CN106554933A - 异戊二烯基因工程生产菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及异戊二烯基因工程生产菌及其应用。本发明通过在宿主细胞中引入外源的甲羟戊酸途径并过表达异戊二烯合成酶,更优选地还增强宿主细胞中的磷酸甲基赤藓醇途径,从而实现了应用原核细胞高效生产异戊二烯。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域;更具体地,本发明涉及异戊二烯基因工程生产菌及其应用。
背景技术
2-甲基-1,3-丁二烯(2-Methyl-1,3-butadiene)又称为异戊二烯(Isoprene),是一种无色、易挥发,刺激性油状液体。其分子式为C5H8,分子量为68.12。异戊二烯不溶于水,能溶于苯,易溶于乙醇、乙醚、丙酮等多数有机溶剂。异戊二烯可在空气或氧气中燃烧,可与溴水、氯气等发生1,2-加成或1,4-加成反应。
异戊二烯是合成橡胶的重要单体,主要用于合成异戊橡胶,其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶的第三位。其次,用作合成丁基橡胶的一种共聚单体,以改进丁基橡胶的硫化性能,但用量很少,异戊二烯还用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶、以及合成香料、药品、农药等的中间体等。还用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。
现有技术中,异戊二烯的主要生产方法包括脱氢法、合成法等。脱氢法主要步骤是:利用异戊烷脱氢制备异戊烯,异戊烯再脱氢得异戊二烯,然后经乙腈或N,N-=甲基甲酰胺萃取蒸馏分离出异戊二烯纯品。随着技术的发展,人们也进行了化学吸附法以及膜分离法生产异戊二烯的探讨。尽管人们开发了较多种化学生产异戊二烯的方法,但是,这些方法普遍存在原料消耗高、产物转化率低,生产过程产生副产物等各种问题。
生物法合成异戊二烯是近年来兴起的一种方法。有研究者利用欧洲山杨叶中提取的活性物质,已二甲基丙烯基二磷酸为原料合成了异戊二烯。也有研究者以枯草杆菌作为催化剂,以甲基赤藻糖醇磷酸盐为原料,合成了异戊二烯。但是,现有的多数生物合成法存在无法大规模产业化或异戊二烯产量偏低、不稳定等问题。
因此,本领域还需要进一步地研究和开发新型生产异戊二烯的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供异戊二烯基因工程生产菌及其应用。
在本发明的第一方面,提供一种异戊二烯基因工程生产菌,该基因工程菌是原核细胞,其具有外源的甲羟戊酸(MVA)途径,且其过表达异戊二烯合成酶(IspS)。
在一个优选例中,所述的异戊二烯基因工程生产菌中,还具有增强的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径。
在另一优选例中,所述的甲羟戊酸途径含有:乙酰辅酶A硫解酶(mvaE),甲羟戊酸合成酶(mvaS),甲羟戊酸激酶(mvk),磷酸甲羟戊酸激酶(pmk),二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mvd),异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)。
在另一优选例中,所述的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径还可含有:2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(ispF),其能将4–二磷酸胞苷–2C–甲基–赤藓糖醇–2–磷酸转化成2C-甲基-D-赤藓醇2,4-焦磷酸。但ispF并非该途径的限速酶,不对ispF加以增强也可实现反应。
在另一优选例中,所述的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径含有:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs),1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(dxr),(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶(ispG),(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶(ispH),异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)。
在另一优选例中,所述的基因工程生产菌还表达(过表达):铁氧化还原蛋白1(fldA),铁氧化还原蛋白(petF),铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(petH)。
在另一优选例中,所述的乙酰辅酶A硫解酶(mvaE)来源于Saccharomycescerevisiae;
在另一优选例中,所述的甲羟戊酸合成酶(mvaS)来源于Saccharomycescerevisiae;
在另一优选例中,所述的甲羟戊酸激酶(mvk)来源于Methanosarcinamazei;
在另一优选例中,所述的磷酸甲羟戊酸激酶(pmk)来源于Saccharomycescerevisiae;
在另一优选例中,所述的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mvd)来源于Saccharomyces cerevisiae;
在另一优选例中,所述的异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)来源于Saccharomyces cerevisiae。
在另一优选例中,所述的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)来源于E.coli;
在另一优选例中,所述的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(dxr)来源于E.coli;
在另一优选例中,所述的(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶(ispG)来源于T.elongatus或E.coli;
在另一优选例中,所述的(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶(ispH)来源于Anabaena sp.;
在另一优选例中,所述的铁氧化还原蛋白1(fldA)来源于E.coli;
在另一优选例中,所述的铁氧化还原蛋白(petF)来源于T.elongatus;
在另一优选例中,所述的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(petH)来源于T.elongatus。
在另一优选例中,敲除原核细胞基因组中天然的异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)编码基因,引入Saccharomyces cerevisiae的异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因,可以增加大肠杆菌MEP途径通量。
在另一优选例中,所述的增强的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径为通过外源引入磷酸甲基赤藓醇途径的基因来实现增强。
在另一优选例中,所述的异戊二烯合成酶,甲羟戊酸途径的各个酶,磷酸甲基赤藓醇的各个酶,铁氧化还原蛋白1,铁氧化还原蛋白,铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶,被可操作性地构建于表达盒中,通过表达载体被引入原核细胞中。
在另一优选例中,所述的原核细胞是不具备MVA途径的原核细胞;包括:大肠杆菌。
在本发明的另一方面,提供所述的异戊二烯基因工程生产菌的用途,用于生产异戊二烯。
在本发明的另一方面,提供一种制备异戊二烯基因工程生产菌的方法,所述方法包括:提供原核细胞,在其中引入外源的甲羟戊酸(MVA)途径,并且过表达异戊二烯合成酶(IspS),获得可生产异戊二烯基因的工程菌。
在一个优选例中,所述方法还包括:在该原核细胞中增强的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径。
在本发明的另一方面,提供一种制备异戊二烯的方法,述方法包括:培养所述的异戊二烯基因工程生产菌,从而获得异戊二烯。
在一个优选例中,培养时,pH为7.0±0.2,温度为34±1℃。
在另一优选例中,培养(较佳地碳源为葡萄糖)异戊二烯基因工程生产菌,当OD600为4±0.5时,加入IPTG(较佳地,终浓度为110±10uM)诱导,OD600为40±5时,补加IPTG(较佳地浓度增加至190±15uM),转速200-600rpm,溶氧控制在15%以上,碳源耗尽后进行葡萄糖流加培养,发酵过程中残糖浓度控制在2g/L以下,发酵48±5小时。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、为重组质粒pFI的示意图,过表达fldA和ispG基因,fldA和ispG均来源于E.coli。
图2、重组质粒pHGFH的示意图,过表达ispH、ispG和ispH基因,其中ispH来源于Anabaena sp.PCC7120,ispG、petF、petH来源于T.elongatus BP-1。
图3、为重组质粒pIspS的示意图,过表达ispS基因、ispS来源于Poplar alba。
图4、为重组质粒pUpper的示意图,过表达mvaE和mvaS基因,mvaE和mvaS均来源于Saccharomyces cerevisiae。
图5、为重组质粒pIM的示意图,过表达ispS和mvk基因,其中ispS来源于Poplar alba,mvk来源于Methanosarcina mazei。
图6、为重组质粒pFIUpper的示意图,过表达fldA、ispG、mvaE和mvaS基因,其中fldA和ispG来源于E.coli,mvaE和mvaS来源于Saccharomycescerevisiae。
图7、利用电子鼻实时检测发酵过程中尾气中异戊二烯浓度。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,首次揭示了应用于异戊二烯异源生物合成的关键途径和关键酶,从而可实现异戊二烯的高效异源生物合成。
术语
如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(如异戊二烯合成酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶等)所需的所有必要元件的基因表达系统,通常其包括以下元件:启动子、编码多肽的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等;这些元件是操作性相连的。
如本文所用,所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”或“可操作性地构建”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用,所述的“异源”或“外源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系,或来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如,如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的,则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“异源的”。
合成途径的蛋白及其表达系统
本发明人首次发现,将原核细胞(也称为原核宿主)中的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径增强的同时引入甲羟戊酸(MVA)途径,同时过表达异戊二烯合成酶IspS,获得了高产异戊二烯的菌株,培养所述菌株,其异戊二烯的产量明显高于单独两个途径增强或引入相加之和,说明两个途径具有协同增强作用。
本发明在工程菌中引入异戊二烯合成酶(ispS),该酶可将二甲基烯丙基二磷酸转化成异戊二烯,是合成异戊二烯的关键酶。
本发明中,所述的甲羟戊酸(MVA)途径的关键酶,包括乙酰辅酶A硫解酶(mvaE),甲羟戊酸合成酶(mvaS),甲羟戊酸激酶(mvk),磷酸甲羟戊酸激酶(pmk),二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mvd),异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)。各酶的功能如表1所示。
表1、MVA途径关键酶
作为本发明的优选方式,本发明还在工程菌中引入增强磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径关键酶,包括:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs),1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(dxr),(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶(ispG),(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶(ispH),异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)。各酶的功能如表2所示。
表2、MEP途径关键酶
由表1和表2也可见,idi是两个途径的共用酶。
作为本发明的优选方式,本发明还在工程菌中引入铁氧化还原蛋白1(fldA),铁氧化还原蛋白(petF),铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(petH),如表3。这些蛋白若不引入,也能实现异戊二烯生产;引入后,则能够有效地提高ispG和ispH的酶活性,从而提高MEP途径通量,从而有效地提高异戊二烯的产量。
表3
在本发明中,上述的酶或蛋白可以是天然存在的,比如其可被分离或纯化自微生物。此外,所述的酶或蛋白也可以是人工制备的,比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组酶或蛋白。
任何适合的酶或蛋白均可用于本发明。所述的酶或蛋白包括全长的酶或蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的酶或蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。酶或蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽,其仍然能保持全长的酶或蛋白的全部或部分功能。通常情况下,所述的生物活性片段至少保持50%的全长酶或蛋白的活性。在更优选的条件下,所述活性片段能够保持全长酶或蛋白的55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或100%的活性。酶或蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列,所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术,所述技术可以很容易地被实施,并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到,一般来说,在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of TheGene,第四版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
本发明也可采用经修饰或改良的酶或蛋白,比如,可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的酶或蛋白。所述经过修饰或改良的酶或蛋白可以是与天然存在的酶或蛋白具有较小的共同点,但也能发挥与野生型相同或基本相同的功能,且不会带来其它不良影响。也就是说,任何不影响酶或蛋白的生物活性的变化形式都可应用于本发明中。
本发明还包括了编码所述的酶或蛋白的生物活性片段的分离的核酸,也可以是其互补链。作为本发明的优选方式,可对酶或蛋白的编码序列进行密码子优化,以提高表达效率。编码酶或蛋白的生物活性片段的DNA序列,可以全序列人工合成,也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的酶或蛋白的生物活性片段的DNA序列之后,将其连入合适的表达构建物(如表达载体)中,再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞,得到所要的蛋白。
异戊二烯基因工程生产菌
本发明还包括了包含编码所述酶或蛋白的生物活性片段的核酸分子的表达构建物。所述的表达构建物可包括一个或多个编码所述酶或蛋白的基因表达盒,还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列,以便于蛋白的表达。所述的表达调控序列的设计是本领域公知的。表达调控序列中,根据不同的需要,可以应用诱导型或组成型的启动子,诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产,有利于工业化应用。
表达构建物的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此,在得知了所需选择的酶或蛋白之后,本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。编码酶或蛋白的基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中,也可以被插入到同一表达构建物中,只要在转入到细胞后酶或蛋白能够被有效地表达即可。
本发明还包括含有编码所述酶或蛋白的生物活性片段核酸序列的异戊二烯基因工程生产菌(重组菌株),其中具有外源的甲羟戊酸途径,且其过表达异戊二烯合成酶。
适用于制备本发明的基因工程菌的细胞(即出发菌株)是原核细胞,或称为原核宿主。常用的原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌等。MVA途径是在大多数真核生物和高等植物细胞中普遍存在的,不具备MVA途径的原核细胞均可引入外源MVA途径,且产生由该途径的引入而导致的接近的技术效果。因此,尽管本发明的实施例中以大肠杆菌这种较为常用的细胞作为实验示例,除大肠杆菌外的其它原核细胞应也可被应用于本发明中。
合成异戊二烯的方法
本发明公开一种利用微生物异源合成生产异戊二烯的方法。利用合成生物学技术将不同来源的与异戊二烯生物合成相关的酶进行人工组合,使得细胞生产异戊二烯。
本发明的制备异戊二烯的方法包括:培养所述的异戊二烯基因工程生产菌,从而获得异戊二烯。
本发明人通过在宿主细胞中引入外源的甲羟戊酸途径并过表达异戊二烯合成酶,更优选地还增强宿主细胞中的磷酸甲基赤藓醇途径,实现了应用原核细胞高效生产异戊二烯。
利用本发明的方法,异戊二烯产量能达到24g/L以上,碳源的转化率超过22%,处于很高的水平。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:重组质粒pFI的构建
分别以GI1.6-fldA-F/NruI-SacII-fldA-R和SacII-ispG-rbs-F/NruI-ispG-R为引物,分别以大肠杆菌E.coli基因组为模板,PCR扩增分别获得GI1.6-fldA和ispG。
GI1.6-fldA片段利用SalI酶切克隆入pCL1920载体(获自山东大学)的SalI/SamI位点,连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于含壮观霉素抗性平板上进行筛选培养,阳性质粒可利用EcoRI酶切验证,应得到约1kb/4.3kb片段,获得pCL-fldA。
ispG片段利用SacII酶切克隆入pCL-fldA的SacII/NruI位点,连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于含壮观霉素抗性平板上进行筛选培养,阳性质粒利用EcoRI酶切验证,应得到约2.0kb/4.3kb片段,获得的质粒命名为pFI质粒,如图1。
GI1.6-fldA-F(SEQ ID NO:1):
5’-CGAGGTCGACGCGAGCCGTCACGCCCTTGACAATGCCACATCCTGAGCAAATAATTCAACCACTAAACAAATCAACCGCGTTTCCCGGAGGTAACCTTCAAGAGGTTATTTCACTCATGGCTATCACTGGCATCTTTTTC-3’
NruI-SacII-fldA-R(SEQ ID NO:2):
5’-GCTCTCGCGAGAGCCCGCGGTCAGGCATTGAGAATTTCGTCGAG-3’
SacII-ispG-rbs-F(SEQ ID NO:3):
5’-TCCACCGCGGGCTCGAAGGAGATATACCATGCATAACCAGGCTCCAATTCAA-3’
NruI-ispG-R(SEQ ID NO:4):
5’-GCTCTCGCGATTATTTTTCAACCTGCTGAACGTC-3’
实施例2:重组质粒pHGFH的构建
ispH来源于Anabaena sp.PCC7120(GenBank登录号:NC_003272.1),ispG、petF、petH来源于T.elongatus BP-1(GenBank登录号:NC_004113.1)。
ispH序列见GenBank登录号:GI:499304384;
ispG序列见GenBank登录号:GI:22298539;
petF序列见GenBank登录号:GI:22298552;
petH序列见GenBank登录号:GI:22298754。
上述四个基因ispH、ispG、petF、petH均进行有利于表达的密码子优化。利用Ptac启动子(GenBank登录号:E02927)启动表达,终止子序列来源于aspA(GenBank登录号:CP001164),各片段连接后构成Ptac-ispH-ispG-petF-petH-term序列。
人工合成Ptac-ispH-ispG-petF-petH-term序列,并在序列两端添加SmaI酶切位点,克隆入pSU2718(参见文献Martinez E等,Gene 1988,68(1):159-162)的SmaI位点,连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于含氯霉素抗性平板上进行筛选培养,阳性质粒利用PvuII酶切验证,应得到约0.1kb/0.4kb/1kb/1.5kb/3.2kb五条片段,即获得pHGFH质粒,如图2。
实施例3:重组质粒pIspS的构建
参照专利US20130295632中的记载合成ispS基因(MEA P.alba IspS S288CG491S),两端添加NcoI和PstI酶切位点,克隆入pTrcHis2B(获自中国科学院上海植物生理生态研究所)的NcoI/PstI位点,连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄霉素抗性平板上进行筛选培养,转化子利用2B-F/2B-R进行菌落PCR验证,阳性片段约1.7kb,即获得pIspS质粒,如图3。
2B-F:5’-AGACAATCTGTGTGGGCACTCG-3’(SEQ ID NO:5);
2B-R:5’-TCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC-3’(SEQ ID NO:6)。
实施例4:重组质粒pUpper的构建
mvaE和mvaS来源于Enterococcus faecalis(GeneBank:NC_004668.1)。
mvaE见GenBank登录号:GI:29375931;
mvaS见GenBank登录号:GI:29375930。
分别利用mvaE-F/mvaE-R和mvaS-F/mvaS-R为引物,以Enterococcusfaecalis为模板,PCR扩增mvaE和mvaS片段;mvaE-F/mvaS-R为引物,mvaE和mvaS片段进行over-lap PCR扩增mvaE-mvaS片段,SacI/BglII酶切mvaE-mvaS片段,克隆入pTrcHis2A(获自中国科学院上海植物生理生态研究所)的SacI/BglII位点,获得pTrc-mvaES;pTrc-mvaES利用SspI酶切,回收含trc启动子+mvaES+terminator片段,克隆入pCL1920的PvuI位点,获得pUpper质粒,如图4。
mvaE-F:
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG-3’(SEQ ID NO:7);
mvaE-R:
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC-3’(SEQ ID NO:8);
mvaS-F:
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA-3’(SEQ ID NO:9);
mvaS-R:
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT-3’(SEQID NO:10)。
实施例5:重组质粒pIM的构建
分别以P1-mMvk-F/P1-mMvk-R和mMvk-F/mMvk-R为引物,pIspS质粒和Methanosarcina mazei基因组为模板,PCR扩增IspS-partly和mvk(见GenBank登录号:GI:21227864)片段,两片段再以P1-mMvk-F/mMvk-R为引物,进行over-lap PCR扩增IspS-mvk片段,IspS-mvk利用NheI/PmeI酶切克隆入pIspS质粒的NheI/PmeI位点,连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄霉素抗性平板上进行筛选培养,转化子可利用P1-V-F/mMvk-R进行菌落PCR验证,阳性片段约1.1kb,即获得pIM质粒,如图5。其中IspS-partly具有全长IspS的第441-545位氨基酸。
P1-mMvk-F:5’-CGGCTAGCGCGTCTGCGGAAATTG-3’(SEQ ID NO:11);
P1-mMvk-R:
5’-TTTTTACCTCCTTTATGCAGTTAGCGTTCAAACGGCAGAATCG-3’(SEQ ID NO:12);
mMvk-F:
5’-CTGCATAAAGGAGGTAAAAAAACATGGTATCCTGTTCTGCGCC-3’(SEQ ID NO:13);
mMvk-R:
5’-AGCTTTGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTTGCTCG-3’(SEQ ID NO:14);
P1-V-F:5’-AGGAAAAACTGAGTGGTAGCCTG-3’(SEQ ID NO:15)。
实施例6:重组质粒pFIUpper的构建
以AG-F/AG-R为引物,pFI质粒为模板,PCR扩增AG片段(含有fldA+ispG片段),与实施例4中的trc启动子+mvaES+terminator片段利用Gibson方法进行连接,连接产物转入DH5α感受态细胞,涂布于含壮观霉素抗性平板上进行筛选培养,阳性质粒利用EcoRI酶切验证,应得到约1.3kb/2.5kb/2.6kb/4.3kb片段,获得pFIUpper质粒,如图6。
AG-F:
5’-CCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGGCACGACAGGTTTCCCGAC-3’(SEQ ID NO:16);
AG-R:
5’-ACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATCTGCATTAATGAATCGGCCAAC-3’(SEQ ID NO:17)。
实施例7:重组质粒pMPMI的构建
以PL.2-mvk-F/mMVK-rbs-R为引物,Methanosarcina mazei(GeneBank:NC_003901.1)为模板,PCR扩增PL.2-mvk片段(其中PL.2为启动子);分别以pmk-F/pmk-R、mvd-F/mvd-R和idi-F/idi-R为引物,Saccharomyces cerevisiae基因组为模板,PCR扩增pmk、mvd和idi;分别以PL.2-mvk-F/pmk-R和mvd-F/idi-R为引物,PL.2-mvk/pmk和mvd/idi片段为模板,over-lap PCR扩增PL.2-mvk-pmk和mvd-idi片段;以PL.2-mvk-F/idi-R为引物,PL.2-mvk-pmk/mvd-idi片段为模板,over-lap PCR扩增PL.2-mvk-pmk-mvd-idi片段;PL.2-mvk-pmk-mvd-idi片段利用ApaI/XhoI酶切,克隆入pTrcHis2B的ApaI/XhoI位点,获得pPL.2-MPMI-S。
分别以glmS-F/glmS-R和pstS-F/pstS-R为引物,E.coli MG1655基因组为模板,PCR扩增glmS和pstS片段;以Cm-F/Cm-R为引物,pKD3质粒(参见文献Datsenko KA等,Proc Natl Acad Sci 2000,97(12):6640-6645.Datsenko and Wanner(2000))为模板,PCR扩增Cm(含FRT+Cm抗性盒+FRT)片段;分别以glmS-F/Cm-R为引物,glmS/Cm片段为模板,over-lap PCR扩增glmS-Cm片段,glmS-Cm片段利用PmeI/XhoI酶切,克隆入pPL.2-MPMI-S质粒的PmeI/XhoI位点,获得pPL.2-MPMI-S2;pstS片段利用ApaI酶切,克隆入pPL.2-MPMI-S2的ApaI位点,获得pMPMI质粒。MPMI即PL.2-mvk+pmk+mvd+idi。其中,glmS和pstS片段作为基因插入的同源臂序列。
PL.2-mvk-F:
5’-CCGCTCGAGAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACGTAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCAGCAGGACGCACTGACCACCATGAAGGTGCAAAGGAGGTAAAAAAAC-3’(SEQ ID NO:18);
mMVK-rbs-R:
5’-GTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTAATCTACTTTCAGACCTTGCTCG-3’(SEQ ID NO:19);
pmk-F:
5’-GCTAATTTGCGATAGGCCTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAG-3’(SEQ ID NO:20);
pmk-R:
5’-TTTTTTTTCCTCCTTAAGGGCGAATTCTGCATGCAGCTACCTTAAGTTATTTATCAAGATAAGTTTCCGG-3’(SEQ ID NO:21);
mvd-F:
5’-CTTAAGGTAGCTGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGGAAAAAAAAATGACCGTTTACACAGCATCCG-3’(SEQ ID NO:22);
mvd-R:
5’-TTTTTTTTACCTCCTAAGGGCGATGCAGCGAATTGATCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTC-3’(SEQ ID NO:23);
idi-F:
5’-GATCAATTCGCTGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGC-3’(SEQ ID NO:24);
idi-R:5’-GCGGGCCCTTATAGCATTCTATGAATTTGCC-3’(SEQ ID NO:25);
glmS-F:
5’-AGCTTTGTTTAAACGCTACGTACCCAATCGCGCTGGAAGGC-3’(SEQ ID NO:26);
glmS-R:
5’-GGACCATGGCTAATTCCCATGAAAAATTTTCATTCTGTGACAG-3’(SEQ ID NO:27);
pstS-F:5’-GCGGGCCCTGTCATCTCTTCGTTATTAATG-3’(SEQ ID NO:28);
pstS-R:5’-GCGGGCCCGCTACGTAGATGTCGCCGAGGGTTTTAC-3’(SEQ ID NO:29);
Cm-F:
5’-CTGTCACAGAATGAAAATTTTTCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQ ID NO:30);
Cm-R:5’-CCGCTCGAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:31)。
实施例8:宿主菌CIBTS1756的构建
pKD46载体(参见Datsenko and Wanner(2000))化转入BL21感受态细胞中,获得BL21/pKD46;实施例7获得的pMPMI质粒利用PmeI/ApaLI酶切,胶回收约7kb片段,含同源臂序列、PpL.2启动子、MVA下游途径基因及氯霉素抗性盒片段(PL.2-MPMI-Cm);利用PCR-targeting方法(Datsenko and Wanner(2000)),将PL.2-MPMI-Cm(即MVA下游途径)片段电转入BL21/pKD46中,37℃下LB液体培养基培养1小时,将菌液涂布在含有氯霉素的固体LB平板上,37℃过夜静置培养,对长出的转化子利用lowerMVA-V-F/lowerMVA-Cm-V-F进行菌落PCR验证,阳性片段大小约为2.8kb,即获得BL21(glmS-pstS::pL.2-mMyPMI-Cm)菌株。
抗性基因环出:将pCP20质粒(参见Datsenko and Wanner(2000))借助电击(电转化条件:2.5kV,200Ω,25μF)转化入BL21(glmS-pstS::pL.2-mMyPMI-Cm)中,菌液涂布于含有氨苄霉素固体LB平板上30℃下静置培养24小时,将得到的单菌落转接到不含抗生素的LB平板上,42℃静置培养12小时,利用lowerMVA-V-R/mMVK-V-R进行菌落PCR验证,阳性片段大小约为1.7kb,即获得BL21(glmS-pstS::pL.2-mMyPMI)菌株,命名为CIBTS1756。
lowerMVA-V-F:5’-CCAGCACCGATGGGTAAAGTAG-3’(SEQ ID NO:32);
lowerMVA-Cm-V-F:5’-GGAAAACGGTGTAACAAGGGTG-3’(SEQ ID NO:33);
lowerMVA-V-R:5’-CTGTTGATGCTGGTGGCGAAG-3’(SEQ ID NO:34);
mMVK-V-R:5’-GCTCGAGTTAATCTACTTTCAGACCTTGCTCG-3’(SEQID NO:35)。
实施例9:宿主菌CIBTS1757的构建
以pKD4质粒(参见Datsenko and Wanner(2000))为模板,dxs-Kan-F/dxs-Kan-R为引物,PCR扩增含有dxs同源臂、PpL.6启动子及卡那霉素抗性盒片段(PL.6-dxs-Kan),参照实施例8,利用PCR-targeting方法将PL.6-dxs-Kan片段整合入BL21染色体上,可利用lowerMVA-Cm-V-F/dxs-V-R为引物进行菌落PCR验证,阳性片段约1.5kb,即获得BL21(Pdxs::PpL.6-Kan)菌株;然后参照实施例8中抗性基因环出方法,将BL21(Pdxs::PpL.6-Kan)菌株的卡纳抗性基因环出,可用homo-dxs-F/dxs-V-R为引物进行菌落PCR验证,阳性片段约1.5kb,即获得BL21(Pdxs::PpL.6)菌株。
以pIJ778质粒(参见Datsenko and Wanner(2000))为模板,dxr-Spec-F/dxr-Spec-R为引物,PCR扩增含dxr同源臂、Pgi1.6启动子及壮观霉素抗性盒片段(GI1.6-dxr-Spec),同样利用PCR-targeting方法将GI1.6-dxr-Spec片段整合入BL21(Pdxs::PpL.6)染色体上,可利用dxr-V-F/Spec-V-R为引物进行菌落PCR验证,阳性片段约1.6kb,即获得BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6-Spec)菌株;然后参照实施例8中抗性基因环出方法,将BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6-Spec)菌株的壮观抗性基因环出,可用dxr-V-F/dxr-V-R为引物进行菌落PCR验证,阳性片段约1.4kb,即获得BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6)菌株。
分别以pIJ773质粒(Datsenko and Wanner(2000))和Saccharomycescerevisiae基因组为模板,以idi-Apr-F/GI1.6-Apr-R和GI1.6-yidi-F/yidi-R为引物,PCR分别扩增idi-Apr和GI1.6-yidi片段,以idi-Apr/GI1.6-yidi片段为模板,idi-Apr-F/yidi-R为引物,over-lap PCR扩增含idi同源臂、Pgi1.6-yidi及安普霉素抗性盒片段(Pgi1.6-yidi-Apr),同样参照实施例8,利用PCR-targeting方法将Pgi1.6-yidi-Apr整合入BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6),可利用idi-V-F/yidi-V-R为引物进行菌落PCR验证,阳性片段约1.9kb,即获得BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6,Δidi::Pgi1.6-Scidi-Apr)菌株;参照实施例8中抗性基因环出方法,将BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6,Δidi::Pgi1.6-Scidi-Apr)菌株的安普抗性基因环出,可用idi-V-F/yidi-V-R为引物进行菌落PCR验证,阳性片段约0.7kb,即获得BL21(Pdxs::PpL.6,Pdxr::Pgi1.6,Δidi::Pgi1.6-Scidi)菌株,命名为CIBTS1757。
dxs-Kan-F:
5’-TCGATACCTCGGCACTGGAAGCGCTAGCGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAAACAATAAGTATTAATAGGCCCCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:36);
dxs-Kan-R:
5’-AACAGTCGTAACTCCTGGGTGGAGTCGACCAGTGCCAGGGTCGGGTATTTGGCAATATCAAAACTCATGTTTTTTTACCTCCTTTGCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCAGATGGTTATCTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQ ID NO:37);
lowerMVA-Cm-V-F:5’-CCAGCACCGATGGGTAAAGTAG-3’(SEQ ID NO:38);
dxs-V-R:5’-CTTTAGCGTGGTGATAAGCCCC-3’(SEQ ID NO:39);
homo-dxs-F:5’-AATGTGCGGTGGTCAGGCATTAG-3’(SEQ ID NO:40);
dxr-Spec-F:
5’-ACAAAAACGCCGCTCAGTAGATCCTTGCGGATCGGCTGGCGGCGTTTTGCTTTTTATTCTGTCTCAACTCTGGATGTTTCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’(SEQ ID NO:41);
dxr-Spec-R:
5’-GTTCGGGATTATGGCGCACCACGTCCAGCGTGCTGCAACCAATCGAGCCGGTCGAGCCCAGAATGGTGAGTTGCTTCATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATNGTCAAGGGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:42);
dxr-V-F:5’-ACTGAGACAAGTTTTCAAGGATTC-3’(SEQ ID NO:43);
Spec-V-R:5’-GGACCTACCAAGGCAACGCTATG-3’(SEQ ID NO:44);
dxr-V-R:5’-AGATTATGCTGGATAGGTTGCGG-3’(SEQ ID NO:45);
idi-Apr-F:
5’-GGTTAATCATTTCACTCTTCAATTATCTATAATGATGAGTGATCAGAATTACATGTGAGAAATTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’(SEQ ID NO:46);
GI1.6-Apr-R:
5’-ATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATTGTCAAGGGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:47);
GI1.6-yidi-F:
5’-GCCCTTGACAATGCCACATCCTGAGCAAATAATTCAACCACTTTTATTCACTAACAAATAGCTGGTGGAATATATGACTGCCGACAACAATAGTATGCCC-3’(SEQ ID NO:48);
yidi-R:
5’-GATGCGTCCGGTAAAATAAGCATTACGTTATGCTCACAACCCCGGCAAATGTCGGGGTTTTTATAGCATTCTATGAATTTG-3’(SEQ ID NO:49);
idi-V-F:5’-CGGCATCCGCTCAAAACGGG-3’(SEQ ID NO:50);
yidi-V-R:5’-CAATACATAGTGGATGAGAGCAG-3’(SEQ ID NO:51)。
实施例10:宿主菌CIBTS1758的构建
按照构建实施例8构建方法,将PL.2-MPMI-Cm片段整合入CIBT1757染色体上,获得CIBTS1757(glmS-pstS::pL.2-mMyPMI),即E.coli BL21染色体上既整合了MVA下游途径,同时增强了MEP途径相关基因;获得的菌株命名为CIBTS1758。
实施例11:异戊二烯重组表达菌株的获得
将实施例1-6获得重组质粒组合化转入BL21衍生的宿主菌中,即实施例8-10构建的宿主感受态细胞中(感受态细胞制备及转化具体方法参考《分子克隆III》第1章96页)。将pFI/pHGFH/pIspS三个质粒转入CIBTS1757中,在含壮观霉素(终浓度50ug/ml)/氯霉素(终浓度34ug/ml)/氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)LB平板上进行筛选,获得CIBTS 1357;将pUpper/pIM两个质粒化转入CIBT1756中,在含氯霉素(终浓度34ug/ml)/氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)LB平板上进行筛选,获得CIBTS 1385;将pFIUpper/pHGFH/pIM三个质粒化转入CIBTS1758中,在含壮观霉素(终浓度50ug/ml)/氯霉素(终浓度34ug/ml)/氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)LB平板上进行筛选,获得CIBTS1440。如表4所示:
表4
CIBTS1357 | CIBTS1757/pFI/pHGFH/pIspS |
CIBTS1385 | CIBTS1756/pUpper/pIM |
CIBTS1440 | CIBTS1758/pFIUpper/pHGFH/pIM |
实施例11:摇瓶发酵生产异戊二烯
本例中,分别摇瓶发酵CIBTS1357、CIBTS1385、CIBTS1440,具体发酵方法如下:
挑取单菌落接种于4ml LB试管中,添加相应抗生素,37℃220rpm过夜培养;过夜培养菌液以1%接种量转接于含有20ml V7S培养基的250ml三角瓶中,37℃220rpm培养约6-7小时;将摇瓶种子液转接于含有10ml V7E培养基的300ml密封瓶中,使初始菌浓(OD600)为0.2左右,添加终浓度为1mM IPTG,37℃220rpm培养20小时,发酵结束,上层气体中异戊二烯浓度利用GC(上海天美GC7900)进行检测,同时测发酵液菌浓,如表5所示。
摇瓶发酵培养基组成:
V7S培养基配方(1L):MOPS 0.1M,葡萄糖10g,(NH4)2SO4 5g,MgSO40.5g,KH2PO4 0.4g,Na2HPO4 1g,CaCl2*2H2O 0.1g,酵母粉5g,100×微量元素10ml,维生素B12mg。
V7E培养基配方(1L):MOPS 0.1M,葡萄糖5g,(NH4)2SO4 5g,MgSO40.5g,KH2PO4 0.4g,Na2HPO4 1g,CaCl2*2H2O 0.1g,酵母粉1g,100×微量元素10ml,维生素B12mg。
100×微量元素(1L):一水柠檬酸10g,MnSO4*7H2O 2g,FeSO4*7H2O0.5g,ZnSO4*7H2O 0.2g,CuSO4*5H2O 0.05g,CoCl2*2H2O 0.05g,NaMoO4*2H2O 0.05g。
GC检测方法如下:
天美GC7900,检测器:PID;毛细管PLOT-Q柱(30m×0.53mm×40μmfused silica,Tian-mei Co.),柱温:140℃;进样器:150℃;检测器:150℃。进样量:200μl气体,异戊二烯出峰时间为5.6min左右。
表5、摇瓶发酵异戊二烯产量及菌浓列表
异戊二烯(mg/L) | 菌浓(OD600) | |
CIBTS1357 | 58.371±5.827 | 4.68±0.173 |
CIBTS1385 | 315.558±29.068 | 5.883±0.042 |
CIBTS1440 | 815.03±23.984 | 4.24±0.075 |
从表5结果可见,将大肠杆菌BL21宿主菌中的磷酸甲基赤藓醇(MEP)途径增强的同时引入甲羟戊酸(MVA)途径,同时过表达异戊二烯合成酶IspS,获得了高产异戊二烯菌株CIBTS1440,摇瓶发酵异戊二烯的产量明显高于单独两个途径增强或引入相加之和,说明两个途径具有一定的协同增强作用。
实施例12:发酵罐发酵生产异戊二烯
本实施例中发酵罐发酵菌株为CIBTS1440,具体方法如下:
一级种子液:-80℃甘油保藏菌解冻后以0.1%接种量转接于50ml LB培养基中,添加相应抗生素,34℃过夜培养;二级种子液:一级种子液以1%接种量转接于2L V7S培养基中,220r/min 34℃培养至菌浓OD600为1.0;发酵罐发酵:2L二级种子液转接于18L发酵培养基中(即10%接种量),pH控制在7.0,发酵温度为34℃,当OD600到达4时,加入终浓度为110uM IPTG诱导,OD600达到40时,IPTG浓度增加至190uM,转速200-600rpm,溶氧控制在15%以上,初糖耗尽后进行葡萄糖流加培养,发酵过程中残糖浓度控制在2g/L以下,发酵48小时,发酵过程中尾气中异戊二烯浓度利用电子鼻(华东理工大学提供)进行实时检测,如图7所示。
发酵罐发酵培养基配方:
发酵罐培养基(1L):K2HPO4 7.5g,MgSO4*7H2O 2g,一水柠檬酸2g,柠檬酸铁铵0.3g,酵母粉0.5g,葡萄糖10g,维生素B10.1g,1000×微量元素1ml,pH7.0
1000×微量元素(1L):一水柠檬酸40g,MnSO4*H2O 30g,NaCl 10g,FeSO4*7H2O 1g,CoCl2*6H2O 1g,ZuSO4*7H2O 1g,CuSO4*5H2O 100mg,H3BO3100mg,NaMoO4*2H2O 100mg,pH3.0(HCl/NaOH调),滤膜过滤除菌
补料培养基(1L):葡萄糖500g,K2HPO4 5g,MgSO4*7H2O 5g
表6.发酵罐发酵异戊二烯产量及菌浓曲线
从表6发酵罐发酵结果可见,异戊二烯的产量为24.962g/L,对应葡萄糖的转化率达到22.73%,处于很高的水平。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
1.一种异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,该基因工程菌是原核细胞,其具有外源的甲羟戊酸途径,且其过表达异戊二烯合成酶。
2.如权利要求1所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,该基因工程菌中,还具有增强的磷酸甲基赤藓醇途径。
3.如权利要求1所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,所述的甲羟戊酸途径含有:乙酰辅酶A硫解酶,甲羟戊酸合成酶,甲羟戊酸激酶,磷酸甲羟戊酸激酶,二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,异戊烯基焦磷酸异构酶。
4.如权利要求2所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,所述的磷酸甲基赤藓醇途径含有:1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶,1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶,(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸合成酶,(E)-4羟基-3-甲基-2-丙烯焦磷酸还原酶,异戊烯基焦磷酸异构酶。
5.如权利要求2所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,所述的基因工程生产菌还过表达:铁氧化还原蛋白1,铁氧化还原蛋白,铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶。
6.如权利要求2所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,所述的增强的磷酸甲基赤藓醇途径为通过外源引入磷酸甲基赤藓醇途径的基因来实现增强。
7.如权利要求1-6任一所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,所述的异戊二烯合成酶,甲羟戊酸途径的各个酶,磷酸甲基赤藓醇的各个酶,铁氧化还原蛋白1,铁氧化还原蛋白,铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶,被可操作性地构建于表达盒中,通过表达载体被引入原核细胞中。
8.如权利要求1-6任一所述的异戊二烯基因工程生产菌,其特征在于,所述的原核细胞是不具备MVA途径的原核细胞;包括:大肠杆菌。
9.权利要求1-8任一所述的异戊二烯基因工程生产菌的用途,用于生产异戊二烯。
10.一种制备异戊二烯基因工程生产菌的方法,其特征在于,所述方法包括:提供原核细胞,在其中引入外源的甲羟戊酸途径,并且过表达异戊二烯合成酶,获得可生产异戊二烯基因的工程菌。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:在该原核细胞中增强的磷酸甲基赤藓醇途径。
12.一种制备异戊二烯的方法,其特征在于,所述方法包括:培养权利要求1-8任一所述的异戊二烯基因工程生产菌,从而获得异戊二烯。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,培养时,pH为7.0±0.2,温度为34±1℃。
14.如权利要求12所述的方法,其特征在于,培养异戊二烯基因工程生产菌,当OD600为4±0.5时,加入IPTG诱导,OD600为40±5时,补加IPTG,转速200-600rpm,溶氧控制在15%以上,碳源耗尽后进行葡萄糖流加培养,发酵过程中残糖浓度控制在2g/L以下,发酵48±5小时。
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Application publication date: 20170405 |
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