CN1157637A - 用于表达植物中导入的基因的乙酰羟酸合成酶启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作在植物中表达异源基因的启动子的，分离的非编码核苷酸序列。本发明还涉及含有该分离核苷酸序列的载体和植物细胞。来自玉米的AHAS启动子被用于在各种植物组织中高水平地表达导入的基因。来自玉米als1和als2基因的启动子被克隆并测序，然后将这些基因的启动子区域导入质粒中报道基因β葡糖苷酸酶(GUS)的5’端。两种启动子片段都来自XI12玉米株系。als1启动子片段长约1400碱基对，als2启动子片段含819碱基对。

Description

用于表达植物中导入的基因的乙酰羟酸合成酶启动子
发明领域
本发明涉及分离出的非编码核苷酸序列，该序列是用作植物中异源基因表达的启动子。本发明还涉及包含分离出的核苷酸序列的载体和植物细胞。
发明背景
植物界分有两门，苔藓植物门和维管植物门。维管植物门包括超过266,000种，分成四亚门。羽叶亚门包括被子植物纲。该纲又分为两个亚纲，双子叶植物和单子叶植物。
由于单子叶亚纲包括了许多重要的谷类和饲料作物，植物遗传学家力图能够生产出转基因单子叶植物。已知的单子叶植物约有50,000种。其中包括百合、棕榈、兰花、鸢尾根、郁金香、苔草和禾本植物。禾本植物包括玉米、小麦、稻子及所有其它谷类。不幸的是，单子叶植物极难进行遗传工程，所以大多用双子叶植物进行此类工作。
双子叶植物是两族中较大的一族，已知约有200,000种。毛茛、金鱼草、香石竹、木兰、罂粟、甘蓝、玫瑰、豌豆、一品红、棉花、仙人掌、胡萝卜、蓝莓、薄荷、西红柿、向日葵、榆树、橡树和槭树代表了双子叶植物250科中的19科。
DNA分子中的遗传信息通常起着模板作用以合成大量较短的RNA分子，大多数RNA分子又是合成特定多肽链的模板。启动RNA合成的RNA聚合酶分子能够识别特定的核苷酸片段(一般称为启动子)。功能RNA链转录完成后，第二类信号终止RNA的合成并使之与其对应的DNA模板分离。
目前，已有许多通用启动子被用于在单子叶植物中启动异源基因的表达。
David McElroy等(1990)称，对水稻肌动蛋白(rice actin)1基因(Act1)启动子与细菌β-葡糖苷酸酶基因(GUS)融合而成的构建物在转化的水稻原生质体中的瞬时表达测试显示，肌动蛋白启动子可引发高水平的基因表达。该表达是用玉米醇脱氢酶1基因(Adh1)启动子所观察到的约6倍，而且依赖于完整的Act15’内含子的存在。
David McElroy等(1991)称，使用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或Act1启动子构建了用于单子叶植物转化的最佳载体。同时对经转化的水稻和玉米原生质体进行了瞬时表达测试。在两种启动子序列中增加Act1内含子和最佳GUS翻译起始位点都显著提高了基因表达水平。同时作为非公开结果提出的是，肌动蛋白启动子在小麦、燕麦、大麦和芦粟原生质体中瞬时表达测试中被证明能够引发GUS的表达。
Wanggen Zhang等(1991)称，对携带Act1-GUS基因融合体的转基因水稻植株进行原位杂交研究，结果显示Act1启动子在营养组织和生殖组织中都具有组成型表达。
Jun Cao等(1992)称，利用在CaMV 35S启动子或者水稻Act1启动子调控下表达的bar基因转化后，在bialohpos上挑选出了转基因水稻植株。
Alan H.Christensen等(1992)称，在瞬时表达测试中，以玉米Ubi-1-CAT基因融合体转化的玉米原生质体表现出的CAT活性水平是以CaMV-35S-GUS基因融合体转化的玉米细胞的约10倍。热激玉米苗后就Ubi-1和Ubi-2转录水平的Northern印迹分析证明，两种基因在25℃为组成型表达，但在热激后呈诱导型表达。
Seiichi Toki等(1992)称，用在玉米Ubi-1启动子调控下表达的bar基因经电穿孔介导转化，并用bialophos选择后得到了稳定转化的转基因水稻植株。该结果证明了Ubi-1启动子能够用于在水稻中引发足够高水平的基因表达，从而可进行结实的、转基因植物的选择与繁殖。
J.Troy等(1993)称，用在玉米Ubi-1启动子调控下表达的bar基因和GUS轰击未成熟胚的愈伤组织，再用bialophos选择，得到了稳定转化的小麦植株。该结果证明Ubi-1启动子能够用于在小麦中引发足够高水平的基因表达，从而可进行结实的、转基因植物的选择与繁殖。
Yuechun Wan和Peggy G.Lemaux(1994)称，用在玉米Ubi-1启动子调控下表达的bar基因和GUS微粒轰击大麦的胚组织，再用bialophos选择，得到了稳定转化的结实大麦植株。该结果证明Ubi-1启动子能够用于在大麦中引发足够高水平的基因表达，从而可进行结实的、转基因植物的选择与繁殖。用Ubi-bar或CaMV35S-bar轰击少量植株的试验显示，在获得的转化体数量上没有明显差异。
Junko Kyozuka等(1991)称，玉米Adh1启动子-GUS融合基因被导入水稻原生质体以获取转基因水稻植株。为了测定GUS表达的方式，检测了转基因植株中的GUS活性。玉米Adh1启动子被发现在被检植株的各部分均促进组成型表达。与过去就Adh1在玉米中的表达所证明的相同，无氧条件可诱导由Adh1引发的GUS表达。
D.I.Last等(1991)称，通过加以多拷贝的玉米ADH1基因无氧反应元件和根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱合成酶基因(pEmu)中ocs元件来修饰玉米Adh1启动子时，在以pEmu-GUS转化的不同单子叶植物原生质体的瞬时表达测试中，此最佳构建物在小麦、玉米、水稻、单粒小麦和多花毒麦(loliummultiflorum)中产生的表达水平是CaMV 35S启动子的10至50倍。
Robert Bower和Robert G.Birch(1992)称，用受Emu启动子调控的新霉素磷酸转移酶基因转化甘蔗的胚生成愈伤组织，得到了稳定的转化体。
D.A.Chamberlain等(1994)称，Emu启动子可用于启动表达转化入小麦和水稻的四种不同可选择标记基因(新霉素磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、phophinothrycin N-乙酰基转移酶和赋予除草剂抗性的突变型乙酰乳酸合成酶)。在选择转化体后得到了小麦愈伤组织和经转化的水稻植株，这表明该启动子能够用于表达可选择标记基因以获取转化的谷类。
最近，公开了有关在转基因谷类中用于调控外源基因表达的启动子元件的综述，在此参考引用。(McElroy和Brettel，1994)
目前，有一系列的启动子被用于转化双子叶植物。这些启动子具有多种不同的来源。一组常用启动子是从根癌土壤杆菌中分离出来的，它们在其中表达在T-DNA上携带的章鱼碱合成酶基因，T-DNA片段在感染时与植物的基因组整合。这些启动子包括章鱼碱合成酶(ocs)启动子(L.Comai等，1985；C.Waldron等，1985)，甘露碱合成酶(mas)启动子(L.Comai等，1985；K.E.McBride和K.R.Summerfelt，1990)和胭脂碱合成酶(nos)启动子(M.W.Bevan等，1983；L.Herrera-Estrella等，1983，R.T.Fraley等，1983，M.DeBlock等，1984，R.Hain等，1985)。这些启动子在许多植物组织中具有活性。
几种病毒启动子也被用于促进双子叶植物中的异源基因表达(J.C.Kridl和R.M.Goodman，1986)。花椰菜花叶病毒35S启动子是双子叶植物转化中最常用的启动子之一，因为它在几乎所有组织中都赋予高水平的基因表达(J.Odell等1985；D.W.Ow等，1986；D.M.Shah等，1986)。也使用该启动子的修饰形式，其中包括由两个串列35S启动子(R.Kay等，1987)和由甘露碱合成酶启动子串联35S启动子后构成的mas-35S启动子(L.Comai等，1990)形成的结构物。上述两个启动子都促成比35S启动子单拷贝更高水平的基因表达。已在使用的其它病毒启动子还包括花椰菜花叶病毒19S启动子(J.Paszkowski等，1984；E.Balazs等)和玄参花叶病毒34S启动子(M.Sanger等，1990)。
对一系列植物中AHAS表达的研究显示AHAS在所有植物组织中都能够表达。Gail Schmitt和Bijay K.Singh(1990)称，对青豆各种组织进行的酶测试证明，在包括叶、茎、根、花、豆荚和分生组织在内的所有被测组织中都存在AHAS活性。AHAS活性在茎中相当稳定，而在叶、根和分生组织中则随年龄的增长而下降。
Sharon J.Kheeler等(1993)称，烟草具有两个编码乙酰羟酸合成酶的基因，SurA和SurB。两种基因似乎都能在所有类型的组织中表达，在不同组织中的表达水平差异约为4倍。正在发育的器官似乎具有最高的表达水平。原位杂交研究证明，总是在代谢活跃或正在迅速分裂的细胞中观察到最高水平的表达。在所有被检组织中，SurB的表达水平高于SurA。
Therese Ouellet等(1992)称，芸苔(属)(Brassica)具有编码乙酰羟酸合成酶的多基因家族。在番油菜(Brassica napus)中已经鉴定出了5个AHAS基因中的4个。为了确定基因家族中不同成员在不同芸苔(属)植物中的表达方式，进行了利用基因特异性探针的RNA酶保护测试。其中两个基因，AHAS1和AHAS3，被发现在所有被检组织中组成型表达。只在繁殖器官和种子的胚外组织中检测到AHAS2转录产物。没有检测到由第四个基因AHAS4编码的转录产物，所以它被认为是一个假基因。
Dale L.Shaner和N.Moorthy Mallipudi(1991)称，比较未成熟玉米叶和生长于悬浮培养物中的BMS细胞中的AHAS活性显示，每克鲜重BMS细胞中的活性是叶样品中的5.8倍。因为BMS细胞正在活跃分裂，所以这一结果与先前以烟草和豌豆进行研究的结果一致，先前的研究证明新生的、分裂活跃的组织比衰老的组织具有更高的AHAS活性。
发明概述
玉米的AHAS启动子被用于在多种植物组织中高水平地表达导入的基因。来自玉米als1和als2基因的启动子被克隆和测序(图1，图2，图3)，然后将来自这些基因的启动子区域导入质粒中报道基因β-葡糖苷酸酶(GUS)的5’端。两种启动子片段都来自XI12玉米株系。als1启动子片段约长1400碱基对，als2启动子片段约含819碱基对。为了测定AHAS启动子的活性，然后以嵌合质粒转移入玉米Black Mexican Sweet的原生质体和水稻的原生质体，以测试瞬时表达的水平。为了比较，又以带驱动GUS报道基因的CaMV 35S启动子的质粒转化原生质体。通过分析GUS酶活性来测定嵌合质粒在玉米细胞中的表达水平。在两种细胞中，玉米als2启动子的活性相当于或高于CaMV 35S启动子的活性(图4)。图5显示对玉米BMS细胞系(该细胞系以pCD221B(als2-GUS-ocs终止子质粒)或pAC400(CaMV 35S-GUS-ocs终止子质粒)稳定转化)进行的β-葡糖苷酸酶测试结果。对植物组织以放射性标记的RNA探针进行原位杂交以分析AHAS mRNA的分布，结果显示玉米AHAS启动子在植物的大多数部分具有活性(图6，图7，图8)。
在以根癌土壤杆菌稳定转化的南芥(属)(Arobidopsis)植物中测定南芥(属)AHAS启动子的活性。南芥(属)AHAS基因上游的启动子区域与GUS报道基因融合，插入二元载体pBIN19，然后用于转化南芥(属)。对转化植株的分析显示在植物大多数部分中的GUS表达(表明启动子的活性)。
附图简述
图1显示来自玉米XA17的AHAS启动子序列ALS1。
图2显示来自玉米XA17的AHAS启动子序列ALS2。
图3显示来自玉米XI12的AHAS启动子序列ALS2。
图4为一条线图，表示经pCD221(als2-GUS-ocs终止子质粒)或pAC400(CaMV35S-GUS-ocs终止子质粒)转化后，对Black Mexican Sweet玉米细胞或水稻悬浮细胞原生质体进行瞬时表达测试得出的β-葡糖苷酸酶活性。将GUS活性计算为pmol/分钟(min)/mg蛋白质。结果由三次独立实验得出。
图5为一条线图，表示经pCD221(als2-GUS-ocs终止子质粒)或pAC400(CaMV35S-GUS-ocs终止子质粒)转化后，稳定转化的Black Mexican Sweet玉米细胞原生质体中的β-葡糖苷酸酶活性。CK代表未经转化的对照组织。将GUS活性计算为pmol/min/mg蛋白质。
图6-用放射性标记RNA探针对2周龄玉米苗的轮生叶(1eaf whorl)进行的原位杂交研究。制备组织切片，与编码AHAS有义链(AHAS-)或AHAS无义链(AHAS+)的RNA探针杂交。为了比较，又使用了SSU(RUBISCO小亚单元)有义链(SSU-)或SSU无义链(SSU+)探针。在所有情况中，只有无义链(+)可能与组织中的mRNA杂交。a)SSU+探针；b)SSU-探针；c)AHAS+探针；d)AHAS-探针。
图7-如图6所述进行授粉，对12天后的玉米粒进行的原位杂交研究，a)种胚和胚柄，AHAS+探针；b)种胚和胚柄，AHAS-探针；c)种皮、糊粉和胚乳，AHAS-探针；d)种皮、糊粉和胚乳，AHAS+探针。
图8-以如图6所述制备的未成熟玉米的顶端分生组织进行的原位杂交研究。a)和b)AHAS+探针；c)和d)AHAS-探针。
本发明的详细说明
科学家试图利用遗传修饰来赋予植物以需要的特征。人们置力于研究改善粮食作物诸如口味、结构、大小、抗虫害性和除草剂抗性、颜色、酸度或甜度等性状的遗传工程技术，以此作为比常规的杂交育种法快速得多的战略。
本发明涉及来自玉米和南芥(属)的AHAS启动子，以及包含这些启动子的载体和植物细胞。(出于本发明的目的，启动子定义为在某基因上游发现的一段核苷酸序列，起着RNA聚合酶结合信号的作用。)对玉米的als1和als2基因进行了克隆和测序，然后将这些基因的启动子区域导入质粒中GUS表达基因的5’端。出于本发明的目的，报道基因定义为融合于目标启动子下游的一段核苷酸序列，由启动子开始的转录因而可通过报道基因。报道基因编码一些易于测定的酶活性；例如，在本发明中，通过测定β-葡糖苷酸酶(GUS)的酶活性来测定嵌合质粒在玉米细胞中的表达。
本领域熟练技术人员应知道，AHAS在许多不同的植物组织中具有高度的活性，因此可被用于在多种植物中表达新的基因。新的基因包括但不限于除草剂抗性基因、解毒基因和对植物病原体的抗性基因。
本发明提出的启动子可用于单子叶植物(包括但不限于玉米，水稻、小麦、大麦、芦粟、燕麦、黑麦和粟)中的异源基因表达。本领域熟练技术人员还应该知道，本发明提出的启动子还能在双子叶植物中驱动基因表达，但单子叶植物启动子在双子叶植物中的表达水平预计要比在单子叶植物中的低。
本领域熟练技术人员应该知道，玉米als2启动子可用于在其它单子叶植物中驱动基因的表达。例如，水稻的Act1启动子在玉米的原生质体中驱动基因的表达，玉米的Emu启动子被用于选择转基因小麦、大麦和水稻，南芥(属)AHAS启动子，双子叶植物启动子，被用于驱动AHAS基因在转基因烟草和转基因土豆中的表达。本发明提出的als2启动子在玉米中的表现最好，但也能在其它单子叶植物中驱动基因的表达。根据在玉米及其它植物中的研究，该启动子在整个植株中驱动基因的组成型表达。在分裂活跃或代谢活跃的组织中可看到最高的表达水平。
转化单子叶作物使用了许多对本领域熟练技术人员来说是众所周知的技术，其中包括但不限于微粒轰击、PEG介导的转化、电穿孔和硅纤维。以上技术都涉及使用DNA载体来送递用于转化的核苷酸序列。适用于本发明的载体包括但不限于带有用于选择转基因材料的标记基因的载体，包括提供潮霉素、卡那霉素、bialophos以及咪唑啉酮和磺酰脲类除草剂抗性的基因。
以下实施例对本发明只进行说明，绝非对本发明限定。
实施例
通过在玉米和水稻的原生质体中或携带有启动子序列与GUS基因融合而成的构建物的玉米细胞系中测定GUS活性，评价als1和als2启动子的效率。下文将说明载体的制备方法和转化的方法。包含嵌合CaMV 35S-GUS，als1-GUS以及als2-GUS基因的构建物
质粒pAC400以质粒pUC19为基础，融合有一段418碱基对(bp)的CaMV35S启动子EcoRI-XbaI片段，克隆在一段含GUS基因的1.7kb XbaI-PstI片段和含章鱼碱合成酶终止子的700bp PstI-BamHI片段上游。筛选由玉米株系XI12制得的基因组文库，获得als1和als2基因。以als1基因的ATG起始密码子上游的一段1.4kb EcoRI-NcoI片段取代CaMV 35S启动子亚克隆在pAC400中，制成pCD223B。将als2基因的ATG上游的一段819bp PstI-NcoI片段在pBluescriptKS-(Stratagene)中亚克隆在相同的GUS-ocs终止子融合体前，制成pCD221B。图3给出了玉米XI12的als2启动子序列。水稻和玉米原生质体的转化与分析
从水稻(Nortai)或玉米(Black Mexican Sweet；BMS)悬浮细胞中分离出原生质体，根据L.A.Lyznik等(1989)和J.Y.Peng等(1990)的PEG介导的转化方法，用pAC221B或pAC400转化。为了进行瞬时表达测试，将转化的水稻原生质体平铺在Millipore滤膜上，滤膜被放置在含有饲养细胞的培养基上，将转化的BMS原生质体培养在3ml液体培养基中。转化后2天，收集原生质体培养物并用GUS萃取缓冲液萃取。根据R.A.Jefferson(1987)的方法以荧光测定法测定GUS活性。
为了从玉米BMS培养物中回收稳定的转化体，用pFF19K(含有编码新霉素磷酸转移酶可选择标记基因)和pCD221B或pAC400共转化原生质体。转化后，将原生质体培养在Millipore滤膜上，滤膜被放置在含有饲养细胞的培养基上。1周后，将原生质体培养物转移至含有饲养细胞和100mg/l卡那霉素的培养基中。将原生质体培养物转移到含100mg/l卡那霉素的新鲜MS培养基中，直至抗性愈伤组织能够被看见。挑选出单个卡那霉素抗性愈伤组织，在卡那霉素存在下再生长2至3周。卡那霉素抗性愈伤组织用X-Gluc染色或根据R.A.Jefferson的方法(1987)用MUG进行测试，以筛选出GUS阳性愈伤组织。将鉴定出的表达GUS的愈伤组织在萃取缓冲液中粉碎以进行测试；以荧光测定法测定GUS活性。
以上实验的数据见图4和图5。
一种突变型玉米AHAS基因提供对咪唑啉酮类除草剂的抗性，由玉米als2启动子驱动，它被用作可选择标志以在转化BMS和A188×B73细胞和水稻细胞后获取转基因愈伤组织。该结果支持这样的观点，即als2启动子能够驱动足够高水平的表达以驱动标记基因的表达。原位杂交
按照J.A.Langdale等(1988)所述制备玻片。在4％的甲醛中固定组织，在乙醇中脱水，以亚二甲基苯澄清，然后包埋在石蜡中。将组织切成8-10μm的切片，放在涂有聚L-赖氨酸的玻片上。用亚二甲基苯去除石蜡，用乙醇洗涤再用水洗涤以重新水合组织。利用Ambion Maxistript试剂盒，同时由als2编码区中一段172个核苷酸(nt)片段和SSU编码区中一段392nt片段的双链(+和-)制备RNA探针。根据Meyerowitz等(1988)的方法，在50℃利用探针通宵进行玻片的杂交，溶液为SPB[100μl10×盐(3M NaCl，10mM Tris pH6.8，50mMDTA)；400μl甲酰胺；200μ1 50％硫酸葡聚糖；40μl 10mg/ml tRNA；10μl 1MDTT；50μl 10mg/ml PolyA]1∶4稀释液，探针在50％甲醛和10mM DTT中在80℃变性30秒。玻片在50℃，在洗涤缓冲液(1×盐，50％甲酰胺，10mM TrispH8，1mM EDTA和10mM DTT)中洗涤2×15分钟，在37℃用RNA酶A(20μg/ml的NTE溶液)处理30分钟，在37℃的NTE缓冲液中洗涤5次，共计1小时，在50℃的洗涤缓冲液中洗涤2×30分钟，在乙醇中脱水，在空气中干燥。在暗房中将玻片浸在预热至37℃的乳液中进行放射性自显影，干燥30分钟至1小时，在暗房中于4℃保存直至显影。玻片显影2分钟，用水洗涤，至少定影5分钟，然后再用水洗涤。组织以Alcien蓝染色，在乙醇和亚二甲基苯中脱色。以Permout计数后，用暗视场显微镜观察玻片。
图6至图8中的原位杂交数据证明，基因在整个玉米种胚中都表达。
可以通过以下方法评价AHAS启动子的表达水平：
1.构建als2-GUS融合基因，测定转基因玉米或水稻植株中的GUS活性方式。先前利用玉米启动子的研究已经证实了在水稻中评价玉米启动子表达的可靠性(Junko Kyozuka等，1991)。挑选出转基因植株后，在各发育阶段对植物组织进行组织化学分析，以同时测定组织特异性和细胞类型特异性。这一技术常用于在单子叶植物和双子叶植物中评价启动子活性。
2.用als2-GUS构建物转化不同种类的植物，从中制备原生质体进行瞬时表达测试。该方法是用于评价不同启动子在异种中的作用能力。用目标构建物转化原生质体，为了表达导入的基因并计量蛋白质而进行培养。培养后，测定细胞中由转基因编码的蛋白质含量，以确定驱动转基因表达的启动子的效率。参考文献
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                          序列表(1)一般信息
(i)申请人
(ii)发明标题：乙酰羟酸酶合成酶(AHAS)结构基因5’端的非编码序列(启动子)可用于转导基因在植物中的表达
(iii)序列数量：3
(iv)通信地址：
   (A)收信人：美国氰胺公司
   (B)街道：One Cyamide Plaza
   (C)城市：Wayne
   (D)州：新泽西
   (E)国家：美国
   (F)邮编：07470-8426
(v)计算机可读形式：
   (A)记录介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容性
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25
(vi)本申请资料：
   (A)申请号：US
   (B)申请日：
   (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
   (A)姓名：Harrington，James J.
   (B)登记号：p38，711
   (C)参考/案卷号：32，348
(ix)通讯信息：
   (A)电话：201-831-3246
   (B)传真：201-831-3305(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：413碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股性：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TCTAGAGAAA CTAAACTACT AATAAAAATT ATTTTTAGCA TATTTTAGTA CTGTNGTTTA60TATTTNNAAA TGATAAAGTT TAACTAAAAG TGCACCGCTA AACCACCGTA AATCCAAAGA120GACCGTAAAT CTCTTCCACG CACTCTGTCG TGTACCAACG TGCTGTGGAA ACGCTCACGT180ACCTTTGTGT ATTATGTACG GATTCGGGCA ACGGACATTT CGACGTCGGT TTGCCAGTCC240NATTCCCATC TGAACCACAC ATCTCTGAAC AAAAGTAGGG GAGGCGCCCG CGTAGCCCCC300TTTCCCACAA TCCCACTCCG TGCCAGGTGC CACCCTCCCC AAGCCCTCGC GCCGCTCCGA360GACAGCCGCC CGCAACCATG GCCACCGCCG CCACCGCGGC CGCCGCGCTC ACC413(2)SEQ ID NO：2信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：509碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股性：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：CCGGATTTCC CTGTTGCGGA TTGCGGGTGG CAGCCTGGCA GGTGGGTGCG ACCCCGTTTG60GATTCCCTTG TCTGGGCCCC TTGTGTCAGT ACCGTCTGTA CTCCGATGAC ATGCACCGTC120GTCCACAGTC AAGTCCAAAA TCTCCCCTCT TTTTTTTAAC GGAACAGTTC AAAACCTCCT180TGACGCACGC TGTCGTGTAC CAGCACTCGG TGGACACCAC GTTTGTAATC CAGGCCGACA240CGTCGGTCCC ACGTCGACAG GCCCCACCGT CCGGTCTGTA GCGTGTACGT ATTCGGGCGA300CGGACGTGTC GTCGTCGTCT TGCGAGTCCC ATTCCCATCA CCATCTGAGC CACACATCCT360CTGAACAAAA GCAGGGAGGC CTCCACGCAC ATCCCCCTTT CTCCACTCCG GTCCGTGGCA420CCCACCCCAA ACCCTCGCGC CGCCTCCGAG ACAGCCGCCG CAACCATGGC CACCGCCGCC480GCCGCGTCTA CCGCGCTCAC TGGCGCCAC509(2)SEQ ID NO：3信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：829碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股性：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CTGCAGGTCA ACGGATCACC TATCAACATC CCAGCTAAAA ACAGTAAAAA GGGGGAAAAC60GTGGGTGAGT TGAGTCTGTC TTGTGGAAAA AACGTTTTAG TTTCTCCTGG AATTAACAAT120AAAAACAGTT GAACAAGATT GACTGTTCCT CCGGGAGGGT TTGGAACATC GTTACAGATG180TGAGCGAAAG GTGAGGAAAC AGAGCGGAGG GCTTGGAGGT GACCTCGGTA GTCAGACGCC240GGAGTTGAGC TTGATGACGA CACCGTACTG GCGTACCAGG CCTAGTAGTG AACACCGGGC300CTGAAGCTGT CGCCGCCGCT GCTCATCTTG TNGGCTGTGC NCGGTGTCCC TGTTGCGGAT360TGCGGGTGGC AGCCTGGCAG GTGGGTGCGA CCCGTTTGGA CTCCCTGATC TGGGCCCTTT420GTGTCAGTAC CGTCTGTACT CCGATGACAT GCACANCGTC GTCCACAGTC AAGTCCACAA480TCTCCCCTCT TTTTTTAACG GAATAGTTNC AAAATCTCCT TGACGCACGC TATCGTGTAC540CAGCGCTCAC TGGACACCAC GTTTGTAATC CACGCCGACA CGTCGNTCCC ACGTCGACAG600GCCCCACCGT CCGGTCTGTA GCGTGTACGT ATTCGGGCAA CGGACGTGTC GTCGTCGTCT660TGCNNNNGTC CCANNNCCCA TCACCATCTG AGCCATCACA TCTCATGCGT GAANAAAAGC720AGGGAAGGCC TCTACGCACA TCCCCCTTTC TNNCTNNNNT CCGTGTCCGT GGCACCCAGG780GGAAACCCTC GCGCCGCCTC CGAGACAGCC GCCGCAACCA TGGCCACCG829

Claims (15)

1.分离的核苷酸序列，它包含一个用于在植物中表达基因的AHAS启动子。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，它包含图1所示的序列，SEQ.ID.No.1。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，它包含图2所示的序列，SEQ.ID.No.2。
4.根据权利要求1所述的核苷酸序列，它包含图3所示的序列，SEQ.ID.No.3。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的核苷酸序列，其中的植物是单子叶植物。
6.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其中的单子叶植物是玉米。
7.包含权利要求1、2、3、4或5所述的核苷酸序列的转化载体。
8.包含权利要求7所述载体的植物细胞。
9.含有权利要求1、2、3、4或5所述核苷酸序列的成熟植株。
10.在植物的不同组织中高水平地表达异源基因的方法，它包括在所述植物中，在权利要求1、2、3或4所述核苷酸序列的调控下表达异源基因。
11.核酸构建物，它包含与异源基因连接的权利要求1、2、3或4所述的序列。
12.根据权利要求11所述的核酸构建物，其中的基因是AHAS基因。
13.将核酸构建物用作可选择标志的方法，构建物包含与突变型基因连接的权利要求1、2、3或4所述的AHAS启动子序列，该基因提供对可选择、转基因物质的抗性，该方法包含以下步骤：
(a)通过插入核酸构建物重组地转化植物材料；
(b)将植物材料放置在含有某种化合物的生长基上；
(c)鉴定出能够在该化合物存在下生长的植物材料。
14.根据权利要求13所述的方法，其中的突变型基因是AHAS基因。
15.根据权利要求13所述的方法，其中的化合物是咪唑啉酮或磺酰脲类化合物。
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