CN103476926A - 使用两种类型的ispg酶改善异戊二烯产量的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过使用重组工程改造的细胞产生异戊二烯的组合物和方法，所述细胞除了异戊二烯合酶外还利用双IspG酶系统。

Description

使用两种类型的ISPG酶改善异戊二烯产量的组合物和方法

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求2010年12月22日提交的美国临时专利申请No.61/426,505的优先权，该临时专利申请的内容据此以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明整体涉及通过利用两种类型的IspG酶改善来自重组细胞的异戊二烯产量的组合物和方法。

发明背景

异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多种合成聚合物(最值得注意的是合成橡胶)的关键原料。异戊二烯由多种微生物、植物和动物物种自然产生。具体地讲，已经发现了两种进行异戊二烯生物合成的途径：甲羟戊酸(MvA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径。然而，天然存在的生物体的异戊二烯产率没有商业吸引力。每年大约有800,000吨顺式聚异戊二烯由异戊二烯的聚合反应产生；这种聚异戊二烯大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯还通过共聚反应用作其他产品中的合成弹性体，这些产品例如为鞋类、机械产品、医疗产品、体育用品和乳胶。

目前，轮胎和橡胶工业立足于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶得自存在于非洲雨林的橡胶树或植物的乳状汁液。合成橡胶则主要基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，丁二烯作为乙烯和丙烯制造的副产物而获得。

尽管可以通过分馏石油获得异戊二烯，但该材料的纯化昂贵而且耗时。C5烃流的石油裂解仅生成约15％的异戊二烯。因此，需要更经济的产生异戊二烯的方法。具体地讲，以足以满足稳定商业过程的需求的速率、滴度和纯度产生异戊二烯的方法是所需的。还需要的是由低成本的起始物质产生异戊二烯的系统。本文所述的发明解决了这些需要并且还提供了另外的有益效果。

将本说明书中引述的所有出版物、专利申请和专利均以引用的方式并入本文，就如同具体且独立地表明将每篇独立的出版物、专利申请或专利以引用的方式并入本文一样。具体地讲，将本文引述的所有出版物明确地以引用的方式并入本文以描述和公开可结合本发明使用的组合物和方法。

发明内容

本发明尤其提供以提高的量产生异戊二烯的组合物和方法，其中使用两种类型的1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS或IspG)IspG酶和/或其他DXP途径核酸和多肽、铁-硫簇相互作用氧化还原核酸和多肽以及异戊二烯合酶核酸和多肽。

在一个方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，该细胞包含(i)编码第一物种的第一1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的异源核酸，或编码第一物种的IspG多肽的内源核酸的一个或多个拷贝；(ii)编码第二物种的第二IspG多肽的异源核酸，或编码第二物种的IspG多肽的内源核酸的一个或多个拷贝，其中第二物种不同于第一物种；(iii)编码至少一种另外的DXP途径酶的异源核酸；和(iv)编码异戊二烯合酶多肽的核酸。在另一方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，该细胞用以下核酸转化：(i)编码第一物种的第一1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的核酸；(ii)编码第二物种的第二IspG多肽的核酸，其中第二物种不同于第一物种；(iii)编码至少一种DXP途径酶的核酸以及(iv)编码异戊二烯合酶多肽的核酸。在这些方面的任何一者中，第一IspG来自T.elongatus。在其他方面，第二IspG来自大肠杆菌(E.coli)。在一些方面，该另外的DXP途径酶选自DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDR(IspH)和IDI。在一些方面，该另外的DXP途径酶可以为以下任意一者或多者：DXS、DXR、HDR(IspH)和IDI。

在本文的任何方面，重组细胞还包含编码铁-硫簇相互作用氧化还原多肽的异源核酸，或编码铁-硫簇相互作用氧化还原多肽的内源核酸的一个或多个拷贝。在一些方面，铁-硫簇相互作用氧化还原多肽选自铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白。

在本文的任何方面，重组细胞还包含编码DXP途径相关多肽(如DXP伴侣蛋白)的异源核酸，或编码DXP途径相关多肽(如DXP伴侣蛋白)的内源核酸的一个或多个拷贝。在某些方面，DXP途径相关多肽选自伴侣素，其中包括表现出熟知的蛋白折叠和/或重折叠功能的酶以及功能性铁-硫簇的运输、维持和/或修复中涉及到的酶。

在本文的任何方面，重组细胞还包含编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的一个或多个异源核酸，或编码IDI多肽的内源核酸的一个或多个拷贝。

在本文的任何方面，重组细胞还包含编码MVA途径多肽的一个或多个异源核酸，或编码MVA途径多肽的内源核酸的一个或多个拷贝。

在本文的任何方面，异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽。在本文的任何方面，异戊二烯合酶多肽为银白杨(P.alba)异戊二烯合酶。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为得自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂交体(Populus alba x Populus tremula)的多肽。在其他方面，异戊二烯合酶多肽选自葛麻姆(Pueraria montana)或野葛(Pueraria lobata)、山杨(Populustremuloides)、银白杨(Populus alba)、黑杨(Populus nigra)和毛果杨(Populustrichocarpa)。在其他方面，植物异戊二烯合酶多肽为葛根异戊二烯合酶多肽。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为天然存在的异戊二烯合酶多肽。在其他方面，异戊二烯合酶多肽为非天然存在的异戊二烯合酶多肽。在其他方面，异戊二烯合酶多肽为如WO2009/041581、美国专利公布No.2010/0003716、WO2010/0124146或美国专利申请13/283,564中所公开的异戊二烯合酶变体或异戊二烯合酶突变体。

在本文的任何方面，重组细胞为细菌、藻类、真菌或酵母细胞。在一些方面，重组细胞为细菌细胞。在一些方面，细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在一些方面，细菌细胞为大肠杆菌。在其他方面，细菌细胞选自大肠杆菌、柠檬假交替单胞菌(P.citrea)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodluranls)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、白色链霉菌(S.albus)、变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)、假单胞菌(Pseudomonassp.)和产碱假单胞菌(P.alealigenes)细胞。在本文的任何方面，核酸可在一个或多个质粒上。

在另一方面，本发明还提供包含如本文所公开的任何重组细胞的细胞培养物，其中该细胞培养物能够产生至少约8.4g/l的异戊二烯。

在另一方面，本发明还提供产生异戊二烯的方法，该方法包括：(a)将本文所公开的任何重组细胞在适于产生异戊二烯的条件下培养，以及(b)产生异戊二烯。在一些方面，该方法还包括回收异戊二烯。在其他方面，重组细胞产生大于约8.4g/l的异戊二烯。

附图说明

图1示出了Ptac鱼腥藻ispH-T elong ispG系统aspA term/pEWL454的质粒图谱。kan-卡那霉素抗生素抗性标记；p15A ori-质粒复制起点；RBS一核糖体结合位点。Tac启动子、aspA终止子以及编码IspH和IspG系统组分的基因的位置在图谱上指出；鱼腥藻ispH编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(IspH)，T elong gcpE编码1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)，T elong petF编码铁氧还蛋白(Fd)，并且T elong petH编码铁氧还蛋白-NADP⁺氧化还原酶(Fpr)。

图2显示了在REM F2_18的15L规模发酵中异戊二烯滴度与时间的关系图。

图3显示了异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier et al.，Progress in Lipid Res.44：357-429，2005(F.Bouvier等人，《脂类研究进展》，第44卷，第357-429页，2005年))。下面说明包括途径中每种多肽的别名以及公开测量所指示多肽的活性的测定法的参考文献(据此将这些参考文献中的每一篇各自全文以引用方式并入本文中)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰辅酶A乙酰转移酶，MvaE，EC2.3.1.9。测定法：J.Bacteriol.184：2116-2122，2002(《细菌学杂志》，第184卷，第2116-2122页，2002年)；HMGS；羟甲基戊二酰辅酶A合酶，MvaS，EC2.3.3.10。测定法：J.Bacteriol.184：4065-4070，2002(《细菌学杂志》，第184卷，第4065-4070页，2002年)；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，MvaE，EC1.1.1.34。测定法：J.Bacteriol.184：2116-2122，2002(《细菌学杂志》，第184卷，第2116-2122页，2002年)；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC2.7.1.36。测定法：Curr Genet19：9-14，1991(《当代遗传学》，第19卷，第9-14页，1991年)；PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC2.7.4.2，测定法：Mol.Cell.Biol.11：620-631，1991(《分子与细胞生物学》，第11卷，第620-631页，1991年)；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVDl，EC4.1.1.33。测定法：Biochemistry，33：13355-13362，1994(《生物化学》，第33卷，第13355-13362页，1994年)；IDI；异戊烯基二磷酸δ-异构酶，IDIl，EC5.3.3.2。测定法：J.Bio1.Chem.264：19169-19175，1989(《生物化学杂志》，第264卷，第19169-19175页，1989年)；DXP途径：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC2.2.1.7。测定法：PNAS，94：12857-62，1997(《美国国家科学院院刊》，第94卷，第12857-12862页，1997年)；DXR；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，dxr，EC2.2.1.7。测定法：Eur.J.Biochem.269：4446-4457，2002(《欧洲生物化学杂志》，第269卷，第4446-4457页，2002年)；MCT；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合酶，IspD，EC2.7.7.60。测定法：PNAS97：6451-6456，2000(《美国国家科学院院刊》，第97卷，第6451-6456页，2000年)；CMK；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶，IspE，EC2.7.1.148。测定法：PNAS97：1062-1067，2000(《美国国家科学院院刊》，第97卷，第1062-1067页，2000年)；MCS；2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC4.6.1.12。测定法：PNAS96：11758-11763，1999(《美国国家科学院院刊》，第96卷，第11758-11763页，1999年)；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二-磷酸合酶，ispG，EC1.17.4.3。测定法：J.Org.Chem.70：9168-9174，2005(《有机化学杂志》，第70卷，第9168-9174页，2005年)；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶，IspH，EC1.17.1.2。测定法：JACS126：12847-12855，2004(《美国化学会志》，第126卷，第12847-12855页，2004年)。

图4显示了在REM F2_18和REM H8-12的单独15L规模发酵中异戊二烯滴度与时间的关系图。

具体实施方式

本发明尤其提供用于提高异戊二烯产生的系统、组合物和方法，方式是用两种类型的IspG酶、DXP途径酶和异戊二烯合酶多肽进行重组细胞工程改造，使得可产生提高量的异戊二烯。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都是本发明所属领域的技术人员通常所理解的意思。以下文献给技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般词典：Singleton，etal.，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，2nd ed.，John Wiley and Sons，New York(1994)(Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》，第2版，纽约约翰威立父子出版公司，1994年)；以及Hale＆Marham，The Harper Collins Dictionary ofBiology，Harper Perennial，N.Y.(1991)(Hale和Marham，《哈勃考林斯生物学词典》，纽约Harper Perennial，1991年)。应当理解，本发明并不限于所述的具体方法、规程和试剂，它们可以有所不同。本领域的技术人员还将了解，也可以用类似于或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料实施或测试本发明。本文所提供的标题并未限制可参考作为一个整体的说明书的本发明的各个方面。

如本文所用，术语“异戊二烯”或“2-甲基-1，3-丁二烯”(CAS#78-79-5)是指从3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)中脱去焦磷酸的直接和最终挥发性C5烃产物，并且不涉及一个或多个异戊烯基二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。术语“异戊二烯”一般不旨在限于其制备方法。

如本文所用，术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽的片段和融合多肽。

如本文所用，“分离的多肽”不是多肽文库(例如2、5、10、20、50或更多个不同多肽的文库)的一部分，并且与其在自然界中一起存在的至少一种组分分离。分离的多肽可例如通过编码多肽的重组核酸的表达而获得。分离的多肽可以是非天然存在的多肽。

所谓“异源多肽”，是指由源自与宿主细胞不同的生物体、物种或菌株的核酸序列编码的多肽。在一些方面，异源多肽不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型多肽。

如本文所使用，“核酸”是指以单股或双股形式共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。

所谓“重组核酸”，是指这样的所关注核酸，其缺少在该所关注核酸旁侧的、所关注核酸所源自的生物体的天然存在的基因组中的一种或多种核酸(如，基因)。因此，该术语包括(例如)掺入载体中、掺入自主复制型质粒或病毒中或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者独立于其他序列作为单独的分子(如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化制备的cDNA片段)存在的重组DNA。在一些情况下，重组核酸是编码非天然存在的多肽的核酸。

所谓“异源核酸”，是指源自与宿主细胞不同的生物体、物种或菌株的核酸序列。在一些方面，异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型核酸。

如本文所用，短语“与DXP途径相关的各种核酸和多肽”或“DXP途径相关核酸或多肽”是指直接或间接地与DXP途径多肽或核酸相互作用的任何核酸或多肽，包括但不限于萜烯合酶(如，罗勒烯合酶、金合欢烯合酶和青蒿素合酶)。

如本文所用，除非另外明确指明，否则术语“一个”、“一种”等是指一个或多个、一种或多种。

对本文中的“约”值或参数的参考包括(并描述)涉及该值或参数自身的方面。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括限定该范围的端值在内。

应当理解，本文所述的本发明的方面包括“包含”、“由组成”和“基本上由组成”的各个方面。

能够产生异戊二烯的重组细胞

如本文更详细地描述和进一步举例说明，可对能够产生异戊二烯的重组细胞进行工程改造以提高异戊二烯的产生。如本文所述，提高的异戊二烯产生可通过包含以下核酸的能够产生异戊二烯的重组细胞实现：(i)编码第一物种的第一1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的异源核酸，或编码第一物种的IspG多肽的内源核酸的一个或多个拷贝；(ii)编码第二物种的第二IspG多肽的异源核酸，或编码第二物种的IspG多肽的内源核酸的一个或多个拷贝，其中第二物种不同于第一物种；(iii)编码至少一种另外的DXP途径酶的异源核酸；和(iv)编码异戊二烯合酶多肽的核酸。在一个方面，第一物种的第一IspG多肽来自大肠杆菌。在另一方面，第二物种的第二IspG多肽来自T.elongatus IspG。

IspG酶和系统

IspG酶是下游DXP途径的一部分。IspG核酸编码1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)或HDS多肽，其将2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)转化成(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。

一些已进行工程改造以利用类异戊二烯生物合成的DXP途径的重组细胞(如，BL21大肠杆菌菌株)具有的IspG活性过低，而不能支持由葡萄糖高产率地生成异戊二烯。因此，对于异戊二烯的商业生产，这些重组细胞不足以产生所需的商业相关水平的异戊二烯。因此，本发明提供了通过提高IspG多肽活性而提高异戊二烯产生的组合物和方法。

对于提高IspG多肽活性，一种选择是更多地表达内源大肠杆菌IspG系统。本文所述的系统、重组细胞组合物和方法利用不同的方法，其中IspG多肽活性和后续异戊二烯的产生通过两种类型的IspG多肽编码核酸的过表达而增强。在一个方面，这两种类型的IspG多肽为大肠杆菌和T.elongatus IspG多肽。在一些方面，IspG多肽由异源核酸编码。在其他方面，IspG多肽由引入宿主细胞(如，大肠杆菌)中的内源核酸的一个或多个拷贝编码。在任何这些方面，核酸可通过一个或多个质粒引入宿主细胞(如，大肠杆菌)。在其他方面，核酸可通过整合进宿主细胞的染色体而引入宿主细胞(如，大肠杆菌)。本领域的技术人员将认识到，整合应发生在对宿主细胞非必需的位置处。例如，在细菌细胞(如，大肠杆菌细胞)中，整合到复制起点(或染色体的任何其他必需区域)将使得细菌不能复制。因此，应当小心避免整合到宿主生物体中染色体的必需位置。

大肠杆菌IspG系统包含但不限于酶IspG(由基因ispG编码)和所需的黄素氧还蛋白氧化还原伴侣FldA(由基因fldA编码)。

T.elongatus IspG系统包含但不限于酶IspG(由基因gcpE编码)和所需的铁氧还蛋白氧化还原伴侣Fd(由petF基因编码)以及非必需的铁氧还蛋白-NADP(+)氧化还原酶氧化还原伴侣Fpr(由petH基因编码)。

在一些情况下，Fpr活性不是T.elongatus IspG在大肠杆菌内发挥作用所必需的，其中据发现T.elongatus IspG的活性依赖于Fd辅因子。大肠杆菌的fpr基因是非必需的，并且T.elongatus IspG在大肠杆菌内的活性依赖于T.elongatus Fd的共表达。

不受理论的约束，据信，大肠杆菌IspG系统和T.elongatus IspG系统最终通过一些黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP(+)氧化还原酶活性从NADPH获得执行其催化功能所必需的电子。具有黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP(+)氧化还原酶活性的酶已在体外经证实起着将电子转运到IspG活性所必需的期望黄素氧还蛋白和铁氧还蛋白辅因子的作用，然而这些还原酶的体内生理相关性尚不明确，因此不能进行预测。

示例性多肽和核酸

如上所述，对本发明的重组细胞及其子代进行工程改造，以具有两种类型的IspG酶、异戊二烯合酶以及一种或多种其他DXP途径多肽。在某些方面，细胞还可包含各种铁-硫簇相互作用氧化还原多肽和核酸、MVA途径多肽和核酸、DXP途径相关多肽(如，DXP伴侣蛋白)和核酸、PGL多肽和核酸以及IDI多肽和核酸。

多肽包括多肽、蛋白质、肽、多肽的片段和融合多肽。在一些方面，融合多肽包含第一多肽(如铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽(如，DXP伴侣蛋白)、异戊二烯合酶多肽和IDI多肽或其催化活性片段)的部分或全部，并可任选地包含第二多肽(如有利于融合多肽的纯化或检测的肽，诸如组氨酸标签)的部分或全部。在一些方面，融合多肽具有两种或更多种DXP途径多肽的活性。

在特定方面，核酸包含任何铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、IspG核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸(如DXP伴侣蛋白)、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的片段或整个核酸序列。在一些方面，核酸包含铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、IspG、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸中至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800个或更多个邻接核苷酸。在一些方面，核酸与野生型(即在自然界中存在的)IspG核酸、铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的序列相比具有一个或多个突变。在一些方面，核酸具有增加IspG核酸、铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的转录或翻译的一个或多个突变(如，沉默突变)。在一些方面，核酸为编码IspG多肽、铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的任何核酸的简并变体。

示例性异戊二烯合酶与DXP途径多肽和核酸的登录号在WO2009/076676的附录1中列出并且也在本文进一步详细描述。

示例性铁-硫簇相互作用氧化还原多肽和核酸

铁-硫簇相互作用氧化还原多肽在类异戊二烯生物合成的DXP途径中发挥着不可或缺的作用。示例性铁-硫簇相互作用氧化还原多肽包括具有铁-硫簇相互作用氧化还原多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可通过使用测量甲硝唑[1-(2-羟基乙基)-2-甲基-5-硝基咪唑]还原率的氢化酶联测定法(Chen and Blanchard，Analytical Biochem，93：216-222(1979)(Chen和Blanchard，《分析生物化学》，第93卷，第216-222页，1979年))，将标准方法用于确定多肽是否具有铁-硫簇相互作用氧化还原多肽活性。

示例性铁-硫簇相互作用氧化还原多肽核酸包括编码具有铁-硫簇相互作用氧化还原多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性铁-硫簇相互作用氧化还原多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变多肽和核酸。

铁-硫簇相互作用氧化还原多肽是一种能够将电子转移到含铁-硫簇的多肽的多肽。铁-硫簇相互作用氧化还原多肽包括但不限于黄素氧还蛋白(如黄素氧还蛋白I)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(如铁氧还蛋白I)、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶，及其编码基因或多肽(如fpr或fldA)。例如，DXP途径多肽HDS(GcpE)是具有[4Fe-4S]²⁺中心的金属酶，并在黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶的存在下通过还原[4Fe-4S]²⁺中心介导的两个连续单电子转移而催化cMEPP还原成HMBPP(参见Wolff etal.，FEBS Letters，541：115-120(2003)(Wolff等人，《欧洲生物化学学会联盟通讯》，第541卷，第115-120页，2003年))。相似地，DXP途径多肽HDR(LytB)也是在黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH体系的存在下通过两个连续单电子转移而催化HMBPP还原成IPP或DMAPP的Fe/S蛋白。参见例如Seemann，M.et al.Agnew.Chem.Int.Ed.，41：4337-4339(2002)(Seemann，M.等人，《德国应用化学》，第41卷，第4337-4339页，2002年)；Wolff，M.et al.，FEBS Letters，541：115-120(2003)(Wolff，M.等人，《欧洲生物化学学会联盟通讯》，第541卷，第115-120页，2003年)。

黄素氧还蛋白是一种能够转移电子并含有辅基黄素单核苷酸的蛋白。在大肠杆菌(Escherichia coli)中，黄素氧还蛋白由fldA基因编码并由含FAD的蛋白NADPH：铁氧还蛋白氧化还原酶还原，同时在类异戊二烯生物合成的DXP途径中发挥着不可或缺的作用(参见例如Kia-Joo，P.et al.FEBS Letters，579：3802-3806，2005(Kia-Joo，P.等人，《欧洲生物化学学会联盟通讯》，第579卷，第3802-3806页，2005年))。

铁氧还蛋白是一种能够转移电子并包含等量的铁和不稳定硫、同时在类异戊二烯生物合成的DXP途径中发挥着不可或缺的作用的蛋白质。例如，已表明植物和蓝细菌中的HDS为铁氧还蛋白、而不是黄素氧还蛋白依赖性酶(Seemannet al.，FEBS Lett.，580(6)：1547-52(2006)(Seemann等人，《欧洲生物化学学会联盟通讯》》，第580卷第6期，第1547-1552页，2006年))。

Fpr编码黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白NADPH-氧化还原酶并通过FldA为HDS和HDR提供源自NADPH的必要电子以执行它们的催化功能(综述报告：L.A.Furgerson，The Mevalonate-Independent Pathway to IsoprenoidCompounds：Discovery，Elucidation，and Reaction Mechanisms，publishedFebruary13，2006(L.A.Furgerson，《类异戊二烯化合物的非甲羟戊酸依赖性途径：发现、说明和反应机理》，2006年2月13日发表))。

示例性DXP途径多肽和核酸

示例性DXP途径多肽包括但不限于下列多肽中的任一者：DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽以及具有DXP途径多肽中的一种、两种或更多种的活性的多肽(如，融合多肽)。具体地讲，DXP途径多肽包括具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性DXP途径核酸包括编码具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途径多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。

具体地讲，DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或体内转化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。

DXR多肽将1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)转化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化DXP的能力来确定多肽是否具有DXR多肽活性。

MCT多肽将2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)转化为4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化MEP的能力来确定多肽是否具有MCT多肽活性。

CMK多肽将4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME)转化为2-二磷酸4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-MEP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化CDP-ME的能力来确定多肽是否具有CMK多肽活性。

MCS多肽将2-磷酸-4-(胞苷-5′-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-MEP)转化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化CDP-MEP的能力来确定多肽是否具有MCS多肽活性。

HDS多肽将2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2，4-环二磷酸转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化ME-CPP的能力来确定多肽是否具有HDS多肽活性。

HDR多肽将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-l-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)转化为异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。在一个实施例中，ispH基因可用于编码HDR多肽。IspH也称为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶、4Fe-4S蛋白、LytB、ECK0030、JW0027、lytB、yaaE和b0029。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化HMBPP的能力来确定多肽是否具有HDR多肽活性。

IDI多肽将异戊烯基二磷酸转化成二甲基烯丙基二磷酸。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物中或在体内转化异戊烯基二磷酸的能力来确定多肽是否具有IDI多肽活性。

与DXP途径相关的示例性多肽和核酸

各种与DXP途径相关的多肽(如DXP伴侣蛋白)和编码那些多肽的核酸可结合异戊二烯合酶、DXP途径多肽和/或MVA途径多肽中的任何一者或多者使用。在一个实施例中，可使用伴侣素。伴侣素有利于蛋白的折叠和去折叠，这是要获得功能性三级结构所需的活性。此类分子伴侣涉及蛋白质三维结构的生成和修复，从而用于实现和维持蛋白质的功能。大肠杆菌伴侣素DnaK和GroEL/GroES是此类酶充分表征的例子(Bukau et al.，Cell，92：351-366(1998)(Bukau等人，《细胞》，第92卷，第351-366页，1998年))。伴侣素有利于酶催化所需的辅因子的运输、维持和修复。在一个实施例中，此类伴侣素可以是铁-硫簇辅因子的功能所涉及的那些酶分子伴侣。大肠杆菌的iscR操纵子基因hreA、hrcB和iscA以及erpA和另外的A型载体蛋白是在大肠杆菌内涉及铁-硫簇运输、维持和修复的那些中的可用伴侣素类别的非限制性例子。(Tokumoto and Takahashi，J.Biochem.，130：63-71(2001)(Tokumoto和Takahashi，《生物化学杂志》，第130卷，第63-71页，2001年)；Loiseau etal.，PNAS，104(34)：13626-13631(2007)(Loiseau等人，《美国国家科学院院刊》，第104卷第34期，第13626-13631页，2007年)；Vinella et al.，PLOS Genetics，5(5)：1-16of e1000497(2009)(Vinella等人，《公共科学图书馆-遗传学》，第5卷第5期，e1000497第1-16页，2009年))。在另一个实施例中，可以使用iscS基因。除了在从头铁-硫簇生物发生中更好表征的作用外，iscS基因也已涉及被损坏的铁-硫簇的修复并可用作所述分子伴侣的一个例子(Djaman et al.，J.Biol.Chem.，279(43)：44590-44599(2004)(Djaman等人，《生物化学杂志》，第279卷第43期，第44590-44599页，2004年)。相似地，由大肠杆菌的ytfE编码的Ric蛋白质和由ftn编码的铁蛋白A是铁-硫簇修复中涉及到的伴侣素的另外例子(Justino et al.，Biometals，22：99-108(2009)(Justino等人，《生物金属》，第22卷，第99-108页，2009年)；Justino et al.，J.Biol.Chem.，282(14)：10352-10359(2007)(Justino等人，《生物化学杂志》，第282卷第14期，第10352-10359页，2007年)；Bitoun et al.，Biometals，21：693-703(2008)(Bitoun等人，《生物金属》，第21卷，第693-703页，2008年)。

示例性异戊二烯合酶多肽和核酸

如上所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变型多肽和核酸。

在本发明的一些方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述的重组细胞还包含编码异戊二烯合酶多肽或具有异戊二烯合酶活性的多肽的一种或多种核酸。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为内源多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子。在一些方面，使用不止一个编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸(如，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的2个、3个、4个或更多个拷贝)。在特定方面，对细胞进行工程改造，以相对于野生型细胞过表达内源异戊二烯合酶途径多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸可操作地连接至弱启动子。

在一些方面，异戊二烯合酶多肽为异源多肽。在一些方面，细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的不止一个拷贝。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接至弱启动子。

编码异戊二烯合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组，或者可在细胞中稳定表达。编码异戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于载体上。

在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，诸如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或诸如(Populus alba x Populus tremula)的杂交体的多肽。在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸为来自以下的多肽或核酸：葛麻姆(葛根)(Sharkey et al.，Plant Physiology137：700-712，2005(Sharkey等人，《植物生理学》，第137卷，第700-712页，2005年))、野葛、杨树(诸如银白杨、黑杨、毛果杨或(Populus alba x tremula)(CAC35696)Miller et al.，Planta213：483-487，2001(Miller等人，《植物》，第213卷，第483-487页，2001年))、白杨类(诸如山杨)(Silver et al.，JBC270(22)：13010-1316，1995(Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷第22期，第13010-1316页，1995年))或英国栎(Quercus robur)(Zimmer等人，WO98/02550)。合适的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所标示的那些。在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸不是来自英国栎的天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸为来自英国栎的天然存在的多肽或核酸之外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自杨树的天然存在的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自杨树的天然存在的多肽或核酸。

在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸(例如，来自杨属的天然存在的多肽或核酸)。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的变体(例如，来自杨属的野生型或天然存在的多肽或核酸的变体)。

在一些方面，异戊二烯合酶多肽为变体。异戊二烯合酶的变体可具有改善的活性，诸如改善的酶活性。在一些方面，异戊二烯合酶变体具有其他改善的特性，诸如改善的稳定性(如热稳定性)和/或改善的可溶性。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的活性，诸如改善的催化活性。活性(如催化活性)的增加可为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意一者。在一些方面，诸如催化活性的活性增加为至少约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任意一者。在一些方面，诸如催化活性的活性增加为约10％至约100倍(如，约20％至约100倍、约50％至约50倍、约1倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍)。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的可溶性。可溶性的增加可为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意一者。可溶性的增加可为至少约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任意一者。在一些方面，可溶性的增加为约10％至约100倍(如，约20％至约100倍、约50％至约50倍、约1倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为天然存在的异戊二烯合酶的变体，并与天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的稳定性(诸如热稳定性)。

在一些方面，变体具有野生型或天然存在的异戊二烯合酶的活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％。变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶共有序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体可具有与野生型或天然存在的异戊二烯合酶至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％中任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体具有与野生型或天然存在的异戊二烯合酶约70％至约99.9％、约75％至约99％、约80％至约98％、约85％至约97％或约90％至约95％中任一者的氨基酸序列同一性。

在一些方面，变体在野生型或天然存在的异戊二烯合酶中包含突变。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸置换。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶之间的不同氨基酸残基的数量可为一个或多个，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。天然存在的异戊二烯合酶可包括来自植物的任何异戊二烯合酶，例如葛根异戊二烯合酶、杨树异戊二烯合酶、英国栎异戊二烯合酶和柳树异戊二烯合酶。在一些方面，变体为来自银白杨的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，来自银白杨的异戊二烯合酶的变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些方面，变体为截短的银白杨异戊二烯合酶。在一些方面，编码变体(如来自银白杨的异戊二烯合酶的变体)的核酸为密码子优化的(例如，基于在其中表达异源异戊二烯合酶的宿主细胞而进行密码子优化的)。

本文提供的异戊二烯合酶多肽可以是WO2009/132220、WO2010/124146、美国专利申请公布No.2010/0086978、美国专利申请13/283,564和PCT/US2011/058188中所述的异戊二烯合酶或异戊二烯合酶变体中的任何一种，这些专利关于异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体的内容整体明确地以引用方式并入本文。合适的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所标示的那些。可用于本文所述的组合物或方法(包括用于制备编码异戊二烯合酶的微生物的方法)的任何一种中的异戊二烯合酶的类型还在国际专利申请公布No.W02009/076676、No.WO2010/003007、No.WO2009/132220、No.WO2010/031062、No.WO2010/031068、No.WO2010/031076、No.WO2010/013077、No.WO2010/031079、No.WO2010/148150、No.WO2010/124146、No.WO2010/078457和No.WO2010/148256中有所描述，这些专利关于异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体的内容整体明确地以引用方式并入本文。

本文所述的启动子中的任何一种(例如，本文所述的以及在本公开的实例中所鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)均可用于驱动本文所述的任何异戊二烯合酶的表达。

可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化为异戊二烯的能力，来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性测定中，通过如实例1中所述的摇瓶法使菌株(例如，如本文所述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)生长而制备细胞提取物。完成诱导后，将大约10mL的细胞通过以7000×g离心10分钟而沉淀，然后重悬在无甘油的5m1PEB中。使用标准程序用弗氏细胞压碎器将细胞裂解。或者，在-80℃下进行冻融循环后将细胞用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理。

细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性可例如按以下文献中所述进行测量：Silver et al.，J.Biol.Chem.270：13010-13016，1995(Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷，第13010-13016页，1995年)以及其中的参考文献，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的内容。将DMAPP(西格玛公司(Sigma))在氮气流下蒸发至干，然后在100mM磷酸钾缓冲液(pH8.2)中再水化至100mM的浓度，并在-20℃下保藏。为进行该测定，将5μL的1M MgCl₂、1mM(250μg/ml)DMAPP、65uL的植物提取物缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM MgCl₂，5％甘油和2mM DTT)的溶液加到20mL顶空小瓶中的25μL细胞提取物中，并在振动下于37℃培养15分钟，其中小瓶具有金属旋盖和涂有特氟龙的硅隔膜(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))。反应可通过加入200μL的250mM EDTA进行猝灭并通过GC/MS进行定量。

示例性MVA途径多肽和核酸

在本发明的一些方面，在本文所述的任何组合物或方法中描述到的细胞包含编码MVA途径多肽的核酸。在一些方面，MVA途径多肽为内源多肽。在一些方面，细胞包含编码MVA途径多肽的内源核酸的一个或多个额外拷贝。在一些方面，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA途径多肽的内源核酸可操作地连接至强启动子。在特定的方面，将细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源MVA途径多肽。

在一些方面，MVA途径多肽为异源多肽。在一些方面，细胞包含编码MVA途径多肽的异源核酸的不止一个拷贝。在一些方面，编码MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA途径多肽的异源核酸可操作地连接至强启动子。

示例性MVA途径多肽包括乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、乙酰乙酰辅酶A合酶(其利用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地讲，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸。另外，也可使用能提高异戊二烯产量的MVA途径多肽变体。

在某些方面，编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在其他方面，编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为内源核酸的拷贝。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽可选自：(a)缩合两个乙酰辅酶A分子以形成乙酰乙酰辅酶A的酶(AA-CoA硫解酶)或可由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶(乙酰乙酰辅酶A合酶)；(b)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯基焦磷酸的酶；以及(g)将异戊烯基焦磷酸转化成二甲基烯丙基二磷酸的酶。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽选自(a)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(b)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯基焦磷酸的酶。

可用的MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的类型以及制备编码MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的微生物的方法还在国际专利申请公布No.WO2009/076676中有所描述。

本领域的技术人员可容易地选择和/或使用合适的启动子来优化异戊二烯合酶和/或一种或多种MVA途径多肽和/或一种或多种DXP途径多肽的表达。类似地，本领域的技术人员可容易地选择和/或使用合适的载体(或转移媒介)来优化异戊二烯合酶和/或一种或多种MVA途径多肽和/或一种或多种DXP途径多肽的表达。在一些方面，载体含有选择性标记。选择性标记的例子包括但不限于抗生素抗性核酸(例如，卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博莱霉素、新霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(诸如营养优势)的核酸。在一些方面，异戊二烯合酶或MVA途径核酸在没有选择性标记的情况下整合到细胞的染色体中。

示例性来源生物体

铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸(及它们的编码多肽)可得自天然包含铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸和/或IDI核酸的任何生物体。如上所述，异戊二烯由多种生物体(例如细菌、酵母、植物和动物)天然地形成。生物体含有MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径二者来产生异戊二烯(图3)。因此，DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDS或HDR核酸可例如从任何具有DXP途径或同时具有MVA和DXP途径的生物体获得。IDI和异戊二烯合酶核酸可例如从任何含有MVA途径、DXP途径或同时含有MVA和DXP途径的生物体获得。

在一些方面，铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸的核酸序列与通过自然界中的任何以下生物体产生的核酸的序列相同。在一些方面，铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽的氨基酸序列与通过自然界中的任何以下生物体产生的多肽的序列相同。在一些方面，铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸或其编码多肽为衍生自本文所述的任何生物体的突变型核酸或多肽。如本文所用，“衍生自”是指一个或多个突变所引入的核酸或多肽源。例如，“衍生自植物多肽”的多肽是指通过将一个或多个突变引入野生型(即，自然界中存在的)植物多肽的序列而得到的所关注多肽。

在一些方面，来源生物体为真菌，其例子为曲霉属(Aspergillus)的种，诸如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)；酵母属(Saccharomyces)的种，诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的种，诸如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；以及木霉属(Triohoderma)的种，诸如里氏木霉(T.reesei)。在一些方面，来源生物体为丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，IntroductoryMycology，Wiley，New York(Alexopoulos，C.J.，1962年，《真菌学概论》，纽约威利出版社))。这些真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由几丁质、纤维素和其他复合多糖构成。丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。丝状真菌亲本细胞可以是以下各属(但不限于以下各属)的种的细胞：木霉属(如里氏木霉(其为之前归类为长梗木霉(T.longibrachiatum)的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形式)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Triohoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum))(Sheir-Neirs et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol20：46-53，1984(Sheir-Neirs等人，《应用微生物学和生物技术》，第20卷，第46-53页，1984年)；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉属(Penicillium sp.)；腐质霉属(Humicola sp.)(如特异腐质霉(H.insolens)、柔毛腐质霉(H.lanuginose)或灰腐质霉(H.grisea))；金孢霉属(Chrysosporiumsp.)(如C.lucknowense)；粘帚霉属(Gliocladium sp.)；曲霉属(Aspergillussp.)(如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))(Ward et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743，1993(Ward等人，《应用微生物学和生物技术》，第39卷，第7380743页，1993年)和Goedegebuur et al.，Genet41：89-98，2002(Goedegebuur等人，《遗传学》，第41卷，第89-98页，2002年))；镰孢属(Fusarium sp.)(如粉红镰孢(F.roseum)、禾赤镰孢(F.graminum)、F.cerealis、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)或F.venenatum)；脉孢菌属(Neurospora sp.)(如粗糙脉孢菌(N.crassa))；肉座菌属(Hypocreasp.)；毛霉属(Mucor sp.)(如米黑毛霉(M.miehei))；根霉属(Rhizopus sp.)和裸胞壳属(Emericella sp.)(另见Innis et al.，Sci.228：21-26，1985(Innis等人，《科学》，第228卷，第21-26页，1985年))。术语木霉属(“Trichoderma”或“Trichoderma sp.”或“Trichoderma spp.”)是指之前或目前被归类为木霉的任何真菌属。

在一些方面，真菌为构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌或腐皮镰孢霉(F.solani)。曲霉菌菌株在Ward et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993(Ward等人，《应用微生物学和生物技术》，第39卷，第738-743页，1993年)和Goedegebuur et al.，Curr Gene41：89-98，2002(Goedegebuur等人，《现代基因》，第41卷，第89-98页，2002年)中有所公开，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于真菌的内容。在特定方面，真菌为木霉属菌株，诸如里氏木霉菌株。里氏木霉菌株是已知的，并且非限制性例子包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCCNo.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL15709，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于里氏木霉菌株的内容。在一些方面，宿主菌株为RL-P37的衍生物。RL-P37在Sheir-Neiss et al.，Appl.Microbiol.Biotechnology20：46-53，1984(Sheir-Neiss等人，《应用微生物学和生物技术》，第20卷，第46-53页，1984年)中有所公开。

在一些方面，来源生物体为酵母，诸如酵母属(Saccharomycessp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)或假丝酵母属(Candida sp.)。

在一些方面，来源生物体为细菌，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，诸如地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；泛菌属(Pantoea)的菌株，诸如柠檬假交替单胞菌；假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株，诸如产碱假单胞菌；链霉菌属(Streptomyces)的菌株，诸如变铅青链霉菌或锈赤链霉菌(S.rubiginosus)；嗜热蓝藻属(Thermosynechococcus)的菌株，诸如T.elongatus；中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的菌株，诸如苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)；螺杆菌属(Helicobacter)的菌株，诸如幽门螺旋杆菌(H.pylori)；农杆菌属(Agrobacterium)的菌株，诸如根癌农杆菌(A.tumefaciens)；异常球菌属(Deinococcus)的菌株，诸如耐辐射异常球菌(D.radiodurans)；李斯特氏菌属(Listeria)的菌株，诸如单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)；乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，诸如L.spp；或者埃希杆菌属(Escherichia)的菌株，诸如大肠杆菌。

本文所用的“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽包杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。应该认识到，还在继续对芽孢杆菌属进行分类学整理。因此，意在使该属包括已经重新分类的种，包括但不限于诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在存在氧气的情况下抗性内生孢子的产生被视为芽孢杆菌属的定义性特征，但该特性还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paerlibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

在一些方面，来源生物体为革兰氏阳性细菌。非限制性例子包括链霉菌属的菌株(如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌)、芽孢杆菌属的菌株、李斯特氏菌属的菌株(如单核细胞增生李斯特菌)或乳杆菌属的菌株(如L.spp)。在一些方面，来源生物体为革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌、假单胞菌或幽门螺旋杆菌。

在一些方面，来源生物体为植物，诸如来自豆科的植物，诸如蝶形花亚科。在一些方面，来源生物体为葛根、杨树(诸如Populus alba xtremula CAC35696)、白杨类(诸如山杨)、英国栎、拟南芥属(Arabidopsis)(诸如阿拉伯芥(A.thaliana))或玉蜀黍属(Zea)(诸如玉米(Z.mays))。

在一些方面，来源生物体为藻类，诸如绿藻、红藻、灰胞藻门(glaucophyte)、chlorarachniophyte、鞭毛虫、色藻界(chromista)或沟鞭藻类。

在一些方面，来源生物体为蓝细菌，诸如基于形态学分类成以下任何族的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。在一些方面，蓝细菌为Thermosynechococcus elongates。

示例性宿主细胞

多种宿主细胞可在受权利要求书保护的本发明的方法中用于表达铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽、MVA途径多肽、MVA途径相关多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽并产生异戊二烯。示例性宿主细胞包括来自标题为“示例性来源生物体”的前面部分中所列出的任何生物体的细胞。宿主细胞可以是天然产生异戊二烯的细胞或不会天然产生异戊二烯的细胞。在一些方面，宿主细胞使用DXP途径和异戊二烯合酶天然产生异戊二烯，并将一种或多种DXP途径多肽和铁-硫簇相互作用氧化还原多肽加入以使用该途径提高异戊二烯的产量。在一些方面，宿主细胞使用DXP途径和异戊二烯合酶天然产生异戊二烯，并将一种或多种DXP途径核酸、一种或多种铁-硫簇相互作用氧化还原核酸和IDI加入以使用该途径提高异戊二烯的产量。

因此，本领域的技术人员将认识到，可对表达载体进行设计，以便包含优化某些宿主菌株的基因表达的某些组分。此类优化组分包括但不限于复制起点、启动子和增强子。本文引用的载体和组分仅出于示例性目的进行描述，且不旨在缩小本发明的范围。

可用于异源表达基因的任何细胞或其子代均可在本文的受权利要求书保护的本发明的方法中用于表达铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽、MVA途径多肽、MVA途径相关多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽并产生异戊二烯。在一些实施例中，宿主细胞为革兰氏阳性细菌。非限制性例子包括链霉菌属的菌株(如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌)、芽孢杆菌属的菌株、李斯特氏菌属的菌株(如单核细胞增生李斯特菌)或乳杆菌属的菌株(如L.spp)。在一些实施例中，来源生物体为革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌、假单胞菌或幽门螺旋杆菌。在某些实施例中，大肠杆菌宿主细胞可在受权利要求书保护的本发明的方法中用于表达一种或多种铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽、MVA途径多肽、MVA途径相关多肽、异戊二烯合酶多肽或IDI多肽并产生异戊二烯。

包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的细菌细胞可用于表达上文所述的任何异源基因。具体地讲，柠檬假交替单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、白色链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌和产碱假单胞菌细胞中的任何一者。

存在许多类型的可在本发明的组合物和方法中用作宿主细胞的厌氧细胞。在本发明的一个方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述的细胞为专性厌氧细胞及其子代。专性厌氧菌在存在氧的条件下通常生长不良，或根本不生长。应当理解，可以存在少量的氧，也就是说，存在专性厌氧菌对低水平氧的一定耐受度。在一个方面，经工程改造以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的专性厌氧菌可作为本文所述的任何方法和/或组合物的宿主细胞，并在基本上无氧的条件下生长，其中氧的存在量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害。

在本发明的另一方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述和/或所用的宿主细胞为兼性厌氧细胞及其子代。兼性厌氧菌可在存在氧时通过有氧呼吸(例如利用TCA循环)生成细胞ATP。然而，兼性厌氧菌也可在不存在氧的情况下生长。这与在存在较高氧含量下死亡或生长不良的专性厌氧菌形成对照。在一个方面，因此，兼性厌氧菌可作为本文提供的任何组合物和/或方法的宿主细胞，并可经工程改造以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯。兼性厌氧宿主细胞可在基本上无氧的条件下生长，其中氧的存在量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害，或者作为另外一种选择可在存在较高氧含量的情况下生长。

宿主细胞另外可以为丝状真菌细胞及其子代。(参见例如Berka＆Barnett，Biotechnology Advances，(1989)，7(2)：127-154(Berka和Barnett，《生物技术进展》，1989年，第7卷第2期，127-154页))。在一些方面，丝状真菌细胞可以为以下任何一者：长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、绿色木霉、康宁木霉、哈茨木霉、青霉属、特异腐质霉、柔毛腐质霉、灰腐质霉、金孢霉属、C.lucknowense、粘帚霉属、曲霉菌(诸如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、构巢曲霉或泡盛曲霉)、镰孢属(诸如粉红镰孢、禾赤镰孢、F.cerealis、尖孢镰刀菌或F.venenatum)、脉孢菌属(诸如粗糙脉孢菌)、肉座菌属、毛霉属(诸如米黑毛霉)、根霉属或裸胞壳属。在一些方面，真菌为构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌或腐皮镰孢霉。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利公布No.US2011/0045563中所述的那些。

宿主细胞也可以为酵母，诸如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属。在一些方面，酵母属为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(参见例如Romanos et al.，Yeast，(1992)，8(6)：423-488(Romanos等人，《酵母》，1992年，第8卷第6期，第423-488页))。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利No，7,659,097和美国专利公布No.US2011/0045563中所述的那些。

宿主细胞还可以为藻类的种，诸如绿藻、红藻、灰胞藻门、chlorarachniophyte、鞭毛虫、色藻界或沟鞭藻类。(参见例如Saunders＆Warmbrodt，“Gene Expression in Algae and Fungi，Including Yeast，”(1993)，National Agricultural Librarw，Beltsville，MD(Saunders和Warmbrodt，《藻类和真菌(包括酵母)中的基因表达》，1993年，马里兰州贝尔茨维尔美国国家农业图书馆))。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利公布No.US2011/0045563中所述的那些。在一些方面，宿主细胞为蓝细菌，诸如基于形态学分类成以下任何族的蓝细菌：色球藻目、宽球藻目、颤藻目、念珠藻目或真枝藻目(参见例如Lindberg et al.，Metab.Eng.，(2010)12(1)：70-79(Lindberg等人，《代谢工程》，2010年，第12卷第1期，第70-79页))。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利公布No.US2010/0297749、US2009/0282545和国际专利申请No.WO2011/034863中所述的那些。

示例性转化方法

IspG核酸、铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、异戊二烯合酶核酸或IDI核酸或包含它们的载体可使用本领域的技术人员已知的标准技术插入宿主细胞(如本文所述的大肠杆菌细胞、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)。引入的核酸可整合进染色体DNA内或维持为染色体外复制型序列。

另外的宿主细胞突变

在本文所述的重组细胞还包含一种或多种MVA途径多肽的某些实施例中，本发明还设想了通过MVA途径增加碳通量的某些宿主细胞突变。在另一个实施例中，本发明设想了通过DXP途径增加碳通量的某些宿主细胞突变。在另一个实施例中，本发明设想了通过DXP和MVA途径增加碳通量的某些宿主细胞突变。通过增加碳流量，可以产生更多的异戊二烯。在某些实施例中，如本文所述的重组细胞还可经工程改造以增加朝向甲羟戊酸产生的碳通量，其中调节一种或多种选自以下的酶的活性：(a)柠檬酸合酶；(b)磷酸转乙酰酶；(c)乙酸激酶；(d)乳酸脱氢酶；(e)NADP依赖性苹果酸酶；以及(f)丙酮酸脱氢酶。

柠檬酸合酶途径

柠檬酸合酶催化草酰乙酸和乙酰辅酶A的缩合以形成柠檬酸，其为三羧酸(TCA)循环的代谢物(Ner，S.et a1.1983.Biochemistry22：5243-5249(Ner，S.等人，1983年，《生物化学》，第22卷，第5243-5249页)；Bhayana，V.and Duckworth，H.1984.Biochemistry23：2900-2905(Bhayana，V.和Duckworth，H.，1984年，《生物化学》，第23卷，第2900-2905页))(图5)。在大肠杆菌中，这种由gltA编码的酶在表现上与二聚亚单元的三聚体相似。六聚形式允许酶由NADH别构调节。该酶已得到了广泛研究(Wiegand，G.，and Remington，S.1986.Annual Rev.BiophysicsBiophys.Chem.15：97-117(Wiegand，G.和Remington，S.，1986年，《生物物理化学年评》，第15卷，第97-117页)；Duckworth et al.1987.Biochem Soc Symp.54：83-92(Duckworth等人，1987年，《生物化学社会研讨会》，第54卷，第83-92页)；Stockell，D.et al.2003.J.Biol.Chem.278：35435-43(Stockell，D.等人，2003年，《生物化学杂志》，第278卷，第35435-35443页)；Maurus，R.et al.2003.Biochemistry.42：5555-5565(Maurus，R.等人，2003年，《生物化学》，第42卷，第5555-5565页))。为了避免NADH产生的别构抑制，已考虑了通过枯草芽孢杆菌NADH非敏感性柠檬酸合酶进行替换或补充(Underwood et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：1071-1081(Underwood等人，2002年，《应用与环境微生物》，第68卷，第1071-1081页)；Sanchez et al.2005.Met.Eng.7：229-239(Sanchez等人，2005年，《代谢工程》，第7卷，第229-239页))。

由柠檬酸合酶催化的反应直接与催化甲羟戊酸途径第一步的硫解酶竞争，因为它们都以乙酰辅酶A作为底物(Hedl et al.2002.J.Bact.184：2116-2122(Hedl等人，2002年，《细菌学杂志》，第184卷，第2116-2122页))。因此，本领域的技术人员可以调节柠檬酸合酶的表达(如，降低酶活性)以允许更多的碳流入甲羟戊酸途径，从而增加甲羟戊酸和异戊二烯的最终产量。柠檬酸合酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些方面，柠檬酸合酶的活性通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性而进行调节。这可通过以下方式实现：将内源柠檬酸合酶基因用编码NADH非敏感性柠檬酸合酶的转基因进行染色体替换，或使用源自枯草芽孢杆菌的编码NADH非敏感性柠檬酸合酶的转基因。柠檬酸合酶的活性还可以通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子而进行调节(如，降低)。柠檬酸合酶活性的降低可导致与不具有降低的柠檬酸合酶表达的微生物相比更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。

涉及磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的途径

磷酸转乙酰酶(pta)(Shimizu et al.1969.Biochim.Biophys.Acta191：550-558(Shimizu等人，《生物化学与生物物理学学报》，第191卷，第550-558页，1969年))催化乙酰辅酶A与乙酰磷酸(acetyl-P)之间的可逆转化，而乙酸激酶(ackA)(Kakuda，H.et a1.1994.J.Biochem.11：916-922(Kakuda，H.等人，1994年，《生物化学杂志》，第11卷，第916-922页))则使用acetyl-P形成乙酸。这些基因可在大肠杆菌中作为操纵子而转录。它们一起催化乙酸的异化，同时释放ATP。因此，本领域的技术人员可通过降低磷酸转乙酰酶基因(如内源磷酸转乙酰酶基因)和/或乙酸激酶基因(如内源乙酸激酶基因)的活性而增加可用乙酰辅酶A的量。一种实现降低的方式是缺失磷酸转乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)。这可通过以下方式实现：将一个或两个基因替换为氯霉素表达盒，然后将该表达盒环出(looping out)。乙酸由大肠杆菌因多种原因而产生(Wolfe，A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69：12-50(Wolfe，A，2005年，《微生物学与分子生物学评论》，第69卷，第12-50页))。不受理论的约束，由于ackA-pta使用乙酰辅酶A，因此缺失这些基因可能使碳不转向乙酸，并从而增加甲羟戊酸或异戊二烯的产率。

在一些方面，重组微生物与不具有降低的内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因表达的微生物相比产生量减少的乙酸。所产生乙酸的量的减少可通过本领域技术人员已知的常规测定法进行测量。乙酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

磷酸转乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)的活性还可通过对酶进行其他分子操纵而降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一些情况下，降低内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与不具有降低的内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因表达的微生物相比更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。

涉及乳酸脱氢酶的途径

在大肠杆菌中，D-乳酸由丙酮酸通过乳酸脱氢酶(ldhA-图5)产生(Bunch.P.et al.1997.Microbiol.143：187-195(Bunch，P.等人，1997年，《微生物学》，第143卷，第187-195页))。乳酸的产生伴随NADH的氧化，因此，当氧被限制并且无法适应所有还原当量时，将产生乳酸。因此，乳酸的产生可能是碳消耗的源头。因此，为了增加流向甲羟戊酸(和异戊二烯)产生的碳，本领域的技术人员可以调节乳酸脱氢酶的活性，诸如通过降低该酶的活性。

因此，在一个方面，乳酸脱氢酶的活性可通过降低内源乳酸脱氢酶基因的活性而进行调节。这种降低可以通过使内源乳酸脱氢酶基因缺失而实现。也可以使用本领域技术人员已知的降低乳酸脱氢酶基因活性的其他方式。通过操纵涉及乳酸脱氢酶的途径，重组微生物与不具有降低的内源乳酸脱氢酶基因表达的微生物相比产生量减少的乳酸。所产生乳酸的量的减少可通过本领域技术人员已知的常规测定法进行测量。乳酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

乳酸脱氢酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵而降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

因此，在一些情况下，降低内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与不具有降低的内源乳酸脱氢酶基因表达的微生物相比更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。

涉及苹果酸酶的途径

苹果酸酶(在大肠杆菌中，为sfcA和maeB)是通过以下方程式催化苹果酸转化成丙酮酸(使用NAD+或NADP+)的回补酶：

因此，这种酶的两种底物为(S)-苹果酸和NAD(P)⁺，而其三种产物为丙酮酸、CO₂和NADPH。

NADP依赖性苹果酸酶(maeB-图5)的表达(Iwikura，M.et al.1979.J.Biochem.85：1355-1365(Iwikura，M.等人，1979年，《生物化学杂志》，第85卷，第1355-1365页))可通过以下方式有助于增加甲羟戊酸和异戊二烯产率：1)将碳从TCA循环带回甲羟戊酸途径的丙酮酸、乙酰辅酶A的直接前体、其自身的直接前体，以及2)产生可用于HMG-CoA还原酶反应的额外NADPH(Oh，MK et al.(2002)J.Biol.Chem.277：13175-13183(Oh，MK等人，2002年，《生物化学杂志》，第277卷，第13175-13183页)；Bologna，F.et al.(2007)J Bact.189：5937-5946(Bologna，F.等人，2007年，《细菌学杂志》，第189卷，第5937-5946页))。

这样，可通过调节(诸如增加)苹果酸酶的活性和/或表达而实现更多的用于甲羟戊酸或异戊二烯的下游产生的起始底物(丙酮酸或乙酰辅酶A)。NADP依赖性苹果酸酶基因可以是内源基因。实现此目的的一种非限制性方式是将内源NADP依赖性苹果酸酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子。另一种增加酶活性的非限制性方式是使用编码NADP依赖性苹果酸酶多肽的一种或多种异源核酸。本领域的技术人员可使用易得的分子生物学技术在发酵或培养过程中监测maeB RNA的表达。

因此，在一些实施例中，重组微生物与不具有增加的NADP依赖性苹果酸酶基因表达的微生物相比产生量增加的丙酮酸。在一些方面，增加NADP依赖性苹果酸酶基因的活性导致与不具有增加的NADP依赖性苹果酸酶基因表达的微生物相比更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。

所产生丙酮酸的量的增加可通过本领域技术人员已知的常规测定法进行测量。丙酮酸增加的量与未进行分子操纵时相比可为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

苹果酸酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵而增加。酶活性增加可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性增加任何量。在一些情况下，酶活性的增加为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

涉及丙酮酸脱氢酶复合物的途径

催化丙酮酸脱羧成乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合物由基因aceE、aceF和lpdA编码的蛋白质构成。那些基因的转录由多种调节因子调节。因此，本领域的技术人员可通过调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性而增加乙酰辅酶A。调节可以是增加丙酮酸脱氢酶复合物的活性和/或表达(例如，恒定表达)。这可通过不同的方式实现，例如通过在操纵子前设置强组成型启动子如PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg-λ启动子，GenBankNC_001416)，或使用一个或多个合成的组成型表达启动子。

因此，在一个方面，丙酮酸脱氢酶的活性通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一个或多个基因的活性而进行调节，所述丙酮酸脱氢酶复合物由以下组成：(a)丙酮酸脱氢酶(El)，(b)二氢硫辛酸转乙酰基酶和(c)二氢硫辛酸脱氢酶。应当理解，可操纵这些基因中的任何一个、两个或三个以增加丙酮酸脱氢酶的活性。在另一方面，丙酮酸脱氢酶复合物的活性可通过如下文进一步详述降低内源丙酮酸脱氢酶复合物抑制因子基因的活性而进行调节。内源丙酮酸脱氢酶复合物抑制因子的活性可通过使内源丙酮酸脱氢酶复合物抑制因子基因缺失而降低。

在一些情况下，丙酮酸脱氢酶复合物的一个或多个基因为内源基因。增加丙酮酸脱氢酶复合物活性的另一种方式是向微生物引入编码选自以下的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸：(a)丙酮酸脱氢酶(El)，(b)二氢硫辛酸转乙酰基酶和(c)二氢硫辛酸脱氢酶。

通过使用任何这些方法，重组微生物可与未调节丙酮酸脱氢酶活性的微生物相比产生增加量的乙酰辅酶。调节丙酮酸脱氢酶活性可导致与未调节丙酮酸脱氢酶表达的微生物相比有更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。

突变的组合

应当理解，对于本文所述的任何酶和/或酶途径，明确地设想了调节本文所述的酶和/或酶途径(如其中两者、三者、四者、五者或六者)的任何组合的分子操纵。为了便于对组合进行表述，将柠檬酸合酶(gltA)指定为A，将磷酸转乙酰酶(ptaB)指定为B，将乙酸激酶(ackA)指定为C，将乳酸脱氢酶(ldhA)指定为D，将苹果酸酶(sfcA或maeB)指定为E，并且将丙酮酸脱羧酶(aceE、aceF和/或lpdA)指定为F。如上所述，丙酮酸脱羧酶复合物的aceE、aceF和/或lpdA酶可单个地使用、或三种酶中的两种或三种酶中的三种一起使用，以增加丙酮酸脱羧酶活性。

因此，对于酶A-F的任何两种的组合，可以使用的非限制性组合为：AB、AC、AD、AE、AF、BC、BD、BE、BF、CD、CE、CF、DE、DF和EF。对于酶A-F的任何三种的组合，可以使用的非限制性组合为：ABC、ABD、ABE、ABF、BCD、BCE、BCF、CDE、CDF、DEF、ACD、ACE、ACF、ADE、ADF、AEF、BDE、BDF、BEF和CEF。对于酶A-F的任何四种的组合，可以使用的非限制性组合为：ABCD、ABCE、AB3CF、ABDE、ABDF、ABEF、BCDE、BCDF、CDEF、ACDE、ACDF、ACEF、BCEF、BDEF和ADEF。对于酶A-F的任何五种的组合，可以使用的非限制性组合为：ABCDE、ABCDF、ABDEF、BCDEF、ACDEF和ABCEF。在另一方面，使用所有六种酶的组合：ABCDEF。

因此，如本文所述的重组微生物可实现与不在三羧酸(TCA)循环活性条件下生长的微生物相比增加的甲羟戊酸产量，其中重组微生物中的代谢碳通量通过调节选自以下的一种或多种酶的活性而被导向甲羟戊酸产生：(a)柠檬酸合酶，(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶，(c)乳酸脱氢酶，(d)苹果酸酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。

用于增加产量的其他调节因子和因素

其他分子操纵可用于增加碳流向甲羟戊酸和/或异戊二烯产生。一种方法是降低、减弱或消除负调节因子对进入甲羟戊酸途径的途径的影响。例如，在一些情况下，基因aceEF-lpdA处于操纵子中，而第四个上游基因pdhR.pdhR是其操纵子转录的负调节因子。在不存在丙酮酸的情况下，它结合其靶启动子并抑制转录。它还以相同的方式调节ndh和cyoABCD(Ogasawara，H.et al.2007.J.Bact.189：5534-5541(Ogasawara，H.等人，2007年，《细菌学杂志》，第189卷，第5534-5541页))。在一个方面，pdhR调节因子的缺失可改善丙酮酸的供应，并因此提高甲羟戊酸和异戊二烯的产量。

在其他方面，将6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)引入缺乏PGL的微生物(诸如各种大肠杆菌菌株)可用于提高甲羟戊酸和/或异戊二烯的产量。PGL可使用染色体整合或染色体外载体(诸如质粒)而引入。

示例性细胞培养基和条件

本发明还包括产生异戊二烯的培养物中的细胞或细胞群。所谓“培养物中的细胞”，是指允许细胞经历一次或多次细胞分裂的溶液(如，细胞培养基)中的两个或更多个细胞。“培养物中的细胞”不包括为含有已分化为植物组织的细胞的活的多细胞植物的部分的植物细胞。在多个方面，细胞培养物包含至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000个或更多个细胞。

可用于培养宿主细胞的碳源在WO2009/076676、wO2010/003007和WO2009/132220中有所描述。在一个方面，本发明的重组细胞可使用以下试剂以15L规模在补料分批培养物中生长：

1000X微量金属溶液(每升)：一水柠檬酸40g、MnSO₄*H₂O30g、NaCl10g、FeSO4*7H₂O1g、CoCl₂*6H₂O1g、ZnSO*7H₂O1g、CuSO₄*5H₂O100mg、H₃BO₃100mg、NaMoO₄*2H₂O100mg。以每次溶解一种物质的方式将每种组分溶于去离子水中，用HCl/NaOH将pH调至3.0，然后将溶液定容并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

维生素溶液(每升)：盐酸硫胺素1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、D-泛酸4.8g、盐酸吡比多辛4.0g。以每次溶解一种物质的方式将每种组分溶于去离子水中，用HCl/NaOH将pH调至3.0，然后将溶液定容并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

Macro盐溶液(每升)：MgSO₄*7H₂O296g、一水合柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。将所有组分溶于水，定容并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

进料溶液(每千克)：葡萄糖0.57kg、去离子水0.38kg、K₂HPO₄7.5g和100％Foamblast10g。将所有组分混合在一起并高压灭菌。溶液冷却到25℃后，将Macro盐溶液11.1mL、1000X微量金属溶液1.6ml、维生素溶液13.1mL和5.4mL350g/L的酵母提取物溶液(经0.22微米过滤器过滤灭菌)加入。

磷酸盐溶液(每升)：KH₂PO₄68g、K₂HPO₄68g。将所有组分溶于水，定容，高压灭菌30分钟。

可用于培养本文的任何重组细胞的其他方法和材料在实例中描述。适于细菌培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。示例性技术可见于WO2009/076676、WO2010/003007和WO2009/132220以及Manual of Methods for General BacterioloayGerhardt etal.，eds)，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.(1994)(《普通细菌学方法手册》，Gerhardt等人编辑，华盛顿美国微生物学会，1994年)或Brock inBiotechnoloay：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(Brock，《生物技术：工业微生物学教科书》，第二版，1989年，马萨诸塞州森德兰Sinauer Associates出版公司)。在一些方面，将细胞在培养基中在允许由插入宿主细胞的核酸编码的一种或两种IspG酶、一种或多种异戊二烯合酶多肽、铁-硫簇相互作用氧化还原多肽、DXP途径多肽、DXP途径相关多肽或IDI多肽表达的条件下培养。

将异戊二烯产生与细胞生长解耦的示例性方法。

本发明的重组细胞的生长方式可将异戊二烯产生与细胞生长解耦。当使用给料时，希望给料中的碳转化成异戊二烯而不是细胞生长和维持。在一些方面，细胞生长到低至中OD₆₀₀，然后开始或增加异戊二烯的产生。该策略允许大部分碳转化成异戊二烯。本领域的技术人员可根据WO2010/003007中的教导使本发明的重组细胞生长。

在一些方面，异戊二烯只在静止期产生。在一些方面，异戊二烯在生长期和静止期均产生。在一些方面，异戊二烯只在生长期产生。在一些方面，将编码本文所述的各种酶和多肽的核酸置于在静止期比在生长期更具活性的启动子或因子的控制下。例如，可将一种或多种异戊二烯合酶核酸、铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、IspG酶和/或IDI核酸置于静止期σ因子(诸如RpoS)的控制下。在一些方面，将一种或多种异戊二烯合酶核酸、铁-硫簇相互作用氧化还原核酸、DXP途径核酸、DXP途径相关核酸、IspG酶和/或IDI核酸置于可在静止期诱导的启动子(诸如可通过在静止期具有活性的反应调节因子进行诱导的启动子)控制下。

在安全操作范围内产生异戊二烯

使用本文所公开的重组细胞产生异戊二烯可根据其易燃性特性在安全操作水平内完成，其简化商业设施的设计和构造、大大提高安全操作的能力并限制失火的可能性。具体地讲，异戊二烯的产生的最佳范围在安全区内，即异戊二烯浓度的不易燃范围内。在一个这种方面，本发明涉及在异戊二烯浓度的不易燃范围内(在异戊二烯的易燃性区域之外)产生异戊二烯的方法。安全操作范围在WO2010/003007中有所描述，其中公开的范围具体以引用方式并入。

异戊二烯的示例性产生

本发明尤其提供使用两种类型的IspG酶、一种或多种DXP途径酶和异戊二烯合酶任选地与铁-硫簇相互作用氧化还原基因或多肽以及IDI基因和多肽相结合以增加培养细胞中异戊二烯产量的组合物和方法。在一些方面，重组细胞产生高于或为约1、2、3、4、5、6、7、8、8.4、9、10、25、50、75、100、150、175或200g/L_发酵液的异戊二烯累积滴度(总量)。在一些方面，上限为约1、2、3、4、5、6、7、8、8.4、9、10、25、50、75、100、150、175或200g/L_发酵液。

异戊二烯产生的各种量度(如，异戊二烯的比生产率、发酵罐中异戊二烯的瞬时产率等)可如WO2009/076676、WO2010/003007和WO2009/132220中所公开的那样进行测量。

在一些方面，以组合物中所有C5烃类的总重量计，异戊二烯组合物包含大于或为约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100重量％的异戊二烯。在一些方面，以组合物中所有C5烃类的检测器响应计，组合物的异戊二烯相对检测器响应大于或为约99.90、99.91、99.92、99.93、99.94、99.95、99.96、99.97、99.98、99.99或100％。在一些方面，以组合物中所有C5烃类的总重量计，异戊二烯组合物包含约99.90至约99.92、约99.92至约99.94、约99.94至约99.96、约99.96至约99.98、约99.98至100重量％的异戊二烯。

在一些方面，以组合物中所有C5烃类的总重量计，异戊二烯组合物包含少于或为约0.12、0.1O、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001重量％的异戊二烯以外的C5烃类(诸如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或页式-戊-3-烯-1-炔)。在一些方面，以组合物中所有C5烃类的检测器响应计，组合物的异戊二烯以外的C5烃类的相对检测器响应小于或为约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％。在一些方面，以组合物中所有C5烃类的检测器响应计，组合物的1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔的相对检测器响应小于或为约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％。在一些方面，以组合物中所有C5烃类的总重量计，异戊二烯组合物包含约0.02至约0.04％、约0.04至约0.06％、约0.06至0.08％、约0.08至0.10％、或约0.10至约0.12％的异戊二烯以外的C5烃类(诸如1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、页式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或页式-戊-3-烯-1-炔)。

在一些方面，就组合物中抑制异戊二烯聚合的任何化合物而言，异戊二烯组合物包含少于或为约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些方面，就组合物中抑制异戊二烯聚合的任何化合物而言，异戊二烯组合物包含介于约0.005至约50之间，诸如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些方面，异戊二烯组合物包含少于或为约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L的异戊二烯以外的烃(诸如1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、页式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些方面，异戊二烯组合物包含介于约0.005至约50之间，诸如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的异戊二烯以外的烃。在一些方面，异戊二烯组合物包含少于或为约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L的蛋白质或脂肪酸(诸如与天然橡胶天然相关的蛋白质或脂肪酸)。

在一些方面，异戊二烯组合物包含少于或为约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的α-乙炔、戊间二烯、乙腈或1，3-环戊二烯。在一些方面，异戊二烯组合物包含少于或为约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些方面，异戊二烯组合物包含少于或为约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的所有炔烃(诸如戊炔-1、丁炔-2、2MB1-3炔和1-戊炔-4炔)。在一些方面，异戊二烯组合物包含少于或为约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的异戊二烯二聚体，诸如环状异戊二烯二聚体(如由两个异戊二烯单元的二聚化衍生的环状C10化合物)。

在一些方面，组合物包含大于约2mg的异戊二烯，诸如大于或为约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg的异戊二烯。在一些方面，组合物包含大于或为约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g的异戊二烯。在一些方面，组合物中异戊二烯的量介于约2至约5,000mg之间，诸如介于约2至约100mg、约100至约500mg、约500至约1,000mg、约1,000至约2,000mg或约2,000至约5,000mg之间。在一些方面，组合物中异戊二烯的量介于约20至约5,000mg、约100至约5,000mg、约200至约2,000mg、约200至约1,000mg、约300至约1,000mg或约400至约1,000mg之间。在一些方面，组合物的挥发性有机部分的大于或约20、25、30、40、50、60、70、80、90或95重量％为异戊二烯。

示例性的异戊二烯纯化方法

在一些方面，本文所述的任何方法还包括回收异戊二烯。例如，使用本发明的组合物和方法产生的异戊二烯可使用标准技术回收，诸如气提、膜增强分离、分馏、吸附/解吸、全蒸发、异戊二烯从固相热或真空解吸或者使用溶剂提取固定或吸收到固相的异戊二烯(参见例如美国专利No.4,703,007和No.4,570,029，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于异戊二烯回收和纯化方法的内容)。在一个方面，异戊二烯通过吸附汽提法回收(参见例如美国专利公布No.2011/0178261)。在特定方面，将通过醇(诸如乙醇、甲醇、丙醇或它们的组合)进行的萃取蒸馏用于回收异戊二烯。在一些方面，异戊二烯的回收涉及分离液体形式的异戊二烯(诸如异戊二烯的纯溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提涉及以连续方式从发酵尾气流中移除异戊二烯蒸气。这种移除可以多种不同的方式实现，包括但不限于吸附到固相、分配进液相或直接冷凝(诸如因暴露于冷凝盘管或因压力升高而冷凝)。在一些方面，在高于蒸气露点的条件下对稀的异戊二烯蒸气流进行薄膜富集会造成液体异戊二烯的冷凝。在一些方面，将异戊二烯压缩并冷凝。

异戊二烯的回收可涉及一步或多步。在一些方面，从发酵尾气中移除异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相同时地进行。例如，异戊二烯可直接从尾气流冷凝形成液体。在一些方面，从发酵尾气中移除异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相相继地进行。例如，异戊二烯可吸附到固相，然后通过溶剂从固相提取。在一个方面，使用如美国专利申请No.12/969,440(美国专利公布No.2011/0178261)中所述的吸附汽提法回收异戊二烯。

在一些方面，本文所述的任何方法还包括纯化异戊二烯。例如，使用本发明的组合物和方法产生的异戊二烯可使用标准技术纯化。纯化是指将异戊二烯与产生异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的过程。在一些方面，异戊二烯作为基本上纯的液体获得。纯化方法的例子包括(i)从液体萃取剂中的溶液蒸馏和(ii)层析。如本文所用，“纯化的异戊二烯”是指已与产生异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的异戊二烯。在一些方面，异戊二烯的至少约20重量％不含产生异戊二烯时存在的其他组分。在各个方面，异戊二烯的纯度为至少或约25重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、90重量％、95重量％或99重量％。可以用任何合适的方法分析纯度，如通过柱层析、HPLC分析或GC-MS分析。

在一些方面，将移除异戊二烯的一个或多个回收步骤后剩余的气相的至少一部分回收利用，方式是将气相引入细胞培养系统(诸如发酵罐)以产生异戊二烯。

实例

旨在对本发明进行纯粹地示例性说明因而不应该被视为以任何方式限制本发明的实例也描述并详细说明了上面论述的本发明的各方面。除非另外指明，否则温度均以摄氏度表示，压力均为或接近大气压。上述实例和详细描述是以示例方式而不是以限制方式给出。尽管为了清晰理解已经通过举例说明和实例的方式相当详细地描述了上述本发明，但对于本领域的普通技术人员将显而易见的是按照本发明的教导内容在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可进行各种变化和修改。

实例1：Ptac鱼腥藻ispH-T elong ispG系统aspAterm/pEWL454的生 成

将T.elongatus IspG系统克隆进Ptac鱼腥藻ispH aspA term/pE WL454

具有由存在于质粒Ptac-gcpE-petF-petH/pK184中的gcpE-petF-petH组成的T.elongate IspG系统的DNA序列之前已有描述(参见美国专利申请No.12/817,134(美国专利公布No.2011/0014672)，实例9)。使用DNA聚合酶I(大Klenow片段)、BamHI和PstI(马萨诸塞州新英格兰生物实验室(New England BioLabs，MA))，获得了5’钝端(BamHI破坏的)-3’PstI gcpE-petF-petH片段。将Ptac鱼腥藻ispH aspA term/pEWL454载体用SmaI和PstI(马萨诸塞州新英格兰生物实验室(New England BioLabs，MA))根据制造商建议的方案消化。将SmaI和PstI切割的Ptac鱼腥藻ispH aspA term/pEWL454DNA与具有5’钝端(BamHI破坏的)-gcpE-petF-petH-3’PstI片段的最终消化反应物合并，然后将DNA混合物用QiagenQiaQuick凝胶回收试剂盒清洗。将大约一半清洗后的切割DNA用T4DNA连接酶(马萨诸塞州新英格兰生物实验室(New England BioLabs，MA))根据制造商建议的方案连接。通过电穿孔方法，将一部分连接物用于转化此前在美国专利申请No.12/817,134(美国专利公布No.2011/0014672)的实例11中有所描述的菌株MD09-220。使用具有0.1em电转杯的Bio RadGene Pulser系统(加利福利亚州伯乐公司(Bio-Rad，CA))(目录号165-2089)以及制造商建议的转化方案。将转化体在37℃下在添加了500μM甲羟戊酸的LB肉汤中恢复培养1小时，然后铺到无甲羟戊酸的含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂上。预计只有含有功能性表达的ispH等位基因的转化体才会形成集落。如下筛选卡那霉素抗性集落以确认gcpE-petF-petH插入序列：

通过制备以下混合物建立聚合酶链式反应(PCR)测定；

0.5μl模板(大约0.5μl体积的集落细胞)

16.25μl去离子水

0.25μl dNTP(100mM)

0.625μl引物(10μM)5’top Te gcpE seq primer

0.625μl引物(10μM)5’NdeI F-T.e.gcpE pET-15b

0.625μl引物(10μM)3’bottom Te gcpE seq primer

0.625μl引物(10μM)3’BamHI R-T.e.gcpE pET-15b

5.0μl HerculaseII缓冲液

0.5ul HereullaseII融合体(加利福利亚州Strataeene公司(Strataeene， CA))

25μl总体积

使用以下循环参数在Biometra T3000Combi热循环仪(德国Biometra公司(Biometra，Germany))上进行PCR反应：95℃×2min，(95℃×30s、55℃×30s、72℃×1min)×29个循环；72℃×5min，4℃直至冷却。

引物序列如下；

5’top Te gcpE seq primer：5’-cacttgagtttatacgcatc

3’bottom Te gcpE seq primer：5’-gatgcgtataaactcaagtg

5’NdeI F-T.e.gcpE pET-15b：5’-gcggcagccatatgcaaacgttgccaagccca

3’BamHI R-T.e.gcpE pET-15b：5’-tagcagccggatccttatggatctacccatctacc

将所得的PCR片段在1.2％E-gel(加利福利亚州英杰公司(Invitrogen，CA))上分离。将观察到预期大小的PCR产物的集落视为含gcpE的插入序列阳性，并进一步处理。

使成功扩增了gcpE片段的卡那霉素抗性集落在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB肉汤中生长过夜，然后收获用于后续质粒制备。使用Qiagen QiaprepSpin小量提取试剂盒(加利福利亚州Qiagen公司(Qiagen，CA))分离质粒构建体。使用引物M13-65(5’-AGGCGATTAAGTTGGGTA)和pSE3805(5’-GGCTCGTATAATGTGTGG)对所关注的质粒制备物测序(加利福利亚州Sequetech公司(Sequetech，CA))，以进一步确认将gcpE-petF-petH序列插入了Ptac鱼腥藻ispH aspA term/pEWL454，而现在将所得的质粒构建体称为Ptac鱼腥藻ispH-T elong ispG系统aspA term/pEWL454(参见图1)。识别了正确的Ptac鱼腥藻ispH-T elong ispG系统aspA term/pEWL454克隆，并指定为菌株REM I617。

实例2：提高DXP流异戊二烯产量的菌株REM F2_18的生成

将REM I711用Ptac鱼腥藻ispH-T elong ispG系统aspAterm/pEWL454转化

产异戊二烯的亲本菌株REM I7_11之前已有所述(参见美国专利申请No.12/817,134(美国专利公布No.2011/0014672)实例29)。除了通过染色体编码的DXP途径基因dxs和dxr增加的表达外，REM I7_11菌株还含有fldA和ispG两者的质粒编码拷贝以及存在于BL21基因组内的fldA和ispG基因座。将Ptac鱼腥藻ispH-T elong ispG系统aspA term/pEWL454质粒通过电穿孔引入菌株REM I7_11。电穿孔使用具有0.1cm电转杯的BioRad Gene Pulser系统(目录号165-2089)进行。转化通过以下制造商建议的方案实现。将转化体在37℃下在LB肉汤中恢复培养1小时，然后铺到含壮观霉素(50μg/ml)、羧苄青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂上。将所得的菌株命名为REM F2_18。

实例3：产生8.4a/L异戊二烯滴度的REM F2_18的大规模发酵

使用以下试剂以15L的规模在补料分批培养物中，使表达DXP途径中的基因和异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞生长以产生异戊二烯；

1000X微量金属溶液(每升)：一水柠檬酸40g、MnSO₄*H₂O30g、NaCl10g、FeSO4*7H₂O1g、CoCl₂*6H₂O lg、ZnSO*7H₂O1g、CuSO₄*5H₂O100mg、H₃BO₃100mg、NaMoO₄*2H₂O100mg。以每次溶解一种物质的方式将每种组分溶于去离子水中，用HCl/NaOH将pH调至3.0，然后将溶液定容并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

维生素溶液(每升)：盐酸硫胺素1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、D-泛酸4.8g、盐酸吡多辛4.0g。以每次溶解一种物质的方式将每种组分溶于去离子水中，用HCl/NaOH将pH调至3.0，然后将溶液定容并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

Macro盐溶液(每升)：MgSO₄*7H₂O296g、一水合柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。将所有组分溶于水，定容并通过0.22微米过滤器过滤灭菌。

进料溶液(每千克)：葡萄糖0.57kg、去离子水0.38kg、K₂HPO₄7.5g和100％Foamblast10g。将所有组分混合在一起并高压灭菌。溶液冷却到25℃后，将Macro盐溶液11.1mL、1000X微量金属溶液1.6ml、维生素溶液13.1mL和5.4mL350g/L的酵母提取物溶液(经0.22微米过滤器过滤灭菌)加入。

磷酸盐溶液(每升)：KH₂PO₄68g、K₂HPO₄68g。将所有组分溶于水，定容，高压灭菌30分钟。

使用F2_18菌株在15L生物反应器中进行发酵；该菌株为过表达dxp途径中的前两种酶(PL.6-dxs和GI1.6-dxr)、DXP途径中的最后一种酶(G11.6-yIDI)、DXP途径中涉及的其他基因(GI1.6-fldA-ispG/pCL、PTac-鱼腥藻ispH-T.elong.gcpE-petF-petH aspA term/pEWL454)、下游MVA途径(PL.2-mKKDyI)、银白杨的截短异戊二烯合酶(pDW33，参见美国专利公布No.201I/0014672)并包含恢复的染色体pgl基因(t ybgS：：Kan或tybgS：：frt)的大肠杆菌BL21细胞。该实验在pH7.0和34℃下进行。截短的异戊二烯合酶还在美国专利公布No.2010/0003716中有所描述。

将大肠杆菌菌株的冷冻小瓶解冻，然后接种到生物反应器的胰蛋白胨酵母提取物培养基中。培养物生长到在550nm处测得的光密度(OD₅₅₀)为1.0之后，将500mL用于接种15L生物反应器，并将初始罐体积加至5L。羧苄青霉素、壮观霉素和卡那霉素各自分别以50μg/mL的浓度存在于接种瓶和发酵罐中。

批料葡萄糖耗尽后，以从0.35g/min起的指数速率加入葡萄糖进料溶液，直到进料速率达到2.72g/min。此后紧接着持续发酵过程并在68h时将进料速率带到最高4.225g/min的线性斜坡。在68h的发酵过程中加入生物反应器的葡萄糖总量为3.5kg。

在二氧化碳释放率(CER)为50mmol/L/h时开始以0.2lg/min进料上述磷酸盐溶液，且在进料了16h时逐步减少至0.11g/min并持续进料直到实验完成。

通过添加来自10mg/mL储液的异丙基-β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)而实现诱导。在零时间点，添加3mL(25μM)。后续添加在二氧化碳释放率(CER)为25mmol/L/h时(3mL)、CER为50mmol/L/h时(6mL)、CER为100mmol/L/h时(6mL)以及CER为150mmol/L/h时(3mL)。

使用Hiden Analytical质谱仪(美国密歇根州利沃尼亚(Livonia，Michigan，USA))测定生物反应器尾气中的异戊二烯水平。仪器校准通过加拿大安大略省密西沙加精气产品有限公司(Precision Gas Products Inc.，Mississauga，Ontario，Canada)提供的异戊二烯校准标准品进行。在发酵过程中异戊二烯滴度增加至在68小时处的8.4g/L的最大值(参见图2和图4)。计算异戊二烯滴度的公式：

∫(异戊二烯的瞬时产率，g/L/h))dt(从t＝0至68小时)[＝]g/L发酵液

质粒Ptac鱼腥藻ispH-T elongispG系统aspA tenn/pEWL454的序列

cgataagctagcttcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactccaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcggatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcggatgataagctgtcaaacatgagaattacaacttatatcgtatggggctgacttcaggtgctacatttgaagagataaattgcactgaaatctagaaatattttatctgattaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaaacgaaaaaaccgccttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttgaaccgaggtaactggcttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagccttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgccagtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcggactgaacggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgcctacccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaacgcggccataacagcggaatgacaccggtaaaccgaaaggcaggaacaggagagcgcacgagggagccgccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccaccactgatttgagcgtcagatttcgtgatgcttgtcaggggggcggagcctatggaaaaacggctttgcctcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaaggaattctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagattacggatccctggagtttaaacatatggatactaaaacctttaaacgtacgttgcaacactccgaaaactacaatcggaaagggttcggtcatcaggcggaggttgcaactcaactgcaatcagaatatcagagttctttgattcaggaaatccgcgatcgcaactacactcttcaacgtggggatgtcacgataagacttgctcaggcatttggcttctgctggggtgttgaacgtgcggtcgcgatggcttatgagacccggaagcattttccaactgaacgcatctggattaccaacgaaatcattcacaatccgagcgtcaaccagcggatgcaggaaatgcaagtgggctttataccagtagaggcgggcaacaaggattttagcgtagtcggcaataatgacgtcgttatcctgccagcctttggcgcttctgtgcaagagatgcagcttttatctgaaaaaggatgtaaaatagttgataccacatgtccgtgggtatcaaaagtctggaataccgtggaaaagcataaaaagggggatcatacctctataatacatggcaaatataaacacgaagaaacgattgccacaagttccttcgcgggtaaatatctcatcgtccttaaccttaaggaagcacaatacgttgctgactacattctgcatgggggtaatcgtgaggagttcttacagaaatttgcaaaagcatgctcggcgggctttgaccccgatagagatcttgaaagagttggcattgccaatcagacaacaatgttgaaaggagagaccgaacagatcggtaaactttttgaacataccatgctgcaaaaatacggacccgtggagttaaatcaacattttcagtccttcaatacaatttgcgacgctacccaggaacggcaggacgccatgctggagctggtacaagaaaatttggacctcatgatcgtgatcggaggttttaattcttccaacacaacacagctccaacagattagccaggaacggggtctgccgtcctatcatattgatgtagttgagcgtattaaaagcataaactcgatagagcaccggcagttaaacggagagttggtcactacggaaaattggctgcctgcgggcaaaattgtcgtaggtgtaacaagtggcgcgagtacaccagataaggtggttgaagacgtgatcgaaaagatctttgcgcttaaagcaacagcggccgtcttttaacccgatccatttgaggagtaagccatgcaaacgttgccaagcccagttcaagctacaccaacggaaacagctattgttagacgcaaaacccgcccggttccgataggctccgttgttattggtggcggccatcccgtggctgttcagtcaatgattaacgaagacactctggatatcgaaggttctgttgctgcaattcggcgcttacacgagatcggttgcgagatcgtacgtgtgactgtaccttcattagcacacgcgaaagcaatggaagagattcgggatcggctttataaaacgtacaaaccggtccccttagttgccgacgtgcatcataacggaatgaaaatcgcgttagaggttgccaagtacgtggacaatgtgcgcattaatcctggattatacgtgtttgagaagccaaaaccaaatcgcaeggagtacactcaagctgaatttgacgagattggcgcgaaaatccgtgaaacgttggaaccactggtaatttcactgcgggatcagggaaagtcgatgcgcattggcgttaatcatggcagtctggcggaacggatgctgtttacctatggcgataccccagagggtatggtagagagtgcacttgagtttatacgcatctgtgaaagtctcaacttctataacttagaaatttcccttaaagctagccgcgtcccggttatgatagccgccaatcggcttatggttaagcgcatggacgagctgggtatggattatccgttgcatctcggagtgactgaggcaggtgatggtgaatatggccgtattaaaagcacagcaggcattgcaacactgctggcggaaggaattggagacacaatccgtgtttcattgactgaagctccggaaaaggaaatccccgtgtgctatggcatccttcaagccctcggtctccgccgcaccatggtagaatatgtagcttgcccgtcgtgtggtcggacattgtttaacctggaagaggttctgcacaaggtgagagaagcgactaaacacctgacgggactgaatattgcggttatgggatgtattgtaaatggacctggcgaaatggccgatgcagactacggctatgtaggtaaacagccgggatatataagtctttaccgcggccgggaagaagtcaagaaagtgcccgaggccgagggcgttgcagctctggtcgaactgataaaagcggatggtagatgggtagatccataagtggagctccccggtaccgtggacgaggtttaatatggcgacgtataaagtcacactggtccgtccggatggcagcgaaacgaccatcgatgttccggaggacgaatacatactggatgtcgccgaagaacaaggtctggatctcccgttttcttgtcgcgccggtgcctgctctacctgtgctggcaaattgttggagggagaagtcgatcaaagcgaccagagcttcttggatgacgatcagatcgaaaaaggattcgtgcttacttgtgtggcctacccccgttcggactgcaagatcttgacgaaccaagaggaggagctgtactaagaggtcgacgacgcatgcattaacagaggttagtatgtataatgccactaactctcgctca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实例4：REM H812的大规模发酵

将质粒编码的大肠杆菌IspG系统(GI1.6-fldA-ispG/pCL)与质粒编码的T.elongatus IspG系统(PTac-gcpE-petF-petH/pK185)结合到DxP宿主菌株中。在14L的规模下使用类似的发酵过程将异戊二烯的产生与仅有大肠杆菌IspG系统的菌株REM H8_12(对照)进行比较。不受理论的约束，如果IspG活性相对于对照菌株增强而IspH活性无限制，则通过组合的大肠杆菌和T.elongatus IspG系统菌株生成了更高的异戊二烯滴度。

使用标准分子生物学技术生成了相容的表达构建体，以便适应在该特定背景下表达的附加异源IspH酶，同时维持与对照菌株相似的抗生素抗性基因并保持类似拷贝数的所关注基因。将编码T.elongatus IspG系统的基因与编码附加异源IspH酶的基因结合到pK184载体衍生物pEWL454上所具有的一个操纵子中。这产生卡那霉素抗性载体构建体PTac-鱼腥藻ispH-T.elong IspG系统/pEWL454。

相关的测试菌株REM F2_18具有以下基因型：BL21pgl+PL.2-下游MVA途径GI1.6-yidi PL.6-dxs GI1.6-dxr+GI1.6-fldA-ispG/pCL(Spec50)+PTac-鱼腥藻ispH-T.elong IspG系统/pEWL454(Kan50)+PTrc-截短的albaIspS/pTrc His(Carb50)。对照菌株为：BL21pgl+PL.2-下游MVA途径GI1.6-yidi PL.6-dxs GI1.6-dxr+GI1.6-fldA-ispG/pCL(Spec50)+PTac鱼腥藻ispH/pK184(Kan50)+PTrc-截短的alba IspS/pTrc His(Carb50)。

实例5：改变IspG水平实现增强的体内活性

将大肠杆菌IspG系统的表达增加到高于在目前的大肠杆菌IspG系统产异戊二烯菌株(对照)中的水平。比较两个菌株的异戊二烯产量。不受理论的约束，如果IspG活性相对于对照菌株增强而IspH活性无限制，则通过增强的大肠杆菌IspG系统菌株生成了更高的异戊二烯滴度。

为了提高大肠杆菌IspG系统的表达，使用分子生物学方法由其目前的载体构建体(基于pCL的载体)提高大肠杆菌IspG系统的表达，方式是增加控制系统表达水平的启动子强度(例如，将目前系统的高组成型GI1.6启动子变为更强的组成型PL.6启动子)或将目前的大肠杆菌IspG系统移动到更高拷贝数的载体(pBBRlMCS-5载体，由庆大霉素抗性编码，与类似的高DXP流菌株所需的其他载体相容)。

相关的增强启动子强度的测试菌株具有以下基因型：BL21pgl+PL.2-下游MVA途径GI1.6-yidi PL.6-dxs GI1.6-dxr+PL.6-fldA-ispG/pCL(Spec50)+PTac鱼腥藻ispH/pKl84(Kan50)+PTrc-截短的alba IspS/pTrc His(Carb50)。所提议的相关增加载体拷贝数的测试菌株具有以下基因型：BL21pgl+PL.2-下游MVA途径GI1.6-yidi PL.6-dxs GI1.6-dxr+GI.6-fldA-ispG/pBBRlMCS-5(Gent10)+PTac鱼腥藻ispH/pK184(Kan50)+PTrc-截短的alba IspS/pTrc His(Carb50)。所提议的附加增加载体拷贝数的测试菌株具有以下基因型：BL21pgl+PL.2-下游MVA途径GI1.6-yidi PL.6-dXsGI1.6-dxr+GI.6-fldA-ispG/pCL(Spec50)+GI.6-fldA-ispG/pBBRlMCS-5(Gent10)+PTac鱼腥藻ispH/pK184(Kan50)+PTrc-截短的alba IspS/pTrcHis(Carb50)。对照菌株为BL21pgl+PL.2-下游MVA途径GI1.6-yidi PL.6-dxs GI1.6-dxr+GI1.6-fldA-ispG/pCL(Spec50)+PTac鱼腥藻ispH/pK184(Kan50)+PTrc-截短的alba IspS/pTrc His(Carb50)。

不受理论的约束，相对于如上所述的IspH活性无限制，现有大肠杆菌IspG系统和T.elongatusIspG系统产异戊二烯菌株中的IspH活性未显示出限制性。为了确定不足的IspH活性水平将会妨碍异戊二烯输出并混淆对IpsG活性的任何影响的解读，本领域的技术人员寻找上述表型并使用生物化学测定法。在不存在IpsH活性有限的任何指示下，将异戊二烯的产生用作反映IspG活性改善的手段。IspG水平可通过免疫印迹测定，用于确认与测得的活性相关的表达水平。

Claims (29)

1.一种能够产生异戊二烯的重组细胞，所述细胞用以下核酸转化：(i)编码第一物种的第一1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)多肽的核酸；(ii)编码第二物种的第二IspG多肽的核酸，其中所述第二物种不同于所述第一物种；(iii)编码至少一种DXP途径酶的核酸以及(iv)编码异戊二烯合酶多肽的核酸。

2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述第一IspG多肽为T.elongatus IspG多肽。

3.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述第二IspG多肽为大肠杆菌IspG多肽。

4.根据权利要求1所述的重组细胞，其还包含编码铁-硫簇相互作用氧化还原多肽的核酸。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述铁-硫簇相互作用氧化还原多肽选自铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白。

6.根据权利要求1所述的重组细胞，其还包含编码DXP途径相关多肽的核酸。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其中所述DXP途径相关多肽为分子伴侣蛋白。

8.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞还包含编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的至少一种异源核酸或编码IDI多肽的内源核酸的至少一个拷贝。

9.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞还包含编码MVA途径多肽的至少一种异源核酸或编码MVA途径多肽的内源核酸的至少一个拷贝。

10.根据权利要求8所述的重组细胞，其中所述细胞还包含编码MVA途径多肽的至少一种异源核酸或编码MVA途径多肽的内源核酸的至少一个拷贝。

11.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽。

12.根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂交体Populus alba x Populus tremula的多肽。

13.根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽选自葛麻姆或野葛、山杨、银白杨、黑杨和毛果杨。

14.根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽为葛根异戊二烯合酶多肽。

15.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞为细菌、藻类、真菌或酵母细胞。

16.根据权利要求15所述的重组细胞，其中所述细胞为细菌细胞。

17.根据权利要求16所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。

18.根据权利要求17所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞选自大肠杆菌、柠檬假交替单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、白色链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌和产碱假单胞菌细胞。

19.根据权利要求18所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。

20.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述另外的DXP途径酶选自DXS、DXR、MCT、CMK、MCS、HDR(IspH)和IDI。

21.根据权利要求20所述的重组细胞，其中所述另外的DXP途径酶选自DXS、DXR、HDR(IspH)和IDI。

22.一种包含权利要求1所述的重组细胞的细胞培养物，其中所述细胞培养物产生至少约8.4g/l的异戊二烯。

23.一种包含权利要求10所述的重组细胞的细胞培养物，其中所述细胞培养物产生至少约8.4g/l的异戊二烯。

24.一种产生异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)将权利要求1所述的重组细胞在适于产生异戊二烯的条件下培养，以及(b)产生异戊二烯。

25.根据权利要求24所述的方法，其还包括回收所述异戊二烯。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述重组细胞产生多于约8.4g/l的异戊二烯。

27.一种产生异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)将权利要求10所述的重组细胞在适于产生异戊二烯的条件下培养，以及(b)产生异戊二烯。

28.根据权利要求27所述的方法，其还包括回收所述异戊二烯。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述重组细胞产生多于约8.4g/l的异戊二烯。

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