CN101054585A - 利用水稻蓝光受体隐花色素cry1基因改良植物的形态建成 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蓝光受体CRY1基因的用途，它被用于制备矮化的植物或用于增强植物的光反应。本发明还公开了一种使植物矮化或增强植物光反应的方法。本发明还公开了一种制备具有组成型光形态建成表现型的植物的方法。本发明的方法可减少单子叶植物对光的依赖性，从而可改进许多粮食作物或园林植物的产量和品质。

Description

利用水稻蓝光受体隐花色素CRY1基因改良植物的形态建成

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，具体地说，本发明涉及蓝光受体CRY1基因的用途，以及应用所述蓝光受体CRY1基因来制备矮化的植物和增强植物光反应的方法。

背景技术

光是生命的产生和繁衍最重要的环境因子之一，光调控着植物自种子萌发一直到开花结实的整个生长发育过程。对于高等植物而言，它不仅是光合作用的能量来源，同时也是调节植物重要生命活动——光形态建成、光周期反应以及内在生物钟节律性调节的信号来源。植物每时每刻都根据周围光照时间长短、光照强度、光照周期等条件的变化，不断调节自己生命活动过程，以最大限度地适应周围的环境。

太阳光由七色光组成，其中最有效的光源是蓝光，红光和远红光。蓝光要发挥其信号的调控作用，必须通过由蓝光受体介导的信号传导途径来实现。在双子叶模式植物拟南芥菜中，目前主要有四种蓝光受体：CRY1，CRY2，PHOT1，PHOT2。其中，CRY1、CRY2在植物光形态建成、开花时间、花色素苷合成和生物节律性等重要生理过程中发挥重要的调控作用。

与双子叶植物相比，在形态上，单子叶植物不具有下胚轴和子叶，而具有中胚轴和胚芽鞘。在开花调控方面，双子叶模式植物拟南芥菜是长日照植物，而单子叶的模式植物水稻是短日照植物。因此在光形态建成及开花调控这两个重要生理过程方面，双子叶植物和单子叶植物具有一定的区别。

水稻、玉米、大麦、小麦、高粱等单子叶植物都是我国重要的粮食作物，改进它们的产量和品质对确保我国农业持续稳定发展有十分重要的战略意义。但是，目前对于各种单子叶植物蓝光受体功能及机理的研究还不清楚。因此，迫切需要找到可影响单子叶植物光形态建成、增强植株光反应且使植株矮化的方法，以改进一些粮食作物的产量，或者改良观赏类和园林绿化类经济植物如草坪草等。

发明内容

本发明的目的在于提供蓝光受体CRY1基因的用途，用于：(i)制备矮化的植物；(ii)增强植物的光反应。

本发明的另一目的在于提供一种使植物矮化或增强植物光反应的方法。

本发明的另一目的在于提供一种制备具有组成型光形态建成表现型的植物的方法。

在本发明的第一方面，提供一种蓝光受体CRY1基因的用途，用于：

(i)制备矮化的植物；或

(ii)增强植物的光反应。

在本发明的另一优选例中，所述矮化的植物是指：在种植条件、种植天数相同的前提下，比正常生长的同种类植物矮10％(更优选的为20％；最优选的为30％或大于30％)的植物。

在本发明的另一优选例中，所述的植物为单子叶植物。

在本发明的另一优选例中，所述的植物选自下组：

禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、或蓝雪科补血草属。

在本发明的另一优选例中，所述的植物为水稻。

在本发明的另一优选例中，所述的蓝光受体CRY1基因是选自以下植物的蓝光受体CRY1基因：禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、或蓝雪科补血草属。

在本发明的另一优选例中，所述的蓝光受体CRY1基因为水稻的蓝光基因受体OsCRY1a，或OsCRY1b。

在本发明的另一优选例中，所述蓝光受体CRY1基因编码全长的蓝光受体CRY1蛋白或其功能区(即植物CRY1蛋白C-末端约180-260个氨基酸，更优选的，为植物CRY1蛋白C-末端约190-220个氨基酸)。

在本发明的另一优选例中，所述的蓝光受体CRY1基因选自下组：

(a)编码蓝光受体CRY1蛋白功能区的核苷酸序列；

(b)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(c)具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

(d)具有SEQ ID NO：1第1494-2133位的核苷酸序列；

(e)具有SEQ ID NO：2第1494-2103位的核苷酸序列；或

(f)(a)-(e)任一基因与GUS基因的融合基因。

在本发明的第二方面，提供一种融合基因，包括第一部分和第二部分，其中，

所述的第一部分为：GUS基因；

所述的第二部分为：蓝光受体CRY1基因。

在本发明的另一优选例中，所述的第一部分和第二部分之间还包括：3-30个核苷酸的连接序列。

在本发明的另一优选例中，GUS基因位于融合基因的5’端，蓝光受体CRY1基因位于融合基因的3’端。

在本发明的另一优选例中，所述的融合基因具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白由所述的融合基因编码而成。

在本发明的第三方面，提供所述的融合基因或其编码蛋白的用途，用于：

(a)制备矮化的植物；

(b)增强植物的光反应；或

(c)制备具有组成型光形态建成(COP)表现型的植物。

在本发明的第四方面，提供一种制备矮化的植物或增强植物光反应的方法，包括：

(1)使所述植物过量表达蓝光受体CRY1基因；或

(2)使所述植物表达所述的融合基因(更优选的，使所述植物过量表达所述的融合基因)。

在本发明的另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(1’)将外源的蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因转入植物细胞或组织，获得转化入外源蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因的植物细胞或组织；和

(2’)将步骤(1)获得的转入了外源蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因的植物细胞或组织再生成植物植株。

在另一优选例中，将外源的蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因转入植物细胞或组织的方法选自：

(a)农杆菌介导的转化法；

(b)基因枪法；

(c)离子束介导法；

(d)脂质体法；

(e)激光微束法；或

(f)超声波法。

在本发明的另一优选例中，所述的植物为单子叶植物。

在本发明的另一优选例中，所述植物选自下组：禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、或蓝雪科补血草属。

在本发明的另一优选例中，所述的植物为水稻。

在本发明的第五方面，提供一种制备具有组成型光形态建成表现型的植物的方法，所述的方法包括：使所述植物表达所述的融合基因(更优选的，使所述植物过量表达所述的融合基因)。

在本发明的另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(1)将所述的融合基因转入植物细胞或组织，获得转化入所述的融合基因的植物细胞或组织；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述的融合基因的植物细胞或组织再生成植物植株。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了蓝光(左)和黑暗(右)下生长7天的水稻幼苗。其中，箭头所指的为水稻幼苗的形态结构图；a为胚芽鞘的长；b为第一叶的叶长；c为第二叶的叶鞘长；d为第二叶的叶片长；α表示叶展角(即：第二叶的叶片与Y轴的夹角)。

图2显示了OsCRY1b过表达的转基因植株介导增强的蓝光反应，而GUS-OsCRY1b，GUS-OsCCT1b，GUS-OsCCT1a呈现出黑暗下组成型的光形态(COP表现型，即叶鞘明显变短，叶片与Y轴之间有个明显夹角)和其它光质条件下的超敏感光反应。其中，OsCRY1b-ovx(27)是指过量表达OsCRY1b的转基因植株。

图3为Western印迹分析检测部分OsCRY1b转基因植株不同的独立株系中OsCRY1b蛋白的表达水平。

图4为Western印迹分析检测部分GUS-OsCRY1b转基因植株不同的独立株系中GUS-OsCRY1b蛋白的表达水平。

图5为Western印迹分析检测部分GUS-OsCCT1b转基因植株不同的独立株系中GUS-OsCCT1b蛋白的表达水平。

图6为Western印迹分析检测部分GUS-OsCCT1a转基因植株不同的独立株系中GUS-OsCCT1a蛋白的表达水平。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现蓝光受体CRY1基因的过量表达能够使单子叶模式植物水稻矮化，增强植物的光反应，从而减少植物对光的依赖性；并且还发现GUS基因与蓝光受体CRY1基因的融合基因能够使植物在黑暗下呈现组成型的光形态。基于此完成了本发明。

本发明的方法特别适用于改良单子叶植物。所述的植物包括但不限于：禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、蓝雪科补血草属等。

在本发明的优选方式中，本发明的方法特别适用于改良水稻等粮食作物，获得矮杆、半矮杆、抗倒伏、且生长茁壮、光利用率高的粮食作物，通过将粮食作物合理密植增加早期产量，从而提高土地光能利用率。

在本发明的优选方式中，本发明的方法特别适用于改良观赏类和园林绿化类经济植物如草坪草等。在用于草坪草时，可减少草坪草对光的依赖性，即使在背阴的地方也能茁壮生长；并且还可以根据蛋白表达的高低来选择株形的高低，多方面地适应园林绿化的需求并且可以减少园林绿化的管理成本。

如本文所用，“蓝光受体隐花色素CRY1”、“隐花色素CRY1”、蓝光受体CRY1”、“CRY1”可互换使用。

如本文所用，所述的“蓝光受体CRY1基因”编码全长的蓝光受体CRY1蛋白或所述的蓝光受体CRY1蛋白的功能区。在单子叶植物水稻中，CRY1蛋白的功能区一般为在CRY1蛋白的C-末端约180-260个氨基酸，更优选的，为植物CRY1蛋白C-末端约190-220个氨基酸。

如本文所用，“OsCRY1”是指水稻的蓝光受体CRY1，“OsCRY1a”是指一个编码水稻的蓝光受体CRY1的基因，“OsCRY1b”是指另一个编码水稻的蓝光受体CRY1的基因。

如本文所用，“OsCCT1a基因”是指编码水稻蓝光受体OsCRY1a蛋白的C端功能区的OsCRY1a的基因片段；“OsCCT1b基因”是指编码水稻蓝光受体OsCRY1b蛋白的C端功能区的OsCRY1b的基因片段。

如本文所用，“GUS基因”是指β-葡糖苷酸酶基因，当它的产物-β-葡糖苷酸酶与特定的生色底物-X-Gluc试剂结合时，能产生特定的蓝颜色反应，因此，以往的研究中一般作为植物转基因研究中的报道基因。在本发明中，GUS基因与CRY1基因形成的融合基因在植物中表达或过表达能够使植物在黑暗下呈现组成型的光形态。GUS基因的序列的GenBank登录号为：S69414。

如本文所用，“融合基因GUS-OsCRY1b”是指由GUS基因与全长的OsCRY1b融合而成的基因。

如本文所用，“融合基因GUS-OsCCT1a”是指由GUS基因与OsCCT1a基因融合而成的基因。

如本文所用，“融合基因GUS-OsCCT1b”是指由GUS基因与OsCCT1b基因融合而成的基因。

如本文所用，“光形态建成”是指依赖光控制细胞的分化、结构和功能的改变，最终汇集成组织和器官的建成的过程，亦即光控制发育的过程。

如本文所用，“组成型光形态建成”是指本身不受光启动的光形态建成的过程。

蓝光受体CRY1

蓝光受体CRY1基因是一种目前已知的基因，广泛存在于各种植物中，其在各种植物中是较为保守的。CRY具有两个明显的功能区，一个是氨基末端区域PHR，与光裂解酶有很高的同源性；另一个是羧基末端区域，与目前已知的蛋白质没有紧密地序列相似性。目前，有关拟南芥菜CRY的功能研究的最为详细，其他的双子叶植物如番茄和豌豆中，CRY功能的研究也有良好的进展。但是有关CRY在单子叶植物中的功能目前还没有报道。

由于单子叶植物和双子叶植物在形态及开花调控方面具有显著的差别，因此本发明提供的水稻CRY1的例子，可以更好的应用到其它单子叶植物中。在水稻中，存在水稻CRY1a基因(即OsCRY1a)和水稻CRY1b(即OsCRY1b)基因，其中OsCRY1a基因的在NCBI中的登记号为AB073546，cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；OsCRY1b基因在NCBI中的登记号为AB073547，cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中，可通过各种方法来获得蓝光受体CRY1，包括但不限于：PCR扩增法、重组法、或人工合成法。

对于PCR扩增法，可根据已知的蓝光受体CRY1的序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，将所述序列克隆入载体，再转化植物细胞或组织，培养所述植物细胞或组织，获得转基因植物。

一般的，本发明所用的载体为适合用于转化植物细胞或植物组织的载体，包括但不限于：pKYL71载体、pHB载体、或pCambia 1301、pCambia 1302、pCambia3301等。

通常，在单子叶植物中，所述的蓝光受体CRY1基因还包括：编码CRY1蛋白的功能区的CRY1基因的片段，所述基因片段是位于CRY1的3’端的540-780个核苷酸；更优选的，所述基因片段是位于CRY1的3’端的570-660个核苷酸。

更特别的，以水稻为例，编码OsCRY1a蛋白的功能区的OsCRY1a基因的片段(OsCCT1a)是位于OsCRY1a基因的3’端1494-2133位核苷酸；编码OsCRY1b蛋白的功能区的OsCRY1b基因的片段(OsCCT1b)是位于OsCRY1a基因的3’端1494-2103位核苷酸。

GUS基因与CRY1基因的融合基因

本发明构建了一种融合基因，包括第一部分和第二部分，其中，所述的第一部分为：GUS基因；所述的第二部分为：蓝光受体CRY1基因。

本发明对制备所述融合基因的方法没有特别的限制，可采用本领域常规用于制备融合基因的方法。

在制备融合基因时，可以将两种基因片段直接相连接，在必要的情况下也可以在两种基因片段之间设置一段连接序列。在本发明的一种方式中，所述的第一部分和第二部分之间还包括：3-30个核苷酸的连接序列。

在本发明的一种方式中，GUS基因位于融合基因的5’端，蓝光受体CRY1基因位于融合基因的3’端。

在本发明的优选方式中，所述的融合基因具有：

(i)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列(即GUS基因与OsCRY1b基因的融合基因)；

(ii)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(即GUS基因与OsCCT1a基因的融合基因)；或

(iii)SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列(即GUS基因与OsCCT1b基因的融合基因)。

植物的转基因

植物的转基因是指将目的基因转化进入植物并整合到植物基因组中的技术。用重组DNA转化植物可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。所述技术包括但不限于：

(a)农杆菌介导的转化法；(b)基因枪法；(c)离子束介导法；(d)脂质体法；(e)激光微束法；或(f)超声波法。

转基因植株的基因能否表达，还要对其进行筛选，需要区分转化的植株或细胞，为了能更早地筛选转基因植株或细胞，在构建载体时，将一些具有特殊标记的报告基因构建到载体上，也可用分子生物学方法进行检测，例如分子杂交，包括点杂交(Dot Blot)，Southern印迹，Northern印迹，Western印迹和PCR等方法。

使植物矮化或增强植物光反应的方法

本发明还提供了一种使植物矮化或增强植物光反应的方法，包括：

(1)使所述植物过量表达蓝光受体CRY1基因；或

(2)使所述植物表达GUS与CRY1的融合基因。

在本发明的优选方式中，所述的方法包括步骤：

(1’)将外源的蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因转入植物细胞或组织，获得转化入外源蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因的植物细胞或组织；和

(2’)将步骤(1)获得的转入了外源蓝光受体CRY1基因或所述的融合基因的植物细胞或组织再生成植物植株。

在本发明的一个实施例中，通过过量表达所述CRY1基因的全长而使功能增强。在本发明的另一个实施例中，通过过量表达GUS与编码CRY1蛋白功能区的CRY1基因片段的融合基因而呈现出组成型的增强光反应的表型。

当使所述植物表达GUS基因和蓝光受体CRY1基因(如GUS-OsCRY1b、GUS-OSCCT1a、GUS-OSCCT1b)时，即可达到使植物矮化或增强植物光反应的目的。更优选的，使所述植物过量表达GUS基因和蓝光受体CRY1基因的融合基因。通过过量表达所述融合基因，可减少植物对光的依赖性，即使在背阴的地方也能茁壮生长。

本发明的方法特别适合于使单子叶植物矮化以及增强单子叶植物的光反应。在本发明的优选方式中，所述植物选自下组：禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、或蓝雪科补血草属。

在本发明的优选例中，所述的植物为水稻。并且，当所述的植物为水稻时，所述的蓝光受体CRY1基因为水稻的蓝光基因受体OsCRY1a基因，或OsCRY1b基因。

在本发明的优选方式中，使所述植物过量表达蓝光受体CRY1基因或GUS基因与CRY1基因的融合基因的方法选自：

(a)农杆菌介导的转化法；(b)基因枪法；(c)离子束介导法；(d)脂质体法；(e)激光微束法；或(f)超声波法。

通过过量表达CRY1基因获得矮化及增强光反应的植株适用于各种单子叶植物。可采用本领域已知的各种方法来使CRY1基因过量表达。在本发明的优选方式中，以水稻为例，通过PCR方法分别获得OsCRY1a，OsCRY1b cDNA全长，分别插入pKYL71载体[参见Schardl，C.L.，Byrd，A.D.，Benzion，G.，Altschuler，M.A.，Hildebrand，D.F.，和Hunt，A.G.(1987).“Design andconstruction of a versatile system for the expression of foreign genesin plants”.Gene 61，1-11]或pHB载体[参见Jian Mao，Yan-Chun Zhang，Yi Sang，Qing-Hua Li，and Hong-Quan Yang(2005)A role for Arabidopsiscryptochromes and COP1 in the regulation of stomatal opening.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102，12270-12275.]中的35S启动子后面获得过量表达OsCRY1a，OsCRY1b的植物表达载体。再将这些载体分别转化植物，获得转基因植株。分别在中等强度蓝光下(20μmol.m^-2.s^-1)筛选胚芽鞘明显变短(正常的约为3-5mm，明显变短的约为2-3mm)的小苗，获得的转基因植株为过量表达OsCRY1a，OsCRY1b的转基因植株。

使植物呈现黑暗下的组成型光形态的方法

使植物呈现黑暗下的组成型光形态的方法包括：使所述植物表达GUS与CRY1基因的融合基因。

在本发明的优选方式中，所述的方法包括步骤：

(1)将所述的融合基因转入植物细胞或组织，获得转化入所述的融合基因的植物细胞或组织；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述的融合基因的植物细胞或组织再生成植物植株。

在本发明的一种优选方式中，通过使植物过量表达GUS与CRY1基因(包括编码CRY1蛋白功能区的CRY1基因片段)的融合基因而使植物呈现黑暗下的组成型光形态。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次证实过表达蓝光受体CRY1基因能够使单子叶植物矮化或增强单子叶植物光反应。

(2)本发明首次证实过量表达GUS与CRY1基因的融合基因能够使单子叶植物呈现出增强光反应的表型，以及使植物呈现出黑暗下的组成型光形态。

(3)本发明提供了使单子叶植物矮化或增强植物的光反应的方法，可减少单子叶植物对光的依赖性，从而可改进许多粮食作物(如水稻、玉米等)的产量和品质。并且可以用来改良园林绿化植物如草坪草等的光形态建成，以便更好地适应园林绿化建设。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：Alaboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A LaboratoryMannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1过量表达OsCRY1b，OsCRY1a转基因植株的构建

根据GenBank登录号AB073546所提供的序列合成OsCRY1a全长，或通过PCR方法从常规的水稻基因组文库中获得OsCRY1a的功能区序列，使其与GUS融合后，插入载体pHB中的HindIII和SacI酶切位点获得可过量表达OsCRY1a的植物表达载体。

根据GenBank登录号AB073547所提供的序列合成OsCRY1b全长，或通过PCR方法从常规的水稻基因组文库中获得OsCRY1b全长，插入载体pHB中的35S启动子后面HindIII和SacI获得可过量表达OsCRY1b的植物表达载体。

再将上述载体分别转化水稻愈伤组织，培养水稻愈伤组织，获得转基因植株。在中等强度蓝光(20μmol.m^-2.s^-1)筛选叶鞘或者胚芽鞘明显变短的小苗，获得的转基因植株为过量表达OsCRY1b的转基因植株。

实施例2融合基因GUS-OsCCT1a，GUS-OsCCT1b和GUS-OsCRY1b的构建

通过常规的PCR方法扩增GUS基因(GenBank登录号：S69414)，将获得的GUS基因与前述获得的OsCRY1b融合，获得融合基因GUS-OsCRY1b，所述融合基因的序列见SEQ ID NO：3所示。

同样地，采用常规的技术将GUS基因分别与OsCCT1a和OsCCT1b融合，获得融合基因GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b，所述融合基因的序列见SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

将上述获得的融合基因采用常规的农杆菌介导的水稻成熟胚的转化方法分别转化水稻。

实施例3光形态建成反应的研究

1.光形态建成研究

去壳的水稻颖果先用70％的酒精灭菌两分钟，然后再用20％漂白剂灭菌40分钟。无菌水冲洗4-6次后种植于含有0.8％琼脂粉和2％蔗糖的MS培养基上，并且放置于30℃培养箱中，黑暗下处理两天诱导发芽。将发芽的种子移植到新鲜的MS培养基容器中。容器的尺寸为77×77×97mm，型号为Sigma，Magentavessel GA-7 V8505。

2.光源

植物生长时所用的光源是E-30 LED生长培养箱，蓝光的波长为469纳米，红光的波长为680纳米，远红光的波长为730纳米，在连续光照条件下的温度是22℃。光谱测定用的仪器是美国ASD公司的便携式光谱仪，光强测定用的仪器是美国Li-Cor公司的Li250光量子测定仪。

实施例4过量表达OsCRY1b对植株的影响

首先本发明人观测了分别在黑暗下和蓝光下生长了7天的野生型的水稻幼苗，发现黑暗下野生型幼苗的胚芽鞘，第一叶(不含叶片，只有叶柄，也称不完全叶)，第二叶的叶片和叶柄都明显的长于蓝光下幼苗的相应部分。这表明蓝光抑制胚芽鞘和第一叶的伸长。除此之外，黑暗下第二叶的叶片是蜷曲的，不张开的，垂直生长，与Y轴之间没有夹角，而蓝光下生长的幼苗，第二叶的叶片完全张开并且伸展，与Y轴之间有个明显的夹角，即具有明显的叶展角，如图1所示。

为了检测OsCRY1b是否参与此反应，本发明人制备了过量表达OsCRY1b的转基因植株。本发明人共获得9株独立的转基因植株，可采用Western印迹的方法来检测植物中目的蛋白的表达水平。图3为Western印迹分析检测部分OsCRY1b转基因植株不同的独立株系(代号为：OsCRY1b(25)、OsCRY1b(26)、OsCRY1b(27))中OsCRY1b蛋白的表达水平。

上述的9株转基因植株呈现出增强的蓝光反应，但在其他光质条件下如红光，远红光以及黑暗条件下与野生型没有明显差别(图2)。

本发明人测量了所有光质条件下幼苗的胚芽鞘长，第一叶长，第二叶的叶鞘长和叶片长，如表1所示(测量蓝光、红光和远红光条件下7天以及黑暗下9天的水稻幼苗的胚芽鞘长、第一叶长、第二叶的叶鞘和叶片长；每种基因型测量20个单株；SD为标准偏差)，过量表达OsCRY1b的转基因植株，其胚芽鞘，第一叶，第二叶的叶鞘和叶片的长度在蓝光下明显短于野生型。而在其他光质条件下和野生型没有明显差别。

这些数据表明：OsCRY1b可作为水稻蓝光受体，介导在早期幼苗发育中蓝光抑制的胚芽鞘及叶片伸长的反应。

                     表1  水稻胚芽鞘和叶长的测量

光质	植物基因型	胚芽鞘(mm)	初生叶(mm)	第二叶叶鞘(mm)	第二叶叶片(mm)
						黑暗蓝光红光远红光	WTOsCRY1b-ovx(27)GUS-OsCRY1b(2)GUS-OsCCT1b(10)WTOsCRY1b-ovx(27)GUS-OsCRY1b(2)GUS-OsCCT1b(10)WTOsCRY1b-ovx(27)GUS-OsCRY1b(2)GUS-OsCCT1b(10)WTOsCRY1b-ovx(27)GUS-OsCRY1b(2)GUS-OsCCT1b(10)	19.45±7.7316.11±6.304.15±1.215.31±1.224.31±0.822.91±0.433.63±0.202.92±0.435.56±0.654.17±0.712.77±0.332.42±0.327.22±0.957.36±1.414.14±0.833.25±0.33	38.06±4.2134.63±5.5211.57±1.8211.47±1.9214.17±1.245.88±0.717.56±1.016.26±0.7417.61±1.6214.56±1.5310.04±1.315.97±0.5120.49±2.3120.71±2.5210.29±1.416.35±0.45	109.68±11.32106.38±10.9322.22±1.6419.75±1.6329.88±2.238.21±1.6413.98±1.628.81±1.0250.65±5.2346.41±3.5218.88±2.938.13±0.5966.42±7.8263.05±9.5517.64±3.117.78±0.42	26.11±3.5123.01±4.0214.55±0.3111.58±0.4117.51±1.716.43±1.9111.04±1.488.73±0.8119.84±3.5220.57±2.2212.81±2.017.70±0.6424.91±4.6125.43±4.8214.37±0.478.26±0.47

因此，过量表达OsCRY1b的转基因植株呈现出蓝光下胚芽鞘及叶片明显缩短的表现型。

实施例5 GUS-OsCCT1a，GUS-OsCCT1b和GUS-OsCRY1b转基因植株介导水稻中的COP表现型

1.GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b的转基因植物的表现型

本发明人将携带GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b片段的载体转入野生型水稻中，分别获得了5株GUS-OsCCT1a过量表达和12株GUS-OsCCT1b过量表达的转基因植株。

可采用Western印迹的方法来检测植物中目的蛋白的表达水平。图5为Western印迹分析检测部分GUS-OsCCT1b转基因植株不同的独立株系(代号为：GUS-OsCCT1b(10)、GUS-OsCCT1b(8)、GUS-OsCCT1b(5))中GUS-OsCCT1b蛋白的表达水平。其中，WT表示野生型。

图6为Western印迹分析检测部分GUS-OsCCT1a转基因植株不同的独立株系(代号为：GUS-OsCCT1a(1)、GUS-OsCCT1a(2)、GUS-OsCCT1a(10))中GUS-OsCCT1a蛋白的表达水平。其中，WT表示野生型。

观察发现，这些转基因植株在黑暗下种植时，呈现出COP表现型，即第二叶完全伸展并张开，叶鞘变短，第二叶的叶片与Y轴之间有个明显的叶展角(图2和表1)。这个形态在野生型中通常只有光下才能看到(图1，左)。

进一步研究发现GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b的幼苗在蓝光，红光和远红光的光质条件下也呈现出明显矮化的表型(图2和表1)。

2.GUS-OsCRY1b融合基因的转基因植物的表现型

本发明人将构建好的GUS与OsCRY1b的融合基因转入野生型水稻中，共获得21株转基因植株。

图4为Western印迹分析检测部分GUS-OsCRY1b转基因植株不同的独立株系(代号为：GUS-OsCRY1b(2)、GUS-OsCRY1b(5)、GUS-OsCRY1b(7))中GUS-OsCRY1b蛋白的表达水平。其中，WT表示野生型。

这些植株呈现出黑暗下的COP表现型，并且在蓝光，红光和远红光的光质条件下呈现出矮化的表现型(图2和表1)，这种表型与GUS-OsCCT1a和GUS-OsCCT1b的转基因植株的表现型是相似的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                            序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>利用水稻蓝光受体隐花色素CRY1基因改良植物的形态建成

<130>062253

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2133

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

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gtggtgtggt tcaggcggga cctgcgcgtg gaggacaacc cggcgctggc ggcggcggcg   120

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ccgctgtcgc tggtgaggga ccaccgggtg aaggcgctgc tgacggccga gggcatcgcc   420

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<210>2

<211>2103

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<213>水稻(0ryza sativa)

<400>2

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<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

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<400>3

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<210>4

<211>2454

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>4

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caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac   720

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca   780

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attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg   1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct   1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc   1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa   1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt   1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg   1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt   1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg   1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt   1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg   1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc   1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata   1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg   1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga   1800

ggcaaacaaa ctagtgagat gtgggagctc gaggccgcgt cacgcgcagc gatggagaac   1860

ggaatggagg agggcctcgg cgactcctcc gacgtgccgc cgatcgcctt cccaccggag   1920

ctgcagatgg aagttgaccg agcaccggcc cagcctactg ttcacggacc gacaacggct   1980

ggccggcgac gagaggatca gatggttccc agcatgacct cctcgctggt cagagctgaa   2040

acagaacttt cagcggattt tgacaacagc atggacagta ggccggaggt gccgtcgcag   2100

gtgctcttcc agcctcggat ggaaagggaa gaaacagtgg acggcggcgg tggcggcgga   2160

atggtcggca ggagcaacgg cggcggccac caaggccaac accagcagca acagcacaac   2220

tttcagacta caattcaccg ggcacggggc gttgcgccgt ctacgtcaga ggcatcaagc   2280

aactggactg ggagagaagg cggcgtggtg cccgtctggt cgcctccggc agcgtcaggc   2340

ccctcagatc actacgctgc cgatgaagct gacattacca gtagaagtta tttggacagg   2400

catccacagt cgcatacgtt gatgaactgg agtcagctct cgcagtcatt gtga         2454

<210>5

<211>2427

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>5

atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca   60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa   120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt   180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca   240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat   300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg   360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg   420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac   480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg   540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg   600

tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat   660

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac   720

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca   780

gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag   840

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac   900

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg   960

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg   1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct   1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc   1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa   1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt   1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg   1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt   1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg   1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt   1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg   1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc   1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata   1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg   1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga   1800

ggcaaacaaa ctagtgaaat gtggcagctt gaggcagcat ccagggccgc aatggacaat   1860

ggaatggaag aaggccttgg cgactcctcg gaggttccac caattgaatt tcctcgagaa   1920

ctacagatgg aagttgaccg agaaccagct cgagtaacag ccaatgtgct gacaacagct   1980

cgaagacgcg aggatcagat ggtgccaaca atgacatctt cactaaacag ggctgaaact   2040

gagatttctg ccgattttat gaacagtgtg gacagtaggg cagaggtacc aacccgtgtg   2100

aattttgagc ctgcaactga gcgggaagaa aatttccgta ccactgcggg aaatgttgct   2160

agaacaaatg gtattcatga gcacaataat ttccagcaac ctcagcaccg tatgcgaaat   2220

gttctagcac catctgtatc agaggcatca agtggctgga ctgggagaga gggaggcgta   2280

gtcccagttt ggtcgcctcc tgcagcatca gaccattcag aaacttttgc ctctgatgaa   2340

gctgacattt ctagtaggag ttatttggat aggcatccac agtcgcaccg gttgatgaac   2400

tggagtcaat tatcccagtc attgtga                                       2427

Claims (10)

1.一种蓝光受体CRY1基因的用途，其特征在于，用于：

(i)制备矮化的植物；或

(ii)增强植物的光反应。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物为单子叶植物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的植物选自下组：

禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、或蓝雪科补血草属。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蓝光受体CRY1基因是选自以下植物的蓝光受体CRY1基因：禾本科稻属、禾本科大麦属、禾本科羊茅族早熟禾属、禾本科剪股颖族剪股颖属、旋花科马蹄金属、豆科三叶草属、桑科榕属、棕榈科散尾葵属、或蓝雪科补血草属。

5.一种融合基因，包括第一部分和第二部分，其特征在于，

所述的第一部分为：GUS基因；

所述的第二部分为：蓝光受体CRY1基因或CRY1C端功能区编码序列。

6.权利要求5所述的融合基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，用于：

(a)制备矮化的植物；

(b)增强植物的光反应；或

(c)制备具有组成型光形态建成表现型的植物。

7.一种制备矮化的植物或增强植物光反应的方法，其特征在于，包括：

(1)使所述植物过量表达蓝光受体CRY1基因；或

(2)使所述植物表达权利要求5所述的融合基因。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1’)将外源的蓝光受体CRY1基因或权利要求5所述的融合基因转入植物细胞或组织，获得转化入外源蓝光受体CRY1基因或权利要求5所述的融合基因的植物细胞或组织；和

(2’)将步骤(1)获得的转入了外源蓝光受体CRY1基因或权利要求5所述的融合基因的植物细胞或组织再生成植物植株。

9.一种制备具有组成型光形态建成表现型的植物的方法，其特征在于，所述的方法包括：使所述植物表达权利要求5所述的融合基因。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将权利要求5所述的融合基因转入植物细胞或组织，获得转化入权利要求5所述的融合基因的植物细胞或组织；和

(2)将步骤(1)获得的转入了权利要求5所述的融合基因的植物细胞或组织再生成植物植株。

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