CN109182583B

CN109182583B - 用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物

Info

Publication number: CN109182583B
Application number: CN201811219778.6A
Authority: CN
Inventors: 张映; 刘富中; 杨锦坤; 陈钰辉; 连勇
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109182583A

Abstract

本发明公开了用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物。本发明提供了下述P1‑P4中任一种作为茄子基因表达分析中的内参基因的应用：P1、由D1、D4和D5这三个基因组成的成套基因；P2、由D1和D5这两个基因组成的成套基因；P3、由D4和D5这两个基因组成的成套基因；P4、D5；P1‑P4中，所述D5是编码氨基酸序列是序列2的蛋白质的基因，所述D4是编码氨基酸序列是序列4的蛋白质的基因；所述D1是编码氨基酸序列是序列6的蛋白质的基因。本发明不仅为低温和/或常温条件下茄子不同果实发育时期的基因表达水平的标准化定量提供了可靠的内参基因。本发明将进一步促进茄子不同果实发育时期低温抗性基因的研究。

Description

用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物

技术领域

本发明涉及生物学领域中用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)是世界上最受欢迎的蔬菜作物之一。与大多数喜温蔬菜一样，茄子在低温条件下不容易坐果，从而严重影响了茄子的产量和品质(NothmannJ,Koller D.Effects of growth regulators on fruit and seed development ineggplant(Solanum melongena L.).J Hort Sci.1975；50:23-7)。为了避免低温造成的重大损失，生产中常常采用栽培耐低温茄子品种的方法。然而，目前茄子中与低温抗性相关的主效基因尚未被挖掘，茄子低温抗性的分子机制也有待进一步的研究。

在进行功能基因筛选及相关分子机理研究时，基因转录表达量检测是一种重要手段。目前，诸如DNA微阵列技术，Northern印记分析法，核糖核酸酶保护法和实时荧光定量PCR等都被广泛地应用于基因表达水平的研究中。在这些技术中，荧光定量PCR技术凭借高灵敏度，高准确性，高特异性，高通量和低成本等优势成为当前最常用的基因表达水平检测工具(Wong ML,Medrano JF.Real-time PCR for mRNAquantitation.BioTechniques.2005；39:75-85)。然而，在进行荧光定量PCR试验时，为了避免定量结果出现偏差，选择合适的内参基因用于标准化目的基因的表达定量是十分必要的。内参基因，也被称作看家基因，一般认为内参基因能够在不同发育阶段，不同组织类型和不同试验条件中均稳定表达。

由于内参基因能够在不同试验条件中稳定表达，因此在确保荧光定量PCR结果的准确性方面具有重要作用。已报道的常用作内参基因的有actin，glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)，TUB，ubiquitin(UBQ)和18S ribosomal RNA(18S)(Bustin SA.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR(RT-PCR):trends and problems.J Mol Endocrinol.2002；29:23–39)。然而，许多研究均表明，这些内参基因在不同的植物材料，不同的植物组织和试验处理中有明显的表达水平的差异(Li J,Han J,Hu Y,Yang J.Selection of reference genes for quantitativereal-time PCR during flower development in tree peony(Paeonia suffruticosaAndr.).Front Plant Sci.2016；7:516；Qi S,Yang L,Wen X,Hong Y,Song X,Zhang M,etal.Reference gene selection for RT-qPCR analysis of flower development inchrysanthemum morifolium and chrysanthemum lavandulifolium.Front PlantSci.2016；7:287；Sinha P,Saxena RK,Singh VK,Krishnamurthy L,VarshneyRK.Selection and validation of housekeeping genes as reference for geneexpression studies in Pigeonpea(Cajanus cajan)under heat and salt stressconditions.Front Plant Sci.2015；6:1071；Li W,Qian YQ,Han L,Liu JX,SunZY.Identification of suitable reference genes in buffalo grass for accuratetranscript normalization under various abiotic stress conditions.Gene.2014；547:55–62)。因此，在进行基因表达研究前，选择和评价不同试验条件中合适可靠的内参基因是十分重要的。目前有关茄子内参基因筛选的报道包括在高温胁迫下茄子中表达最稳定的两个内参基因SmEf1α和SmTRX(庞强强,李植良,罗少波,陈日远,金庆敏,黎振兴,李德明,孙保娟,孙光闻.高温胁迫下茄子qRT-PCR内参基因筛选及稳定性分析[J].园艺学报,2017,44(03):475-486)；此外，Kanakachari等分析茄子不同果实发育时期内参基因稳定性的结果显示，geNorm认为SAND和TBP是最稳定的内参基因组合，而NormFinder则认为Expressed是最佳的内参基因(Kanakachari M,Solanke AU,Prabhakaran N,Ahmad I,Dhandapani G,Jayabalan N,et al.Evaluation of suitable reference genes for normalization ofqPCR gene expression studies in brinjal(Solanum melongena L.)During fruitdevelopmental stages.Applied Biochemistry&Biotechnology.2016；178:433-50)。迄今为止，还没有适用于茄子低温条件下不同果实发育时期内参基因的相关报道。因此，筛选及评价低温条件下茄子不同果实发育时期的内参基因将有助于提高茄子低温抗性基因选择的准确性，并为茄子耐低温分子机制的研究打下基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供低温和/或常温条件下，茄子基因表达分析中的稳定性高的内参基因。

为了解决以上技术问题，本发明提供了下述P1-P4中任一种作为茄子基因表达分析中的内参基因的应用：

P1、由D1、D4和D5这三个基因组成的成套基因；

P2、由D1和D5这两个基因组成的成套基因；

P3、由D4和D5这两个基因组成的成套基因；

P4、D5；

P1-P4中，所述D5是编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的基因，所述D4是编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的基因；所述D1是编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质的基因。

上述应用中，所述D5可为编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；所述D4可为编码序列是SEQ ID No.3的DNA分子；所述D1可为编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子。

上述应用中，所述茄子基因表达分析可为分析茄子基因转录水平。

为了解决以上技术问题，本发明提供了用于茄子基因表达分析的试剂。

本发明所提供的用于茄子基因表达分析的试剂为下述R1-R4中的任一种：

R1、由名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质、名称为W4的检测权利要求1或2所述的D4表达水平的物质和名称为W1的检测权利要求1或2所述的D1表达水平的物质组成；

R2、由名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质和名称为W1的检测权利要求1或2所述的D1表达水平的物质组成；

R3、由名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质和名称为W4的检测权利要求1或2所述的D4表达水平的物质组成；

R4、名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质。

上述试剂中，所述W5可为PCR扩增所述D5全长或其片段的引物，所述W4可为PCR扩增所述D4全长或其片段的引物，所述W1可为PCR扩增所述D1全长或其片段的引物。

上述试剂中，所述PCR可为荧光定量PCR和普通定量PCR。

上述试剂中，所述W5可为由D5-F和D5-R组成的D5特异引物对，所述D5-F是SEQ IDNo.7所示的单链DNA，所述D5-R是SEQ ID No.8所示的单链DNA；

所述W4可为由D4-F和D4-R组成的D4特异引物对，所述D4-F是SEQ ID No.9所示的单链DNA，所述D4-R是SEQ ID No.10所示的单链DNA；

所述W1可为由D1-F和D1-R组成的D1特异引物对，所述D1-F是SEQ ID No.11所示的单链DNA，所述D1-R是SEQ ID No.12所示的单链DNA。

含有上述试剂的用于茄子基因表达分析的试剂盒也属于本发明的保护范围。

上述用于茄子基因表达分析的试剂盒除含有所述试剂外，还可含有进行PCR(如荧光定量PCR)所需的其它试剂。

上述试剂或试剂盒在茄子基因表达分析中的应用也属于本发明的保护范围。

上文中，所述茄子基因表达分析可为茄子果实中基因表达分析，如低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

上文中，所述低温条件可为日最低温度为7-17℃。所述常温条件可为日最低气温为17-28℃。

上述试剂或试剂盒中，各种引物对均可独立包装，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。

本发明基于基因表达水平的FPKM值从茄子果实(子房)的转录组测序数据(数据未公开)筛选出了18个候选内参基因，并评价了它们在低温和常温条件下茄子果实发育过程中的表达稳定性。选择了三种常用的内参筛选工具(geNorm、BestKeeper和RefFinder)进行相关分析，结果表明，D5(Sme2.5 08608.1 g00002.1)在低温和常温条件下不同果实发育时期的生物学样本中表达稳定性最佳，其次是D1(Sme2.5_01136.1_g00003.1)和D4(Sme2.5_00276.1_g00016.1)。并将筛选出的内参基因D5、D4和D1与先前报道的在茄子果实发育过程中稳定性最好的3个内参基因(SAND、TBP和Expressed)以及在高温条件下稳定性好的2个内参基因(SmEf1α和SmTRX)进行比较分析，结果表明无论在低温样本、常温样本还是在所有样本中D1、D4和D5的稳定性优于SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因(表5)。由此可见，本发明筛选得到的三个内参基因是稳定可靠的。说明D1，D4和D5这三个基因均可作为低温条件和/或常温条件下的果实中基因表达分析的内参基因。D1，D4和D5这三个基因均可单独作为内参基因使用，为了提高荧光定量PCR的准确性，可将D1，D4和D5这三个基因组合起来作为成套内参基因使用。本发明不仅为低温条件下茄子不同果实发育时期的基因表达水平的标准化定量提供了可靠的内参基因，也为常温条件下茄子不同果实发育时期的基因表达水平的标准化定量提供了可靠的内参基因。本发明将进一步促进茄子不同果实发育时期低温抗性基因的研究。

附图说明

图1为18个候选内参基因引物PCR的产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，泳道M为marker 50bp；泳道D1-D18为表1的基因编号为D1-D18的候选内参基因对应的PCR扩增产物，50bp～200bp为maker的部分条带大小。

图2为18个候选内参基因的熔解曲线。横坐标为温度，纵坐标为荧光值，D1-D18为表1的基因编号为D1-D18的18个候选内参基因。

图3为18个候选内参基因和五个已报道的内参基因在所有生物学样本中的Cq均值。图中，横坐标为候选内参基因，D1-D18为表1的基因编号为D1-D18的18个候选内参基因，A1为SAND，A2为Expressed，A3为SmEf1α，A4为SmTRX，A5为TBP；纵坐标为cq值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、低温条件下和常温条件下茄子不同果实发育时期的基因表达分析中内参基因的确立

1试验材料

茄子单性结实品系D-10和茄子非单性结实品系03-2(李艳玮，刘富中，陈钰辉，张映，张伟伟，连勇.温度对茄子单性结实子房(果实)发育过程中内源激素含量的影响.中国蔬菜2013(22)：32-38)是中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的品系，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

D-10为茄子耐低温自交系，在低温条件下果实能够正常膨大形成无籽果实(在开花和坐果期间日最低温度为7℃-17℃，日平均最低温度12.6℃时表现单性结实，果实内无种子，果实正常膨大)，在常温条件下则形成有籽果实。03-2为不耐低温自交系，在低温条件(最低温度为7℃-17℃，日平均最低温度12.6℃)下形成僵果或落花落果，而在常温条件下则能形成正常的有籽果实。两份材料从2月-6月份种于中国农业科学院蔬菜花卉研究所位于北京的试验田。

2月中旬将两份材料的种子播于温室中，温度维持18-30℃，相对湿度为50％，在自然光照条件下生长。4月中下旬(门茄已现花蕾，但还没开花)定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所位于北京的试验露地。从4月中下旬到5月初，日最低温度在7-17℃，该温度条件(简称T1)下D-10果实正常膨大形成无籽果实，03-2形成小僵果或落花落果；6月到7月初日最低气温为17-28℃，该温度条件(简称T2)下两份材料果实均正常发育形成有籽果实。在T1和T2这两个温度条件下对两份材料进行取样工作，取样部位为开花当天，开花后2d，4d，10d，15d和20d的子房或果实。每个时期取三个生物学重复的样品，将取回的样品用锡箔纸包好后放入液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存备用。将在T1温度条件取的样本称为低温样本、将在T2温度条件取的样本称为常温样本，将低温样本和常温样本组成的群体称为所有样本。

2试验方法及结果

2.1总RNA提取和cDNA第一链合成

使用Quick RNA Isolation Kit试剂盒(华越洋，北京，中国)提取所有样本的总RNA，详细提取方法参照试剂盒中的说明书。用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，确保RNA无降解。并用BioSpec-nano紫外可见微量分光光度计检测RNA的浓度，RNA样品OD260/OD280的值应在1.9-2.2之间，OD260/OD230的值应不小于2.0，只有符合上述条件的RNA样品方可用于合成cDNA。

所提取的RNA样品在1％琼脂糖凝胶电泳中的检测结果显示，样品为清晰的两条带，且28S和18S的比例接近2:1,无拖带现象，表明所提取的RNA可用于质量合格，可用于后续cDNA第一链的合成。

cDNA第一链的合成用5×All-In-One Master Mix试剂盒(应用生物材料公司abm,温哥华,加拿大)，详细合成方法同样参照试剂盒附带的说明书。所有的RNA和cDNA样品均设置三个生物学重复。将用于反转录的RNA统一定量，反转录成cDNA后将cDNA原液稀释10倍后置于-20℃冰箱中保存。

2.2候选内参基因的来源及引物设计

2016年本申请发明人所在的课题组获得了60份茄子生物学样本的转录组测序数据，并从8万8千多个基因中选出了18个在所有生物学样本中FPKM(expected number offragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairssequenced)值大小合适且变异系数小的基因作为候选的内参基因。用这18个候选内参基因的CDS序列设计用于荧光定量PCR的引物。引物设计采用DNASTAR软件包中的PrimerSelect工具，具体参数设置如下：T_m值大于55℃，引物长度18-25bp，产物长度100-200bp。候选内参基因及引物的详细信息见表1。

表1候选内参基因及引物信息

注：基因序列号为Eggplant Genome DataBase中的ID。

2.3实时荧光定量PCR扩增

实验所需的引物由北京华大基因公司合成。

荧光定量PCR试验在罗氏的

480荧光定量分析仪上进行，使用的是罗氏公司的

480 SYBR Green I Master kit荧光定量PCR试剂盒。具体的反应条件如下：

(1)总反应体积为10μl，包括2μl cDNA模板(50ng/μl)，引物分别为0.25μl(0.5μM)，5μl SYBR Green I Master Mix和2.5μl的无核酸水；

(2)反应程序为：95℃预变性10min，40个循环的扩增(95℃10s，56℃20s，单捕获模式下72℃30s)，95℃熔解5s，65℃1min，97℃持续捕获模式，最后40℃冷却10s。

所有的样本的反应均包括三个生物学重复和三个机械重复。用标准曲线和熔解曲线分析候选内参引物的扩增效率和特异性。

2.4、标准曲线的绘制

(1)将反转录得到的cDNA溶液稀释10倍；

(2)以该稀释液为起始液分别按5倍或10倍梯度稀释法进行稀释(1/5,1/25,1/125,1/625或者1/10,1/100,1/1000,1/10000)；

(3)用上述体系和反应程序执行三个平行的荧光定量PCR反应；

(4)计算三个平行的Cq均值，绘制不同模板浓度下标准曲线，获得曲线方程，扩增效率和相关系数。

2.5候选内参基因引物的可靠性分析

用3％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测18对候选内参基因引物的特异性，结果显示目标条带均为单一条带，且与预期的产物大小相符(图1)。而且荧光定量熔解曲线分析也表明它们的PCR产物为单一的峰(图2)，说明无非特异性的引物二聚体形成。综上表明，18对候选内参的引物序列是特异且有效的。

标准曲线分析结果显示这些引物的扩增效率从81.05％(D3)-99.90％(D11)不等，符合荧光定量PCR对引物扩增效率的要求。18个基因的引物标准曲线的相关系数从0.9607(D2)-0.9998(D6，D13)不等(表2)，表明模板梯度稀释浓度在合理的范围内，标准曲线的线性相关系较好。因此这些引物是可靠的。

表2茄子耐低温相关基因表达定量的内参基因引物参数

基因编号	标准曲线方程	R<sup>2</sup>	E(％)
				D1	y＝-2.4577x+18.457	0.9994	96.20
D2	y＝-3.1046x+20.786	0.9607	94.75
				D3	y＝-4.7732x+23.806	0.9980	81.05
D4	y＝-2.4817x+17.931	0.9977	96.40
				D5	y＝-2.488x+17.459	0.9979	98.50
D6	y＝-2.7623x+20.467	0.9998	89.35
				D7	y＝-3.4699x+19.406	0.9994	97.55
D8	y＝-3.4799x+16.931	0.9931	92.10
				D9	y＝-2.9437x+23.142	0.9995	86.70
D10	y＝-3.2972x+15.593	0.9951	99.55
				D11	y＝-3.3664x+14.257	0.9981	99.90
D12	y＝-3.4274x+19.049	0.9997	98.00
				D13	y＝-3.4174x+18.919	0.9998	98.30
D14	y＝-2.6307x+20.680	0.9964	95.25
				D15	y＝-2.501x+18.042	0.9982	96.90
D16	y＝-2.602x+20.889	0.9985	95.50
				D17	y＝-2.4903x+18.655	0.9900	96.60
D18	y＝-4.6168x+21.538	0.9780	89.40

2.6候选内参基因的表达稳定性分析

为了评价18个候选内参基因在不同果实发育时期和不同温度条件下生物学样本中的表达稳定性，用两个内参基因筛选软件(geNorm和BestKeeper)以及一个线上综合性评价工具(RefFinder,http://150.216.56.64/referencegene.php？type＝reference)对18个候选内参基因进行分析和稳定性排序。这些工具的原理和着重点各不相同，因此相同基因的表达稳定性结果可能会有差异(Yim AK,Wong JW,Ku YS,Qin H,Chan TF,LamHM.Using RNA-Seq data to evaluate reference genes suitable for geneexpression studies in soybean.PLOS ONE.2015；10:e0136343:e136343)。最终综合分析判断不同条件下的最适内参基因。

2.6.1候选基因的转录表达丰度

在荧光定量表达分析中，基因的转录表达量的高低可以通过基因的Cq值来反应。Cq值越大，表达水平越低。所有生物学样本的平均Cq值从14.33-22.77不等，而且D5和D18在这些样品中分别有最高和最低的表达水平(图3)。

2.6.2 geNorm分析结果

在进行geNorm分析时，候选内参基因的稳定性主要由稳定性值(M)决定。默认为M值小于1.5的基因是稳定表达的基因，M值越小基因表达的稳定性越高(Vandesompele J,DePreter K,Pattyn F,Poppe B,Van Roy N,De Paepe A,et al.Accurate normalizationof real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multipleinternal control genes.Genome Biol.2002；3:RESEARCH0034.Pubmed:12184808)。表3是自动分析模式下geNorm计算得到的平均稳定值。

由表3可知，低温，常温和所有样本条件下候选内参基因的稳定性均值分别介于0.39-1.10,0.41-0.96和0.46-1.04之间，稳定性均值均小于1.5。在所有样本和低温样本中，D1和D2是最稳定的两个内参基因，相对应的M值分别为0.46和0.39。而在常温条件下D4和D5是最稳定的内参基因，相应的M为0.41。另外，D18在所有样本数据组中均是最不稳定的内参基因，相应的M值分别为1.10，0.96和1.04。根据geNorm的分析结果，综合考虑三种样品情况D5、D4、D1和D2是表现最稳定的内参基因。

表3候选内参基因稳定性均值M及稳定性排序

geNorm可以根据候选基因标准化因子的配对变异值(V_n/V_n+1)来确定所需最适内参基因的数目。默认值为Vn/n+1＝0.15。若Vn/n+1<0.15说明以n个基因作为内参基因组合已经足够稳定，不需要引入第n+1条基因。如表4所示，低温样本与所有样本的成对变异值V_2/3均小于0.15，说明在这两个样本集中只需要两个内参基因；而常温样本的成对变异值V_2/3大于0.15且V_3/4小于0.15，说明在该样本集中三个内参基因才能准确用于基因的表达研究。

表4候选内参基因的成对变异值

2.6.3 BestKeeper分析结果

BestKeeper可用于分析候选内参基因的表达稳定性，该软件通过计算标准差(SD)和变异系数(CV)来评价候选内参基因在特定生物学样本中的表达稳定性，标准差(SD)和变异系数(CV)越小基因表达越稳定，候选基因的SD值大于1将被过滤，本试验中18个候选内参基因在所有生物学样本的平均Cq值从14.33-22.77，所有Cq值处于同一个数量级，因此根据SD值判断候选内参基因的稳定性，标准差(SD)越小基因表达越稳定。由BestKeeper计算得到的SD如表5所示。根据SD值按从小到大排序，在低温条件下排在前三位的有D5、D1和D4；在常温条件下排在前三位的有D10、D5和D8；在所有样品中前三位的有D5、D1和D10。由此可见，在低温条件和所有样品中D5是最稳定的内参基因，在常温条件下D10是最稳定的内参基因，D5稳定性也很好，排在第二位。BestKeeper分析表明，综合三种样品情况D5是稳定性最好的基因。

2.6.4 RefFinder分析结果

geNorm和BestKeeper对这18个候选内参基因的稳定性排序结果存在差异(表3，表5)。为了对这些基因的稳定性进行综合评价，用RefFinder计算得到的M₂值对这些基因进行排序。结果表明，在低温、常温和所有样本三个集中D5都表达最稳定，D4和D1是排名第二或第三的内参基因，D5、D1和D4这3个基因在各样品集稳定排名中稳居前3位，是18个候选内参基因中在低温、常温和所有样本中都表现最稳定的3个基因。且根据geNorm结果其M值小于1.5，根据BestKeeper结果其SD小于1，这3个基因都是较好的可用的内参基因。

虽然也有研究报道使用一个内参基因作为参照分析的基因的转录表达水平(DengX,Zhou S,Hu W,Feng J,Zhang F,Chen L,Huang C,Luo Q,He Y,Yang G,et al(2013)；Ectopic expression of wheat TaCIPK14,encoding a calcineurin B-like protein-interacting protein kinase,confers salinity and cold tolerance intobacco.Physiol Plant,149(3):367–377；Yang T,Peng H,Whitaker BD,Jurick WM(2013).Differential expression of calcium/calmodulin-regulated SlSRs inresponse to abiotic and biotic stresses in tomato fruit.Physiol Plant,148(3):1320445–455；张婷，武喆，张开京，徐建，娄群峰，李季，陈劲枫.2016；黄瓜单性结实候选基因预测与表达分析.核农学报，30(2):224-230)，但是使用多个内参基因结果的更准确和可靠(Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，Poppe B，Van Roy N，De Paepe A，SpelemanF.2002；Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes.Genome Biology，3(7):research0034.0031-research0034.0011；Artico S,Nardeli SM,Brilhante O,Grossi-de-Sa MF,Alves-Ferreira M(2010).Identification and evaluation of newreference genes in Gossypium hirsutum for accurate normalization of real-timequantitative RT-PCR data.BMC Plant Biol,10:49；王瑛，陈亚娟，丁莉萍，魏建华，王宏芝.2016.毛白杨不同组织器官稳定表达看家基因的筛选.植物生理学报，(08):1312-1320)。本试验根据geNorm软件计算的候选基因的配对变异值(V_n/V_n+1)(表3)可知，在低温和全部样品条件下(V₂/V₃＜0.15)因此使用2个内参基因就满足标准定量的要求，因此从D5、D4和D1中任意选择2个基因进行组合就可以作为内参基因进行表达定量，可组成的组合有D5+D4、D5+D1和D4+D1。在常温条件下(V₃/V₄＜0.15)，因此使用3个内参基因可满足标准定量的要求，在常温条件下D5+D4+D1是进行表达分析的最好的内参基因组合。

表5 BestKeeper和RefFinder对18个候选内参基因的稳定性排序

注：括号外面为稳定性从高到低的基因排序，括号里面的数值分别为括号外基因对应的SD值(BestKeeper)和综合排名值(RefFinder)。

2.7内参基因稳定性比较

为了进一步确认本实验筛选出的内参基因D5、D1和D4的稳定性，选取了五个已报道的内参基因—SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX与本发明的内参基因D5、D1和D4按照步骤2.1、2.3-2.6的方法进行试验。其中，D5、D1和D4的引物如表7所示，D5的引物由D5-F和D5-R组成，D5-F是SEQ ID No.7所示的单链DNA，D5-R是SEQ ID No.8所示的单链DNA；D4的引物由D4-F和D4-R组成，D4-F是SEQ ID No.9所示的单链DNA，D4-R是SEQ ID No.10所示的单链DNA；D1的引物由D1-F和D1-R组成，D1-F是SEQ ID No.11所示的单链DNA，D1-R是SEQ IDNo.12所示的单链DNA。

根据先前的报道，SAND、TBP和Expressed在茄子不同果实发育过程中表达最稳定(Kanakachari M,Solanke AU,Prabhakaran N,Ahmad I,Dhandapani G,Jayabalan N,etal.Evaluation of suitable reference genes for normalization of qPCR geneexpression studies in brinjal(Solanum melongena L.)During fruit developmentalstages.Applied Biochemistry&Biotechnology.2016；178:433-50)。这里直接用文章提供的这三个基因的引物序列。

SmEf1α和SmTRX是高温胁迫下茄子中表达最稳定的两个内参基因(庞强强,李植良,罗少波,陈日远,金庆敏,黎振兴,李德明,孙保娟,孙光闻.高温胁迫下茄子qRT-PCR内参基因筛选及稳定性分析[J].园艺学报,2017,44(03):475-486)；这里直接用文章提供的这两个基因的引物序列。

在本试验中SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因在步骤2.6.1的所有生物学样本中的表达情况如图3所示，其平均数cq值为16.78-22.58，明显高于D1，D4和D5这三个基因的平均cq值，表明SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因表达丰度低于D1，D4和D5这三个内参基因。

同样用geNorm、Bestkeeper和Refinder这三种分析方法比较SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因与本发明筛选的三个内参基因D5、D1和D4稳定性。结果表明无论在低温样本、常温样本还是在所有样本中D1、D4和D5的稳定性优于SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因(表6)。由此可见，本发明筛选得到的三个内参基因是稳定可靠的。说明D1，D4和D5这三个基因均可作为低温条件和/或常温条件下的果实中基因表达分析的内参基因。D1，D4和D5这三个基因均可单独作为内参基因使用，为了提高荧光定量PCR的准确性，可将D1，D4和D5这三个基因组合起来作为成套内参基因使用。

表6、选出的8个内参基因的稳定性比较

表7本发明的内参基因的引物序列

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物

<130> GNCFH181936

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 茄子 (Solanum melongena L.)

<400> 1

atgggtaaag agaagactca catcagcatt gtggtcattg gccatgtcga ctctggaaag 60

tcgactacta ctggtcactt gatctataag cttggtggta ttgacaagcg tgttattgag 120

aggttcgaga aggaagctgc tgagatgaac aagaggtcat tcaagtatgc ctgggtgctt 180

gacaagctta aggctgaacg tgagcgtggt atcaccattg atattgcttt gtggaagttt 240

gagaccacta agtactactg cactgtgatt gatgcccccg gacacaggga ctttatcaag 300

aacatgatca ctggtacctc ccaggctgac tgtgctgtcc tgattattga ctccaccact 360

ggtggtttcg aagctggtat ctctaaagat ggatatgtgt catatgctaa gtcttgtctg 420

tgtggttttg agaggtctac taaccttgac tggtacaagg gaccaaccct ccttgaggct 480

cttgaccaga ttaatgagcc caagaggcca tcagacaagc ccctccgtct tccacttcag 540

gatgtttaca agattggtgg tattggaact gtccctgttg gtcgtgtaga gactggtatt 600

atcaagcctg gtatggttgt gacctttggc ccttctggtt tgacaactga agtcaagtct 660

gtagagatgc accacgaagc tctccaggag gcactccctg gtgacaatgt tgggttcaat 720

gttaagaatg ttgctgttaa ggatcttaag cgtggttatg ttgcatcaaa ctccaaggat 780

gacccagcca aggaagcggc cagcttcacc gcccaggtca tcatcatgaa ccatccaggc 840

cagattggaa acggatatgc cccagtgctg gattgccaca cctcccacat tgctgtcaag 900

tttgctgaga tcttgaccaa gattgacagg cgttcaggta aggaactcga gaaggagcct 960

aagttcttga agaatggtga tgctggtatg gttaagatga ttcccaccaa gcccatggtt 1020

gtcgagacct ttgctgagta cccaccattg ggtcgttttg ctgtgagaga catgaggcaa 1080

acagttgctg ttggtgttgt caagaacgtt gaaaagaagg acccaactgg tgccaaggtg 1140

accaaggctg cccagaagaa gggaaagtga 1170

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 茄子(Solanum melongena L.)

<400> 2

Met Gly Lys Glu Lys Thr His Ile Ser Ile Val Val Ile Gly His Val

1 5 10 15

Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Leu Gly

20 25 30

Gly Ile Asp Lys Arg Val Ile Glu Arg Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu

35 40 45

Met Asn Lys Arg Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys

50 55 60

Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe

65 70 75 80

Glu Thr Thr Lys Tyr Tyr Cys Thr Val Ile Asp Ala Pro Gly His Arg

85 90 95

Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Cys Ala

100 105 110

Val Leu Ile Ile Asp Ser Thr Thr Gly Gly Phe Glu Ala Gly Ile Ser

115 120 125

Lys Asp Gly Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ser Cys Leu Cys Gly Phe Glu

130 135 140

Arg Ser Thr Asn Leu Asp Trp Tyr Lys Gly Pro Thr Leu Leu Glu Ala

145 150 155 160

Leu Asp Gln Ile Asn Glu Pro Lys Arg Pro Ser Asp Lys Pro Leu Arg

165 170 175

Leu Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro

180 185 190

Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Ile Ile Lys Pro Gly Met Val Val Thr

195 200 205

Phe Gly Pro Ser Gly Leu Thr Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met His

210 215 220

His Glu Ala Leu Gln Glu Ala Leu Pro Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn

225 230 235 240

Val Lys Asn Val Ala Val Lys Asp Leu Lys Arg Gly Tyr Val Ala Ser

245 250 255

Asn Ser Lys Asp Asp Pro Ala Lys Glu Ala Ala Ser Phe Thr Ala Gln

260 265 270

Val Ile Ile Met Asn His Pro Gly Gln Ile Gly Asn Gly Tyr Ala Pro

275 280 285

Val Leu Asp Cys His Thr Ser His Ile Ala Val Lys Phe Ala Glu Ile

290 295 300

Leu Thr Lys Ile Asp Arg Arg Ser Gly Lys Glu Leu Glu Lys Glu Pro

305 310 315 320

Lys Phe Leu Lys Asn Gly Asp Ala Gly Met Val Lys Met Ile Pro Thr

325 330 335

Lys Pro Met Val Val Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Pro Pro Leu Gly Arg

340 345 350

Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr Val Ala Val Gly Val Val Lys

355 360 365

Asn Val Glu Lys Lys Asp Pro Thr Gly Ala Lys Val Thr Lys Ala Ala

370 375 380

Gln Lys Lys Gly Lys

385

<210> 3

<211> 639

<212> DNA

<213> 茄子 (Solanum melongena L.)

<400> 3

atggacgcag gtgtagtagc cgccccccct gctgccaatg caaaggaaga gaacaaggtt 60

cacaccgatg tcatgctttt caatcgctgg agctatgatg atgttcagat caatgacatg 120

tctgttgagg attacatcac agcaactcct aacaagcatc cagtttacat gccacacaca 180

gctggtagat accaggccaa gcgtttcagg aaggcccagt gcccaattgt tgagaggctc 240

accaattctc tcatgatgca cggaaggaac aatggaaaga agctaatggc tgttcgcatt 300

ataaagcatg caatggagat cattcatttg ttgacagacc aaaacccaat tcaagtcatt 360

gttgatgctg ttatcaacag tgggccaagg gaagatgcaa cacgtattgg ttcagctggt 420

gttgtgagac gtcaagccgt tgatatttct ccacttcgtc gtgttaacca ggcaatttat 480

ttgctgacaa ctggtgcacg tgagagtgct ttcaggaaca tcaagaccat agctgaatgc 540

cttgcagatg aactcatcaa tgctgccaag ggttcttcaa atagctatgc cattaagaag 600

aaggatgaga ttgaaagggt tgccaaggcc aatcgttaa 639

<210> 4

<211> 212

<212> PRT

<213> 茄子 (Solanum melongena L.)

<400> 4

Met Asp Ala Gly Val Val Ala Ala Pro Pro Ala Ala Asn Ala Lys Glu

1 5 10 15

Glu Asn Lys Val His Thr Asp Val Met Leu Phe Asn Arg Trp Ser Tyr

20 25 30

Asp Asp Val Gln Ile Asn Asp Met Ser Val Glu Asp Tyr Ile Thr Ala

35 40 45

Thr Pro Asn Lys His Pro Val Tyr Met Pro His Thr Ala Gly Arg Tyr

50 55 60

Gln Ala Lys Arg Phe Arg Lys Ala Gln Cys Pro Ile Val Glu Arg Leu

65 70 75 80

Thr Asn Ser Leu Met Met His Gly Arg Asn Asn Gly Lys Lys Leu Met

85 90 95

Ala Val Arg Ile Ile Lys His Ala Met Glu Ile Ile His Leu Leu Thr

100 105 110

Asp Gln Asn Pro Ile Gln Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn Ser Gly

115 120 125

Pro Arg Glu Asp Ala Thr Arg Ile Gly Ser Ala Gly Val Val Arg Arg

130 135 140

Gln Ala Val Asp Ile Ser Pro Leu Arg Arg Val Asn Gln Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Leu Leu Thr Thr Gly Ala Arg Glu Ser Ala Phe Arg Asn Ile Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Glu Cys Leu Ala Asp Glu Leu Ile Asn Ala Ala Lys Gly Ser

180 185 190

Ser Asn Ser Tyr Ala Ile Lys Lys Lys Asp Glu Ile Glu Arg Val Ala

195 200 205

Lys Ala Asn Arg

210

<210> 5

<211> 1383

<212> DNA

<213> 茄子 (Solanum melongena L.)

<400> 5

atgcggaggt taaatcgact cagcctttgc aaatatgaca cagtccccac taagggtggc 60

aacgagatca gaaccaaaac tggtatcacc ggatcggact ttaccgaaac cggaccgata 120

ccggtaataa aaggacaaaa tttctctaga accgtaccga tattggcagt accgggaaat 180

tttaacatta ccttactggt ccggactttg tttaacgttg caatggcaga tatgaaccac 240

cacccaactg ttttccagaa ggcttctaac cagctgcatt tgagctcaag tctatcccaa 300

gatgtccatg ggcgctatgg aggtgttcag cctgctcttt accagaggca ttttgcttat 360

ggcaactact ccaatgcagg actgctgaga ggccaagcca ctcaggatct atcattgatc 420

acctcaaatg cctcacctgt gtttgtgcag gctcctcaag agaaaggatt tgcagctttt 480

gctactgact ttctcatggg tggagtttct gctgctgtat caaagactgc tgctgcccct 540

attgagcgtg tgaaactttt gattcaaaat caagatgaga tgctcaaggc tggtaggctc 600

tctgaaccat acaagggaat tggcgattgt ttcagcagaa caattaagga tgaaggtgtc 660

atgtctttat ggaggggaaa cactgccaat gttatccgtt atttccccac tcaggccctg 720

aactttgcat tcaaggacta tttcaagaga ctcttcaact tcaagaagga ccgtgatggt 780

tactggaagt ggtttgccgg caaccttgca tcaggtggtg ctgctggtgc ttcctctttg 840

ttctttgtct actccttgga ctatgctcgt acccgtctcg ctaatgacgc caaagcttca 900

aagaagggag gtgagaggca gttcaatggt ttggttgatg tctacaggaa gacactcaaa 960

tctgatggaa ttgctggtct ataccgtgga ttcaacattt catgtgttgg tatcattgtt 1020

taccgtggtt tgtactttgg aatgtatgac tcgttgaagc ctgtcctcct gactggaagc 1080

ctgcaggata gtttctttgc tagctttgga cttggttggc tcatcaccaa tggtgctggt 1140

cttgcttctt acccaatcga tacagtaaga agaagaatga tgatgacatc tggtgaggca 1200

gttaagtaca agagctcgct cgatgcattc agccagattg ttaagaatga gggagccaaa 1260

tctctgttca agggtgccgg tgctaacatc ctccgagctg ttgctggtgc tggtgtgttg 1320

gctggatatg acaagcttca ggttcttgtt ttgggaaaga aatatggatc cggtggtgcc 1380

taa 1383

<210> 6

<211> 460

<212> PRT

<213> 茄子 (Solanum melongena L.)

<400> 6

Met Arg Arg Leu Asn Arg Leu Ser Leu Cys Lys Tyr Asp Thr Val Pro

1 5 10 15

Thr Lys Gly Gly Asn Glu Ile Arg Thr Lys Thr Gly Ile Thr Gly Ser

20 25 30

Asp Phe Thr Glu Thr Gly Pro Ile Pro Val Ile Lys Gly Gln Asn Phe

35 40 45

Ser Arg Thr Val Pro Ile Leu Ala Val Pro Gly Asn Phe Asn Ile Thr

50 55 60

Leu Leu Val Arg Thr Leu Phe Asn Val Ala Met Ala Asp Met Asn His

65 70 75 80

His Pro Thr Val Phe Gln Lys Ala Ser Asn Gln Leu His Leu Ser Ser

85 90 95

Ser Leu Ser Gln Asp Val His Gly Arg Tyr Gly Gly Val Gln Pro Ala

100 105 110

Leu Tyr Gln Arg His Phe Ala Tyr Gly Asn Tyr Ser Asn Ala Gly Leu

115 120 125

Leu Arg Gly Gln Ala Thr Gln Asp Leu Ser Leu Ile Thr Ser Asn Ala

130 135 140

Ser Pro Val Phe Val Gln Ala Pro Gln Glu Lys Gly Phe Ala Ala Phe

145 150 155 160

Ala Thr Asp Phe Leu Met Gly Gly Val Ser Ala Ala Val Ser Lys Thr

165 170 175

Ala Ala Ala Pro Ile Glu Arg Val Lys Leu Leu Ile Gln Asn Gln Asp

180 185 190

Glu Met Leu Lys Ala Gly Arg Leu Ser Glu Pro Tyr Lys Gly Ile Gly

195 200 205

Asp Cys Phe Ser Arg Thr Ile Lys Asp Glu Gly Val Met Ser Leu Trp

210 215 220

Arg Gly Asn Thr Ala Asn Val Ile Arg Tyr Phe Pro Thr Gln Ala Leu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Phe Lys Asp Tyr Phe Lys Arg Leu Phe Asn Phe Lys Lys

245 250 255

Asp Arg Asp Gly Tyr Trp Lys Trp Phe Ala Gly Asn Leu Ala Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ala Gly Ala Ser Ser Leu Phe Phe Val Tyr Ser Leu Asp Tyr

275 280 285

Ala Arg Thr Arg Leu Ala Asn Asp Ala Lys Ala Ser Lys Lys Gly Gly

290 295 300

Glu Arg Gln Phe Asn Gly Leu Val Asp Val Tyr Arg Lys Thr Leu Lys

305 310 315 320

Ser Asp Gly Ile Ala Gly Leu Tyr Arg Gly Phe Asn Ile Ser Cys Val

325 330 335

Gly Ile Ile Val Tyr Arg Gly Leu Tyr Phe Gly Met Tyr Asp Ser Leu

340 345 350

Lys Pro Val Leu Leu Thr Gly Ser Leu Gln Asp Ser Phe Phe Ala Ser

355 360 365

Phe Gly Leu Gly Trp Leu Ile Thr Asn Gly Ala Gly Leu Ala Ser Tyr

370 375 380

Pro Ile Asp Thr Val Arg Arg Arg Met Met Met Thr Ser Gly Glu Ala

385 390 395 400

Val Lys Tyr Lys Ser Ser Leu Asp Ala Phe Ser Gln Ile Val Lys Asn

405 410 415

Glu Gly Ala Lys Ser Leu Phe Lys Gly Ala Gly Ala Asn Ile Leu Arg

420 425 430

Ala Val Ala Gly Ala Gly Val Leu Ala Gly Tyr Asp Lys Leu Gln Val

435 440 445

Leu Val Leu Gly Lys Lys Tyr Gly Ser Gly Gly Ala

450 455 460

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtaaagag aagactcaca tcag 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacccaggca tacttgaatg ac 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

ccaggccaag cgtttcagga 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

cccttggccc actgttgata ac 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

ggtgctgctg gtgcttcctc ttt 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

aactgcctct cacctccctt cttt 24

Claims

1.下述P1-P4中任一种作为茄子基因表达分析中的内参基因的应用：

P1、由D1、D4和D5这三个基因组成的成套基因；

P2、由D1和D5这两个基因组成的成套基因；

P3、由D4和D5这两个基因组成的成套基因；

P4、D5；

P1- P4中，所述D5是编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的基因，所述D4是编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的基因；所述D1是编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质的基因；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述D5为编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；所述D4为编码序列是SEQ ID No.3的DNA分子；所述D1为编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子。

3.用于茄子基因表达分析的试剂，所述试剂为下述R1-R4中的任一种：

R1、由名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对、名称为W4的检测权利要求1或2中所述的D4表达水平的引物对和名称为W1的检测权利要求1或2中所述的D1表达水平的引物对组成；

R2、由名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对和名称为W1的检测权利要求1或2中所述的D1表达水平的引物对组成；

R3、由名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对和名称为W4的检测权利要求1或2中所述的D4表达水平的引物对组成；

R4、名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析；

所述W5为由D5-F和D5-R组成的D5特异引物对，所述D5-F是SEQ ID No.7所示的单链DNA，所述D5-R是SEQ ID No.8所示的单链DNA；

所述W4为由D4-F和D4-R组成的D4特异引物对，所述D4-F是SEQ ID No.9所示的单链DNA，所述D4-R是SEQ ID No.10所示的单链DNA；

所述W1为由D1-F和D1-R组成的D1特异引物对，所述D1-F是SEQ ID No.11所示的单链DNA，所述D1-R是SEQ ID No.12所示的单链DNA。

4.含有权利要求3所述的试剂的用于茄子基因表达分析的试剂盒；

5.权利要求3所述的试剂在茄子基因表达分析中的应用；

6.权利要求4所述的试剂盒在茄子基因表达分析中的应用；