CN102770544B - 制备包含几丁质的植物细胞壁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了改变植物次生细胞壁的反应性，尤其棉花纤维中存在的棉花细胞壁的反应性的方法和工具。这可通过在棉花植物中表达编码同丝水霉几丁质合酶的嵌合基因方便地实现。

Description

制备包含几丁质的植物细胞壁的方法
发明领域
本发明涉及改变植物细胞壁(例如次生植物细胞壁)的反应性。具体地，本发明提供了包含带正电多糖(例如几丁质和壳聚糖)的棉纤维。这些棉纤维具有改变的反应性，所述改变的反应性可被利用以便用纤维反应性染料将纤维染色。另外，可应用所述改变的反应性来提高纤维与反应物(如阻燃剂、水、拒油剂以及拒污剂、软化剂、抗静电剂、荧光增白剂等)的反应性。
发明背景
人类数千年来一直使用天然纤维，包括含有纤维素的、来自植物(例如棉花和亚麻)的天然纤维，以生产许多不同种类的纺织品。随着要求的增加以及纤维质量的改进，基于棉花的全球纺织工业发展迅速。现今，棉花提供了约45％的全球服装，并且许多最好的时装店都使用由高质量棉花制成的纺织品。棉纤维由纤维素组成，所述纤维素是由许多葡萄糖分子组成的天然聚合物。棉纤维独特的结构理想地适合于纺织品生产。每根纤维基本上都是几厘米长的中空管，当纺织和编织时提供非常特别的特征性棉“感”。然而，因为由β-1-4连接的葡萄糖单体组成的纤维素相对惰性的性质，所以含有纤维素的天然纤维不具有合成纤维的化学多功能性。这种相对惰性性质在棉纤维和织物的染色过程中是明显的。直接染料和纤维反应性染料是用于棉花着色的两类阴离子染 料。棉花本身在水中产生阴离子电荷，使得不用特殊处理，纤维或织物即可非常巧妙地吸收染料。直接染料与纤维素聚合物建立了相对较弱的氢键，形成半永久性连接，这是因为它经不起彻底洗涤。纤维反应性染料是将发色团与反应性基团组合在一起的分子，所述反应性基团通过与羟基反应而与纤维形成强共价键。共价键提供了染色的纤维对洗涤的良好的抗性。在染色过程期间，需要大量电解质来保护这些阴离子染料免受阴离子纤维电荷的影响。未反应的经水解的染料(多达40％)需要通过洗涤步骤去除，从而产生也含有上文提到的电解质的大量废水。
对纤维素纤维提供正电荷(例如通过掺入带正电的化合物)可因此改进天然纤维素纤维的可染性，并且改进改性纤维素纤维与带负电的化合物的任何化学反应。还将可能使用酸性染料。
一些出版物已经描述了将壳聚糖寡聚物涂布在纤维素纤维上以产生壳聚糖/纤维素掺合物、纱线或织物。壳聚糖是带正电的葡糖胺聚合物，其可以通过几丁质的脱乙酰作用，例如通过碱处理来获得。几丁质本身是β-1-4连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的聚合物。
Liu等人(Carbohydrate Polymers44(2003)233-238)描述了用壳聚糖对棉纤维进行表面涂布的化学方法。具有了这种壳聚糖涂层，棉纤维表面变得具有生理学和生物学活性，这是因为氨基的化学反应性导致对纤维进行随后的化学修饰的可能性更大。基于壳聚糖抑制例如皮肤真菌的生理功能，许多功能性衣服、织物以及纤维都采用纤维素-壳聚糖掺合纤维、纤维素纤维-壳聚糖缀合物、以及涂有含壳聚糖树脂的织物。
WO00/09729描述了在植物中表达几丁质合酶和几丁质脱乙酰酶基因以改变细胞壁，供工业应用并且提高抗病性。特别提到的用途是：提供纤维素、几丁质以及壳聚糖的单个植物来源，增加拉伸强度并增加脆断。特别提出的几丁质合酶基因源自真菌生物。既没提供关于在植物中产生几丁质或壳聚糖的实验数据，也没提供关于在植物细胞壁中掺入几丁质或壳聚糖的实验数据。WO2006/136351显示，WO00/09729中所提出的策略并不能导致将几丁质功能性地掺入到植物细胞壁中。而WO2006/136351公开了只有当真菌几丁质合酶(来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))主动重新定位至高尔基体时，才在棉纤维的次生细胞壁中有效地产生几丁质。通过将这种真菌几丁质合酶与对高尔基体特异的信号锚序列有效地融合，并且在植物中表达所得的嵌合基因，实现几丁质合酶主动重新定位至高尔基体。虽然几丁质可在棉花植物的细胞壁中有效地产生，但还观察到转基因植物依然较小，推定是因为嵌合几丁质合酶在棉花中的棉纤维外部的表达具有毒性。
因此，仍然需要备选方法，以产生包含带正电多糖的植物细胞壁(例如次生细胞壁)。具体地，存在提供用于产生纤维的方法的需要，所述纤维可以直接从植物中收获、并且含有带正电的化学基团和/或反应性比纤维素的羟基更强的基团，并且不需引入此类的化学基团的进一步化学处理即可直接应用，并且其中转基因植物不显示生长迟缓。如下文在不同实施方案、实例以及权利要求书中所描述的解决了这些以及其他问题。
发明概述
本发明显示，在植物细胞中表达源自同丝水霉(Saprolegnia monoica)的几丁质合酶(这种酶没有与高尔基体靶向信号有效地连接)，可使N-乙酰葡糖胺聚合物有效地掺入到植物细胞壁、尤其植物次生细胞壁中。在不同的实施方案、实例以及权利要求书中所描述的本发明提供了水霉属几丁质合酶以及包含于表达盒中的它的嵌合基因，所述表达盒可以用于用带正电多糖修饰植物细胞壁。因此，本发明的第一目标提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1或它的互补序列具有至少97％的同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述几丁质合酶多肽与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。在又一个实施方案中，本发明提供了嵌合基因，其包含以下有效连接的DNA区：a)植物可表达的启动子，b)与SEQ ID NO：1或它的互补序列具有至少97％的同一性的核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性的几丁质合酶多肽的核苷酸序列，以及c)转录终止以及多聚腺苷酸化区。在另一个实施方案中，嵌合基因包含组成型启动子。在又一个实施方案中，嵌合基因包含纤维选择性启动子。在又一个实施方案中，嵌合基因包含扩展蛋白启动子。在又一个实施方案中，本发明提供了如之前实施方案中任一个所定义的嵌合基因。在又一个实施方案中，本发明提供了基本上由植物细胞组成的植物，植物细胞包含如之前实施方案中任一个所定义的嵌合基因。在特定实施方案中，植物是棉花植物。在又一个实施方案中，本发明提供了从根据本发明 的植物获得的纤维。在又一个实施方案中，本发明提供了包含如之前实施方案中任一个所定义的嵌合基因的转基因种子。在又一个实施方案中，本发明提供了制备包含带正电多糖的植物细胞壁的方法，所述方法包括在植物中表达根据之前实施方案中任一个的嵌合基因，并且分离所述植物细胞壁。在特定的实施方案中，所述方法提供了棉花植物的细胞壁。在又一个特定的实施方案中，所述方法提供了存在于棉纤维中的棉花植物的细胞壁。。
附图
图1：
图1a显示了经罗丹明缀合的几丁质结合探针染色的未转化的成熟毛状体(拟南芥)，而图1b显示了经罗丹明缀合的几丁质结合探针染色的包含SmCHS2嵌合基因的重组成熟毛状体(拟南芥)。观察到与几丁质结合探针的明显反应，这是因为重组毛状体(图1b)的染色比源自对照植物的毛状体(图1a)更强。重组毛状体中红点的存在，证明有几丁质(图1b)，而未转化的毛状体中无红点(图1a)。
本发明的不同实施方案的详细描述
本发明是基于以下值得注意的发现：在植物细胞中表达编码几丁质合酶的同丝水霉基因导致N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)聚合物被有效地掺入到植物细胞壁中。编码几丁质合酶的同丝水霉基因不需要与高尔基体靶向定位信号有效地连接(或融合)，而在WO2006/136351中的粗糙脉孢菌几丁质合酶是需要的。在本发明 中，观察到几丁质(即N-乙酰葡糖胺的聚合物)是在转基因植物的细胞壁、特别是次生细胞壁中产生的。编码几丁质合酶的同丝水霉基因可以用于例如在棉花植物中表达以产生反应性更强的棉纤维。
因此，在第一个实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1或它的互补序列具有至少97％的同一性。SEQ ID NO：1描述了同丝水霉几丁质合酶2(SmCHS2)的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述几丁质合酶多肽与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。SEQ ID NO：2描述了同丝水霉几丁质合酶2(SmCHS2)的氨基酸序列。在具体的实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述几丁质合酶多肽与SEQ ID NO：2具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％或甚至至少99％的同一性。在又一个实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3或它的互补序列具有至少90％的同一性。在具体的实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3或它的互补序列具有至少95％、至少98或甚至至少99％的同一性。SEQ ID NO：3是同丝水霉几丁质合酶1(SmCHS1)。在又一个实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述几丁质合酶多肽与SEQ ID NO：4具有至少80％的同一性。在具 体的实施方案中，本发明提供了包含编码几丁质合酶多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述几丁质合酶多肽与SEQ ID NO：4具有至少85％、至少90％同一性、至少95％、至少98％或甚至至少99％的同一性。SEQ ID NO：4是同丝水霉几丁质合酶1的氨基酸序列。
核酸可以是DNA或单链或双链的RNA。核酸可以化学合成或通过体外或甚至体内生物表达来产生。
可使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺以及常规DNA/RNA合成仪化学合成核酸。RNA合成试剂的供应商是Proligo(Hamburg，德国)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的分部，Rockford，IL，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)、以及Cruachem(Glasgow，UK)。
与本发明的嵌合基因有关的DNA包括cDNA和基因组DNA。
在酶学中，几丁质合酶(EC2.4.1.16)是催化以下化学反应的酶：
UDP-N-乙酰-D-葡糖胺+[1，4-(N-乙酰-β-D-葡糖胺基)]n→UDP+[1，4-(N-乙酰-β-D-葡糖胺基)]n+1
因此，这种酶的两种底物是UDP-N-乙酰-D-葡糖胺和[[[1，4-(N-乙酰-β-D-葡糖胺基)]n]]，而它的两种产物是UDP和[[[1，4-(N-乙酰-β-D-葡糖胺基)]n+1]]。这种酶属于糖基转移酶家族，具体地是己糖基转移酶家族。这种酶类别的系统名称是UDP-N-乙酰-D-葡糖胺：几丁质4-β-N-乙酰葡糖胺基-转移酶。其他常用名称包括几丁 质-UDP N-乙酰葡糖胺基转移酶、几丁质-尿苷二磷酸乙酰葡糖胺基转移酶、几丁质合成酶、几丁质合酶以及反式-N-乙酰葡糖胺苷酶。这种酶参与氨基糖代谢。因此，几丁质是β-1，4-连接的N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)的聚合物。
几丁质合酶1和2(分别描述于SEQ ID NO：3和1中)都源自同丝水霉。水霉属属于卵菌纲(Oomycetes)家族。根据一般形态和生活方式，这一组群传统上被划分为真菌。然而，基于现代观点的分支分类法支持它与真核生物组群—长短鞭毛体中的光合成生物诸如褐藻和硅藻的关系相对密切。源自同丝水霉的几丁质合酶1和2的序列包含约70个氨基酸的保守氨基末端结构域，也称为MIT结构域。MIT结构域是包含约70个氨基酸的保守结构域，具有交替的保守疏水区与极性区，和预测的螺旋二级结构，所述二级结构在涉及微管结合与胞内运输的蛋白质中首先被鉴定出。将这类结构域命名为MIT结构域(包含在微管相互作用和运输分子内)。MIT结构域还存在于以下蛋白质中：分选连接蛋白、核硫醇蛋白酶PalBH、具有类似结构域结构的AAA蛋白痉挛蛋白(spastin)和古细菌蛋白、液泡分选蛋白以及其他。MIT结构域的确切分子功能尚不清楚。并非意在将本发明局限于特定的作用模式，认为同丝水霉的几丁质合酶中存在的MIT结构域是转基因植物的细胞壁中几丁质的有效合成的原因。之前在WO2006/136351中已显示，真菌来源的几丁质合酶(例如粗糙脉孢菌几丁质合酶)必须通过将真菌几丁质合酶与高尔基定位信号有效地偶联以适应于获得转基因植物的细胞壁中几丁质的有效合成。因为MIT结构域存在于几个其他几丁质合酶中，尤其存在于一些 源自卵菌纲的几丁质合酶中，所以本发明提供了天然包含MIT结构域的几丁质合酶用于在植物次生细胞壁中制备几丁质的用途。此类天然包含MIT结构域的几丁质合酶包括寄生水霉(Saprolegnia parasitica)的几丁质合酶，其具有SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24中描述的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中描述的核酸序列编码的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了MIT结构域与不包含MIT结构域的几丁质合酶(例如真菌几丁质合酶，例如非卵菌纲几丁质合酶)的有效地偶联，以生成用于在植物次生细胞壁中有效生产几丁质的嵌合几丁质合酶。换言之，公开的是嵌合基因，其包含编码不含MIT结构域的几丁质合酶多肽的DNA区(该DNA区有效地连接至编码MIT结构域的DNA区，使得表达时产生融合蛋白)、植物可表达的启动子、以及转录终止以及多聚腺苷酸化区。还公开了用于制备包含带正电多糖的植物细胞壁的方法，其包括a)表达嵌合基因，其包含编码不含MIT结构域的几丁质合酶多肽的DNA区(该DNA区有效地连接至一个编码MIT结构域的DNA区，使得表达时产生融合蛋白)；和b)分离a)中所获得的植物细胞壁。
MIT结构域被指定为Pfam家族，编号PF04212。目前，已知495种蛋白质现获悉或预测包含MIT结构域。这些蛋白质的序列可例如从UniProt服务器(http://www.uniprot.org/)用以下UniProt登录号检索，登录号之后是(预测的)MIT结构域在序列中的位置。将所有序列以及尤其是(预测的)MIT结构域的序列以其整体并入作为参考。
C5L7B3/6-74；C5K7I8/6-74；B9PJ69/9-77；B6K9M2/9-77；B9QA65/9-77；A7ASR9/7-74；B6AJD9/4-72；Q5CFS7/1-69；Q5CSB4/3-71；Q4UC87/4-82；B3L9J0/6-74；A5K3I1/6-74；Q8IKQ5/6-74；Q4Z291/6-74；Q4X5E3/6-74；Q7RRP6/6-74；A8IAJ1/7-74；Q6ETH5/5-73；B8AI60/5-73；B9SG62/5-73；B9HVY7/5-73；B9HL02/5-73；B9NGD1/5-73；Q3EDG2/1-41；Q9SGD4/1-41；Q8LKV4/5-73；B6TLN7/5-73；B8A2I4/5-73；B6T3Y2/5-73；A2WKH8/5-73；A2ZP36/5-73；B8A2W9/5-73；A2WKI0/5-73；Q5ZEN9/5-73；Q8LAK9/5-73；Q9ZNT0/5-73；Q9SEA8/5-73；Q1W2L1/5-73；B9HQW8/5-73；B9H1R8/5-73；A5BIG1/5-73；A7R0D5/5-73；A9SGM2/5-73；A9TBU2/5-73；A9P2N1/5-73；B9SCR4/5-73；A4S3E8/8-75；C1ECR7/11-78；C1NA06/11-78；C1E2F1/103-169；B6K5C2/6-74；Q09803/6-74；A8PSV3/1-33；Q5KC30/6-74；Q4PDZ4/6-74；A8N0F3/6-74；B0DXQ0/6-74；A7F3H9/6-74；Q7S0H4/6-74；Q2GQ74/6-74；B2AFE6/6-74；C5FLK6/6-74；C5JDP2/6-74；C5GXE6/6-74；C0NGS1/6-74；C0SHS5/6-74；C1H9G7/6-74；C1GCX1/6-74；C4JW95/6-74；Q1E6C4/6-74；B6QQZ4/6-74；B8M727/6-74；Q2UQD2/6-74；B8MZP8/6-74；A1D7B7/7-75；B0XY62/7-75；Q4WXF8/7-75；Q5B8R9/6-74；Q0CXN9/6-74；B6GYF9/6-74；A2R7C1/6-74；A1CK47/6-74；B2VXZ4/6-65；Q0U7R6/6-74；Q6CEE2/6-74；Q5YKJ0/7-75；C4R134/4-72；Q6FQG5/6-74；Q9C1F4/6-74；B3LKD3/6-74；A6ZX48/6-74；P52917/6-74；B5VTV5/1-34；C5DUT4/6-74；Q6CVM8/6-74；C5DBA6/6-74； A7TH89/6-74；Q758U9/6-74；C4Y9U8/7-75；Q5AGH7/7-75；Q5AG40/7-75；B9WHM5/7-75；A5E2L0/55-123；C5MHK4/5-73；A5DQ68/6-74；A3LVF1/7-75；Q6BPY2/7-75；A9V5Z2/5-73；Q57V58/5-74；Q4E658/5-74；Q4D9C2/5-74；Q4FXF2/5-74；A4I4W4/5-74；A4HHP9/5-74；Q54PT2/6-74；Q4RKZ3/1-69；A8QBQ7/7-76；C3YEH0/5-74；C3ZYE4/31-98；C4Q408/2-71；Q5DBH6/2-71；A8Y1H3/5-74；Q9BL83/5-74；B3RJ28/5-74；A7SK75/5-74；B3MXW2/6-75；Q29H77/6-75；B4NPI4/6-75；B4L2B2/6-75；B3NWZ3/6-75；B4M6S6/6-75；B4R6Q7/6-75；B4I6L5/6-75；Q9Y162/6-75；B4Q2M1/6-75；Q7QFR0/6-75；B0XJH8/6-75；Q17GP3/6-75；B7PVD7/6-75；Q66IY7/5-74；B2GUK1/3-72；B2RCB7/5-74；Q9UN37/5-74；Q08BZ6/5-74；Q4SKA0/1-69Q2HJB1/5-74；Q793F9/5-74；Q8VEJ9/5-74；Q6IRG3/5-74；Q3TDX2/5-74；Q5U4Y4/7-76；Q6DJK7/7-76；Q8AVB9/7-76；B5X7N1/5-74；VPS4B/7-76；A8K4G7/7-76；Q69HW4/7-76；A8K5D8/7-76；O75351/7-76；Q3TN07/7-76；Q6PJZ4/7-76；P46467/7-76；Q4KLL7/7-76；Q3U8P5/7-76；Q0VD48/7-76；Q4RVG5/6-75；Q5ZMI9/4-73；C0H991/95-164；B5X1U4/6-75；Q7SXY0/6-75；A7YYH5/6-75；B2GU12/6-75；A5WWM0/6-75；C0H991/9-78；Q8T127/7-75；B7P0K9/283-324；C3Z907/321-389；A7S4I8/283-324；Q4S8A8/285-352；A4IG43/277-345；A4IID6/279-347；Q4V7Q6/279-347；Q5ZJH6/280-348；B4DFS6/190-258；B4DRQ7/280-348；B2RXK3/280-348；B4DDG2/163-231；B4DQN3/163-231； B4DFT0/291-359；Q3U3Q1/280-348；B2RXB9/280-348；B3RSI2/276-344；B4GNS6/275-343；Q29BD1/275-343；B4NAJ4/275-343；B3M073/275-343；Q86P98/275-343；Q8T0L6/275-343；Q9VHF6/275-343；B3P1R4/275-343；B4QX75/275-343；B4HKF5/275-343；B4PUL9/275-343；B4K4Y3/275-343；B4LW06/275-343；B4JYT0/275-343；B0XAE0/178-246；Q7QEQ2/275-343；Q5C1I1/163-221；C4Q8U0/273-338；B0E7C2/4-72；C4LYN8/4-72；A3DP09/6-74；B8D2W2/9-77；A9A4K6/8-76；B3TCM2/8-75；A0RVT9/8-75；Q877H3/7-75；Q972B3/7-75；Q97ZJ7/7-75；C3MPU4/7-75；C3NE34/7-75；C3NHM9/7-75；C4KH36/7-75；C3MUV6/7-75；C3N5H0/7-75；A4YHC5/7-75；A2BKZ1/9-75；Q9YDF3/7-75；C4LZH7/3-71；A8BSU6/8-77；Q8T6L4/8-77；B8C9Z5/5-73；B8LDI1/5-73；B7GCY6/5-73；Q54CX7/4-72；Q22143/5-70；A8XST3/5-70；Q54CX7/246-316；Q55GN8/5-73；A4QZC1/8-77；A2D8M7/10-80；Q54RJ5/10-79；C4LYH7/2-70；Q8I8X1/16-84；Q54CX7/120-188；Q0UZT0/375-444；C4JEZ5/18-85；Q1E904/19-86；C5FCB8/23-90；C1GDJ4/63-130；C0SAK1/19-86；C1HDA2/19-86；C5JPG7/78-145；C5G855/19-86；A6RHR0/1-68；C0NMG2/1-68；A2QKF2/239-307；B6H2K6/100-168；Q0CFY4/216-284；B0XW44/210-278；A1DG63/193-261；Q4X270/211-279；A1CSH7/266-334；B8NC13/82-150；Q2TZ95/233-301；Q5B0X3/178-246；B8M0Z2/44-113；B6Q8T3/44-113；A7EZ31/1-69；A6S2Q3/293-361；Q7S0P7/402- 470；B2ADU1/368-424；Q2GTY0/352-420；C1E4H7/3-68；C1MPZ7/3-69；C3ZZL4/6-70；B7P5B6/8-73；Q9R1S8/6-71；Q499T5/6-71；Q9Y6W3/6-71；B2RAM2/6-71；Q7Z479/6-71；A0FKG7/6-71；B0FGU2/6-71；B4F6P1/6-71；C0H9M1/6-71；Q4S467/6-71；B3RQK1/8-73；A7RRP7/7-70；Q54JG4/13-81；Q55GN8/176-244；C4LYH7/369-438；Q8I8X1/383-452；B0EV39/371-440；A9V3C1/6-74；A7URZ9/6-72；B0X0P8/1-69；Q16FL8/1-69；Q0IFG1/1-69；B4KNS6/15-76；B4MS07/21-82；B3M8E0/5-71；B4IZ41/4-72；B4KXT1/5-71；B4MFW3/3-71；B4MLA7/3-71；Q29EY7/4-71；B3NG09/3-71；B4PH91/3-71；Q9VZK1/3-71；Q7YU93/3-71；B4QQ18/3-62；B4HTX3/3-71；B3RKL7/450-515；Q7T332/322-390；A9JT54/322-390；A4IIB7/268-336；Q28CB9/261-329；Q63ZH0/269-337；Q0P3R2/270-338；A7SVK8/274-341；Q20821/252-320；A8Y3X4/266-339；Q148E7/275-343；B3KU31/268-336；B2RDR2/268-336；Q9NRS6/268-336；B0CM75/268-336；Q4V896/269-337；Q91WE1/268-336；Q9CW22/63-131；Q6NU31/257-325；KS6C1/239-307；B1APS8/227-295；B3KVM4/239-307；B4DRK0/58-126；Q5R5U6/239-307；KS6C1/238-306；B8JLT3/232-300；Q4RR16/253-353；B4NG93/233-301；B3MTR0/236-304；B3NZ90/246-314；Q9VEA9/242-310；B4QUH5/242-310；B4IB83/242-310；B4PL88/246-314；B4GLM4/255-323；Q293U2/255-323；B4JI50/203-271；B4K7H6/227-295；B4M0W2/211-279； Q7PYF1/252-320；B0X4C2/216-284；Q16ZH6/224-292；Q4RLU8/6-73；Q8R2S1/49-117；B4DSP6/49-117；Q5RA67/49-117；Q9Y6S9/49-117；Q32PG2/49-117；A9RII8/29-104；B8B1Z6/49-124；Q658G8/49-124；B4FVB5/49-124；Q944N4/90-165；A8MRR2/55-130；Q0WMJ4/55-130；O64630/55-130；B9RDF4/52-127；B9IC21/13-88；A7PY13/56-131；A5BB69/56-131；A5BIC4/76-120；A9V1R3/29-100；B3S0V7/15-93；C3XZ15/1-79；C3ZJS8/19-88；B7PXE3/98-174；B4NBP4/237-313；B4M0H8/223-299；B4K799/217-293；B4JII0/234-310；B4G437/239-315；B4QSF0/232-308；B3M301/235-311；B4HGG6/232-308；B3P8A3/232-308；Q298L4/239-315；B4PL32/232-308；Q8I0P1/232-308；Q16IA7/179-255；Q7QBW0/230-306；B0X289/2-60；Q4TCF6/6-91；Q4TCD9/16-91；Q6NW58/83-158；Q6AZT2/110-185；Q05AS3/113-188；Q9QYY8/117-193；Q9UBP0/119-195；A2VDN5/117-193；Q719N1/116-192；Q5ZK92/116-192；B2RYN7/117-192；C3XW83/29-96；B7Q7T2/7-83；A7RQX2/15-88；Q4RRG4/9-85；C0H9Y4/20-96；Q0P3W0/20-96；Q4SG05/11-87；A8WFZ3/15-90；B3DLA2/21-97；Q8R1X6/19-95；Q3TVW1/19-95；A0JNJ3/19-95；Q4R7V2/19-95；Q8N0X7/19-95；B3KMI3/19-95；A8K6Q9/19-95；A2Q8K6/7-77；Q00204/6-77；B8MY71/5-77；Q9Y6Z8/5-77；Q0CUT6/6-77；A1CRW2/6-77；Q1DXZ5/5-72；B6QNP8/12-76；B0DXY2/11-78；Q7QGN5/7-67；B0WDD1/4-67；Q179Z1/4-67；Q179Z0/4-67；B7P5B6/89-157；Q5DBL1/86-142； A8P1B5/37-127；Q9R1S8/86-154；Q7Z479/86-154；B2RAM2/86-154；Q9Y6W3/86-154；A0FKG7/86-154；B0FGU2/86-154；Q499T5/86-154；C0H9M1/86-154；B4F6P1/86-154；Q4S467/86-149；Q6NVT4/42-110；C1BMZ4/11-74；A8PMC5/4-73；Q5D999/6-77；Q5D9R4/6-77；C4Q8N9/35-106；A7RL55/2-70；Q5I0J5/12-79；Q8VDV8/12-79；Q8WV92/12-79；B8ZZL5/12-79；A8YXZ4/12-79；Q6DJ62/7-75；C3XWE6/1-69；B0S8J9/9-77；B5XBB0/7-75；Q4S0N8/9-77；Q54KQ7/168-232；B3RXW5/5-72；A8PZJ1/282-350；C3Z907/423-490；Q4V7Q6/374-442；Q3U3Q1/375-444；B2RXB9/375-444；B4DFT0/386-455；B4DRQ7/375-444；B4DDG2/258-327；B4DFS6/285-354；B4DQN3/258-327；B2RXK3/375-444；A4IG43/372-441；Q5ZJH6/375-444；Q7QEQ2/417-485；B0XAE0/287-363；B3M073/404-479；B4HKF5/399-474；B3P1R4/399-474；B4PUL9/399-474；B4QX75/399-474；B4JYT0/404-479；Q86P98/399-474；Q9VHF6/399-474；Q8T0L6/399-464；Q29BD1/399-474；B4NAJ4/403-478；B4LW06/400-475；B4K4Y3/397-472。另外的MIT结构域包括以下文献中所公开的那些MIT结构域：Ciccarelli等人(2003；Genomics81：437-41)或Patel等人(2002；Nature Genetics31：347-8)或pdb(蛋白质数据库)文档(或相关出版物)：1wfd(Suetake等人；Solution structure of mouse MIT domain)；1wr0(Takasu等人(2005).Biochem Biophys Res Commun，334，460-465.)；1yxr(Scott等人(2005)Proc Natl Acad Sci U S A.102：13813-13818)；2cpt （Suetake等人;Solution structure of MIT domain from human skdl）；2dl1（Suetake等人;Solution structure of MIT domain from human skdl）；2jq9和2jqh（Stuchell-Brereton等人(2007).Nature，449，740-744.），2k3w（C.Kieffer等人(2008).Dev Cell，15，62-73.），2v6x，2v6y（T.Obita等人(2007).Nature，449，735-739.），2w2u（Samson等人(2008).Science，322，1710-1713.），2zam，2zan，2zao（均为Inoue等人(2008).Traffic，9，2180-2189.）或3eab（Yang等人(2008).Nat Struct Biol，15，1278-1286.）。
在此所鉴定的几丁质合酶中，MIT结构域位于SEQ ID NO:4（CHS1）中从103位到171位的氨基酸序列段（对应于SEQ IDNO:20），以及SEQ ID NO:2（CHS2）中从141位到209位（对应于SEQ ID NO:19）的氨基酸序列段。
其他MIT结构域实例显示出与CHS1（SEQ ID NO:4）中存在的MIT结构域（对应于SEQ ID NO:20）以及CHS2（SEQ IDNO:2）中存在的MIT结构域（对应于SEQ ID NO:19）、或UniProt序列或以上所列参考文献中存在的任一个MIT结构域的序列同一性为至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%。在此公开的所有MIT结构域都具有CHS1（SEQ ID NO:4）以及CHS2（SEQ ID NO:2）中存在的MIT结构域的生物学功能。所述生物学功能可以例如如实例中所概述的通过检查包含所述MIT结构域的融合蛋白在植物细胞中的定位来进行评估。
如在此所使用的，术语“序列同一性%”是指最佳比对DNA窗的两个区段之间相同核苷酸的百分比。用于比对比较窗的最佳序列 （Isotianil）、代森锰锌（Mancozeb）、代森锰（Maneb）、叉氨苯酰胺（Metominostrobin）、吡噻菌胺（Penthiopyrad）、啶氧菌酯（Picoxystrobin）、甲基代森锌（Propineb）、丙硫菌唑（Prothioconazole）、百克敏（Pyraclostrobin）、五氯硝基苯（Quintozene）、戊唑醇（Tebuconazole）、氟醚唑（Tetraconazole）、甲基托布津（Thiophanate-methyl）、布洛芬（Trifloxystrobin）。
MIT结构域可以例如与以下几丁质合酶(几丁质UDP-乙酰-葡糖胺基转移酶)中任一项有效地连接，所述几丁质合酶(包括氨基酸)可见于不同数据库，具有以下标识符(登录号)：CHS1_AJECA(P30576)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(I类几丁质合酶1)，来自荚膜组织胞浆菌(Ajellomyces capsulata或Histoplasma capsulatum)；CHS1_AJEDE(P30579)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-氨基葡糖基转移酶1)(I类几丁质合酶1)，来自皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)(皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis))；CHS1_ASPNG(P30581)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(I类几丁质合酶1)，来自黑曲霉；CHS1_BOTCI(P49603)几丁质合酶1(EC 2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(I类几丁质合酶1)，来自灰葡萄孢(贵腐菌)(富氏葡萄孢盘菌)；CHS1_CANAL(P23316)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)，来自白假丝酵母(酵母)；CHS1_CRYNV(O13356)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(IV类几丁质合酶1)。{基因：名称＝CHS1}-新型隐球酵母变种格鲁比(Cryptococcus neoformans var.grubii)(新生线黑粉菌变种格鲁比(Filobasidiella neoformans var.grubii))；CHS1_EMENI(P30583)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-氨基葡糖基转移酶1)(I类几丁质合酶1)(片段)。{基因：名称＝chs1}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHS1_EXODE(P30600)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(II类几丁质合酶1)。{基因：名称＝CHS1}-皮炎外瓶霉(皮炎万氏霉(Wangiella dermatitidis))；CHS1_EXOJE(P30585)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(I类几丁质合酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-甄氏外瓶霉；CHS1_NEUCR(P29070)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(III类几丁质合酶3)。{基因：名称＝chs-1；ORF名称＝B11H24.170，NCU03611.1}-粗糙脉孢菌；CHS1_PHAEX(P30590)；几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-外瓶暗色球菌(Phaeococcomyces exophialae)；CHS1_PHYBL(P87073)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺 基转移酶1)(II类几丁质合酶1)。{基因：名称＝chs1}-布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)；CHS1_RHIAT(P30592)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(I类几丁质合酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-暗绿喙枝孢(Rhinocladiella atrovirens)；CHS1_RHIOL(P30594)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)。{基因：名称＝CHS1}-少孢根霉；CHS1_RHIRA(Q12632)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(II类几丁质合酶1)。{基因：名称＝CHS1}-多变根毛霉(Rhizomucor racemosus)(毛霉科真菌卷枝毛霉(Mucor circinelloides t.lusitanicus))；CHS1_SCHCO(P30596)；几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-裂褶菌(弧状菌)；CHS1_SCHPO(P30597)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)。{基因：名称＝chs1；ORF名称＝SPAC13G6.12c，SPAC24B11.01c}-粟酒裂殖酵母(裂殖酵母)；CHS1_TUBUN(P55003)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-氨基葡糖基转移酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-具钩块菌(Tuber uncinatum或Burgundy truffle)；CHS1_USTMA(P30598)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-玉蜀黍黑粉菌(黑粉菌)；CHS1_XYLBA(P30603)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)(片段)。{基因：名称＝CHS1}-班替木丝霉(Xylohypha bantiana)；CHS1_酵母(P08004)几丁质合 酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)。；CHS2_AJECA(P30577)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(III类几丁质合酶2)荚膜组织胞浆菌；CHS2_AJEDE(P30580)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(II类几丁质合酶2){基因：名称＝CHS2}-皮炎芽生菌CHS2_ASPNG(P30582)；几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(II类几丁质合酶2)(片段)。{基因：名称＝chs2}-黑曲霉；CHS2_CANAL(P30572)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2){基因：名称＝CHS2}-白色念珠菌(酵母)；CHS2_EXODE(P30601)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(I类几丁质合酶2)。{基因：名称＝CHS2}-皮炎外瓶霉(皮炎万氏霉)；CHS2_EXOJE(P30586)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(片段)。{基因：名称＝CHS2}-甄氏外瓶霉；CHS2_NEUCR(P30589)；几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)。{基因：名称＝chs-2；ORF名称＝NCU05239.1}-粗糙脉孢菌；CHS2_PARBR(Q92444)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(II类几丁质合酶2)。{基因：名称＝CHS2}-巴西副球孢子菌；CHS2_PHAEX(P30591)；几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(II类几丁质合酶2)(片段)。{基因：名称＝CHS2}-外瓶暗色球菌；CHS2_RHIAT(P30593)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶 2)(III类几丁质合酶2)(片段)。{基因：名称＝CHS2}-暗绿喙枝孢；CHS2_RHIOL(P30595)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2){基因：名称＝CHS2}-少孢根霉；CHS2_SCHPO(O74756)几丁质合酶样蛋白质2。{基因：名称＝chs2；ORF名称＝SPBC1709.01，SPBC1734.17}-粟酒裂殖酵母(裂殖酵母)；CHS2_USTMA(P30599)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(片段)。{基因：名称＝CHS2}-玉蜀黍黑粉菌(黑粉菌)；CHS2_XYLBA(P30604)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)(II类几丁质合酶2)(片段)。{基因：名称＝CHS2}-班替木丝霉；CHS2_YEAST(P14180)；几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)。{基因：名称＝CHS2；顺序基因座名称＝YBR038W；ORF名称＝YBR0407}-酿酒酵母(面包酵母)；CHS3_AJECA(P30578)几丁质合酶3(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶3)(II类几丁质合酶3)(片段)。{基因：名称＝CHS3}-荚膜组织胞浆菌；CHS3_CANAL(P30573)几丁质合酶3(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶3)(IV类几丁质合酶3)。{基因：名称＝CHS3}-白假丝酵母(酵母)；CHS3_EXODE(P30602)几丁质合酶3(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶3)(III类几丁质合酶3)。{基因：名称＝CHS3}-皮炎外瓶霉(皮炎万氏霉)；CHS3_EXOJE(P30587)；几丁质合酶3(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶3)(III类几丁质合酶3)(片段)。{基因：名称＝CHS3}-甄氏外瓶霉；CHS3_NEUCR (P30588)几丁质合酶3(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶3)。{基因：名称＝chs-3；ORF名称＝G65A3.040}-粗糙脉孢菌；CHS3_酵母(P29465)几丁质合酶3(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶3)(IV类几丁质合酶3)。{基因：名称＝CHS3；同义词＝CAL1、CSD2、DIT101、KIT2；顺序基因座名称＝YBR023C；ORF名称＝YBR0305}-酿酒酵母(面包酵母)；CHS4_MAGGR(O13353)；几丁质合酶4(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶4)(IV类几丁质合酶4)。{基因：名称＝CHS4}-稻瘟病菌(水稻稻瘟病菌(Rice blast fungus或Pyricularia grisea))；CHS4_NEUCR(Q01285)几丁质合酶4(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶4)(IV类几丁质合酶4)。{基因：名称＝chs-4；ORF名称＝NCU09324.1}-粗糙脉孢菌；CHS5_USTMA(O13394)几丁质合酶5(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶5)(IV类几丁质合酶5)。{基因：名称＝CHS5}-玉蜀黍黑粉菌(黑粉菌)；CHS6_USTMA(O13395)几丁质合酶6(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶6)(V类几丁质合酶6)。{基因：名称＝CHS6}-玉蜀黍黑粉菌(黑粉菌)；CHSA_AMPQU(Q12564)；几丁质合酶A(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶A)(I类几丁质合酶A)。{基因：名称＝CHSA}-宿白粉菌；CHSA_EMENI(P30584)几丁质合酶A(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶A)(II类几丁质合酶A)。{基因：名称＝chsA；同义词＝chs2}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHSB_EMENI(Q00757)几丁质合酶B(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶B) (III类几丁质合酶B)。{基因：名称＝chsB}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHSC_ASPFU(Q92197)几丁质合酶C(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶C)(III类几丁质合酶C)。{基因：名称＝chsC}-烟曲霉(萨托菌属(Sartorya fumigata))；CHSD_ASPFU(P78746)几丁质合酶D(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶D)(VI类几丁质合酶D)。{基因：名称＝chsD}-烟曲霉(萨托菌属)；CHSD_EMENI(P78611)几丁质合酶D(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶D)(V类几丁质合酶D)。{基因：名称＝chsD；同义词＝chsE}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHSG_ASPFU(P54267)；几丁质合酶G(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶G)(III类几丁质合酶G{＞{基因：名称＝chsG}-烟曲霉(萨托菌属)；CHSX_USTMA(Q99126)几丁质合酶1(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶1)。{基因：名称＝CHS1}-玉蜀黍黑粉菌(黑粉菌)；或CHSY_USTMA(Q99127)几丁质合酶2(EC2.4.1.16)(几丁质-UDP乙酰-葡糖胺基转移酶2)。{基因：名称＝CHS2}-玉蜀黍黑粉菌(黑粉菌)。所有序列并入本文作为参考。
有效地连接可导致MIT结构域存在于几丁质合酶序列的N末端、C末端或内部，只要这一位置基本上不损伤所得蛋白质的几丁质合酶活性。就这一点而言，“基本上不损伤”指的是当表达于植物细胞中时，几丁质合酶的活性仍足以在所述植物的细胞壁中提供可检测量值的带正电多糖。这指的是几丁质合酶活性是CHS1或CHS2的几丁质合酶活性的至少20％、至少30％、至少40％、至 少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。测定几丁质合酶活性的方法在本领域是已知的，并且在本申请中也已公开。
在特定的实施方案中，本发明还提供了SmCHS1和SmCHS2的变体序列，其可以通过体外或体内诱导产生变异来获得。本领域中可获得体外诱导产生变体核苷酸序列的几种方法，其包括但不限于DNA改组或定向进化技术，如美国专利5605793、美国专利5,811,238以及美国专利5,830,721中所述。体内诱导产生变异核苷酸序列的方法在本领域中也是熟知的，并且例如，如在本描述书的其他地方所述，可以包括将同丝水霉暴露于诱变剂，如电离辐射、EMS、MMS等，之后分离几丁质合酶1或2的编码核酸。在另一个特定的实施方案中，可以通过使密码子用法适应于植物中特异表达来修饰SmCHS1和SmCHS2、尤其是编码它们的核酸。此类用于密码子修饰(或密码子适应，它是等效用语)以便在特定植物中表达的方法在本领域中为熟知的。SEQ ID NO：18描述了变体SmCHS2核苷酸序列，其是经过优化用于在棉花中表达的经密码子修饰的变体。SEQ ID NO：18编码了在SEQ ID NO：2中描述的几丁质合酶多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了嵌合基因，其包含以下有效连接的DNA区：1)植物可表达的启动子，2)编码了几丁质合酶多肽的DNA区，，其中DNA区的核苷酸序列与SEQ ID NO：1具有至少97％的同一性，或其中DNA区的核苷酸序列与SEQ ID NO：3至少90％的同一性，或其中DNA区的核苷酸序列包含编码与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的几丁质合酶多肽的核苷酸 序列，或其中DNA区的核苷酸序列包含编码与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的几丁质合酶多肽的核苷酸序列，以及3)转录终止以及多聚腺苷酸化区。
根据本发明的嵌合基因包含植物可表达的启动子。如在此所使用的，术语“启动子”表示在转录起始期间被DNA依赖的RNA聚合酶识别并(直接或间接地)结合的任何DNA。启动子包括转录起始位点、以及转录起始因子与RNA聚合酶的结合位点，并且可包含基因表达调控蛋白可结合的多种其他位点(例如增强子)。
如在此所使用的，术语“植物可表达的启动子”指的是能够在植物细胞中控制(起始)转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，也包括能够在植物细胞中指导转录的任何非植物来源的启动子，即某些病毒或细菌来源的启动子(如CaMV35S)、地三叶病毒启动子No4或No7、或T-DNA基因启动子等。
优先在纤维细胞中控制转录的起始和维持的植物可表达的启动子是驱动有效连接的DNA区在纤维细胞和底层表皮细胞中的转录水平高于在植物的其他细胞或组织中的转录水平的启动子。较高的水平可以是例如在纤维细胞以及任选地在底层表皮细胞中的转录比在植物的其他细胞或组织中的转录多至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少500倍。这种定义也适用于术语“纤维选择性启动子”。换言之，该术语包括这样的启动子，其在纤维细胞以及任选地在底层表皮细胞中驱动的转录比在植物的其他细胞或组织中的转录多至少2倍、至少5倍或至少10倍。此类启动子包括来自棉花的纤维特异性β-微管蛋白基因的启动子(如WO0210377中所描述)、来自棉花的纤维特异性 肌动蛋白基因的启动子(如WO0210413中所描述)、来自棉花的纤维特异性脂质转移蛋白基因的启动子(如US5792933中所描述)、来自棉花的扩展蛋白基因的启动子(WO9830698)、或来自棉花的几丁质酶基因的启动子(US2003106097)、或在US6259003或US6166294中所描述的纤维特异性基因的启动子、或如在US6096950中所公开的源自E6家族的启动子。在特定的实施方案中，植物可表达的启动子是组成型启动子。如实施例3最后6行中所讨论，与未转化的植物相比，表达本发明的几丁质合酶并不引起植物生长的差异。
在特定的实施方案中，本发明提供了植物细胞，其包含在此之前描述的嵌合基因。
该嵌合基因可通过本领域熟知的方法引入到植物细胞中。
“引入”与本申请结合时涉及通过人工方法将遗传信息放置于植物细胞或植物中。这可通过本领域中已知的用于将RNA或DNA引入到植物细胞、组织、原生质体或整株植物中的任何方法来实现。
许多方法可用于将DNA转移到植物细胞或植物中。例如美国专利5,004,863、美国专利6,483,013或WO2000/71733中已描述了农杆菌属介导的棉花转化。
植物或植物细胞也可以通过粒子轰击来转化：用DNA涂布金或钨颗粒，然后射入年幼植物细胞或植物胚芽中。这一方法也可允许植物质体的转化。例如WO92/15675中报导了通过粒子轰击的棉花转化。
病毒转化(转导)可以用于基因的瞬时或稳定表达，这取决于病毒基因组的性质。所希望的遗传物质被包装到适合的植物病毒中，并且允许经修饰的病毒感染植物或植物细胞。经感染的植物的子代无病毒，并且无插入基因。在示例性病毒转化方案中，DNA(例如包含在此所述嵌合基因的DNA)以及辅助病毒可通过单独用包含在此所描述的嵌合基因的DNA或用含有所述DNA的病毒体进行机械接种被引入整株植物中。最适合的转化方案的选择(包括转化方式和参数、转化计时等)完全属于本领域普通技术人员的知识范围内。适合的方法描述或进一步详述于例如WO90/12107、WO03/052108或WO2005/098004。
在另一个特定的实施方案中，本发明提供了基本由植物细胞组成的植物，所述植物细胞包含在此之前所描述的嵌合基因。个特定的实施方案中，该植物是转基因棉花植物。
除了用于引入以上描述的嵌合基因的方法以外，所述嵌合基因还可渐渗(introgress)到植物中。“渐渗”指的是通过自然方法将基因整合到植物的基因组中，即通过将包含在此描述的嵌合基因的植物与不包含所述嵌合基因的植物进行杂交。可选择包含该嵌合基因的后代。
植物可以是任何产生纤维的植物，如棉花。其他实例包括其他产生纤维的植物，如大麻、黄麻、亚麻以及木本植物，包括但不限于松属(Pinus spp.)、杨属(Populus spp.)、云杉属(Picea spp.)、桉树属(Eucalyptus spp.)等。
在另一个特定的实施方案中，本发明提供了转基因种子，其包含如在此之前描述的嵌合基因。
在又一个实施方案中，本发明提供了制备包含带正电多糖的植物细胞壁的方法，所述方法包括1)在植物或植物细胞中表达如本文之前所概述的嵌合基因，以及2)分离所述植物细胞壁。所述分离是从进行步骤1)之后获得的植物分离。
在特定的实施方案中，所述制备(或产生，它是等效用语)方法在植物次生细胞壁中产生了带正电多糖。在另一个特定的实施方案中，所述制备方法在植物次生细胞壁中产生了几丁质。在另一个特定的实施方案中，所述制备方法在植物次生细胞壁中产生了壳聚糖，这是因为例如如下文进一步描述的包含几丁质脱乙酰酶的另外的嵌合基因的存在和表达。在特定的实施方案中，所述植物细胞壁或所述植物次生细胞壁是棉花植物细胞壁或棉花次生植物的细胞壁。在特定的实施方案中，所述棉花植物细胞壁或所述棉花次生细胞壁存在于棉纤维中。
本发明进一步提供了包括使用根据本发明的方法从植物细胞获得的细胞壁的植物细胞壁，以及包含所述细胞壁的纤维。此类植物细胞壁包含带正电多糖，如N-乙酰葡糖胺聚合物或几丁质，这些带正电多糖被嵌入到纤维素中。这些植物细胞壁可经进一步修饰，例如部分或完全脱乙酰化，这样就获得了包含葡糖胺残基的寡聚物。所得葡糖胺的氨基基团在化学上的反应性强于N-乙酰葡糖胺的氨基乙酰基或纤维素的羟基。在特定的实施方案中，包含几丁质的植物细胞壁、尤其是植物次生细胞壁，可通过化学脱乙酰作用的步骤来进一步修饰。在另一个特定的实施方案中，在植物细胞壁中制备带正电多糖的方法可通过以下方法进行：在植物或植物细胞中表达两种嵌合基因，一种嵌合基因是本发明的几丁质合酶 加上嵌合的几丁质脱乙酰酶。在酶学中，几丁质脱乙酰酶是催化以下化学反应的酶(EC3.5.1.41)：
因此，这种酶的两个底物是几丁质和H2O，而它的两个产物是壳聚糖和乙酸盐。这种酶属于水解酶家族，它们作用于除肽键以外的碳氮键、尤其是线性氨基化物中的碳氮键。这种酶类别的系统名称是几丁质酰胺水解酶。
在特定的实施方案中，根据本发明获得的植物细胞壁、尤其是已进行了脱乙酰作用的步骤(例如按照以上描述在体内，或在收集细胞壁以后)的那些植物细胞壁，可进一步进行化学修饰。含有此类植物细胞壁的产物(例如纤维、纱线或织物)其质量类似于本领域中所描述的纤维素-壳聚糖掺合物的质量，包括改进的可染性、改进的对例如皮肤真菌的抑制作用、受控药物释放等。
在特定的实施方案中，本发明提供了棉纤维，其根据本发明的方法获自或可以获自棉花植物。换言之，棉纤维是由棉花植物提供，所述棉花植物的细胞基因组(例如核基因组)中包含含有被有效地连接至编码根据本发明的几丁质合酶基因1或2的DNA区的植物可表达的启动子的嵌合基因，或包含编码根据本发明的几丁质合酶基因1和2的两个嵌合基因的组合。将嵌合基因中所包含的DNA编码区或启动子转移到棉花植物中的特定实施方案在本文件的其他地方有所描述。
根据本发明的棉纤维与天然存在的棉纤维(即从不包含根据本发明的嵌合基因的同基因系获得的棉纤维)可通过以下各项进行区别：这种纤维具有增强的用阴离子染料(包括例如刚果红)染色 的能力、这种纤维具有增强的用胺活性染料(包括例如四氟苯基酯)染色的能力。根据本发明的棉纤维还具有结合小麦胚芽凝集素的能力，而小麦胚芽凝集素结合几丁质。根据本发明的棉纤维与天然存在的棉纤维还可通过以下方式进行区别：任选地在用几丁质酶处理纤维细胞壁材料后，直接检测N-乙酰葡糖胺和GlcNAc聚合物。根据本发明的棉纤维还可通过其增加的氮含量进行区别。
根据本发明的棉纤维还可与现有技术中壳聚糖涂布的纤维相互区别，因为带正电聚合物均匀分布于构成纤维的次生植物细胞壁中，这与现有技术中表面涂布着壳聚糖的纤维相反。因此，在例如如以下所述用WGA或用刚果红或用四氟苯基染色的棉纤维的显微镜切片中，染料将均匀分布在构成棉纤维的整个细胞壁中，而在经壳聚糖涂布的纤维中，染色将集中在以片层形式位于经处理的纤维表面上的壳聚糖涂层中。
阴离子染料(例如刚果红)对根据本发明的植物细胞壁材料的增强的染色可通过以下方式定量，例如在标准条件下将统一量的材料染色，在标准化区域(例如多孔板的孔中)内铺展该材料，针对材料着色层的灰度标度使该区域的照片数字化。灰色越浅，染色的植物细胞壁材料越多。以此方式，与来自等基因植物系但无几丁质合酶编码基因的对照细胞壁材料或纤维相比，根据本发明的棉纤维和细胞壁材料显示刚果红的染色增加了至少约5％。在特定的实施方案中，根据本发明获得的植物细胞材料可用商业染料进行染色，商业染料包括棉花活性染料(例如活性红120(Reactive Red120)、丽华实蓝(Levafix Blue CA)、酸性染料(酸性橙7(Acid Orange7)、酸性蓝281(Acid Blue281))以及羊毛活性染料 (例如活性红116、丽雅伦琥珀(Realan Amber EHF)。在一个实例中，与不包含几丁质合酶编码基因的所述纤维和材料相比，根据本发明的棉纤维和细胞壁材料显示染色增加了至少约5％、至少约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至至少100％，如2倍、5倍或10倍。
新型棉纤维特异性地结合小麦胚芽凝集素的能力(可由偶联的荧光基团检测)是所提供的新型棉纤维与天然存在的棉纤维之间的明显的区别特征。除极低的背景荧光以外，当用WGA-alexa fluor488或555处理时，天然存在的棉纤维不染色/发荧光。当几丁质聚合物存在时，棉纤维的荧光提高了至少5倍。因此，本发明提供了能够特异性地结合小麦胚芽凝集素或与荧光基团偶联的WGA(例如WGA Alexa488或WGA Alexa555)的棉纤维，或当用WGA Alexa488或WGA Alexa555处理时在UV光下提供亮荧光的棉纤维。这种荧光不局限于棉纤维的表面，而是分布在纤维细胞的整个细胞壁中。
根据本发明的棉纤维与仅用壳聚糖涂布的纤维还可以通过应用WO2010/015423中公开的检测方法和检查纤维中本发明的嵌合基因的存在来进行区分。
虽然本发明的方法涉及将嵌合基因引入植物细胞中，但应当清楚的是还可将这种方法应用于将植物细胞掺入到成熟植物中的情况。例如，根据所建立的方法，可在转基因植物中再生转基因细胞。
对植物细胞和植物进行转化的方法在本领域中是熟知的。对棉花植物进行转化的方法在本领域中也是熟知的。例如美国专利5,004,863中或美国专利6,483,013中已经描述了农杆菌属介导的棉花的转化，并且例如WO92/15675中报导了通过粒子轰击进行棉花转化。
可以通过在源自胚愈伤组织的棉花植物中进行转化而引入嵌合基因，所述棉花植物例如Coker312、Coker310、Coker5AcalaSJ-5、GSC25110、FiberMax819、Siokra1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、Acala SJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、Acala B1654-43、Acala B3991、Acala GC356、Acala GC510、Acala GAM1、Acala C1、Acala Royale、Acala Maxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、Acala B2724、Acala B4894、Acala B5002、非Acala“采摘者”Siokra(non Acala″picker″Siokra)、“摘取机”品种FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMA S6以及ORO BLANCO PIMA、 FM5013、FM5015、FM5017、FM989、FM832、FM966以及FM958、FM989、FM958、FM832、FM991、FM819、FM800、FM960、FM966、FM981、FM5035、 FM5044、FM5045、FM5013、FM5015、FM5017或FM5024、以及具有源自它们的基因型的植物。
如在此所使用的，“棉花”包括陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、亚洲棉(Gossypium arboreum)以及草本棉(Gossypium herbaceum)或此类物种与其他物种杂交的子代或此类物种之间杂交的子代。
本发明的方法和工具还可用于其他植物种类，如大麻、黄麻、亚麻以及木本植物，包括但不限于松属、白杨属、云杉属、桉树属等。
所获得的经转化的植物可用于常规育种方案中，以产生具有相同特征的更多的经转化的植物，或在相同或相关植物种类的其他品种中或在杂种植物中引入根据本发明的嵌合基因。从经转化的植物获得的种子含有作为稳定的基因组插入片段的本发明的嵌合基因，且为本发明所涵盖。
本发明的嵌合基因与编码赋予了此类植物有用的农艺学性质的蛋白质或RNA的其他基因有利地在植物中组合。在编码赋予了经转化植物有用的农艺学性质的蛋白质或RNA的基因中，可提及这样的DNA序列，所述DNA序列编码赋予了对一种或多种除草剂的耐受性的蛋白质以及赋予对某些昆虫的耐受性的其他蛋白质或赋予了对某些疾病的耐受性的那些蛋白质。
此类基因描述于例如公开的PCT专利申请WO91/02071和WO95/06128中。
在编码赋予了经转化的植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性的蛋白的DNA序列中，可提及bar或PAT基因或天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)基因(该基因描述于WO2009/152359，它赋予了对除草剂草铵膦的耐受性)、编码合适的EPSPS的基因(该基因赋予了对以EPSPS作为靶标的除草剂的耐受性，例如草甘膦及其盐)(US4,535,060、US4,769,061、US5,094,945、US4,940,835、US5,188,642、US4,971,908、US5,145,783、US5,310,667、US5,312,910、US5,627,061、US5,633,435、US6,566,587以及WO97/04103)、编码草甘膦氧化还原酶的基因(US5,463,175)、或编码对HPPD抑制剂除草剂(如异噁唑类)的耐受性的HPPD酶的基因(WO96/38567)。
如在此使用的，“包含”应当被解释为指定正如所提及的经声明的特征、整数、步骤或组分的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组分、或它们的组群。因此，例如包含核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的序列更多的核苷酸或氨基酸，即被包含在更大的核酸或蛋白质中。包含功能或结构已定义的DNA区的嵌合基因可以包含额外的DNA区等。
以下非限制性实例描述了用于改变植物细胞壁的方法。除非实例中另外指出，否则所有重组DNA技术将根据以下文献中描述的标准方案进行：Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册第二版，冷泉港出版社，纽约，以及Ausubel等人(1994)现代分子生物学方案，现代方案(Current Protocols)，USA的第1卷和第2卷(A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY and in Volumes1and2of Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols， USA)。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy撰写的植物分子生物学(Plant Molecular Biology Labfax(1993))实验指导(1993)中，该书由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)以及Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。
通过在此描述的方法获得的经转化的植物细胞和植物可进一步用于本领域所熟知的育种方法中，例如杂交、自交、以及回交。育种程序可涉及杂交产生F1代(子一代)，之后进行几代自交(产生F2、F3等)。育种程序还可涉及回交(BC)步骤，其中将后代与称为回归亲本的亲本品系之一回交。
由在此所公开的方法获得的转基因植物细胞和植物还可进一步用于随后的转化步骤中，例如用来引入另外的嵌合基因。
包含在此公开的嵌合基因的植物可还用以下各项处理：棉花除草剂，如敌草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、MSMA、氟硝草醚(Oxyfluorfen)、扑草净(Prometryn)、氟乐灵(Trifluralin)、氟酮唑草(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、精吡氟禾草灵(Fluazifop-butyl)、草甘膦(Glyphosate)、达草灭(Norflurazon)、胺硝草(Pendimethalin)、嘧硫苯甲酸(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、得杀草(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)、氟噁臻酮(Flumioxazin)、噻二唑素-(Thidiazuron)；棉花杀昆虫剂，如高灭磷(Acephate)、涕灭威(Aldicarb)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿维菌素(Abamectin)、吡虫清(Acetamiprid)、因灭汀(Emamectin Benzoate)、吡虫啉(Imidacloprid)、噁二唑虫(Indoxacarb)、λ-赛洛宁(Lambda-Cyhalothrin)、赐诺杀(Spinosad)、硫敌克(Thiodicarb)、γ-氯氟氰菊酯(Gamma-Cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、氟尼胺(Flonicamid)、氟虫酰胺(Flubendiamide)、杀虫隆(Triflumuron)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、β-氟氯氰菊酯(Beta-Cyfluthrin)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫酰胺(Flubendiamide)、氰虫酰胺(Cyazypyr)、艾克敌(Spinosad)、赐诺特(Spinotoram)、γ-氯氟氰菊酯(gamma Cyhalothrin)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威(Thiodicarb)、齐墩螨素(Avermectin)、氟尼胺(Flonicamid)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、砜虫啶(Sulfoxaflor)；以及棉花杀真菌剂，如腈嘧菌酯(Azoxystrobin)、双噁芬(Bixafen)、白克列(Boscalid)、多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、铜(Copper)、环唑醇(Cyproconazole)、恶醚唑(Difenoconazole)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氧唑菌(Epoxiconazole)、咪唑菌酮(Fenamidone)、氟啶胺(Fluazinam)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异丙定(Iprodione)、吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、异噻菌胺 (Isotianil)、代森锰锌(Mancozeb)、代森锰(Maneb)、叉氨苯酰胺(Metominostrobin)、吡噻菌胺(Penthiopyrad)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、甲基代森锌(Propineb)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、百克敏(Pyraclostrobin)、五氯硝基苯(Quintozene)、戊唑醇(Tebuconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基托布津(Thiophanate-methyl)、布洛芬(Trifloxystrobin)。
在整个说明书以及实施例中，对序列表中所示出的以下序列进行引用：
SEQ ID No：1：同丝水霉几丁质合酶2基因的核苷酸序列
SEQ ID No：2：同丝水霉几丁质合酶2基因的氨基酸序列
SEQ ID No：3：同丝水霉几丁质合酶1基因的核苷酸序列
SEQ ID No：4：同丝水霉几丁质合酶1基因的氨基酸序列
SEQ ID NO：5-17是合成引物，其序列描述在表1中。
SEQ ID NO：18：同丝水霉几丁质合酶2的经修饰的核苷酸序列(密码子被优化用于在棉花中表达)
SEQ ID NO:19：同丝水霉几丁质合酶2的MIT结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO:20：同丝水霉几丁质合酶1的MIT结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO：21：寄生水霉几丁质合酶基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：22：由寄生水霉几丁质合酶基因SEQ ID NO：21编码的氨基酸序列
SEQ ID NO：23：寄生水霉几丁质合酶基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：24：由寄生水霉几丁质合酶基因SEQ ID NO：23编码的氨基酸序列
实施例
1.来自同丝水霉的几丁质合酶基因的克隆
卵菌纲同丝水霉Pringsheim53-967Dick获自“Centraal Bureau voor Schimmel Culturen”(CBS，Baarn，The Netherlands)，并且在90毫米培养皿内的马铃薯葡萄糖琼脂上培养。实验中所用的菌丝体在黑暗中在25℃下在玛驰(Machlis)液体培养基(Machlis L.(1953)Am.J.Bot.40，449-460)中生长3-5天。
使用RNeasy植物迷你试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)(Qiagen)，并联合DNaseI的柱上消化，从100mg3天龄的同丝水霉菌丝体中提取总RNA。按照制造商的说明书，使用Superscript III第一链cDNA合成试剂盒(Superscript III First Strand cDNA Synthesis kit)(Invitrogen)，用4.5μg总RNA进行逆转录。将1μl合成的cDNA用于PCR反应，使用引物CHS2Fwd和CHS2Rev对CHS2序列进行扩增，所述引物是根据以登录号U19946储存的序列(该序列还公开于Mort-Bontemps M.等人(1997)Microbiology143，2009-2020中，其中几丁质合酶2(CHS2)序列描述于所述参考文献的图3中)而设计的。使用RNA连接酶介导的RACE试剂盒(RLM-RACE，Ambion)来分离并且测定CHS2的3′端序列。用引物CHS2Fwd1和CHS2Fwd2获得CHS2的3′端。使用引物CHS2Fwd和CHS2FLRev，从同丝水 霉菌丝体cDNA扩增完全的全长CHS2编码序列(描述于SEQ ID NO：1中)。根据制造商的说明书，使用Gateway技术将这种所得到的序列克隆到pENTR-D-TOPO(Invitrogen)中。将构建体转化入One Shot TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)中，并且测定核苷酸序列(MWG，Germany)。观察到，所公开的同丝水霉CHS2的编码序列(登录号U19946)与SEQ ID NO：1中描述的分离的CHS2序列仅具有96％的同一性。核苷酸序列的差异是因为以登录号U19946公开的几丁质合酶2的编码序列中存在许多小缺失。因此，描述于SEQ ID NO：1中的编码序列的翻译序列与登录号U19946的经翻译的编码序列仅具有79％的同一性。后者是由U19946的核苷酸序列中的小缺失引起的，这导致当U19946的编码序列翻译时，相对于SEQ ID NO：1的翻译发生移码。显然，SEQ ID NO：2包含保守的微管相互作用和运输分子结构域(MIT结构域)，而从保藏号U19946翻译的几丁质合酶蛋白质中并无该结构域。
使用软件BioEdit(Hall TA(1999)BioEdit：a user-friendly biological sequence alignement editor and analysis-http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)编辑这些序列。使用ClustalW(Larkin MA等人(2007)Bioinformatics23，2947-2948)进行比对。使用SmCHS1和SmCHS2全长序列对来自美国国家生物技术中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的非冗余蛋白质数据库进行BLASTp搜索。
表1描述了引物的序列：
CHS2Fwd，SEQ ID NO：5 CACCATGAGTGACCAGCTCGACCTCGCGGC
CHS2Rev，SEQ ID NO：6 TGCTCTCTGCACGGGCAACCACAACCCGAC
CHS1Fwd，SEQ ID NO：7 AATGAGGACGAGAACGAGCTCCGGTCG
CHS1Rev，SEQ ID NO：8 AGCTTGTAAAAGGACGACTTGGTTGGC
CHS1Rev1，SEQ ID NO：9 TCTCCTTGGTCATTTGCAGCGAGTGTTC
CHS1Rev2，SEQ ID NO：10 CAGAACGTTGTTGCAAACCTTGCGGAGT
CHSFwd1，SEQ ID NO：11 TCCGGTCGACACTCCGCAAGGTTTGCAA
CHS1Fwd2，SEQ ID NO：12 ACTACACGGTCCTCCTCGATGTTGGGAC
CHS2Fwd1，SEQ ID NO：13 TGTCGGTGGCTTGATTGTCTTTGC
CHS2Fwd2，SEQ ID NO：14 TTTGGCTCTACGTTGTGACGGACT
CHS1FLFwd，SEQ ID NO：15 CACCATGCCGCCCAAGCGACCGACGACCGA
CHS1FLRev，SEQ ID NO：16 CTAGCGCATGCGGTTGTACGGCGCTTGG
CHS2FLRev，SEQ ID NO：17 TTAGACTTGTTGGTAGGCGCCGCCGCGG
两种引物(CHS1Fwd和CHS1Rev)是根据同丝水霉几丁质合酶1(CHS1)的部分序列(对应于登录号U42304)而设计的，用于CHS1的保守区的扩增。使用RNA连接酶介导的RACE试剂盒(RLM-RACE，Ambion)扩增CHS1的5′端和3′端。使用以下巢式反向引物组来获得CHS1的5′端：CHS1Rev1和CHS1Rev2。使用巢式正向引物CHSFwd1和CHS1Fwd2分离3′端。使用用于扩增CHS1基因的编码序列的引物CHS1FLFwd和CHS1FLRev，从同丝水霉菌丝体cDNA扩增全长CHS1，以证实完全序列。根据制造商的说明书，使用Gateway技术，将全长基因克隆到pENTR-D-TOPO(Invitrogen)中。将构建体转化至One Shot TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)中，并且通过测序确定核苷酸序列 (MWG，Germany)。所有PCR反应都是根据制造商的说明书使用Phusion High-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes)进行。几丁质合酶1核苷酸序列的编码区描述于SEQ ID NO：3中。几丁质合酶1的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：4中。
2.编码同丝水霉几丁质合酶2(CHS2)蛋白的嵌合的植物可表达的基因的构建
使用标准的重组DNA技术，构建了植物可表达的同丝水霉CHS2嵌合基因，其含有以下有效地连接的DNA片段：
·来自CaMV的35S启动子区
·编码未翻译的前导序列(5′Cab22L)的DNA片段
·编码同丝水霉的CHS2(描述于SEQ ID NO：1中)的DNA片段
·来自章鱼碱合酶基因的转录终止以及多聚腺苷酸化信号
简言之，根据制造商的说明书，使用定向TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)，通过将CHS2基因PCR克隆到Gateway进入载体pENTR/D/TOPO中来产生该构建体。使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)进行PCR反应。使用Gateway LR Clonase Enzyme Mix(Invitrogen)，将得到的进入载体重组到目标载体pEarleyGate103中(Earley KW等人(2006)Plant J.45：616-629)。所有构建体均通过序列分析来核实序列。用于植物转化的选择标记是提供对草胺膦的抗性的bar基因。使用包含SmCHS2基因的重组双元载体pEarleyGate103对农杆菌属菌株C58C1进行转化(Voinnet O.等人(2003)Plant J.33：949-956)，所述菌株C58C1用 于通过花浸染法对拟南芥进行转化(Clough SJ和Bent AF(1998)Plant J.16：735-743)。与未转化的拟南芥植物相比，包含嵌合的同丝水霉几丁质合酶2的经转化的拟南芥植物在生长方面没有差异。这与这样的转基因拟南芥植物生长减慢形成对比，所述植物包含与高尔基定位信号有效地连接的粗糙脉孢菌几丁质合酶(如WO2006/136351中所公开的，参见实施例9)。
3.重组拟南芥的毛状体的组织化学分析
拟南芥中的毛状体(植物毛发)是具有特征性三维结构的大型非分泌表皮细胞，。因为毛状体很容易地被遗传学、细胞生物学以及分子方法组合使用，所以我们使用源自实施例2中产生的重组拟南芥植物的成熟毛状体用于对经过SmCHS2转化的拟南芥植物的植物细胞壁进行分析。在最近的研究过程中，我们观察到毛根培养物的细胞壁分析(参见WO2006/136351，实例2)导致了与成熟毛状体的细胞壁分析类似的结果(成熟毛状体更容易建立，并且比毛根培养物更容易分离)。
将毛状体进行组织化学染色使细胞的不同化合物可见，并且用显微镜进行分析。
例如，在与针对N-乙酰葡糖胺的IgM单克隆抗体(BIODESIGN)进行免疫反应之后，可检测到N-乙酰葡糖胺。几丁质可以通过例如使用小麦胚芽凝集素-Alexa Fluor555或备选地通过使用罗丹明缀合的结合几丁质的探针进行检测。后者是特异性地结合几丁质的重组融合蛋白。融合蛋白包含小的(5kDa)几丁质结合结构域(CBD)，其源自与来自大肠杆菌的麦芽糖结合 蛋白质(43kDa)的C末端融合的环状芽孢杆菌WL-12的几丁质酶A1的C末端区。该融合蛋白按照标准方法使用四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)标记。我们从New England BioLabs购买了罗丹明缀合的几丁质结合探针(目录号P5210)。
通过荧光显微术，使用配备有Apotome(Zeiss)用于允许光学切片的Axioplan2显微镜(Zeiss，Jena，Germany)来检查经组织化学染色的毛状体。使用Axio4.2版(Zeiss)进行图像处理。
植物细胞壁的Calcofluor染色可用以下方案进行。Calcofluor White(或荧光增白剂28)是无色有机化合物，它在紫外光照射(λmax＝350nm)下发出清楚的淡蓝色荧光。将待染色的样品(即毛状体)在包含最终浓度为50μg/mL的荧光增白剂28的培养基或PBS(缓冲溶液)中浸渍15到30分钟。然后用培养基或缓冲液洗涤样品，并且使用配备用于荧光显微术且使用Zeiss滤镜组18的显微镜检查样品。细胞壁发出清楚的淡蓝色荧光。对包含SmCHS2嵌合基因的重组成熟毛状体进行免疫组织化学染色以检查N-乙酰葡糖胺的存在，并且随后用Calcofluor染色以使细胞壁可见。正如由光学切片的重叠可观察到，仅在重组毛状体的细胞壁中检测到N-乙酰葡糖胺的存在。
小麦胚芽凝集素-Alexa Fluor555染色或用罗丹明缀合的几丁质结合探针染色的方法：
在约3周后，从体外产生的转基因芥菜属植物(即根据实施例2的包含SmCHS2的重组植物)以及从对照芥菜属植物(即非 转化植物)中分离包含毛状体的成熟叶子。首先将叶子在固定剂(含10％福尔马林、0.25％戊二醛的PBS)中固定1小时。真空浸润样品，并且重新更换固定剂并与叶子再温育3小时。最后，固定后可对叶子进一步处理或存储在4℃下若干天。下一步骤，用PBS洗涤固定过的叶子(60分钟)，之后用PBT(即PBS+0.1％Tween20)洗涤60分钟。随后将叶子与小麦胚芽凝集素-Alexa Fluor555(Alexa fluor555TFP酯是可从Molecular Probes公司获得的试剂盒)在PBT(3mg/ml)中温育4至6小时。或者备选地，将叶子与罗丹明-几丁质结合探针一起温育16小时。温育后，洗去荧光染料或罗丹明-几丁质结合探针(用PBT洗涤两次并且用PBS洗涤一次)。
使用荧光显微术例如用Zeiss滤镜38，检查叶子边缘处的经染色的重组毛状体。观察到来自重组毛状体的细胞壁材料可再现的染色比来自对照植物的细胞壁材料更强烈(参见图1)。
4.几丁质合酶在棉花中的纤维特异性表达
使用如在US6483013中所述的转化方法已经产生了包含如实施例2中所概述、在F286纤维选择性启动子(在US2003/1060971中公开)控制下的嵌合几丁质合酶2基因的转基因棉花植物，以及包含两个嵌合基因(即，在F286启动子控制下的所述嵌合几丁质合酶2基因以及在所述F286启动子控制下的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶(gfa)基因，或者在E6启动子控制下的所述嵌合几丁质合酶2基因以及在E6启动子控制下的gfa基因)的转基因植物。将来自这些转基因棉花植物的纤维分离，并且用于产生具有 改进的反应性(例如改进的可染性)的纱线和织物。从转基因植物的棉铃分离的纤维具有增加量的均匀分布于细胞壁中的N-乙酰葡糖胺聚合物。
5.反应性提高的棉纤维
正如实施例4中所述，已经产生包含有效地连接到纤维特异性启动子的嵌合SmCHS2编码区的转基因棉花植物。从这些植物收集成熟的棉纤维，并且可将其用刚果红进行染色，或可与WGA-Alexa fluor555进行反应。此外，可用商业染料对得到的成熟棉纤维进行染色，所述商业染料包括棉活性染料(例如活性红120、丽华实蓝CA)、酸性染料(酸性橙7、酸性蓝281)、以及羊毛活性染料(例如活性红116、丽雅伦琥珀EHF)。
WGA-Alexa555染色
棉纤维不需要脱水或经透化处理。相反，通过将纤维在氯仿∶甲醇混合物(1∶1)中处理3次10分钟，之后在丙酮中处理2次10分钟，并且在乙醚中处理2次5分钟来去除脂质和蜡。允许将纤维风干。
可用WGA-Alexa555、WGA-Alexa488或WGA-四甲基罗丹明对纤维进行染色。
将纤维放入封闭溶液(pH7.4的150mM NaCL、10mM磷酸钠缓冲液、0.1％Tween20、以及1％牛血清白蛋白)中，并且温育1小时。此后，用包含WGA-荧光染料的相同缓冲液替换该缓冲液，并且温育4小时。用封闭溶液替换WGA-荧光染料溶液， 洗涤10分钟，之后用无BSA的封闭溶液洗涤3次10分钟，并且用无BSA并且无Tween的封闭溶液洗涤2次5分钟。将染色的纤维在显微镜载玻片上封固，并且通过荧光显微术(Axioplan2(Zeiss，Jena，Germany))使用滤镜组38(激发：BP470/40；发射：BP525/50)评估Alexa fluor488缀合物或使用滤镜组20(激发：BP546/12；发射：BP575-640)评估Alexa fuor555或四甲基罗丹明缀合物。虽然在来自非转基因棉花植物的棉纤维中没有检测到特异性荧光，但是在包含嵌合SmCHS2基因的转基因棉花植物的棉纤维中可检测到亮荧光。棉纤维的实际显微切片显示，WGA-fluor555均匀分布于棉纤维细胞的次生细胞壁中。

Claims (8)

1.编码几丁质合酶多肽的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子的核苷酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸序列或它的互补序列组成。
2.编码几丁质合酶多肽的分离的核酸分子，所述几丁质合酶多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
3.嵌合基因，其包含以下有效地连接的DNA区：
a)植物可表达的启动子，
b)编码根据权利要求1或2的任一项中的几丁质合酶多肽的DNA区，
c)转录终止以及多聚腺苷酸化区。
4.根据权利要求3的嵌合基因，其中所述启动子是组成型启动子。
5.根据权利要求3的嵌合基因，其中所述启动子是纤维选择性启动子。
6.制备包含带正电多糖的植物细胞壁的方法，所述方法包括
a)在植物中表达根据权利要求3至5的任一项中所述的嵌合基因，
b)和分离所述植物细胞壁。
7.根据权利要求6的方法，其中所述植物细胞壁是棉花植物细胞壁。
8.根据权利要求7的方法，其中所述棉花植物细胞壁存在于棉花纤维中。
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