ES2608927T3 - Resistencia a herbicidas que inhiben la acetohidroxiácido sintasa - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una acetohidroxiácido sintasa (AHAS) de arroz funcional, donde: la AHAS codificada exhibe una resistencia a al menos un herbicida de imidazolinona y a al menos un herbicida de sulfonilurea que interfieren normalmente con la AHAS de arroz de tipo natural; la AHAS codificada tiene una sustitución de serina a asparagina en la posición del aminoácido 627 de la SEQ ID NO: 17; y la AHAS codificada es idéntica a la AHAS de tipo natural que comprende la secuencia de aminoácidos tal como la mostrada por la SEQ ID NO: 17, a excepción de la sustitución de serina a asparagina que está presente en dicha AHAS codificada.
Description
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DESCRIPCION
Resistencia a herbicidas que inhiben la acetohidroxiacido sintasa Campo tecnico
La presente invencion es pertinente a plantas resistentes a herbicidas, y a secuencias de nucleotidos que confieren a las plantas resistencia a herbicidas, en particular, resistencia a herbicidas que interfieren normalmente con la enzima vegetal acetohidroxiacido sintasa (AHAS), dichos herbicidas incluyen, por ejemplo, los de la clase imidazolinona y los de la clase sulfonilurea.
Antecedentes de la tecnica
El desarrollo de nueva resistencia a herbicidas en plantas ofrece ventajas economicas y de produccion significativas. Como ejemplo, la produccion de arroz se restringe con frecuencia por la prevalencia de un tipo de maleza relacionada con el arroz que florece en arrozales comerciales. La maleza se denomina habitualmente "arroz rojo", y pertenece a la misma especie que el arroz cultivado (Oryza sativa L.). La similitud genetica del arroz rojo y del arroz comercial ha hecho que el control herbicida del arroz rojo sea diffcil. Los herbicidas Ordram™ (molinato: hexahidro- 1-H-azepin-1-carbotioato de S-etilo) y Bolero™ (tiobencarb: dietilcarbamotioato de S-[(4-clorofenil)metilo]) ofrecen una supresion parcial del arroz rojo, pero actualmente no se utiliza ningun herbicida que controle realmente el arroz rojo en los arrozales comerciales debido a la sensibilidad simultanea de cultivares comerciales existentes de arroz a dichos herbicidas. La liberacion de lmeas de arroz comercial mutante que tienen resistencia a herbicidas que son eficaces en el arroz rojo aumentara en gran medida la capacidad de los productores de controlar las infestaciones de arroz rojo. El desarrollo de la resistencia a herbicidas en otros cultivos y en otras plantas tendra beneficios similares.
Los productores de arroz en el sur de Estados Unidos normalmente rotan los cultivos de arroz con soja para ayudar a controlar las infestaciones de arroz rojo. Aunque esta rotacion por lo general no es economicamente deseable, es a menudo necesaria porque actualmente no hay ningun herbicida disponible para controlar las infestaciones de arroz rojo de forma selectiva en cultivos de arroz comercial. Durante la rotacion de la soja, el productor tiene un amplio intervalo de herbicidas disponibles que pueden utilizarse en el arroz rojo, de modo que el arroz puede crecer de nuevo al ano siguiente. Los productores de arroz de Estados Unidos pueden perder 200 $-300 $ por acre por ano al cultivar soja en lugar de arroz, una perdida potencial anual que afecta aproximadamente a 2,5 millones de acres. Las perdidas adicionales en Estados Unidos se estiman en 50 millones de $ por ano como resultado del bajo precio pagado por las fabricas para el transporte del grano contaminado con arroz rojo. Se estima que solo las perdidas economicas totales debidas al arroz rojo en el sur de Estados Unidos son de 500 a 750 millones de $ al ano. Las perdidas economicas por arroz rojo pueden ser incluso mayores en otros pafses productores de arroz.
Los productores de arroz utilizan normalmente herbicidas de propanil (nombre comercial Stam™) o molinato (nombre comercial Ordram™) para controlar las malas hierbas en la produccion de arroz. El propanil no posee actividad residual. El molinato es toxico para los peces. Ninguno de estos herbicidas controla el arroz rojo. Imazetapir (acido (±)-2-[4,5-dihidro-4-metil-4-(1-metiIetil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-5-etil-3-piridincarboxflico) ofrece una alternativa medioambientalmente aceptable a molinato, posee la actividad de control de malezas residual que no posee el propanil, y es un herbicida muy eficaz en el arroz rojo. Imazetapir tambien ofrece un control excelente de otras malezas importantes en la produccion de arroz, incluyendo arrocillo. El arrocillo es una maleza principal en la produccion de arroz, y actualmente se controla con propanil o molinato. No obstante, el arrocillo ha desarrollado resistencia a propanil en algunas regiones.
El mercado potencial total para las variedades de arroz que son resistentes a un herbicida que puede controlar el arroz rojo es de aproximadamente 5,3 millones de acres en Estados Unidos, y el mercado potencial fuera de los Estados Unidos es mucho mayor. La produccion mundial de arroz ocupa aproximadamente 400 millones de acres. El arroz rojo y otras malezas son grandes plagas en la produccion de arroz en Estados Unidos, Brasil, Australia, Espana, Italia, Corea del Norte, Corea del Sur, Filipinas, Vietnam, China, Taiwan, Brasil, Argentina, Colombia, India, Pakistan, Bangladesh, Japon, Ecuador, Mexico, Cuba, Malasia, Tailandia, Indonesia, Sri Lanka, Venezuela, Birmania, Nigeria, Uruguay, Peru, Panama, Republica Dominicana, Guatemala, Nicaragua, y en otras areas productoras de arroz.
Un numero de herbicidas se orientan selectivamente a la acetohidroxiacido sintasa (AHAS), una enzima conocida tambien como acetolactato sintasa (ALS), y designada igualmente como EC 4.1.3.18. Esta enzima cataliza la primera etapa en la smtesis de los aminoacidos leucina, valina, e isoleucina. La inhibicion de la enzima AHAS es normalmente fatal para las plantas. Los herbicidas que inhiben la enzima acetohidroxiacido sintasa ofrecenan numerosas ventajas sobre los herbicidas disponibles actualmente si se pudieran utilizar en la produccion de arroz comercial, y en la produccion de otros cultivos, en circunstancias en las que de lo contrario no podfan utilizarse. Las ventajas potenciales incluyen una actividad residual prolongada contra las malezas, un control eficaz de las malezas mas importantes en la produccion de arroz, incluyendo el arroz rojo, y una aceptabilidad en materia ambiental relativa. Incluso en regiones en las que el arroz rojo no es actualmente un problema, la disponibilidad de arroz resistente a herbicidas puede tener una gran influencia en las practicas de produccion de arroz al proporcionar al
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granjero un nuevo arsenal de herbicidas adecuados para su uso en los arrozales.
La demanda potencial total de la resistencia a herbicidas que actuan sobre AHAS en plantas distintas de arroz es diffcil de estimar, pero podna de hecho ser muy grande.
La patente de Estados Unidos n.° 4.761.373 describe el desarrollo de plantas de mafz mutantes resistentes a herbicidas por la exposicion de cultivos tisulares al herbicida. Se dijo que las plantas de mafz mutantes teman una enzima alterada, concretamente acetohidroxiacido sintasa, que confena resistencia a ciertos herbicidas de imidazolinona y sulfonamida. Veanse tambien las patentes de Estados Unidos n.° 5.304.732, 5.331.107, 5.718.079, 6.211.438, 6.211.439, y 6.222.100; y la solicitud de patente Europea 0 154 204 A2.
Lee et al., "The Molecular Basis of Sulfonylurea Herbicide Resistance in Tobacco", The EMBO J., vol. 7, n.° 5, pags. 1241-1248 (1988), describen el aislamiento y la caracterizacion de genes mutantes espedficos de formas resistentes a herbicidas de acetolactato sintasa a partir de Nicotiana tabacum, y la reintroduccion de esos genes en lmeas sensibles del tabaco.
Saxena et al., "Herbicide Resistance in Datura innoxia", Plant Physiol., vol. 86, pags. 863-867 (1988) describen varias lmeas de Datura innoxia resistentes a herbicidas de sulfonilurea, algunas de las cuales se descubrio que tambien posefan resistencia cruzada a herbicidas de imidazolinona.
Mazur et al., "Isolation and Characterization of Plant Genes Coding for Acetolactate Synthase, the Target Enzyme for Two Classes of Herbicides", Plant Physiol. vol. 85, pags. 1110-1117 (1987), discuten las investigaciones sobre el grado de homologfa entre acetolactato sintasas de diferentes especies.
La patente de Estados Unidos n.° 5.767.366 divulga plantas transformadas con resistencia a imidazolinona modificada por ingeniena genetica, conferida por medio de un gen clonado de una planta, tal como una Arabidopsis thaliana mutada. Vease tambien un artmulo relacionado, Sathasivan et al., "Nucleotide Sequence of a Mutant Acetolactate Synthase Gene from an Imidazoline-resistant Arabidopsis thaliana var. Columbia", Nucleic Acids Research vol. 18, n.° 8, pag. 2188 (1990).
Ejemplos de resistencia a herbicidas que inhiben AHAS en plantas distintas de arroz se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 5.013.659; K. Newhouse et al., "Mutations in corn (Zea mays L.) Conferring Resistance to Imidazolinone Herbicides", Theor. Appl. Genet., vol. 83, pags. 65-70 (1991); K. Sathasivan et al., "Molecular Basis of Imidazolinone Herbicide Resistance in Arabidopsis thaliana var Columbia", Plant Physiol. vol. 97, pags. 1044-1050 (1991); B. Miki et al., "Transformation of Brassica napus canola cultivars with Arabidopsis thaliana Acetohydroxyacid Synthase Genes and Analysis of Herbicide Resistance", Theor. Appl. Genet., vol. 80, pags. 449-458 (1990); P. Wiersma et al., "Isolation, Expression and Phylogenetic Inheritance of an Acetolactate Synthase Gene from Brassica napus", Mol. Gen. Genet., vol. 219, pags. 413-420 (1989); J. Odell et al., "Comparison of Increased Expression of Wild-Type and Herbicide-Resistant Acetolactate Synthase Genes in Transgenic Plants, and Indication of Postranscripctional Limitation on Enzyme Activity', Plant Physiol., vol. 94, pags. 1647-1654 (1990); solicitud de patente internacional publicada WO 92/08794; patente de Estados Unidos n.° 5.859.348; solicitud de patente internacional publicada WO 98/02527; solicitud de patente europea publicada EP 0 965 265 A2, y solicitud de patente internacional publicada WO 90/14000.
Las patentes de Estados Unidos n.° 5.853.973 y 5.928.937 divulgan el modelado basado en la estructura de AHAS, los puntos de enlace presuntivos de la enzima para herbicidas que actuan sobre AHAS, y ciertas mutaciones de AHAs concebidas para conferir resistencia a herbicidas. Estas patentes divulgan asimismo secuencias de aminoacidos para las enzimas e isozimas AHAS de varias plantas, incluyendo la de Zea mays. Vease tambien la solicitud de patente internacional publicada WO 96/33270.
S. Sebastian et al., "Soybean Mutants with Increased Tolerance for Sulfonylurea Herbicides", Crop. Sci., vol. 27, pags. 948-952 (1987) divulgan mutantes de soja resistentes a herbicidas de sulfonilurea. Vease tambien la patente de Estados Unidos n.° 5.084.082.
K. Shimamoto et al., "Fertile Transgenic Rice Plants Regenerated from Transformed Protoplasts", Nature, vol. 338, pags. 274-276 (1989) divulgan un protocolo de transformacion genetica en el que se utiliza electroporacion de protoplastos para transformar un gen que codifica p-glucuronidasa en arroz.
T. Terakawa et al., "Rice Mutant Resistant to the Herbicide Bensulfuron Methyl (BSM) by in vitro Selection", Japan. J. Breed., vol. 42, pags. 267-275 (1992) divulgan un mutante de arroz resistente a un herbicida de sulfonilurea, derivado por presion selectiva en un cultivo tisular de callo. La resistencia se atribuyo a una enzima AHAS mutante.
Lo siguiente son publicaciones del inventor (o el inventor y otros autores), relativas a la investigacion de variedades de arroz resistentes a herbicidas. Estas publicaciones son T. Croughan et al., "Rice and Wheat Improvement through Biotechnology', 84th Annual Research Report, Rice Research Station, 1992, pags.100-103 (1993); T. Croughan et al., "Rice and Wheat Improvement through Biotechnology", 85th Annual Research Report, Rice Research Station,
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1993, pags. 116-156 (1994); T. Croughan, "Application of Tissue Culture Techniques to the Development of Herbicide Resistant Rice", Louisiana Agriculture, vol. 37, n.° 3, pags. 25-26 (1994); T. Croughan et al., "Rice Improvement through Biotechnology', 86th Annual Research Report, Rice Research Station, 1994, pags. 461-482 (1995); T. Croughan et al., "Assessment of Imidazolinone-Resistant Rice", 87th Annual Research Report, Rice Research Station, 1994, pags. 491-525 (septiembre de 1996); T. Croughan et al., "IMI-Rice Evaluations", 88th Annual Research Report, Rice Research Station, 1996, pags. 603-629 (septiembre de 1997); T. Croughan et al., "Rice Biotechnology Research", 89th Annual Research Report, Rice Research Station, 1997, pag. 464 (septiembre de 1998); T. Croughan et al., "Imidazolinone-Resistant Rice", 90th Annual Research Report, Rice Research Station, 1998, pag. 511 (diciembre de 1999); T. Croughan et al., "Rice and Wheat Improvement through Biotechnology', USDA CRIS Report numero de acceso. 0150120 (durante el ano fiscal 1994 - fecha de publicacion actual desconocida); T. Croughan, "Improvement of Lysine Content and Herbicide Resistance in Rice through Biotechnology', USDA CRIS Report numero de acceso 0168634 (durante el ano fiscal 1997 - fecha de publicacion actual desconocida); T. Croughan, "Improvement of Lysine Content and Herbicide Resistance in Rice through Biotechnology', USDA CRIS Report numero de acceso 0168634 (durante el ano fiscal 1999 - fecha de publicacion actual desconocida); T. Croughan, "Improvement of Lysine Content and Herbicide Resistance in Rice through Biotechnology', USDA CRIS Report numero de acceso 0168634 (durante el ano fiscal 2000 - fecha de publicacion actual desconocida); T. Croughan, "Herbicide Resistant Rice", Proc. 25th Rice Tech. Work. Groups, pag. 44 (1994); T. Croughan et al., "Applications of Biotechnology to Rice Improvement', Proc. 25th Rice Tech. Work. Groups, pags. 62-63 (1994); T. Croughan, "Production of Rice Resistant to AHAS-Inhibiting Herbicides", Congress on Cell and Tissue Culture, Tissue Culture Association, In Vitro, vol. 30A, pag. 60, Abstract P-1009 (4-7 de junio de 1994). (Tenga en cuenta que los Informes de Investigacion Anuales de la Estacion de Investigacion de Arroz se publican en el ano posterior al ano natural en el cual se informan las actividades. Por ejemplo, the 84th Annual Research Report, Rice Research Station, 1992, resume una investigacion realizada en 1992, y publicada en 1993). Los informes en the 87th and 88th Annual Research Report, Rice Research Station (publicados en septiembre de 1996 y septiembre de 1997, respectivamente) mencionan la lmea de cultivo 93AS3510 en las tablas que presentan los datos sobre ciertos ensayos de resistencia a herbicidas. Estos informes no proporcionan informacion alguna sobre como se ha desarrollado la lmea de cultivo. La lmea de cultivo no estaba disponible publicamente en los momentos en los que se publicaron estos informes. La lmea de cultivo 93AS3510 es la misma que la del arroz CACT 97523 que se describe con mayor detalle en la solicitud de patente internacional WO 97/41218 (1997) publicada mas tarde, en las patentes de Estados Unidos n.° 5.736.629, 5.773.704, y 5.952.553, y en la solicitud de patente de Estados Unidos numero de serie 09/351.889, presentada el 13 de julio 1999 del inventor de la presente.
Veanse tambien E. Webster et al., "Weed Control Systems for Imi-Rice", pag. 33 en Program of the 27th Rice Technical Working Group Meeting (marzo de 1998); L. Hipple et al., "AHAS Characterization of Imidazolinone Resistant Rice", pags. 45-46 en Program of the 27th Rice Technical Working Group Meeting (marzo de 1998); W. Rice et al., "Delayed Flood for Rice Water Weevil Control using Herbicide Resistant Germplasm", pag. 61 en Program of the 27th Rice Technical Working Group Meeting (marzo de 1998); E. Webster et al., "Weed Control Systems for Imidazolinone-Rice", pag. 215 en Proceedings of the 27th Rice Technical Working Group Meeting (1999); L. Hipple et al., "AHAS Characterization of Imidazolinone Resistant Rice", pags. 68-69 en Proceedings of the 27th Rice Technical Working Group Meeting (1999); W. Rice et al., "Delayed Flood for Rice Water Weevil Control using Herbicide Resistant Germplasm", pag. 134 en Proceedings of the 27th Rice Technical Working Group Meeting (1999); y W. Rice et al., "Delayed flood for management of rice water weevil (Coleopterae: Curculionidae)", Environmental Entomology, vol. 28, n.° 6, pags.1130-1135 (diciembre de 1999).
La patente de Estados Unidos n.° 5.545.822 del presente inventor divulga una lmea de plantas de arroz que tiene una resistencia metabolicamente basada en herbicidas que interfieren con la enzima vegetal acetohidroxiacido sintasa, es decir, la resistencia a herbicidas de estas plantas de arroz no se debfa a una enzima AHAS resistente. (Vease la solicitud de patente internacional publicada WO 97/41218, paginas 6-9). Vease tambien la patente de Estados Unidos n.° 5.773.703 del presente inventor.
La solicitud de patente internacional publicada WO 97/41218 del presente inventor divulga una lmea de plantas de arroz que tiene una enzima AHAS mutante que es resistente a herbicidas que interfieren con la enzima vegetal acetohidroxiacido sintasa de tipo natural. Esta lmea de plantas de arroz se desarrollo exponiendo semillas de arroz al mutageno ester etflico del acido metanosulfonico (EMS), e identificando de forma sistematica millones de progenies para la resistencia a herbicidas. Veanse tambien las patentes de Estados Unidos n.° 5.736.629, 5.773.704, y 5.952.553 del presente inventor, y la solicitud de patente de Estados Unidos numero de serie 09/351.889, presentada el 13 de julio de 1999, fecha de presentacion de CPA, 15 de mayo de 2000.
La solicitud de patente internacional publicada WO 00/27182 del presente inventor divulga lmeas adicionales de plantas de arroz que tienen enzimas AHAS mutantes que son resistentes a herbicidas que interfieren con la enzima vegetal acetohidroxiacido sintasa de tipo natural. Estas lmeas de plantas de arroz se desarrollaron exponiendo semillas de arroz a EMS, e identificando de forma sistematica millones de progenies para la resistencia a herbicidas.
La patente de Estados Unidos n.° 4.443.971 divulga un metodo para preparar plantas tolerantes a herbicidas mediante cultivo tisular en presencia de herbicida. La patente de Estados Unidos n.° 4.774.381 divulga plantas de tabaco resistentes a un herbicida de sulfonilurea (sulfonamida) preparadas de dicha manera.
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La patente de Estados Unidos n.° 5.773.702 divulga remolachas azucareras con una enzima AHAS mutante resistente, derivada de cultivos celulares cultivados en presencia de herbicida. Vease tambien la solicitud de patente internacional publicada WO 98/02526.
La solicitud de patente internacional publicada WO 00/26390 divulga la clonacion y la secuenciacion de la protema de la subunidad pequena de AHAS de Arabidopsis, y un vector de expresion para transformar plantas con esta subunidad pequena de AHAS para impartir tolerancia al herbicida.
La patente de Estados Unidos n.° 5.633.437 divulga una enzima AHAS resistente a herbicidas y un gen aislado de berberechos.
La patente de Estados Unidos n.° 5.767.361 divulga una enzima AHAS resistente mutante de mafz. Las definiciones de la patente n.° 5.767.361 se incorporan en la presente divulgacion por referencia, en la medida en que estas definiciones no se contradigan con la presente divulgacion, al igual que las descripciones de esta patente de ciertas tecnicas de transformacion genetica de plantas. Vease tambien la patente de Estados Unidos n.° 5.731.180 y la solicitud de patente Europea 0 525 384 a2.
La patente de Estados Unidos n.° 5.605.011; la solicitud de patente Europea 0 257 993 A2; y la solicitud de patente Europea 0 730 030 A1 divulgan enzimas acetolactato sintasa resistentes derivadas de cultivo de callo de celulas de tabaco en presencia de herbicida, a partir de mutaciones espontaneas del gen de ALS en levadura; las mutaciones inducidas por EMS en semillas de Arabidopsis; ciertas modificaciones de estas enzimas; y la transformacion de diversas plantas con genes que codifican las enzimas resistentes. Estas patentes divulgan diversas tecnicas para modificar los genes de AHAS para producir enzimas AHAS resistentes a herbicidas, y para transformar plantas con estos genes.
La patente de Estados Unidos Re 35.661 (una reexpedicion de la patente de Estados Unidos n.° 5.198.599) divulga plantas de lechuga con resistencia mejorada a herbicidas que orientan selectivamente la enzima acetolactato sintasa. La fuente inicial de resistencia a herbicidas era una infestacion de malezas de escarola en el campo del productor, una infestacion que no estaba controlada con los herbicidas de sulfonilurea comerciales.
T. Shimizu et al., "Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide sensitive wild type", numero de acceso BLAST AB049822 (abril de 2001), disponible en
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, divulgan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos inferida para ADNc de ALS de tipo natural de Oryza sativa var. Kinmaze. Estas dos secuencias se reproducen a continuacion como las SEQ ID NOS 2 y 3, respectivamente.
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, divulgan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos inferida para ADNc de ALS de tipo natural de Oryza sativa var. Kinmaze. Estas dos secuencias se reproducen a continuacion como las SEQ ID NOS 2 y 3, respectivamente.
T. Shimizu et al., "Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide resistant biotype", numero de acceso BLAST AB049823 (abril de 2001), disponible en
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, divulgan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos inferida para ADNc de ALS de Oryza sativa var. Kinmaze que se informo que era resistente a herbicidas, aunque la naturaleza de la resistencia a herbicidas no se especifica en la descripcion BLAST. Estas dos secuencias se reproducen a continuacion como las SEQ ID NOS 4 y 5, respectivamente.
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, divulgan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos inferida para ADNc de ALS de Oryza sativa var. Kinmaze que se informo que era resistente a herbicidas, aunque la naturaleza de la resistencia a herbicidas no se especifica en la descripcion BLAST. Estas dos secuencias se reproducen a continuacion como las SEQ ID NOS 4 y 5, respectivamente.
Posteriormente, se seleccionan los datos tomados de algunas de las referencias citadas anteriormente, respecto a la ubicacion de cierta imidazolinona o mutaciones de tolerancia a herbicidas de sulfonilurea en AHAS/ALS de varias especies. No se ha intentado reconciliar o alinear los diferentes sistemas de numeracion de nucleotidos o aminoacidos utilizados en las distintas referencias. En la descripcion de las sustituciones siguientes (asf como en el resto de la memoria descriptiva y las reivindicaciones), el nucleotido o el aminoacido de tipo natural siempre ocupa el primer lugar en el listado, seguido por el nucleotido o aminoacido mutante. Todas las sustituciones discutidas se refieren a la secuencia codificante de ADN de AHAS/ALS, o a la secuencia de aminoacidos de AHAS/ALS expresada o inferida.
Lee et al. (1988) informaron que habfa dos genes de ALS homologos en Nicotiana tabacum. El mutante C3 resistente a herbicidas de sulfonilurea en un gen de ALS tuvo un reemplazo Pro-Gln en el aminoacido 196; pese a que el mutante S4-Hra resistente a herbicidas de sulfonilurea en el otro gen de ALS tuvo dos cambios de aminoacidos: Pro-Ala en el aminoacido 196, y Trp-Leu en el aminoacido 573.
Sathasivan et al. (1990), Sathasivan et al. (1991), y en la patente de Estados Unidos n.° 5.767.366 informaron sobre una sustitucion de nucleotidos G-A en la posicion 1.958, correspondiente a una sustitucion de Ser-Asn en la posicion 653, en Arabidopsis thaliana resistente a un herbicida de imidazolinona.
Wiersma et al. (1989) informaron sobre la resistencia a herbicidas de sulfonilurea en plantas de tabaco que se habfan transformado con un gen de ALS de Brassica napus mutante, en el que el codon 173 habfa sido alterado por mutagenesis dirigida al sitio para reemplazar Pro con Ser.
La solicitud de patente Europea 0 257 993 A2 informo sobre varias mutaciones espontaneas en el gen de ALS de levadura (Saccharomyces cerevisiae), lo que dio lugar a la resistencia a herbicidas de sulfonilurea: en la posicion del
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aminoacido 121, una sustitucion de Gly de tipo natural con Ser; en la posicion del aminoacido 122, una sustitucion de Ala de tipo natural con Pro, Asp, Val, o Thr; en la posicion 197, una sustitucion de Pro de tipo natural con Ser o Arg; en la posicion 205, una sustitucion de Ala de tipo natural con Asp o Thr; en la posicion 256, una sustitucion de Lys de tipo natural con Glu, Thr, o Asn; en la posicion 359, una sustitucion de Met de tipo natural con Val; en la posicion 384, una sustitucion de Asp de tipo natural con Glu, Val, o Asn; en la posicion 588, una sustitucion de Val de tipo natural con Ala; en la posicion 591, una sustitucion de Trp de tipo natural con Arg, Cys, Gly, Leu, Ser, o Ala; en la posicion 595, una sustitucion de Phe de tipo natural con Leu. La misma solicitud de patente informo sobre varias mutaciones dirigidas al sitio del gen de ALS de levadura en algunas de las mismas posiciones para producir tambien resistencia a herbicidas de sulfonilurea: en la posicion del aminoacido 122, una sustitucion de Ala de tipo natural con Ser, Val, Thr, Pro, Asn, Ile, His, Arg, Leu, Tyr, Cys, Phe, Glu, Met, Lys, Gln, o Trp; en la posicion 205, una sustitucion de Ala de tipo natural con Arg, Cys, Glu, o Trp; en la posicion 256, una sustitucion de Lys de tipo natural con Asp, Gly, Leu, Pro, o Trp; en la posicion 359, una sustitucion de Met de tipo natural con Pro o Glu; en la posicion 384, una sustitucion de Asp de tipo natural con Pro, Trp, Ser, Gly, Cys, o Lys; en la posicion 591, una sustitucion de Trp de tipo natural con Asp, Glu, Phe, His, Tyr, Ile, Val, Lys, Arg, Met, Asn, Gln, o Thr. Vease tambien la patente de Estados Unidos n.° 5.605.011, que tambien describe los datos experimentales de las siguientes mutaciones dirigidas al sitio: en el aminoacido 121, una sustitucion de Gly de tipo natural con Asn o Ala; en el aminoacido 197, una sustitucion de Pro de tipo natural con Gln, Glu, Ala, Gly, Trp, Tyr, Cys, o Val; en el aminoacido 205, una sustitucion de Ala de tipo natural con Tyr, Val, o Asn; en el aminoacido 359, una sustitucion de Met de tipo natural con Gln, Lys, Tyr, o Cys; en la posicion 583, una sustitucion de Val de tipo natural con Ser, Asn, Trp, o Cys; y en la posicion 595, una sustitucion de Phe de tipo natural con Gly, Asn, Arg, Cys, Pro, Ser, o Trp. Otras sustituciones de aminoacidos en las mismas posiciones tambien se describen profeticamente, sin datos experimentales. Vease tambien la patente de Estados Unidos n.° 5.013.659.
El documento WO 98/02527 informo sobre la resistencia a sulfonilurea y triazolopirimidina en una lmea de remolachas azucareras procedentes de una sustitucion C-T en el nucleotido 562, que corresponde a una sustitucion de Pro-Ser en el aminoacido 188. Esta misma referencia tambien informo sobre la resistencia a sulfonilurea, imidazolinona, y triazolopirimidina en una segunda lmea de remolachas azucareras procedente de dos mutaciones: la misma mutacion descrita en la primera lmea (de la cual se ha derivado la segunda lmea), se acoplo con una sustitucion G-A en el nucleotido 337, que corresponde a una sustitucion de Ala-Thr en el aminoacido 113. Veanse tambien el documento WO 98/02526, las patentes de Estados Unidos n.° 5.859.348 y 5.773.702.
El documento WO 96/33270 describe una serie de mutaciones disenadas o predichas a partir de un metodo de modelado basado en una estructura, que se decfa que inducfa tolerancia a imidazolinona en los resultados experimentales de AHAS que confirmaron dicha tolerancia en AHAS de Arabidopsis mutada, in vitro o en las plantas de tabaco transformadas in vivo, proporcionada por las siguientes sustituciones: Met-Ile en la posicion del aminoacido 124, Met-His en la posicion 124, Arg-Glu en la posicion 199, y Arg-Ala en la posicion 199. Veanse tambien las patentes de Estados Unidos n.° 5.928.937 y 5.853.973.
El documento WO 92/08794 informo sobre la resistencia a imidazolinona en dos lmeas de mafz. Una tema una sustitucion G-A para el nucleotido en la posicion 171, lo que origina una sustitucion de Ala-Thr en la posicion del aminoacido correspondiente. La otra tema una substitucion G-A en la posicion 1.888, lo que origina una sustitucion de Ser-Asn en la posicion del aminoacido correspondiente.
La patente de Estados Unidos n.° 5.731.180 informo sobre la resistencia a imidazolinona en mafz como consecuencia de una sustitucion G-A en la posicion del nucleotido 1.898, lo que origina una sustitucion de Ser-Asn en la posicion del aminoacido 621. Veanse tambien la patente de Estados Unidos n.° 5.767.361 y la solicitud de patente Europea 0 525 384.
La patente de Estados Unidos n.° 5.633.437 informo sobre la resistencia a imidazolinona en berberechos, caracterizada por cinco diferencias entre biotipos de enzimas ALS resistentes y biotipos sensibles: Lys-Glu en la posicion del aminoacido 63, Phe-Leu en la posicion 258, Gln-His en la posicion 269, Asn-Ser en la posicion 522, y Trp-Leu en la posicion 552. Se penso que los cambios en las posiciones 522 y 552 eran de particular importancia.
T. Shimizu et al., "Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide resistant biotype", numero de acceso BLAST AB049823 (abril de 2001) informaron sobre una secuencia de nucleotidos y una secuencia de aminoacidos inferida para un ALS de arroz que se decfa que era resistente a herbicidas, aunque la naturaleza de la resistencia a herbicidas no se especifica en la entrada de BLAST. En comparacion con una ALS de tipo natural contemporanea de la misma variedad de arroz (Kinmaze), la secuencia de aminoacidos inferida para la ALS resistente parecio mostrar dos diferencias: una sustitucion de Trp-Leu en la posicion 548, y una sustitucion de Ser-lle en la posicion 627.
Divulgacion de la invencion
Se han descubierto secuencias de nucleotidos que pueden utilizarse para impartir a las plantas verdes resistencia a herbicidas. Estas fuentes de nueva resistencia a herbicidas se aislaron originalmente en plantas de arroz mutante. Las secuencias de nucleotidos imparten resistencia de pre-emergencia, resistencia de post-emergencia, o ambas;
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resistencia de post-emergencia y resistencia de pre-emergencia a multiples herbicidas. Hasta la fecha, se ha demostrado resistencia contra al menos los siguientes herbicidas, asf como algunas mezclas de los mismos herbicidas: imazetapir, imazapic, imazapir, imazamox, sulfometuron-metil, imazaquin, clorimuron-etil, metsulfuron- metil, rimsulfuron, tifensulfuron-metil, piritiobac-sodio, tribenuron-metil, y nicosulfuron. Las plantas verdes transformadas con estas secuencias de nucleotidos son tambien resistentes a derivados de estos herbicidas, y al menos a algunos de los otros herbicidas que inhiben normalmente la acetohidroxiacido sintasa (AHAs), particularmente herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea. El grado de resistencia a herbicidas impartido por algunas de las nuevas secuencias de nucleotidos es comparable a (y posiblemente mayor que) los niveles mas altos de resistencia a herbicidas que inhiben AHAS que se han descubierto previamente en mutantes resistentes de cualquier especie de planta verde que es normalmente susceptible a esta clase de herbicidas.
Estas secuencias de nucleotidos pueden utilizarse para transformar las plantas verdes incluyendo, entre otros, arroz. Alternativamente, las mutaciones analogas pueden introducirse en plantas verdes por mutagenesis dirigida al sitio de la secuencia o las secuencias codificantes de AHAS nativa de la planta. Como ejemplo particular, la transformacion de las secuencias de nucleotidos en plantas de arroz, o la mutagenesis dirigida al sitio de las plantas de arroz, acelerara lo que tambien podna llevarse a cabo, aunque mas lentamente, por tecnicas de cultivo tradicionales, tales como cruce y retrocruzamiento. Puesto que ninguna secuencia codificante procedente de otra especie se introduce de este modo en el arroz, la mayona de los investigadores no consideran que dicha planta de arroz transformada sea "transgenica". (No se necesita aun un gen marcador para una transformacion de este tipo, ya que la seleccion puede realizarse directamente por el propio rasgo de resistencia a herbicidas). De manera similar, cuando se utiliza la mutagenesis dirigida al sitio para introducir una mutacion puntual analoga a la secuencia codificante de AHAS nativa de una planta verde distinta del arroz, la mayona de los investigadores no considerana la planta resultante como transgenica.
Ademas de controlar el arroz rojo, muchos herbicidas que inhiben AHAS tambien controlan eficazmente otras malezas que se encuentran habitualmente en los campos en los que se cultivan arroz y otros cultivos. Varios de estos herbicidas poseen una actividad residual, de forma que un tratamiento controla tanto las malezas existentes como las malezas que germinan despues - una ventaja significativa en la produccion.
Ningun herbicida actualmente marcado para su uso en el arroz posee una actividad residual contra un amplio espectro de malezas, incluyendo arroz rojo. Con una actividad residual eficaz contra el arroz rojo y otras malezas, los productores de arroz tienen ahora un sistema de control de malezas muy superior a los actualmente utilizados. Un papel del agua en la produccion de arroz reside en el control de malezas - una capa de agua estancada en el arrozal inhibe el crecimiento de malezas. Con un herbicida que tenga propiedades residuales de control de malezas, los productores tendran mucha mas flexibilidad en la gestion del agua. Ahora la inundacion de los campos puede retrasarse, lo que a su vez ayudara a controlar al gorgojo acuatico del arroz, la principal plaga de insectos del arroz. Alternativamente, o tal vez en conjunto, los costes de bombeo podnan reducirse al retrasar la inundacion hasta que lloviera lo suficiente como para inundar un campo sin ningun coste para el productor.
La resistencia a herbicidas de cada una de las nuevas secuencias de nucleotidos es atribuible a la mutacion de la enzima AHAS de arroz expresada, la produccion de enzimas que expresan resistencia directa a niveles de herbicida que inhiben normalmente las enzima AHAS de tipo natural. El hecho de que la resistencia se deba a enzimas AHAS mutantes (en lugar de otra ruta, tal como numero de copia genica, mejor actividad promotora, degradacion metabolica, etc.) se confirma por ensayos in vitro.
Las siguientes mutaciones se han observado en una o mas de las secuencias codificantes de AHAS de las diversas lmeas de arroz resistentes a herbicidas: Algunas de las lmeas resistentes a herbicidas tienen una mutacion de serina a asparagina en el codon correspondiente al aminoacido en la ubicacion 627. Tambien se describe una lmea resistente a herbicidas que se cree que tiene una mutacion de serina a lisina en el codon correspondiente al aminoacido en la ubicacion 627, acoplado con una delecion que causa un desplazamiento del marco de lectura, que provoca un codon de parada poco despues.
Algunas de las secuencias de aminoacidos de AHAS de arroz mutante descritas en el presente documento muestran una mutacion de serina a asparagina en el aminoacido 627, una ubicacion proxima al extremo carboxi-terminal de la protema de AHAS que es analoga a la ubicacion de las mutaciones de serina a asparagina que se han descrito previamente en AHAS resistente a herbicidas de imidazolinona a partir de Arabidopsis y plantas de mafz (vease la discusion anterior). No obstante, las nuevas secuencias muestran propiedades sorprendentes que no podnan haber sido predichas del trabajo anterior. El grado de resistencia a herbicidas impartido por algunas de las nuevas secuencias de nucleotidos es comparable a (y posiblemente mayor que) los niveles mas altos de resistencia a herbicidas que inhiben AHAS que se han hallado previamente en mutantes resistentes de cualquier especie de planta verde que es normalmente susceptible a esta clase de herbicidas. La razon subyacente es actualmente desconocida. Sin desear quedar ligado a esta teona, es posible que la molecula de AHAS de arroz proporcione un entorno particularmente favorable para la mutacion de Ser-Asn. En otras palabras, hipoteticamente, en comparacion con otras plantas en las que se ha descrito previamente una mutacion de AHAS de Ser-Asn, existe una sinergia entre otras porciones de la molecula de AHAS de arroz y el sitio de la mutacion, lo que se traduce en algunos niveles muy altos de resistencia a herbicidas. Estos niveles muy altos de resistencia a herbicidas hacen que las nuevas
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secuencias de AHAS de arroz mutante sean mas atractivas como candidatos para la transformacion de otras plantas para la resistencia a herbicidas.
A partir de los datos descritos en el presente documento, as^ como los datos descritos en algunas de las referencias previamente citadas, parece que las mutaciones en sitios homologos a la serina 627 en la molecula de AHAS de arroz pueden provocar la resistencia a herbicidas que inhiben AHAS en plantas verdes. Sin desear quedar ligado a esta teona, se plantea la hipotesis de que una sustitucion del amino Ser-Asn en esta ubicacion es particularmente favorable para un fenotipo resistente a herbicidas. Igualmente se describen en el presente documento los resultados para la lmea CMC31 que muestra en su lugar una sustitucion de Ser-Lys en esta ubicacion, seguido por una mutacion por desplazamiento del marco de lectura; y se observa que las presentaciones BLAST por Shimizu (abril de 2001) describieron una resistencia a herbicidas (de naturaleza actual desconocida) despues de una sustitucion de Ser-Ile en la posicion 627 y una sustitucion de Trp-Leu en la posicion 548.
Debido a su similitud qmmica con Asn, su similitud esterica con Asn, o ambas, se espera tambien que las siguientes sustituciones de aminoacidos en sitios homologos a la serina 627 en la molecula de AHAS de arroz tambien provoquen la resistencia a herbicidas que inhiben AHAS: Gln, Asp, y Glu. Estas mutaciones no podfan, sin embargo, proceder de sustituciones de un unico nucleotido en la secuencia codificante, y, por lo tanto, considerablemente, son menos propensas de producirse a partir de los esfuerzos de cultivo por mutacion no dirigida. No obstante, estas mutaciones podnan inducirse mediante tecnicas de mutagenesis dirigida al sitio conocidas en la materia. Veanse, por ejemplo, R. Higuchi, "Recombinant PCR", pags. 177-183 en M. Innis et al. (Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); patente de Estados Unidos n.° 6.010.907; Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., vol. 82, pags. 488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol., vol. 154, pags. 367-382 (1987); patente de Estados Unidos n.° 4.873.192; Walker et al. (Eds.), Techniques in Molecular Biology (MacMillan, Nueva York, 1983); o los protocolos Genoplasty™ de ValiGen (Newtown, PA).
Por ende, ninguna de las mutaciones descritas en el presente documento puede incorporarse en el genoma del arroz o de cualquier otra planta verde mediante mutagenesis dirigida al sitio. Al hacerlo, puede, entre otras cosas, acelerar el proceso de introduccion de resistencia a herbicidas en un cultivar existente, eliminando el tiempo necesario para cruzar y retrocruzar por medio de tecnicas de cultivo tradicionales, y sin introducir un gen procedente de otra especie.
Del mismo modo, la sustitucion de Ser-Lys en la posicion 627, seguido por un desplazamiento del marco de lectura que podna ser en cambio una sustitucion de Ser-Arg o Ser-His, seguido por un desplazamiento del marco de lectura, ya que Lys, Arg, y His son qmmicamente similares.
La invencion proporciona los acidos nucleicos de las reivindicaciones 1 y 4, el vector de transformacion de la reivindicacion 8, la construccion de acido nucleico de la reivindicacion 9, el metodo de conferir a la planta resistencia segun la reivindicacion 13, la planta de la reivindicacion 14, y el proceso de control de las malezas de la reivindicacion 17.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion proporciona plantas verdes transformadas con el acido nucleico de la invencion que codifica la molecula de AHAS de arroz, en la que la serina en la posicion del aminoacido 627 se ha reemplazado con asparagina.
Asimismo se describen plantas verdes con una secuencia de oligonucleotidos que codifica una molecula de AHAS, en la que el homologo de serina en la posicion 627 en la molecula de AHAS de arroz se ha reemplazado con glutamina, acido glutamico o acido aspartico. La molecula de AHAS puede ser de otra manera nativa a la misma planta en la que se expresa, o puede derivarse de otra planta. Un ejemplo es una planta verde que comprende una secuencia de oligonucleotidos que codifica una molecula de AHAS identica a la molecula de AHAs de arroz de tipo natural, a excepcion de que la serina de la posicion 627 en la molecula de AHAS de arroz se ha reemplazado con glutamina, acido glutamico, o acido aspartico. Si la molecula de AHAS mutante es de otro modo nativa a la planta en la que se expresa, a excepcion de la sustitucion en la posicion 627, entonces dicha planta no ha de considerarse un "organismo geneticamente modificado", en el sentido popular de un organismo que se ha transformado artificialmente con una secuencia codificante de oligonucleotidos derivada de una especie diferente. Por ejemplo, una planta de este tipo podna ser una planta de arroz que contiene una secuencia de oligonucleotidos que codifica una molecula de AHAS identica a la molecula de AHAS de arroz de tipo natural, a excepcion de que la serina de la posicion 627 en la molecula de AHAS de arroz se ha reemplazado con glutamina, acido glutamico, o acido aspartico.
Asimismo se describen plantas verdes con una secuencia de oligonucleotidos que codifica una molecula de AHAS en la que el homologo de serina de la posicion 627 en la molecula de AHAS de arroz se ha reemplazado con lisina, arginina, o histidina - preferentemente lisina - seguido por cualquier aminoacido que pueda codificarse entre la posicion 627 y el extremo carboxi-terminal como resultado de un desplazamiento del marco de lectura en la secuencia codificante de AHAS en la misma posicion 627 o posterior a la posicion 627. La molecula de AHAS puede ser de otra manera nativa a la misma planta en la que se expresa, o puede derivarse de otra planta. Un ejemplo es una planta verde que comprende una secuencia de oligonucleotidos que codifica una molecula de AHAS identica a la molecula de AHAS de arroz de tipo natural, a excepcion de que la serina de la posicion 627 en la molecula de
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AHAS de arroz se ha reemplazado con lisina, arginina, o histidina - preferentemente lisina - seguido por cualquier aminoacido que pueda codificarse entre la posicion 627 y el extremo carboxi-terminal como resultado de un desplazamiento del marco de lectura en la secuencia codificante de AHAS en la misma posicion 627 o posterior a la posicion 627. Si la molecula de AHAS mutante es de otro modo nativa a la planta en la que se expresa, a excepcion de las sustituciones en la posicion 627 y posteriores, entonces dicha planta no ha de considerarse un "organismo geneticamente modificado", en el sentido popular de que un organismo se ha transformado artificialmente con una secuencia codificante de oligonucleotidos derivada de una especie diferente. Por ejemplo, una planta de este tipo podna ser una planta de arroz que contiene una secuencia de oligonucleotidos que codifica una molecula de AHAs identica a la molecula de AHAS de arroz de tipo natural, a excepcion de que la serina de la posicion 627 en la molecula de AHAS de arroz se ha reemplazado con lisina, arginina, o histidina - preferentemente lisina - seguido por cualquier aminoacido que pueda codificarse entre la posicion 627 y el extremo carboxi-terminal como resultado de un desplazamiento del marco de lectura en la secuencia codificante de AHAS secuencia en la misma posicion 627 o posterior a la posicion 627.
Los procedimientos utilizados a continuacion para ensayar la actividad de las acetohidroxiacido sintasas se describieron basicamente en B. K. Singh et al., "Assay of Acetohydroxyacid Synthase", Analytical Biochemistry, vol. 171, pags. 173-179 (1988), salvo mencion expresa de lo contrario. En el primer parrafo de "Materials and Methods" de Singh, en lugar de celulas de cultivo de suspension de mafz, se utilizaran tejidos del brote de las plantas de semillero de arroz que crecen en invernaderos en la etapa de desarrollo de 3-4 hojas, o celulas de cultivo de suspension de arroz. Para los tejidos de brote, se extrajeron 40,0 gramos (peso fresco) de tejido de la misma forma para cada una de las lmeas de cultivo; para las celulas de suspension de Cypress, se utilizaron 16,0 gramos de celulas, recogidos ocho dfas despues del subcultivo. A sugerencia del primer autor, B. K. Singh (comunicacion personal), se elimino la etapa de desalacion mencionada al final de la primera columna del texto de Singh "Materials and Methods". El herbicida Pursuit™ (imazetapir) o el herbicida Arsenal™ (imazapir) se incluyo en la "mezcla de reaccion convencional" para el ensayo de AHAS en diversas concentraciones. La absorbancia colorimetrica se midio a 520 nm. Se realizan comprobaciones para la formacion directa de acetoma durante el ensayo enzimatico.
Un ensayo de AHAS alternativo que podna utilizarse (pero que no se utilizo en la recogida de los datos descritos en el presente documento) es el que se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 5.605.011, col. 53, lmea 61 a col. 54, lmea 37.
Modos para llevar a cabo la invencion
Se identificaron un total de 27 nuevas lmeas de arroz que expresaban resistencia a herbicidas que inhiben AHAS, despues las semillas de arroz se expusieron al mutageno ester etflico del acido metanosulfonico (EMS). Se desarrollaran e identificaran lmeas de arroz resistentes adicionales utilizando tecnicas similares de mutacion e identificacion sistematica. En la generacion de dichas mutaciones, pueden sustituirse otros mutagenos conocidos en la materia con EMS, por ejemplo, azida de sodio, W-metil-W-nitrosourea, W-etil-W-nitrosourea, nitrosoquanidina, hidroxilamina, hidrazina, radiacion ionizante (tal como rayos X, rayos gamma, o UV), o compuestos radiomimeticos, tales como bleomicinas, etoposido, y teniposido. (Las bleomicinas son, por ejemplo, antibioticos glicopeptfdicos aislados a partir de cepas de Streptomyces verticillus. Una bleomicina se vende con el nombre comercial Blenoxane® en Bristol Laboratories, Syracuse, NY). Las secuencias de nucleotidos de AHAS resistentes a partir de estas lmeas de arroz se clonaran y se utilizaran para transformar otras lmeas de arroz, y las lmeas de otras plantas verdes, para impartir caractensticas de resistencia a herbicidas.
Ejemplos 1-15 (ejemplos de referencia)
Se identificaron de forma sistematica aproximadamente 52 millones de semillas de arroz mutadas (M2). Las semillas mutadas se desarrollaron mojando un total de 340 libras de semilla (M1), de los cultivares de arroz "Cypress" o "Bengal", en una solucion acuosa al 0,175 % (en peso) de EMS. Se expusieron aproximadamente 170 lb de arroz a EMS durante 16 horas; se expusieron aproximadamente 85 lb durante 24 horas; y se expusieron aproximadamente 85 lb durante 35 horas. Se agruparon las semillas de los tres regfmenes de exposicion para los experimentos de identificacion sistematica descritos a continuacion.
Despues del tratamiento con EMS, las semillas M1 se aclararon a fondo con agua y se drenaron antes de ser plantadas por siembra a voleo en aguas poco profundas, aguas que se drenaron 24 horas despues. El campo se volvio a inundar tres dfas despues, y el campo se mantuvo en un estado de inundacion hasta que se dreno para la recoleccion. Las semillas M2 recolectadas se almacenaron durante el invierno, y en la primavera siguiente las plantas cultivadas a partir de las semillas M2 se identificaron de forma sistematica para la resistencia a herbicidas. Despues de sembrar mediante una sembradora a aproximadamente 52 millones de semillas M2, se aplico una aplicacion de pre-emergencia de imazetapir a una tasa de 0,125 lb de pa/A (libras de principio activo por acre) antes de la primera floracion. Se aplico un tratamiento de post-emergencia de imazetapir a 0,063 lb de pa/A cuando el arroz alcanzo la etapa de 3 hojas. Las quince plantas M2 que sobrevivieron a la aplicacion del herbicida se recogieron y transfirieron al invernadero.
La resistencia a herbicidas de la progenie de estas plantas (M3) se confirmo mediante una aplicacion de post-
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emergencia de 0,125 lb de pa/A de imazetapir en la etapa de 3 hojas en el invernadero. Las 15 plantas resistentes de un total de 52 millones de plantas M2 representan una tasa de exito de aproximadamente 1 mutante resistente a imidazolinona identificado entre 3,5 millones de semillas mutadas identificadas de forma sistematica.
La semilla de progenie M4 se recogio de las plantas M3 resistentes, y se utilizo en un ensayo de campo. El ensayo de campo se compoma de 8 conjuntos de replicados. Cada uno de los conjuntos contema 1O0 filas de cuatro pies de longitud. Cada uno de los conjuntos tema 74 filas de las lmeas resistentes M4. Cada conjunto tema multiples filas de cada una de las 15 lmeas resistentes, variando el numero de filas de cada una de las lmeas debido a los diferentes numeros de semillas que estaban disponibles en ese momento. Cada uno de los conjuntos de replicados tambien contema 16 filas de cultivar no resistente "Cypress" como control negativo, y 10 filas de las lmeas de arroz resistentes a herbicidas desarrolladas anteriormente como controles positivos. (Los controles positivos eran o CACT 97523 o un hforido de CACT 97523 y CACT 75295).
Se aplico un tratamiento de herbicida diferente en la post-emergencia a cada uno de estos ocho conjuntos de replicados cuando el arroz alcanzo la etapa de las 3 hojas. El conjunto de control se trato con 4 cuartos/acre de Arrosolo™. Arrosolo™ es un herbicida que se utiliza actualmente de forma comercial con variedades convencionales de arroz. Los 7 conjuntos restantes se trataron con herbicidas de imidazolinona de la siguiente forma: (1) imazetapir (nombre comercial Pursuit™ o Newpath™) a 0,125 lb de pa/A; (2) imazetapir a 0,188 lb de pa/A; (3) imazapic (nombre comercial Cadre™) a 0,063 lb de pa/A; (4) imazapic a 0,125 lb de pa/A; (5) imazapir (nombre comercial Arsenal™) a 0,05 lb de pa/A; (6) imazapir a 0,09 lb de pa/A; y (7) una mezcla de imazetapir al 75 % e imazapir al 25 % (nombre comercial Lightning™) a 0,052 lb de pa/A.
Tenga en cuenta que todas las tasas de aplicacion de herbicida ensayadas eran iguales o superiores a las tasas de aplicacion recomendadas para el uso de los mismos herbicidas en otros cultivos.
Los niveles de resistencia a herbicidas se determinaron tanto a las tres semanas despues de la pulverizacion como en la etapa de madurez. Ninguna fila resulto significativamente danada por el tratamiento de control con el herbicida convencional de arroz Arrosolo™. En cambio, cada uno de los siete tratamientos de imidazolinona provocaron un control del 100 % de las filas de arroz Cypress no resistente, sin que sobreviviese una sola planta entre cualquiera de las 112 filas tratadas. Cada una de las filas de progenie M4 resistente a herbicidas de cada uno de los conjuntos, y cada uno de los controles positivos resistentes a herbicidas de cada uno de los conjuntos, mostro lesiones insignificantes o no mostro ninguna lesion de los diversos tratamientos con imidazolinona. Las filas de progenie M4 resistente tratada con las imidazolinonas, y las filas de los controles positivos resistentes a herbicidas tratados con las imidazolinonas, no se distinguieron visualmente de las filas tratadas con Arrosolo™ con respecto a la altura, energfa, dfas de madurez, y falta de lesion visible en el herbicida.
Se depositaron por separado muestras de las semillas recolectadas de cada una de las quince lmeas de la progenie M4, es decir, muestras de la semilla M5 de cada una de las quince lmeas separadas; lmeas concebidas por el inventor como SSC01, SSC02, SSC03, SSC04, SSC05, SSC06, SSC07, SSC08, SSC09, SSC10, SSC11, SSC12, SSC13, SSC14, y SSC15; con la Coleccion Americana de Cultivo Tipo (CACT), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, el 5 de noviembre de 1998; y se asignaron los numeros de acceso de la CACT 203419, 203420, 203421, 203422, 203423, 203424, 203425, 203426, 203427, 203428, 203429, 203430, 203431, 203432, y 203433, respectivamente. Cada uno de estos depositos se realizo de conformidad con un contrato entre la CATC y el cesionario de la presente solicitud de patente, Junta de Supervisores del Estado de la Universidad de Luisiana y Colegio de Agricultura y Mecanica. Cada uno de los contratos con la CACT proporciona una disponibilidad permanente y no restringida de estas semillas o de la progenie de estas semillas al publico en la expedicion de la patente de Estados Unidos que describe e identifica el deposito o la publicacion o la inspeccion abierta al publico de cualquier solicitud de patente de Estados Unidos o extranjera, cualquiera que sea el orden de prioridad, y para la disponibilidad de estas semillas a uno determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas Comerciales de Estados Unidos (o por cualquier homologo del comisionado en cualquier oficina de patentes en cualquier otro pafs) que tiene derecho al mismo en decretos y regulaciones pertinentes. El cesionario de la presente solicitud ha acordado que en caso de que cualquiera de estas semillas en el deposito sean inviables o se perdieran o se destruyeran cuando se cultivasen en condiciones adecuadas, se reemplazanan de inmediato bajo notificacion con una muestra viable de las mismas semillas.
Ejemplos 16-27
Se identificaron de forma sistematica aproximadamente 60 millones adicionales de semillas de arroz mutadas (M2). Las semillas mutadas se desarrollaron mojando un total de 300 libras de semilla (M1) del cultivar de arroz "Cypress" en una solucion acuosa al 0,175 % (en peso) de mutageno EMS durante 23 horas.
Despues del tratamiento con EMS, las semillas M1 se aclararon a fondo con agua y se drenaron antes de plantarse por una siembra a voleo en aguas poco profundas, aguas que se drenaron 24 horas despues. El campo se volvio a inundar tres dfas despues, y el campo se mantuvo en un estado de inundacion hasta que se dreno para la recoleccion. Las semillas M2 recolectadas se almacenaron durante el invierno, y en la primavera siguiente las plantas cultivadas de las semillas M2 se identificaron de forma sistematica para la resistencia a herbicidas. Despues
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de la siembra a voleo y de la incorporacion en suelo poco profundo de aproximadamente 60 millones de semillas M2, se pulverizo una aplicacion de post-emergencia de imazapic (nombre comercial CadreTM) a 0,125 lb de pa/A en la mitad del campo, y se aplico una aplicacion de post-emergencia de imazapir (nombre comercial Arsenal™) a 0,10 lb de pa/A a la otra mitad del campo en la fase de tres hojas. Las veintitres plantas M2 que sobrevivieron a la aplicacion del herbicida se recogieron y se transfirieron al invernadero. El ultimo ensayo (descrito a continuacion) mostro que doce de estas plantas representaban nuevas lmeas resistentes a herbicidas; las otras plantas eran semillas "de malas hierbas" de la lmea CACT 97523 que permanecieron en el suelo desde la temporada anterior.
Las 12 plantas resistentes de un total de 60 millones de plantas M2 representan una tasa de exito de aproximadamente 1 mutante resistente a imidazolinona identificado entre 5 millones de semillas mutadas identificadas de forma sistematica.
La resistencia a herbicidas de la progenie de estas plantas (M3) se confirmo con las siguientes aplicaciones de herbicida en el invernadero: 0,125 lb de pa/A de imazetapir (nombre comercial Pursuit™) como aplicacion de pre- emergencia; 0,063 lb de pa/A de imazetapir como aplicacion de post-emergencia; 0,10 lb de pa/A de sulfonmeturon- metil (nombre comercial Oust™) como aplicacion de pre-emergencia; 0,05 lb de pa/A de sulfonmeturon-metil como aplicacion de post-emergencia; 0,10 lb de pa/A de nicosulfuron (nombre comercial Accent™) como aplicacion de pre-emergencia; y 0,05 lb de pa/A de nicotsulfuron como aplicacion de post-emergencia. Se plantaron dos semillas M3 de cada una de las veintitres lmeas resistentes a herbicidas en cada una de las cuatro parcelas de replicados para cada tratamiento. Se realizaron plantaciones equivalentes de lmeas de control con semillas de arroz Cypress y Bengal (no resistentes).
Se depositaron por separado muestras de las semillas recogidas de varias de estas lmeas de la progenie M4, concretamente, muestras de semillas M5 de cada una de las siete lmeas separadas concebidas por el inventor como PWC16, PWC23, CMC29, CMC31, WDC33, WDC37, y WDC38; con la Coleccion Americana de Cultivo Tipo (CACT), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, el 2 de noviembre de 1999; y se asignaron los numeros de acceso de la CACT PTA-904, PTA-905, PTA-902, PTA-903, PTA-906, PTA-907, y PTA-908, respectivamente. Cada uno de estos depositos se realizo de conformidad con un contrato entre la CATC y el cesionario de la presente solicitud de patente, Junta de Supervisores de Estado de la Universidad de Luisiana y Colegio de Agricultura y Mecanica. Cada uno de los contratos con la CACT proporciona una disponibilidad permanente y no restringida de estas semillas o de la progenie de estas semillas al publico en la expedicion de la patente de Estados Unidos que describe e identifica el deposito o la publicacion o la inspeccion abierta al publico de cualquier solicitud de patente de Estados Unidos o extranjera, cualquiera que sea el orden de prioridad, y para la disponibilidad de estas semillas a uno determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas Comerciales de Estados Unidos (o por cualquier homologo del comisionado en cualquier oficina de patentes en cualquier otro pafs) que tiene derecho al mismo en decretos y regulaciones pertinentes. El cesionario de la presente solicitud ha acordado que en caso de que cualquiera de estas semillas en el deposito sean inviables o se perdieran o se destruyeran cuando se cultivasen en condiciones adecuadas, se reemplazanan de inmediato bajo notificacion con una muestra viable de las mismas semillas.
Otras cinco lmeas, concebidas por el inventor como PWC17, PWC19, PWC21, PWC22, y CMC27, exhibieron niveles inferiores de resistencia a herbicidas. Estas lmeas parecen ser diferentes de las lmeas que actualmente se han depositado ante la CACT, y de la lmea anterior CACT 97523. Debido a sus niveles de resistencia inferiores, estas lmeas no se depositaron ante la CACT en la fecha de prioridad del 10 de mayo de 2000 de la presente solicitud. No obstante, estas lmeas pueden tener un posible valor como material de cultivo para cruzar con otras fuentes de resistencia a herbicidas, o entre sf, a fin de potenciar los niveles totales de resistencia. Si estas cinco lmeas implican mecanismos de resistencia diferentes, o diferentes isozimas AHAS en comparacion con las lmeas depositadas ante la CACT, entonces el cruce de una de estas lmeas con una de las lmeas depositadas ante la CACT podna producir un hfbrido con un nivel total potenciado de resistencia. No obstante, sus niveles de resistencia a herbicidas parecen que no producen ninguna de estas cinco lmeas, por sf solos, candidatos adecuados para el cultivo de nuevas lmeas de arroz resistentes a herbicidas.
Ejemplo 28 (ejemplo de referencia)
Se indujeron mutaciones en semillas de diez variedades de arroz por exposicion a rayos gamma o a EMS. Se sometieron lotes de diez libras de semillas de cada variedad a 25 k-rad de radiacion gamma de una fuente de cobalto 60 en el Centro de Ciencia Nuclear, Universidad del Estado de Luisiana, Baton Rouge, La., antes de la plantacion. Diez libras adicionales de semillas de cada variedad se dividieron en tres porciones iguales; y cada porcion se mojo durante 16 horas en EMS al 0,1 %, 0,5%, o 1 % inmediatamente antes de la plantacion. Varios cientos de libras de semillas se recolectaron de las plantas cultivadas de las semillas sometidas a estos tratamientos mutagenicos.
En la primavera siguiente la semilla recolectada se planto en franjas en un campo de plantacion ocupando un total de aproximadamente tres acres. En la etapa de 3-4 hojas del desarrollo de las plantas de semillero, se aplicaron los herbicidas para la identificacion sistematica de mutantes resistentes a herbicidas. La mitad de las plantas de semillero de cada variedad se pulverizaron con un tratamiento 2x de nicosulfuron, y la otra mitad se pulverizo con un
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tratamiento 2x de imazetapir, en ambos casos por una pulverizadora montada en el tractor. Se aplico nicosulfuron en una tasa de 0,063 lb de principio activo (pa) por acre, y se aplico imazetapir a 0,125 lb de pa por acre. Se anadio tensioactivo no ionico (0,25 %) a cada solucion de pulverizacion. Aproximadamente se pulverizaron 35 millones de plantas de semillero de arroz de esta manera. Aproximadamente cuatro semanas despues se identifico una unica planta superviviente. La planta superviviente se encontraba en una franja que se ha^a pulverizado con imazetapir, y se derivo de la variedad de arroz "parental" "AS3510", tratada por exposicion a EMS al 0,5%. No se produjeron smtomas evidentes de lesion del tratamiento con herbicidas en esta planta en el momento en que se descubrio, mientras que todas las otras plantas resultaron gravemente danadas o murieron. La planta se transfirio al invernadero para el aumento de semillas y un ensayo adicional.
Los ensayos posteriores en el invernadero y en el campo demostraron que la progenie de esta planta de arroz posefa resistencia a varios herbicidas que inhiben AHAS, incluyendo al menos los siguientes herbicidas: imazetapir, nicosulfuron, imazaquin, imazamet, imazapir, e imazamox. Los ensayos enzimaticos AHAS indicaron que esta lmea de arroz posefa una enzima AHAS mutante que era responsable de la resistencia a herbicidas que inhiben AHAS.
Se deposito una muestra de la semilla de esta lmea de arroz, concebida 93AS3510 o SPCW-1; ante la Coleccion Americana de Cultivo Tipo (CACT), direccion actual 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, el 25 de abril de 1996; y se asigno con el numero de acceso de la CACT 97523. Este deposito se realizo de conformidad con un contrato entre la CATC y el cesionario de la presente solicitud de patente, Junta de Supervisores del Estado de la Universidad de Luisiana y el Colegio de Agricultura y Mecanica. El contrato con la CACT proporciona que estas semillas o la progenie de estas semillas tengan actualmente una disponibilidad permanente y sin restriccion al publico. El cesionario de la presente solicitud ha acordado que en caso de que cualquiera de estas semillas en el deposito sean inviables o se perdieran o se destruyeran cuando se cultivasen en condiciones adecuadas, se reemplazanan de inmediato bajo notificacion con una muestra viable de las mismas semillas.
Ensayos en campos y ensayos en invernadero adicionales
Se llevaron a cabo ensayos en campos y ensayos en invernaderos adicionales para evaluar la tolerancia de las lmeas resistentes. Los ensayos en campos incluyeron tanto estudios de aplicacion de herbicida de pre-emergencia como de post-emergencia. En ambos estudios se incluyeron las mismas lmeas, a excepcion de que la lmea WDC37 se incluyo solo en el estudio de pre-emergencia, debido a la falta de cantidad suficiente de semillas en el momento del estudio.
Los herbicidas aplicados como aplicaciones de pre-emergencia eran imazaquin, imazetapir, e imazapic. Cada tratamiento se aplico a cada una de las dos parcelas de replicados. Cada parcela de replicados contema filas de tres pies de longitud de cada lmea resistente a herbicidas, junto con una lmea de control de arroz no resistente. Se dejaron sin pulverizar dos parcelas para que sirviesen como controles sin tratar. Todas las lmeas resistentes a herbicidas exhibieron poco o ningun dano de las aplicaciones de herbicida. En cambio, todas las filas de control de la variedad de arroz Cypress resistente a herbicidas, se destruyeron o resultaron gravemente danadas en todas las parcelas pulverizadas con tratamientos con herbicidas.
La aplicacion de post-emergencia se estudio en cincuenta parcelas de replicados de las mismas lmeas resistentes a herbicidas, a excepcion de que la lmea WDC37 no se incluyo en el estudio en campo de post-emergencia. Para el estudio en campo de post-emergencia, cada tratamiento con herbicida se aplico a cada una de las dos parcelas de replicados. Se dejaron sin pulverizar dos parcelas para que sirviesen como controles sin tratar. Los tratamientos con herbicidas estudiados de post-emergencia eran imazetapir (Pursuit™ o Newpath™), imazapic (Cadre™), imazamox (Raptor™), una mezcla 1:1 (en peso) de imazapic e imazapir, una mezcla 3:1 (en peso) de imazapic (Cadre™) e imazapir (Arsenal™), imazapir (Arsenal™), clorimuron-etil (Classic™), metsulfuron-metil (AllyT ), nicosulfuron (Accent™), rimsulfuron (Matrix™), una mezcla 2:1 (en peso) (Harmony Extra™) de tifensulfuron-metil y tribenuron- metil, y piritiobac-sodio (Staple™).
Los ensayos en invernaderos comprendieron dos estudios de replicados que utilizaban los mismos herbicidas y las tasas que se utilizaban en el ensayo en campos de post-emergencia. Los estudios en invernaderos evaluaron la resistencia a herbicidas de post-emergencia de unas pocas lmeas para las cuales la cantidad de semillas disponibles entonces no eran adecuadas para incluirse en los ensayos en campos. Las semillas de las lmeas resistentes se plantaron en macetas de turba de 2 pulgadas x 2 pulgadas, y despues se pulverizaron las plantas de semillero en la etapa de 3-4 hojas. Se incluyeron lmeas de control no resistentes para su comparacion. Al igual que en los ensayos en campos, los controles no resistentes se destruyeron o resultaron gravemente danados por los tratamientos con herbicidas.
Los resultados de estos estudios en campos e invernaderos se resumen en las Tablas 3 y 4.
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Resultados y discusion
Las selecciones previas de arroz resistente a imidazolinona por identificacion sistematica despues de la exposicion de las semillas a EMS produjeron menos lmeas de arroz resistentes. Por ejemplo, la identificacion sistematica de aproximadamente 35 millones de semillas M2 despues de la exposicion de las semillas M1 a EMS al 0,1 %, 0,5 %, o 1,0 % durante 16 horas produjo una unica planta mutante resistente a herbicidas (CACT 97523), para una relacion de exito de 1 mutante resistente entre 35 millones de semillas mutadas. En cambio, cada una de las dos series posteriores de identificaciones sistematicas tuvo una tasa significativamente superior de produccion exitosa de mutantes resistentes a herbicidas. Se cree, sin desear queda ligado a esta teona, que la eficacia mejorada se debio a la diferencia en las concentraciones mutagenicas y los tiempos de exposicion utilizados.
Los protocolos de mutacion mas eficaces descritos en el presente documento utilizaron una exposicion relativamente prolongada para una concentracion relativamente menor de mutageno que la que se habfa utilizado previamente. En los Ejemplos 1-15, el tiempo medio de exposicion al mutageno era de 22,75 horas, y la concentracion de EMS era de 0,175 %, Esto representa un tiempo medio de exposicion superior del 42 %, y una reduccion del 65 % de la concentracion mutagenica, en comparacion con el unico acontecimiento exitoso de la identificacion sistematica anterior de 35 millones de semillas (Ejemplo 28). El resultado era un aumento de 10 veces la tasa de recuperacion mutante resistente (una entre 3,5 millones de semillas frente a una entre 35 millones de semillas).
Los Ejemplos 16-27 utilizaron condiciones similares a las de los Ejemplos 1-15, y tambien eran mas eficaces en la produccion de mutantes resistentes. Se utilizo la misma concentracion mutagenica de EMS (0,175%), y solo un tiempo de exposicion ligeramente diferente (23 horas frente a una media de 22,75 horas). En este ensayo la tasa de produccion de mutante resistente a herbicidas era de 1 planta entre 5 millones de semillas. Estos resultados indican que las exposiciones mas prolongadas a concentraciones mutagenicas inferiores parecen producir generalmente tasas superiores de mutantes exitosos resistentes a herbicidas.
Cada uno de los mutantes resistentes de estas dos identificaciones sistematicas exhibio resistencia a uno o mas herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea. Un resumen de las aplicaciones de herbicidas utilizadas en la identificacion sistematica inicial para la resistencia se presenta en la Tabla 1. En la Tabla 2 se presentan los resultados de los ensayos en campos de los Ejemplos 1-15 (SSC01 a SSC15). En las Tablas 3 y 4 se presentan los resultados de los ensayos en campos de los Ejemplos 16-27 (las lmeas resistentes que tienen designaciones PWC, CMC, o WDC). Tenga en cuenta que las tasas de aplicacion de las Tablas 1, 2, y 3, se dan en libras de principio activo por acre, mientras que las tasas de la Tabla 4 se dan en onzas de principio activo por acre.
Tabla 1 - Identificacion sistematica de aplicacion de herbicida
- Identificacion sistematica de aplicacion de herbicida (Ib de pa/A)
- Lmea
- Imazetapir 0,125 pre-emergencia + 0,063 post-emergencia Imazapir 0,10 post-emergencia Imazameth 0,125 post- emergencia
- SSC01
- X
- SSC02
- X
- SSC03
- X
- SSC04
- X
- SSC05
- X
- SSC06
- X
- SSC07
- X
- SSC08
- X
- SSC09
- X
- SSC10
- X
- SSC11
- X
- SSC12
- X
- SSC13
- X
- SSC14
- X
- SSC15
- X
- PWC16
- X
- PWC17
- X
- PWC18
- X
- Identificacion sistematica de aplicacion de herbicida (Ib de pa/A)
- Linea
- Imazetapir 0,125 pre-emergencia + 0,063 post-emergencia Imazapir 0,10 post-emergencia Imazameth 0,125 post- emergencia
- PWC19
- X
- PWC20
- X
- PWC21
- X
- PWC22
- X
- PWC23
- X
- PWC24
- X
- CMC25
- X
- CMC26
- X
- CMC27
- X
- CMC28
- X
- CMC29
- X
- CMC30
- X
- CMC31
- X
- WDC32
- X
- WDC33
- X
- WDC34
- X
- WDC35
- X
- WDC36
- X
- WDC37
- X
- WDC38
- X
- Tasa de aplicacion de herbicida (Ibde pa/A); y si se aplica pre-emergencia o post-emergencia
- Imazetapir Imazapir imazameth Imazatapir (75 %) + Imazapir (25%) Sulfometuron- metil Nicosulfuron
- Lfnea
- 0,125 0,063 0,125 0,188 0,05 0,09 0,063 0,125 0,052 post 0,10 0,05 0,10 0,05
- pre
- post post post post post post post pre post pre post
- SSC01
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC02
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC03
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC04
- X X X X X X X X X X 0 X X
- SSC05
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC06
- X X X X X X X X X X 0 X X
- SSC07
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC08
- X X X X X X X X X X 0 X X
- SSC09
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC10
- X X X X X X X X X 0 X X
- SSC11
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC12
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC13
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC14
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- SSC15
- X X X X X X X X X 0 0 X X
- PWC16
- X X 0 0 X X
- PWC17
- X X X 0 X X
- PWC18
- X X 0 0 X X
- PWC19
- X X 0 0 X X
- PWC20
- X X 0 0 X X
- PWC21
- X X 0 0 X X
- PWC22
- X
- Tasa de aplicacion de herbicida (Ibde pa/A); y si se aplica pre-emergencia o post-emergencia
- Imazetapir Imazapir imazameth Imazatapir (75 %) + Imazapir (25%) Sulfometuron- metil Nicosulfuron
- Lfnea
- 0,125 0,063 0,125 0,188 0,05 0,09 0,063 0,125 0,052 post 0,10 0,05 0,10 0,05
- pre
- post post post post post post post pre post pre post
- PWC23
- X X X X X X
- PWC24
- X X X 0 X X
- CMC25
- X X X 0 X X
- CMC26
- X X 0 0 X X
- CMC27
- CMC28
- X X 0 0 X X
- CMC29
- X X 0 0 X X
- CMC30
- X X 0 0 X X
- CMC31
- X X 0 0 X X
- WDC32
- X X X X X X
- WDC33
- X X 0 0 X X
- WDC34
- X X X 0 X X
- WDC35
- X X 0 0 X X
- WDC36
- X X 0 0 X X
- WDC37
- X X 0 0 X X
- WDC38
- X X 0 0 X X
- Notas a la Tabla 2: X = resistente;
- 0 = sensible (exhibio reaccion de tipo natual a herbicida); bianco = aun no ensayado.
- Tasa de aplicacion de herbicida (b de pa/A); y si se aplica pre-emergencia o post-emergencia
- Imazetapir Imazapic imazaquin Imazamox Imazapic 0,05 + Imazapir 0,05
- Lfnea
- 0,063 pre 0,125 pre 0,188 pre 0,063 post 0,125 post 0,037 pre 0,075 pre 0,15 pre 0,075 post 0,15 post 0,125 pre 0,25 pre 0,375 pre 0,05 post 0,10 post post
- SSC01
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC02
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC03
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC04
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC05
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC06
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC07
- X X X X X X X X X X X X X X 0 X
- SSC08
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC09
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC10
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC11
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC12
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- SSC13
- X X X X X X X X X X X X X X 0 X
- SSC14
- X X X X X X X X X X X X X X 0 X
- SSC15
- X X X X X X X X X X X X X X 0 X
- PWC16
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- PWC23
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- CMC29
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- CMC31
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- WDC33
- X X X X X X X
- Tasa de aplicacion de herbicida (Ibde pa/A); y si se aplica pre-emergencia o post-emergencia
- Imazetapir Imazapic imazaquin Imazamox Imazapic 0,05 + Imazapir 0,05
- Lfnea
- 0,063 pre 0,125 pre 0,188 pre 0,063 post 0,125 post 0,037 pre 0,075 pre 0,15 pre 0,075 post 0,15 post 0,125 pre 0,25 pre 0,375 pre 0,05 post 0,10 post post
- WDC37
- X X X X X X X X X
- WDC38
- X X X X X X X X X X X X X X X X
- Notas a la Tabla 3: X = resistente; 0 = sensible (exhibio reaccion de tipo natural a herbicida); bianco = aun no ensayado
- Tasa de aplicacion de herbicida (Ib de pa/A); y si se aplica pre-emergencia o post-emergencia
- Imazapic 0,075 + Imazapir 0,025 Imazapic 0,15 + Imazapir 0,05 Imazapir
- Linea
- post post 0,05 post 0,10 post
- SSC01
- X X X X
- SSC02
- X X X X
- SSC03
- X X X X
- SSC04
- X X X X
- SSC05
- X X X X
- SSC06
- X X X X
- SSC07
- X X X X
- SSC08
- X X X X
- SSC09
- X X X X
- SSC10
- X X X X
- SSC11
- X X X X
- SSC12
- X X X X
- SSC13
- X X X X
- SSC14
- X X X X
- SSC15
- X X X X
- PWC16
- X X X X
- PWC23
- X X X X
- CMC29
- X X X X
- CMC31
- X X X X
- WDC33
- X X X X
- WDC37
- WDC38
- X X X X
- Notas a la Tabla 3: X = resistente; 0 = sensible (exhibio reaccion de tipo natural a herbicida); blanco= aun no ensayado.
K)
O
- Tasa de aplicacion de herbicida (onzas de pa/A); y si se aplica preemergencia o post-emergencia
- Clorimuron-etil Metilsufuron- Nicosulfuron Rinsulfuron Tifensulfuron-metil (66,7%) + tribenuron- Piritiobac-sodio
- etil metil (33,3 %)
- 0,125 0,250 0,06 0,12 0,5 1,0 0,20 0,40 1,0 2,0
- Lfnea
- post post post post post post post post 0,45 post 0,90 post post post
- SSC01
- X X X X X X X X X X X X
- SSC02
- X X X X X X X X X X X X
- SSC03
- X X X X X X X X X X X X
- SSC04
- X X X X X X X X X X X X
- SSC05
- X X X X X X X X X X X X
- SSC06
- X X X X X X X X X X X X
- SSC07
- X X X X X X X X X X X X
- SSC08
- X X X X X X X X X X X X
- SSC09
- X X X X X X X X X X X X
- SSC10
- X X X X X X X X X X X X
- SSC11
- X X X X X X X X X X X X
- SSC12
- X X X X X X X X X X X X
- SSC13
- X X X X X X X X X X X X
- SSC14
- X X X X X X X X X X X X
- SSC15
- X X X X X X X X X X X X
- PWC16
- 0 0 X X X 0 0 0 X X X X
- PWC23
- 0 0 X X X 0 0 0 X X X X
- CMC29
- 0 0 0 X X 0 0 0 X X X X
- CMC31
- 0 0 0 X X X 0 0 X X X X
- Tasa de aplicacion de herbicida (onzas de pa/A); y si se aplica preemergencia o post-emergencia
- Clorimuron-etil Metilsufuron- etil Nicosulfuron Rinsulfuron Tifensulfuron-metil (66,7%) + tribenuron- metil (33,3 %) Piritiobac-sodio
- Lfnea
- 0,125 post 0,250 post 0,06 post 0,12 post 0,5 post 1,0 post 0,20 post 0,40 post 0,45 post 0,90 post 1,0 post 2,0 post
- WDC33
- X X X X 0 0 0 0 X X X X
- WDC37
- WDC38
- 0 0 0 X X X 0 0 0 X X X
- Notas a la Tabla 4: X = resistente; 0 = sensible (exhibio reaccion de tipo salvaje a herbicida); bianco = aun no ensayado. En las entradas para CMC29, CMC31 y WDC38 para metsulfuron-metil, y tambien para WDC38 (solo) para la mezcla de tifensulfuronmetil-tribenuron-metil, a la tasa de aplicacion inferior, la respuesta fue identica a la del tipo natural, sobreviviendo todas a la tasa de aplicacion inferiprmientras que a la tasa de aplicacion superior, las plantas de tipo natural resultaron gravemente danadas, y ladineas CMC29, CMC31, y WDC38 exhibieron lineas sustancialmente menos dafio.
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Un examen adicional de estas plantas concluyo que las siguientes lmeas resistentes a herbicidas paredan ser identicas a la lmea anterior resistente a herbicidas CACT 97523, presumiblemente porque unas pocas semillas de la CACT 97523 de ensayos anteriores hadan permanecido latentes en la tierra entre las estaciones de cultivo; PWC18, PWC20, PWC24, CMC25, CMC26, CMC28, CMC30, WDC32, WDC34, WDC35, y WDC36.
Los estudios de germinacion confirmaron los altos niveles de resistencia de pre-emergencia demostrados por varias de las nuevas lmeas de arroz. Normalmente, cuando la germinacion de una lmea no resistente se produce en concentraciones de imidazolinona en una solucion tan baja como 1-2 ppm, se producen danos significativos o incluso la muerte. Para las nuevas lmeas PWC16, PWC23, CMC29, CMC31, WDc33, WDC37, y WDC38, asf como para la lmea parental de Cypress (no resistente), los estudios de germinacion se llevaron a cabo de la siguiente forma. Para cada lmea, se germinaron 15 semillas por placa en tres placas de replicados de Petri a concentraciones de 0, 10, 20, 30, 40, 50, y 60 ppm para cada herbicida ensayado. La lmea parental Cypress no pudo germinar en concentraciones de 10 ppm y en concentraciones mayores para cada uno de los herbicidas ensayados. En cambio, germinaron en cada una de las lmeas experimentales, en diversos grados (algunas mas que otras) en concentraciones de herbicida de 60 ppm, salvo mencion expresa de lo contrario. Con imazapir, todas las lmeas experimentales germinaron en cierta medida a 60 ppm. Con imazetapir, todas las lmeas experimentales germinaron en cierta medida a 60 ppm. Con imazamox, todas las lmeas experimentales germinaron en cierta medida a 60 ppm, a excepcion de WDC38. Con imazapic, solo germinaron PWC16 y PWC23 en 60 ppm. Por consiguiente, las nuevas lmeas germinaron en concentraciones de herbicida de 60 veces con lo que habitualmente destruye o provoca un dano significativo a las plantas de arroz de tipo natural.
Una resistencia potenciada se conseguira cruzando nuevas lmeas de arroz con otras. Tambien se conseguira una resistencia potenciada de la sinergia al cruzar una o mas de las nuevas lmeas de arroz, con sus enzimas AHAS resistentes, con las lmeas de arroz metabolicamente resistentes divulgadas en la patente de Estados Unidos n.° 5.545.822, como se tipifica por el arroz con el numero de acceso de la CACT 75295. Como se divulga en la solicitud de patente internacional publicada WO 97/41218 del presente inventor, dicha sinergia se ha observado en dbridos de arroz con el numero de acceso de la CACT 75295 con el arroz con el numero de acceso de la CACT 97523, teniendo este ultimo una enzima AHAS resistente mutante en el arroz.
Notas sobre procedimientos de seleccion de mutacion en el campo
Se utilizaron los siguientes procedimientos para identificar de forma sistematica grandes cantidades de semillas de arroz mutado para la resistencia a herbicidas en el campo.
La exposicion a mutagenos o a condiciones propicias para la induccion de mutaciones puede realizarse en diferentes etapas de crecimiento y en diferentes condiciones de cultivo, por ejemplo, exponiendo a mutagenos semillas secas, semillas brotadas en agua durante 24 horas, o semillas brotadas en agua durante 48 horas, etc.; o celulas de crecimiento en cultivo tisular, tales como cultivo de antera, con o sin la aplicacion contemporanea de mutageno; y similares.
El arroz que se va a plantar para siembra se limpia generalmente despues de la cosecha. Una vez completada la limpieza, puede utilizarse de forma satisfactoria cualquier equipo de plantacion convencional. No obstante, esta etapa de limpieza laboriosa y larga puede evitarse si el equipo de plantacion tolera los trozos de paja y otros materiales extranos que normalmente acompanan al arroz recolectado. Eliminar la etapa de limpieza permite que crezcan generaciones de semillas, se identifiquen de forma sistematica, y aumenten mas rapidamente. Por ejemplo, utilizando una arrancadora/esparcidora unida a un tractor permite sembrar a voleo el arroz que va con una cantidad moderada de material extrano. La siembra a voleo tambien es mas rapida que la siembra por sembradora, puesto que ahorra tiempo y trabajo. Las semillas plantadas con una arrancadora/esparcidora pueden incorporarse facilmente a la tierra despues de esparcir a voleo, o se permite que permanezcan en la superficie de la tierra, en cuyo caso ha de mantenerse suficientemente humeda mediante riego si las precipitaciones son inadecuadas.
Las semillas de arroz recien recolectadas pueden tener un grado de inactividad, que evita que algunas de las semillas viables diferentes broten inmediatamente. Esta inactividad desaparece habitualmente durante el almacenamiento. No obstante, si la semilla recolectada va a plantarse para fines de seleccion poco despues de la cosecha para acelerar el tiempo de generacion, entonces es beneficioso un tratamiento para reducir o eliminar la inactividad. Un metodo para eliminar la inactividad es exponer la semilla a una temperatura de aproximadamente 50 °C durante aproximadamente cinco dfas; aunque temperaturas significativamente superiores pueden danar las semillas de arroz. Durante este tratamiento se debe permitir que la humedad salga de la semilla, por lo que debe utilizarse recipientes relativamente pequenos de material permeable a la humedad, tales como bolsas de tela. Alternativamente, los tallos con pamculas aun unidas pueden colocarse para permitir circular el aire en las pamculas, por ejemplo, en posicion vertical en una bolsa de papel. Como alternativa adicional, puede utilizarse un secado por aire forzado, con o sin almacenamiento en bolsas, con la condicion de que las semillas se situen de forma que no quede humedad en torno a las porciones del grano.
Cuando se pulverizan semillas o plantas de arroz mutado para identificar individuos resistentes, es importante conseguir un tratamiento lo mas uniforme y preciso posible. Ya que el numero de verdaderos individuos resistentes
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sera una fraccion muy pequena del numero total de semillas, incluso una pequena fraccion de "escapes" (es decir, plantas positivas falsas que fortuitamente no reciben herbicida alguno) puede complicar y retrasar el proceso de identificacion sistematica. Por lo tanto, el equipo de pulverizacion de herbicida ha de encontrarse en buen estado, y ha de calibrarse con la mayor exactitud posible. Cada boquilla de pulverizacion junto con la bomba de pulverizacion ha de distribuir una pulverizacion con la misma tasa volumetrica. Las boquillas han de alinearse con exactitud para evitar una superposicion insuficiente de pulverizacion entre las boquillas. Son utiles bombas de pulverizacion relativamente cortas en tractores (por ejemplo, aproximadamente 12 pies) en la minimizacion de movimientos no deseados de la bomba mientras se pulveriza.
Las boquillas apropiadas incluyen lo siguiente, cada una de las cuales tiene una punta de pulverizacion plana, y pulveriza con una presion de pulverizacion de aproximadamente 15 galones por acre a 40 libras por pulgada cuadrada (calibre), con un espacio de la boquilla de 20 pulgadas, a las velocidades de avance indicadas: 8001VS (2 mph), 80015VS (3 mph), 8O02VS (4 mph), 8003VS (5 mph). (Spraying Systems Co., Wheaton, Illinois). Para optimizar el patron de pulverizacion, la altura de la boquilla sobre la diana (parte superior del dosel de la planta o el suelo) ha de ajustarse de forma que el patron de pulverizacion de cada boquilla se superponga al patron de pulverizacion de cada boquilla de pulverizacion adyacente en aproximadamente un 30 % (medido linealmente). Utilizando las boquillas de 80 grados enumeradas previamente, a una presion de pulverizacion de 40 psi, y con un espacio entre las boquillas de 20 pulgadas, una altura optima de pulverizacion en la diana debena ser 17 a 19 pulgadas. Manteniendo otros parametros constantes, pero cambiando el espacio entre las boquillas a 30 pulgadas, la altura optima de pulverizacion aumentana de 26 a 28 pulgadas. Utilizar presiones de pulverizacion inferiores a 40 psi reducira normalmente los angulos de pulverizacion de la boquilla, y para un ajuste a una altura de pulverizacion inferior puede ser necesario conseguir una superposicion apropiada a presiones inferiores. Todos los equipos de pulverizacion han de calibrarse de forma precisa antes de uso.
Cuando se pulveriza, marcas medidas cuidadosamente para guiar al operador del equipo de pulverizacion son con frecuencia beneficiosas, ya que son marcas en el centro de campos mayores, ademas de las de los extremos de los campos. La velocidad del viento ha de ser practicamente cero, una condicion que se aprecia con frecuencia en la madrugada o a ultima hora de la tarde. No ha de pulverizarse si se pronostica lluvia en aproximadamente las 6 siguientes horas (un periodo de tiempo que vana, en funcion del herbicida particular). Ha de aplicarse una pulverizacion de pre-emergencia en terrenos secos. En caso de que el herbicida requiera humedad para su activacion, entonces se requiere riego o precipitaciones tras la plantacion.
La uniformidad de la pulverizacion se consigue mejor dividiendo el herbicida que se va a aplicar por igual entre dos pulverizaciones consecutivas, una tras otra. La solucion de pulverizacion se prepara con la mitad de la concentracion del tratamiento final. Despues se realizan dos pasadas en direcciones opuestas para conseguir la concentracion del tratamiento total deseada. Por ejemplo, si la primera pasada en una fila particular se realiza en la direccion norte a sur, la segunda pasada se realiza en la direccion sur a norte. Cuando se pulveriza con un tractor, esto puede llevarse a cabo desplazandose en la direccion opuesta en el mismo recorrido para la segunda aplicacion.
Se favorece la completa cobertura utilizando grandes volumenes de pulverizacion (es decir, concentraciones diluidas de herbicida) y un tamano pequeno de gotas de pulverizacion. Los volumenes de pulverizacion de 30 a 40 galones por acre han funcionado bien, particularmente con dos aplicaciones de 15 a 20 galones por acre cada una. Las presiones de pulverizacion de 30 a 40 libras por pulgada cuadrada (calibre) han funcionado bien en la produccion de pulverizaciones finas que proporcionan una amplia cobertura. Las boquillas han de estar separadas de forma uniforme, preferentemente aproximadamente a 20 pulgadas de distancia.
La tasa total de aplicacion de herbicida utilizada para la seleccion es preferentemente al menos dos veces la tasa normal de uso para el mismo herbicida. Por ejemplo, si 0,063 lb de pa/A es la tasa normal de uso para los cultivos, entonces la concentracion apropiada para seleccionar individuos resistentes sena de dos aplicaciones a la misma tasa, produciendo un tratamiento total de 0,125 libras de pa/A.
La combinacion de dos pulverizaciones, grandes volumenes de pulverizacion, presiones altas de pulverizacion, y una concentracion elevada de tratamiento ayuda a minimizar la ocurrencia de escapes, es decir, individuos que no son realmente resistentes, pero que sobreviven al procedimiento simplemente porque no se pulverizaron adecuadamente.
Existen ventajas para llevar a cabo la seleccion con herbicidas que poseen actividades tanto en la tierra como foliares. La actividad en la tierra del herbicida puede utilizarse directamente para seleccionar individuos resistentes que crecen a pesar de la aplicacion de pre-emergencia. Alternativamente, puede utilizarse una aplicacion de pre- emergencia para eliminar un gran porcentaje de entidades no resistentes, tras lo cual se realiza la aplicacion foliar en los individuos supervivientes. Esta escasez temprana de densidad reduce considerablemente el problema de la intercepcion de la pulverizacion que puede producirse de otra forma en un estado denso de plantas de semillero jovenes, es decir, la posibilidad de que una planta de semillero se cubra ffsicamente de la pulverizacion por otras plantas de semillero.
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El uso tanto de la aplicacion en la tierra como foliar de un herbicida adecuado tambien reduce el problema de "escapes", puesto que la actividad en la tierra del herbicida eliminara a menudo individuos que podnan escapar de la pulverizacion foliar. Cuando se utiliza un herbicida que tiene principalmente, o solo, actividad foliar, puede ser necesaria una pulverizacion adicional por dos motivos. Un motivo es eliminar individuos no resistentes que escapan de la pulverizacion foliar. Asimismo es importante la eliminacion de individuos no resistentes de semillas que brotan mas tarde. Una planta que crece a partir de una semilla que brota tras la pulverizacion no se controlara por un herbicida que solo tiene actividad foliar. En un plazo de dos semanas, dicha planta puede alcanzar un tamano que hace que parezca un mutante resistente que sobrevivio al tratamiento foliar. Si no es deseable ni posible una segunda pulverizacion foliar, una alternativa es dejar un area pequena del campo sin pulverizar cuando se realiza la primera aplicacion para proporcionar un estandar directo para determinar el tamano que han de conseguir las plantas de semillero resistentes durante el periodo de intervencion.
El uso de un herbicida con solo actividad en la tierra y foliar tambien ofrece la posibilidad de seleccionar eficazmente una resistencia tanto de pre-emergencia como de post-emergencia en las mismas plantas individuales. Esta seleccion se realiza realizando aplicaciones secuenciales. Si se realiza correctamente, hay una alta probabilidad de que los individuos supervivientes a las aplicaciones secuenciales sean resistentes tanto a tratamientos de pre- emergencia como de post-emergencia con ese herbicida, en lugar de que escapen.
Conforme esta en curso el procedimiento de seleccion, se debe prestar atencion a que los pocos individuos supervivientes no sean comidos por pajaros o insectos. Evitar esta depredacion es importante para tratamientos de post-emergencia y de pre-emergencia. Se pueden utilizar dispositivos que hacen ruido para espantar a los pajaros, tales como mirlos, que se comen las semillas de arroz y las plantas de semillero pequenas. Insectos, tales como cogolleros y picudos acuaticos tambien matan las semillas supervivientes pequenas, y la aplicacion de un insecticida de forma preventiva resulta con frecuencia deseable. Se debe efectuar un control diario de la situacion en caso de que un investigador elija no utilizar disuasores de pajaros o insecticidas de forma preventiva.
Ensayos para la actividad total de AHAS
Los procedimientos utilizados para ensayar la actividad de las acetohidroxiacido sintasas de varias lmeas de arroz, descritas como se indica mas adelante, se describen sustancialmente en B. K. Singh et al., "Assay of Acetohydroxyacid Synthase", Analytical Biochemistry, vol. 171, pags. 173-179 (1988), salvo mencion expresa de lo contrario. En el primer parrafo de "Materials and Methods" de Singh, en lugar de celulas de cultivo de suspension de mafz, se utilizaron tejidos del brote de las plantas de semillero de arroz que crecen en invernaderos en la etapa de desarrollo de 3-4 hojas, o celulas de cultivo de suspension de arroz. Para los tejidos de brote, se extrajeron 40,0 gramos (peso fresco) de tejido de la misma forma para cada una de las lmeas de cultivo; para las celulas de suspension de Cypress, se utilizaron 16,0 gramos de celulas, recogidas ocho dfas despues del subcultivo. A sugerencia del primer autor, B. K. Singh (comunicacion personal), se elimino la etapa de desalacion mencionada al final de la primera columna del texto de Singh "Materials and Methods". El herbicida Pursuit™ (imazetapir, tambien conocido como Newpath™) o el herbicida Arsenal™ (imazapir) se incluyo en la "mezcla de reaccion convencional" para el ensayo de AHAS en diversas concentraciones. La absorbancia colorimetrica se midio a 520 nm. Se realizaron comprobaciones de la formacion directa de acetoma durante el ensayo enzimatico.
Hasta la fecha, las siguientes nueve lmeas de arroz se ensayaron de esta manera: la lmea no resistente Cypress (la lmea parental para algunas de las lmeas resistentes a herbicidas), CACT 97523, PTA-904, PTA-905, PTA-902, PTA- 903, PTA-906, PTA-907, y PTA-908. Algunos ensayos se llevaron a cabo en diferentes momentos, y se repitieron los ensayos en algunas concentraciones de herbicida. Se apreciaron diferencias entre las lmeas con respecto a la actividad total de la enzima AHAS y los niveles de resistencia a herbicidas. En el ensayo modificado de Singh para una actividad total de AHAS, utilizando un extracto enzimatico crudo, en ausencia de herbicida, la mayor parte (aunque no toda) de las lmeas resistentes a herbicidas expresaron mayor actividad total de AHAS que la lmea no resistente Cypress. Tras el tratamiento con los herbicidas Pursuit™ (imazetapir, tambien conocido como Newpath™) o Arsenal™ (imazapir), la reduccion en la actividad de AHAS fue mayor en la lmea Cypress que en cualquiera de las otras lmeas resistentes ensayadas. Para la lmea que parecfa tener la resistencia mas alta en los ensayos realizados hasta la fecha, PWC23 (PTA-905), la actividad enzimatica en presencia de niveles muy altos de herbicidas (1.000 |jM de imazetapir o imazapir) era similar a la actividad enzimatica de la lmea no resistente Cypress en ausencia de cualquier herbicida. Todas las lmeas resistentes ensayadas expresaron resistencia tanto a imazetapir como a imazapir, mientras que la lmea no resistente Cypress era sensible a ambos herbicidas. Los resultados se muestran en la Tabla 5. En la Tabla 5, la primera fila ("sin herbicida") se indico como la absorbancia a 520 nm Todas las otras entradas en una columna presentada (es decir, para una lmea dada de arroz) se expresaron como un porcentaje de la absorbancia para la misma lmea de arroz en ausencia de herbicida.
- Cypress CACT 97523 (93AS3510) CACT PTA- 904 (PWC16) CACT PTA- 905 (PWC23) CACT PTA- 902 (CMC29) CACT PTA- 903 (CMC31) CACT PTA- 906 (WDC33) CACT PTA- 907 (WDC37) CACT PTA- 908 (WDC38)
- Sin herbicida
- 0,766 0,837 0,713 1,107 0,811 1,038 0,851 1,226 0,822
- 50 |jM imazetapir
- 63 % 101 % 95 % 99 % 92 % 84 % 89 % 92 % 95 %
- 100 pM imazetapir (primer replicado)
- 54 % 92 % 83 % 88 % 88 % 82 % 85 % 86 % 90 %
- 100 pM imazetapir (segundo replicado)
- 58 % 91 % 92 % 93 % 93 % 87 % 86 % ... ...
- 1.000 pM imazetapir
- 56 % 78 % 78 % 80 % 84 % 81 % 82 % 64 % 66 %
- 50 |jM imazapir
- 63 % 91 % 90 % 95 % 92 % 86 % 88 % 84 % 81 %
- 100 pM imazapir
- 57 % 83 % 83 % 88 % 84 % 80 % 74 % 78 % 78 %
- 1.000 pM imazapir
- 45 % 68 % 76 % 75 % 75 % 68 % 73 % 66 % 66 %
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Los resultados mostrados en la Tabla 5 muestran claramente que cada una de las lmeas resistentes enumeradas en esa Tabla (CACT 97523, CACT PTA-904, etc.) contiene una enzima AHAS mutante resistente. Las concentraciones mas bajas ensayadas, 50 pM de imazetapir o imazapir, redujeron la actividad de AHAS de la lmea no resistente a aproximadamente un 63 % del control - una reduccion en la actividad que es mas que suficiente para ser letal en plantas en el campo. En cambio, las lmeas resistentes teman actividades de AHAS que oscilan de 84 % a 101 % de control a estas concentraciones de herbicidas. Incluso en las concentraciones mas altas de herbicidas ensayadas, 1.000 pM, las actividades de AHAS en las plantas resistentes oscilaron de 64 % a 84 %, frente al 45 % o 56 % de la lmea no resistente. Dicho de otra manera, cada una de las plantas resistentes mostro una mayor actividad de AHAS en la concentracion extremadamente alta de herbicida de 1.000 pM que la actividad de AHAS de la lmea no resistente en la tasa de herbicida mas baja ensayada, 50 pM. De hecho, la actividad absoluta exhibida por la lmea mas resistente, PTA-905, en las tasas mas altas de herbicida de 1.000 pM ensayadas (actividades de 0,883 para imazetapir y 0,834 para imazapir) era mayor que la actividad de AHAS para la lmea no resistente Cypress en ausencia de cualquier herbicida (0,766).
Por lo tanto, los resultados expuestos en la Tabla 5 demuestran claramente que las caractensticas de resistencia a herbicidas de al menos las lmeas de arroz resistentes enumeradas en la Tabla 1 se debieron a una enzima AHAS mutante resistente.
Niveles de inhibicion de germinacion
Se ensayaron las aplicaciones de herbicidas de pre-emergencia para identificar los niveles de dos herbicidas diferentes que inhiben completamente la germinacion de varias lmeas de arroz. La semilla de cada lmea ensayada se germino en una placa de Petri de plastico desechable que contiene 8 ml de solucion de herbicida y una capa de papel de filtro n.° 4 Whatman. El fungicida Vitavax 200 a una concentracion de 0,5 ml/l se anadio a las soluciones de incubacion para inhibir el crecimiento de hongos. Los controles no tratados se incubaron en soluciones que contienen fungicida, pero no herbicida. Veinte semillas se colocaron en 3 placas de replicados por tratamiento, y se incubaron a 25 °C en fotoperiodos de 16 horas:8 horas de luz/oscuridad a una intensidad de luz fluorescente de 15 microeinsteins por metro cuadrado por segundo. (Un einstein = 1 mol de fotones). Los tratamientos se evaluaron 11 dfas despues de la incubacion. Los resultados de estos experimentos de pre-emergencia se muestran en la Tabla 6, que indica las concentraciones de herbicidas, en partes por millon, necesarias para inhibir completamente la germinacion de las lmeas ensayadas.
Tabla 6 - Concentraciones de herbicidas (ppm) necesarias para inhibir completamente la germinacion.
- Imazapic (Cadre™1) Imazetapir (Pursuit™1 o Newpath™1)
- Cypress
- 0,5 1
- CACT 97523 (93AS3510)
- 10 10
- CACT PTA-904 (PWC16)
- 60 80
- CACT PTA-905 (PWC23)
- 90 100
- CACT PTA-902 (CMC29)
- 50 90
- CACT PTA-903 (CMC31)
- 70 60
- CACT PTA-906 (WDC33)
- 50 70
- CACT PTA-907 (WDC37)
- 50 60
- CACT PTA-908 (WDC38)
- 30 30
Como se muestra en la Tabla 6, cada una de las lmeas de CACT PTA-904, CACT PTA-905, CACT PTA-902, CACT PTA-903, CACT PTA-906, CACT PTA-907, y CACT PTA-908 exhibieron sustancialmente mayor resistencia a las aplicaciones de pre-emergencia de los herbicidas de imazapic e imazetapir que CACT 97523 - mayor en un factor de 3 a 10. Tenga en cuenta asimismo que las caractensticas de resistencia de pre-emergencia de cada una de estas siete lmeas de imazapic e imazetapir demuestran claramente que son diferentes de la lmea CACT 97523; del mismo modo, vease tambien los resultados expresados en las Tablas 7 y 8 a continuacion.
Ensayos en invernaderos y en campos adicionales
La resistencia de post-emergencia de las nuevas lmeas tambien se ha ensayado: en macetas de turba en un invernadero, y en las plantas en el campo. En el ensayo en macetas de turba, se ensayo la tolerancia de las plantas de cuarta generacion (M4) en diversos tratamientos con herbicidas de imidazolinona de post-emergencia. Las plantas de semillero individuales, en 3 macetas de turba de replicados por tratamiento, se pulverizaron en la etapa de 2-3 hojas con 0X, 5X, 10X, 15X, y 20X tratamientos con herbicidas. Las plantas se evaluaron 42 dfas despues del tratamiento. Los valores enumerados en la Tabla 7 a continuacion eran las tasas mas altas ensayadas que se toleraron sin dano visible, en algunos casos junto con un valor en parentesis que presenta una tasa mas alta en la que sobrevivieron las plantas, pero con dano.
K)
- Cypress CACT 97523 (93AS3510) CACT PTA- 904 (PWC16) CACT PTA- 905 (PWC23) CACT PTA- 902 (CMC29) CACT PTA- 903 (CMC31) CACT PTA- 906 (WDC33) CACT PTA- 907 (WDC37) CACT PTA- 908 (WDC38)
- Imazetapir (Pursuit)
- Todas murieron a 5X Todas murieron a 5X 10X (sobrevivieron 15X) 15X (sobrevivieron 20X) 15X (sobrevivieron 20X) 10X (sobrevivieron 15X) 15X (sobrevivieron 20X) 10X (sobrevivieron 15X) Todas murieron a 5X
- Imazamox (Raptor)
- Todas murieron a 5X Todas murieron a 5X Todas murieron a 5X 5X (sobrevivieron 10X) danadas a 5X 5X (sobrevivieron 10X) 5X 5X 10X
- Imazapir (Arsenal)
- Todas murieron a 5X Todas murieron a 5X 10X 10X 10X 10X 10X 10X 10X
- Imazapic (Cadre)
- Todas murieron a 5X Todas murieron a 5X 5X 10X 5X Todas murieron a 5X 5X 5X (sobrevivieron 10X) danadas a 5X
Notas: (1) A excepcion de imanazox, en cada caso, una aplicacion 10X = 0,63 Ibde pa/A = 706 g pa/ha, y todas lasotrastasas de aplicacion son proporcionales. Para imazamox, una aplicacion 10X = 0,32 Ibde pa/A = 359 pa/ha. (2) Puesto que el numero de replicados en este experimento particular fue bajo, y puesto que las lineas se estaban aun segregando, puede ser apropiado un mayor grado de confidencia para los resultados positivos en la Tabla 7 (tolerancia a herbicidas) que para los resultados negativos (susceptibilidad a herbicidas).
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Se llevaron a cabo ensayos en campos para evaluar la resistencia a herbicidas de las lmeas PTA-902, PTA-903, PTA-904, PTA-905, y PTA-908. Los mismos ensayos se llevaron a cabo tanto en la variedad no resistente de arroz Cypress como en la lmea de arroz resistente a herbicidas CACT 97523. Todas las lmeas se plantaron en filas de 1 metro, con dos replicaciones de cada tratamiento. Los tratamientos de post-emergencia de varios herbicidas se aplicaron cuando el arroz se encontraba en la etapa del desarrollo de 2-3 hojas. Las aplicaciones con herbicidas se realizaron con una mochila con rociador a una velocidad de pulverizacion de 15 galones por acre (163 litros por hectarea). Las evaluaciones de la resistencia a herbicidas se realizaron conforme las plantas alcanzaron la etapa de floracion, y se basaron en el rendimiento relativo en comparacion con las filas de control no tratadas de las mismas lmeas. Las dificultades tecnicas en la realizacion de este conjunto de experimentos impidio la adquisicion de buenos datos para la lmea PTA-907. La lmea PTA-906 se evaluo en ensayos en invernaderos, en lugar de los ensayos en campos, con el fin de conservar la limitada cantidad de semillas que estaban disponibles para esta lmea en el momento. Las plantas individuales en macetas de turba de 5 cm por 5 cm se pulverizaron en la etapa de 2-3 hojas con las mismas aplicaciones de herbicidas que se utilizaron en los ensayos en campos de post-emergencia. Los tratamientos con herbicidas tambien se realizaron con una mochila con rociador a una velocidad de pulverizacion de 15 galones por acre (163 litros por hectarea). Las evaluaciones de la resistencia a herbicidas se realizaron conforme las plantas alcanzaron la etapa de floracion, y se basaron en el rendimiento relativo en comparacion con los controles no tratados de las mismas lmeas en el invernadero. La evaluacion en el invernadero se llevo a cabo dos veces, y se replico cada tratamiento. Al igual que en el ensayo en campos, los controles se llevaron a cabo para la comparacion con las plantas no resistentes (en este caso, se utilizo la variedad Bengal no resistente) y con las plantas anteriores CACT 97523. Los resultados se muestran en la Tabla 8. (Se llevaron a cabo asimismo varios tratamientos con herbicidas adicionales, no mostrados en la Tabla 8).
Tabla 8 - Tolerancia al herbicida de post-emergencia en ensayos en campos o en ensayos en invernaderos. Las entradas expresan el dano en porcentaje en comparacion con los controles no tratados de las mismas
lmeas.
- Imazapic (Cadre) 0,075 lb de pa/A + imazapir (Arsenal) 0,025 lb de pa/A (= 84 y 28 g de pa/A/ha, respectivamente) Rimsulfuron (Matrix) 0,025 lb de pa/A (= 28 g de pa/ha)
- Cypress (campo)
- 100 % 100 %
- CACT 97523 (93AS3510) (campo)
- 95 % 90 %
- CACT 203419 (SSC01) (campo)
- 28 % 18 %
- CACT 203420 (SSC02) (campo)
- 60 % 20 %
- CACT 203421 (SSC03) (campo)
- 38 % 18 %
- CACT 203422 (SSC04) (campo)
- 23 % 18 %
- CACT 203423 (SSC05) (campo)
- 75 % 20 %
- CACT 203424 (SSC06) (campo)
- 8 % 8 %
- CACT 203425 (SSC07) (campo)
- 23 % 75 %
- CACT 203426 (SSC08) (campo)
- 15 % 18 %
- CACT 203427 (SSC09) (campo)
- 8 % 13 %
- CACT 203428 (SSC10) (campo)
- 8 % 18 %
- CACT 203429 (SSC11) (campo)
- 48 % 45 %
- CACT 203430 (SSC12) (campo)
- 33 % 18 %
- CACT 203431 (SSC13) (campo)
- 30 % 20 %
- CACT 203432 (SSC14) (campo)
- 63 % 33 %
- CACT 203433 (SSC15) (campo)
- 43 % 35 %
- CACT PTA-904 (PWC16) (campo)
- 0 % 100 %
- CACT PTA-905 (PWC23) (campo)
- 3 % 100 %
- CACT PTA-902 (CMC29) (campo)
- 0 % 100 %
- CACT PTA-903 (CMC31) (campo)
- 0 % 100 %
- CACT PTA-908 (WDC38) (campo)
- 5 % 100 %
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- Imazapic (Cadre) 0,075 lb de pa/A + imazapir (Arsenal) 0,025 lb de pa/A Rimsulfuron (Matrix) 0,025 lb de pa/A
- (= 84 y 28 g de pa/A/ha, respectivamente) (= 28 g de pa/ha)
- Bengal (invernadero)
- 100 % 100 %
- CACT 97523 (93AS3510) (invernadero)
- 100 % 60 %
- CACT PTA-906 (WDC33) (invernadero)
- 3 % 100 %
- CACT PTA-907 (WDC37)
- N/D N/D
Secuenciacion, clonacion, y transformation de plantas
Los reiterados intentos por el inventor y sus colegas para secuenciar la secuencia codificante de AHAS de arroz mediante amplificacion por PCR de ADN genomico de arroz durante un periodo prolongado no habfan tenido exito. Estas dificultades han sido ahora superadas por amplificacion por RT-PCR en lugar de ARN.
Las secuencias de nucleotidos de AHAS resistentes mutantes de las plantas de arroz con numeros de acceso CACT 97523, 203419, 203420, 203421, 203422, 203423, 203424, 203425, 203426, 203427, 203428, 203429, 203430, 203431, 203432, 203433, PTA-904, PTA-905, PTA-902, PTA-903, PTA-906, PTA-907, y PTA-908 se secuenciaron y se clonaron, junto con la secuencia de nucleotidos de AHAS de tipo natural de las variedades de arroz parental AS3510 y Cypress. A partir de la fecha de presentacion de la presente solicitud, las partes sustanciales de este trabajo se han completado, como se describe a continuacion. La secuenciacion restante y la clonacion se procederan en lo sucesivo a su complecion utilizando tecnicas conocidas en la materia, como se describe en general a continuacion. Las secuencias que se han obtenido hasta la fecha muestran la naturaleza y la ubicacion de algunas de las mutaciones puntuales responsables de los fenotipos resistentes a herbicidas observados.
La lmea parental no resistente Cypress se ha difundido publicamente por la Estacion de Investigacion en Arroz del Centro Agncola de la Universidad del Estado de Luisiana, y es de facil adquisicion. Las muestras de la lmea parental no resistente AS3510 estan disponibles a peticion y sin cargo del inventor, Timothy P. Croughan, c/o Centro Agncola de la Universidad del Estado de Luisiana, Estacion de Investigacion en Arroz, Aptdo. postal 1429, Crowley, Louisiana 70527-1429, Estados Unidos. Las muestras de la lmea AS3510 tambien pueden estar disponibles en otros programas de cultivo o colecciones de germoplasma de arroz.
Ejemplo 29 - CMC31 (CACTPTA-903)
El ARN total de la lmea CMC31 (numero de acceso CACT PTA-903) se extrajo a partir de cultivo tisular de callo de arroz con el Mini Kit RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) utilizando ~100 mg de tejido. Se siguio el "Mini protocolo de plantas RNeasy para el aislamiento de ARN total a partir de celulas, tejidos vegetales, y hongos filamentosos" del fabricante. El ARN total se eluyo en 50 jl de dietil pirocarbonato - solucion de agua, para un rendimiento de ~100 |jg.
A continuacion, ARN poli A+ (ARNm) se purifico a partir del ARN total con el mini kit ARNm Oligotex (Qiagen Inc., Valencia, CA) siguiendo el protocolo de columna centrifugada para ARNm Oligotex. Las cantidades de tampon utilizadas fueron las recomendadas por el fabricante para un tamano miniprep. El ARNm se eluyo dos veces con 25 jl del tampon OEB del kit.
Los resultados de la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se obtuvieron utilizando microesferas por RT-PCR Ready-To-Go (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), siguiendo el protocolo de dos etapas del fabricante para RT-PCR. Los cebadores de PCR se basaron en una secuencia de AHAS publicada de Hordeum vulgare, numero de acceso de GenBank AF059600. Dos pares de cebadores, Hvals-3 y Hvals-4, y Hvals-3 y Hvals-6 (Hvals-3 = TGG CGA GGC ACG GCG CCC; Hvals-4 = GAC GTG GCC GCT TGT AAG; Hvals-6 = AGT ACG AGG TCC TGC CAT) (SEQ ID NOS 6-8, respectivamente) produjeron dos productos, uno de aproximadamente 550 pares de bases y otro de aproximadamente 1.100 pares de bases. (El producto de ~550 pb era un subconjunto del producto de ~1. 100 pb, y se confirmo la secuencia del producto de ~1. 100 pb en la region de su solapamiento). Estos productos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % a 70 voltios durante 90 minutos. Las bandas se escindieron y se purificaron con el kit de gel de recuperacion de ADN ZymoClean™ (Zymo Research, Orange, CA), y se eluyeron en 13 jl de 10 mM de tampon Tris.
Los productos de PCR extrafdos del gel se secuenciaron utilizando el kit Big Dye™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando 5 jl de plantilla por cebador de PCR. La secuencia de 1.095 bases resultante se analizo contra secuencias previamente expuestas por el software de busqueda Blast (Centro Nacional para la informacion Biotecnologica, disponible en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). La secuencia se presenta a continuacion como la SEQ ID NO 1, en la orientacion convencional 5'-3'. Estas 1.095 bases representan aproximadamente la mitad de la
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). La secuencia se presenta a continuacion como la SEQ ID NO 1, en la orientacion convencional 5'-3'. Estas 1.095 bases representan aproximadamente la mitad de la
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porcion codificante del gen de AHAS. La secuencia de aminoacidos inferida parcial se presenta a continuacion como la SEQ ID NO 15, en la orientacion del extremo carboxi-terminal-amino-terminal convencional.
La SEQ ID NO 1 es identica al 85 % a nivel de nucleotidos (902 bases de 1.058) a la secuencia de AHAS de Zea mays descrita como el numero de acceso de GenBank X63553; identica al 84 % (896 bases de 1.060 bases) a la secuencia de AHAS de Zea mays descrita como el numero de acceso de GenBank X63554; e identica al 88 % (603 bases de 678) a la secuencia de AHAS de Hordeum vulgare descrita como el numero de acceso de GenBank AF059600. Es identica al 97% (1.062 bases de 1.088) a la secuencia de AHAS de Oryza sativa var. Kinmaze descrita como el numero de acceso AB049822 (SEQ ID NO 2).
Hasta el punto de la mutacion por desplazamiento del marco de lectura, la SEQ ID NO 15 es identica al 99 % a nivel de aminoacidos inferido (352 aminoacidos de 355) a la secuencia de AHAS de Oryza sativa var. Kinmaze de tipo natural segun lo descrito por T. Shimizu et al., "Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthasa, complete cds, herbicide sensitive wild type", numero de acceso BLAST AB049822 (abril de 2001), disponible en
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, SEQ ID NO 3. En la posicion del aminoacido 627, se halla una sustitucion de Ser-Lys en la secuencia de aminoacidos inferida para la lmea CMC31, seguido de una delecion de una sola base en el ADN, causando una mutacion por desplazamiento del marco de lectura que altera generalmente la identidad de la mayona de los aminoacidos posteriores (es decir, aquellos entre la posicion 627 y el extremo carboxi-terminal), y que introduce una "terminacion" de siete codones aguas abajo del codon para la posicion del aminoacido 627 (Ser-Lys).
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, SEQ ID NO 3. En la posicion del aminoacido 627, se halla una sustitucion de Ser-Lys en la secuencia de aminoacidos inferida para la lmea CMC31, seguido de una delecion de una sola base en el ADN, causando una mutacion por desplazamiento del marco de lectura que altera generalmente la identidad de la mayona de los aminoacidos posteriores (es decir, aquellos entre la posicion 627 y el extremo carboxi-terminal), y que introduce una "terminacion" de siete codones aguas abajo del codon para la posicion del aminoacido 627 (Ser-Lys).
Puesto que la fuente presuntiva de la mutacion de resistencia a herbicidas se ha identificado en la lmea CMC31, es razonable deducir que la secuencia codificante completa para esta lmea es la misma que para la de AHAS "parental" de tipo natural Cypress (SEQ ID NO 14), a excepcion del reemplazo del codon AGT con serina en la posicion del aminoacido 627 con la sustitucion y delecion A-A apreciada en la posicion correspondiente en la SEQ ID NO 1. La secuencia codificante de AHAS completa inferida para la lmea CMC31 se enumera a continuacion como la SEQ ID NO 20. La secuencia de aminoacidos completa correspondiente inferida para esta AHAS resistente a herbicidas se enumera a continuacion como la SEQ ID NO 21.
Ejemplo 30-34 - PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, y WDC38 (CACT PTA-904; PTA-905, PTA-902, PTA-906, y PTA-908)
Las secuencias de ADNc parcial tambien se determinaron para la secuencia codificante de AHAS de las lmeas PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, y WDC38 (CACT PTA-904, PTA-905, PTA-902, PTA-906, PTA-908).
Se cultivo material foliar de las plantas jovenes de semillero cultivadas en invernadero, y el ARN total se extrajo utilizando el "Mini kit de ARN total para plantas RNEASY" de Qiagen, siguiendo los protocolos sugeridos por el fabricante. A continuacion, se purifico ARNm a partir del ARN total extrafdo utilizando el "sistema de purificacion de ARNm Oligotex" de Qiagen, siguiendo los protocolos sugeridos por el fabricante.
Los cebadores de PCR se disenaron en base a un analisis de secuencias codificantes de AHAS conocidas de otras especies. Los cebadores se eligieron para corresponder las regiones muy conservadas con baja degeneracion de codones. Estos cebadores se utilizaron entonces en la amplificacion por PCR de segmentos de la secuencia de las reacciones por RT-PCR de ARNm de arroz aislado.
El ARNm se transcribio en forma inversa utilizando un cebador oligo-dT suministrado por el "Sistema de Smtesis de Primera Hebra con la Superscript para RT-PCR" de Life Technologies. Se siguieron los protocolos sugeridos por el fabricante.
Se utilizo la amplificacion de dos cebadores de aproximadamente 300-350 pares de bases para amplificar el extremo 3' de la secuencia codificante de AHAS. Los fragmentos de ADN resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se clonaron en vectores de Topo-TA™, y se secuencio una serie de aislados individuales. La secuenciacion se llevo a cabo de acuerdo con los protocolos convencionales, utilizando un prisma ABI Perkin Elmer 310 o un secuenciador Beckman CEQ2000 automatizado. La informacion de la secuencia de ADN resultante se analizo por medio de los programas informaticos de analisis de ADN disponibles comercialmente, tales como Sequencer™.
Las secuencias observadas para las lmeas PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, y WDC38 se presentan a continuacion como la SEQ ID NOS 9 a 13, respectivamente. Tenga en cuenta que en la secuencia de AHAS de tipo natural (Cypress) (SEQ ID NO 14), el codon correspondiente al aminoacido 627 es AGT, que codifica la serina. En cada una de las secuencias de lmeas PWC16, pWc23, CMC29, WDC33, WDC38 (SEQ ID NOS 9-13), el codon correspondiente al aminoacido 627 es AAT, que codifica la asparagina. Se cree que esta sustitucion de serina- asparagina es responsable de la resistencia a herbicidas demostrada por la enzima AHAS de estas lmeas.
Puesto que la fuente de la mutacion de resistencia a herbicidas se ha identificado en las lmeas PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, y WDC38, es razonable deducir que las secuencias codificantes completas para cada una de estas lmeas es la misma que la AHAS "parental" de tipo natural Cypress (SEQ ID No 14), a excepcion del
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reemplazo del codon AGT con serina en la posicion del aminoacido 627 con un codon AAT de asparagina. La secuencia codificante de AHAS completa inferida para cada una de las lmeas de PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, y WDC38 se enumera a continuacion como la SEQ ID NO 18. La secuencia de aminoacidos completa inferida correspondiente para esta AHAS resistente a herbicidas se enumera a continuacion como la SEQ ID NO 19.
Debido a que las diferentes lmeas PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, y WDC38 han demostrado diferentes niveles de tolerancia a herbicidas en el campo, fue sorprendente que las mutaciones identificadas para estas cinco lmeas fuesen todas identicas. La secuenciacion de las secuencias codificantes de AHAS de estas lmeas se repetira para fin de verificacion.
Ejemplo 35 - Linea parental de tipo natural (Cypress); y comparacion de secuencias de AHAS de tipo natural a partir de diferentes variedades de arroz
La secuencia de codificacion de AHAS para Cypress "parental" de tipo natural se presenta a continuacion como la SEQ ID NO 14. La secuencia de aminoacidos inferida para la secuencia de AHAS de tipo natural (Cypress) se enumera a continuacion como la SEQ ID NO 17, correspondiente a la traduccion del marco de lectura abierto de la SEQ ID NO 14.
Se descubrio que con el uso de BLAST para comparar secuencias, existe aproximadamente una identidad del 89 % a nivel de aminoacidos entre la secuencia de AHAS de arroz de tipo natural (SEQ ID NO 17) y la secuencia de AHAS de Zea mays descrita segun el numero de acceso GenBank X63553 (576 aminoacidos de 641).
Es tambien interesante comparar la secuencia codificante de AHAS de tipo natural para el cultivar de arroz Cypress con la secuencia codificante de AHAS de tipo natural descrita por T. Shimizu et al., "Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide sensitive wild type", numero de acceso BLAST AB049822. Las dos secuencias son identicas al 98% a nivel de nucleotidos (1.955 bases de 1.986). Las secuencias de aminoacidos inferidas son identicas al 99 % (640 aminoacidos de 644). La inmensa mayona de las 31 bases que difieren entre las dos secuencias de nucleotidos son mutaciones "silenciosas", es decir, dan lugar a diferentes codones que codifican los mismos aminoacidos. Las diferencias "no silenciosas" se producen en el aminoacido 11 (Cypress, Thr; Kinmaze, Ala); en el aminoacido 293 (Cypress, Arg; Kinmaze, Trp); en el aminoacido 401 (Cypress, Asp; Kinmaze, Gln); y en el aminoacido 643 (Cypress, Met; Kinmaze, Val).
Ejemplo 36 - CMC31 (CACTPTA-903)
La secuencia codificante de AHAS de la lmea CMC31 se secuencio de nuevo, por un conjunto diferente de trabajadores de aquellos que derivaron la SEQ ID NO 1, utilizando el protocolo descrito a continuacion.
Se cultivo 1,0 g de tejido reciente de plantas de semillero jovenes cultivadas en invernadero, y se aislo el ADN genomico utilizando el Maxi kit para plantas DNeasy (Qiagen), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. La cantidad de ADN aislado se midio leyendo la absorbancia a 260 nm. Se utilizaron 100 ng de aDn en una reaccion de PCR disenada para amplificar el extremo 3' de la secuencia codificante de AHAS. Se utilizaron los siguientes cebadores, en base a la secuencia publicada del Oryza sativa var. Kinmaze (GenBank AB049822), para amplificar el extremo 3' de la secuencia codificante: cebador RA7, AGTGGCTGTCTTCGGCTGGTCT (SEQ ID NO 22), y cebador RA5, CCTACCACTACCGTCCTGACACAT (SEQ ID NO 23).
El kit de PCR de alta fidelidad de expansion de Roche se utilizo para amplificar el ADN. El ADN de la reaccion de PCR se verifico para el tamano correcto mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Las bandas del tamano esperado se cortaron del gel, y luego el ADN se purifico utilizando el kit de extraccion de gel QIAquick (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se ligo al ADN vector pCR2.1-TOPO™. Tras el ligamento, el DNA se transformo con OneShot™ en celulas competentes de E. coli. Las celulas se sembraron, y se cultivaron durante la noche. Al dfa siguiente se recogieron las colonias individuales, se volvieron a sembrar, y se estimaron.
Las celulas de E. coli se lisaron mediante la adicion de una pequena cantidad de celulas a 20 ml de agua, y calentamiento a 95 °C durante 5 minutos. PCR se realizo entonces en las celulas lisadas con los cebadores RA7 y RA5 y Taq polimerasa. Las colonias que dieron positivo para el ADN insertado se cultivaron durante la noche, y se preparo ADN a partir de estos cultivos utilizando el kit de plasmido miniprep de Qiagen. El ADN se comprobo de nuevo por digestion con las enzimas de restriccion PstI y HindIII.
El ADN se secuencio por el metodo BigDye terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador RA7 se utilizo en la reaccion de secuenciacion (en la direccion directa). La secuenciacion se realizo en un instrumento Perkin Elmer 377. Las secuencias se analizaron utilizando Vector NTI Suite 6.
La secuencia resultante se presenta a continuacion como la SEQ ID NO 16. Esta vez, la secuencia mostro la misma sustitucion de nucleotido unico G-A, dando lugar a la misma sustitucion de Ser-Asn en la posicion del aminoacido 627, como se aprecio para cada una de las lmeas PWC16, PWC23, CMC29, WDC33, WDC38.
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La razon de la discrepancia entre la SEQ ID NO 1 y la SEQ ID NO 16 para la lmea CMC31 es actualmente desconocida. A partir de la fecha de presentacion de la presente solicitud, el escenario mas probable es que la delecion/mutacion por el desplazamiento del marco de lectura mostrada en la SEQ ID NO 1 sea correcta, y que la sustitucion de Ser-Asn implicada por la SEQ ID NO 16 sea resultado de algun error experimental actualmente desconocido, por ejemplo, etiquetado erroneo de un paquete de semillas. Tambien es posible, aunque se considera actualmente menos probable, que la lmea CMC31 tenga la misma sustitucion de Ser-Asn apreciada en las otras lmeas. La secuenciacion reiterada de la secuencia codificante de AHAS a partir de semillas que se confirma se trata de la lmea CMC31 que permitira aclarar esta discrepancia.
Ejemplo 37 - WDC37 (CACT PTA-907)
Se aislo ADN de la lmea WDC37, se clono, y se secuencio como se ha descrito previamente para CMC31 (concretamente, el metodo que utiliza los cebadores RA5 y RA7), a excepcion de que el ADN de la lmea WDC37 se secuencio por secuenciacion didesoxi automatizada, generalmente de acuerdo con el metodo de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU, vol. 74, pags. 5463-5467 (1977). Las reacciones se realizaron con el kit de secuenciacion de ciclo Prism Big Dye terminator de Applied Biosystems (Foster City, CA) con ADN polimerasa FS AmpliTaq y se sometieron a electroforesis en un secuenciador de ADN Prism 377 de Applied Biosystems.
Hasta la fecha, la mutacion responsable de la resistencia a herbicidas en WDC37 no se ha identificado. Las secuencias obtenidas hasta la fecha del tipo natural han sido indistinguibles. Los posibles motivos para ello incluyen semillas marcadas erroneamente, efectos de segregacion que causan que las secuencias de AHAs de tipo natural se recojan de vez en cuando en la lmea resistente a herbicidas, o una mutacion en una parte diferente de la molecula de AHAS procedente de la orientada selectivamente por los cebadores de PCR, RA5 y RA7. Las repeticiones de estos esfuerzos de secuenciacion, utilizando una semilla nueva confirmaron que se trata de WDC37, e incluyen que la totalidad de la secuencia de codificacion de AHAS aclarara esta discrepancia.
Ejemplos adicionales
Tambien se determinaran (o se volveran a determinar) las secuencias completas de ADN y las secuencias de aminoacidos inferidas de las moleculas de AHAS para cada una de las plantas de arroz que tienen numeros de acceso CACT 97523, 203419, 203420, 203421, 203422, 203423, 203424, 203425, 203426, 203427, 203428, 203429, 203430, 203431, 203432, 203433, PTA-904, PTA-905, PTA-902, PTA-906, PTA-907, y PTA-908, utilizando, en general, protocolos similares, u otras tecnicas conocidas adecuadamente en la materia.
La secuenciacion preliminar de la secuencia codificante de AHAS de CACT n.° 97523 (93AS3510) ha sido concluyente. La secuencia determinada inicialmente era identica a la secuencia de tipo natural Cypress. El motivo para este resultado es actualmente desconocido, ya que la lmea 93AS3510 tema claramente una enzima AHAS resistente determinada por el ensayo enzimatico modificado de Singh et al. descrito previamente. Es posible que los trabajadores del laboratorio hayan cometido un error experimental desconocido, tal como una sustitucion inadvertida de la lmea parental susceptible "AS3510" con la lmea resistente "93AS3510", debido a la similitud de sus nombres. La continuacion del trabajo en las lmeas que se han descrito previamente en general resolvera esta discrepancia.
Clonacion en otras plantas verdes.
Se pueden utilizar estas y otras secuencias de nucleotidos de AHAS resistente a herbicidas, clonadas de plantas de arroz para transformar una resistencia a herbicidas en otras plantas de arroz, asf como la transformacion de otras plantas verdes en general para impartir resistencia a herbicidas. La resistencia a herbicidas puede introducirse en otras plantas de arroz, por ejemplo, por cultivo tradicional, retrocruzamiento, y seleccion; o mediante la transformacion de cultivares con las secuencias de nucleotidos de AHAS resistentes clonadas. La transformacion directa de cultivares de arroz tiene el potencial de permitir la introduccion rapida de las caractensticas de resistencia a herbicidas en una variedad, sin requerir multiples generaciones de cultivo y retrocruzamiento para alcanzar la uniformidad.
Es mas, al menos en el caso del arroz transformado a traves del vector preferente de la patente de Estados Unidos n.° 5.719.055, algunos individuos han manifestado que gran parte de la preocupacion sobre la conveniencia de la transformacion genetica de las especies agncolas debena atenuarse. La transformacion de una variedad de arroz con una secuencia de nucleotidos de otra planta de arroz solamente acelerana lo que tambien podna lograrse a traves de tecnicas de cultivo tradicionales. No podnan introducirse secuencias codificantes exogenas a plantas de arroz, simplemente se producina la introduccion eficaz de un alelo de AHAS de arroz de otra planta de arroz. El uso del vector de la patente de Estados Unidos n.° 5.719.055 permite la introduccion de unicamente la secuencia codificante deseada, sin que se introduzcan otras secuencias codificantes en el genoma. No seran necesarios genes resistentes a antibioticos u otros marcadores: la seleccion de acontecimientos de transformacion exitosos puede basarse directamente en la propia resistencia a herbicidas. Como se explica con mas detalle en la patente de Estados Unidos n.° 5.719.055, las unicas secuencias que deben introducirse ademas de la secuencia de nucleotidos de interes son las secuencias de insercion flanqueantes reconocidas por la transposasa utilizada por el vector. Las secuencias de insercion no son en sf secuencias codificantes, y son inertes en ausencia de la transposasa; es mas,
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el vector se concibe para que la transposasa no sea codificada por cualquier ADN que se inserta en el cromosoma transformado. La unica porcion del ADN transformado que sera activa siguiendo la transformacion es la propia secuencia de nucleotidos de AHAS resistente. Esta secuencia de nucleotidos de AHA se deriva del arroz, de modo que las plantas de arroz transformadas no son "transgenicas" en el sentido habitual de la realizacion del ADN codificante de otra especie.
Los expertos en la materia entenderan que las secuencias de acido nucleico de las enzimas AHAS mutantes resistentes con numeros de acceso de la CACT 97523, 203419, 203420, 203421, 203422, 203423, 203424, 203425, 203426, 203427, 203428, 203429, 203430, 203431,203432, 203433, PTA-904, PTA-905, PTA-902, PTA-903, PTA- 906, PTA-907, y PTA-908 no son las unicas secuencias que se pueden utilizar para conferir resistencia. Tambien se contemplan las secuencias de acido nucleico que codifican protemas identicas pero que, debido a la degeneracion del codigo genetico, poseen diferentes secuencias de nucleotidos. El codigo genetico puede encontrarse en numerosas referencias relativas a la genetica o a la biologfa, incluyendo, por ejemplo, la Figura 9.1 en la pagina 214 de B. Lewin, Genes VI (Oxford University Press, Nueva York, 1997). La Figura 9.3 de la pagina 216 de Lewin ilustra directamente la degeneracion del codigo genetico. Por ejemplo, el codon para la asparagina puede ser AAT o AAC.
Las secuencias pueden transformarse en una planta de interes con o sin algunos o todos los intrones de los genes de AHAS de Oryza sativa nativa, que puede identificarse por medios adecuadamente conocidos en la materia. Los intrones pueden afectar a la regulacion de la expresion genica.
Los productos de expresion se orientan selectivamente de forma preferente a los cloroplastos, que se cree que son el principal sitio para la actividad de AHAS de tipo natural en las plantas verdes. La secuencia senal de direccionamiento corresponde normalmente al extremo amino-terminal del producto de expresion de protemas, y por lo tanto, la secuencia codificante correspondiente debena aparecer aguas arriba del extremo 5' de la secuencia codificante. Esta orientacion selectiva se consigue preferentemente con la secuencia de senal de AHAS Oryza sativa nativa, aunque tambien puede utilizar otras secuencias de senal del cloroplasto de plantas conocidas en la materia, tales como, por ejemplo, las divulgadas en Cheng et al., J. Biol. Chem., vol. 268, pags. 2363-2367 (1993); vease tambien Comai et al., J. Biol. Chem., vol. 263, pags. 15104-15109 (1988).
Asimismo se describen secuencias de nucleotidos que codifican las protemas de AHAS que tienen uno o mas cambios de aminoacidos silenciosos en porciones de la molecula no involucradas con la resistencia o la funcion catalftica. Por ejemplo, se contemplan las alteraciones en la secuencia de nucleotidos que dan como resultado la produccion de un aminoacido qmmicamente equivalente en un sitio dado; por consiguiente, un codon para el aminoacido alanina, un aminoacido hidrofobo, puede sustituirse con un codon que codifica otro residuo hidrofobo, tal como glicina, o puede sustituirse con un residuo mas hidrofobo, tal como valina, leucina, o isoleucina. De manera similar, tambien se puede esperar que los cambios que dan lugar a la sustitucion de un residuo cargado negativamente por otro, tal como acido aspartico por acido glutamico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, produzcan un producto biologicamente equivalente. Vease, por ejemplo, la Fig. 1.8 en la pagina 10 de Lewin (1997), que muestra la naturaleza de las cadenas laterales de los 20 aminoacidos "convencionales" codificados por el codigo genetico. (Tenga en cuenta tambien un error tipografico en esta figura publicada, concretamente, la abreviatura de glutamina debe ser "Gln").
Se describen ademas secuencias de nucleotidos quimericos, en los que la porcion mutada de una secuencia de nucleotidos de AHAS de arroz resistente se recombina con porciones inalteradas de la secuencia de nucleotidos de AHAS de otra especie.
Ademas, no solo se describe una enzima AHAS funcional que tiene la secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos de AHAS resistente, mutante descrita en la presente memoria descriptiva, incluyendo, por ejemplo, la de una de las plantas de arroz identificadas depositadas ante la CACT, sino tambien a una enzima que tiene modificaciones en una secuencia tal que da lugar a una secuencia de aminoacidos que tiene la misma funcion (es decir, una enzima AHAS funcional, con resistencia al menos a algunos herbicidas que normalmente interfieren con AHAS), y aproximadamente 60-70 %, preferentemente 90 % o mas de homologfa con la secuencia de la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de nucleotidos de AHAS de al menos una de dicha lmea de arroz depositada ante la CACT, mas preferentemente de manera aproximada 95 % o mas de homologfa, en particular, en regiones conservadas, tales como, por ejemplo, un sitio de union de herbicida aparente. "Homologfa" significa sustituciones identicas o conservadoras de aminoacidos (por ejemplo, acido para acido, basico para basico, polar para polar, no polar para no polar, aromatico para aromatico). El grado de homologfa puede determinarse por el alineamiento simple en base a los programas conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, GAP y PILEUP por GCG, o el programa BLAST disponible en el sitio web NIH. Mas preferentemente, un cierto porcentaje de "homologfa" sera el porcentaje de aminoacidos identicos.
Una mutacion puntual particular deseada puede introducirse en una secuencia codificante de AHAS utilizando metodos de mutagenesis dirigida al sitio conocidos en la materia. Veanse, por ejemplo, R. Higuchi, "Recombinant PCR", pags. 177-183 en M. Innis et al. (Eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); patente de Estados Unidos n.° 6.010.907; Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., vol. 82, pags. 488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol., vol. 154, pags. 367-382 (1987); patente de Estados Unidos n.° 4.873.192;
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Walker et al. (Eds.), Techniques in Molecular Biology (MacMillan, Nueva York, 1983); o los protocolos Genoplasty™ de ValiGen (Newtown, PA).
Las secuencias aisladas de ADN de AHAS de la presente invencion son utiles para transformar plantas de cultivo diana, y, de este modo, conferir resistencia. Un amplio intervalo de tecnicas existe actualmente para lograr la transformacion directa o indirecta de plantas superiores con ADN exogeno, y cualquier metodo por el cual una de las nuevas secuencias puede incorporarse en el genoma del huesped, y heredarse de forma estable por su progenie, se contempla por la presente invencion.
La secuencia de codificacion de AHAS clonada debe colocarse en el control de un promotor adecuado, por lo que se expresa apropiadamente en las celulas de la planta transformada. Se espera que el promotor mas adecuado sea un promotor de AHAS nativo. El promotor de AHAS nativo podna ser de cualquier planta, por ejemplo, el promotor de AHAS nativo de la planta que esta transformandose. Alternativamente, se espera que el promotor de AHAS de arroz nativo funcione adecuadamente en otras plantas verdes en general (incluyendo, por ejemplo, tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas), y que por simplicidad, el mismo promotor de AHAS de arroz pueda utilizarse cuando se realice la transformacion de cualquier especie de planta de interes.
El promotor de AHAS nativo, si se trata de arroz o de otra planta, puede aislarse de la siguiente manera. ADNc de AHAS se afsla y se amplifica, por ejemplo, por PCR o por clonacion en una bacteria, tal como E. coli o Agrobacterium, y se desnaturaliza en un aDn monocatenario. Una biblioteca genomica se prepara para el arroz o para otra planta de interes utilizando tecnicas convencionales, y la transferencia Southern se utiliza para hibridar segmentos de ADN genomico al ADNc de AHAS. Los segmentos de ADN hibridizante se amplifican por PCR y se secuencian. El promotor se encontraran en los segmentos aguas arriba del sitio de iniciacion de la transcripcion.
Tenga en cuenta que no es necesario identificar la secuencia del promotor de AHAS con precision. Cuando la secuencia aguas arriba, que constituye el promotor, no se ha identificado con precision, el promotor, sin embargo, se incluira tomando un numero suficientemente grande de bases "aguas arriba" del sitio de iniciacion de la transcripcion. El hecho de que las bases "extra" tambien puedan incluirse ademas en el promotor es aceptable. El numero de bases aguas arriba necesarias para abarcar un promotor particular puede determinarse con facilidad en un caso particular, y por los motivos ya dados, el numero preciso de bases no es crucial. En general, las secuencias de aproximadamente 500, 1.000, o 1.500 bases aguas arriba del sitio de iniciacion de la transcripcion debe ser suficiente en la mayona de los casos.
Como alternativa adicional, un promotor constitutivo podna utilizarse para controlar la expresion de la secuencia codificante de AHAS mutante transformada. Los promotores que actuan de forma constitutiva en plantas se conocen adecuadamente en la materia, e incluyen, por ejemplo, el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor.
La transformacion de celulas vegetales puede mediarse por el uso de vectores. Un metodo comun para la transformacion de plantas es el uso de Agrobacterium tumefaciens para introducir una secuencia de nucleotidos extrana en la celula vegetal diana. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos de AHAS mutante se inserta en un vector plasirndico que contiene las secuencias flanqueantes en el plasmido Ti del ADN-T. El plasmido se transforma entonces en E. coli. Un apareamiento triparental se lleva a cabo entre esta cepa, una cepa de Agrobacterium que contiene un plasmido Ti desarmado que contiene las funciones de virulencia necesarias para efectuar la transferencia de las secuencias de ADN-T que contienen AHAS en el cromosoma de la planta diana, y una segunda cepa de E. coli que contiene un plasmido que tiene las secuencias necesarias para producir la transferencia de la construccion de AHAS desde E. coli a Agrobacterium. Para infectar discos de hoja se utiliza una cepa de Agrobacterium recombinante que contiene las secuencias necesarias para la transformacion de plantas. Los discos se cultivan en un medio de seleccion y se identifican los regenerantes transformados con exito. Las plantas recuperadas son resistentes a los efectos de herbicidas cuando se cultivan en su presencia.
Los virus de plantas tambien proporcionan un posible medio para transferir ADN exogeno.
Tambien puede utilizarse la captacion directa de ADN en celulas de plantas. Normalmente, los protoplastos de la planta diana se colocan en un cultivo en presencia del ADN a transferir, junto con un agente que favorece la captacion de ADN en protoplastos. Tales agentes incluyen, por ejemplo, polietilenglicol y fosfato de calcio.
Alternativamente, la captacion de ADN puede estimularse por electroporacion. En este metodo, se utiliza un impulso electrico para abrir de forma temporanea los poros de la membrana celular de un protoplasto, y el ADN en la solucion circundante se crea en la celula a traves de los poros. Del mismo modo, puede utilizarse microinyeccion para introducir el ADN directamente en una celula, de forma preferente, directamente en el nucleo de la celula.
En muchas de estas tecnicas, la transformacion se produce en una celula vegetal en cultivo. Despues del acontecimiento de transformacion, las celulas vegetales deben regenerarse en plantas completas. Las tecnicas para la regeneracion de plantas maduras a partir de cultivos de callos o protoplastos se conocen para un gran numero de especies de plantas. Vease, por ejemplo, Handbook of Plant Cell Culture, vols. 1-5, 1983-1989 McMillan, N. Y.
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Tambien se disponen metodos alternativos que no requieren necesariamente el uso de celulas aisladas y las tecnicas de regeneracion de plantas para lograr la transformacion. Estos se conocen generalmente como metodos "baKsticos" o de "aceleracion de partmulas", en los que las partmulas metalicas recubiertas con ADN se impulsan a las celulas vegetales mediante una carga de polvora (vease Klein et al., Nature 327:70-73, 1987) o por una descarga electrica (vease el documento EPO 270 356). De esta manera, pueden transformarse de forma estable las celulas vegetales en cultivo o celulas u organos reproductores de las plantas, por ejemplo, polen, con la secuencia de ADN de interes.
En ciertas dicotiledoneas y monocotiledoneas, la captacion directa de ADN es el metodo preferente de transformacion. Por ejemplo, en el mafz o en el arroz, la pared celular de las celulas cultivadas se digiere en un tampon con una o mas enzimas que degradan la pared celular, tales como celulasa, hemicelulasa, y pectinasa, para aislar protoplastos viables. Los protoplastos se lavan varias veces para eliminar las enzimas degradantes, y luego se mezclan con un vector plasmfdico que contiene la secuencia de nucleotidos de interes. Las celulas pueden transformarse con PEG (por ejemplo, PEG 4000 al 20 %) o por electroporacion. Los protoplastos se colocan en un filtro de nitrocelulosa y se cultivan en un medio con celulas de mafz embebidas que funcionan como cultivos de alimentacion. Despues de 2-4 semanas, los cultivos del filtro de nitrocelulosa se colocan en un medio que contiene herbicida y se mantienen en el medio durante 1-2 meses. Los filtros de nitrocelulosa con las celulas vegetales se transfieren cada dos semanas a un medio fresco con herbicidas y celulas nodrizas. Las celulas no transformadas dejan de crecer y mueren al cabo de un tiempo.
Otros metodos de transformacion de plantas se describen en B. Jenes et al., y en S. Ritchie et al., en S.-D. Kung et al. (Eds.), Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich (1993); y en L. Mannonen et al., Critical Reviews in Biotechnology, vol. 14, pags. 287-310 (1994). Vease tambien las diversas referencias citadas en las paginas 15-17 de la solicitud de patente internacional publicada WO 00/26390, cada una de las cuales se incorpora por referencia.
Un vector de transformacion particularmente preferente, que puede utilizarse para transformar semillas, celulas germinales, plantas completas, o celulas somaticas de las monocotiledoneas o dicotiledoneas, es el vector basado en transposon divulgado en la patente de Estados Unidos n.° 5.719.055. Este vector puede introducirse en las celulas vegetales por medio de una de las tecnicas descritas previamente o, por ejemplo, a traves de liposomas que se fusionan con las membranas de los protoplastos de las celulas vegetales.
La presente invencion puede aplicarse para transformar practicamente cualquier tipo de planta verde, tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas. Entre las plantas de cultivo y otras plantas para las que se contempla la transformacion para la resistencia a herbicidas son, (por ejemplo) arroz, mafz, trigo, mijo, centeno, avena, cebada, sorgo, girasol, patata dulce, yuca, alfalfa, cana de azucar, remolacha azucarera, canola y otras especies de hortaliza del genero Brassica, girasol, tomate, pimiento, soja, tabaco, melon, lechuga, apio, berenjena, zanahoria, calabaza, melon, pepino y otras cucurbitaceas, judfas, col y otras crudferas, patata, tomate, cacahuete, guisante, otras verduras, algodon, trebol, cacao, uva, dtricos, fresas y otras frutas del bosque, arboles frutales, y arboles de frutos secos. Las nuevas secuencias tambien pueden utilizarse para transformar cesped, especies ornamentales, tales como petunia y rosa, y especies lenosas, tales como pino y alamo.
Purificacion, analisis, y secuenciacion enzimatica
Los datos preliminares (descritos a continuacion) sugieren que el arroz puede producir al menos tres isozimas AHAS diferentes, que presumiblemente podran codificarse por secuencias de nucleotidos de AHAS diferentes en el genoma del arroz, aunque los experimentos completados a partir de la fecha de presentacion de la presente solicitud aun no descartan la posibilidad de que diferentes isozimas puedan ser codificadas por un unico gen, aunque se produjeran por vfas separadas, tales como corte y empalme alternativo de ARNm, o procesamiento post- traduccional alternativo de polipeptidos. Por cierto, se cree que la presente solicitud de patente es el primer informe publicado en el que el arroz parece tener al menos tres isozimas AHAS diferentes. Para conocimiento del inventor, es la primera vez que se informa que el arroz tema mas de una forma de la enzima AHAS.
La secuencia obtenida para la primera isozima podra utilizarse para preparar cebadores para amplificar y secuenciar las otras isozimas, ya sea a partir de ADN genomico o de ADNc. Se pueden obtener mayores niveles de resistencia en plantas que transportan alelos resistentes en multiples secuencias de nucleotidos de AHAS. Dichas plantas pueden cultivarse con facilidad por cruce y retrocruzamiento a traves de medios conocidos en la materia, o por mutagenesis dirigida al sitio. Incluso pueden obtenerse mayores niveles de resistencia mediante el cruce de un "mutante doble" o un "mutante triple" con las lmeas de arroz metabolicamente resistentes a herbicidas divulgadas en la patente de Estados Unidos n.° 5.545.822, como se tipifica por el arroz que tiene el numero de acceso CACT 75295, como se ha discutido previamente, ya que su resistencia metabolica se basa en un mecanismo separado actualmente desconocido.
Los datos preliminares de isozimas descritos a continuacion sugieren que la resistencia apreciada en algunas de las nuevas lmeas puede haberse producido a partir de mutaciones de diferentes isozimas AHAS. Por ejemplo, en la lmea de Cypress parental no resistente, la isozima AHAS-1 aparente (definida a continuacion) pareda representar
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aproximadamente el 25 % de la actividad total, y AHAS-2 aparente y AHAS-3 aparente paredan representan aproximadamente el 75 % de la actividad total. En cambio, en CACT 97523, AHAS-1 aparente pareda representar aproximadamente el 75 % de la actividad total, junto con AHAS-2 aparente y AHAS-3 aparente que paredan representar aproximadamente el 25 % de la actividad total; y AHAS-1 aparente PWC23 pareda representar aproximadamente el 95 % de la actividad total, junto con AHAS-2 aparente y AHAS-3 aparente que paredan representar aproximadamente el 5 % de la actividad total.
Se plantea la hipotesis de que los productos finales de aminoacidos del proceso catalizado por AHAS-1 pueden causar la supresion de la realimentacion de AHAS-2 y AHAS-3 en las lmeas con actividades bajas en las dos ultimas isozimas.
Ademas, la actividad total de AHAS en muchas de las lmeas resistentes nuevas supero a la lmea parental de Cypress no resistente.
Nota preliminar: Se cree que el arroz posee multiples isozimas AHAS, tal vez dos o tres de estas isozimas. Los procedimientos descritos en el presente tttulo ("Purificacion, analisis, y secuenciacion enzimatica") se llevaron a cabo para tratar de separar las diferentes isozimas. Puesto que se llevaron a cabo estos experimentos, el inventor ha tenido conocimiento (B. J. Singh, comunicacion privada) de que estos procedimientos de separacion de isozima particulares, pueden estar sujetos a artefactos, a errores experimentales. A partir de la fecha de presentacion de la presente solicitud del Tratado de Cooperacion de Patentes internacional, esta cuestion no se ha resuelto de manera satisfactoria para el inventor. Si bien se cree que el arroz tiene multiples isozimas AHAS, los datos experimentales particulares descritos en esta seccion, relativa a la purificacion y a la separacion enzimatica, pueden o no ser una senal fiable de la actividad isozimatica AHA. Si estos datos experimentales particulares resultan no ser fiables, a continuacion, otros procedimientos de purificacion y separacion enzimaticas conocidos en la materia pueden sustituirse. Ademas, es importante tener en cuenta que los otros resultados descritos en la presente solicitud de patente no dependen de si los datos de isozimas descritos en la presente seccion son correctos o incorrectos.
Los procedimientos utilizados para separar las isozimas acetohidroxiacido sintasas en arroz entre sf eran sustancialmente como se describe en B. Singh et al., "Separation and Characterization of Two Forms of Acetohydroxyacid Synthase from Black Mexican Sweet Corn Cells", J. Chromatogr., vol. 444, pags. 251-261 (1988). Las celulas de suspension, o los tejidos del brote de las plantas cultivadas en invernaderos en la etapa de desarrollo de 3-4 hojas, se utilizaron para la extraccion enzimatica cruda. Para la extraccion de las celulas de suspension, se recolectaron 16 gramos de celulas 8 dfas despues del subcultivo de los cultivos de suspension de Cypress. Despues de la granulacion de la enzima cruda, la enzima se volvio a suspender en 25 mM de tampon fosfato potasico (pH = 7,0) que contiene 5 mM de piruvato, 5 mM de EDTA, y 5 pM de DFA (dinucleotido de flavina adenina). Las isozimas se separaron a continuacion por HPLC en un cromatografo Waters 600 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) en un caudal de eluyente de 1 ml por minuto. Despues de la filtracion a traves de un filtro de jeringa de 45 pm Millex (Millipore, Bedford, MA), se cargaron 2,00 ml de cada muestra en una columna Mono Q HR 5/5 (5 x 0,5 cm)
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) que se habfa pre-equilibrado con el mismo tampon. Despues de la inyeccion y la elucion de 5 ml de eluyente, se inicio un gradiente lineal de 20 minutos de cloruro potasico 0-0,5 M en tampon equilibrado. Fracciones de un ml se recogieron y se ensayaron para determinar la actividad de la enzima AHAs. Se utilizan de forma opcional procedimientos de purificacion adicionales que son convencionales en la materia, tal como electroforesis en gel o separaciones por HPLC adicionales.
De esta manera se han ensayado varias lmeas de arroz. Las lmeas resistentes restantes se ensayaron de la misma manera. Cada una de las lmeas muestreadas parece tener al menos tres isozimas AHAS. Se observaron diferencias entre las lmeas con respecto a la actividad total de la enzima AHAS, al nivel general de resistencia a herbicidas, y a la actividad de las isozimas individuales.
La Tabla 9 representa cualitativamente las actividades relativas apreciadas en varias lmeas para las tres isozimas aparentes que se han designado provisionalmente "AHAS-1", "AHAS-2", y "AHAS-3". (La numeracion corresponde al orden en el que se eluyeron las enzimas desde la HPLC).
Tabla 9 - La actividad de la isozima AHAS relativa se describio cualitativamente en una escala de 5 puntos en
base a la absorbancia a 520 nm
- Cypress CACT 97523 PWC16 PWC23 CMC29 CMC31 WDC33
- AHAS-1
- 1 2 0 5 3 0+ 0+
- AHAS-2
- 1 0+ 1 0 0+ 1 0+
- AHAS-3
- 2 0+ 1 + 0+ 1- 2 0+
Para preparar isozimas AHAS aisladas para la secuenciacion directa de aminoacidos, se utilizaron los mismos protocolos como se ha descrito previamente, a excepcion de que se combinaron almuotas de cuatro ensayos separados por la HPLC (4 inyecciones, 2 ml/inyeccion). Las almuotas combinadas se concentraron por evaporacion
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fna del ftquido utilizando un Savant Insfruments SpeedVac (Farmingdale, NY). Las muestras concentradas se ejecutaron a continuacion, a traves de una columna de desalacion PD-10 Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) antes de la liofilizacion. La secuencia de aminoacidos de cada una de los tres isozimas se determinara por degradacion de Edman. (La aftcuota combinada 4 x 1,0 ml = 4,0 ml que tiene el pico mas alto para cada isozima se selecciono para la secuenciacion de aminoacidos, en el supuesto de que esta aftcuota tuviese una concentracion relativamente alta y una concentracion relativamente pura de la isozima particular).
La tecnica de degradacion de Edman y las tecnicas de analisis proteico relacionadas se conocen adecuadamente en la materia pepftdica. En pocas palabras, el residuo amino-terminal de un polipeptido se etiqueta y se escinde a partir del peptido sin alterar los enlaces pepftdicos entre los otros restos de aminoacidos. La degradacion de Edman elimina de forma secuencial un residuo a la vez desde el extremo amino de un polipeptido. El isotiocianato de fenilo reacciona con el grupo amino-terminal no cargado del peptido para formar un derivado de feniltiocarbamoil. En condiciones acidas, un derivado dclico del aminoacido terminal se libera, dejando un peptido intacto acortado por un aminoacido. El compuesto dclico es un aminoacido de feniltiohidantoma (PTH). El aminoacido de PTH se identifica entonces mediante procedimientos convencionales. Vease, en general, R. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology, pags. 731-741, y 764-773 (1995).
Los resultados de la secuenciacion del polipeptido se utilizaran para complementar los resultados de la secuenciacion de ARNm por RT-PCR como se ha descrito previamente. Las secuencias de aminoacidos se confirmaran mediante el diseno de cebadores de ADN de las secuencias parciales de aminoacidos observadas, la clonacion de las secuencias de nucleotidos de AHAS a partir de bibliotecas genomicas o de ADNc de tipo natural y lmeas de arroz mutante, y la secuenciacion de las secuencias de nucleotidos asf clonadas. Las secuencias tambien se confirmaran mediante la comparacion de la complementariedad de las secuencias determinadas para las cadenas positivas y las cadenas negativas de cada una.
Los datos de la secuencia de aminoacidos se utilizaran para disenar cebadores para la amplificacion por PCR de las isozimas AHAS aparentes, junto con los datos de la secuencia codificante de AHAS conocida (por ejemplo, SEQ ID NO. 14). Ademas, es posible a traves de tecnicas convencionales digerir la protema en trozos mas pequenos, que luego se secuencian individualmente para dar secuencias de aminoacidos para las regiones internas de la protema.
Mecanismos de accion propuestos
Nota preliminar: La discusion en el presente tftulo ("Mecanismos de accion propuestos") esta sujeta a las mismas advertencias mencionadas en el tftulo previo en relacion a los protocolos de purificacion y separacion de isozimas que se han utilizado hasta la fecha. La validez de los otros datos descritos en el presente documento no depende de estos mecanismos de accion propuestos.
Sin desear quedar ligado a la teona presentada en esta seccion, las siguientes hipotesis son consistentes con los datos de isozimas preliminares descritos en el tftulo previo: el arroz parece tener al menos tres isozimas AHAS, isozimas que se producen normalmente por una planta de arroz en diferentes niveles de actividad. A excepcion de CACT 75295, las mutaciones descubiertas por el presente inventor para la resistencia a herbicidas en el arroz parecen ser mutaciones en las propias enzimas AHAS, en lugar de mutaciones procedentes de otra fuente, tales como una mutacion en una via metabolica o una mutacion en la regulacion de un gen de AHAS. En algunos de los mutantes resistentes, al menos en ausencia de herbicida, los niveles de actividad relativos de las tres isozimas AHAS no parecen estar sustancialmente alterados en comparacion con los de tipo natural, tal vez porque la mutacion de resistencia en estas lmeas aparece en la isozima "predominante". En al menos uno de los mutantes resistentes, las actividades relativas de las tres isozimas paredan ser inferiores a las de tipo natural.
Por otra parte, existen mutantes resistentes en los que una de las isozimas "alternativas" parece producirse preferentemente, por razones desconocidas. El aumento de la actividad de esta isozima mutante provoca una inhibicion de la retroalimentacion de las otras dos isozimas; es decir, los niveles mas altos de los productos aminoacidos que resultan de la actividad de la isozima mutante inhiben la expresion de las otras dos isozimas a traves de mecanismos de retroalimentacion reguladores normales.
El herbicida parece actuar por una union fuerte (o incluso irreversible) a la molecula de AHAS. Esta union no elimina completamente la actividad de AHAS, incluso AHAS de tipo natural, aunque la union al herbicida reduce la actividad (~50 %) lo suficiente como para destruir las celulas vegetales de tipo natural. Parece que hay un punto de "saturacion" en la concentracion del herbicida, por ejemplo, ~10 pM (en funcion del herbicida), por encima del cual la actividad de la enzima de tipo natural no disminuye sustancialmente.
En cambio, incluso en concentraciones de herbicidas muy superiores, por ejemplo, incluso hasta ~1.000 pM, la actividad de algunas de las enzimas AHAS mutantes es aun mas o menos comparable a la actividad de la enzima de tipo natural en ausencia de cualquier herbicida, lo que sugiere que la enzimas AHAS mutantes no se unen a los herbicidas con tanta fuerza. Sin embargo, incluso las enzimas de AHAS mutantes que muestran normalmente una fuerte resistencia a los herbicidas que actuan sobre AHAS, son susceptibles a algunos de los herbicidas que actuan sobre AHAS. Esta propiedad indica que la resistencia de la enzima a ciertos herbicidas se debe a una afinidad de
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union mas debil entre los herbicidas y la enzima mutante; y no, por ejemplo, a la sobreproduccion de pre-herbicida de los aminoacidos catalizados por AHAS que permite que las celulas vegetales sobrevivan en "reservas" de los aminoacidos hasta que el efecto del herbicida haya desaparecido. Era tal la superproduccion responsable de la resistencia a herbicidas, que cabna esperar entonces de forma generalizada una resistencia a todos los herbicidas que actuan sobre AHAS.
Miscelanea
Mediante practicas de cultivo habituales en la materia, se cultivara la progenie de cada una de las lmeas de arroz parentales resistentes identificadas previamente. Una vez identificada la progenie que es demostrablemente resistente, esta progenie se utilizara para cultivar variedades de uso comercial. El cruce o el retrocruzamiento de plantas resistentes con otros germoplasmas por medios convencionales produciran variedades e hforidos resistentes a herbicidas que tienen buena productividad y otras propiedades agronomicamente deseables. Alternativamente, puede emplearse la transformacion directa en una variedad o en un padre de un hfbrido que tiene propiedades agronomicamente deseables, a medida que la transformacion directa pueda acelerar la seleccion global y los procesos de cultivo.
Puesto que el arroz rojo y el arroz comercial pertenecen a la misma especie, la plantacion de un cultivo de arroz comercial resistente a herbicidas conlleva algunos riesgos de que la resistencia a herbicidas se transfiera al arroz rojo. No obstante, el arroz se autopoliniza, y la frecuencia de exogamia es baja, incluso entre plantas inmediatamente adyacentes que florecen en sincroma. La probabilidad de transferir la resistencia al arroz rojo podna minimizarse mediante el cultivo de variedades resistentes que florecen significativamente antes que el arroz rojo (por ejemplo, utilizando tecnicas de cultivo convencionales, o mediante cultivo tisular, tal como cultivo de antera). Por ejemplo, sera deseable el mantenimiento de un fenotipo de maduracion temprana en variedades resistentes para reducir la probabilidad de exogamia con el arroz rojo. Ademas, los niveles mas altos de resistencia en el cultivo (por ejemplo, mediante lmeas de cruce entre diferentes isozimas AHAS con otras, o lmeas de cruce con enzimas AHAS resistentes con la resistencia metabolica de la CACAT 75295) permitiran el control del arroz rojo producido por exogamia aplicando tasas de herbicida superiores a las que el arroz rojo producido por exogamia tolerara.
No obstante, en caso de desarrollase una cepa de arroz rojo resistente a los mismos herbicidas al igual que el arroz comercial resistente, las plantas siempre pueden tratarse con un amplio intervalo de otros herbicidas disponibles - particularmente si el arroz rojo resistente se descubriera pronto, antes de tener mas oportunidades para propagarse.
Las tecnicas identicas o analogas han de emplearse para inhibir la exogamia de la resistencia a herbicidas en "malezas" o relativos salvajes de otras especies de cultivo.
Puesto que cada uno de los herbicidas ensayados inhibe la actividad de la acetohidroxiacido sintasa, y puesto que la resistencia de cada uno de estos herbicidas se ha demostrado en las nuevas lmeas, se espera que el nuevo arroz resistente a herbicidas muestre resistencia a otros herbicidas que normalmente inhiben esta enzima. Ademas de los discutidos previamente, dichos herbicidas incluyen otros de las clases imidazolinona y sulfonilurea, incluyendo al menos los siguientes: primisulfuron, clorosulfuron, imazametabenz-metil, y triasulfuron. Otras clases de herbicidas de AHAS conocidos en la materia incluyen triazolopirimidinas, triazolopirimidina sulfonamidas, sulfamoilureas, sulfonilcarboxamidas, sulfonamidas, pirimidiloxibenzoatos, ftalidas, pirimidilsalicilatos, carbomoilpirazolinas, sulfonilimino-triazinil heteroazoles, valilanilidas N-protegidas, sulfonilamida azinas, acidos pirimidil maleicos, bencenosulfonil carboxamidas, sulfonildiamidas sustituidas y ubiquinona-o.
Como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresion “condiciones que inducen a la mutacion” se refiere a condiciones que provocaran mutaciones en el genoma de una planta a velocidades sustancialmente superiores a la velocidad antecedente. Los especialistas en la materia conocen adecuadamente varias de estas condiciones. Incluyen, por ejemplo, la exposicion de las semillas a mutagenos qmmicos o la radiacion de ionizacion como se ha descrito anteriormente. Dichas condiciones tambien incluyen celulas de crecimiento en cultivos tisulares (cultivos de antera, cultivos de callo, cultivos de suspension, cultivos de protoplastos, etc.), con o sin exposicion deliberada de las celulas a condiciones adicionales que inducen a la mutacion diferentes de las inherentes en el cultivo tisular. (Se sabe que el cultivo tisular es propicio per se para la produccion de variabilidad genetica, incluyendo mutaciones). En funcion de las condiciones particulares que inducen a la mutacion utilizadas, las mutaciones pueden inducirse mejor en las diferentes etapas del ciclo de vida, por ejemplo, con semillas secas, con semillas pre-germinadas, etc.
Como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, el termino “imidazolinona” significa una composicion herbicida que comprende uno o mas compuestos qmmicos de las clase imidazolinona, incluyendo, a modo de ejemplo y sin limitacion, 2-(2-imidazolin-2-il)piridinas, 2-(2-imidazolin-2-il)quinolinas y 2-(2-imidazolin-2-ilo) benzoatos o derivados de los mismos, incluyendo sus isomeros, diastereoisomeros y/o tautomeros opticos que exhiben actividad herbicida, incluyendo, a modo de ejemplo y sin limitacion, acido 2-[4,5-dihidro-4-metil-4-(1- metiletil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-3-quinolincarboxflico (nombre generico imazaquin); acido 2-[4,5-dihidro-4-metil-4-(1- metiletil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-5-etil-3-piridincarboxflico (nombre generico imazetapir); y acido 2-[4,5-dihidro-4- metil-4-(1-metiletil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-5-(metoximetil)-3-piridincarboxflico (nombre generico imazamox); acido 2-
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[4,5-dihidro-4-metil-4-(1-metiletil)-5-oxo-1H-immidazol-2-il]-3-pindincarboxflico (nombre generico imazapir); acido 2- [4,5-dihidro-4-metil-4-(1-metiletil)-5-oxo-1H-immidazol-2-il]-5-metil-3-piridincarbox^lico (nombre generico imazameth, tambien conocido como imazapic); y los otros ejemplos de herbicidas de imidazolinona presentados en la memoria descriptiva.
Como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, el termino “sulfonilurea” significa una composicion herbicida que comprende uno o mas compuestos qmmicos de la clase sulfonilurea, que comprende generalmente un puente de sulfonilurea, -SO2NHCONH-, que se une a dos anillos aromaticos o heteroaromaticos, incluyendo, a modo de ejemplo y sin limitacion, 2-(((((4,6-dimetoxipiridin-2-il) aminocarbonil))aminosulfonil))-N,N- dimetil-3-piridincarboxamida (nombre generico nicosulfuron); 3-[4,6-bis(difluorometoxi)-pirimidin-2-il]-1-(2- metoxicarbonilfenilsulfonil) urea (nombre generico primisulfuron); ester metilico del acido 2-[[[[(4,6-dimetil-2- pirimidinil)amino]carabonil]amino]sulfonil]benzoico (nombre generico sulfometuron-metil); 2-[[[[(4-metoxi-6-metil- 1,3,5-triazin-2-il)amino]carbonil]amino]sulfonil]benzoato de metilo (nombre generico metsulfuron-metil); metil-2-[[[[N- (4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il) metilamino]carabonil]amino]sulfonil]benzoato (nombre generico tribenuron-metil); metil-3-[[[[(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il)amino]carbonil]amino]sulfonil]-2-tiofencarboxilato (nombre generico
tifensulfuron-metil); 2-cloro-N-[(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il)aminocarbonil]bencenosulfonilamida (nombre
generico clorsulfuron); 2-[[[[(4-cloro-6-metoxipirimidin-2-il)amino]carbonil]amino]sulfonil benzoato de etilo (nombre generico clorimuron-etil); 2-[[[[N-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il)metilamino]carbonil]amino]sulfonil benzoato de metilo (nombre generico tribenuron-metil); 3-(6-metoxi-4-metil-1,3,5-triazin-2-il)-1-[2-(2-cloroetoxi)-fenilsulfonil]-urea (nombre generico triasulfuron); y los otros ejemplos de herbicidas de sulfonilurea presentados en la memoria descriptiva.
Como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, el termino “planta” tiene por objeto incluir plantas en cualquier fase de madurez, asf como cualquier celula, tejido u organo cogido o derivado de cualquiera de dichas plantas, incluyendo sin limitacion, cualquier embrion, semilla, hoja, tallo, flor, fruto, rafz, tuberculo, celulas individuales, gametos, cultivos de antera, cultivos de callo, cultivos de suspension, otros cultivos tisulares, o protoplastos. A menos que el contexto indique claramente lo contrario, el termino "planta" tiene por objeto referirse a un organismo fotosintetico o planta verde que incluye algas, musgos, helechos, gimnospermas, y angiospermas. El termino excluye, no obstante, tanto las procariotas como las eucariotas que no realizan la fotosmtesis, tales como levadura, otros hongos, y las llamadas plantas rojas y plantas marrones que no realizan la fotosmtesis.
A menos que el contexto indique claramente lo contrario, el "genoma" de una planta se refiere a todo el contenido de la secuencia de ADN de la planta, incluyendo cromosomas nucleares, cromosomas mitocondriales, cromosomas de cloroplastos, plasmidos, y otro ADN extra-nuclear o extra-cromosomico. Si, por ejemplo, se incorpora una secuencia de nucleotidos de resistencia a herbicidas en las celulas de una planta transformada en un plasmido u otro elemento genetico que de otro modo no podna mantenerse y heredarse de manera consistente por la planta y su progenie, entonces el propio rasgo de resistencia a herbicidas puede utilizarse para aplicar una presion selectiva sobre dichas plantas para mantener el fenotipo y genotipo de resistencia a herbicidas. Se considera que dicha planta tiene la secuencia de nucleotidos de resistencia a herbicidas en su "genoma" en la contemplacion de esta definicion.
A menos que el contexto indique claramente lo contrario, la "progenie" de una planta incluye una planta de cualquier generacion posterior cuyo linaje puede seguirse hasta la planta.
A menos que el contexto indique claramente lo contrario, un "derivado" de una planta resistente a herbicidas incluye tanto la progenie de esta planta resistente a herbicidas, segun se ha definido previamente el termino "progenie"; como tambien cualquier mutante, recombinante o derivado modificado por ingeniena genetica de esa planta, ya sea de la misma especie o de especies diferentes; cuando, en cada caso, las caractensticas de resistencia a herbicidas de la planta original resistente a herbicidas se hayan transferido a la planta derivada. Por consiguiente, un "derivado" de una planta de arroz con una enzima AHAS resistente incluira, a modo de ejemplo y sin limitacion, cualquiera de las siguientes plantas que expresan la misma enzima AHAS resistente: plantas de arroz de progenie F1, plantas de arroz de progenie F2 y plantas de arroz de progenie F30, una planta de mafz transgenica transformada con una secuencia de nucleotidos resistente a herbicidas de la planta de arroz resistente.
Se debe entender que las siguientes definiciones se aplican a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Una secuencia de acido nucleico "aislada" es una secuencia oligonucleotidica que se situa fuera de una celula viva. Una celula que comprende una secuencia de acido nucleico "aislada" es una celula que se ha transformado con una secuencia de acido nucleico que en un momento se localizo fuera de una celula viva; o una celula que es la progenie, o un derivado, de dicha celula.
Una enzima AHAS "funcional" o "normal" es aquella que es capaz de catalizar la primera etapa de la via para la smtesis de los aminoacidos esenciales isoleucina, leucina, y valina; independientemente de si la enzima expresa resistencia a herbicidas.
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Una planta "resistente" es aquella que produce una enzima AHAS funcional, y que es capaz de alcanzar la madurez cuando se cultiva en presencia de niveles normalmente inhibidores de un herbicida que inhibe normalmente AHAS. El termino "resistente" o "resistencia", como se utiliza en el presente documento, tambien tiene por objeto incluir plantas "tolerantes", es decir, las plantas que muestran fenotipicamente reacciones adversas pero no letales a uno o mas herbicidas de AHAS. Una enzima AHAS "resistente" es una enzima AHAS funcional que retiene sustancialmente mas actividad que la enzima AHAS de tipo natural en presencia de niveles normalmente inhibidores de un herbicida de AHAS, medios mediante ensayos in vitro de las actividades de las enzimas respectivas. Una planta "de tipo natural" o "sensible" es aquella que produce una enzima AHAS funcional, en la que la planta es sensible a niveles normalmente inhibidores de un herbicida que inhibe normalmente AHAS. Una planta "resistente" es una planta que es resistente a niveles normalmente inhibidores de un herbicida que inhibe normalmente AHAS (debido a la enzima AHAS resistente o a cualquier otro mecanismo de resistencia en la planta). Tenga en cuenta que en la contemplacion de esta ultima definicion, las plantas "de tipo natural" incluyen variedades cultivadas; la designacion "de tipo natural" se refiere a la presencia o ausencia de niveles normales de sensibilidad a herbicidas, y en el contexto de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones, el termino "de tipo natural" no posee connotacion alguna sobre si una planta particular es el producto de cultivo o de una seleccion artificial, o sobre si se encuentra en la naturaleza en un estado no cultivado.
Una enzima AHAS "de tipo natural" o una secuencia AHAS "de tipo natural" es una enzima AHAS o una secuencia de ADN que codifica una enzima AHAS, respectivamente, que no confiere resistencia a herbicidas. Por consiguiente, en el alcance de esta definicion, una AHAS de "tipo natural" puede, por ejemplo, contener una o mas mutaciones, siempre que las mutaciones no confieran resistencia a herbicidas. En algunas especies, tales como arroz, como se aprecio por ejemplo en las variedades Kinmaze y Cypress, mas de una AHAS de tipo natural puede existir naturalmente en diferentes variedades. Una AHAS de "tipo natural" incluye, por ejemplo, cualquiera de estas multiples enzimas AHAS de diferentes variedades. Una AHAS de "tipo natural" tambien incluye, por ejemplo, un hubrido de dos o mas de estas enzimas AHAS de tipo natural. (Un "hubrido" de diferentes enzimas AHAS corresponde exactamente a al menos una de las enzimas "parentales" en cada aminoacido en su secuencia, por ejemplo, una AHAS que es identica al AHAS de Kinmaze en los aminoacidos 1 a 300. y que es identica a la AHAS de Cypress en el aminoacido 301 al extremo carboxi).
Notas sobre la nomenclatura de herbicidas - el siguiente listado presenta los nombres comerciales, los nombres genericos, y los nombres qmmicos de diversos herbicidas: Pursuit™ o Newpath™ (imazetapir: acido (±)-2-[4,5- dihidro-4-metil-4-(1-metiletil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-5-etil-3-piridincarboxflico); Scepter™ (imazaquin: acido 2-[4,5- dihidro-4-metil-4-(1-metiletil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-3-quinolincarboxflico); Accent™ (nicosulfuron: 2-(((((4,6- dimetoxipirimidin-2-il)aminocarbonil)) aminosulfonil))-N,N-dimetil-3-piridincarboxamida); Beacon™ (primisulfuron: 3- [4,6-bis(difluorometoxi)-pirimidin-2-il]-1-(2-metoxicarabonilfenilsulfonil) urea); Raptor™ (imazamox: acido (±)-5- metoximetil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) nicotmico); Cadre™ (imazapic: acido (±)-2-[4,5-dihidro-4- metil-4-(1-metil-etil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-5-metil-3-piridincarboxflico; nombre qrnmico alternativo acido (±)-2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotmico); Arsenal™ (imazapir: acido 2-[4,5-dihidro-4-metil-4-(1- metiletil)-5-oxo-1H-imidazol-2-il]-3-piridincarboxflico); Oust™ (sulfometuron-metil: nombre qrnmico ester metflico del acido 2-[[[[(4,6-dimetil-2-pirimidinil)amino]carbonil]amino]sulfonil]benzoico); Ally™ (metsulfuron-metil: 2-[[[[(4-metoxi- 6-metil-1,3,5-triazin-2-il)amino]carbonil]amino]sulfonil]benzoato de metilo); Harmony™ (mezcla de tifensulfuron-metil y tribenuron-metil; mezcla de metil-3-[[[[(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il) amino]carbonil]amino]sulfonil]-2- tiofencarboxilato y metil-2-[[[[N-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il) metilamino]carbonil]amino]sulfonil]benzoato); Pinnacle™ (tifensulfuron-metil: metil-3-[[[[(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il) amino]carbonil]amino]sulfonil]-2- tiofencarboxilato); Glean™ o Telar™ ^jjclorsulfuron; 2-cloro-N-[(4-metoxi-6-metil-1,3,5-tria-zin-2-il)-
aminocarbonil]bencenosulfonamida); Classic™ (clorimuron-etil: 2-[[[[(4-cloro-6-metoxipirimidin-2-
il)amino]carbonil]amino]sulfonil benzoato de etilo); Express™ (tribenuron-metil: 2-[[[[N-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin- 2-il)metilamino]carbonil]amino]sulfonil benzoato de metilo); Assert™ (imazametabenz-metil: acido m-toluico, 6-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-metil ester; y acido p-toluico, 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)- metil ester); y Amber™ (triasulfuron: 3-(6-metoxi-4-metil-1,3,5-triazin-2-il)-1-[2-(2-cloroetoxi)-fenilsulfonil]-urea); Staple™ (piritiobac-sodio; 2-cloro-6-[(4,6-dimetoxi pirimidin-2-il)tio]benzoato de sodio); y Matrix™ (rimsulfuron: N- ((4,6-dimetoxipirimidin-2-il)aminocarbonil)-3-(etilsulfonil)-2-piridinsulfonamida).
Nota sobre la regla de numeracion de aminoacidos utilizados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones: como se utiliza en las reivindicaciones, y como se utiliza en la memoria descriptiva a menos que el contexto indique claramente lo contrario, los aminoacidos de AHAS de arroz se numeran conforme corresponde a la numeracion mostrada para la secuencia de AHAS de tipo natural (Cypress) (SEQ ID NO 17), o la posicion correspondiente en otras secuencias codificantes de AHAS en las que existen variaciones (tales como las apreciadas en el presente documento para la variedad Kinmaze). En particular, la posicion del aminoacido 627 es el aminoacido correspondiente al aminoacido 627 en la SEQ iD NO 17, que es el residuo de serina proximo al extremo carboxi- terminal en la AHAS de arroz de tipo natural. Las posiciones de los nucleotidos se indican generalmente de forma indirecta, por referencia al numero del aminoacido codificado por un codon particular. Por ejemplo, el codon en la secuencia codificante de AHAS de tipo natural (Cypress) que corresponde al aminoacido 627 es el codon AGT que aparece en la SEQ ID NO 14 en los nucleotidos 1.879-1.881. En cambio, en la secuencia de tipo natural (Kinmaze) de la SEQ ID NO 2, este codon aparece en los nucleotidos 1.926-1.928. Las posiciones de los aminoacidos y las posiciones de nucleotidos correspondientes para otras especies se determinan por homologfa - por ejemplo, el
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aminoacido o el codon que se encuentra en la posicion que es homologa al aminoacido 627 (serina de tipo natural) en el arroz, o al codon correspondiente. Dicha homologfa puede determinarse por un software utilizado habitualmente en la materia, tal como GAP, PILEUP, o BLAST.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Board of Supervisors of Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College Croughan, Timothy
<120> RESISTENCIA A HERBICIDAS QUE INHIBEN LA ACETOHIDROXlACIDO SINTASA
<130> 98A9.2-PCT Croughan
<150> US 60/203.434 <151>
<160> 23
<170> PatentIn version 3.0
<210> 1 <211>1095 <212>ADN <213> Oryza sativa
<220>
<221> misc_feature
<223> Secuencia AHAS parcial, lmea CMC31 <400> 1
- ggcacggcgc
- ccgattctct atgtcggtgg tggctgctct gcatctggtg atgaattgcg 60
- ccggtttgtt
- gagctgaccg gcatcccagt tacaaccact ctgatgggcc tcggcaattt 120
- ccccagtgat
- gatccgttgt ccctgcgcat gcttgggatg catggcacgg tgtacgcaaa ISO
- ttatgcggtg
- gataaggctg acctgttgct tgcatttggc gtgcggtttg atgatcgtgt 240
- gacagggaaa
- attgaggctt ttgcaagcag ggccaagatt gtgcacattg acattgatcc 300
- agcggagatt
- ggaaagaaca agcaaccaca tgtgtcaatt tgcgcagatg ttaagcttgc 3 SO
- tttacagggc
- ttgaatgctc tgctagacca gagcacaaca aagacaagtt ctgattttag 420
- tgcatggcac
- aatgagttgg accagcagaa gagggagttt cctctggggt acaagacttt 480
- tggtgaagag
- atcccaccgc aatatgctat tcaggtgctg gatgagctga cgaaagggga 540
- ggcaatcatc
- gctactggtg ttggacagca ccagatgtgg gcggcacaat attacaccta 600
- caagcggcca
- cggcagtggc tgtcttcggc tggtctgggc gcaatgggat ttgggctgcc 660
- tgctgcagct
- ggtgcttcfcg tggctaaccc aggtgtcaca gttgttgata ttgatgggga 720
- tggtagcttc
- ctcatgaaca ttcaggagtt ggcattgatc cgcattgaga acctcccggt 780
- gaaggtgatg
- gtgttgaaca accaacattt gggtatggtt gtgcaatggg aggataggtt 840
- ttacaaggca
- aatagggcgc atacatactt gggcaaccca gaatgtgaga gcgagatata 900
- tccagatttt
- gtgactattg ctaaagggtt caatattcct gcagtccgtg taacaaagaa 960
- gagtgaagtc
- cgtgccgcca tcaagaagat gctcgagacc ccagggccat acttgttgga 1020
- tatcatcgtc
- ccacaccagg agcatgtgct gcctatgatc ccaaaggggg cgcattcaag 1080
- gacatgatct
- ggagg 1095
<210>2 <211> 2301 5 <212>ADN
<213> Oryza sativa
<220>
<221> misc_feature
10 <223> Secuencia AHAS de tipo natural, variedad Kinmaze
<300>
<308> BLAST / AB049822 <309> 15
<400> 2
- cccaaaccca
- gaaaccctcg ccgccgccgc cgccgccacc acccaccatg gctacgaccg 60
- ccgcggccgc
- ggccgccgcc ctgtccgccg ccgcgacggc caagaccggc cgtaagaacc 120
- accagcgaca
- ccacgtcctt cccgctcgag gccgggtggg ggcggcggcg gtcaggtgct 180
- c<?gcggtgtc
- cccggtcacc ccgccgtccc cggcgccgcc ggccacgccg ctccggccgt 240
- gggggccggc
- cgagccccgc aagggcgcgg acatcctcgt ggaggcgctg gagcggtgcg 300
Claims (19)
- 51015202530354045505560651. Un acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos de una acetohidroxiacido sintasa (AHAS) de arroz funcional, donde:la AHAS codificada exhibe una resistencia a al menos un herbicida de imidazolinona y a al menos un herbicida de sulfonilurea que interfieren normalmente con la AHAS de arroz de tipo natural;la AHAS codificada tiene una sustitucion de serina a asparagina en la posicion del aminoacido 627 de la SEQ ID NO: 17; y la AHAS codificada es identica a la AHAS de tipo natural que comprende la secuencia de aminoacidos tal como la mostrada por la SEQ ID NO: 17, a excepcion de la sustitucion de serina a asparagina que esta presente en dicha AHAS codificada.
- 2. El acido nucleico de la reivindicacion 1, donde dicho acido nucleico es un acido nucleico aislado.
- 3. El acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el herbicida se selecciona entre el grupo que consiste en imazetapir, imazapic, imazameth, imazapir, nicosulfuron, sulfometuron-metil, imazaquin, primisulfuron, imazamox, clorimuron-etil, metsulfuron-metil, rimsulfuron, tifensulfuron-metil, tribenuron-metil, y derivados de estos herbicidas.
- 4. Un acido nucleico que comprende una secuencia tal como la mostrada por la SEQ ID NO: 18; o que comprende una secuencia que codifica la misma secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia tal como la mostrada por la SEQ ID NO: 18 de acuerdo con la degeneracion del codigo genetico.
- 5. El acido nucleico segun la reivindicacion 4, donde dicho acido nucleico comprende la SEQ ID NO: 18.
- 6. El acido nucleico de la reivindicacion 1, donde la sustitucion de serina a asparagina en la posicion 627 se codifica por una sustitucion inducida por un mutageno en dicho acido nucleico.
- 7. El acido nucleico de la reivindicacion 1, donde la AHAS codificada tiene la sustitucion de serina a asparagina en la posicion del aminoacido 627 de la SEQ ID NO: 17 como resultado de una mutacion inducida por un tratamiento mutagenico con ester etflico del acido metanosulfonico (EMS).
- 8. Un vector de transformacion que comprende el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
- 9. Una construccion de acido nucleico que comprende un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la secuencia se une operativamente a un promotor que es funcional en las plantas.
- 10. La construccion de acido nucleico de la reivindicacion 9, donde dicho promotor es un promotor de AHAS de planta nativo.
- 11. La construccion de acido nucleico de la reivindicacion 9 o 10, donde dicho promotor es un promotor AHAS de arroz nativo.
- 12. La construccion de acido nucleico de la reivindicacion 9, donde dicho promotor es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.
- 13. Un metodo para conferir a una planta una resistencia a al menos un herbicida de imidazolinona y a al menos un herbicida de sulfonilurea que interfieren normalmente con la AHAS de arroz de tipo natural, que comprende la incorporacion de la construccion de acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en el genoma de una planta.
- 14. Una planta que comprende el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 15. La planta de la reivindicacion 14, donde la planta se transforma con la construccion de acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, opcionalmente mediante un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en Agrobacterium tumefaciens, captacion directa de ADN, electroporacion, microinyeccion o transformacion balfstica.
- 16. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, donde la planta es una planta de arroz.
- 17. Un proceso para controlar las malezas en la vecindad de una planta segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, expresando dicha planta una AHAS que exhibe una resistencia a al menos un herbicida de imidazolinona y a al menos un herbicida de sulfonilurea como se define en la reivindicacion 1, comprendiendo dicho proceso la aplicacion de un herbicida a las malezas y a la planta, donde el herbicida inhibe normalmente la acetohidroxiacido sintasa, a niveles del herbicida que inhiben normalmente el crecimiento de una planta de tipo natural de la misma especie.
- 18. El proceso de la reivindicacion 17, donde el herbicida se selecciona entre el grupo que consiste en imazetapir, imazapic, imazameth, imazapir, nicosulfuron, sulfometuron-metil, imazaquin, primisulfuron, imazamox, clorimuron- etil, metsulfuron-metil, rimsulfuron, tifensulfuron-metil, piritiobac-sodio, tribenuron-metil, y derivados de estos herbicidas.5
- 19. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la planta es una semilla que comprende el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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