CN1190490C - 来自棉花的纤维特异性β－微管蛋白启动子的分离和鉴定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及棉花β-微管蛋白基因CFTUB2及其活性片段。这些启动子显示出强纤维特异性活性。

Description

来自棉花的纤维特异性β-微管蛋白启动子的分离和鉴定
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体地涉及转基因植物和用于创建转基因植物的启动子，更具体地涉及纤维特异性启动子。
发明背景
棉花是纺织工业最广泛使用的天然纤维，全世界棉花年产量为1亿捆，总值450亿美元。在过去的几十年间虽然已通过经典育种明显改进了纤维的品质和产量，但是通过经典育种进一步改善纤维性质的潜力已被限制，因为需要物种相容性和可利用的性状。基因工程提供了进一步改良棉花的新途径，其是通过导入基因以产生具有高度所需特征的新种质而进行。
棉花纤维(种毛)是经历快速同步延伸的单细胞毛状体。皮层(cortical)微管提供了规范和调控细胞延伸的纤维素微原纤维排列所需的空间信息(Giddings和Staehelin，1991；Cyr和Palevitz，1995；Fisher和Cyr，1995)。纤维发育由4个重叠阶段组成(即起始、初级细胞壁形成、次生细胞壁形成和成熟)(Basra和Malik，1984)。微管蛋白和肌动蛋白可能在发育纤维细胞中起重要功能作用。成熟纤维是纤维素、水、少量蛋白质、果胶、半纤维素、矿物质、蜡、少量有机酸、糖和色素的生物学组合物，其提供优异的穿着性能和美学(Arthur，1990；Basra和Malik，1984；Ryser，1985)。纤维分化和发育需要许多基因，这些基因在纤维发育的不同阶段差异表达，目前仅鉴别了参与大量纤维特异性结构蛋白、酶、多糖、蜡或木质素的生物合成的一些基因(John和Crow，1992；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Kawai等，1998；Whittaker和Triplett，1999)。这些分离的基因由于其纤维特异性表达可被认为具有改良棉花纤维的潜在应用。例如，John已使用纤维特异性基因启动子产生基因工程棉花以收获改变的纤维(John，1996b，1997a，1997b)。
启动子是确定植物和动物发育过程中基因表达的时空特异性的DNA片段。在过去十年间已从各种植物和动物中鉴别和分离了许多组织特异性基因及其启动子，包括一些棉花组织特异性基因和启动子(Loguerico等，1999；Kawai等，1998；Song和Allen，1997；Ma等，1997；John，1996a；Rinehart等，1996；Hasenfratz等，1995；John和Peterson，1994；John和Crow，1992)。有几种启动子以显示在棉花中以纤维特异性方式控制基因表达(Rinehart等，1996；John，1996a；John和Crow，1992)。一些植物组织特异性启动子可被用于在特异组织中以发育调控模式表达外源蛋白质(John，1996b，1997a，1997b)。
发明概述
从棉花中分离了编码β-微管蛋白的纤维特异性基因(命名为CFTUB2)。所分离的完整CFTUB2 cDNA长度为1.623kb，包括1.338kb的开放读框。基于CFTUB2 cDNA的序列，从棉花中分离了两个CFTUB2启动子片段(1.433kb和0.984kb)。将两个CFTUB2启动子片段(1.3和0.9kb)与GUS基因融合以构建用于分析启动子功能的基因表达载体。通过Southern印迹杂交鉴别了具有CFTUB2启动子/GUS融合基因的转基因棉花和烟草植物。在所研究的所有转基因棉花植物中，仅在新生纤维中检测到GUS活性，而在花器官如花药、花瓣和萼片中或在叶和根中未检测到该活性。这一结果与Northern印迹分析一起提示CFTUB2启动子在棉花中是纤维特异性的。该启动子在棉花纤维中在转录水平控制特异基因表达。所分离的启动子可用于通过基因操作改良棉花纤维，产生具有高纤维品质和产量的新棉花品种。
附图简述
图1示出棉花CFTUB2基因cDNA的核苷酸序列(1623bp；SEQID NO：1)。
图2示出分离的1433bp CFTUB2启动子片段的核苷酸序列(SEQID NO：2)，984bp片段相应于这一序列的核苷酸449-1433。
图3示出在表达载体中的与gus基因融合的CFTUB2启动子的构建体。
详细描述
CFTUB2启动子是棉花中的活性纤维特异性启动子。来自各种棉花组织的cDNA的Northern印迹分析结果显示包含CFTUB2基因的一cDNA克隆在8和14 DPA(开花后天数)的初生(young)纤维中强表达，并且在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表达，但在所有其它组织中很少表达或不表达。该cDNA克隆的测序揭示其长度为1623bp，含有一1338bp的开放读框(图1)。将棉花CFTUB2的核苷酸和预计的多肽序列与数据库进行比较，发现CFTUB2 cDNA与已知的来自其它植物(如拟南芥属、烟草、水稻、大豆、玉米、马铃薯、胡萝卜等)的β-微管蛋白cDNA和基因在氨基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。
CFTUB2基因的转录物显示在8 DPA的棉花新生纤维中有最高的积累，随后随着纤维的进一步发育基因产物(mRNA)的积累有一可见的降低。棉花胚珠不同发育阶段中的基因表达的比较也示出基因转录物在8 DPA胚珠中的积累比在4和14 DPA中的积累多，随着从8 DPA  28 DPA纤维发育，基因产物的积累逐渐降低至不可检水平。这提示该基因与其它棉花纤维特异性基因一样在棉花纤维和胚珠发育过程中以转录水平严格调控而特异表达(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。
分离该启动子区的两个片段并分别克隆进pGEM-T载体。CFTUB2启动子的一个片段长度为1433bp(图2)，另一个长度为984bp。两个片段均是有活性的纤维特异性启动子。用CFTUB2启动子/GUS融合基因构建体经农杆菌介导的基因转移转化烟草和棉花，用含有CaMV35S启动子/GUS融合体的pBI121载体作为阳性对照。与Northern印迹分析结果一致，在所研究的所有31个转基因棉花植物中，由CFTUB2启动子驱动的GUS基因特异地在新生纤维中表达，但不在其它组织中表达；而在阳性对照棉花植物(35S：GUS)的所有组织中均检测到GUS活性。总共获得36个转化棉花植物，将其移植到土壤中生长成熟。类似地，发现在CFTUB2启动子驱动下的GUS基因活性仅在所研究的所有15个转基因烟草植物的种子中检测到，提示CFTUB2启动子活性在烟草中也是组织特异性的(棉花纤维是种皮的延伸种毛，其与烟草种皮有组织学相应性)。这一结果与上述Northern印迹分析结果一起表明CFTUB2启动子在转录水平控制棉花纤维中基因特异表达。
因此，本发明的一个实施方案是得自棉花纤维β-微管蛋白基因CFTUB2的纤维特异性启动子。
本发明的另一实施方案是包含棉花纤维CFTUB2基因启动子的1433bp活性片段的纤维特异性启动子。
本发明的再一实施方案是包含棉花纤维CFTUB2基因启动子的984bp活性片段的纤维特异性启动子。
本发明的再一实施方案是棉花纤维特异性启动子，其包含SEQID NO：2的CFTUB2启动子片段的活性片段。活性片段是长度比SEQID NO：2短但仍保持作为棉花中纤维特异性启动子的活性的序列。片段可包含SEQ ID NO：2序列的切除、缺失、截短或取代，或其组合。优选的活性片段由SEQ ID NO：2的核苷酸449-1433组成。
本发明的启动子可用于产生具有改变的纤维特征的转基因棉花。本发明的纤维特异性启动子的应用使得可以在棉花纤维中选择性表达转基因，从而可采用的转基因类型更多。选择性表达避免了以下问题，如由转基因的系统表达造成的转基因植物的代谢负担，或者转基因在非纤维组织中表达的副作用。在棉花纤维中表达而在棉花植物的其它部分不表达的所需基因的例子包括：(1)彩色棉花所需的花青苷基因，(2)用于增加棉花纤维强度的来自蚕或蜘蛛的丝蛋白，(3)用于改善热性质和绝缘特征的棉花纤维中的聚羟基丁酸酯的生物合成(John等，1996)。现有技术中有无数增强纤维的基因的例子，它们可有利地与本发明的启动子连接，用于经熟知技术转化棉花(参见，例如Umbeck，1992)，以实现转基因在转基因棉花纤维中的表达。参见例如，John，1996b，1997a，1997b；John等，1996。
实施例1  编码在棉花纤维发育早期表达的CFTUB2序列的纤维特异性cDNA的分离
棉花种子用70％乙醇表面消毒30-60秒，用10％H2O2表面消毒30-60分钟，之后用无菌水清洗。种子在培养室中于光照下28℃在1/2MS培养基上萌发，从无菌幼苗中切下的子叶和下胚轴用作转化外植体材料。棉花植物在罐中培养以用于DNA和RNA提取。
用硫氰酸胍方法或SV总RNA分离系统(Promega)从棉花新生纤维、子房、花药、花瓣、萼片、叶和根中提取总RNA。用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)的寡(dT)-纤维素旋转柱纯化聚(A)+RNA。用cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)合成棉花cDNA。通过将cDNA片段插入ZAP表达载体(Stratagene)构建棉花cDNA文库。
将分别来自约8和14 DPA的棉花新生纤维的聚(A)+RNA转化成cDNA，用于构建棉花cDNA文库。从该纤维cDNA文库中随机挑取约200个cDNA克隆，随后测序。根据序列数据选择潜在参与细胞扩张的一些克隆。
为发现转录物在棉花纤维中特异表达的cDNA克隆，用来自克隆的探针与分离自棉花纤维、胚珠、花药、花瓣、萼片、蕾、叶和根的总RNA进行Northern印迹杂交，从而分析所选cDNA克隆的表达模式。来自不同棉花组织的RNA样品在琼脂糖-甲醛凝胶上分离，经毛细印迹转移至Hybond-N尼龙膜上。RNA Northern印迹在68℃、ExpressHyb溶液(Clontech)中与随机标记(PromegaPrime-a-Gene标记系统)制备的32P cDNA探针杂交。杂交后，在68℃用0.1×SSC，0.5％SDS洗印迹30-60分钟。实验结果表明一个cDNA克隆在8和14 DPA的新生纤维中强表达，在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表达，但在所有其它组织中很少或不表达。
将PCR片段和cDNA片段亚克隆进载体中，用制备自Qiagen质粒试剂盒的质粒DNA作为PCR反应的模板。由自动测序仪测序PCR产物。该cDNA克隆的测序表明其长度为1623bp，含有1338bp的开放读框，与β-微管蛋白基因相同(图1)。这是从棉花中分离的第一个CFTUB2 cDNA克隆。将棉花CFTUB2的核苷酸和预计的多肽序列与数据库进行比较，发现CFTUB2 cDNA与已知的来自其它植物(如拟南芥属、烟草、水稻、大豆、玉米、马铃薯、胡萝卜等)的β-微管蛋白cDNA和基因在氨基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。
来自不同棉花组织的总RNA用于逆转录用作示差展示PCR反应中的模板的第一链cDNA。用示差展示试剂盒(Clontech)进行示差展示分析。用2pg总RNA作为逆转录的起始材料，以寡(dT)作为引物在42℃反应1小时合成第一链cDNA。示差展示PCR反应为94℃ 5分钟、40℃ 5分钟和68℃ 5分钟的初始循环、随后两个循环的94℃ 2分钟、40℃ 5分钟和68℃ 5分钟、随后25个循环的94℃ 1分钟、60℃ 1分钟和68℃ 2分钟以及最终的68℃延伸7分钟。切下差示展示靶带，再扩增以进行进一步分析。取可重复的纤维特异性差示展示产物进行进一步分析。收获每一靶带的cDNA，经PCR扩增再生。随后将分离的cDNA亚克隆进载体并测序。
Northern印迹分析显示CFTUB2基因的转录物在8 DPA的棉花新生纤维中有最高的积累，随后随着纤维的进一步发育基因产物(mRNA)的积累有一可见的降低。棉花胚珠不同发育阶段中的基因表达的比较也示出基因转录物在8 DPA胚珠中的积累比在4和14DPA中的积累多，随着从8 DPA至28 DPA的纤维发育，基因产物的积累逐渐降低至不可检水平。这提示该基因与其它棉花纤维特异性基因一样在棉花纤维和胚珠发育过程中以转录水平严格调控而特异表达(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。
实施例2  CFTUB2启动子的分离
基于筛选的CFTUB2 cDNA序列，经基因组步行PCR从棉花基因组步行(Genome Walker)文库中分离CFTUB2启动子。
用下述方法棉花植物叶中提取和纯化总DNA，将液氮加至4g叶组织，充分均质叶。在一50ml试管中向均质组织中加入20ml冰冷的提取缓冲液(63g/L葡萄糖、0.1MTris.HCl(pH8.0)、5mM EDTA、20g/L PVP-40、1g/L DIECA、1g/L抗坏血酸、2ml/Lβ-巯基乙醇)，250rpm离心15分钟。除去上清后，向每管中加入10ml裂解缓冲液。将重悬的沉淀在65℃保温30分钟。向每管中加入10ml氯仿，与样品混合并在3500rpm离心10分钟。将上清转移至新管中，重复1次氯仿提取。将上清转移至新管中，向每管中加入0.6体积异丙醇进行DNA沉淀。3500rpm离心30分钟后，用70％乙醇洗DNA。随后将分离的基因组DNA溶解在无菌水或TE(10mM Tris.HCl，1mMEDTA)中备用。
从棉花植物的叶中构建棉花基因组DNA文库。将DNA用BamHI部分消化，将DNA片段克隆进ZAP表达载体(Stratagene)的BamHI位点。
用通用基因组步行试剂盒(Clontech)构建基因组步行文库。来自棉花叶的基因组DNA分别用5种限制酶消化，随后经苯酚/氯仿纯化，并用乙醇沉淀。将消化的DNA于基因组步行衔接子连接。相继进行两轮基因组步行PCR反应。在初级PCR中使用1微升每一基因组步行DNA文库作为模板，初级PCR引物用作二级PCR的模板。PCR起始为95℃ 1分钟，随后35个循环的95℃ 15秒、68℃ 4分钟，最终在68℃延伸6分钟。切下靶PCR条带，经Geneclean试剂盒(Bio 101)纯化。
分离启动子区的两个片段并分别克隆进pGEM-T载体。CFTUB2启动子的一个片段长度为1433bp，另一个片段长度为984bp(图2)。经PCR方法在棉花0.9kb CFTUB2启动子片段的5’-末端和3’-末端分别产生HindIII和BamHI位点。将HindIII/BamHI片段首先亚克隆进pGEM-T载体(Promega)。用HindIII和BamHI消化含有CFTUB2启动子片段的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段。通过在pBI121载体的HindIII/BamHI位点中插入该片段置换CaMV35S启动子而产生嵌合CFTUB2启动子/GUS构建体。
将1.3kb BamHI/BamHI CFTUB2启动子片段首先亚克隆进pGEM-T载体(Promega)。用BamHI消化含有CFTUB2启动子片段的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段。通过将该片段插入pBI101载体的BamHI位点产生嵌合CFTUB2启动子/GUS构建体。
实施例3  CFTUB2启动子的功能分析
为了鉴定CFTUB2启动子在CFTUB2基因的纤维特异性表达中的功能，在基因表达载体pBI101或pBI121(缺失CaMV35S启动子)中分别将CFTUB2启动子的1.3kb片段或0.9kb片段与gus编码序列融合(图3)。用CFTUB2启动子/GUS融合基因的构建体用农杆菌介导的基因转移转化烟草和棉花，用含有CaMV35S启动子/GUS融合体的pBI121载体作为阳性对照。CaMV35S启动子在棉花和其它植物的所有组织中均是活性的，其是一种组成型启动子(Odell等，1985；Ow等，1987；McCabe和Martinell，1993)。将含有CFTUB2启动子/GUS融合基因或CaMV35S启动子/GUS对照的双元载体转移进根瘤农杆菌菌株LBA 4404中。用于转化的棉花外植体得自如实施例1所述培养的棉花幼苗。烟草外植体材料得自烟草幼苗。烟草种子用70％乙醇表面消毒30-60秒，用0.1％HgCl2表面消毒15分钟，随后用无菌水洗。种子在培养室中于光照下28℃在1/2MS培养基上萌发，从无菌幼苗上切下的叶用作转化外植体。用载体经农杆菌转化棉花子叶和下胚轴外植体及烟草叶外植体，将转化植物移植到温室土壤中生长至成熟。
将烟草叶切成2×2cm的片，浸入农杆菌悬液5分钟。在具有1mg/L6-BA的MS培养基上于28℃培养感染的烟草外植体48小时，然后转移至含有100mg/L卡那霉素和1mg/L6-BA的MS选择培养基上培养20-30天，选择转化的茎(卡那霉素抗性茎)。从愈伤组织上切下转化茎，在含有50-100mg/L卡那霉素的MS培养基上生根。将转化的烟草植物转移至温室土壤中生长至成熟。
用子叶和下胚轴作为外植体进行棉花转化。棉花种子用70％乙醇表面消毒30秒钟，用10％H2O2表面消毒60分钟，随后用无菌水洗。这些种子在无菌水中于28℃保温。过夜后，种子发芽。取出胚并置于IM培养基(1/2{MS(大量营养素，微量营养素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L}+phytogel2g/L pH＝6.4)上，于28℃保温7天。棉花的子叶和下胚轴用作转化外植体。在切成5mm2(mm)块后，将外植体浸入根瘤农杆菌菌株LBA 4404悬液(OD600＝0.2-0.4)中15分钟，然后将外植体置于CM培养基(MS(大量营养素，微量营养素，EDTA-Fe)+VB110mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl2 0.7mg/L+phytogel 2g/L pH＝6.4)上于24℃培养2天。用液体MS培养基洗后，将外植体置于SM培养基(MS(大量营养素，微量营养素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB61mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl2 0.7mg/L+phytogel 2g/L+卡那霉素50mg/L+Cefutoxime 200mg/L pH＝6.4)上在培养室中于光照下、28℃进行选择，每月传代培养。在SM上传代培养2-3个月后，从外植体诱导愈伤组织。将愈伤组织转移至DM培养基(MS(大量营养素，微量营养素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+KNO3 19g/L+MgCl2 0.7mg/L+葡萄糖30g/L++phytogel3g/LpH＝6.4)上，每月传代培养。约5个月后，体细胞胚开始形成。在DM培养基上持续培养幼胚，直至它们发育成熟。将成熟胚转移至GM培养基(1/2{MS(大量营养素，微量营养素，EDTA-Fe)+VB110mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L}+NAA 0.01mg/L+葡萄糖30g/L++phytogel 3.5g/L pH＝6.4)上，于盒中发育成小植物。然后将小植物移植到土壤中进行植物生长，收集转基因种子。
通过DNA Southern印迹杂交和GUS组织化学分析来分析具有嵌合CFTUB2启动子/GUS基因(或35S:GUS基因)的转基因烟草和棉花植物以及作为阴性对照的非转化植物。用限制酶消化来自棉花和烟草叶的总基因组DNA，在琼脂糖凝胶上分离，并经毛细印迹转移至Hybond-N尼龙膜上。DNA Southern印迹在68℃、ExpressHyb溶液(Clontech)中与随机标记(Promega Prime-a-Gene标记系统)制备的32P DNA探针杂交。杂交后，在68℃用0.1×SSC，0.5％SDS洗印迹30-60分钟。在-70℃将32P标记的尼龙膜曝光在X-光片上进行放射自显影。Southern印迹分析的结果证实CFTUB2启动子/GUS基因整合进烟草和棉花基因组中。总共获得325个转化的棉花植物，它们属于31个转化品系，将它们移植在土壤中生长至成熟。
根据Jefferson等(1987)所述的方案稍作修改在转基因烟草和棉花植物中进行GUS活性的组织化学分析。将植物的新鲜组织在由0.1M磷酸钠(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亚铁氰化钾和0.5mM铁氰化钾及0.1％X-gluc(Clontech)组成的X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中保温过夜。染色的植物材料随后通过依次用100％和70％乙醇清洗而洗清并固定，检查样品并直接或在显微镜下照相。与Northern印迹分析结果一致，在所研究的所有31个转基因棉花植物中，由CFTUB2启动子驱动的GUS基因在新生纤维中特异表达，但是在其它组织中不表达，而GUS活性在阳性对照棉花植物(35S:GUS)的所有组织中均检测到。总共获得36个转化的棉花植物，并将它们移植至土壤中生长成熟，所有植物均是仅在新生纤维中有可检测水平的GUS活性，但在花器官如花药、花瓣和萼片或在叶和根中没有可检测水平的GUS活性。类似地，发现在CFTUB2启动子驱动下的GUS基因活性仅在所研究的所有15个转基因烟草植物的种子中检测到，提示CFTUB2启动子活性在烟草中也是组织特异性的。这一结果与上述Northern印迹分析结果一起表明CFTUB2启动子在棉花纤维中在转录水平控制基因特异性表达。
参考文献
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                            序列表
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    李学宝
    程宁辉
    刘建伟
<120>来自棉花的纤维特异性β-微管蛋白启动子的分离和鉴定
<130>2577-138
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1623
<212>DNA
<213>Arabidopsis sp.
<400>1
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agaggttgat gagcagatga tcaatgtgca aaacaagaac tcatcttact ttgttgaatg 1080
gatcccgaac aatgtgaagt ccactgtttg tgacatccct ccaatcggct taaagatggc 1140
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aaa                                                               1623
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<400>2
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cctctccaat ttcccgtcac tttccggaga aaatgagaga aatccttcac atc         1433

Claims (2)

1.棉花纤维特异性启动子，其由具有SEQ ID NO：2序列的棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的启动子组成。
2.棉花纤维特异性启动子，其由具有SEQ ID NO：2的核苷酸449-1433序列的棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的启动子组成。
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