JP2003531593A

JP2003531593A - イミダゾリノン除草剤に耐性のあるトランスジェニックな単子葉植物、トウモロコシ、イネ、およびコムギ植物を選択するための、トウモロコシｘ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子およびイミダゾリノン除草剤の使用

Info

Publication number: JP2003531593A
Application number: JP2001579580A
Authority: JP
Inventors: ペン，ジャンイン; ヒラヤマ，リン; ロチェット，クリスチャン
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2003-10-28
Also published as: MXPA02010625A; US20030167538A1; AU5920601A; AU2001259206B2; BR0110410A; CA2407396A1; AR030216A1; EP1284597A1; MX233208B; EP1284597A4; US6653529B2; WO2001082685A1; CA2407396C

Abstract

(57)【要約】トウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を単子葉植物（イネ、コーンおよびコムギ）細胞内へ形質転換するための系、イミダゾリノン類の除草剤化合物による形質転換細胞の選択、ならびにイミダゾリノン除草剤に耐性のあるトランスジェニックトウモロコシ、イネおよびコムギ植物の産生が記載される。変異型ａｈａｓ２遺伝子は形質転換において有効な選択マーカーとして使用することができ、スタック遺伝子の特徴の選択に有用であり、育種またはハイブリッド種子の産生における選択マーカーとして有用であり、品質制御手段として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、２０００年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／２００
，６５８号からの優先権を主張する。

【０００２】［発明の分野］本発明は、特に、トウモロコシ（コーン）、コムギおよびイネなどの単子葉植
物へのトウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子の形質転換、イミダゾリノ
ンを用いた形質転換トウモロコシ（コーン）、イネおよびコムギ細胞の選択、イ
ミダゾリノン除草剤に耐性のあるトランスジェニックトウモロコシ（コーン）、
イネおよびコムギの材料および植物の産生、形質転換植物のインビトロでの特徴
付け、ならびに種々の除草剤で処理したイミダゾリノン耐性トランスジェニック
トウモロコシ（コーン）、イネおよびコムギ植物の温室栽培における性能に関す
る。

【０００３】［発明の背景］分枝鎖アミノ酸（バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の生合成経路が植物
中に存在し、動物中に存在しないことは、植物生化学と動物生化学の主な相違点
の１つである。したがって、分枝鎖アミノ酸生合成の阻害は植物にとっては有害
であるが、動物には影響を与えない。イミダゾリノンおよびスルホニル尿素除草
剤は、分枝鎖アミノ酸の生合成において重要な酵素であるアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ（ＡＨＡＳ、あるいはアセト乳酸シンターゼ−ＡＬＳ、Ｅ．Ｃ．４．１
．３．１８）を阻害する（ChaleffおよびMauvais、1984、Shanerら、1984）。そ
の結果、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素除草剤は非常に低い散布量で有効
であるとともに、動物に対しては比較的無毒なので、これらの除草剤は近代農業
で広く使用される。

【０００４】イミダゾリノン除草剤に対する感受性の差異は、その特定の除草剤の化学的な
性質、および植物中での毒性形態から無毒性形態に至る化合物の代謝の違いに依
存する（Shanerら、1984、Brownら、1987）。吸収および移行などの他の植物生
理学的相違も、選択性において重要な役割を果たす（ShanerおよびRobinson、19
85）。ＡＨＡＳ−阻害剤複合体の三次元コンホメーションのコンピュータに基づ
くモデリングによって、突然変異が導入されればイミダゾリノンに対する選択的
な耐性を与えそうな部位として提唱される阻害剤が結合するポケット内にあるい
くつかのアミノ酸が予測された（Ottら、1996）。提唱されたＡＨＡＳ酵素の結
合部位に、これらの論理的に設計された突然変異をさせて産出したトランスジェ
ニック植物は、単一の種類の除草剤に対して特異的な耐性を示した（Ottら、199
6）。

【０００５】主要作物の野外産生においてイミダゾリノン除草剤を適用すると、他の化学薬
剤よりも有効な雑草制御、および環境に対する影響を減らすことが可能になる。
主要な農作物の中で、ダイズだけはその化合物を急速に代謝できるためにイミダ
ゾリノン除草剤に対して自然に耐性がある（ShanerおよびRobinson、1985）が、
コーン（Newhouseら、1991）、コムギ（Newhouseら、1992）およびイネ（Barret
teら、1989）などの他の作物はいくらか影響を受けやすい。イミダゾリノンおよ
びスルホニル尿素除草剤の適用をより多くの作物へ拡大するために、これらの化
合物に対する植物の耐性を高めることが必要である。今までのところ、植物の耐
性を高めるために、１）細胞培養で自然発生する耐性突然変異をスクリーニング
すること（ChaleffおよびRay、1984; AndersonおよびGeorgeson、1989; Sebasti
anら、1989; Maghaら、1993）、２）種子または小胞子中に突然変異を人工的に
誘発すること（Swansonら、1989; Newhouseら、1992; Croughan、1996）、およ
び３）遺伝子操作によって異なる種属間で耐性遺伝子を転移させること（Haughn
ら、1988; Charestら、1990; Odellら、1990; Liら、1992；Tourneurら、1993）
という３つの主要なアプローチが用いられている。これまで、自然発生の除草剤
耐性突然変異体は、タバコ（ChaleffおよびRay、1984）、ダイズ（Sebastianら
、1989）、コーン（AndersonおよびGeorgeson、1989）およびナタネ（Maghaら、
1993）において同定および特徴付けされている。化学的突然変異誘発は、コムギ
（Newhouseら、1992）、キャノーラ（Swansonら、1989）およびイネ（Croughan
、1996）において、耐性突然変異体の産生に成功した。タバコ（Haughnら、1988
; Odellら、1990; Charestら、1990）およびイネ（Liら、1992）に関する研究は
、１つの種属から別の種属へ遺伝子を転移させ、耐性作物を産生する可能性を示
唆した。

【０００６】単子葉植物、特にイネの形質転換技法における進歩は、特性が改良されたトラ
ンスジェニック植物の開発のための種属間の遺伝子の転移を可能にした。トラン
スジェニックイネ植物は、プロトプラストの形質転換（Shimamotoら、1989; Pen
gら、1990）によって、細胞に光照射すること（Christouら、1991; Liら、1993
）によって、およびつい最近では未成熟胚のアグロバクテリウム媒介形質転換（
Chanら、1992; Hieiら、1994; Aldemitaら、1996）によって産生されている。全
ての形質転換プロセスにおいて重要なのは、形質転換された細胞を、残りの細胞
集団から選択できることである。典型的には、抗生物質と、その抗生物質への耐
性を与える遺伝子との組み合わせが使用されている。例としては、カナマイシン
耐性のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子またはジ
ェネティシン（Ｇ−４１８）、ハイグロマイシンＢ耐性のためのハイグロマイシ
ンＢトランスフェラーゼ（ｈｙｈ）（Shimamotoら、1989; Hayashimotoら、1990
）、およびホスフィノスリシン耐性のためのｂａｒ遺伝子（Christouら、1991;
Rathoreら、1993）が挙げられる。これらの選択遺伝子（ｎｅｏ、ｈｙｈおよび
ｂａｒ）は全て細菌に由来する。１つの報告では、スルホニル尿素除草剤による
選択とともに、アラビドプシスからの変異型ａｌｓ遺伝子を使用することが、ト
ランスジェニックイネ植物の産生について実証された（Liら、1992）。クロルス
ルフロン（chlorsulfuron）に対するインビトロ耐性の同様の規模（２００倍）
の増大は、３５Ｓ／ａｌｓ導入遺伝子を含むトランスジェニックイネにおいて実
証され（Liら、1992）、トランスジェニックタバコのイミダゾリノン耐性成長は
、非形質転換コントロール植物よりも１００倍大きいことが報告された（Sathas
ivanら、1991）。文献では、種々の大きさの導入ＡＨＡＳ（またはＡＬＳ）遺伝
子の発現は、異なるプロモーターの使用、およびより広範な形質転換体集団のス
クリーニングを含む、いくつかの形質転換の態様を操作することによって達成さ
れた（Odellら、1990; Sathasivanら、1991; Liら、1992）。研究によって、ア
ラビドプシスのＡＬＳプロモーターをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで置き換える
と、その結果、クロルスルフロンに対するインビトロ耐性が４０倍に変化するこ
とが示された（Liら、1992）。タバコでは、アラビドプシスからの変異型ａｌｓ
遺伝子で形質転換された個々のカルスにおけるイマゼタピル（imazethapyr）に
対する耐性の増大は、１０倍〜１０００倍の範囲であり、遺伝子コピー数の相違
または導入遺伝子の染色体位置の相違を反映する可能性が最も高い（Sathasivan
ら、1991）。

【０００７】イミダゾリノンに特異的な耐性は、多数の特許で報告されている。米国特許第
４，７６１，３７３号は植物における除草剤耐性の基礎として改変ａｈａｓにつ
いて一般論として説明しており、特に、特定のイミダゾリノン耐性コーン系統を
開示した。米国特許第５，０１３，６５９号は、除草剤耐性を示す突然変異体が
、１つまたは複数の保存領域において少なくとも１つのアミノ酸に突然変異を有
することを開示した。この特許に記載された突然変異は、イミダゾリノンおよび
スルホニル尿素に対する交差耐性か、あるいはスルホニル尿素に特異的な耐性の
いずれかをコードするが、イミダゾリノンに特異的な耐性はコードしない。さら
に、米国特許第５，７３１，１８０号および一部継続出願第５，７６７，３６１
号は、単子葉植物においてイミダゾリノンに特異的な耐性をコードする遺伝子を
単離し、それが野生型単子葉植物のＡＨＡＳアミノ酸配列の単一のアミノ酸置換
と関連付けられることを決定した。米国特許第５，７３１，１８０号および同第
５，７６７，３６１号は、同第５，７５０，８６６号および同第６，０２５，５
４１号と同様に、参照によって本明細書中に援用される。しかしながら、参照し
た特許は、概して、イミダゾリノンによる選択のための選択マーカーとしての遺
伝子の使用について暗に言及するが、本発明は、トウモロコシ（コーン）、イネ
およびコムギ品種のような単子葉植物へトウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２
遺伝子を特異的に適用すること、あるいはイミダゾリノン除草剤に対する耐性の
ための選択系として、イミダゾリノン化合物とともに変異型ＸＩ１２ａｈａｓ２
遺伝子を選択マーカーとして使用することを説明する。

【０００８】ＡＨＡＳ遺伝子は、分枝鎖アミノ酸の生合成経路における第１の共通酵素であ
るアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８、アセ
ト乳酸シンターゼ、ＡＬＳとも呼ばれる）をコードする（Shanerら、1984）。イ
ミダゾリノン除草剤はＡＨＡＳ活性を阻害する除草剤の一種であり、それゆえ、
イネおよび多くの雑草種のような感受性植物がさらに成長および発育するのを防
止する。生化学的研究では、イミダゾリノン除草剤の選択性は、除草剤の性質お
よび代謝速度の相違に基づいて示されてきた（ShanerおよびRobinson、1985; Br
ownら、1987）。遺伝子研究では、ａｈａｓ遺伝子における突然変異は、キャノ
ーラ（Swansonら、1989）およびコーン（Newhouseら、1991）のイミダゾリノン
除草剤に対する耐性について関連づけられている。トウモロコシ（ＸＩ１２）植
物から単離した変異型ａｈａｓ２遺伝子の分析によって、開始コドンに対してヌ
クレオチド６２１におけるＧからＡへの単一塩基の突然変異が、ＡＨＡＳ酵素に
おいてＳｅｒからＡｓｎへの１つのアミノ酸変化をもたらすことが明らかにされ
た（Dietrich、1998）。変異型ａｈａｓ２遺伝子という用語は、本明細書中で使
用される場合、変異型ａｈａｓ２遺伝子の機能を変化させることのない、Dietri
chの米国特許第５，７３１，１８０号に記載された核酸配列における任意の付加
、欠失または置換を含む。変異型ａｈａｓ２遺伝子の機能とは、イミダゾリノン
除草剤に対する耐性を付与することである。トウモロコシＸＩ１２変異型ａｈａ
ｓ２遺伝子は、植物の形質転換に使用するのに多数の利点を与える。トウモロコ
シＸＩ１２変異型ａｈａｓ２遺伝子は植物遺伝子であり、さらに、この変異型は
、植物集団に存在することが知られている。トウモロコシＸＩ１２変異型ａｈａ
ｓ２遺伝子とイミダゾリノン化学の組み合わせは、形質転換された細胞、植物お
よび子孫の選択のための有用な系を提供する。植物の形質転換における選択に植
物変異型ａｈａｓ遺伝子を使用することによって、トランスジェニック植物にお
ける細菌由来の抗生物質遺伝子の形質転換に関連する問題を回避できる。変異型
ａｈａｓ２遺伝子という用語は、本明細書中で使用される場合、変異型ａｈａｓ
２遺伝子の機能を変化させることのない、Dietrichの米国特許第５，７３１，１
８０号に記載された核酸配列における任意の付加、欠失または置換を含む。変異
型ａｈａｓ２遺伝子の機能とは、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与する
ことである。

【０００９】［発明の簡単な概要］本発明において、本発明者らは、トウモロコシおよびコムギの胚ならびにイネ
のプロトプラストへのトウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子の形質転換
、イミダゾリノン化合物による形質転換細胞の選択、イミダゾリノン除草剤に耐
性のあるトランスジェニックトウモロコシ、イネおよびコムギ植物の産生、形質
転換植物のインビトロでの特徴付け、ならびに種々の除草剤で処理したイミダゾ
リノン耐性トランスジェニック植物の温室栽培における性能について報告する。

【００１０】イネにおいて、イマゼタピルによる選択に続いて、形質転換から耐性カルスを
回収し、繁殖可能な植物へ再生した。２つのトランスジェニックイネ系統（２６
および２９）についての遺伝子研究では、導入されたトウモロコシａｈａｓ２遺
伝子が子孫植物へ安定的に伝達され、メンデル方式で遺伝される単一の優性形質
を与えることが示された。ホモ接合性イミダゾリノン耐性系統は、種子発芽およ
び温室スクリーン試験に基づいて、容易に同定および単離された。トランスジェ
ニックホモ接合耐性植物から誘導された細胞系統および未成熟胚において、イマ
ゼタピルに対するインビトロ耐性が１００倍増大することが実証された。また本
発明は、同時形質転換において第２の遺伝子を送達するためにも使用できる。ま
た、本発明は、カルス材料の選択およびイミダゾリノン除草剤が補充された培地
での植物の再生とともに、トウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を選択
マーカーとして用いるアグロバクテリウム媒介性形質転換によって、トランスジ
ェニックトウモロコシおよびコムギ植物の産生を確認する。形質転換効率はコー
ンでは平均で約２％であり、いくつかの実験では１６％〜２０％にも到達し、コ
ムギでは０．４〜３．１％の範囲であった。

【００１１】本発明者らは、温室における種々の除草剤の適用に応じて、トウモロコシＸＩ
１２ａｈａｓ２遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ、イネおよびコム
ギ植物の性能を評価した。５種のイミダゾリノン（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）
イマゼタピル (imazethapyr)、ＣＡＤＲＥ（登録商標）イマザメス（imazameth
）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックス（imazamox）、ＳＣＥＰＴＥＲ（
登録商標）イマザキン（imazaquin）、およびＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イマ
ザピル（imazapyr））、２種のイネ除草剤（ＡＣ３２２，１４０シクロスファ
ムロン（cyclosufamuron）およびＬＯＮＤＡＸ（登録商標）ベンスルフロン−メ
チル（bensulfuron-methyl））、ＡＣＣＥＮＴ（登録商標）ニコスルフロン（ni
cosulfuron）、ならびにＣＬＡＳＳＩＣ（登録商標）クロリムロン−エチル（cl
orimuron-ethyl）を含む全部で９種の除草剤が、４段階の異なる散布量で施用さ
れ、トランスジェニックイネ植物の研究において使用された。その結果、非形質
転換コントロール植物と比較して、トランスジェニック植物は、典型的な散布量
の６倍もの散布量でも、５つのイミダゾリノン除草剤に耐性であり、スルホニル
尿素除草剤に対する感受性を保持することがわかった。イミダゾリノン除草剤で
処理しても、トランスジェニック植物は、イミダゾリノン除草剤で未処理のもの
に匹敵する収穫をもたらした。しかしながら、除草剤処理を行なわない場合にお
いては、非形質転換コントロール植物の方が、トランスジェニック植物よりも１
０〜２０％高い収穫であった。全ての散布量で試験された全ての除草剤において
、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イマザピルを高散布量で散布した場合にトランス
ジェニック植物に深刻な不稔性が生じたことを除いて、結実に対して有害な影響
はなかった。酵素アッセイは、導入されたＸＩ１２トウモロコシａｈａｓ２遺伝
子がトランスジェニック植物に選択的耐性ＡＨＡＳ酵素を与えるという証拠を提
供した。種々のイミダゾリン除草剤のトランスジェニックコーン植物に対する影
響の評価は、１６倍のＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イマザピル（３８４ｇ／ｈａ
）、８倍のＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピル（５００ｇ／ｈａ）、４倍
のＣＡＤＲＥ（登録商標）イマザメス（８００ｇ／ｈａ）までは、被害が表れな
いことを示した。４倍のイマザモックス（１６０ｇ／ｈａ）では、植物への被害
は観察されなかったか、あるいはわずかに観察された。トランスジェニックコム
ギ植物では、イマザモックスに対する耐性が５倍に増大することが実証された。

【００１２】変異型ａｈａｓ２遺伝子は形質転換において有効な選択マーカーとして使用す
ることができ、スタック遺伝子特性の選択に有用であり、育種またはハイブリッ
ド種子の産生における選択マーカーとして有用であり、品質制御手段として有用
である。

【００１３】［発明の説明］好ましい実施形態では、トランスジェニックイネ植物はトウモロコシＸＩ１２
変異型ａｈａｓ２遺伝子を用いる形質転換によって産生され、この遺伝子は、次
に選択マーカーとして利用される。イネの品種ノルタイ（Nortai）（Ｎｔ）およ
びラドン（Radon）（Ｒｄ）から単離したイネのプロトプラストは、ＰＥＧ媒介
形質転換によって、トウモロコシＸ１１２ａｈａｓプロモーターおよび変異型Ｘ
１１２ａｈａｓ２遺伝子（Ｓｅｒ６２１Ａｓｎ）を含むプラスミド構築物である
ｐＣＤ２２０を用いて形質転換された。本研究における形質転換効率は、イネに
使用される他の耐性遺伝子／選択系について報告された効率よりもわずかに低い
ものの、同程度であった（Pengら、1990; Liら、1992）。また、タバコでは、ク
ロルスルフロン（イミダゾリノン除草剤と類似した作用形態を有する除草剤）か
らの形質転換体の回収は、カナマイシンからの形質転換体の回収よりもはるかに
低いと報告された（Charestら、1990）。カナマイシン（Pengら、1991）などの
抗生物質とは違って、イミダゾリノン除草剤は、形質転換されたイネカルスの植
物再生の可能性に対して有害な影響を与えなかった。したがって、トウモロコシ
変異型ａｈａｓ２遺伝子を、イミダゾリノン除草剤を用いた選択と結びつけるこ
とによって、イネおよび他の単子葉植物の遺伝子操作のための、新たな価値ある
選択性遺伝子および選択系が与えられる。

【００１４】また、さらなる実施形態では、本発明は、トウモロコシＸ１１２変異型ａｈａ
ｓ２遺伝子を選択マーカーとして用いて、アグロバクテリウム媒介の形質転換に
よって産生されたトランスジェニックトウモロコシおよびコムギ植物を同定する
。特に、０．８〜１．５ｍｍの未成熟胚は受粉の１０〜１６日後に単離され、ト
ウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を保有するアグロバクテリウム細胞
とともに、３〜７日間共培養された。次に外植体を、コムギでは７〜１０週間、
トウモロコシでは５〜８週間、イミダゾリノン除草剤を含む選択培地へ移し、２
〜３週間ごとに継代培養した。本発明の選択スキームでは、イミダゾリノン除草
剤の初期濃度は非常に低く、わずか０．０５〜０．１μＭのイマゼタピルまたは
イマザモックスを培地へ添加しただけであった。本発明者らは、再生可能なカル
ス細胞を確実に形成するために、初めは選択圧を低く保持することが重要である
ことを見出した。初期の選択段階で高濃度のイミダゾリノン化合物を使用した場
合には、植物へ再生できない粘液性カルスが形成されただけであった。第２およ
び第３の選択段階においては、イマゼタピルまたはイマザモックスの濃度を、そ
れぞれ、０．５または０．３μＭへ上げた。これらの濃度で普通に成長した細胞
の多くは、トウモロコシ変異型ＸＩ１２ａｈａｓ２遺伝子で形質転換された細胞
であった。トウモロコシの苗条を再生している間はイマゼタピル濃度を０．２５
μＭへ低下させ、根の形成中はイミダゾリノン化合物を全く添加しなかった。コ
ムギの再生中は、イマザモックス濃度を０．１μＭとし、根の形成中にはやはり
選択試薬を添加しなかった。

【００１５】次に、推定のトランスジェニック植物に、イミダゾリノン除草剤を散布した。
コムギ小植物には、移植の１０〜１４日後に、２５〜５０ｇ／ｈａのＲＡＰＴＯ
Ｒ（登録商標）が散布され、コーン植物には、移植の約２週間後に、１２５〜２
５０ｇ／ｈａのＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルを散布した。除草剤処
理を生き残った植物を大型の鉢へ移植し、成熟するまで成長させた。

【００１６】これらの形質転換系から産生したトランスジェニックトウモロコシおよびコム
ギ植物は、導入トウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を含んでいた。Ｐ
ＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）および／またはサザンブロット分析を用いて、導
入遺伝子の存在を確認した。イマゼタピル耐性カルスから再生した植物（推定の
形質転換体）から抽出したＤＮＡのサザンブロット分析は、アッセイした全ての
植物が導入トウモロコシａｈａｓ２遺伝子を有することを示した。いくつかの植
物は多数の挿入を伴う多数のコピーで形質転換しており、他の植物は単一の遺伝
子座へ組み込まれた１〜２個の遺伝子コピーで形質転換していた。無傷の導入遺
伝子の１〜２個のコピーによる単一の組込みパターンを有する植物は、インビト
ロおよびインビボでさらに評価するために、次の世代へ伝達された。導入遺伝子
のイネＴ１植物への伝達は、ＰＣＲ分析および散布試験によって研究された。

【００１７】トランスジェニックイネのＴ２子孫の除草剤耐性を評価するために、３つの試
験を実行した。Ｔ２子孫は、まず、種子の発芽試験によって評価され、続いて温
室散布試験およびＰＣＲ分析が行なわれた。トランスジェニック植物試験の準備
として、０．１〜１０μＭの範囲のイマゼタピル濃度で非形質転換イネ種子を発
芽させるための実験を行なった。非形質転換種子は１μＭで完全に阻害されたた
め、次に行ったＴ２世代の種子発芽試験では、閾値の５倍に相当する５μＭのイ
マゼタピルを使用した。温室散布試験およびＰＣＲ分析を用いて、種子発芽試験
の結果が耐性ホモ接合、感受性ホモ接合、または分離性ヘミ接合としての系統と
矛盾しないことをさらに確認した。

【００１８】実施例に示されるような形質転換細胞および植物の特徴付けから得られたデー
タは、本発明に従って産生したトランスジェニックトウモロコシ、コムギおよび
イネが植物レベルで十分な耐性を有することを示す。イネはインビトロのイミダ
ゾリノン除草剤に対する感受性が本質的に高い。非常に低濃度（０．１μＭ以上
）のイマゼタピルであっても、非形質転換イネ細胞の成長を阻害する。導入トウ
モロコシＸＩ１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を有するトランスジェニック細胞は、
トランスジェニック植物から誘導された微細懸濁細胞、または単離直後の未成熟
胚の両方で、インビトロのイマゼタピル耐性が１００倍に増大した。

【００１９】インビトロＡＨＡＳアッセイは、耐性ＡＨＡＳ酵素がトランスジェニック植物
における選択的除草剤に対する耐性の基本であることを実証するために実行した
。抽出およびＡＨＡＳ活性のインビトロアッセイのための手順は、以前に公表さ
れた手順を用いた（Singhら 1988）。分析のための植物組織源として苗条の下方
部分を用いた。脱塩した粗製抽出物をインビトロ酵素アッセイのために使用した
。酵素によって産生されたアセトラクテートをアセトインへ変換して、ウェスタ
ーフィールド（Westerfield）アッセイ系により測定した。

【００２０】本発明は、さらに、形態学的に正常であり、かつ導入遺伝子を伝達および遺伝
した繁殖可能なトランスジェニック植物を提供する。再生された植物はその種子
成長対応物と極めて似ている形態学的形質を有しており、いくつかの植物は結実
が非常に低かったが、ほとんど自己繁殖であった。生存可能な種子の産生および
導入遺伝子の遺伝は、トランスジェニック系統から他の選択育種系統への除草剤
耐性の伝達を可能にする。

【００２１】最後に、実施例は、種々の除草剤で処理したイミダゾリノン耐性トランスジェ
ニック植物の温室栽培における性能を示す。本明細書に示されたトウモロコシＸ
Ｉ１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を含むトランスジェニック植物の性能についての
温室栽培における評価の結果は、非常に有望である。そのようにして産生された
トランスジェニックイネおよびトウモロコシ植物は、作物への被害を最少にして
除草剤の適用を持続するために、野外産生において使用できる。本発明の形質転
換に使用した２つのコムギ品種、チッチョ（Ciccio）およびコロッセオ（Coloss
eo）は、イミダゾリノン除草剤、特にＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックス
に対して極めて高い感受性を有する。１０ｇ／ｈａ（野外散布量の１／３以下）
で処理した場合、チッチョおよびコロッセオの草高は、変異型トウモロコシＸ１
１２ａｈａｓ遺伝子を有する形質転換植物の草高に比べて５０％未満であった。
１０ｇ／ｈａより多いＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックスを散布した場合
、非形質転換植物は完全に死滅した。本発明はさらに、イミダゾリノン除草剤に
対する耐性が向上したトランスジェニックコムギ植物を提供する。

【００２２】［好ましい実施形態の実施例］実施例１：形質転換に使用されるプラスミド構築物以下のプラスミドは、単子葉植物の形質転換のために使用される（図４参照）
。ｐＣＤ２２０：プラスミドｐＣＤ２２０は、トウモロコシＸＩ１２変異型ａｈａ
ｓ２遺伝子を促進するトウモロコシａｈａｓプロモーター、およびその自然ター
ミネーターとを含む。ｐＣＤ２２０プラスミドは、ＸＩ１２ａｈａｓ２遺伝子を
ＰｓｔＩフラグメントとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｐＫＳ−）へサブク
ローニングすることによって構築した（ｐＫＳ−は、Stratagene、11011 North
Torrey Pines Rd. La Jolla, California 92037から購入した）。ｐＡＣ１５５８：このプラスミドは、ｐＣＤ２２０のＸｂａＩフラグメントをＪ
ＴベクターｐＳＢ１２へ挿入して作られ、ｐＳＢ１へ組み込まれる。（ｐＳＢ１
２およびｐＳＢ１はJapan Tobacco Inc.からのベクターであり、米国特許第５，
５９１，６１６号が参照される。American Cyanamidはこれらのベクターを使用
するためのライセンスを有する。）ＰＡＣ１５５８は、トウモロコシＸＩ１２変
異型ａｈａｓ２遺伝子を促進するトウモロコシａｈａｓプロモーターと、その自
然ターミネーターとを含む。

【００２３】実施例２：イネの形質転換および選択、ならびにイミダゾリノン除草剤に対する
耐性のためのトランスジェニックイネの特徴付け Dr. Thomas K. Hodges（Department of Botany and Plant Pathology、Purdue
University、 W. Lafayette, IN 47907）により提供されたイネ品種のノルタイ
（Ｎｔ）およびラドン（Ｒｄ）の懸濁細胞からプロトプラストを単離して、Peng
ら（1990、1992）によって記載された手順に従って形質転換した。形質転換のた
めに使用した構築物（ｐＣＤ２２０）は、実施例１で説明したように、その構築
物自体が有するプロモーターによって駆動される変異型トウモロコシＸＩ１２ａ
ｈａｓ２遺伝子（Ｓｅｒ６２１Ａｓｎ）を含んでいた。形質転換の後、プロトプ
ラストを、フィーダー細胞を含む固体アガロース培地の頂部に載置したミリポア
フィルター上でどちらも培養した（Leeら、1989）。イネの培養に使用されたア
ガロースはゲル化温度が３６〜４２℃であり、ＧＩＢＣＯＢＲＬ（Grand Island
, NY 14702）から購入した。あるいは、７％グルコース溶液中の３％アルギン酸
塩１容量とプロトプラスト1容量を混合することによって、プロトプラストをア
ルギン酸塩フィルム中に包埋し、フィーダー細胞を含む液体状の上記と同じプロ
トプラスト培養液（Pengら、1990、1992）で培養した。アルギン酸塩培養は、低
速シェーカー（４０〜５０ｒｐｍ）上で暗所に保持された。培地はプロセスにと
って重要ではなく、当業者の知識によって変更することができる。アガロース培
養では、形質転換細胞の選択は、０．５μＭのイマゼタピル（ＡＣ２６３，４９
９）上で形質転換の３週間後に開始し、中間で１回または２回の継代培養をしな
がら、６〜８週間継続した。アルギニン酸塩／液体培養法が使用される場合、選
択は、０．５μＭのイマゼタピル上で形質転換の３〜５日後に始め、培養物を、
７〜１０日ごとに、０．５〜１μＭのイマゼタピルを含む新鮮な液体培地へ移し
た。形質転換の７〜９週間後に、耐性コロニー（約０．５ｍｍの大きさ）を取り
出し、同じイマゼタピル濃度で０．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、２％のスクロース
、および０．６％のアガロースが補充された（Pengら、1990）ＬＳ培地（Linsma
ierおよびSkoog、1965）上に載置し、さらに３週間増殖させた後、さらにもう３
週間、選択試薬を含まない新鮮な培地へ移した。苗条誘発のために２〜３週間、
耐性カルスをＭＳＫＴ培地（５ｍｇ／ｌのキネチン、５ｍｇ／ｌのゼアチン、０
．１ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、３％のスクロースおよび０．６％のアガロース
を補充したＭＳ（MurashigeおよびSkoog、1962)基本培地）へ移した。根の形成
のために、小さな苗条をＭＳＯ培地（植物成長調節物質は含まずに、３％のスク
ロースおよび０．６％のアガロースを補充したＭＳ培地、Pengら、1992）へ移し
た。２〜３週間後、温室内の６インチ鉢中の土壌およびＭｅｔｒｏｍｉｘ３６０
（The Scotts Company, Marysville, OH 43040）の半々の混合物へ小植物を移植
した。確実に自家受粉をさせるために植物に袋をかぶせ、成熟して種子を産生す
るまで成長させた。イネでは、選択後に回収した耐性コロニーに基づく見かけの
形質転換効率は、処理した１００万個のプロトプラストあたり１〜１４個の範囲
であった。１つを除いて、選択されたカルスの３〜１０％が植物へ再生した（表
１）。

【００２４】実施例３：推定トランスジェニックイネ植物のＰＣＲ分析Ｗａｎｇら（１９９３）の良く知られた手順を用いて個々のイネ植物からＤＮ
Ａを単離した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、
０．１％トリトンＸ−１００）、２００ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸
、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（すべてPerkins Elmer
Applied Biosystems, Foster City, CAから）、および７．５ｐモルの各プライ
マーを含む５０μｌの反応容量。反応混合物を３分間かけて９５℃まで加熱し、
「９５℃で１分、５５℃で２分、７２℃で２分」のサイクルを４０回繰り返して
増幅した後、７２℃で５分間のインキュベーションを行った。トウモロコシＸＩ
１２ＡＨＡＳ遺伝子を同定するために、配列番号１とされるフォワードプライマ
ー５’−ＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’、および配列番号２
とされるリバースプライマー５’−ＡＡＧＧＧＴＣＡＡＣＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧ
Ｔ−３’のプライマーは、遺伝子の３’末端から２５１ｂｐフラグメントを増幅
するように設計された。プライマーはGenosys Biotechnologies, Inc., The Woo
dlands, Texas 77380-3600から得られた。ＰＣＲ分析によって、耐性系統から誘
導されたＴ０、Ｔ１および全てのＴ２植物において、導入トウモロコシａｈａｓ
２遺伝子の存在が立証された。１つの例では、ＰＣＲ反応産物についてアッセイ
された１５のＴ１植物のうち、系統２６および系統２９ではそれぞれ１２および
１３のＴ１植物が導入遺伝子に対して陽性であり、Ｔ１子孫植物のいくつかへ、
導入遺伝子が確実に安定的に伝達されることが示された（表２）。Ｔ１植物のい
くつかに導入遺伝子が存在しないのは、最初のＴ０植物において導入遺伝子がヘ
ミ接合状態にあるからであると予想された。

【００２５】実施例４：発芽試験個々のＴ１植物から収穫したＴ２種子を、５０％のＣｌｏｒｏｘ（登録商標）
漂白剤（２．３％次亜塩素酸ナトリウム）中で３０分間滅菌した後、オートクレ
ーブ処理した水で十分に洗浄し、２〜３日間水中で予備発芽させた。３０〜３５
個の予備発芽させた種子を、５μＭのイマゼタピル（ＡＣ２６３，４９９、技術
グレード）を含む２０ｍｌの水が添加された、マジェンタボックス（Sigma, St.
Louis, MO）底部に直立して配置された折り畳んだペーパータオルの表面へ移し
た。２６℃で約１ヶ月間、１２時間光を当てて、苗を成長させた。イマゼタピル
処理を生き残った苗は耐性であると評価され、死滅した苗は感受性であると評価
された。Ｔ２世代の次の種子発芽試験のために、閾値の５倍に相当する５．０μ
Ｍのイマゼタピルを使用した。Ｔ０植物２６番から誘導された１６系統のＴ１か
ら収穫されたＴ２種子およびＴ０植物２９番から誘導された１５系統のＴ１から
収穫されたＴ２種子を、種子発芽試験でスクリーニングした。５μＭのイマゼタ
ピルで１ヶ月処理した後、全てのコントロール種子は死滅し、耐性のトランスジ
ェニック植物は生き残って、水だけで処理したコントロール植物と明白な相違を
示さず成長を続けた。種子発芽試験の結果は、イマゼタピル処理に対して、全て
耐性のＴ２種子を産生するＴ１系統があわせて１０個存在し、全て感受性のＴ２
種子を産生するＴ１系統はあわせて５個であり、耐性または感受性の両方のＴ２
種子を産生するＴ１系統はあわせて１４個であることを示した（表２）。種子発
芽試験から得られたデータの統計的分析は、系統２６および２９では、導入トウ
モロコシＸＩ１２ａｈａｓ２遺伝子によって与えられたイマゼタピル耐性形質は
、おそらく、メンデル方式で遺伝される一方の優性形質であることを示した（表
２）。

【００２６】実施例５：トランスジェニックイネ細胞のインビトロ成長分析未成熟胚（受精の１２〜１４日後）は、図１で２６−４とされるトランスジェ
ニックホモ接合Ｔ２植物、または種子成長したノルタイ植物から単離され、イマ
ゼタピル（ＡＣ２６３，４９９）の濃度を、０、０．０１、０．０３３、０．１
、０．３、１．０、３．３、１０、２５、または５０μＭのとした、２ｍｇ／ｌ
の２，４−Ｄ、３％のスクロース、０．６％のアガロースが補充されたＮ６基本
培地中（Chiuら、Sci. Sin 18:659-68、1975）（３ＳＮ６ｄ２）に載置された。
１つの１０×６０ｍｍペトリ皿に５つの胚を載置し、各濃度に対して２〜３個の
プレートを反復実験した。３週間後に、個々の胚から誘導されたカルスの生体重
を測定することによって、インビトロの細胞応答をモニターした。

【００２７】細胞の懸濁培養は、３ＳＮ６ｄ２液体培地において、トランスジェニックホモ
接合Ｔ２植物２６−４−１０またはノルタイ植物のいずれかからの未成熟胚に由
来するカルスから開始され、種々の濃度のイマゼタピルで処理される前に２〜３
ヶ月培養された。懸濁細胞を４０μナイロンメッシュによってろ過し、回収し、
３ＳＮ６ｄ２液体培地に再懸濁させた。０．２ｍｌの懸濁細胞をミリポアフィル
ター上へ載せて、次に、０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５、５、
１０、２５または５０μＭのイマゼタピル（ＡＣ２６３，４９９）を含むアガロ
ース凝固培地へ載置した。３週間後、全ての培養物を、同じ濃度のイマゼタピル
を含む新鮮な培地へ一度移し、さらに５週間成長させた。８週間の培養期間の最
後に生体重を測定した。

【００２８】トランスジェニック胚およびコントロール胚は、イマゼタピルを含まない培地
上でのカルス開始に十分に応答した。イマゼタピルで処理した培地に載置された
場合、ノルタイ植物（コントロール）から単離した未成熟胚からのカルス誘発は
０．１μＭで完全に阻害され、成長はカルス開始に応答して０．０３μＭで５０
％未満へ低下した。トランスジェニック胚では、１μＭまでのイマゼタピルで処
理された培地上で通常のカルス誘発および成長が観察され、３．３μＭでは約５
０％の成長低下が観察され、１０μＭではカルス誘発は全く観察されなかった（
図１Ａ）。したがって、トランスジェニック胚ではインビトロでのイマゼタピル
に対する耐性が１００倍増大されたことが明らかである。

【００２９】直径４０μ未満の細胞クラスターによる高速成長懸濁培養物は、イマゼタピル
に対するそのインビトロ応答について評価された。イマゼタピルが存在しない場
合には、トランスジェニック細胞とコントロール細胞の成長に明らかな違いはな
かった。イマゼタピルの存在下では、実験で用いられた最低濃度の０．１μｍで
コントロール細胞の成長は停止され、トランスジェニック懸濁細胞の成長は１．
０μｍまでは通常であり、以下、２μｍで急激に低下し、５μｍでは全く成長し
なかった（図１Ｂ）。

【００３０】実施例６：トランスジェニック植物におけるＡＨＡＳ活性インビトロＡＨＡＳアッセイを、トランスジェニック植物の除草剤に対する耐
性の基礎を理解するために実行した。抽出およびＡＨＡＳ活性のインビトロアッ
セイの手順のために、以前に公表された手順を使用した（Singhら、1988）。苗
条の下方部分をアッセイのための植物組織源として使用した。インビトロ酵素ア
ッセイのために脱塩粗抽出物を使用した。酵素により産生されたアセトラクテー
トをアセトインへ変換し、ウェスターフィールドアッセイ系により測定した（We
sterfield 1945）。ＡＨＡＳの比活性は、ノルタイ（Ｎｔ）の活性（５０ｎモル
／ｍｇタンパク質／ｈ）と比較して、系統２６（６７ｎモル／ｍｇタンパク質／
ｈ）および系統２９（６４ｎモル／ｍｇタンパク質／ｈ）の方が約３０％高かっ
た。許容性の系統２６および系統２９からの酵素活性の大部分は、ノルタイ植物
からの通常の酵素についての阻害曲線と比較した場合、イマゼタピルおよびイマ
ザピルによる阻害に対して非感受性であった（図２）。興味深いことに、３つ全
ての系統からのＡＨＡＳ活性はクロルスルフロンによって同様に阻害された（図
２）。この結果は、トウモロコシＸＩ１２変異型ａｈａｓ２遺伝子がイミダゾリ
ノン除草剤に対してだけ選択的に耐性であることを示す。

【００３１】実施例７：ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルを散布したイネ植物の温室
栽培における性能本発明者らは、温室におけるＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルの適用
に対するトランスジェニックイネの応答を評価した。この実験には、２つのトラ
ンスジェニック系統およびそれらに対応する非形質転換体（Ｎｔ）が含まれた。
系統２６および２９で示されるトランスジェニック系統は、それ自体のプロモー
ターにより促進されるトウモロコシＸＩ１２ａｈａｓ２遺伝子を含む、既に同定
されたホモ接合耐性トランスジェニック植物に由来するＴ３子孫であった。全て
の種子を水中で２〜３日間予備発芽させ、次に温室内の６インチ鉢（１鉢あたり
２つの種子）中の土壌およびＭｅｔｒｏＭｉｘ３６０（The Scotts Company, Ma
rysville, OH 43040）が１：１からなる植栽混合物中で成長させ、６３，１２５
、または２５０ｇａｉ／ｈａでＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルを散布
した。出芽後の適用では、ほとんどの植物が三枚葉を有する播種の１５日後に、
植物に散布した。出芽前の処理では、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピル
は播種の翌日に散布した。それぞれの処理には、処理ごとに２０株の植物、およ
び３つの反復実験が含まれた。１セットの実験材料には散布せず、コントロール
として使用した。植物を温室で成長させ、成熟時にて収穫した。ＰＵＲＳＵＩＴ
（登録商標）イマゼタピルは、現在では水田で使用されていないので、この研究
で適用されたＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルの量（６３、１２５また
は２５０ｇａｉ／ｈａ）は、イミダゾリノン耐性コーンの野外散布量の１、２ま
たは４倍に近い量とした（表３参照）。全ての除草剤に適用するために、注文設
計されたベルト散布器を、説明された通りに（Newhouseら、1992）操作した。各
処理から５株の植物を無作為に選択し、形態学的形質を個別に測定した。３つの
反復実験に関して平均および標準偏差を計算した。草高は、除草剤適用の９３日
後（ＤＡＨ）に、植物の根底から止め葉の先端までを測定し、植物あたりの分げ
つ数は１０２〜１０３ＤＡＨ（除草剤適用後の日数）に数えた。植物を収穫した
後、植物ごとの円錐花序の数および収量のデータを収集した。

【００３２】この実験の結果は表４および５に要約され、以下のことを実証する。（１）出
芽前の適用では、トランスジェニック系統は使用された全ての散布量のＰＵＲＳ
ＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルに対して耐性であった。コントロール（ノルタ
イ）植物は１２５および２５０ｇ／ｈａのＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタ
ピルで完全に死滅し、６３ｇ／ｈａでは草高が約２０％低下し、収量が４０％減
少した。全ての散布量で生き残った系統２６および２９のトランスジェニック植
物は非常に良好に成長し、その未処理の対応物に匹敵する収量をもたらした（表
４）。（２）出芽後の適用では、トランスジェニック植物は、この場合もまた十
分に機能し、全ての処理体から匹敵する収量が得られた（表５）。コントロール
は、６３ｇａｉ／ｈａのＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルではいくらか
影響を受け、それより高い散布量の１２５ｇａｉ／ｈａでは測定された全ての場
合において劇的な低下を引き起こし、２５０ｇａｉ／ｈａでは全ての植物が死滅
した（表５）。（３）一般的に、除草剤処理をしない場合には、未処理のトラン
スジェニック植物は、非形質転換コントロール植物よりも背が低く、多くの分げ
つおよび円錐花序を有する。非形質転換ノルタイ植物は、トランスジェニック植
物よりも約１０％（出芽後の実験）〜２０％（出芽前の実験）高い収量であった
。

【００３３】実施例８：種々の除草剤の適用に対するトランスジェニックイネ植物の応答５種のイミダゾリノン、２種のイネ除草剤、並びにＡＣＣＥＮＴ（登録商標）
（ニコスルフロン）およびＣＬＡＳＳＩＣ（登録商標）（クロリムロン−エチル
）の全部で９種の除草剤をこの研究で適用した。６インチ鉢の代わりに、１８個
の（セルあたり３インチ×３インチ）セルを有する仕切りのある鉢を使用したこ
とを除いて、実験材料および方法は基本的には上記と同じであり、１つの３イン
チ×３インチのセルに１０〜１２個の種子が植えられた。出芽後の適用では、１
つのセルに１０個の植物が保持された。各除草剤は、処理ごとに３つの反復実験
をし、出芽前または出芽後の適用のいずれかで、４つの異なる散布量、１倍、２
倍、４倍、および６倍で散布された。この実験で適用された除草剤の名称および
量、並びにそれらの商業的な適用に関連した情報は表３に示される。簡潔にする
ため、および便宜のために、使用される最低濃度を１倍の散布量として示し、２
倍、４倍および６倍の散布量とは、最低濃度の散布量の倍数とする。

【００３４】種々の除草剤に対する植物の応答をモニターするために、生体重のデータを収
集した。出芽前の適用では、１つのセルからの全ての植物を散布の３２日後に収
穫し（３６日齢植物）、重量を測定した。出芽後の適用では、除草剤散布の２９
日後に、各セルから５つの植物（４４日齢植物）を切断し、個別に重量を測定し
た。各処理に対する平均生体重を、３つの反復実験について計算した。残りの５
つの植物は、成熟するまで温室内で成長させ、成熟した時点で、３つの植物の円
錐花序を収集し、充填された種子の数および穀粒全体の数が数えられ、結実率を
決定した。

【００３５】目視観察からの結果、および生体重測定からの結果によって、全体として、ト
ランスジェニック植物は出芽前適用よりも出芽後適用において良好に機能し、２
種のイネ除草剤（ＡＣ３２２，１４０シクロスファムロンおよびＬＯＮＤＡＸ
（登録商標）ベンスルフロン−メチル）は、処理した全ての植物の成長に対して
影響が最小限であることが示された。出芽後適用では、トランスジェニック植物
の成長は、ＣＡＤＲＥ（登録商標）イマザメス、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イ
マザピル、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピル、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標
）イマザモックスおよびＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）イマザキンのいずれのイミ
ダゾリノン除草剤にも４倍までは影響されず、６倍でわずかに影響された。ＡＣ
ＣＥＮＴ（登録商標）ニコスルファンおよびＣＬＡＳＳＩＣ（登録商標）クロリ
ムロン−エチルは、１倍の散布量においてでさえ、植物の成長に大きな影響を与
えた。同様の傾向が、両方のトランスジェニック系統の成長が２倍以上のＳＣＥ
ＰＴＥＲ（登録商標）イマザキンおよび６倍のＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザ
モックスの適用によって影響を受ける点を除いて、出芽前適用においても見られ
た。低比率のＡＣＣＥＮＴ（登録商標）ニコスルファン（１および２倍）は、２
つのトランスジェニック植物およびコントロール植物の植物生体重に大きな影響
は与えなかった。表６に示されるデータは、除草剤処理をしなかった植物、およ
び２種のイネ除草剤（ＡＣ３２２，１４０シクロスファムロンおよびＬＯＮＤ
ＡＸベンスルフロン−メチル）で処理した植物は、平均して、８０〜９８％が結
実したことを実証する。ほとんどの散布量（１×ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イ
マゼタピル、１および２×ＣＡＤＲＥ（登録商標）を除く）のイミダゾリノン除
草剤、全ての散布量のＡＣＣＥＮＴ（登録商標）、ならびに４および６倍の散布
量のＣＬＡＳＳＩＣ（登録商標）クロリムロン−エチルで処理されたコントロー
ル（ＮＴ）植物は、種子を産生することなく死滅した。ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商
標）イマゼタピル、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックス、ＣＡＤＲＥ（登
録商標）イマザメス、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）イマザキン（試験した全ての
散布量において）、および低散布量のＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イマザピル（
１〜２倍）は、２つのトランスジェニック系統において、結実（円錐花序あたり
の全穀粒数に対する充填種子の割合）および円錐花序あたりの全穀粒数に全く影
響を与えなかった。これらの処理体から平均約８５％の結実が得られた。しかし
ながら、４倍（９６ｇａｉ／ｈａ）および６倍（１４４ｇａｉ／ｈａ）のＡＲＳ
ＥＮＡＬ（登録商標）イマザピルの適用では、生体重に反映されるこれらの植物
の成長と、円錐花序あたりの全穀粒数は大きく影響されなかったにもかかわらず
、２つのトランスジェニック系統において結実は２０％以下に低下した（図３お
よび表６）。ＡＣＣＥＮＴ（登録商標）ニコスルファンおよびＣＬＡＳＳＩＣ（
登録商標）クロリムロン−エチルは、トランスジェニック植物の結実、および円
錐花序あたりの全穀粒数の両方に影響を与えた。

【００３６】実施例９：コーンの形質転換および選択未成熟胚の解剖：未成熟胚の大きさに応じて、受粉の９〜１２日後に雌穂を収
集する。種子（ＨｉＩＩＡおよびＡ１８８）は、USDA／ARS and Crop Sciences,
UIUC, Urbana, IL 61801‐4798から得られた。穂軸を表面滅菌するために外皮
の外側から内側へ７０％エタノールおよび１０％ライゾールを数回散布する。全
ての外皮を除去し、メスで絹糸を切除し、穀粒の頂部を薄く削る。０．８〜１．
２ｍｍの範囲の大きさの未成熟胚が解剖顕微鏡の下で単離され、ＬＳ−ｉｎｆ培
地（コーンおよびコムギの形質転換のための全ての培地は（Ishidaら、1996）か
ら適合させた）を含む２．５ｍｌのチューブ内に載置された。それぞれのチュー
ブに対して約１００個の胚を載置するのが適切である。未成熟胚を溶液中で緩や
かにかき混ぜ、溶液を除去する。ＬＳ−ｉｎｆ培養液で同じようにして未成熟胚
をもう一回洗浄する。

【００３７】共培養：トウモロコシＸ１１２変異型ａｈａｓ２遺伝子を含む１ｍｌのアグロ
バクテリウム細胞を、未成熟胚を含むチューブへ添加し、混合物を３０秒間緩や
かにかき混ぜた後、室温で５分間インキュベートする。未成熟胚をペトリ皿へ移
し、１００〜２００μＭのＡＳ（acetosyringeone）を補充したＬＳＤ１．５培
地上へ、胚盤側を培地から離して上にして未成熟胚を慎重に載置する。１つのプ
レートへ最高２００個の胚を載置することができる。プレートをパラフィルム膜
で３日間密閉した後、共培養段階の最後まで、多孔性テープ（３Ｍ、St Paul MN
55144）で密閉する。暗所で7日間、２６℃で未成熟胚をインキュベートする。共
培養を３〜４日間することがJapan Tobacco, Inc. によって推奨されている（Is
hidaら、1996を参照）が、本発明の手法では７日間の共培養が必要とされた。

【００３８】第１の選択：共培養の７日後に、１００×２５ｍｍのペトリ皿中の２５０ｍｇ
／ｌのセフォタキシムおよび０．０５μＭのイマゼタピル（ＡＣ２６３，４９９
）を補充した新鮮なＬＳＤ１．５培地へ未成熟胚を慎重に移す。通常１つのプレ
ートに２５個の胚が載置される。プレートを植物性テープで密閉する。暗所で２
〜３週間、２６℃で未成熟胚を成長させる。

【００３９】第２の選択：解剖顕微鏡をのぞきながらピンセットを使用して、活発に成長し
ているカルス細胞を採取し、２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび０．５μＭ
のイマゼタピルに処理した新鮮な培地へ移す。プレートを製品テープ（Winans M
cShane, Benardsville, NJ 07924から購入した）で密閉する。暗所で３週間、２
６℃で材料を成長させる。

【００４０】第３の選択：上記の選択プロセスを繰り返し、同一条件下で、さらに２〜３週
間、材料を成長させる。

【００４１】植物の再生：苗条誘発のために、解剖顕微鏡下で活発に成長しているカルス材
料を選択し、０．２５μＭのイマゼタピルを補充したＬＳＺＴ５培地（Yoshida
ら、1996のＬＳＺと同じ）へ移す。１４／１０時間の明所／暗所で、２６／２４
℃で２〜３週間（１４時間２６℃で光をあて、１０時間２４℃で暗所におくとい
うサイクルを２〜３週間繰り返す）、あるいは苗条形成が見えるまで、カルス材
料を成長させる。根形成のために、ＭＳ４ＲＧ（３％スクロース、０．８％寒天
を補充した、植物調節物質およびイマゼタピルを含まないＭＳ培地）を含むマジ
ェンタボックスへ小植物を移す。根が出た小植物を、１５セルの各セルにＭｅｔ
ｒｏＭｉｘ３６０（The Scotts Company, Marysville, OH 43040）を有する鉢へ
移植し、温室中で植物を成長させる。

【００４２】再生植物への散布：移植の１０〜１４日後（植物が３〜４枚葉の段階に到達し
たとき）に、再生植物に２倍または４倍のＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタ
ピル（１倍＝６２．５ｇ／ｈａ）を散布した。２〜３週間後、実験の結果を記録
し、生き残った植物を１ガロン鉢へ移し、開花するまで植物を成長させた。必要
に応じて、トランスジェニック植物を自家受粉または他家受粉させる。受粉の約
４５日後に種子を収穫する。種子を乾燥させ、適切に保存する。

【００４３】トランスジェニック子孫の評価：３〜４枚葉の段階（天候次第で約９〜１３日
）まで、３×５の仕切りのある鉢で、１鉢（５×５インチ）あたり１株のコーン
植物を成長させる。散布の日には、植物に十分水をかけ、余分な水を落とす。所
望の散布量のイミダゾリノン除草剤をベルト散布器上で植物に散布する。天候が
許すなら、３日間は植物に上から水をかけない。温度が高すぎる場合には、しお
れるのを防止するために植物に土壌から水を与える。次の２〜３週間は植物を詳
しく観察する。除草剤被害の兆候は散布の３日後に見え始め、感受性植物は温度
次第で２〜３週間以内に死滅するであろう。

【００４４】植物は０〜５の尺度で評定され、０は死滅した植物であり、５は被害が全くな
いか、あるいは最小限である健康な植物であった。

【００４５】コーンの形質転換効率は、少なくとも１つのイミダゾリノン耐性トランスジェ
ニック植物を産生する未成熟胚のパーセントとして計算され、平均して約２％で
あり、いくつかの実験では１６％〜２０％にも達した（表７）。

【００４６】トランスジェニックコーン植物は、種々のイミダゾリノン除草剤に対する耐性
レベル、および導入遺伝子の遺伝について温室内で評価した。コーンでは、本発
明者らのプロトコルには、トランスジェニック植物を２〜３世代にわたって、自
家受粉または他家受粉させ、耐性植物か感受性植物かを同定するためにＴ１子孫
植物に除草剤を散布することが含まれた。除草剤耐性レベルおよび遺伝パターン
について詳細に分析する。導入遺伝子にホモ接合性の系統の同定は、自家受粉ま
たは他家受粉で誘導された子孫植物を用いてＴ２世代において実行された。例え
ば、初期散布処理に生き残り、ＰＣＲ反応で陽性を示したトランスジェニック植
物１Ｂ１（遺伝子型Ａ１８８）は、自家受粉およびＢ７３で他家受粉してＴ１種
子を産生し、これらはもう一度、自家受粉または他家受粉して、Ｔ２種子を産生
した（図５）。Ｂ７３およびＭｏ１７系統は、USDA／ARS and Crop Sciences, U
IUC, Urbana, IL 61801‐4798から得られた。Ｔ１植物は、三枚葉の段階で４倍
のＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピル（２５０ａｉｇ／ｈａ）により処理
され、除草剤に耐性であるか、あるいは感受性を有するかで評定された。全部で
６つの自家受粉したＴ１植物、および８つのＢ７３と他家受粉した１Ｂ１のＴ１
植物に除草剤が散布され、すべてが除草剤処理に生き残った。

【００４７】２つのトランスジェニックハイブリッドＢＡａ−４およびＭＡａ−７系統（そ
の系図については図５を参照）、非形質転換コントロール系統ＢｘＡ（Ｂ７３ｘ
Ａ１８８）、８９６２ＩＴ（ヘテロ接合性ＸＩ１２イミダゾリノン許容性コーン
系統）、８９６２（野生型コントロール）、ならびに３３９５ＩＲ（ホモ接合性
ＸＡ１７イミダゾリノン耐性コーン系統）（８９６２ＩＴおよび８９６２はICI,
現在はGarst Seed Company, Slater, IA50244から得られ、３３９５ＩＲはPion
eer Hi-Bred International Inc., IA50306-3453から得られた）。植物に、４、
８、１６または２０倍のＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピル、ＡＲＳＥＮ
ＡＬ（登録商標）イマザピル、ＣＡＤＲＥ（登録商標）イマザメス、またはＲＡ
ＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックスを散布した。植物を、除草剤処理の１６日
後に個々に０から５で評価した（０は死滅植物であり、５は被害が全くない健康
な植物である）。表８は、使用した系統および除草剤の散布量を示し、この実験
の結果を要約する。本願発明者らによる観察によって、トランスジェニック系統
は両方とも、最高で１６倍のＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イマザピル（３８４ｇ
／ｈａ）、８倍のＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピル（５００ｇ／ｈａ）
、４倍のＣＡＤＲＥ（登録商標）イマザメス（８００ｇ／ｈａ）に対して被害を
示さなかったが、一方、コントロール植物は試験されたどの除草剤でも４倍で全
て死滅することが示された（図５）。４倍のＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモ
ックス（１６０ｇ／ｈａ）では、１つのトランスジェニック系統（ＭＡａ−７）
はこの場合も十分に機能したが、他のトランスジェニック系統（ＢＡａ−４）の
成長はわずかに影響を受けた。４つの試験されたイミダゾリノンのうち、トラン
スジェニック植物は、ＣＡＤＲＥ（登録商標）イマザメスおよびＲＡＰＴＯＲ（
登録商標）イマザモックスよりもＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）イマザピル、ＰＵ
ＲＳＵＩＴ（登録商標）イマゼタピルに対してより高い耐性を有するようである
。

【００４８】実施例１０：コムギの形質転換および選択未成熟胚の滅菌および解剖：Eurogen S.ｒ.I（C.da Grottacalda, Strada Tur
istica, Bivio Ramata, Grottacalda km 4,500, 94015 Piazza Amerina (EN), I
taly）から得られたデュラムコムギの品種チッチョおよびコロッセオが、形質転
換のために使用された。小麦植物が一旦開花し始めたら、最初に開花した日付を
記載した小片テープで各頭部に印を付ける。未成熟胚の大きさ（０．５〜１．０
ｍｍの範囲）によって、開花の１２〜１６日後にコムギの穂状花序を収集する。
枝から穀粒を切り離し、２５×１００ｍｍのペトリ皿に１００〜２００個の穀粒
を載置する。穀粒を滅菌し、未成熟胚を顕微鏡下でメスを用いて解剖した。２ｍ
ｌのＬＳ−ｉｎｆ培養液を含む微量遠心機のチューブ内に約１００〜２００個の
胚を載置し、緩やかにかき混ぜた。未成熟胚をＬＳ−ｉｎｆ培養液で２回洗浄し
た。

【００４９】共培養：未成熟胚を含むチューブへ１ｍｌの細菌細胞を添加し、３０秒間緩や
かにかき混ぜる。室温で５分間、未成熟胚を細菌溶液中でインキュベートした。
インキュベーションの後、未成熟胚は、１００μＭのＡＳを補充したＬＳＤ１．
５培地を含むペトリ皿へ、杯盤側を培地から離して上にして載置した。プレート
をパラフィルムで３日間密閉した後、４日間多孔性テープで密閉された。共培養
のための全インキュベーション時間は７日間であった。

【００５０】第１の選択：共培養後、１００×２５ｍｍのペトリ皿中の２５０ｍｇ／ｌのセ
フォタキシムおよび０．１μＭのイマザモックス（ＡＣ２９９，２６３）を補充
した新鮮なＬＳＤ１．５培地へ未成熟胚を慎重に移す。この段階で胚の苗条が形
成される場合には、移す前に苗条を胚から切り取る。１つのプレートに２５個の
胚を載置する。プレートを植物性テープで密閉する。１４／１０の昼／夜で、２
６℃／２４℃の温度で２週間、未成熟胚を成長させる。

【００５１】第２の選択：解剖顕微鏡下でピンセットを用いて、活発に成長しているカルス
細胞を採取し、２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシム、および０．３μＭのイマザモ
ックス（ＡＣ２９９，２６３）に処理した新鮮な培地へ移す。上記で指定された
のと同一条件下で２週間、培養物を成長させる。

【００５２】第３の選択：上記の選択プロセスを繰り返し、材料を２週間成長させる。

【００５３】植物の再生：通常は、この段階で既に小さい苗条が形成されている。苗条を表
面に有するカルス片を、０．１μＭのＡＣ２９９，２６３を補充したＬＳＺＴ５
培地へ慎重に移す。１４／１０の昼／夜で、２６℃／２４℃の温度で２〜３週間
、未成熟胚を成長させる。根の誘発のための培地を含むマジェンタボックスへ苗
条を移す。１５セルに仕切られている鉢の中の混合物へ小植物を移植し、温室で
植物を成長させる。

【００５４】再生植物への散布：移植の約２週間後の、小植物が３〜４枚葉の段階に到達す
る時に、再生植物に２５ｍｇ／ｈａのＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックス
を散布する。３週間後に、生き残った植物を１ガロン鉢へ移植し、開花するまで
植物を成長させる。植物が開花し始めたら、確実に自家受粉させるために、それ
ぞれの頭花を受粉バッグで被覆する。植物が成熟するまで成長させる。種子を適
切に収穫、乾燥および保存する。

【００５５】トランスジェニック子孫の評価：１セルあたり約１０個の種子で、３×５セル
に仕切られた鉢へ種子を蒔く。植物を約２週間成長させる。散布の日には、植物
に十分水をかけ、余分な水を落とす。所望の散布量のイミダゾリノン除草剤を、
ベルト散布器上で植物に散布する。３日間は植物に水を与えない。散布の３日後
に、通常の水撒きのスケジュールを再開する。次の２〜４週間は植物を詳しく観
察する。除草剤被害の兆候は散布の２週間後に見え始め、感受性植物は４〜６週
間後に死滅するであろう。本発明者らは、通常、草高を測定し、植物の形態を０
から１０で評価し、０は死滅植物、１０は被害が全くないかあるいは最小限であ
る健康な植物とする。

【００５６】コムギの形質転換効率は、少なくとも１つのイミダゾリノン耐性トランスジェ
ニック植物を産生する未成熟胚のパーセントとして計算し、０．４〜３．１％の
範囲であった（表７）。ｐＡＣ１５５８を含むアグロバクテリウム（ＬＢＡ４４
０４）による初期の形質転換実験から生成した繁殖可能な再生体０４０７−１は
、出芽後にＲＡＰＴＯＲ（登録商標）イマザモックスに対する耐性が評価された
。形質転換されていないチッチョおよびコロッセオ植物はＲＡＰＴＯＲ（登録商
標）イマザモックスに非常に感受性であり、非常に低散布量で死滅した。トラン
スジェニックコムギ植物は、非形質転換のコントロールよりも、ＲＡＰＴＯＲ（
登録商標）イマザモックスに対して耐性を示した（図６Ｂ）。

【００５７】この散布量（５０ｇ／ｈａ）は、非形質転換チッチョに死をもたらした（図６
）。２８８個のＴ１トランスジェニック植物の中で、除草剤散布後に７０個が生
き残り、２１８個が死滅し、耐性植物と感受性植物の比率はほぼ１：３であった
。耐性植物は除草剤処理をしても生き残ったが、植物の発育遅延に加えて、分げ
つ数の増大および３３〜７０％の萎縮（stunting）を示した。植物サンプルのＰ
ＣＲ分析は導入遺伝子の完全な挿入を明らかにし、０４０７−１０植物およびそ
の子孫が、イミダゾリノン除草剤に対して耐性のＡＨＡＳ酵素を与えるトウモロ
コシ変異型ＸＩ１２ａｈａｓ遺伝子で、形質転換されたことを示した。

【００５８】また、本発明者らは、０４０７−１−１０の最良系統のうちの１つからのＴ２
子孫植物を分析した。１鉢あたり１０個のＴ２種子が植えられ、１系統あたり２
鉢に、０、１０、２０、３０、４０および５０ｇ／ｈａのＲＡＰＴＯＲ（登録商
標）イマザモックスを散布した。ほとんどの植物は、非形質転換コントロールよ
りも耐性の増加を示した（図６Ｂ）。例えば、耐性トランスジェニック植物の草
高は２０ｇ／ｈａでは約２５％だけ低下したが、非形質転換植物は１０ｇ／ｈａ
より上の散布量では完全に死滅した。

【００５９】本発明の好ましい実施例が図示および説明されたが、本発明の精神および範囲
から逸脱することなく本発明に種々の変化を成し得ることは理解されるであろう
。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【表２】

【００６２】

【表３】

【００６３】

【表４】

【００６４】

【表５】

【００６５】

【表６】

【００６６】

【表７】

【００６７】

【表８】

【００６８】

【表９】

【００６９】

【表１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】種々の濃度のイマゼタピルに処理した培地で、形質転換（２６−４）植物およ
び非形質転換コントロール（Ｎｔ）植物の未成熟胚から誘導された懸濁細胞（Ａ
）およびカルス（Ｂ）の生体重を示す。

【図２】Ａ〜Ｃは、ＡＨＡＳ活性についての酵素分析を示す。Ｎｔは非形質転換コント
ロール植物であり、系統２６および２９はトランスジェニックイネ植物である。

【図３】Ａ〜Ｉは、イネ植物の生体重に対する種々の除草剤の影響を示す。除草剤は、
各グラフに示される１、２および４倍の散布量で三枚葉の段階（出芽後）で散布
した。系統２６および２９はトランスジェニック植物であり、Ｎｔは非形質転換
コントロールである。

【図４】ＡおよびＢは、形質転換で使用されるプラスミド構築物を示す。

【図５】トランスジェニックトウモロコシの交雑スキームである。

【図６】形質転換および非形質転換コムギ植物の草高に対するイマザモックスの影響を
示す。０〜５０ｇ／ｈａのイマザモックスで処理した場合の非形質転換チッチョ
およびコロッセオ植物の草高（Ａ）。三枚葉の段階で０〜５０ｇ／ｈａのイマザ
モックスで処理したトランスジェニック系統０４０７０１−１０および非形質転
換チッチョ（Ｂ）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヒラヤマ，リンアメリカ合衆国ニュージャージー 08619 マーサービルナトローナアベニュー 221 (72)発明者ロチェット，クリスチャンアメリカ合衆国ペンシルヴァニア 19607 ヤーデリーサウスメインストリート 162 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD12 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 AA11 BA07 CA02 CA20 DA02 EA04 FA02 FA07 GA11 GA17 GA21 GA27 HA11 4B063 QA05 QA13 QA17 QQ04 QQ09 QQ21 QQ44 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR55 QR62 QR67 QS16 QS25 QS34 QS36 QX01 QX02 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA10 BA16 BA25 BB01 BB40 BC01 BC31 BC47 CA27 CA53 (54)【発明の名称】イミダゾリノン除草剤に耐性のあるトランスジェニックな単子葉植物、トウモロコシ、イネ、およびコムギ植物を選択するための、トウモロコシＸ112変異型ＡＨＡＳ２遺伝子およびイミダゾリノン除草剤の使用

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トウモロコシ変異型ａｈａｓ２遺伝子を選択マーカーとして
使用する方法であって、（ａ）トウモロコシ変異型ａｈａｓ２遺伝子を含む核酸構築物を用いて、植物
材料を組換えにより形質転換するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換植物材料を、少なくとも１つのイミダゾリノ
ンを含む成長培地上に載置するステップと、（ｃ）イミダゾリノンの存在下で成長可能な形質転換植物材料を特定するステ
ップとを含む方法。
【請求項２】前記植物材料は、単子葉植物細胞である請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記単子葉植物細胞は、イネのプロトプラストである請求項
２に記載の方法。
【請求項４】前記単子葉植物細胞は、トウモロコシ胚に由来する請求項２
に記載の方法。
【請求項５】前記単子葉植物細胞は、コムギ胚に由来する請求項２に記載
の方法。
【請求項６】前記核酸構築物は、適切なプロモーターに連結されたトウモ
ロコシ変異型ａｈａｓ２遺伝子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記核酸構築物は、少なくとも１つのさらなる遺伝子を含む
請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記さらなる遺伝子を保有する形質転換植物材料を選択する
ための請求項７に記載の方法の使用。
【請求項９】前記さらなる遺伝子の使用であって、形質転換効率を測定す
るための請求項７に記載の方法の使用。
【請求項１０】前記トウモロコシ変異型ａｈａｓ２遺伝子は、変異型Ｘ１
１２ａｈａｓ２遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記イミダゾリノンは、イマゼタピル、イマザメス、イマ
ザピル、イマザモックスおよびイマザキンからなる群から選択されるイミダゾリ
ノン除草剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】除草剤耐性などの新しい特徴のためのイミダゾリノンによ
る選択とともに、トウモロコシ変異型Ｘ１１２ａｈａｓ２遺伝子の選択マーカー
としての使用を含む選択方法。
【請求項１３】イミダゾリノンの存在下で成長可能である、請求項２に記
載の方法に従って産生される形質転換植物細胞。
【請求項１４】請求項１３に記載の形質転換植物細胞から産生されるトラ
ンスジェニック植物であって、イミダゾリノンに耐性であるトランスジェニック
植物。
【請求項１５】少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に対して耐性を示
す請求項１４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】前記イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル、イマザメス
、イマザピル、イマザモックスおよびイマザキンからなる群から選択される請求
項１５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】イミダゾリノンの存在下で成長可能である、請求項３に記
載の方法に従って産生される形質転換イネ植物プロトプラスト。
【請求項１８】請求項１７に記載の形質転換イネプロトプラストから産生
されるトランスジェニックイネ植物であって、イミダゾリノンに耐性であるトラ
ンスジェニックイネ植物。
【請求項１９】少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に対して耐性を示
す請求項１８に記載のトランスジェニックイネ植物。
【請求項２０】前記イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル、イマザメス
、イマザピル、イマザモックスおよびイマザキンからなる群から選択される請求
項１９に記載のトランスジェニックイネ植物。
【請求項２１】イミダゾリノンの存在下で成長可能である、請求項４に記
載の方法に従って産生される形質転換トウモロコシ胚。
【請求項２２】請求項２１に記載の形質転換トウモロコシ胚から産生され
るトランスジェニックトウモロコシ植物であって、イミダゾリノンに耐性である
トランスジェニックトウモロコシ植物。
【請求項２３】少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に対して耐性を示
す請求項２２に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
【請求項２４】前記イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル、イマザメス
、イマザピル、イマザモックスおよびイマザキンからなる群から選択される請求
項２３に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
【請求項２５】イミダゾリノンの存在下で成長可能である、請求項５に記
載の方法に従って産生された形質転換コムギ胚。
【請求項２６】請求項２５に記載の形質転換コムギ細胞から産生されるト
ランスジェニックコムギ植物であって、イミダゾリノンに耐性であるトランスジ
ェニックコムギ植物。
【請求項２７】少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に対して耐性を示
す請求項２６に記載のトランスジェニックコムギ植物。
【請求項２８】前記イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル、イマザメス
、イマザピル、イマザモックスおよびイマザキンからなる群から選択される請求
項２７に記載のトランスジェニックコムギ植物。
【請求項２９】請求項２に記載のトランスジェニック単子葉植物から誘導
される生存可能な植物材料。
【請求項３０】細胞組織、植物器官または種子からなる群から選択される
請求項２９に記載の生存可能な植物材料。
【請求項３１】細胞またはプロトプラストが請求項３０に記載の生存可能
な植物材料から誘導される組織培養物。
【請求項３２】請求項１４に記載のトランスジェニック植物から誘導され
る子孫であって、少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に耐性であり、ハイブ
リッド植物である子孫。
【請求項３３】請求項１４に記載のトランスジェニック植物から誘導され
る子孫であって、少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に耐性であり、繁殖可
能な植物である子孫。