CN101479378A - 使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌中生产异戊二烯烃类的方法和组合物。

Description

使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类

相关申请的交叉引用

本申请要求于2006年6月29日提交的专利申请号为60/806,244的美国临时申请的优先权，该申请以引用形式并入本文。

背景技术

已知有多种草本植物、落叶植物以及针叶植物具有合成短链类异戊二烯(例如，异戊二烯(C₅H₈)和甲基丁烯醇(C₅H₁₀O₁))并将其释放到周围环境中的遗传能力及酶促能力。这些短链类异戊二烯来自光合作用中早期的卡尔文循环产物，并可以通过所谓的DXP-MEP途径在某种环境压力条件下以可观速率在草本植物、落叶植物和针叶植物的叶绿体中合成。生物体的热应激对在植物中诱导该过程特别重要，并且所得的烃类对大气的污染已成为本领域现有技术所关注的焦点。

异戊二烯从草本植物、落叶植物和针叶植物中的释放是由于存在异戊二烯合酶(IspS)基因，其是编码一种位于叶绿体中的蛋白质的核基因，该蛋白质催化从二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)到异戊二烯的转化。如上文所提到的，在叶绿体中从卡尔文循环的早期产物合成类异戊二烯(碳固定和还原，参见图1)。五碳的类异戊二烯，例如，异戊二烯(C₅H₈)和甲基丁烯醇(C₅H₁₀O₁)为相对小的疏水分子，其直接由二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)合成(图2)。这些类异戊二烯为挥发性分子，很容易穿过细胞膜并因此从叶释放到大气中。热应激-诱导以及植物释放短链烃的过程已经作为有害的大气污染在文献中讨论过。尚未有从草本植物、落叶植物和针叶植物的叶中大规模生产、收集和分离这些烃类的描述。

急切需要开发可有助于满足全球的能源需求同时不造成气候变化的可再生生物燃料。本发明通过提供生产完全来自于阳光、二氧化碳(CO₂)和水的挥发性短链烃的方法和组合物来应对该需求。这些烃可用作生物燃料或合成化学工业中的原料。

发明概要

本发明部分地基于以下发现，即经过适当的改造可以利用微观藻类(microalgae)、蓝细菌和原核生物光合作用生产五碳类异戊二烯(例如，图3)。在植物和藻类中，DXP-MEP类异戊二烯生物合成途径是绝对需要的，因为它导致许多必需长链细胞化合物的合成。单细胞绿藻在它们的叶绿体中特异性的表达该途径，并利用相应的酶对多种分子(类胡萝卜素、生育酚、植醇、甾醇、激素、以及其它许多分子)进行生物合成。本发明涉及在生产和收集五碳挥发性类异戊二烯化合物(例如异戊二烯和甲基丁烯醇)中使用经遗传改造的微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌的方法和组合物。这些经遗传改造的生物可商业性地用于封闭的大规模培养系统，例如，为内燃机或者在装载改造(on-board reformation)后为燃料电池引擎提供可再生燃料的来源；或者为用于其它化学过程(如化学合成)中的异戊二烯提供来源。

微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌不具有异戊二烯合酶或甲基丁烯醇合酶的基因，所述两种酶分别催化异戊二烯(C₅H₈)和甲基丁烯醇(C₅H₁₀O₁)生物合成的最后一步关键步骤。因此，本发明提供了遗传改造微生物以表达异戊二烯合酶基因(例如调整过密码子的杨树异戊二烯合酶基因)使所述生物可以生产异戊二烯(C₅H₈)的方法和组合物。

另一些方面，本发明还提供了用于遗传改造微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌使其过表达类异戊二烯生物合成的第一关键步骤之内源基因及其所编码蛋白质的方法和组合物。因此，本发明还包括在所述微生物中提高天然Dxs和Dxr基因的表达，所述微生物例如绿藻如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；蓝细菌如集胞藻(Synechocystis sp.)；或者光合细菌如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)，或非光合细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)。Dxs和Dxr编码类异戊二烯生物合成中催化第一关键步骤的酶。

在一些实施方案中，采用了微观藻类。微观藻类是光合作用的工厂，其中约70％的细胞容量被叶绿体占据；绿藻叶绿体包含超过300万的电子传递链，每条链每秒钟能够向卡尔文循环传递100个电子用于将CO₂转化为GA-3-P；微观藻类没有根、茎、叶和花会耗费光合作用合成的资源，因此，大部分的光合作用产物可被引导至产生挥发性类异戊二烯；微观藻类的生长和繁殖比任何其它陆生或水生植物都要快，生物量每天翻一番；微观藻类无毒、无污染，因此对于大规模培养和商业开发是环境友好的。因此，在一些实施方案中，本发明提供了改造微观藻类光合作用的高效过程的方法，以使得从阳光、CO₂和H₂O高容量地生产短链异戊二烯烃类(例如，C₅H₈)。这些经改造的微观藻类可以例如，在大容量(例如，1000到1000000升)的完全封闭光反应器中生产和收集挥发性短链异戊二烯烃类。

本发明可以帮助消除多种当前可再生能源商业化生产、储存和利用中的障碍，包括但不限于：(a)降低燃料生产和存储的成本，(b)提高燃料的重量/体积比，(c)改善燃料生产/存储的效率，(d)提高燃料储存的耐久时间，(e)使燃料自动补给时间最小化，(f)在车辆可接受的范围内提供充足的燃料储存，(g)生产适于再生过程的燃料，(h)在生产或存储阶段，燃料不受氧气的干扰。

一方面，本发明提供了在选自微观藻类、蓝细菌或光合细菌的微生物中生产异戊二烯烃类的方法，所述方法包括：将包含编码异戊二烯合酶的核酸序列的表达盒引入所述微生物中；在编码异戊二烯合酶的核酸得到表达的条件下培养所述微生物。在一些实施方案中，所述微生物是微观藻类如绿藻，如：菜茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。在另一些实施方案中，所述微生物为蓝细菌，如集胞藻。在另外一些实施方案中，所述微生物为光合细菌，如深红红螺菌。可替代地，在一些实施方案中，所述微生物可以是非光合细菌，如大肠杆菌。

在一些实施方案中，引入到微生物中的核酸包含编码异戊二烯合酶多肽的序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示序列，或具有SEQ ID NO：2所示序列但缺少转运肽区域。异戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ IDNO：2的53-595号氨基酸残基，或SEQ ID NO：2的38-595号氨基酸残基。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：1所示序列。在另一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：3中所示异戊二烯合酶的核苷酸编码序列；或所述核酸包含SEQ ID NO：5中所示异戊二烯编码序列。

另一方面，本发明提供了选自微观藻类细胞、蓝细菌细胞以及光合细菌细胞或非光合细菌细胞的微生物，其中所述微生物包含与启动子有效连接的编码异戊二烯合酶的异源核酸。所述启动子可以是组成型启动子或是可诱导启动子，在一些实施方案中，所述微生物为绿藻，如莱茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。在其它一些实施方案中，微生物为蓝细菌、如集胞藻。在其它一些实施方案中，微生物是光合细菌，如深红红螺菌。在一些实施方案中，所述异源核酸包含编码异戊二烯合酶基因的序列，所述异戊二烯合酶具有SEQ ID NO：2中所示序列，或具有SEQ ID NO：2中所示序列但缺少转运肽。该异戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ IDNO：2的53-595号氨基酸残基，或SEQ ID NO：2的38-595号残基。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：1中所示序列。在其它一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：3中所示异戊二烯合酶的核苷酸编码序列；或所述核酸包含SEQ ID NO：5所示的异戊二烯编码序列。

另一方面，本发明提供了一种在包含编码异戊二烯合酶的异源基因的微生物中生产异戊二烯烃类的方法，所述微生物选自微观藻类、蓝细菌、光合细菌和非光合细菌，所述方法包括：在表达所述异戊二烯合酶基因的条件下，在封闭生物反应器中大规模培养所述微生物；收集所述微生物所生产的异戊二烯烃类。在一些实施方案中，所述微生物是微观藻类，所述微观藻类是绿藻如莱茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。可替代地，所述微生物可以是蓝细菌，如集胞藻。在另一些实施方案中，所述微生物为光合细菌，如深红红螺菌。在另一些实施方案中，所述微生物为非光合细菌，如大肠杆菌。

在本发明大规模培养方法的一些实施方案中，所述编码异戊二烯合酶的异源基因包括编码具有SEQ ID NO：2中所示序列或具有SEQ ID NO：2中所示序列但是缺少转运肽的异戊二烯合酶基因的序列。所述异戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ ID NO：2的53-595氨基酸残基，或SEQ ID NO：2的38-595号氨基酸残基。所述核酸可以包含例如SEQ ID NO：1中所示的序列。在另一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：3中所示的异戊二烯合酶的核苷酸编码序列；或SEQ ID NO：5中所示的异戊二烯编码序列。

在本发明的方法和组合物的一些实施方案中，IspS核酸编码包含SEQID NO：8的氨基酸序列或包含SEQ ID NO：8的46-608号氨基酸的蛋白质。

附图说明

图1.光合作用的卡尔文循环中二氧化碳固定和还原的途径以及有机碳通过脱氧木酮糖/甲基赤藓糖醇(DXP/MEP)生物合成途径从普遍存在的3-磷酸甘油醛(GA-3-P)到类异戊二烯的传递途径的示意图。

图2.(左图)分别在草本/落叶树木以及美国松树的叶绿体中生物合成异戊二烯和甲基丁烯醇的单步酶催化反应。(右图)异戊二烯(C₅H₈)和甲基丁烯醇(C₅H₁₀O)的化学式。

图3.由大量叶绿体代谢物3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸形成挥发性类异戊二烯的DXP/MEP生物合成途径。从GA-3-P和丙酮酸合成异戊二烯需要七步不同的酶催化反应。单细胞绿藻、蓝细菌、光合细菌和某些非光合细菌具有这些基因中的前六个，但是缺少异戊二烯合酶或甲基丁烯酸合酶基因。

图4.用新型Cr-IspS基因进行绿藻(例如莱茵衣藻)叶绿体DNA的共转化和同源重组。该构建物包括atpA启动子(PatpA)，该启动子融合到密码子优化的三拷贝血凝素(HA)表位标签DNA的5′UTR末端。该DNA序列之后为Cr-IspS编码区，之后为atpA 3′UTR。

图5.通过基因组DNA PCR筛选莱茵衣藻IspS(Cr-IspS)转化子。引物N和C代表用于扩增的引物对，其退火位置如图4所示。

图6.A.用基因组DNA的Southern印迹分析检测Cr-IspS转基因的完整性。用Cr-IspS DNA探针检测滤膜。与Cr-IspS编码区中放射性标记的Ndel/Xbal片段杂交仅仅在Cr-IspS转化体#9系中鉴定出3.0kbp条带，而在#7对照系泳道中观察不到可检测条带。B.溴化乙锭染色以测试A中加载等量DNA。

图7.A.密码子优化的带3×HA标签的Cr-IspS基因的示意图。B.Cr-IspS基因表达的验证。用特异性多克隆抗HA抗体对相当于10或20μg叶绿体的可溶性蛋白质级分进行SDS-PAGE和Western印迹分析。

图8.pIspS质粒的组件和结构。其密码子用法被设计成用于在蓝细菌(例如集胞藻)中表达的新型异戊二烯合酶基因(Ss-IspS)，其包含氨苄青霉素抗性基因。基于杨树异戊二烯合酶蛋白质的氨基酸序列模板设计出此新型Ss-IspSDNA序列，其设计原则符合集胞藻的密码子偏好性。引入限制性位点以方便克隆。合成该新型Ss-IspS DNA序列并克隆到质粒pIspS中用于在大肠杆菌中增殖。

图9.用于转化蓝细菌(如集胞藻)的pAIGA质粒的构建。采用来自集胞藻的psbA3基因的侧翼序列进行质粒的同源重组，随后用强启动子驱动Ss-IspS基因的表达。将庆大霉素抗性盒引入到质粒中Ss-IspS基因的3′末端以用作选择标记。将Ss-IspS基因克隆至Ncol和Pstl限制性位点之间。

图10.双重同源重组。通过双重同源重组和用Ss-IspS Gm抗性构建物替换天然psbA3基因来转化集胞藻的原理示意图。

图11.用于在细菌(如大肠杆菌)中过表达重组蛋白质的带His标签包含Ss-IspS的质粒的结构。引入N-末端组氨酸标签以方便重组蛋白质的纯化。向液体细胞培养物中加入IPTG来诱导大肠杆菌的表达。

图12.细菌(如大肠杆菌)中带组氨酸标签的Ss-IspS重组蛋白质的表达的证据。考马斯染色的SDS-PAGE分离的来自携带pETIspS质粒的大肠杆菌细胞提取物的总蛋白质。第一泳道：未诱导的对照培养物。2-4和6-10泳道：诱导过的大肠杆菌培养物。5泳道：蛋白质分子量大小标准参照物。

图13.四种已知异戊二烯合酶蛋白质的Clustal比对。

发明详述

定义

“微观藻类”、“藻类(alga)”等，指属于菌藻植物门(phylumThallophyta)的藻亚门(subphylum Algae)的植物。所述藻类是单细胞的光合生氧藻类，为非寄生植物，无根、茎和叶；它们具有叶绿素并且尺寸大小各异，从微观藻类到大型的海藻。绿藻，属于真核生物(Eukaryota)-植物界(Viridiplantae)-绿藻门(Chlorophyta)-绿藻纲(Chlorophyceae)，可以在本发明中使用。然而，本发明中可用的藻类也可以是蓝绿藻、红藻或棕色藻，只要该藻类能够实施提供异戊二烯生产的底物的必要步骤。

本发明文中的“挥发性异戊二烯烃类”是指五碳的短链类异戊二烯，例如异戊二烯或甲基-丁烯醇。

术语“核酸”和“多核苷酸”以相同含义使用，指从5’端到3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。本发明中的核酸一般包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下，可使用可能具有替代主链的核酸类似物，其包括例如，氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A PracticalApproach，Oxford University Press)；以及肽核酸主链和连接。其它核酸类似物包括具有带正电主链、非离子主链和非核糖主链的那些。因此，核酸或多核苷酸还可能包含经修饰的核苷酸，其允许被聚合酶正确阅读。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括作为单独单链或在双链体中的核酸的有义链和反义链。如本领域的人员可以理解的，对单链的说明还限定了互补链的序列；因此本文中所描述的序列也提供它的互补序列。除非另外说明，具体的核酸序列也隐含地涵盖了其变体(例如简并密码子取代物)和互补序列，明确说明的序列。核酸可以是DNA，包括基因组和cDNA、RNA或杂交体，其中核酸可能包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，其包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。

词组“编码......的核酸序列”指包含结构RNA(如rRNA)、tRNA序列信息或者具体蛋白质或多肽的一级氨基酸序列信息或者反式作用调控因子结合位点的序列信息的核酸。该表述特别地涵盖了天然序列的简并密码子(例如，编码单个氨基酸的不同密码子)，其可以被引入序列以符合特定宿主细胞中的密码子偏好性。在本发明语境中，当涉及核酸参考序列(例如SEQ ID NO：3、5或7)使用时，术语“IspS编码区”指编码该蛋白质的核酸区域。

本发明语境中的IspS“基因”指编码IspS蛋白质或其片段的核酸。因此，这些基因经常是编码IspS的cDNA序列。在其它一些实施方案中，IspS基因可包括在cDNA中不会出现的序列，如内含子。

术语“启动子”或“调控元件”指位于转录起点上游或下游的指导转录的区域或序列决定区。如本文中所使用的，启动子包括临近转录起始位点的必需核酸序列，例如，在II型聚合酶启动子的情况下有TATA元件。启动子也可任选地包括远程元件，其位于距转录起始位点多至几千个碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下都有活性的启动子。“可诱导”启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。术语“有效连接”指核酸表达控制序列(如启动子)和第二核酸序列(如IspS基因)之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。“藻类启动子”或“细菌启动子”是能够分别在藻类和/或细菌细胞中启动转录的启动子。因此，该启动子在微观藻类、蓝细菌或细菌细胞中是有活性的，但不必来源于该生物体。应理解，在不破坏调控元件生物功能的情况下，可以对其作出有限的修饰，并且与野生型藻类调控元件相比，这些有限修饰可以使藻类调控元件具有基本相同的或提高的功能。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变，或者也可以是偶然的，如通过带有所述调控元件的宿主中的突变。只要基本保留赋予在单细胞绿藻中表达的能力，藻类调控元件的定义中就包括所有这些经修饰的核苷酸序列。

Dxs或Dxr基因的“提高”或“增强”活性或表达指Dxs或Dxr的活性的变化。这种提高的活性或表达的实例包括下列。Dxs或Dxr的活性或者Dxs或Dxr基因的表达提高至野生型非转基因对照微生物的水平之上(即Dxs或Dxr的活性或者Dxs或Dxr基因的表达的量提高)。Dxs或Dxr的活性或者Dxs或Dxr基因的表达是在其野生型非转基因细胞中通常检测不到上述活性或表达的细胞中进行的(即Dxs或Dxr基因的表达提高)。当细胞中存在Dxs或Dxr的活性或者Dxs或Dxr基因表达的时间比野生型非转基因对照中更长(即Dxs或Dxr的活性或者Dxs或Dxr基因的表达的持续时间增长)时，则Dxs或Dxr活性或者表达也是提高的。

在本发明中IspS基因的“表达”通常是指向细胞中引入IspS基因，所述细胞例如微观藻类(如绿色微观藻类)、蓝细菌、或者光合或非光合细菌，所述基因通常不在这些生物体中表达。因此，IspS活性或表达的“提高”通常是同不具有IspS活性的野生型细胞(例如，微观藻类、蓝细菌或者光合或非光合细菌)相比较确定的。

如果多核苷酸序列来源于外源物种或者若来源于相同物种但经过人类作用而从其原始形式进行了修饰，则它是第二核苷酸序列的“异源”核苷酸序列。例如，与启动子有效连接的异源编码序列是指其来源物种不同于启动子来源物种的编码序列，或者，如果来源于相同物种，则编码序列不同于任何天然等位基因变体。

“IspS多核苷酸”是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的核酸序列，或者SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的IspS编码区域；或者是与SEQ IDNO：1基本相似的核酸序列或者与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的IspS编码区域基本相似的核酸序列；或者编码SEQ ID NO：2或SEQID NO：8的多肽或者编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8基本相似的多肽或者其片段或结构域的核酸序列。因此，IspS多核苷酸：1)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7中的或者SEQ ID NO：3或5之IspS编码区域中的约15到约50、100、150、200、300、500、1000、1500或2000或更多个核苷酸，有时约20或约50到约1800个核苷酸，有时约200到约600或约1500个核苷酸的区域；或者2)在严谨条件下，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7或者与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的IspS编码区域或者与其互补序列杂交；或者3)编码IspS多肽或编码IspS多肽(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8)的至少50个连续氨基酸通常至少100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或更多个连续残基的片段；或者4)编码与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8或在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的至少100、200、300、400、500或550个氨基酸残基的比较窗口上具有至少55％，通常至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多一致性的IspS多肽或片段；或者5)具有与SEQID NO：1或SEQ ID NO：7有大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高核苷酸序列一致性的核酸序列，在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的或者SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5之IspS编码区域的至少约50、100、200、500、1000或更多核苷酸的比较窗口上具有至少80％、85％、90％或至少95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性；或者6)是由针对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7的或者针对SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5之IspS编码区域的引物所扩增的。术语“IspS多核苷酸”是指双链或单链的核酸。本文中所用的IspS核酸编码催化二甲基烯丙基二磷酸底物向异戊二烯转化的活性IspS。

“IspS多肽”是具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8氨基酸序列的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8基本相似的氨基酸序列，或其片段或结构域。因此，IspS多肽可以：1)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8，或者是在SEQ ID NO：2或8的至少100、200、250、300、350、400、450、500或550个氨基酸的比较窗口上，有至少55％的一致性，通常至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的一致性；或者2)包含SEQ ID NO：2或8的至少100，通常至少200、250、300、350、400、450、500、550或更多个连续氨基酸；或者3)结合针对包含SEQ ID NO：2或8之氨基酸序列的免疫原及其保守修饰变体所产生的抗体。本发明中的IspS多肽是催化二甲基烯丙基二磷酸底物向异戊二烯转化的功能性蛋白。

如本文中所使用的，特定的IspS基因(例如，SEQ ID NO：1)的同源物或直系同源物例如是同一植物类型或不同植物类型中与所述第一基因中序列基本一致(如下所述确定)的第二基因。

术语“Dxs”和“Dxr”核酸和多肽是指片段、变体等。示例性Dxs和Dxr序列包括公开于美国专利申请公开No.20030219798中所公开的核酸和多肽Dxs和Dxr序列，例如衣藻(Chlamydomonas)序列。美国专利申请公开No.20030219798中所述的Dxs和Dxr序列以引用形式并入本文。

“表达盒”是指核酸构建物，当引入到宿主细胞中时，其导致RNA或多肽的转录和/或翻译。

在转基因表达的情况下，技术人员能够认识到插入的多核苷酸序列不需要与该序列所来源的基因序列一致，而是可以“基本一致”。如下所解释的，本术语具体地涵盖了这些变体。

在插入的多核苷酸序列被转录和翻译产生功能性多肽的情况下，技术人员会了解，由于密码子的简并性，有一些多核苷酸序列会编码相同的多肽。术语“IspS多核苷酸序列”或“IspS基因”具体地涵盖了这些变体。

当两序列中的核苷酸序列或氨基酸残基序列如下所述地进行最大对应性比对时是相同的，则这两种核酸序列或多肽被称为“一致的”。本文中所用的术语“互补于”意味著该序列互补于参考多核苷酸序列的全部或部分。

用于比较的最佳序列比对可以通过局部同源性算法(Smith和Waterman Add.APL.Math.2：482(1981))、同源性比对算法(Needleman和WunschJ.MoI.Biol.48：443(1970))、相似度检索方法(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sd.(U.S.A.)85：2444(1988))、这些算法的计算机化形式(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI)或通过检查来进行。

“序列一致性的百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定的，其中相比于用于两序列最佳比对的参考序列(不含有添加或缺失)，所述比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口)。所述百分比如下进行计算：确定两序列中一致的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，得到匹配位置数，然后用匹配位置数除以比较窗口中位置总数再乘以100，就可以得到序列一致性百分比。本文所使用的“比较窗口”包括涉及任一连续位置数目的区段，例如20到600，通常约50到约200，更通常为约100到约150，其中在两序列最佳地比对之后，序列可以与具有相同连续位置数的参考序列相比较。

在多核苷酸或氨基酸序列的上下文中术语“基本一致”意为多核苷酸或多肽包含与参考序列有至少50％序列一致性的序列。可替代地，百分比一致性可以为从50％到100％的任何整数。示例性实施方案包括用本文中所述的程序与参考序列相比具有至少55％、57％、60％、65％、70％、75％、80、85％、90％、95％或99％的一致性；所述程序优选如下所述采用标准参数的BLAST。因此，本发明的IspS序列包含与SEQ ID NO：1或SEQID NO：7或者与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的IspS编码区域基本一致的核酸序列。如上所提到的，本发明中的IspS多肽序列包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：8基本一致的多肽序列。

如上所提到的，除了不一致的残基位置可能由于保守的氨基酸变化而不同外，“基本相似”的多肽具有共有的序列。保守氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香基侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸和甲硫氨酸。示例性保守氨基酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

核苷酸序列基本一致的另一个指示是两个分子在严谨条件下是否可以相互杂交或可以与第三核酸杂交。词组“严谨杂交条件”是指探针可以与其靶标子序列(通常是在核酸的复杂混合物中)杂交，但是不与其它序列杂交的条件。严谨条件是依赖于序列的，并且在不同的环境中有所不同。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的详细指导可以参照Tij ssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes，＂Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays＂(1993)。通常，选择在限定的离子强度和pH值下比该特定序列的热熔解温度(Tm)低约5-10℃的严谨条件。Tm值为平衡时(由于靶序列过量存在，在Tm温度下，平衡时占用了50％的探针)互补于靶标的探针中的50％与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH值和核酸浓度下)。严谨条件是pH值7.0到8.3时盐浓度小于约1.0M的钠离子，通常约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐类)，以及温度对于短探针(例如10到50个核苷酸)至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)至少约60℃。也可以通过添加如甲酰胺的去稳定剂实现严谨条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少两倍，任选地为背景杂交的10倍。示例性严谨杂交条件可以为如下所示：50％甲酰胺、5×SSC、1％SDS在42℃下孵育，或者5×SSC、1％SDS、在65℃下孵育，用0.2×SSC和0.1％ SDS在55℃、60℃或65℃下清洗。这些清洗可以实施5、15、30、60、120分钟或更长时间。

如果所编码的多肽基本一致，则在严谨条件下不互相杂交的核酸仍然是基本一致的。这会在一些情况下发生，例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。在这种情况下，该核酸通常在中等严谨的杂交条件下杂交。例如，也可以通过其在严谨条件下(例如，Tm～40℃)与具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7序列的核酸探针杂交的能力鉴定IspS多核苷酸。相对于所选择的核酸探针，该IspS核酸序列可以有例如约25-30％或更低的碱基错配。SEQ ID NO：1是一个示例性IspS多核苷酸序列。示例性“中等严谨杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下的杂交，以及在45℃下用1×SSC清洗。这些清洗可以实施5、15、30、60、120分钟或更长时间。阳性杂交是背景的至少两倍。那些普通的技术人员会很容易了解另外的杂交和清洗条件可用来提供相似严谨条件。

当用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白质基本上不含在自然状态下与其相关联的其它细胞组分。优选地，其处于均一的状态，并且可以是干燥形式或在水性溶液中。纯度和均一性通常采用分析化学技术确定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。作为主要物质存在于制剂中的蛋白质是基本上纯化的。特别地，分离的基因与位于所述基因侧翼并且编码目的基因之外蛋白质的开放读码框相分离。

如本文中所使用的，“大规模培养”是指大量培养已经过改造而表达IspS基因的微观藻类、蓝细菌、或者光合或非光合细菌。“大量”通常是在约100升到约1500000升的范围，或更多。在一些实施方案中，在模块化生物反应器中大量培养该微生物，所述每个反应器的容量为约1000到约1000000升。

本发明中的“生物反应器”为微观藻类、蓝细菌或者光合或非光合细菌在其中生长的任何密闭的大容量容器。本发明中的“大容量容器”可以容纳约100升，通常为约500升，或约1000升到约1000000升，或更多。

如本文所使用的，“收集”挥发性异戊二烯烃类是指在密闭的或容纳的环境中捕获或隔离这些烃类。

IspS、Dxr或Dxs核酸序列

本发明中采用了多种常规的重组核酸技术。总的来说，以下所述的重组DNA技术中的术语和实验室程序都是公知的并且在本领域普遍采用。许多指导实施重组DNA操作的手册都是可以获得的，例如，Sambrook &Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3rd Ed，2001)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994-1999)。

IspS核酸和多肽序列是本领域已知的。IspS基因已从杨树和山杨树(两种相关的树种)以及葛藤(藤本植物)中分离出来并测序。通过登录号在下文中给出所涉及的物种及可从NCBI数据库中获得的序列，其每一个都以参考形式并入本文：

银白杨(Populus alba)(white poplar)的异戊二烯合酶的IspS mRNA；登录号：AB198180；

美洲山杨(Populus tremuloides)(quaking aspen)的异戊二烯合酶(IspS)；登录号：AY341431(完整cds)；

银白杨美洲山杨杂交种(Populus alba×Populus tremuloides)的IspSmRNA；登录号：AJ294819；

黑杨(Populus nigra)(Lombardy poplar)的异戊二烯合酶的mRNA(IspS基因)；登录号：AM410988。

山葛藤野变种(Pueraria montana var.lobata)(kudzu vine)的异戊二烯合酶(IspS)；登录号：AY316691(完整cds.)。

对这些IspS序列的检查表明了高度的核苷酸和氨基酸序列一致性，例如，杨树和山杨树杂交种的cDNA序列在多肽和核苷酸水平上具有98％的一致性(参见，例如，Sharkey et al，Plant Physiol.137：700-712，1995)。山杨树异戊二烯合酶的核苷酸编码序列与葛藤基因有65％的一致性，而蛋白质序列(不包括叶绿体转运肽)有57％的一致性。

杨树的IspS蛋白在所述蛋白质羧基端一半上有高密度的半胱氨酸和组氨酸。例如，就Cr-IspS蛋白(SEQ ID NO：4)的591个氨基酸序列来说，其中半胱氨酸位于34、326、378、413、484、505和559号位置，即7个半胱氨酸中有6个位于蛋白质的后45％。同样也观察到在所述蛋白的C端一半多个位置处有另外的成簇组氨酸。已知组氨酸和半胱氨酸参与了蛋白质适当的折叠和催化位点的结构，并且对于酶活性来说是重要组成部分。图13中提供了对四种已知IspS蛋白质的比对，其表明在所述分子的C端部分中半胱氨酸的高度保守。在一种情况下，葛藤蛋白质中有被丝氨酸取代的另外保守的半胱氨酸(图13的clustal比对中银白杨或黑杨或美洲山杨的Cys-509-Ser序列)。丝氨酸对于半胱氨酸来说是高度保守的取代，因为这两种氨基酸唯一的不同在于用-OH基取代了-SH基。事实上，对四种IspS序列的检查揭示了在包含所述蛋白质的C端一半中许多保守丝氨酸的额外性质。因此，在一些实施方案中，本发明中所使用的核酸编码IspS多肽，其包含SEQ ID NO：2之C端的45％，并保持了催化二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯的活性。也有其它实例，其中在一种微生物(例如绿色微观藻类)中的相关蛋白质缺少所述蛋白质N端的基本部分(相对于例如细菌的另一种微生物中存在的蛋白质形式)，但对活性没有有害作用(参见，例如Melis和Happe，Plant Physiol.127：740-748，2001)。因此，在一些实施方案中，本发明中所使用的IspS核酸编码包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的从约330号氨基酸残基到C末端的多肽。在一些实施方案中，IspS核酸编码的IspS多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的从约300号氨基酸残基到C末端的多肽。在一些实施方案中，IspS序列可以另外缺少SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的最后10、15或20个残基。

IspS蛋白质的转运肽最低限度地包含1-37号氨基酸(对于杨树和山杨树)以及1-45号氨基酸(对于葛藤)。据此分析，成熟的蛋白质以氨基酸序列“CSVSTEN...”等起始。本发明中所使用的IspS核酸序列不需要包含编码转运多肽的序列，并且还可以省略额外的N-末端序列。例如，实施例部分所提到的Ss-IspS构建物缺少编码合成基因DNA中的52个氨基酸。这对IspS蛋白质的合成和积累没有影响。

在本发明的一些实施方案中，使用编码杨树或山杨树IspS多肽(例如，SEQ ID NO：2)的核酸序列，在另外一些实施方案中，使用编码葛藤IspS多肽(例如，SEQ ID NO：8)的核酸序列。由本发明的方法中所用核酸编码的IspS多肽具有催化DMAPP转化为异戊二烯的活性。通常地，活性水平与杨树或山杨树IspS多肽(例如，SEQ ID NO：1所编码的)或天然葛藤IspS多肽(例如，SEQ ID NO：7所编码的)所显示的活性相当。

示例性Dxs和Dxr序列包括美国专利申请No.20030219798所公开的Dxs和Dxr的核酸和多肽序列，例如，衣藻(Chlamydomonas)的序列。美国专利申请No.20030219798中的Dxs和Dxr序列以引用形式并入本文。

可采用多种技术来实现IspS、Dxr或Dxs多核苷酸序列的分离和生成。该技术的克隆和表达在有关IspS基因的部分中有所涉及。然而，也可以采用同样的技术分离和表达Dxr或Dxs多核苷酸。例如，基于本文所公开序列的寡核苷酸探针可用于从所需植物物种的cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需的多核苷酸。然后可以使用基于所克隆的IspS基因序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7)的探针筛选这些cDNA或基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同植物物种中的同源基因。

可替代地，可使用扩增技术从核酸样本中扩增目的核酸。例如，可以采用PCR直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库中扩增所述基因的序列。PCR和其它体外扩增方法也可例如用于克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列，用于制备用作检测样本中期望mRNA存在情况之探针的核酸，用于核酸测序中或其它一些目的。

可以从本文所提供的序列比较中产生用于从植物细胞(例如杨树或另一落叶树)中鉴定IspS基因的合适的引物和探针。对PCR技术的整体概述可以参见PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，(rnnis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.and White，T.，eds.)，Academic Press，San Diego(1990)。在实施例中提供了用于扩增IspS核酸序列的示例性的PCR。

本发明中所使用的IspS核酸序列的种类包括用例如杂交和/或序列分析的技术使用示例性核酸序列(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7)和蛋白质序列(如：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8)鉴定或表征的基因和或基因产物。

重组载体的制备

为了在上述的技术中使用分离的序列，制备了适于绿藻、蓝细菌和光合或非光合细菌细胞转化的重组DNA载体。转化的技术是众所周知的，并在科技文献中已有说明。例如，编码IspS基因的DNA序列(在以下内容中会进一步详细说明)可以与转录调控或其它调控序列结合，这些序列会指导来自该基因的序列在转化的藻类、蓝细菌或细菌中的预期细胞中进行转录。在一些实施方案中，包含了含有IspS基因之表达盒的表达载体还包含有效连接于IspS基因上的启动子。在其它一些实施方案中，指导IspS基因转录的启动子和/或其它调控元件对该微生物而言是内源性的，并通过例如同源重组引入包含IspS基因的表达盒，从而异源IspS基因与内源启动子有效连接，并由内源启动子驱动表达。

调控序列包括可以是组成型或者可诱导型的启动子。在一些实施方案中，启动子可以在环境条件改变的影响下用于指导IspS核酸的表达。可影响可诱导型启动子转录的环境条件的例子包括厌氧条件、升高温度或存在光。在暴露于化学试剂时可诱导的启动子也可用于IspS核酸的表达。其它有用的可诱导调控元件包括铜-诱导型调控元件(Mett et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4567-4571(1993)；Furst et al，Cell 55：705-717(1988))；四环素和氯-四环素-诱导型调控元件(Gatz et al.，Plant J.2：397-404(1992)；R

der et al，MoI.Gen.Genet.243：32-38(1994)；Gatz，Meth.Cell Biol50：411-424(1995))；蜕皮素诱导型调控元件(Christopherson et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(1992)；Kreutzweiser et al，Ecotoxicol.Environ.Safety 28：14-24(1994))；热应激诱导型调控元件(Takahashi et al，Plant Physiol.99：383-390(1992)；Yabe et al，Plant Cell Physiol.35：1207-1219(1994)；Ueda et al，MoI.Gen.Genet.250：533-539(1996))；以及乳糖操纵子元件，其与组成型表达的lac阻抑蛋白一起用于提供例如IPTG-诱导型表达(Wilde et al，EMBO J.11：1251-1259(1992))。诱导型调控元件也可以是例如从菠菜硝酸盐还原酶基因中衍生的(Back et al.，PlantMoI.Biol.17：9(1991))硝酸盐-诱导型启动子，或光-诱导型启动子如与RuBP羧化酶的小亚基或LHCP基因家族有关的启动子(Feinbaum et al.，MoI Gen.Genet.226：449(1991)；Lam and Chua，Science 248：471(1990))，或光。

在一实施例中，可以使用对光有反应性的启动子序列来驱动引入到暴露于光的衣藻(Chlamydomonas)中的IspS核酸构建物的表达(例如，Hahn，Curr Genet 34：459-66，1999；Loppes，Plant MoI Biol 45：215-27，2001；Villand，Biochem J 327：51-7，1997)。也可以使用其它光-诱导型启动子系统，例如光敏色素/PIF3系统(Shimizu-Sato，Nat Biotechnol 20)：1041-4，2002)。另外，可以采用对热有反应性的启动子来驱动藻类(如衣藻(Chlamydomonas))中的表达(Muller，Gene 111：165-73，1992；vonGromoff，MoI Cell Biol 9：3911-8，1989)。其它的启动子，例如在藻类(如绿微观藻类)中的表达，包括RbcS2和PsaD启动子(参见，例如，Stevens etal，MoI.Gen.Genet.251：23-30，1996；Fischer & Rochaix，MoI GenetGenomics 265：888-94，2001)。

在一些实施方案中，启动子可来自与待转化物种或另一物种中的光合成有关的基因。例如，来自一个物种中的这种启动子可以用于指导经转化藻类细胞或另一光合水生生物细胞中的蛋白质表达。可基于来自其它光合生物的已知序列来分离或合成出合适的启动子。优选的启动子是来自其它光合物种的与待转化水藻宿主的光合基因同源的基因的那些。例如，已在三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中鉴定出一系列来自褐藻素叶绿素结合蛋白的光捕获启动子(参见例如Apt，et al.MoI Gen.Genet.252：572-579，1996)。在其它一些实施方案中，可以采用类胡萝卜素叶绿体结合蛋白质启动子，例如多甲藻(黄)素叶绿素结合蛋白质启动子。

在一些实施方案中，用于驱动异源IspS基因表达的启动子为组成型启动子。用于微观藻类中的组成型强启动子的例子包括例如atpA、atpB和rbcL基因的启动子。也已知在蓝细菌中有活性的多种启动子。这些启动子包括，如蓝细菌中的psbA3基因(组成型)启动子和例如美国专利申请No.20020164706中所提到的那些启动子，它们都以参考形式并入本文。也可以在藻类中使用其它一些在植物中有效的启动子，例如，来源于植物病毒中的启动子，如CaMV35S启动子。

在一些实施方案，通过对相应于IspS基因的基因组克隆的5’端序列进行分析来鉴定启动子。启动子序列的特征性序列可用于鉴定所述启动子。

启动子可以通过例如测试启动子在期望引入IspS表达构建物的植物细胞例如绿藻中驱动表达的能力进行评价。

包含IspS核酸序列的载体通常会包含能够赋予藻类或细菌细胞可选择表型的标记基因。这些标记都是已知的。例如，所述标记可以编码抗生素抗性，例如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素等等的抗性。在一些实施方案中，用于衣藻的选择标记可以是具有壮观霉素抗性(Fargo，MoI CellBiol19：6980-90，1999)、卡那霉素和阿米卡星抗性(Bateman，Mol-GenGenet 263：404-10，2000)、zeomycin和腐草霉素抗性(Stevens，MoI GenGenet 251：23-30，1996)、巴龙霉素和新霉素抗性(Sizova，Gene 277：221-9，2001)的标记。

本发明中的IspS核酸序列在微生物中(例如微观藻类、蓝细菌或者光合或非光合细菌)重组表达。如本领域技术人员所理解，可以考虑如IspS核酸将在其中表达的微生物的密码子用法频率等性质来设计表达构建物。可采用已知的方法(参见，例如，Nakamura et al.Nucl.Acids Res.28：292，2000)列出密码子用法频率表。密码子用法频率表，包括微观藻类和蓝细菌的那些表，也可以从本领域中获得(例如，在Kazusa DNA研究所的植物基因组研究部的密码子用法数据库中，www.kazusa.or.jp/codon)。

细菌和蓝细菌的细胞转化方法以及选择标记在本领域中是众所周知的(Wirth，MoI Gen Genet 1989 March；216(l)：175-7；Koksharova，ApplMicrobiol Biotechnol 2002 February；58(2)：123-37；Thelwell)。用于细菌的转化方法和可选择标志物也是众所周知的(参见，例如，Sambrook et ah，supra)。

在微观藻类(如绿色微观藻类)中，其核、线粒体和叶绿体基因组通过多种公知的方法转化，包括通过微粒轰击或使用玻璃珠的方法(参见，例如，Kindle，J Cell Biol 109：2589-601，1989；Kindle，Proc Natl Acad SciUSA 87：1228-32，1990；Kindle，Proc Natl Acad Sci USA 88：1721-5，1991；Shimogawara，Genetics 148：1821-8，1998；Boynton，Science 240：1534-8，1988；Boynton，Methods Enzymol 264：279-96，1996；Randolph-Anderson，MoI Gen Genet 236：235-44，1993)。在一些实施方案中，将IspS基因引入到微观藻类的叶绿体中。在其它实施方案中，将IspS基因引入到细胞核中。

本文中所述的用于在微观藻类、蓝细菌或者光合或非光合细菌中获得和表达IspS核酸序列的技术也可以用于表达Dxr或Dxs核酸序列。

可以作为目标的微生物

IspS可以在期望在其中生产异戊二烯的多种微观藻类(如绿藻)、或蓝细菌、或者光合或非光合细菌中表达。表达异源IspS基因的经转化的微观藻类、蓝细菌或细菌(光合细菌或非光合细菌)在用于烃类(例如，用作燃料来源或合成化学的原料)生产的大规模培养的条件下培养。经转化的生物体在提供容纳所述烃类的密闭环境的生物反应器或发酵罐中培养。在大规模培养的典型实施方案中，所述微观藻类、蓝细菌或细菌在密闭的反应器中生长，其容量为至少约500升，通常为至少约1000升或更大，在一些实施方案中，其容量为约1000000升或更大。

在一些实施方案中，IspS在微观藻类中表达。藻类等是指属于菌藻植物门藻亚门的植物。所述藻类是单细胞的光合生氧藻类，它们是非寄生植物，无根、茎、叶；它们包含叶绿素并且大小各异，从微观级别的到大型的海藻都有。具有叶绿素a和叶绿素b的生氧光合单细胞真核生物的绿藻，属于真核生物(Eukaryota)-植物界(Viridiplantae)-绿藻门(Chlorophyta)-绿藻纲(Chlorophyceae)，通常是优选的靶标。例如、IspS可以在莱茵衣藻(C.reinhardtii)中表达，其分类为团藻目(Volvovales)-衣藻科(Chlamydomonadaceae)。本发明中可以用到的藻类株包括，例如，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、小球藻(Chlorella vulgaris)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、Botryococcussudeticus、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和雨生红球藻(Heamatococcuspluvialis)。

大规模培养藻类的方法是已知的。例如，藻类可以生长于高密度光生物反应器(参见，例如，Lee et al.，Biotech.Bioengineering 44：1161-1167，1994；Chaumont，JAppl.Phycology 5：593-604，1990)、例如那些用于污水或废水处理的生物反应器(例如，Sawayama et al.，Appl.Micro.Biotech.，41：729-731，1994；Lincoln，Bulletin DeL′institut Oceangraphique(Monaco)，12：109-115，1993)，其可以大规模培养用于从受污染的水中消除重金属(例如，Wilkinson，Biotech.Letters，11：861-864，1989)，可以大规模培养以用于生产β-胡萝卜素(例如，Yamaoka，Seibutsu-Kogaku Kaishi，72：111-114，1994)、氢气(例如，美国专利申请No.20030162273)和药物化合物(例如，Cannell，1990)、以及人和动物使用的营养补充剂(Becker，1993，Bulletin DeL′institut Oceanographique(Monaco)，12，141-155)和生产其它有营养价值的化合物。

以上出于示例性目的所说明的培养表达IspS的藻类或细菌的条件在本领域中是已知的(参见例如本文中引用的示例性参考)。可以采用已知的技术收集由改造过的微生物所生产的挥发性异戊二烯烃类。异戊二烯烃类不能与水混合，它们上升至并飘浮于微生物生长培养基的表面。从该表面将它们吸取后放置于合适的容器内。另外，根据微生物大规模培养时的主要温度，异戊二烯可以在反应器容器内的水培养基上以蒸气形式存在(异戊二烯的沸点为T＝34℃)。从生物反应器容器内将异戊二烯蒸气抽走并通过冷却或低程度压缩将其凝结成为液体燃料形式。

实施例

本文中所描述的实施例是以说明性的方式而非限制性的方式提供。本领域中的技术人员会很容易了解可以改变或修改多个非关键参数以获得本质上相似的结果。

实施例1.用于在微观藻类中生产异戊二烯烃类的新型Cr-IspS基因的 设计和表达

根据已知的核编码的银白杨(Populus alba)“异戊二烯合酶”IspS蛋白质序列，生成了调整了密码子的合成DNA构建物。采用该氨基酸序列(SEQID NO：2)作为模板用于从头设计IspS DNA序列以用于在模式微观藻类莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中表达所述基因。出于本发明的目的，将该基因称为Cr-IspS。该基因的特征包括：(1)密码子用法不同于杨树的密码子用法，并具体地选择成适合莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿体的密码子用法；(2)从新型Cr-IspS基因的设计中省略了所述蛋白质的杨树叶绿体靶向序列。(3)将编码血凝素(HA)表位标签的经过密码子优化的基因的三个拷贝融合到所述IspS基因的上游。

Cr-IspS DNA序列(SEQ ID NO：3)设计成特异性地在微观藻类(如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))的叶绿体中编码异戊二烯合酶蛋白(SEQ ID NO：4)。根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿体6803的密码子用法表，调节了用于在衣藻(Chlamydomonas)叶绿体中表达所述基因的密码子用法，所述的密码子用法表列于以下链接：http://www.bio.net/bionet/mm/chlamy/1997-March/000843.html.

SEQ ID NO：4也包含血凝素标签的三个拷贝，其在该序列的N-末端一侧用下划线标出。在Cr-IspS DNA序列的末端引入限制性内切酶的识别位点以方便克隆该基因，合成整段序列并克隆到载体质粒中。

生成了表达密码子优化的重组异戊二烯合酶基因(Cr-IspS)的转基因莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿体。该过程是通过构建包含atpA启动子(PatpA)的嵌合基因(图4上部，Cr-IspS)实现的，所述启动子融合至密码子优化的三拷贝血凝素(HA)表位标签DNA的5’UTR末端(图4)。该DNA序列之后是Cr-IspS编码区(图4)，再之后是atpA3′UTR(图4，TatpA)。通过使用基因枪转化和同源重组实现所构建的嵌合基因在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿体基因组中的整合，其要求转化载体和叶绿体基因组之间的序列同源性(Boynton et al.，Science，240：1534-1538，1988)。出于此目的，采用了载体p322，其包含用作同源重组靶标的部分莱茵绿藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿体基因组(Franklin et al.，Plant J.，30：733-744，2002)。如图4中所示，将嵌合Cr-IspS基因连接至p322的BamHI位点以生成质粒pApISAt。通过颗粒轰击(Boynton et al.，Science，240：1534-1538，1988)的方法，将所述pApISAt构建物与包含赋予壮观霉素抗性(Franklin et al.，PlantJ.，30：733-744，2002)的经修饰16S核糖体基因的质粒p228共转化到莱茵绿藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC503株的叶绿体中。图4中的引物N和C标记用于后续在分离的壮观霉素抗性转化体中进行PCR筛选的引物的退火位置。

图5.提供了对原代转化体进行基因组PCR筛选分析的例子，将所述原代转化体在包含壮观霉素的培养基上进行筛选以检查嵌合Cr-IspS基因的N-末端或C-末端区域是否存在，从而筛选莱茵衣藻(C.reinhardtii)Cr-IspS转化体。对超过100个莱茵绿藻(Chlamydomonas reinhardtii)的壮观霉素抗性转化体集落进行了分离和测试，从中发现了两个独立的株系(#9和#20)在其叶绿体DNA中明确包含稳定整合的Cr-IspS基因。采用一个壮观霉素抗性转化体(#7，未显示)作为PCR分析的阴性对照，并将pApISAt质粒做为阳性对照的模板。引物N和C代表用于扩增的引物，图4示出了它们的退火位置。

用BamHI对来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)对照(#7)和推定的Cr-IspS转化体#9系的基因组DNA进行消化，并在琼脂糖凝胶上分离，进行Southern印迹分析以检测Cr-IspS转基因的完整性。与Cr-IspS编码区的放射性标记的Ndel/Xbal片段的杂交鉴定出在Cr-IspS转化体#9系中特有的～3.0kbp的条带，而在#7对照系的泳道上没有观察到可检测到的条带(图6A)。这些结果验证了在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)转化体#9系的叶绿体基因组中稳定整合了Cr-IspS，并与PCR分析的结果一致(图5)。对琼脂糖凝胶进行溴化乙锭染色(图6B)以确定有等量的DNA加载。在Cr-IspS转化体#20系中也得到了相似的结果(未显示)。

为了证明Cr-IspS基因表达，用Western印迹分析(图7)证实了在莱茵衣藻转基因#9系中Cr-IspS蛋白的积累。采用抗-HA标签抗体(α-HA)检测重组Cr-IspS蛋白的存在及其细胞浓度。将血凝素(HA)标签的三拷贝引入至编码成熟蛋白质的Cr-IspS基因之前的位置(图7A)，用作检测Cr-IspS蛋白积累的方便的表位。在50mM HEPES缓冲液(pH7.0)中，将莱茵衣藻细胞浓缩至500×10⁶个细胞/毫升，并用玻璃珠搅拌5分钟进行破碎以释放叶绿体的可溶性级分。用特异性多克隆抗血凝素抗体，对相当于10或20μg叶绿体的可溶性蛋白质级分进行SDS-PAGE和western印迹分析。在加载了来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)转化体#9系的样品的泳道中约67kD条带处观察到了明显的抗体蛋白质交叉反应，但在对照中(C#7)未观察到(图7B)。另外，在约38kD处也观察到了抗体蛋白质交叉反应，如图5B中加星号处所示。38kD条带的Cr-IspS蛋白的积累可能表示Cr-IspS mRNA翻译的提前终止，或对所述重组蛋白质的特异性降解活性。在对照泳道(C#7)中没有可检测的67kD或38kD条带。对应于34kD蛋白质的明显交叉反应可能是针对莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)蛋白质的第一或第二抗体的非特异结合。在转化体#20系中也检测到了Cr-IspS蛋白(未显示)。

实施例2.用于在蓝细菌中生产异戊二烯烃类的Ss-IspS基因的设计和表 达

为了在蓝细菌中表达产生异戊二烯烃类，基于银白杨(Populus alba)的已知异戊二烯合酶IspS蛋白序列生成了调整了密码子的合成DNA构建物。使用此氨基酸序列作为模板从头设计IspS DNA序列用于在蓝细菌(如集胞藻(Synechocystis sp.))中表达所述基因。根据集胞藻(Synechocystis)PCC6803的密码子用法表，调整了用于在蓝细菌中表达基因的密码子用法，所述密码子用法表列于以下链接：http://gib.genes.nig.ac.ip/single/codon/main.php？spid＝Syne PCC6803。

本文中所述调整了密码子的基因是指Ss-IspS。该基因的特征包括：(1)密码子的使用不同于杨树的密码子用法，其具体地选择为适合集胞藻(Synechocystis)的密码子用法；(2)在新的Ss-IspS基因的设计中省略了所述蛋白质的杨树叶绿体靶向序列。所述DNA序列被设计成特异性地在蓝细菌(如集胞藻(Synechocystis))中编码异戊二烯合酶蛋白质。SEQ IDNO：5的第一段下划线序列代表(反向互补)β-内酰胺酶基因，而第二段下划线序列是Ss-IspS DNA。另外，斜体序列为起始和终止密码子，加粗的序列为克隆用限制性位点。在新设计的Ss-IspS DNA序列的末端引入限制性酶识别位点以帮助克隆所述基因，合成所述整个序列并克隆至载体质粒中(图8)。

将经过密码子优化、长度调节且化学合成的Ss-IspS基因克隆至集胞藻(Synechocystis)的psbA3启动子区的下游，与psbA3基因的ATG起始密码子同一读码框。Ss-IspS基因之后是转录终止子和庆大霉素抗性盒，其后是紧接在psbA3基因下游的集胞藻(Synechocystis)序列。

该新的构建物允许同源重组，即经双重同源重组通过替换内源psbA3基因，Ss-IspS DNA序列插入到集胞藻基因组中(图10)。可以采用庆大霉素(Gm)作为选择标记来选择集胞藻(Synechocystis)转化体，强的psbA3启动子驱动Ss-IspS基因的表达。

为了用Ss-IspS构建物转化集胞藻(Synechocystis)，集胞藻(Synechocystis sp.)细胞生长于存在5mM葡萄糖的基本BG11生长培养基，直到细胞密度达到约50×10⁶个细胞/毫升(OD₇₃₀＝0.5)。接着收集细胞并浓缩至10¹⁰个细胞/毫升，与pAIGA质粒混合用于转化并孵育4-6个小时，然后将混合物涂布在含BG11的琼脂平板上的滤膜上，所述平板还含有0.5μg/ml Gm、0.3％硫代硫酸钠和10mM TES-NaOH，pH8.0。

将Petri平板在低光密度下保持1-2天，随后转移到正常生长条件。每周一次将滤膜转移到包含庆大霉素的新鲜平板上。分离Gm选择标记存在下形成的菌落，然后重新在新鲜滤膜上划线，随后在存在Gm的连续选择条件下，将其转移到液体BG11生长培养基中。

实施例3.大肠杆菌中带组氨酸标签的IspS的表达

为构建在大肠杆菌中表达带组氨酸标签的IspS基因的载体，使用引物：IspS_F_NdeI，5′-CTGGGTCATATGGAAGCTCGACGAA-3′和IspS_R_HindIII，5′-ATGGAAAACCTGAAGCTTTTAACGTTCAA-3′；通过PCR扩增经过密码子优化用于在蓝细菌中表达的Ss-IspSDNA，其分别在所述基因5’和3’末端引入Nde I-位点和HindIII-位点。使用这些位点将所述基因克隆至pET1529表达载体内构成载体pETIspS，所述载体pETIspS携带了位于蛋白质N-末端的组氨酸标签(图11)。

为了证明在大肠杆菌中重组的带组氨酸标签的Ss-IspS的表达，用pETIspS质粒转化大肠杆菌，所述质粒包含Ss-IspS基因和位于Ss-IspS基因5’末端的组氨酸标签编码DNA。加入0.1mM IPTG到液体细胞培养物中诱导该His-Ss-IspS基因在大肠杆菌中的成功表达。收集细胞并通过SDS-PAGE和考马斯染色分析其蛋白质含量(图12)。证明了携带pETIspS质粒的所有克隆表达～65kD的His-Ss-IspS蛋白质(图12，～65kD条带)。

采用经过密码子优化而在单细胞绿藻(如莱茵绿藻(Chamydomonasreinhardtii))中表达Cr-IspS基因也类似地进行了细菌(如大肠杆菌)中IspS基因的表达和重组IspS蛋白质的积累的相似工作和证明(结果未显示)。

本说明书中引用的所有出版物、登录号和专利申请以引用形式并入本文，每个单独的出版物或专利申请都是具体地并单独地指明以引用形式并入本文。

示例性IspS序列：

SEQ ID NO：1银白杨(Populus alba)异戊二烯合酶的cDNA，登录号No.AB198180

1   atggcaactg aattattgtg cttgcaccgt ccaatctcac tgacacacaa acttttcaga

61  aatcccttac ctaaagtcat ccaggccact cccttaactt tgaaactcag atgttctgta

121 agcacagaaa acgtcagctt cacagaaaca gaaacagaag ccagacggtc tgccaattat

181 gaaccaaata gctgggatta tgattatttg ctgtcttcag acactgacga atcgattgag

241 gtatacaaag acaaggccaa aaagctggag gctgaggtga gaagagagat taacaatgaa

301 aaggcagagt ttttgactct gcttgaactg atagataatg tccaaaggtt aggattgggt

361 taccggttcg agagtgacat aaggggagcc cttgatagat ttgtttcttc aggaggattt

421 gatgctgtta caaaaactag ccttcatggt actgctctta gcttcaggct tctcagacag

481 catggttttg aggtctctca agaagcgttc agtggattca aggatcaaaa tggcaatttc

541 ttggaaaacc ttaaggagga catcaaggca atactaagcc tatatgaagc ttcatttctt

601 gcattagaag gagaaaatat cttggatgag gccaaggtgt ttgcaatatc acatctaaaa

661 gagctcagcg aagaaaagat tggaaaagag ctggccgaac aggtgaatca tgcattggag

721 cttccattgc atcgcaggac gcaaagacta gaagctgttt ggagcattga agcataccgt

781 aaaaaggaag atgcaaatca agtactgcta gaacttgcta tattggacta caacatgatt

841 caatcagtat accaaagaga tcttcgcgag acatcaaggt ggtggaggcg agtgggtctt

901 gcaacaaagt tgcattttgc tagagacagg ttaattgaaa gcttttactg ggcagttgga

961 gttgcgttcg agcctcaata cagtgattgc cgtaattcag tagcaaaaat gttttcattt

1021 gtaacaatca ttgatgatat ctatgatgtt tatggtactc tggacgagtt ggagctattt

1081 acagatgctg ttgagagatg ggatgttaat gccatcaatg atcttccgga ttatatgaag

1141 ctctgcttcc tagctctcta caacactatc aatgagatag cttatgacaa tctgaaggac

1201 aagggggaaa acattcttcc atacctaaca aaagcgtggg cagatttatg caatgcattc

1261 ctacaagaag caaaatggtt gtacaataag tccacaccaa catttgatga ctatttcgga

1321 aatgcatgga aatcatcctc agggcctctt caactagttt ttgcctactt tgccgtggtt

1381 caaaacatca agaaagagga aattgaaaac ttacaaaagt atcatgatac catcagtagg

1441 ccttcccaca tctttcgtct ttgcaacgac ctggcttcag catcggctga gatagcgaga

1501 ggtgaaacag cgaattctgt atcatgctac atgcgtacaa aaggcatttc tgaggagctt

1561 gctactgaat ccgtaatgaa cttgatcgac gaaacctgga aaaagatgaa caaagaaaag

1621 cttggtggct ctttgtttgc aaaacctttt gtcgaaacag ctattaacct tgcacggcaa

1681 tcccattgca cttatcataa cggagatgcg catacttcac cagacgagct aactaggaaa

1741 cgtgtcctgt cagtaatcac agagcctatt ctaccctttg agagataa

SEQ ID NO：2银白杨(Populus alba)异戊二烯合酶的多肽序列(来自登录号No.AB198180)。所述蛋白的下划线部分表示叶绿体转运肽。

MATELLCLHRPISLTHKLFRNPLPKVIQATPLTLKLRCSVSTENVSFTETETEARRSAN

YEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQR

LGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFK

DQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAE

QVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLR

ETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDD

IYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGE

NILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAV

VQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISE

ELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSP

DELTRKRVLSVITEPILPFER

SEQ ID NO：3用于在单细胞绿藻中进行转化/表达的Cr-IspS基因和血凝素标签。IspS核苷酸序列由下划线“CCA”密码子开始。

ATGTATCCTTATGATGTTCCAGACTACGCAGGTTATCCTTATGATGTACCAGACTATGCA

GGTTATCCTTACGATGTACCTGATTACGCTGGTCCATGGTGTTCTGTTAGTACTGAAAATG

TTTCATTTACTGAAACAGAAACAGAAGCACGTAGATCAGCAAATTATGAGCCAAATAGT

TGGGATTATGACTATTTATTATCTAGTGATACAGATGAATCTATTGAAGTATATAAAGAT

AAAGCAAAAAAATTAGAAGCAGAAGTACGTCGTGAAATTAATAACGAAAAAGCAGAAT

TTCTTACTTTATTAGAATTAATTGATAATGTACAACGTTTAGGTTTAGGTTATCGTTTTGA

ATCAGACATTCGTGGTGCATTAGATCGTTTTGTATCAAGTGGTGGTTTTGATGCTGTTACA

AAAACTAGTTTACATGGTACTGCTTTAAGTTTTCGTTTACTTCGTCAACATGGTTTTGAAG

TAAGTCAAGAAGCTTTTTCTGGTTTTAAAGATCAAAATGGTAATTTCTTAGAAAATTTAA

AAGAAGATATTAAAGCTATTTTAAGTTTATACGAAGCATCATTTTTAGCTTTAGAAGGTG

AAAATATTTTAGATGAAGCTAAAGTATTTGCTATTTCTCACTTAAAAGAATTATCAGAAG

AAAAAATTGGTAAAGAATTAGCTGAACAAGTAAACCATGCATTAGAATTACCATTACAT

CGTCGTACACAACGTTTAGAAGCAGTTTGGTCTATTGAAGCTTATCGTAAAAAAGAAGAT

GCTAATCAAGTTTTATTAGAATTAGCAATTTTAGATTATAATATGATTCAATCAGTATACC

AACGTGATTTACGTGAAACAAGTCGTTGGTGGCGTCGTGTAGGTTTAGCTACTAAATTAC

ATTTTGCTCGTGATCGTTTAATTGAAAGTTTTTATTGGGCAGTTGGTGTAGCTTTTGAACC

ACAATATTCAGATTGTCGTAATTCAGTTGCAAAAATGTTTTCATTTGTAACTATTATTGAT

GATATTTATGATGTTTACGGTACATTAGATGAATTAGAATTATTCACTGATGCAGTAGAA

CGTTGGGATGTTAATGCTATTAATGATTTACCAGATTATATGAAATTATGTTTTCTTGCTT

TATATAACACTATTAATGAAATTGCTTATGATAACTTAAAAGATAAAGGTGAAAATATTT

TACCATATTTAACAAAAGCTTGGGCTGATTTATGTAATGCTTTTTTACAAGAAGCTAAAT

GGTTATATAATAAATCAACACCAACATTTGATGATTATTTTGGTAATGCTTGGAAAAGTT

CATCTGGTCCATTACAATTAGTTTTTGCTTATTTTGCTGTTGTTCAAAATATTAAAAAAGA

AGAAATTGAAAATTTACAAAAATATCATGATACAATTTCACGTCCATCACATATTTTTCG

TTTATGTAATGATTTAGCTTCAGCTTCAGCTGAAATTGCACGTGGTGAAACAGCAAATTC

AGTTTCATGTTATATGCGTACAAAAGGTATTTCTGAAGAATTAGCTACAGAATCAGTTAT

GAATTTAATTGATGAAACATGGAAAAAAATGAATAAAGAAAAATTAGGTGGTTCTTTAT

TTGCTAAACCATTTGTTGAAACTGCTATTAATTTAGCACGTCAATCACATTGTACTTATCA

TAATGGTGATGCTCATACATCACCAGATGAATTAACACGTAAACGTGTTTTATCAGTTAT

TACAGAACCAATTTTACCATTTGAACGTTAA

SEQ ID NO：4用于Cr-IspS异戊二烯合酶基因的多肽序列。下划线表示血凝素HA标签的三个拷贝。该异戊二烯合酶序列缺少杨树IspS蛋白序列的叶绿体靶向序列。该IspS序列由“CS......”开始，如字体的改变所示。

MYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGPWCSVSTENVSFTETETEARRSANYEPNSWDYDY

LLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDR

FVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYE

ASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAY

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VAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLC

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KSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSV

SCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGD

AHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER

SEQ ID NO：5Ss-IspS DNA以及用于蓝细菌的质粒pIspS的核苷酸序列。SEQ ID NO：5的第一个下划线序列表示(反向互补)β-内酰胺酶基因，而第二个下划线是Ss-IspS DNA。另外，斜体序列是起始密码子和终止密码子，粗体序列是克隆用限制性位点。

>pIspS

aaaaagcattgctcatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaataaaatcattatttaaaagggg

cccgagcttaagactggccgtcgttttacaacacagaaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggg

gccttctgcttagtttgatgcctggcagttccctactctcgccttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgct

cggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata

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tccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac

tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggat

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cgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgggctaactacggctacactagaagaacagtatttg

gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccg

ctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttga

tcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgacgcgcgcgtaactcacgttaagggattttggtcatgagctt

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tctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctgg

ccccagcgctgcgatgataccgcgagaaccacgctcaccggctccggatttatcagcaataaaccagccagccgg

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agtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccatcgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtc

gtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaa

agcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggc

agcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtc

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atccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtg

agcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatattctt

cctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaa

aaataaacaaataggggtcagtgttacaaccaattaaccaattctgaacattatcgcgagcccatttatacctga

atatggctcataacaccccttgcagtgcgactaacggcatgaagctcgtcggggaaataatgattttattttgac

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gtgacatccgccgggcactggatcgttttgtatctagtggcggctttgatggcgtcactaaaactagtttgcacg

cgaccgcactcagttttcggctattacgtcaacacggtttcgaagtgagtcaagaggcgtttagtggcttcaaag

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cccagtacagcgattgccgtaattctgtagcaaaaatgttttctttcgttacaattattgatgacatttatgacg

tttacggcaccctcgacgaactggaattgttcactgacgctgtggaacgttgggacgtaaatgccattaatgacc

tgccagattacatgaagttgtgttttctcgcgttatataacaccattaatgaaattgcatacgacaatttaaagg

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aatggttatataacaaatccacccccacttttgatgactattttggcaatgcctggaagagcagcagcgggcctc

tccaactgatttttgcttattttgcggtagtacaaaacattaagaaagaagagattgaaaatttgcaaaagtacc

atgacattattagtcggcccagtcatattttccgcttgtgcaacgacctggcatccgctagtgccgaaattgcgc

gtggcgaaacagctaatagtgtgagttgttacatgcgcacaaagggcatttccgaagaactagctacggaaagtg

tcatgaacctgattgacgagacttgcaagaaaatgaataaggaaaaattgggcgggtccctatttgccaaaccct

ttgtggaaaccgcgattaatttggctcgccaaagtcattgtacctatcacaatggtgatgctcacaccagtcccg

atgaattaacccgtaaacgagttctgtctgtgattactgaacccattttgccctttgaacgttaaaagtaacagg

ttttccatgttgtcgtctgcaagaacactgcagagcctgcttttttgtacaaagttggcattata

SEQ ID NO：6来自蓝细菌质粒的预期65kD翻译后Ss-IspS蛋白的氨基酸序列

1   MEARRSANYE PNSWDYDFLL SSDTDESIEV YKDKAKKLEA EVRREINNEK

51  AEFLTLLELI DNVQRLGLGY RFESDIRRAL DRFVSSGGFD GVTKTSLHAT

101 ALSFRLLRQH GFEVSQEAFS GFKDQNGNFL ENLKEDTKAI LSLYEASFLA

151 LEGENILDEA RVFAISHLKE LSEEKIGKEL AEQVNHALEL PLHRRTQRLE

201 AVWSIEAYRK KEDANQVLLE LAILDYNMIQ SVYQRDLRET SRWWRRVGLA

251 TKLHFAKDRL IESFYWAVGV AFEPQYSDCR NSVAKMFSFV TIIDDIYDVY

301 GTLDELELFT DAVERWDVNA INDLPDYMKL CFLALYNTIN EIAYDNLKDK

351 GENILPYLTK AWADLCNAFL QEAKWLYNKS TPTFDDYFGN AWKSSSGPLQ

401 LIFAYFAVVQ NIKKEEIENL QKYHDIISRP SHIFRLCNDL ASASAEIARG

451 ETANSVSCYM RTKGISEELA TESVMNLIDE TCKKMNKEKL GGSLFAKPFV

501 ETAINLARQS HCTYHNGDAH TSPDELTRKR VLSVITEPIL PFER^＊

SEQ ID NO：7山葛藤野变种(Pueraria montana var.lobata)异戊二烯合酶(IspS)；登录号：AY316691(完整cds.).atg起始密码子由下划线表示，其表明cDNA的蛋白质编码区域的起点。

1    aatcaatata taatatttac ggaagatttg atgcctttcc tgattttaat ttatttttat

61   ccctgcataa aataattgtg gtcaccgtac actgttcttg tcacttggac aagaaatttg

121  actagcaagc aaggtataat cattcatcta aacttatggt gatttattgc cccacctcat

181  caattttcgt gtgttttatt ttagtgtcct tggatcctcg ttccaatata aaaggagaac

241  atggcatcgc aattttagag catatcattg aaaagtcatg gcaaccaacc ttttatgctt

301  gtctaataaa ttatcgtccc ccacaccaac accaagtact agatttccac aaagtaagaa

361  cttcatcaca caaaaaacat ctcttgccaa tcccaaacct tggcgagtta tttgtgctac

421  gagctctcaa tttacccaaa taacagaaca taatagtcgg cgttcagcta attaccagcc

481  aaacctctgg aattttgaat ttctgcagtc tctggaaaat gaccttaagg tgattataca

541  tatattccag ttaatttttc tttttttctt ttgtgatttt taaggaatca tttagtttgg

601  gaaagtattt tttttatttg cacttttaat tataaaaatg ttatatcatt ttcacttttt

661  tctattcatt ttcaaaattt tacatagaaa acagtaaatt ttttatttt ttttattttct

721  attttcatta tttctcaaat caaacggtatt aaagcataa acaaagaaat taatattgtt

781  cttttaattt tattttttta caataatggg aacgattata tattaggctg accttaataa

841  gttatttttt ttttataata ttgttcttat tgtaacctaa cgacaggtgg aaaaactaga

901  agagaaggca acaaagctag aggaggaggt acgatgcatg atcaacagag tagacacaca

961  accattaagc ttactagaat tgatcgacga tgtccagcgt ctaggattga cctacaagtt

1021 tgagaaggac ataatcaaag cccttgagaa tattgttttg ctggatgaga ataagaaaaa

1081 taaaagtgac ctccatgcta ctgctctcag cttccgttta cttagacaac atggctttga

1141 ggtttcccaa ggtatttatg tatatatatg ttacccactt agcaacatat atatatatat

1201 atattatgat tcactgacca tgcatgtggt gcagatgtgt ttgagagatt taaggacaag

1261 gagggaggtt tcagtggtga acttaaaggt gatgtgcaag ggttgctgag tctatatgaa

1321 gcatcctatc ttggctttga gggagaaaat ctcttggagg aggcaaggac attttcaata

1381 acacatctca agaacaacct aaaagaagga ataaacacca aagtggcaga acaagttagt

1441 catgcactgg aacttcccta tcatcaaaga ttgcatagac tagaagcacg atggttcctt

1501 gacaaatatg aaccaaagga accccaccat cagttactac tcgagcttgc aaagctagat

1561 ttcaatatgg tgcaaacatt gcaccagaaa gaactgcaag acctgtcaag gttagaaatt

1621 tcaattctca agtaattatt acctcataag aaattaaata acaataacaa tattgagtgt

1681 agagatttcc aattaaaaat taacatacga gaggatcaat atatattctt aggtatgtgg

1741 tactaatgaa atatatgcta ggtggtggac ggagatgggg ctagcaagca agctagactt

1801 tgtccgagac agattaatgg aagtgtattt ttgggcgttg ggaatggcac ctgatcctca

1861 attcggtgaa tgtcgtaaag ctgtcactaa aatgtttgga ttggtcacca tcatcgatga

1921 tgtatatgac gtttatggta ctttggatga gctacaactc ttcactgatg ctgttgagag

1981 gttcgtaatt gatttcagtc tcgattcagt tggaatttaa ttattgctta attaataata

2041 acttgcgtac atgcatacac acagatggga cgtgaatgcc ataaacacac ttccagacta

2101 catgaagttg tgcttcctag cactttataa caccgtcaat gacacgtctt atagcatcct

2161 taaagaaaaa ggacacaaca acctttccta tttgacaaaa tctgtacata tatactaatt

2221 atctccttgg ttgattaatt agtttagttt agtttagttg gtatgtcaac acaattaatt

2281 aatattatat atggatgttg acagtggcgt gagttatgca aagcattcct tcaagaagca

2341 aaatggtcga acaacaaaat cattccagca tttagcaagt acctggaaaa tgcatcggtg

2401 tcctcctccg gtgtggcttt gcttgctcct tcctacttct cagtgtgcca acaacaagaa

2461 gatatctcag accatgctct tcgttcttta actgatttcc atggccttgt gcgctcctca

2521 tgcgtcattt tcagactctg caatgatttg gctacctcag cggtgtgtaa ttaattacct

2581 taattaattt gtaacacttg ttagactaat atatataggt gtgtctgtta attactacag

2641 gctgagctag agaggggtga gacgacaaat tcaataatat cttatatgca tgagaatgac

2701 ggcacttctg aagagcaagc acgtgaggag ttgagaaaat tgatcgatgc agagtggaag

2761 aagatgaacc gagagcgagt ttcagattct acactactcc caaaagcttt tatggaaata

2821 gctgttaaca tggctcgagt ttcgcattgc acataccaat atggagacgg acttggaagg

2881 ccagactacg ccacagagaa tagaatcaag ttgctactta tagacccctt tccaatcaat

2941 caactaatgt acgtgtaaca acacaatata aacacttttc tacaagtata tatttgttta

3001 atttcggtgt tgaattaggg gtcaacacag ctatatatac ttcaatggac caactcaacc

3061 aatctgataa gagaaaaaaa ataaaaataa ggttaggtta actttgtata aatccaagtt

3121 agatatcaag ttt

SEQ ID NO：8山葛藤野变种(Pueraria montana var.lobata)异戊二烯合酶多肽序列

MATNLLCLSNKLSSPTPTPSTRFPQSKNFITQKTSLANPKPWRVICATSSQFTQITEHN

SRRSANYQPNLWNFEFLQSLENDLKVEKLEEKATKLEEEVRCMINRVDTQPLSLLELI

DDVQRLGLTYKFEKDIIKALENIVLLDENKKNKSDLHATALSFRLLRQHGFEVSQDV

FERFKDKEGGFSGELKGDVQGLLSLYEASYLGFEGENLLEEARTFSITHLKNNLKEGI

NTKVAEQVSHALELPYHQRLHRLEARWFLDKYEPKEPHHQLLLELAKLDFNMVQTL

HQKELQDLSRWWTEMGLASKLDFVRDRLMEVYFWALGMAPDPQFGECRKAVTKM

FGLVTIIDDVYDVYGTLDELQLFTDAVERWDVNAINTLPDYMKLCFLALYNTVNDT

SYSILKEKGHNNLSYLTKSWRELCKAFLQEAKWSNNKIIPAFSKYLENASVSSSGVAL

LAPSYFSVCQQQEDISDHALRSLTDFHGLVRSSCVIFRLCNDLATSAAELERGETTNSI

ISYMHENDGTSEEQAREELRKLIDAEWKKMNRERVSDSTLLPKAFMEIAVNMARVS

HCTYQYGDGLGRPDYATENRIKLLLIDPFPINQLMYV

序列表

<110>阿纳斯塔西奥斯·梅利斯

     加州大学董事会

<120>使用经遗传工程改造的微藻、蓝细菌或细菌生产短链

     挥发性烃类

<130>18941H-004010PC

<140>WO PCT/US07/7246S

<141>2007-06-29

<150>US 60/806,244

<151>2006-06-29

<150>US 11/770,412

<151>2007-06-28

<160>13

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1788

<212>DNA

<213>银白杨(Populus alba)

<220>

<223>银白杨异戊二烯合酶(IspS)cDNA

<400>1

<210>2

<211>595

<212>PRT

<213>银白杨(Populus alba)

<220>

<223>银白杨异戊二烯合酶(IspS)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(37)

<223>叶绿体转运肽

<400>2

<210>3

<211>1776

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：调整了密码子的合成DNA构建物，其用于在微藻莱茵

     衣藻中表达的省略了叶绿体靶向序列并且带有血凝素(HA)

     表位标签的银白杨IspS基因(Cr-IspS)

<221>基因

<222>(100)..(1776)

<223>省略了叶绿体靶向序列且针对在微藻莱茵衣藻中表达进行了

     密码子优化的银白杨IspS基因(Cr-IspS)

<400>3

<210>4

<211>591.

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于在微藻莱茵衣藻中表达的省略了叶绿体靶向

     序列并且带有血凝素(HA)表位标签的银白杨异戊二烯合酶(IspS)融合蛋白

<220>

<221>肽

<222>(2)..(10)

<223>血凝素(HA)表位标签肽

<220>

<221>肽

<222>(12)..(20)

<223>血凝素(HA)表位标签肽

<220>

<221>肽

<222>(22)..(30)

<223>血凝素(HA)表位标签肽

<220>

<221>肽

<222>(34)..(591)

<223>省略了叶绿体靶向序列的银白杨异戊二烯合酶(IspS)

<400>4

<210>5

<211>3965

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：密码子优化的合成DNA构建物，其用于在带

     有beta-内酰胺酶基因(反向互补体)的蓝细菌(Synechocystis

     sp.cyanobacteria)中表达的省略了叶绿体靶向序列的

     银白杨IspS基因(Ss-IspS)

<220>

<221>基因

<222>互补体(1084)..(1944)

<223>β-内酰胺酶(反向互补)

<220>

<221>基因

<222>(2256)，.(3890)

<223>省略了叶绿体靶向序列且针对在蓝细菌中(Synechocystis sp.

     cyanobcteria)表达进行了密码子优化的银白杨IspS基因(Ss-IspS)

<400>5

<210>6

<211>544

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：来自蓝细菌(Synechocystis sp.cyanobacteria)

     (Ss-IspS)表达质粒pIspS的65kD省略了叶绿体靶向序列的银白杨

      异戊二烯合酶(IspS)基因融合蛋白

<400>6

<210>7

<211>3133

<212>DNA

<213>山葛藤野变种(Pueraria montana var.1obata

<220>

<223>葛藤异戊二烯合酶(IspS)cDNA

<400>7

<210>8

<211>608

<212>PRT

<213>山葛藤野变种(Pueraria montana var.1obata)

<220>

<223>葛藤异戊二烯合酶(IspS)

<400>8

<210>9

<211>595

<212>PRT

<213>美洲山杨(Populus tremuloides)

<220>

<223>美洲山杨异戊二烯合酶(IspS)

<400>9

<210>10

<211>595

<212>PRT

<213>黑杨

<220>

<223>黑杨异戊二烯合酶(IspS)

<400>10

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：省略了叶绿体转运肽的银白杨

     异戊二烯合酶(IspS)成熟蛋白的起始序列

<400>11

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR扩增引物IspS_F_NdeI

<400>12

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR扩增引物IspS_R_HindIII

<400>13

Claims (26)

1.一种在选自微观藻类、蓝细菌或光合细菌的微生物中生产异戊二烯烃类的方法，所述方法包括：

向所述微生物中引入包含编码异戊二烯合酶的核酸的表达盒；和

在表达所述编码异戊二烯合酶之核酸的条件下，培养所述微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为微观藻类，该微观藻类是绿藻。

3.根据权利要求2所述的方法，其中绿藻选自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、小球藻(Chlorella vulgaris)或盐生杜氏藻(Dunaliella salina)。

4.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为蓝细菌。

5.根据权利要求4中所述的方法，其中所述蓝细菌为集胞藻(Synechocystis sp.)。

6.根据权利要求1中所述的方法，其中所述微生物为光合细菌。

7.根据权利要求6中所述的方法，其中所述光合细菌为深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸编码包含SEQ IDNO：2之53-595号氨基酸残基的异戊二烯合酶。

9.一种选自微观藻类细胞、蓝细菌细胞和光合细菌细胞的微生物，其中所述微生物包含编码异戊二烯合酶并与启动子有效连接的异源核酸。

10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述微生物为微观藻类，该微观藻类是绿藻。

11.根据权利要求10所述的微生物，其中所述绿藻选自莱茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。

12.根据权利要求9中所述的微生物，其中所述微生物是蓝细菌。

13.根据权利要求12中所述的微生物，其中所述蓝细菌为集胞藻。

14.根据权利要求9所述的微生物，其中所述微生物为光合细菌。

15.根据权利要求14中所述的微生物，其中所述光合细菌为深红红螺菌。

16.根据权利要求9中所述的微生物，其中所述异源核酸编码包含SEQ ID NO：2之53-595号氨基酸残基的异戊二烯合酶。

17.一种在包含编码异戊二烯合酶之异源核酸的微生物中生产异戊二烯烃类的方法，该微生物选自微观藻类、蓝细菌、光合细菌和非光合细菌，所述方法包括：

在表达所述异戊二烯合酶基因的条件下，在封闭的生物反应器中大规模培养所述微生物；和

收集由所述微生物生产的挥发性异戊二烯烃类。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物为微观藻类，该微观藻类为绿色微观藻类。

19.根据权利要求18中所述的方法，其中所述绿藻选自莱茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。

20.根据权利要求17中所述的方法，其中所述微生物为蓝细菌。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述蓝细菌为集胞藻。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物为光合细菌。

23.根据权利要求22中所述的方法，其中所述光合细菌为深红红螺菌。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物为非光合细菌。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非光合细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。

26.根据权利要求17所述的方法，其中所述异源核酸编码包含SEQ ID NO：2之53-595号氨基酸残基的异戊二烯合酶。

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