在一个实施方案中，此类方法还包括：当培养重组微生物时，通过增加或减少至少一种营养物的浓度或至少一种刺激物的量，来控制由微生物培养物生产的乙烯的量。在一个实施方案中，在微生物培养物中，至少一种营养物的浓度与至少一种刺激物的量的比率为约0.5-1.5g/l至约0.1mM。在一个实施方案中，此类方法还包括：通过将乙烯从气态冷凝成液态来除去由微生物培养物生产的乙烯量，或者其中回收的乙烯量为约0.5ml至约10ml/升/小时。此类实施方案可以通过控制微生物培养物中卡尔文循环的活性速率来提供控制乙烯生产量的益处。例如，可以从表达系统转移到生长系统，其中允许细胞生长5-7天，并监测它们的生长条件。当细胞达到指数生长条件(意味着细胞具有代谢活性)时，有可能从生长系统转移到表达系统，其中细胞转移到乙烯生产周期，以生产用于收集的乙烯。该表达系统可维持7天或更多天。
实施例
实施例1.将乙烯形成酶基因序列克隆到莱茵衣藻载体质粒中
在莱茵衣藻中表达和生产EFE(乙烯形成酶)蛋白。成功制备质粒pChlamy_4-EFE，用于EFE蛋白表达(Creative Enzymes，Shirley，NY)。
将编码萨瓦氏假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas savastanoipv.Phaseolicola)EFE蛋白的多核苷酸(GenBank：KPB44727.1，SEQ ID NO：1)克隆到pChlamy_4载体质粒(ThermoFisher)中。其它试剂和仪器的使用由Creative Biostructure提供。
来自菌株萨瓦氏假单胞菌菜豆致病变种的乙烯形成酶(EFE)基因序列(GenBank：KPB44727.1)用于制备EFE重组蛋白。相应的核苷酸序列是适合于在莱茵衣藻中表达并合成的密码子(SEQ ID NO：3)。将EFE构建体克隆到具有Kpnl和Pstl限制性酶位点的pChlamy_4载体中。
根据pChlamy_4载体特性，设计并产生具有N-标签的EFE。pChlamy_4载体含有ATG起始密码子(载体ATG)，用于在497-499位正确起始翻译，该起始密码子是在除去内含子-1Rbc S2后在Sh ble基因的起始位发现的。位于多克隆位点1(MCS1)旁侧的FMDV 2A肽基因与Sh ble基因在一个框架内。为了使用N-末端6×His-V5-TEV标签，在TEV位点之后在框架内将EFE序列克隆到KphI/PstI消化的pChlamy_4载体中。设计TAA(终止密码子)用于正确的翻译终止。所得序列色谱图如图2所示；参照图2，用标记为“EFE蛋白”的箭头示出EFE蛋白基因编码序列。通过核苷酸测序的质粒验证确认开放阅读框取向。
实施例2：在大肠埃希氏菌中表达EFE的蛋白表达评价
将编码萨瓦氏假单胞菌菜豆致病变种EFE蛋白的多核苷酸(GenBank：KPB44727.1，SEQ ID NO：1)克隆到pET-30a(+)载体质粒中。相应的核苷酸序列是适合于在大肠埃希氏菌中表达的密码子(SEQ ID NO：4)，在C-末端含有任选的His标签，随后是终止密码子和HindII位点(SEQ ID NO：9)。NdeI位点用于克隆5-引物末端，其中NdeI位点含有ATG起始密码子(SEQ ID NO：8)。用重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞。将单个菌落接种到含有卡那霉素的LB培养基中；培养物在37℃以200rpm孵育。一旦细胞密度在600nm达到OD＝0.6-0.8，引入0.5mM IPTG用于诱导。进行EFE(约44.5kDa)_BL21(DE3)的先导表达。SDS-PAGE(图3A)和Western印迹(图3B)用于监测EFE蛋白表达(GenScript USA公司，Piscataway，NJ)。参照图3A和图3B：
SDS PAGE(左)和Western印迹(右)，使用抗His抗体(GenScript，货号A00186))分析构建体pET 30a(+)中的大肠埃希氏菌表达中的EFE先导表达。
泳道M1：蛋白标记物
泳道M2：Western印迹标记物
泳道PC1：BSA(1μg)
泳道PC2：BSA(2μg)
泳道NC：无诱导的细胞裂解物
泳道1：在15℃诱导16小时的细胞裂解物
泳道2：在37℃诱导4小时的细胞裂解物
泳道NC1：无诱导的细胞裂解物上清
泳道3：在15℃诱导16小时的细胞裂解物上清
泳道4：在37℃诱导4小时的细胞裂解物上清
泳道NC2：无诱导的细胞裂解物沉淀
泳道5：在15℃诱导16小时的细胞裂解物沉淀
泳道6：在37℃诱导4小时的细胞裂解物沉淀
SDS-PAGE和Western印迹的结果显示EFE在大肠埃希氏菌中表达。在15℃诱导16小时，发现EFE表达条件最高，导致表达水平为5mg/L，溶解度为30％。
实施例3：适合于在聚球藻属细菌中表达的重组EFE和AKGP表达核苷酸序列
在使核苷酸序列适合于在蓝藻、细长聚球藻和Synechococcus leopoliensis(GenScript，Piscataway，NJ)中表达后，产生用于表达EFE蛋白和表达AKGP蛋白(SEQ IDNO.2)的组合的多核苷酸序列(EFE_-P2A-aKGP，SEQ ID NO：7)。使用密码子适应分析算法，该算法适应对基因表达效率至关重要的各种参数，包括但不限于密码子使用偏差、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二级结构、隐形剪接位点、早熟PolyA位点、内部chi位点和核糖体结合位点、阴性CpG岛、RNA不稳定基序(ARE)、重复序列(直接重复、反向重复和二重(Dyad)重复)以及可能干扰克隆的限制性位点。利用密码子使用频率沿基因序列长度的分布进行密码子使用偏差调整，得到的密码子适应指数(CAI)为0.95。就高基因表达水平而言，1.0的CAI被认为是理想的表达生物体，而大于0.8的CAI被认为是良好的。最佳密码子的频率(FOP)被测量为在计算的密码子质量组中有利密码子的百分比分布，对于在期望的表达生物体中对于给定氨基酸具有最高使用频率的密码子，设定值为100。在91-100的最高密码子质量组中发现80％的密码子结果，在81-90的第二高质量组中发现3％的密码子结果，在71-80的第三高质量组中发现14％的密码子结果。进行GC含量调节，得到平均GC含量为56.46％，GC含量的理想百分比范围为30-70％。一个任选的HindIII克隆位点(SEQ ID NO：12)掺入序列第1位的5-引物末端；一个任选的KpnI克隆位点(SEQ ID NO：13)掺入序列第2524位的3-引物末端。
由SEQ ID NO.7表达的相应的组合EFE和AKGP氨基酸序列具有插入在EFE和AKGP氨基酸序列之间的P2A切割序列(SEQ ID NO：11)。所编码的具有EFE和AKGP序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.5(EFE-P2A_pSyn_6(无His)所示。任选的His-TEV序列可以被包括在N-末端(SEQ ID NO：10)，得到SEQ ID NO.6(EFE-P2A-aKGP_pSyn_6)的氨基酸序列。
实施例4：实验室规模的实验过程。
1.制备定制设计的DNA构建体，其编码合成生物乙烯途径的关键中间体。2.然后将仔细选择的光合微生物扩大用于克隆和基因表达。3.然后进行微生物的遗传和代谢工程以连续生产生物乙烯。4.然后在光生物反应器中选择和扩大生物工程微生物。5.适应生物反应器培养条件(包括CO2浓度、光照时间和波长、温度、pH)。6.收集样品并通过HPLC分析以测量生物乙烯合成。7.适应基因工程微生物中的生物乙烯生产。8.扩大乙烯生产过程。
实施例5：在蓝藻中工程化生产AKG
先前的工作已经表明glgC基因的缺失导致蓝藻中AKG产量的增加。还表明编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶(SEQ ID NO.15)的ppc基因(SEQ ID NO.14，Genbank P74299)和编码柠檬酸合酶(SEQ ID NO.17)的gltA基因(SEQ ID NO.16，Genbank Q59977)可以提高AKG的生产，AKG作为生产其它化合物的底物。基于该研究，选择两类基因，包括与AKG合成和分泌途径直接相关的基因，包括ppc和gltA(过表达)，以及与能量储存途径相关的基因，包括glgC(缺失)，其在糖原合成途径中发挥关键作用。在整合进细长聚球藻和转化菌落生长之前，制备用于克隆入pSyn6质粒的ppc-p2A-gltA(SEQ ID NO.18)的构建体。对pSyn6-PPC-gltA菌落进行PCR，以确认构建体在蓝藻中的表达；观察到4621个碱基对的PPC-gltA的预期条带大小。
在蓝藻中过量表达AKG，通过将IDH基因克隆到pSyn6质粒中，来制备编码异柠檬酸脱氢酶(SEQ ID NO.20)的IDH基因(SEQ ID NO：19)的构建体。通过菌落生长(图5A)以及通过凝胶电泳和DNA分析(图6)来确认IDH基因成功克隆到pSyn6-IDH质粒中。通过细菌培养生长(图9B)以及凝胶电泳和DNA分析(图9A)来确认整合IDH构建体的细长聚球藻菌株S2434-IDH。通过将生长培养基中的碳酸氢盐浓度增加0.5g/L或1.0g/L，表明细胞培养物生长得到显著改善。还制备并确认了一种用于在蓝藻(细长聚球藻)中缺失glgC基因(SEQ ID NO.21，GenBank CP000100.1)的质粒，其编码葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶(SEQ ID NO.22)。
实施例6：在蓝藻中工程化生产蔗糖
为了在蓝藻中生产蔗糖，通过将cscB基因克隆到pSyn6质粒中，制备编码蔗糖通透酶(SEQ ID NO.24)的来自大肠埃希氏菌的cscB基因(SEQ ID NO.23，GenBank P300000)的构建体。通过细菌菌落生长(图5B)以及凝胶电泳和DNA分析(图6)，确认cscB基因成功克隆到pSyn6-cscB构建体中。通过细菌培养生长(图7B)以及凝胶电泳和DNA分析(图7A)，确认整合cscB的细长聚球藻菌株UTEX S2434(S2434-cscB)。
除了cscB基因的过量表达和glgC基因的缺失外，其它基因靶标包括以下基于的过量表达：sps基因(SEQ ID NO.25，GenBank A0A0H3K0V9)，其编码蔗糖磷酸合酶(SEQ IDNO.26)；spp基因(SEQ ID NO.27，Genbank Q7BII3)，其编码蔗糖-6-磷酸酶(SEQ IDNO.28)；glgP基因(SEQ ID NO.29，GenBank Q31RP3)，其编码糖原磷酸化酶(SEQ IDNO.30)；以及galU基因(SEQ ID NO.31，GenBank P0AEP3)，其编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(SEQ ID NO.32)，以将中间体重新回到蔗糖。此外，以下基因的缺失将阻止转化为可供选择的产物：inv基因(SEQ ID NO.33，Genbank P74573)，其编码转化酶(SEQ IDNO.34)；ggpS基因(SEQ ID NO.35，Genbank P74258)，其编码葡糖基甘油-磷酸合酶(SEQ IDNO.36)；此外，编码糖原合酶(SEQ ID NO.38)的glgA基因(SEQ ID NO.37，GenBank P74521)的缺失将消除底物向糖原的转化，这可能增加蔗糖产量。
实施例7：在大肠埃希氏菌中工程化生产乙烯
为了在大肠埃希氏菌中工程化生产乙烯，制备在高拷贝数质粒pUC19中、在IPTG诱导型启动子下编码乙烯形成酶(EFE)的基因构建体pUC-EFE(SEQ ID NO.39)。通过在添加氨苄西林、IPTG和X-gal的琼脂培养基上的菌落生长，以及通过凝胶电泳和DNA分析(图8A和图8B)，观察2322个碱基对的预期条带大小，来确认pUC-EFE质粒在大肠埃希氏菌中的表达。图8A中，箭头示出EFE DNA构建体；图8B中，箭头示出控制质粒拷贝数的DNA元件。DNA测序结果确认了质粒的存在。通过SDS-PAGE和Western印迹分析，确认了EFE的生产。在15℃、16小时诱导条件下，观察到乙烯表达水平为5mg/L和30％溶解度。
为了在大肠埃希氏菌中工程化生产乙烯，构建了用于在大肠埃希氏菌中连续生产EFE的质粒。在所有方法中，EFE表达受叶绿体psbA启动子的控制。在第一个构建体EFE-AKGP-psbA(SEQ ID NO.40)中，EFE和AKGP基因被置于psbA启动子(SEQ ID NO.41)和rrnB终止子(SEQ ID NO.42)的控制之下。在第二个构建体EFE-psbA(SEQ ID NO.43)中，只有EFE基因表达受psbA启动子(SEQ ID NO.41)和T7终止子(SEQ ID NO.44)的控制。在大肠埃希氏菌BL21(DE3)、DH5α或MG1655细胞系中表达蛋白之前，将两种构建体克隆到pUC19质粒主链中，以利用质粒的高拷贝数。构建pUC-psb-EFE质粒(SEQ ID NO.45)。
测量生长培养基以及补充AKG和精氨酸对乙烯生产的影响。结果表明，当在表1所示的条件下发酵时，大肠埃希氏菌BL21 PUC19 EFE的最大乙烯生产量为0.037磅/加仑/月。
表1.大肠埃希氏菌BL 21 PUC19 EFE在30℃生产乙烯的条件
Figure BDA0003775554440000301
Figure BDA0003775554440000311
图4A中示出了所观察到的大肠埃希氏菌BL 21PUC19 EFE的生长速率结果。图4B中示出了在表1所示条件下所观察到的乙烯产率。顶空样品的气相色谱分析确认了大肠埃希氏菌培养物生产乙烯。
附录
Figure BDA0003775554440000321
Figure BDA0003775554440000331
Figure BDA0003775554440000341
Figure BDA0003775554440000351
Figure BDA0003775554440000361
Figure BDA0003775554440000371
Figure BDA0003775554440000381
Figure BDA0003775554440000391
Figure BDA0003775554440000401
Figure BDA0003775554440000411
Figure BDA0003775554440000421
Figure BDA0003775554440000431
Figure BDA0003775554440000441
Figure BDA0003775554440000451
Figure BDA0003775554440000461
Figure BDA0003775554440000471
Figure BDA0003775554440000481
Figure BDA0003775554440000491
Figure BDA0003775554440000501
Figure BDA0003775554440000511
Figure BDA0003775554440000521
Figure BDA0003775554440000531
Figure BDA0003775554440000541
Figure BDA0003775554440000551

Claims (33)

1.一种具有改进的乙烯生产能力的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然EFE表达核苷酸序列，来表达至少一种乙烯形成酶(EFE)蛋白，所述EFE蛋白具有与SEQ IDNO：1至少95％同一性的氨基酸序列，
其中，由所述重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏所述非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然AKGP表达核苷酸序列，来表达至少一种α-酮戊二酸通透酶(AKGP)蛋白，所述AKGP蛋白具有与SEQ IDNO：2至少95％同一性的氨基酸序列，
其中，由所述重组微生物生产的AKGP蛋白的量大于缺乏所述非天然AKGP表达核苷酸序列的对照微生物生产的AKGP蛋白的量。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，由所述重组微生物生产的EFE蛋白的量比缺乏所述非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量大了约5％至约200％或更多。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、高拷贝数细菌载体质粒、具有诱导型启动子的细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。
6.根据权利要求2所述的重组微生物，其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列和所述非天然AKGP表达核苷酸序列插入到细菌载体质粒、高拷贝数细菌载体质粒、具有诱导型启动子的细菌载体质粒、同源重组系统的核苷酸引导序列、CRISPR CAS系统、噬菌体展示系统，或其组合中。
7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQID NO.3至少95％同一性的核苷酸序列，并且所述非天然EFE表达核苷酸序列插入到衣藻属细菌的载体质粒中。
8.根据权利要求2所述的重组微生物，其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列，并且所述非天然EFE表达核苷酸序列和所述AKGP表达核苷酸序列插入到埃希氏菌属细菌的载体质粒中。
9.根据权利要求1所述的重组微生物，还包括非天然AKGP表达核苷酸序列，其中所述非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.5至少95％同一性的组合氨基酸序列，并且所述非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。
10.根据权利要求1所述的重组微生物，还包括非天然AKGP表达核苷酸序列，其中所述非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ ID NO.6至少95％同一性的组合氨基酸序列，并且所述非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到聚球藻属细菌的细菌质粒中。
11.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然PEP表达核苷酸序列，表达至少一种磷酸烯醇式丙酮酸合酶(PEP)蛋白，所述PEP蛋白具有与SEQ IDNO.15至少95％同一性的氨基酸序列，
其中，由所述重组微生物生产的PEP蛋白的量大于缺乏非天然PEP表达核苷酸序列的对照微生物生产的PEP蛋白的量，并且
其中，由所述重组微生物生产的AKG的量大于所述对照微生物生产的AKG的量。
12.根据权利要求11所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列，表达至少一种柠檬酸合酶蛋白，所述柠檬酸合酶蛋白具有与SEQ IDNO.17至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由所述重组微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量大于缺乏所述非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量。
13.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然IDH表达核苷酸序列，表达至少一种异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白，所述IDH蛋白具有与SEQ ID NO.20至少95％同一性的氨基酸序列，
其中，由所述重组微生物生产的IDH蛋白的量大于缺乏所述非天然IDH表达核苷酸序列的对照微生物生产的IDH蛋白的量，并且
其中，由所述重组微生物生产的AKG的量大于所述对照微生物生产AKG的量。
14.根据权利要求13所述的重组微生物，其中，所述重组微生物在葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶表达核苷酸序列中含有缺失，其中，由所述重组微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量小于缺乏所述缺失的对照微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量。
15.根据权利要求11所述的重组微生物，其中，所述重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
16.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列，来表达至少一种蔗糖通透酶蛋白，所述蔗糖通透酶蛋白具有与SEQID NO.24至少95％同一性的氨基酸序列，
其中，由所述重组微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量大于缺乏所述所述非天然蔗糖通透酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的蔗糖通透酶蛋白的量。
17.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达编码至少一种蛋白的非天然核苷酸序列，来表达选自由以下项组成的组的所述至少一种蛋白：具有与SEQID NO.26至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖磷酸合酶蛋白、具有与SEQ ID NO.28至少95％同一性的氨基酸序列的蔗糖-6-磷酸酶蛋白、具有与SEQ ID NO.30至少95％同一性的氨基酸序列的糖原磷酸化酶蛋白，以及具有与SEQ ID NO.32至少95％同一性的氨基酸序列的UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶，
其中，由所述重组微生物生产的所述至少一种蛋白的量大于缺乏编码所述至少一种蛋白的所述非天然核苷酸序列的对照微生物生产的所述至少一种蛋白的量，
其中，由所述重组微生物生产的蔗糖的量大于所述对照微生物生产的蔗糖的量。
18.根据权利要求17所述的重组微生物，其中，所述重组微生物在至少一个核苷酸序列中含有至少一个缺失，其中所述至少一个核苷酸序列编码选自以下的至少一种蛋白：具有与SEQ ID NO.34至少95％同一性的氨基酸序列的转化酶蛋白、具有与SEQ ID NO.36至少95％同一性的氨基酸序列的葡萄糖基甘油-磷酸合酶蛋白，以及具有与SEQ ID NO.38至少95％同一性的氨基酸序列的糖原合酶蛋白，其中，由所述重组微生物生产的所述至少一种蛋白的量低于缺乏所述至少一个缺失的对照微生物生产的所述至少一种蛋白的量。
19.一种生产具有改进的乙烯生产能力的重组微生物的方法，包括：
通过将非天然EFE表达核苷酸序列，或组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列插入到微生物的细菌质粒中，来生产重组微生物，
其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列，或者
其中，所述组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQID NO.5或SEQ ID NO.6至少95％同一性的氨基酸序列；或者
其中，所述组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列具有与SEQID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述微生物选自由以下项组成的组：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ IDNO.3至少95％同一性的核苷酸序列并且所述微生物是衣藻属细菌；或者
其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列并且所述微生物是埃希氏菌属细菌；或者
所述组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.6至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述微生物是聚球藻属细菌；或者
所述组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列具有与SEQ IDNO.7至少95％同一性的核苷酸序列，并且所述微生物是聚球藻属细菌。
22.一种生产乙烯的方法，包括：
提供具有改进的乙烯生产能力的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然EFE表达核苷酸序列，来表达至少一种乙烯形成酶(EFE)蛋白，所述EFE蛋白具有与SEQ IDNO：1至少95％同一性的氨基酸序列，
其中，由所述重组微生物生产的EFE蛋白的量大于缺乏所述非天然EFE表达核苷酸序列的对照微生物生产的EFE蛋白的量；
在足以在生物反应器培养容器中生产乙烯的条件下，在所述生物反应器培养容器中培养所述重组微生物；以及
从所述生物反应器培养容器收集乙烯。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述重组微生物含有插入到所述微生物的细菌质粒中的非天然EFE表达核苷酸序列，或组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列，
其中，所述非天然EFE表达核苷酸序列具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少95％同一性的核苷酸序列，或者
其中，所述组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列具有与SEQID NO.7至少95％同一性的核苷酸序列；或者
其中，所述组合的非天然EFE表达核苷酸序列和非天然AKGP表达核苷酸序列表达与SEQID NO.5或SEQ ID NO.6至少95％同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述微生物选自由以下项组成的组：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcusleopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
25.根据权利要求22所述的方法，还包括：通过向位于所述生物反应器培养容器内的含有所述重组微生物的培养物中加入至少一种活化剂，或者以约100ml/分钟至约500ml/分钟的速率向所述生物反应器培养容器内含有的培养气氛中加入CO2，来增加乙烯生产量。
26.根据权利要求22所述的方法，还包括：通过从位于所述生物反应器培养容器内的含有所述重组微生物的细胞培养物中除去至少一个分子开关，来减少乙烯生产量。
27.根据权利要求22所述的方法，还包括：当培养所述重组微生物时，通过增加或减少至少一种营养物的浓度或至少一种刺激物的量，来控制由所述微生物培养物生产的乙烯的量。
28.根据权利要求22所述的方法，其中，在所述微生物培养物中，至少一种营养物的浓度与至少一种刺激物的量的比率为约0.5-1.5克/升至约0.1mM。
29.根据权利要求22所述的方法，其中，还包括：通过将乙烯从气态冷凝成液态来除去由所述微生物培养物生产的乙烯的量，或者其中回收的乙烯的量为约0.5ml至约10ml/升/小时。
30.一种具有改进的α-酮戊二酸(AKG)生产能力的重组微生物，
其中，所述重组微生物通过表达非天然PEP表达核苷酸序列，来表达至少一种磷酸烯醇式丙酮酸合酶(PEP)蛋白，所述PEP蛋白具有与SEQ ID NO.15至少95％同一性的氨基酸序列，并且
其中，由所述重组微生物生产的PEP蛋白的量大于缺乏所述非天然PEP表达核苷酸序列的对照微生物生产的PEP蛋白的量；或者
其中，所述重组微生物通过表达非天然IDH表达核苷酸序列，来表达至少一种异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白，所述IDH蛋白具有与SEQ ID NO.20至少95％同一性的氨基酸序列，并且
其中，由所述重组微生物生产的IDH蛋白的量大于缺乏所述非天然IDH表达核苷酸序列的对照微生物生产的IDH蛋白的量；
其中，由所述重组微生物生产的AKG的量大于所述对照微生物生产的AKG的量。
31.根据权利要求30所述的重组微生物，其中，所述重组微生物通过表达非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列，来表达至少一种柠檬酸合酶蛋白，所述柠檬酸合酶蛋白具有与SEQID NO.17至少95％同一性的氨基酸序列，其中，由所述重组微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量大于缺乏所述非天然柠檬酸合酶表达核苷酸序列的对照微生物生产的柠檬酸合酶蛋白的量。
32.根据权利要求30所述的重组微生物，其中，所述重组微生物在葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶表达核苷酸序列中含有缺失，其中，由所述重组微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量小于缺乏所述缺失的对照微生物生产的葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶蛋白的量。
33.根据权利要求30所述的重组微生物，其中，所述重组微生物包括选自由以下项组成的组的微生物：蓝藻、聚球藻、细长聚球藻、Synechococcus leopoliensis、集胞藻、鱼腥藻、假单胞菌、丁香假单胞菌、萨瓦氏假单胞菌、衣藻、莱茵衣藻、埃希氏菌、大肠埃希氏菌、土细菌、藻类、微藻、电合成细菌、光合微生物、酵母、丝状真菌，以及植物细胞。
CN202080095327.5A 2019-12-03 2020-12-02 由重组微生物生产乙烯的方法和组合物 Pending CN115052990A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962942895P 2019-12-03 2019-12-03
US62/942,895 2019-12-03
PCT/US2020/062938 WO2021113396A1 (en) 2019-12-03 2020-12-02 Methods and compositions for producing ethylene from recombinant microorganisms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115052990A true CN115052990A (zh) 2022-09-13

Family

ID=76221147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080095327.5A Pending CN115052990A (zh) 2019-12-03 2020-12-02 由重组微生物生产乙烯的方法和组合物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220411829A1 (zh)
EP (1) EP4069857A4 (zh)
JP (1) JP2023505443A (zh)
KR (1) KR20220110249A (zh)
CN (1) CN115052990A (zh)
AU (1) AU2020395163A1 (zh)
BR (1) BR112022010689A2 (zh)
CA (1) CA3160540A1 (zh)
CO (1) CO2022008803A2 (zh)
MX (1) MX2022006610A (zh)
WO (1) WO2021113396A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230407271A1 (en) * 2022-06-21 2023-12-21 Lanzatech, Inc. Microorganisms and methods for the continuous production of ethylene from c1-substrates

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2769321A (en) * 1952-08-07 1956-11-06 Kellogg M W Co Separation of ethylene from a gaseous mixture
JPH0698776A (ja) * 1992-09-18 1994-04-12 Hideo Fukuda 細菌のエチレン生成酵素をコードするｄｎａ断片、及びその用途
MX2010006679A (es) * 2007-12-17 2010-11-30 Univ Amsterdam Reduccion de co2 inducida con luz para compuestos orgánicos que sirven como combustibles o como semiproductos industriales por un autotrofo que contiene un casete genico fermentador.
WO2012175750A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 Algenol Biofuels Inc. Genetically enhanced cyanobacteria lacking functional genes conferring biocide resistance for the production of chemical compounds
US20130203136A1 (en) * 2011-07-27 2013-08-08 Alliance For Sustainable Energy, Llc Biological production of organic compounds
KR20150131880A (ko) * 2014-05-16 2015-11-25 삼성전자주식회사 숙신산 생산성이 향상된 미생물 및 이를 이용한 숙신산 생산방법
WO2018009770A1 (en) * 2016-07-07 2018-01-11 Cemvita Technologies Llc. Cognitive cell with coded chemicals for generating outputs from environmental inputs and method of using same

Also Published As

Publication number Publication date
CO2022008803A2 (es) 2022-06-30
JP2023505443A (ja) 2023-02-09
EP4069857A1 (en) 2022-10-12
US20220411829A1 (en) 2022-12-29
WO2021113396A1 (en) 2021-06-10
AU2020395163A1 (en) 2022-06-16
MX2022006610A (es) 2022-10-07
BR112022010689A2 (pt) 2022-08-23
KR20220110249A (ko) 2022-08-05
CA3160540A1 (en) 2021-06-10
EP4069857A4 (en) 2024-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8133708B2 (en) Short chain volatile hydrocarbon production using genetically engineered microalgae, cyanobacteria or bacteria
JP6603658B2 (ja) 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法
US20230183627A1 (en) Biomanufacturing systems and methods for producing organic products from recombinant microorganisms
WO2014052630A1 (en) Bacterial mutants with improved transformation efficiency
CN111154776B (zh) 一种耐盐基因及其在培育耐盐微生物中的应用
EP2524035A2 (en) Constructs, vectors and cyanobacteria for the synthesis of fatty alcohols, and methods for producing fatty alcohols in cyanobacteria
US20220411829A1 (en) Methods and compositions for producing ethylene from recombinant microorganisms
CN104651388B (zh) 一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用
WO2015147644A1 (en) Erythritol production in cyanobacteria
US11408015B2 (en) Expression vector, recombinant microorganism and method for producing 1,5-diaminopentane
WO2014205096A1 (en) Bacterial mutants with improved transformation efficiency
CN101479378A (zh) 使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类
US20120029248A1 (en) Constructs, vectors and cyanobacteria for the synthesis of fatty alcohols, and methods for producing fatty alcohols in cyanobacteria
KR20220136947A (ko) 고농도 co2 및/또는 산성에 대한 내성이 증진된 재조합 미세조류
CN101899456B (zh) 强旱生植物霸王液泡膜氢焦磷酸酶基因和植物表达载体及其植株遗传转化方法
WO2022261288A2 (en) Methods and compositions
CN101528928A (zh) 编码降解长链正烷烃的酶的核酸分子
CN114466921A (zh) 膜转运蛋白及其用途
Markley c12) United States Patent
CN115916980A (zh) 生产天冬氨酸和甲硫氨酸的嗜氢菌属细菌的转化体
Lian Transcriptomic and Physiological Analysis of a Recombinant Pyrococcus furiosus Strain Metabolically Engineered to Produce 3-Hydroxypropionate from CO2 and Maltose.
CN102127159A (zh) 植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination