CN106987591A

CN106987591A - 一种光诱导型启动子基因及其应用

Info

Publication number: CN106987591A
Application number: CN201710204994.2A
Authority: CN
Inventors: 谢雅晶; 刘贤金; 何鑫; 徐重新; 张霄
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: CN106987591B

Abstract

本发明提供了一种光诱导型启动子基因，包括具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其同源核苷酸序列，所述光诱导型启动子基因包括来自水稻Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)的RbcS基因及内含子序列。本发明还提供了一种外源基因在植物中诱导表达的方法，包括将上述载体引入植物愈伤组织细胞、生长成具有光诱导型表达的转基因植物。本发明利用光诱导型启动子代替组成型启动子，获得含光诱导启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株。

Description

一种光诱导型启动子基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种光诱导型启动子基因及其应用。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。组成型启动子广泛应用于植物转基因，如常用于转Bt基因抗虫水稻的CaMV 35S启动子，ubiquitin启动子和actin启动子，它能高效、持续和非特异的启动外源基因表达，但外源蛋白在转基因植物中组成型表达也会带来很多负面影响。例如，增加植物的代谢负担，影响植株的生长发育，导致植物生长延滞、植株矮小、产量降低等；另外，利用组成型启动子可能诱发基因沉默，影响转基因技术应用；并且，随着人们对于转基因植物食品安全问题的越来越多的关注，组成型启动子亦不能满足现代基因工程育种的要求。

诱导型启动子只在某些物理或化学信号的刺激下或者植物发育到特定的阶段，才启动外源基因的转录。它不仅能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性，同时可避免由组成型启动子启动外源基因超量表达引起对植株发育的负面影响，也可以在一定程度上解决转基因应用中的基因沉默和食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。

核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)基因的启动子同时具有光诱导性和组织特异性。目前，rbcS的启动子在水稻上的应用非常广泛。最早Kyozuka J等从番茄中发现rbcS基因的启动子可以在转基因水稻中驱动gus基因的表达，通过检测GUS活性发现其只在绿色组织中表达，具有组织特异性。刘巧泉等克隆番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游启动子序列，发现rbcS基因的启动子可以驱动gus基因在转基因水稻绿色组织中特异表达，而在种子和根等组织中几乎不表达。黄海群等克隆水稻日本晴rbcS基因5′上游序列的启动子可以驱动gus报告基因在转基因水稻的胚及胚乳中不表达，在叶片叶鞘、茎及颖壳中特异表达。卢碧霞等进行了相类似的实验，对转基因水稻的GUS定量测定结果发现rbcS启动子的表达水平高于CaMV35S组成型启动子。

发明内容

意外地，本申请发明人发现，水稻RbcS基因中的部分序列也具有启动子的特性；例如，申请人发现水稻日本晴RbcS基因及内含子序列(非RbcS基因的启动子序列)，可经过光诱导仅在水稻的绿色组织中表达外源基因，根、籽实(胚及胚乳)中不表达，并伴随植物生理状态(新叶中高效表达，老叶中低效表达)进行适度表达。这种来源于水稻RbcS基因及内含子序列来源的光诱导型启动子有利于解决转基因水稻中籽实的食品安全性问题，且不影响植株的生长发育。

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种光诱导型启动子基因，其为下列核苷酸序列之一:

1)具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)或与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列同源性至少70％、80％、90％或95％的核苷酸序列；

3)或经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白质、由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。

优选地，本发明所述的光诱导型启动子基因中，所述光诱导型启动子基因包括来自水稻RbcS基因及内含子序列。

优选地，本发明所述的光诱导型启动子基因中，所述光诱导型启动子基因包括来自水稻Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)的RbcS基因及内含子序列。

本发明的另一目的在于提供一种含植物光诱导启动子基因的载体，所述载体包含所述任意一种光诱导型启动子基因。

优选地，本发明所述的含植物光诱导启动子基因的载体中，所述载体为质粒p-OsRBCS-727；更优选地，所述载体为质粒p-OsRBCS-727:GUSplus。

本发明的再一目的为提供一种功能蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列由如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列所编码，或由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码的氨基酸残基序列，经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且编码与SEQ ID№：1所示的核苷酸序列所编码相同活性的蛋白质；或与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或95％的氨基酸序列，且编码与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码相同活性的蛋白质。

本发明还提供了一种外源基因在植物中诱导表达的方法，包括以下步骤：

a.将上述载体引入植物愈伤组织细胞；

b.将该植物愈伤组织细胞生长成植物；并且

c.选择具有光诱导型表达的转基因植物。

优选地，在本发明外源基因在植物中诱导表达的方法中，所述植物为水稻；更优选地，所述水稻为Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)。

优选地，在本发明外源基因在植物中诱导表达的方法中，所述光诱导表达的组织为水稻的绿色组织。

本发明的外源基因在植物中诱导表达的方法，所述主要含水稻RbcS基因及内含子序列的启动子之表达载体，外源基因仅在水稻的绿色组织中表达在根、籽实(胚及胚乳)中不表达，并伴随植物生理状态(新叶中高效表达，老叶中低效表达)进行适度表达。这种新型光诱导型启动子有利于解决转基因水稻中籽实的食品安全性问题，且不影响植株的生长发育。

本发明还提供上述启动子在培育转基因水稻中的应用。

本发明利用光诱导型启动子代替组成型启动子，获得含光诱导启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株。

附图说明

图1本发明一个实施例的含有水稻光诱导启动子载体质粒的酶切位点图；

图2本发明一个实施例的启动子p727片段序列示例图；

图3本发明一个实施例的重组双元表达载体的酶切位点示意图；

图4本发明一个实施例的转基因植株的PCR鉴定图；

图5本发明一个实施例的转基因水稻的叶片southern blot的鉴定图；

图6本发明一个实施例的转基因水稻的叶片光处理后GUS染色分析结果图；

图7本发明一个实施例的转基因水稻的叶片、根、种子的GUS染色分析结果图。

具体实施方式

在本发明的一个实施例中选择并构建的光诱导型启动子基因，来源于水稻RbcS基因及内含子序列。

在本发明的一个实施例中，所述构建的光诱导启动子具有TATAbox、CAATbox等启动子必需元件、与光应答有关的特异元件G-box(ctttatca)、IBOXcore(GATAA)、SORLIP2AT(GGGCC)、SORLIP1AT(GCCAC)、GT1core(GGTTAA)、GT1consensus(GRWAAW)等特异元件；并已通过后续实施例验证此启动子具有光诱导特异性及叶片组织特异性，可驱动报告基因GUSplus在转基因水稻叶片中特异表达，根、籽实(胚及胚乳)中不表达。

所述光诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长序列为417bp；该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ IDNo.1衍生的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。

优选地，所述水稻为Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)。

本发明还提供了含上述光诱导型启动子的载体，优选为p-OsRBCS-727:GUSplus。

以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1水稻光诱导型启动子p727片段的合成及序列分析

1.启动子克隆

意外地，发明人发现在水稻日本晴(Nipponbare of ssp.japonica of Oryzasativa(rice)包含OsrbcS基因及内含子序列的启动子p727(SEQ ID NO.1)，含有多个光应答的顺式作用元件以及启动子必需元件，通过后续试验发现，意外地，启动子p727还具有光诱导、叶片组织特异性，外源基因可在转基因水稻叶片中特异性、适度表达，根、籽实(胚及胚乳)中不表达。

分别在两端引入Hind III及Xba I酶切位点，从水稻基因组中扩增出相应序列后，人工合成了p727片段。启动子的p727片段为417bp的酶切产物(图1)，图中1：双酶切后的p-OsRBCS-727质粒，2：p-OsRBCS-727质粒；M：DNA Marker；箭头指示500bp。

p727片段的序列如SEQ ID No.1所示。合成的片段连接在pEASY-blunt simple载体(购自全式金公司)上，获得p-OsRBCS-727质粒，并利用此载体上的通用引物对基因进行测序，测序结果显示克隆正确。

2.启动子序列分析

利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行启动子调控元件分析，启动子p727序列(见图2)含有TATAbox、CAATbox等启动子必需元件，与光应答有关的特异元件G-box(ctttatca)、IBOXcore(GATAA)、SORLIP2AT(GGGCC)、SORLIP1AT(GCCAC)、GT1core(GGTTAA)、GT1consensus(GRWAAW)等特异元件。

实施例2构建转化重组双元表达质粒(如图3所示)；

1.提取p1300-GUSplusNOS和p-OsRBCS-727的质粒(Axygen质粒小提试剂盒)。p1300-GUSplusNOS由pCAMBIA1300双元表达载体(购自CAMBIA公司)改造所得，在Kpn I和EcoR I酶切位点间加入GUSplus-NOS基因，上游无启动子序列。

2.限制性内切酶Hind III、Xba I(购自NEB公司)双酶切p1300-GUSplusNOS质粒与p-OsRBCS-727质粒。

3.胶回收(Axygen胶回收试剂盒)p1300-GUSplusNOS酶切质粒、启动子p727片段，16℃连接30分钟(T4连接酶，购自NEB公司)，转化至全式金公司生产的Trans10感受态细胞中，涂板挑阳性克隆，利用启动子扩增引物测序验证，获得含植物表达载体p-OsRBCS-727:GUSplus的阳性克隆。

实施例3农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的阳性检测

将实施例2中构建好的植物表达载体p-OsRBCS-727:GUSplus利用冷激法转入根癌农杆菌菌株EHA105(南京农业大学慧赠),然后侵染粳稻品种日本晴(Nipponbare ofssp.japonica of Oryza sativa(rice))成熟胚诱导的愈伤组织。

共培养后用50mg/L潮霉素筛选。

水稻组织培养、农杆菌介导转化以及抗性愈伤组织的筛选与植株再生等操作参照本领域通用方法。

阳性植株用PCR法进行阳性检测,引物均为GUSplus基因内部引物(见下)。产物大小为400bp。

GUSplus-F:5'-TAGTTTTTCTCCTTCATTTTCT-3'SEQ ID NO2；

GUSplus-R:5'-GCTTGTTACGAATGACTTTTCCGAG-3'SEQ ID NO3。

PCR反应条件:94℃10min；94℃30s,55℃30s,72℃1min 30s,45个循环；72℃10min。PCR检测阳性的转基因植株，如图4所示，图中1：p-OsRBCS-727:GUSplus质粒；M：DNAMarker；2-9：p-OsRBCS-727:GUSplus潮霉素抗性转基因植株；10-17，p1300-GUSplusNOS潮霉素抗性转基因植株；18-21：未转化植株。箭头指示500bp。

利用southern blot进行外源基因导入拷贝数检测，检测基因为Gusplus 26-621。鉴定结果如图5所示，图中1：DNA Marker；2：非转基因水稻(日本晴)；3：阳性转基因植株p1305(阳性对照，仅含pCAMBIA1305双元表达载体(购自CAMBIA公司)，其中含GUSplus–NOS基因，上游含CaMV 35S启动子)；4：阳性质粒p1300-GUSplusNOS；5：阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus；6-7：阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS转基因水稻；8-9：非转基因水稻(日本晴，Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice))。

实施例4 GUS组织化学分析

1.阳性转基因水稻不同组织GUS组织化学分析

每种构建体转化的转基因水稻植株中分别取10株阳性转基因水稻植株，取叶片、根和种子,切成适当大小或进行组织切片,浸入适量的GUS染液(1.0mM X-gluc,50mmol/LPBS(pH 7.0),2mM EDTA,0.12％Triton X-100,20％甲醇，0.4mM亚铁氰化钾，0.4mM铁氰化钾)中,37℃放置过夜至显色；然后用75％酒精脱色后,观察拍照。

2.暗培养及光诱导下叶片组织GUS组织化学分析

1)暗培养：每种构建体转化的转基因水稻植株中分别取10株阳性转基因水稻，暗培养5天，取黄化的叶片,切成适当大小,浸入适量的GUS染液(1.0mM X-gluc,50mmol/L PBS(pH 7.0),2mM EDTA,0.12％Triton X-100,20％甲醇，0.4mM亚铁氰化钾，0.4mM铁氰化钾)中,37℃放置过夜至显色；然后用75％酒精脱色后,观察拍照。

2)光诱导：光培养(30度12h，25度12h,光照强度为600umol/(m²·s))1、3、5天，取同一叶片的其余部分，切成适当大小,浸入适量的GUS染液(1.0mM X-gluc,50mmol/L PBS(pH 7.0),2mM EDTA,0.12％Triton X-100,20％甲醇，0.4mM亚铁氰化钾，0.4mM铁氰化钾)中,37℃放置过夜至显色；然后用75％酒精脱色后,观察拍照

结果如下：

如图6所示，图6A为正常光照下的叶片，1-4是阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS的叶片，染色后没有变蓝；5-8是阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus的叶片，染色后变蓝；9-12是阳性转基因植株p1305的叶片，染色后变蓝。图6B为暗培养5d后的叶片，1-3是阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS的叶片(黄化叶)，染色后没有变蓝；4-6是阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus的叶片(黄化叶)，染色后没有变蓝；9-12是阳性转基因植株p1305的叶片(黄化叶)，染色后变蓝。图6C为光诱导14小时后的叶片，A行1-5是阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS的叶片(暗处理同片叶片，绿色部分)，染色后未变蓝；B行1-2是阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS的叶片(暗处理同片叶片，绿色部分)，B行3是阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS的叶片(暗处理同片叶片，黄色部分)，染色后未变蓝；C行1-2是阳性转基因植株p-OsRBCS-727的叶片(暗处理同片叶片，绿色部分)，染色后变蓝，C行3-5是阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus的叶片(暗处理同片叶片，黄色部分)，染色后未变蓝；D行1-5是阳性转基因植株p1305的叶片(暗处理同片叶片，绿色部分)，染色后变蓝。

图7为本发明实施例4中阳性转基因水稻的叶片、根、种子的GUS染色分析结果。图中A行是阳性转基因植株p1300-GUSplusNOS的叶片，1-4为新生叶片，5-7为外侧未黄老叶，染色后均没有变蓝；B行是阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus的叶片，1-4为新生叶片，5-7为外侧未黄老叶，染色后新生叶片变蓝明显，老叶中仅维管束部位有变蓝；C行是阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus的根，染色后均没有变蓝；D行是阳性转基因植株p-OsRBCS-727:GUSplus的种子(无外壳，纵切)，染色后胚乳、胚芽均没有变蓝；E行是阴性对照非转基因水稻的叶片，1-4为新生叶片，5-7为外侧未黄老叶，染色后均没有变蓝；F行是阳性转基因植株p1305的叶片，1-4为新生叶片，5-7为外侧未黄老叶，染色后均变蓝；G行是转基因植株p1305的根，染色后有轻微变蓝；H行为阳性转基因植株p1305的种子(无外壳，纵切)，染色后部分胚乳及胚芽均变蓝。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种光诱导型启动子基因及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> 水稻Nipponbare of ssp. japonica of Oryza sativa (rice)

<400> 1

cggtggcagg taggagaggg tctcgaactt cttgatgccc tcaatcggcc acacctaaat 60

aaacgataat tgaattattg gttaatgttg aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag 120

aagaagaata atgtgtgttg ggtcagtagg ttattacctg catgcacctg atcctgccgc 180

cattgctgac gttgccgaag ctggagttgc cggagcggcg ggcgacgggc atgccggcgg 240

tggacttgag cccctggaag ggagcgacgg tggtggccga cgacgccatc acggaggggg 300

ccatctctgc agctcaccaa gctctctcct tctttgctcg agtacttctt gagatgcact 360

gctctgcaca caggctcccg cggtacgtat aaatagccaa aactcagcgg atcggat 417

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagtttttct ccttcatttt ct 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcttgttacg aatgactttt ccgag 25

Claims

1.一种光诱导型启动子基因，其为下列核苷酸序列之一：

1)具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

3)或经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白质、由SEQ IDNO.1所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的光诱导型启动子基因，其特征在于，所述光诱导型启动子基因包括来自水稻RbcS基因及内含子序列。

3.根据权利要求2所述的光诱导型启动子基因，其特征在于，所述光诱导型启动子基因包括来自水稻日本晴Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)的RbcS基因及内含子序列。

4.一种含植物光诱导启动子基因的载体，其包含如权利要求1～3的任意一种光诱导型启动子基因。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为质粒p-OsRBCS-727。

6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为质粒p-OsRBCS-727:GUSplus。

7.一种功能蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码，或由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码的氨基酸残基序列，经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且编码与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所编码相同活性的蛋白质；或与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或95％的氨基酸序列，且编码与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码相同活性的蛋白质。

8.一种外源基因在植物中诱导表达的方法，包括以下步骤：

a.将如权利要求1～6中任一项所述的载体引入植物愈伤组织细胞；

b.将所述植物愈伤组织细胞生长成植物；并且

c.选择具有光诱导型启动子表达特征的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻；优选地，所述水稻为日本晴Nipponbare of ssp.japonica of Oryza sativa(rice)。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述光诱导表达的组织为水稻的绿色组织。