WO1997002353A1 - Promoteur specifique des tissus - Google Patents

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WO1997002353A1
WO1997002353A1 PCT/JP1996/001866 JP9601866W WO9702353A1 WO 1997002353 A1 WO1997002353 A1 WO 1997002353A1 JP 9601866 W JP9601866 W JP 9601866W WO 9702353 A1 WO9702353 A1 WO 9702353A1
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amylase
transgenic plant
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Yukio Okada
Naohiro Yoshigi
Kazutoshi Ito
Makoto Kihara
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Sapporo Breweries Limited
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    • C12N9/2422—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from plant source
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a tissue-specific promoter, and more particularly, to a promoter of a gene that is specifically expressed in a plant seed.
  • Plants, for example barley are major agricultural products for feed and food (beer, whiskey, etc.) and are produced and consumed worldwide.
  • Various barley varieties have been improved according to the various uses of barley.
  • Conventional breeding involves selecting effective ones from artificial or natural mutations, combining them by crossing, etc., and finding out those that express the desired phenotypic trait from among a large number of progeny.
  • breeding methods use crosses, the genetic traits to be introduced are limited to those that are closely related, and it takes a long time to obtain the target variety.
  • the present invention particularly provides a promoter that is specifically expressed in plant seeds.
  • a promoter region that regulates the transcription of the barley / S-amylase gene and the elucidation of the nucleotide sequence. was successfully achieved.
  • barley / ⁇ -amylase is S-amylase (1,4-hi-D-glucan maltohydrolase [EC 3.2.1.2]) obtained from barley seeds, and soy-amylase.
  • S-amylase (1,4-hi-D-glucan maltohydrolase [EC 3.2.1.2]) obtained from barley seeds, and soy-amylase.
  • it is known as an enzyme useful for industrially producing maltose for infusion and food.
  • Barley is also known to be germinated into malt and then used as a raw material in beer making and distilled spirits. Malt is present—amylase is the most important enzyme for starch saccharification during the preparation stage. one of.
  • the present inventors have found that barley ⁇ -expressed strongly and strongly expressed in ripening barley seeds The present inventors thought that the promoter region of the amylase gene was isolated and that barley seeds could be used for the production of substances in the seeds. As a result of intensive studies, the present invention was completed.
  • expression of a foreign gene in a ripened plant seed is achieved by linking an appropriate foreign gene and a transcription termination factor downstream of the obtained promoter region and introducing the gene into a plant seed such as barley. It is possible to improve the seeds of barley and other plant seeds and use them for seed production. Disclosure of the invention
  • the present invention is firstly a promoter capable of expressing a transgene in a plant seed.
  • the promoter has a molecular weight of 1.28 kb and is cut in this order by restriction enzymes Sal I, Apa I, Xba I, Bam HI, Hind III, EcoT 221, Xba I and Bam HI. There are those containing a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, etc.
  • the present invention relates to a vector containing the promoter.
  • the present invention is a method for producing a transgenic plant, characterized by transforming with the vector.
  • the present invention is a transgenic plant transformed by the vector.
  • FIG. 1 is a diagram showing a physical map of a clone containing the promoter region of the S-amylase gene.
  • FIG. 3 is a view showing a physical map of a 2.4 kb Sal I-Sal 1 fragment including a promoter region of a yg-amylase gene.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction process of reporter plasmid.
  • FIG. 4 is a diagram showing the GUS activity of each cell line.
  • FIG. 5 is a diagram showing an expression vector pSBG503 of thermostability; 8-amylase.
  • FIG. 6 is a diagram comparing the heat resistance of amylase extracted from seeds of plant individuals derived from protoplasts into which an 8-amylase gene has been introduced according to the present invention.
  • barley S-amylase is S-amylase (1,4-111 D-glucan maltohydrolase CE C 3.2.1.2) obtained from barley seeds.
  • barley / 3-amylase is known to be specifically synthesized in ripening seeds and is a major protein that accounts for 1-2% of soluble endosperm protein in seeds. (Heredi tas, 93, 311 (1980)).
  • the promoter region of the barley 5-amylase gene was isolated and analyzed, and an expression vector was prepared using the isolated promoter region. The process for expressing the above will be described in detail.
  • substantially the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing refers to deletion, substitution, or substitution of some of the nucleotides as long as this gene has a significant promoter-activity in plant seeds. It indicates that addition may be made.
  • Barley chromosome DNA is the same in cells of all tissues.
  • the chromosome DNA can be prepared from the first leaf obtained by germinating barley seed in vermiculite at 20 ° C. for 7 days.
  • This DNA can be prepared by a known method, for example, see “Clothing and Sequence—Plant Biotechnology—Experiment Manual”, Nomura Bunkasha, p.252 (19989), etc. This can be done in the manner described.
  • a barley chromosome library can be prepared using barley chromosome DNA.
  • the preparation can be performed by a known method, for example, the method described in "Cloning and Sequence-Plant Biotechnology-Experiment Manual", Rural Bunkasha, p. 272 (1989), etc. In monkey.
  • the probe used for screening the barley chromosome library is an appropriate DNA fragment, that is, a DNA fragment having base sequence complementarity with the gene to be screened is DIG-High Prime (Boehringer Germa (Manufactured by Inheim Co., Ltd.).
  • the barley chromosome library can be screened using the probe prepared in (3). This screening can be performed by a known method, for example, by the method described in “Cloning and Science—Experimental Manual for Plant Biotechnology: Rural Culture”, pp. 134 (1989), etc. Can be.
  • the target clone can be detected using the DIG Luminescent Detection Kit (Boehringer-Mannheim).
  • the nucleotide sequence can be determined by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) ⁇ dideoxynucleotide chain termination method (Gene, 19, 269 (1982)) .
  • the resulting promoter activity of the promoter region is determined by the presence of a reporter gene such as ⁇ -glucuronidase enzyme (GUS) and a transcription terminator such as a nopaline synthase gene (NOS) terminator downstream of the promoter region.
  • GUS ⁇ -glucuronidase enzyme
  • NOS nopaline synthase gene
  • reporter gene and the transcription termination factor commercially available ones such as, for example, plasmid ⁇ 101 (manufactured by CL0NTECH) can be used.
  • a known method can be used to measure the promoter activity in ripening seed endosperm cells using the produced reporter plasmid (Plant Cell Reports, 10, 595 (1992)). That is, protoplasts are prepared from ripening seed endosperm cells and Introducing the repo all-over-plasmid by a known method, for example, the method described in US Pat. The GUS activity of the cell line obtained can be measured. (8) Production of transgenic plants
  • An expression vector is prepared by using the promoter of the barley-amylase gene of the present invention, and a transformed plant is grown with the vector.
  • Examples of the plasmid used in the present invention as an expression vector include a gene to be expressed as a thermostable / S-amylase, the promoter of the present invention as a transcriptional regulator, and a force-reducing mosquito virus as a transcription termination factor. By using the 35S terminator, heat-resistant S-amylase is produced in plant seeds.
  • the heat-resistant ⁇ -amylase gene linked to the promoter is a strong one that can use a heat-resistant -amylase gene derived from a living organism or obtained by modifying the gene.
  • a thermostable S-amylase gene obtained by site-specific mutation of the miramase gene was used.
  • the electroporation method for example, see Nature, 319, 791 (1986)
  • the polyethylene glycol method for example, and the particle gun method (for example, Nature, 327, 70 (1987) )
  • the laser-perforation method see, for example, Barley Genetics VI, 231 (1991)
  • the agropacterium method see, for example, Plant II, 6, 271 (1994)
  • the wheat protoplast is preferably a callus derived from an immature embryo (Kihara and Funatsuki, 1995, Plant Sci., 106: 115-120, JP-A-7-21). (Refer to Publication No. 3183) or resuspended cultured cells established from calli derived from immature embryos (Kihara and Funatsuki, 1994, Breeding Sci., 44: 157-160, Funatsuki and Kihara, 1994, Plant Cell Rep., 13: 551-555, Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-36633), a general protoplast preparation method using cell mouth enzyme and vectin enzyme. Can be prepared.
  • the liquid medium and the suspension culture cells are removed, and the cells are further cultured in a liquid medium containing a selection reagent such as dieneticin (G418), dygromycin, or vialaphos. And the development of resistant colonies.
  • a selection reagent such as dieneticin (G418), dygromycin, or vialaphos.
  • These developed colonies are transplanted onto a solid medium containing a selection reagent such as, for example, dieticin (G418), hygromycin, or vialaphos. Since the ability to form an amphogenic callus or embryoid body is observed, when these are transplanted to a solid medium containing no selection reagent, regeneration of the plant is observed.
  • a selection reagent such as, for example, dieticin (G418), hygromycin, or vialaphos. Since the ability to form an amphogenic callus or embryoid body is observed, when these are transplanted to a solid medium containing no selection reagent, regeneration of the plant is observed.
  • the plants obtained in this way are potted and cultivated under normal cultivation conditions, for example, 16 hours daylength, 1000 lux, and 18 ° C environment. Can be obtained.
  • the amylase activity is examined, and the thermophilicity is examined.
  • the activity of amylase can be measured by utilizing the saccharification reaction of starch.
  • the present inventors have determined that the activity of amylase can be easily measured with a small amount of sample, and that the amylase measuring reagent (can be used to measure only the activity of barley carramylase).
  • Example 1 150 ⁇ g of the chromosomal DNA prepared in Example 1 was partially digested with 1 U of Sau3AI at 37 ° C. for 1 hour, and fractionated by sucrose gradient centrifugation. went. The fraction containing a fragment of about 18 kb was purified, and then integrated into a phage vector EMB L3 (Stratagene). It was obtained by packaging in lambda phage particles using Gigapack II Gold (Stratagene) and transforming Escherichia coli XLl-Blue MRACP2 (Stratagene).
  • the probe is an EcoRV-Hind 111 fragment derived from the barley S-amylase structural gene described in Japanese Patent Application No. 7-92004, that is, a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the fragment was prepared by digoxigenin labeling using DIG-High Prime (manufactured by Behringer Mannheim).
  • FIG. 1 shows a physical map of the obtained clone.
  • the abbreviations in the figure are restriction recognition sites for restriction enzymes.
  • the thin line indicates the vector, the blackened area indicates the 5 'end region of the amylase structural gene, and the white area indicates the upstream region including the promoter overnight region. .
  • the arrow indicates the direction of the S-amylase gene.
  • Example 4 Plasmid containing a 2.4 kb Sal I fragment containing the 5 'end region of the amylase structural gene and the promoter region After a deleon clone was prepared using Deletion Kit for Kilo-Sequence (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), the nucleotide sequence was determined by the dideoxynucleotide chain termination method.
  • Figure 2 shows the physical map of the Sal I fragment.
  • the abbreviations in the figure are restriction recognition sites for restriction enzymes.
  • the black part indicates the 5 'end region of the S-amylase structural gene, and the white part indicates the upstream region including the promoter region.
  • SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shows the determined base sequence of one region of the promoter of the amylase gene.
  • SEQ ID NO: 3 in the sequence listing shows the determined partial nucleotide sequence of the 2.4 kb Sal I-SalII fragment.
  • the repo overnight plasmid was prepared by the method shown in Fig.3. That is, the HindIII-EcoRI fragment containing the GUS gene and the NOS terminator of plasmid pBI101 (manufactured by CLONTECH) was incorporated into the HindIII and EcoRI sites of plasmid pUC118 to obtain plasmid pBI11.
  • the GUS activity of each cell line is shown in FIG. From FIG. 4, it was confirmed that the isolated amylase promoter region had activity in the barley ripening seed endosperm cells. In addition, the details with the introduction of pSBG 530dH In the cell line, the GUS activity is reduced by about two-thirds compared to the cell line transfected with pSBG530, confirming that the region shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is required as a promoter region.
  • pSBG 530dH the GUS activity is reduced by about two-thirds compared to the cell line transfected with pSBG530, confirming that the region shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is required as a promoter region.
  • enzyme solution (1 g of the cells) (Cellulose zona mosquito RS 1.0%, vectorase Y—230.1%, MES 5 mM was added to the LW solution, and the solution was added at 25 ° C. for 2 to 3 hours. It was left still.
  • the protoplast suspension thus obtained was filtered through 64 // and 26; / mesh, and centrifuged to collect protoplasts. Next, washing was performed three times using the LW solution.
  • thermostable ⁇ -amylase gene contains the first intron of the barley ⁇ -perylase gene.
  • the collected protoplasts were suspended in 1 ml of L1 medium containing 0.6 M maltose, 2.Omg / L of 2,4-D, and 1.8% agarose, and immediately suspended in a 6 cm Petri dish. Spread up. At this time, it was made into a disk shape of about 4.5 cm in diameter. After solidification, the cells were separated from the petri dish and shake-cultured in a 5 ml liquid medium (the same component as that in which protoplasts were suspended) containing 20 mg / ml of corn wheat liquid suspension cells. In addition, the shaking speed was set to 50 rpm.
  • the plant thus obtained was further transplanted onto an L3 medium containing no plant hormone to promote rooting. About one month later, pots were raised. After potting, the plants were cultivated in a 16-hour daylength, 1000 lux, 15 ° C environment, and a large number of transformed oat plants were obtained. The presence or absence of a thermostable -amylase gene fragment in the obtained plant was examined by polymerase chain reaction (PCR), and the presence was confirmed.
  • PCR polymerase chain reaction
  • thermostable yS-amylase was accumulated in b.
  • thermostable 8-amylase was found to be remarkable in seed sample a.
  • a promoter for a gene specifically expressed in plant seeds is provided.
  • the nucleotide sequence and activity in ripening seeds were clarified. If the appropriate foreign gene and transcription terminator are linked to this promoter overnight and introduced into barley or other plants, the seeds of barley or other plants can be intentionally improved or substances in the seeds can be improved. Production becomes possible, which can contribute to the field of plant breeding.

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Description

明糸田書 組織特異的なプロモーター 技術分野
本発明は、 組織特異的なプロモーターに関するもので、 詳しくは 植物種子中で特異的に発現する遺伝子のプロモーターに関する。 背景技術
植物、 例えば大麦は、 飼料用および食品 （ビール、 ウィスキー等） 製造用の主要農産物であり世界中で生産、 消費されている。 そして、 大麦の多々ある使用目的に応じて、 これまで様々な品種改良がなさ れてきた。 従来の品種改良は、 人工あるいは自然の変異の中から有 効なものを選び出し、 それらを交配などによって組み合わせ、 その 多数の後代の中から希望する表現形質を現すものを見つけ出すとい うものである。 しかし、 このような育種法は交配を利用しているた め、 導入する遺伝形質が近縁のものに限られ、 また目的の品種を得 るまでに長期間を要するというのが現状である。
一方、 今日では、 遺伝子工学、 細胞工学といったバイオテクノロ ジ一の技術によって、 付与したい形質の遺伝子を植物へ直接導入す る方法が大麦においても確立されつつあり、 従来の育種法における 問題点の解決策として期待されている （例えば醸造用大麦について は BIO/TECHNOLOGY 13， 248(1995)参照) 。 ここで必要とされるのが 組織特異的なプロモーターである。 すなわち、 外来遺伝子を植物に 導入する際に、 その遺伝子が目的の組織で適当な時期に十分量発現 することが求められる。 そのためには、 組織特異的なプロモーター に外来遺伝子をつなぎ、 このプロモー夕一の支配下で外来遺伝子を 発現させる必要がある。
本発明は、 特に植物種子中で特異的に発現するプロモータ一を提 供するものであり、 その 1例として大麦 /S—ァミラーゼ遺伝子の転 写を調節するプロモータ一領域の単離および塩基配列の解明を達成 することに成功した。
すなわち、 大麦/ δ—アミラーゼは、 大麦種子から得られる S—ァ ミラーゼ （ 1, 4—ひ一 D—グルカンマルトヒドロラ一ゼ 〔E C 3. 2. 1. 2〕 ) であり、 大豆 —アミラーゼとともに輸液用マルトース や食品用マルトースを工業的に生産するのに有用な酵素として知ら れている。 また、 大麦は発芽させて麦芽とした後、 ビール製造や蒸 留酒の原料として使われることでも知られており、 麦芽に存在する —アミラーゼは、 仕込段階での澱粉の糖化に最も重要な酵素の一 つである。
大麦8—アミラーゼの遺伝子としては、 品種 Hi prolyの 1 7 5 4 塩基からなる c D NAの全塩基配列が報告されており、 同時に 5 3 5 残基からなるそのァミノ酸配列も明らかにされている （Eur. Biochem. 169， 517 (1987) ) 。
また、 品種はるなニ条の 1 7 7 5塩基からなる c D NAの全塩基 配列も報告されており、 同時に 5 3 5残基からなるそのアミノ酸配 列も明らかにされている (J. Biochem. 115, 47 (1994) 、 特開平 6 - 3 0 3 9 8 3号公報） 。 さらに、 品種はるなニ条の 3 8 2 5塩基 からなる染色体 D N Aの構造遺伝子領域の全塩基配列も報告されて いる （特願平 7 _ 9 2 0 0 4号明細書） 。
しかしながら、 /S—アミラーゼ遺伝子の転写を調節するプロモー 夕一領域に関しては、 遺伝子の単離、 ましてやその塩基配列の解明 に関しては、 今まで全く報告がない。
本発明者らは、 登熟中の大麦種子にぉレ、て強力に発現する大麦 β一 ァミラーゼ遺伝子のプロモーター領域を単離し、 大麦の種子の改良 あるレ、は種子での物質生産に利用できるようにしようと考え、 鋭意 検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
本発明によれば、 得られたプロモーター領域の下流に適当な外来 遺伝子および転写終結因子を連結し、 大麦などの植物種子に導入す ることにより、 外来遺伝子の登熟植物種子中での発現が可能となり、 大麦やその他の植物の種子の改良あるレ、は種子での物質生産に利用 できる。 発明の開示
本発明は第 1に、 植物種子中で導入遺伝子を発現可能なプロモー ターである。
なお、 該プロモーターとしては、 分子量が 1 . 2 8 k bであり、 制限酵素 Sal I， Apa I, Xba I, Bam HI, Hind I I I, EcoT 221, Xba I および Bam HI により、 この順序で切断される個所を含むもの （図 2の白抜き部分） 、 実質的に配列表の配列番号 1に示す塩基配列の 遺伝子を有するものなどがある。
本発明は第 2に、 該プロモーターを含むベクタ一である。
また、 本発明は第 3に、 該ベクターによって形質転換することを 特徴とするトランスジエニック植物の作出方法である。
さらに、 本発明は第 4に、 前記べクタ一によって形質転換された トランスジヱニック植物である。 図面の簡単な説明
図 1は、 S—アミラ一ゼ遺伝子のプロモーター領域を含むクロ一 ンのフィジカルマップを示す図である。
図 2は、 S -アミラーゼ遺伝子の構造遺伝子の 5 ' 末端領域と yg—アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む 2. 4 k b Sal I - Sal 1断片のフィジカルマップを示す図である。
図 3は、 レポータープラスミ ドの構築過程を示した図である。 図 4は、 各細胞系の G U S活性を示した図である。
図 5は、 耐熱性; 8—アミラーゼの発現ベクター p S B G 5 0 3を 示した図である。
図 6は、 本発明により耐熱性 ;8—ァミラーゼ遺伝子を導入したプ ロトプラスト由来の植物個体の種子から抽出した —アミラーゼの 耐熱性を比較した図である。 発明を実施するための最良の形態
前述したように、 大麦S—アミラーゼは、 大麦種子から得られる S—アミラーゼ （ 1 , 4一 一 D—グルカンマルトヒドロラーゼ CE C 3. 2. 1.2〕 ) である。
この酵素の遺伝子として、 上記の如く、 特定品種について c DNA の全塩基配列が報告されているが、 /S -アミラ一ゼ遺伝子の転写を 調節するプロモーター領域に関しては、 遺伝子を単離したり、 その 塩基配列を解明したという報告は未だ全くなされていなレ、。
ところで、 大麦植物体内においては、 大麦 /3—アミラーゼは登熟 中の種子において特異的に合成され、 種子胚乳可溶性夕ンパク質の 1〜 2 %を占める主要なタンパク質であることが知られている (Heredi tas, 93, 311 (1980))。
これらのことから、 植物種子中での物質生産を目指す上で、 外来 遺伝子を植物体内に導入する際に、 その転写調節因子として植物種 子中で特異的に発現するプロモータ一領域を利用できると考えた。 また、 特に大麦 一アミラーゼ遺伝子のプロモー夕一領域を単離、 特定し、 これを利用して外来遺伝子を植物種子中に導入することに 着目した。
本発明を具体的に説明するため、 大麦5—ァミラーゼ遺伝子のプ 口モーター領域を単離、 解析し、 これを用いて発現べクタ一を作製 し、 これを植物種子中に導入して外来遺伝子を発現させるプロセス について詳述する。
なお、 本発明において 「実質的に配列表の配列番号 1に示す塩基 配列の遺伝子」 とは、 この遺伝子が植物種子中で有意のプロモータ —活性を有する限り塩基のいくつかについて欠失、 置換、 付加等が あってもよいことを示すものである。
( 1 ) 大麦染色体 DNAの調製
大麦染色体 D N Aは、 どの組織の細胞にも同じものが存在する。 ここでは大麦種子を、 バーミキユライト中で 2 0 °C、 喑所で 7日間 発芽させた第一葉から該染色体 D N Aを調製することができる。 こ の DN Aの調製は公知の方法で行うことができ、 例えば 「クロ一二 ングとシーケンス一植物バイオテクノロジ一実験マニュアル」 、 農 村文化社、 2 5 2頁 （ 1 9 8 9 ) 等に記載の方法で行うことができ る。
( 2 ) 大麦染色体ライブラリーの作製
大麦染色体ライブラリーは、 大麦染色体 D NAを用いて作製する ことができる。 作製は公知の方法で行うことができ、 例えば 「クロ —ニングとシーケンス一植物バイオテクノロジ一実験マニュアル」 、 農村文化社、 2 7 2頁 （ 1 9 8 9 ) 等に記載の方法で行うことがで さる。
( 3 ) プローブの作製
大麦染色体ライブラリーのスクリーニングに使用するプローブは 適当な DNA断片、 すなわちスクリ一ニングすべき遺伝子と塩基配 列的に相補性をもつ DNA断片を DIG- High Prime (ベーリンガーマ ンハイム社製） で標識処理することにより作製することができる。
( 4 ) 大麦 ;5—アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域のクローン化 大麦^—アミラーゼのプロモー夕一領域のクローン化は、 上記の
( 3 ) で作製したプローブを用いて大麦染色体ライブラリーをスク リ一ニングすることにより行うことができる。 このスクリーニング は公知の方法で行うことができ、 例えば 「クローニングとシ一ゲン ス—植物バイオテクノロジ一実験マニュアル」 農村文化社、 1 3 4 頁 （ 1 9 8 9 ) 等に記載の方法で行うことができる。 また、 目的ク ローンの検出は DIG Luminescent Detection Ki t (ベーリンガ一マン ハイム社製） を用いて行うことができる。
( 5 ) 塩基配列の決定
塩基配列の決定は、 マキサム一ギルバートの化学修飾法 (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980))ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結 法 （Gene， 19, 269 (1982)) などにより決定することができる。
( 6 ) レポータープラスミ ドの作製
得られたプロモータ一領域のプロモー夕一活性は、 プロモーター 領域の下流に β一グルクロニダ一ゼ遺伝子 （ G U S ) などのレポー ター遺伝子とノパリン合成酵素遺伝子 (N 0 S ) ターミネ一ターな どの転写終結因子を連結してレポ一タープラスミ ドを作製し、 レポ 一夕一遺伝子の翻訳産物の活性を測定することで確認することがで きる。 レポーター遺伝子および転写終結因子は、 例えばプラスミ ド ρΒΙ 101 (CL0NTECH社製） など市販のものを用いることができる。
( 7 ) 登熟種子胚乳細胞でのプロモータ一活性の検出
作製されたレポータープラスミ ドを用 、て登熟種子胚乳細胞にお けるプロモーター活性を測定するには、 公知の方法を用いることが できる (Plant Cel l Reports, 10, 595 (1992)) 。 すなわち、 登熟 種子胚乳細胞よりプロトプラストを調製し、 ポリエチレングリコー ル法 (例えば Theor. Appl. Genet. , 91， 707 (1995)、 特開平 7— 1 8 4 4 9 2号公報参照） などの公知の方法によってレポ一夕一プ ラスミ ドを導入し、 得られた細胞系の G U S活性を測定すればよい。 ( 8 ) 形質転換植物の作出
本発明の大麦 —アミラ一ゼ遺伝子のプロモー夕一を用レ、て発現 ベクタ一を作製し、 該ベクターで形質転換植物体を育成する。
発現べクタ一として本発明で用いるプラスミ ドとしては、 1例と して発現させる遺伝子を耐熱性 /S—アミラーゼ、 転写調節因子とし て本発明のプロモーター、 転写終結因子として力リフラヮ一モザィ クウィルスの 3 5 Sターミネータ一を用いることにより、 植物種子 中に耐熱性S—アミラーゼを生産させる。
プロモーターへ連結する耐熱性 ^—ァミラーゼ遺伝子は、 生物由 来あるいはその遺伝子を改変することにより得られる耐熱性 ―ァ ミラーゼ遺伝子を用いることが可能である力く、 本発明者らは大麦の β _ Ύミラーゼ遺伝子の部位特異的変異によって得られた耐熱性S ーァミラ一ゼ遺伝子 （特開平 7— 3 2 7 6 8 1号公報参照） を用い た。
この組み換えプラスミ ドを植物細胞にに直接導入するには、 エレ クトロポレーシヨン法 （例えば Nature, 319, 791 (1986)参照） 、 ポリエチレングリコール法、 パーティクルガン法 （例えば Nature, 327, 70(1987)参照） 、 レーザ一穿孔法 （例えば Barley Genetics VI， 231 (1991) 参照） ， ァグロパクテリゥ厶法 （例えば Plant 丄， 6, 271 (1994)参照） などを用いることが可能であるが、 本発明者 らは、 実験材料として大麦を、 また遺伝子導入法としてはプロトプ ラストへのポリエチレングリコール法を用レ、た。
ォォムギプロトプラストは、 好ましくは未熟胚由来カルス （Kihara and Funatsuki, 1995, Plant Sci. , 106: 115-120、 特開平 7— 2 1 3 1 8 3号公報参照） あるいは未熟胚由来カルスから確立した再分 化能を有する懸濁培養細胞 (Kihara and Funatsuki, 1994, Breeding Sci. , 44:157-160, Funatsuki and Kihara, 1994, Plant Cell Rep. , 13:551 -555、 特開平 4 - 3 6 0 6 3 3号公報参照） より、 セル口 一ス分解酵素およびべクチン分解酵素を用レゝる一般的なプロトプラ スト調製法によつて調製することができる。
プロトプラストよりコロニーが形成された時点で、 液体培地およ び懸濁培養細胞を除去し、 例えばジエネティシン （G 4 1 8 ) 、 ノヽ ィグロマイシン、 ビアラフォスなどの選択試薬を含む液体培地中で さらに培養を行うと、 抵抗性コロニーの発達が見られる。
これらの発達したコロニーを、 例えばジヱネティシン （G 4 1 8 ) 、 ハイグロマイシン、 ビアラフォスなどの選択試薬を含む固体培地上 に移植する。 ェンプリオジェニックなカルスあるいは胚様体の形成 力観察されるので、 これらを選択試薬を含まなレ、固体培地にに移植 すると、 植物体の再分化が見られる。
こうして得られた植物体は鉢上げを行い、 通常の栽培条件、 例え ば 1 6時間日長、 1 0 0 0 0ルクス、 1 8 °Cの環境で栽培すると、 稔性のある形質転換植物体を得ることができる。
得られた種子より /3—アミラーゼを抽出し、 熱処理を行った後、 アミラーゼの活性を調べ、 而 ί熱性の調査を行う。 なお、 アミラーゼ の活性は、 澱粉の糖化反応を利用することにより測定できるが、 本 発明者らは、 少量のサンプルで容易に活性を測定でき、 かつ大麦 ーァミラーゼの活性のみを測定できるァミラーゼ測定試薬 （商品名 ：ダイヤカラー ΑΜΥ、 小野薬品工業 （株） 製） を用いた。
実施例
次に、 本発明を実施例により詳しく説明するが、 本発明はこれら に限定されるものではない。 実施例 1
大麦染色体 DNAの調製
大麦種子（はるなニ条） 約 1 0 0 0粒を、 バーミキユラィト中で 2 0 °C、 喑所で 7日間発芽させた。 得られた第一葉 （約 6 5 g ) を 切り取り、 約 1 c mに細片化した後、 染色体 DNAを調製した。 そ の結果、 1 0 g分の第一葉から約 1 m gの DNAが抽出できた。
実施例 2
大麦染色体ライブラリ一の作製
実施例 1で調製した染色体 D NA 1 5 0〃 gを 1 Uの Sau3AIを用 いて、 3 7てで 1時間、 部分分解を行レ、ショ糖密度勾配遠心法を用 いて断片の分画を行った。 1 8 k b程度の断片を含む画分を精製後、 ファージベクター E M B L 3 (ストラタジーン社製） に組み込 んだ。 Gigapack I I Gold (ストラタジーン社製） を用いてラムダフ ァ一ジ粒子中にパッケージングし、 大腸菌 XLl- Blue MRACP2) (スト ラタジーン社製） を形質転換して得た。
実施例 3
プローブの作製
プローブは、 特願平 7— 9 2 0 0 4号明細書記載の大麦S—アミ ラーゼ構造遺伝子由来の EcoRV- Hind 111断片、 すなわち配列表の配 列番号 2に記載した塩基配列を有する D NA断片を、 DIG- High Prime (ベ一リンガーマンハイム社製） を用いてジゴキシゲニン標識する ことにより作製した。
実施例 4
大麦S—アミラーゼ遺伝子のプロモータ一領域のクローン化 実施例 2で作製した大麦染色体ライブラリーのプラークをナイ口 ンメンプレン 「Hybond N」 （アマシャム社製） に写し取り、 実施例 3で作製したプローブを用いて常法に従ってプラークハイブリダィ ゼーシヨンによるスクリーニングを行った。 目的クローンの検出に は DIG Luminescent Detection Kit (ベ一リンガーマンハイム社製） を用いた。 この結果、 1つの陽性クローンを得た。 このクローンに は ;8—ァミラ一ゼ構造遺伝子の 5 ' 末端領域とプロモー夕一領域を 含む上流域が含まれていた。
得られたクローンのフィジカルマップを図 1に示す。 図中の略号 は、 制限酵素の切断認識部位で、 細線はベクター部分、 黒塗り部分 は —アミラーゼ構造遺伝子の 5 ' 末端領域、 白抜き部分はプロモ 一夕一領域を含む上流域を表している。 また、 矢印はS—アミラー ゼ遺伝子の向きを表している。
実施例 5
S—アミラーゼ遺伝子のプロモー夕一領域の塩基配列の決定 実施例 4で得られた陽性クローンから —アミラーゼ構造遺伝子 の 5 ' 末端領域とプロモーター領域を含む 2. 4 k bの Sal 卜 Sal I 断片をプラスミ ド PUC119に組み込み、 Ki lo-Sequence用 Deletion Ki t (宝酒造 （株） 製） を用いてデレーンヨンクローンを作製した 後、 ジデォキシヌクレオチド鎖終結法により塩基配列を決定した。
2. 4 k b Sal I— Sal I 断片のフィジカルマップを図 2に示す。 図中の略号は、 制限酵素の切断認識部位で、 黒塗り部分はS—アミ ラーゼ構造遺伝子の 5 ' 末端領域、 白抜き部分はプロモーター領域 を含む上流域を表している。
配列表の配列番号 1に、 決定された —アミラーゼ遺伝子のプロ モータ一領域の塩基配列を示す。 また、 配列表の配列番号 3に、 2. 4 k b Sal I -Sal 〖 断片の決定された部分塩基配列を示す。 yS -アミラーゼ構造遺伝子の 5 ' 末端領域の塩基配列を、 すでに得 られている大麦8 -アミラーゼの構造遺伝子（特願平 7— 9 2 0 0 4 号明細書） と比較することにより、 得られた DNA断片が —アミ ラーゼ遺伝子であることが確認された。 また、 プロモーター領域に は、 真核生物のプロモーター領域において広く存在する TATAポック スが存在した。
実施例 6
レポータープラスミ ドの作製
レポ一夕一プラスミ ドは図 3に示される方法によって作製した。 すなわち、 プラスミ ド pBI 101 (CLONTECH社製） の G U S遺伝子と N O Sターミネータ一を含む Hind I I I- EcoRI断片をプラスミ ド pUC 118の Hind I I I， EcoRI 部位に組み込み、 プラスミ ド pBI 11とした。 一方で、 実施例 5において作製したデレーンヨンクローンのうち 配列表の配列番号 3に示される塩基配列の 1から 1 6 7 2の位置の 断片、 すなわち配列表の配列番号 1に示されるプロモーター領域と β - ラーゼ構造遺伝子の 5 ' 末端領域 3 4 1 b ρを含むプラス ミ ドから、 この領域を含む Pst I -EcoRI 断片を切り出し、 ブランテ ィングキット （宝酒造株式会社製） を用いて末端を平滑化し、 ブラ スミ ド pBI 11の Sma I 部位へ挿入して、 レポ一夕一プラスミ ド pSBG 530 とした。
さらに、 pSBG 530の；5—アミラーゼプロモーター領域の 5 ' 末端 側をコードする Hind I l l-Hind I I I 断片を除去し、 レポーターブラ スミ KpSBG 530dHとした。
実施例 7
登熟種子胚乳細胞でのプロモータ一活性の検出
単離されたS—アミラーゼ遺伝子のプロモータ一領域の登熟種子 胚乳細胞における活性は、 実施例 6において示されたレポ一タープ ラスミ ドを用いたトランジェントアツセィ系で確認した。
まず、 開花後 1 4日程度の大麦品種 B o m iの登熟種子の殻皮を 剝ぎ、 7 0 %ェ夕ノールで 1回、 5倍希釈した次亜塩素酸で 1回殺 菌し、 水で 3回洗浄した。 胚乳を押し出し、 0. 4%セルラ一ゼ， 1 1 % マンニトールを含む CP W溶液（0. 2mM ΚΗ2 Ρ04 , 1 OmM CaC 12 , 1 mM MgS04 , 1 mM KNOs ) で 25°Cにて 1晚処理した。
得られたプロトプラストを 1 1 % マンニトールを含む CPW溶 液で洗った後、 1形質転換系あたり 1 06 プロトプラストになるよ うに分注し、 DNA 30 zg, C 1 00 S溶液 （7%ソルビトー ル， 1 0 OmM CaC 12 , 4. 7mM MES (pH5. 7) ) 200 1を加えて懸濁し、 40%ポリエチレングリコール 1 540 を含む C 1 00 S溶液 （pH7. 0) 0. 5m lを加えて 1 0分間 処理した。
LW溶液 (Lazzeri et al., Theor. Appl. Genet., 81:437 (1991)) 1 0m lを加えて遠心し、 沈殿に L 1培地 （Theor. Appl. Genet. 81
:437 (1991)) 3m 1を加えて、 25°Cで一晩培養した。 培養液に L W溶液 20m lを加えて遠心し、 沈殿を G US抽出溶液 （0. 05M
NaPO4， 0. 0 1 M EDTA, 0. 1 % サルコシン， 0. 1 % トリ トン X— 1 00, 0. 1 % 2—メルカプトエタノール） 200 ζ 1に懸濁して凍結融解を 2回繰り返し、 遠心上清をプロモ 一夕一活性測定のための粗酵素液として使用した。
すなわち、 得られた粗酵素液を 4ーメチルゥンベリフヱリル一^一 D—グルクロニドと反応させた後、 0. 2M 炭酸ナトリウム溶液 で反応を止め、 4ーメチルゥンベリフヱリルの生成を測定し、 プロ モーター活性とした。 また、 タンパク質の定量は、 バイオラッド社 の "プロテインアツセィ" を用いて行った。
各細胞系の GUS活性を図 4に示した。 図 4より、 単離された ーァミラーゼプロモーター領域が大麦登熟種子胚乳細胞において活 性を持っていることが確認された。 また、 pSBG 530dHを導入した細 胞系では、 pSBG 530を導入した細胞系より GUS活性が 3分の 2程 度に低下することから、 プロモータ一領域として配列表の配列番号 1に示された領域が必要であることが確認された。
実施例 8
形質転換植物の作出
Kihara and Funatsuki(1994, Breeding Sci., 44:157-160) ある いは Funatsuki and Kihara(1994, Plant Cell Rep. , 13:551- 555)の 方法に従い、 大麦 （品種： I gr i) の長さ約 0. 5〜し 0mm の未熟胚を L 2培地に植え付けカルスを誘導した。 1ヶ月後、 形成 したカルスを L 1液体培地に移植し、 弱光化 （500ルクス） で 2 〜4ヶ月振とう培養を行い、 直径約 1〜 3mmの細胞塊よりなる液 体懸濁培養を作出した。
該細胞 1 gに対して約 1 0m lの酵素液 （セルラ一ゼオノズカ RS 1. 0%、 ぺクトリアーゼ Y— 23 0. 1 %、 MES 5mMを LW液を加え、 25°Cで 2〜3時間静置した。
こうして得られたプロトプラスト懸濁液を 64 //および 26； /メ ッシュで濾過したのち、 遠心処理してプロトプラストを収集した。 次いで、 LW液を用い 3度洗浄を行った。
次に、 1〜3 X 1 06 個のプロトプラストを、 1 0〃gZm lの プラスミ ド PSBG 503 (耐熱性; 8—アミラーゼの発現べクタ一、 図 5参照） 、 1 00111^の〇3 (： 12 、 0. 6 Mのソルビトール、 0. 1 %の MESを含み、 pHを 5. 7に調整した 250〃 1の液 体媒体 （Ca— S) に懸濁した。 プラスミ ドはカナマイシン而 i†生遺 伝子と耐熱性 —アミラーゼ遺伝子を含むプラスミ ドであり、 カナ マイシン耐性遺伝子にはィネアクチンプロモーターとカリフラワー モザイクウィルス 35 S夕一ミネ一夕一 （35 S t) 、 耐熱性; 8 一アミラーゼ遺伝子には配列表の配列番号 1に示される大麦 —ァ ミラ一ゼのプロモーター領域と力リフラワーモザイクウィルス 35 Sタ一ミネ一夕一が、 それぞれ転写調節因子および転写終結因子と して連結されている。 また、 耐熱性 ^—アミラーゼ遺伝子には大麦 β— Ύ ラーゼ遺伝子の第 1イントロンが含まれている。 この懸濁 液にポリエチレングリコールを 40%含み、 ρΗを 7. 0に調整し た 600 1の Ca— Sを滴下した。 5分ごとに振とうしながら 1 0 分間静置した。 1 Omlの LW液を加えて希釈した後、 遠心処理し てプロトプラストを回収した。
回収したプロトプラストは、 0. 6 Mのマルト一ス、 2. Omg ノ Lの 2， 4一 D、 1. 8%のァガロースを含む 1 m 1の L 1培地 に懸濁し、 速やかに 6 cmシャーレ上に広げた。 このとき、 直径約 4. 5 cmの円盤状にした。 固化した後、 シャーレより剝離し、 2 0 Omg/m 1のォォムギ液体懸濁細胞を含む 5 m 1の液体培地 （ プロトプラストを懸濁したものと同成分） 中で振とう培養を行った。 なお、 振とう速度は 50 r pmにした。
プロトプラスト培養開始後 1 5日目に液体培地および懸濁培養細 胞を除去し、 ジヱネティシン （G4 1 8) 20〃g/m lを含む液 体培地 3m lを添加した。 これをさらに 1 4日間振とう培養行った ところ、 ァガロース中あるいはその表面または液体培地中に抵抗性 コロニーの発達が見られた。
これらの発達したコロニーを、 ジエネティシン （G 4 1 8) 20 gZm 1を含み、 植物ホルモンとして 0. 5mgZLの 2, 4— Dおよび 1. OmgZLのベンジルァミノプリン （BAP) を含む L 3培地上に移植した。 いずれの培地においても移植後 3〜1 5日 目にェンプリオジェニックなカルスまたは胚様体の形成が観察され た。
これらのカルスまたは胚様体を、 選択試薬を含まず、 0. 5mg ZLの 2, 4—Dおよび 1. OmgZLの BAPを含む L 3培地上 に移植した。 この段階までは弱照明下（約 500ルクス） 、 25°C で培養した。 約 3〜1 5日で植物体 （地上部） の再分化が見られた。 十分な発芽が認められた時点で、 強照明下（約 7000ルクス） に 移動させた。
こうして得られた植物体は、 さらに植物体ホルモンを含まない L 3培地上に移植して発根を促した。 約 1ヶ月後に鉢上げを行った。 鉢上げ後は、 1 6時間日長、 1 0 0 0 0ルクス、 1 5 °Cの環境で栽 培したところ、 形質転換したォォ厶ギ植物体が多数得られた。 得ら れた植物体中に、 耐熱性 —ァミラ一ゼ遺伝子断片が存在している か否かをポリメラーゼ連鎖反応法 （PCR法） を用いて調査した結 果、 その存在が確認された。
この個体の登熟中種子より、 1 OmMの DTTを含む 5 OmlV [酢 酸バッファーを用いてアミラーゼを抽出し、 50〜75°C (2. 5 で間隔） で 30分の熱処理を行った後、 ダイヤカラー AMYにて /S 一アミラーゼ活性の測定を行い、 耐熱性を調査した。 結果を図 6に 示す。
図から明らかなように、 対照の耐熱性 -アミラ一ゼ遺伝子が導 入されていないプロトプラスト由来個体の種子サンプル pと比較し て、 耐熱性/ S—アミラーゼ遺伝子が導入されている種子サンプル a, bには、 耐熱性 yS—ァミラ一ゼが蓄積されていることが確認された。 特に、 種子サンプル aでは、 耐熱性8—アミラーゼの蓄積が顕著で あることがわかった。 産業上の利用可能性
本発明により、 植物種子中に特異的に発現する遺伝子のプロモー 夕一が提供され、 特に /S—ァミラーゼ遺伝子のプロモー夕一領域の 塩基配列および登熟種子中での活性が明らかとなった。 このプロモ 一夕一に適当な外来遺伝子および転写終結因子を連結して大麦、 そ の他の植物に導入すれば、 大麦、 その他の植物の種子を意図的に改 良したり、 あるいは種子での物質生産が可能となり、 植物育種の分 野に貢献できる。
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Claims

請求の範囲
( 1 )植物種子中で導入遺伝子を発現可能なプロモータ一。
(2)導入遺伝子の発現が、 登熟植物種子中で可能である請求の範 囲 1記載のプロモーター。
(3)大麦種子中で可能である請求の範囲 1または 2記載のプロ乇 —ター。
(4)分子量が 1. 28kbであり、 制限酵素 Sal I， Apa I, Xba I, Bam HI, Hind III, EcoT 221, Xba I および Bam HI により、 この 順序で切断される個所を含む請求の範囲 1〜 3のいずれかに記載の プロモーター （図 2の白抜き部分） 。
( 5 )実質的に配列表の配列番号 1に示す塩基配列の遺伝子を有す ることを特徴とする請求の範囲 1〜4のいずれかに記載のプロモー 夕一。
( 6 )請求の範囲 1〜5のいずれかに記載のプロモータ—を含むベ クタ一。
( 7 ) 請求の範囲 6記載のベクタ一によつて形質転換することを特 徵とするトランスジエニック植物の作出方法。
(8)導入遺伝子が、 S—アミラーゼ遺伝子である請求の範囲 7記 載のトランスジヱニック植物の作出方法。
(9) 一アミラーゼ遺伝子が、 耐熱性 β—Ύ ラーゼ遺伝子であ る請求の範囲 8記載のトランスジ ニック植物の作出方法。
(1 0) トランスジ ニック植物力 大麦である請求の範囲 7〜9 のいずれかに記載のトランスジヱニック植物の作出方法。
(1 1)請求の範囲 6記載のベクタ一によって形質転換されたトラ ンスジヱニック植物。
(12)導入遺伝子が、 /3—アミラーゼ遺伝子である請求の範囲 1 1 記載のトランスジエニック植物。
( 1 3 ) —アミラ一ゼ遺伝子が、 耐熱性 yS—ァミラーゼ遺伝子で ある請求の範囲 1 2記載のトランスジエニック植物。
( 1 4 ) トランスジエニック植物が、 大麦である請求の範囲 1 1〜
1 3のいずれかに記載のトランスジエニック植物。
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