JPH07143895A - アルファ−アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域を含んでなる遺伝子発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 工程：植物のα−アミラーゼ遺伝子から誘導
されたプロモーター領域および所望の遺伝子産生物をコ
ードする遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主細胞
を培養し、前記プロモーター領域のコントロール下に前
記遺伝子の発現を促進し、そして発現された遺伝子産生
物を回収することを特徴とする、遺伝子産生物をコード
する遺伝子を植物宿主細胞の中で発現させることによっ
て遺伝子産生物を生産する方法。 【効果】 植物細胞における外来遺伝子の発現のための
新規な発現系を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子産生物を生産す
る方法、とくに遺伝子産生物をコードする遺伝子を植物
宿主細胞の中で発現させることによって所望の遺伝子産
生物を大量生産し、これにより前記所望の遺伝子産生物
を植物宿主細胞の培地から回収することができる方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】植物細胞の培養発現系は、バクテリア、
酵母またはバクロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｕｉｒｕｓ）
の発現系を越えた利点を有する。バクテリアは発現した
タンパク質の翻訳後の修飾を行わず、そして酵母はそれ
を制限された程度にのみ行う。植物細胞は高等真核生物
であり、そしてタンパク質の適切な機能のためにしばし
ば必要とされる、複雑なタンパク質の修飾を実施するこ
とができる。

【０００３】バクロウイルスは高等真核生物のための潜
在的な形質転換ベヒクルであり、そして一般にタンパク
質の満足すべき修飾を行うが、バクロウイルスを培養す
るためのコストは植物細胞についてより非常に高い。さ
らに、宿主細胞はバクロウイルスにより究極的に溶解さ
れ、そして発現したタンパク質と一緒に数千の宿主タン
パク質が混合されそして培地の中に解放され、これが発
現したタンパク質の精製を困難とする。

【０００４】植物細胞のための培地は主として塩類およ
びビタミン類を含有し、したがって、バクロウイルスの
トランスフェクションのために使用される昆虫の細胞系
の培養に使用される培地よりコストとが非常に少ない。
そのうえ、植物細胞のための培地は血清を供給する必要
がないが、ほとんどすべての動物細胞の培養物は血清な
しでは生き残ることができない。さらに、植物細胞は真
核生物であり、その中で発現したタンパク質は適当に後
修飾されて、前記タンパク質を機能的にしかつ植物細胞
から分泌することができるようにする。植物タンパク質
の分泌メカニズムはまだ深くは理解されていないが、現
在それは動物の分泌メカニズムに類似しうるということ
が普通に信じられている。

【０００５】こうして、植物細胞の培養物は薬物、酵
素、香味剤および芳香油の潜在的商業的源であることが
できる。このような化合物の植物細胞での生産は、
（１）それらが植物により少量であるいは植物のつかの
間のまたは収穫できない段階において生産されるとき、
（２）それらが農業に適さないか、あるいは消滅するま
たは容易に得られない環境に対して生来的である植物に
より生産されるとき、および（３）化合物が生体外でま
たは他の生合成系により満足に合成できないとき、探求
される。

【０００６】しかしながら、植物細胞の培養により産生
物を生産する試みは、所望の産生物の非効率的生産およ
び分泌、劣った細胞の成長、および培養における適当な
細胞のタイプの維持の困難のような因子のために、しば
しば商業的に成功しない。カルスのアルファ−アミラー
ゼ（α−アミラーゼ）の発現系は、植物細胞の発酵技術
に使用される潜在的特徴、すなわち、その高い発現、持
続した発現、細胞培養由来の組織または細胞培養におけ
る組織の発酵に無関係の発現、およびその産生物の分泌
を有する。イネのカルスそれ自体は商業的α−アミラー
ゼの理想的な源でないが、高い発現の原因となる遺伝子
の調節領域を、組み換えＤＮＡ技術および植物の形質転
換の助けにより使用して、他の価値があるタンパク質の
高い発現を達成することができる（Carl R.Simmons et
al.(1991),Biotechnology and Bioengineering, 38:545
-551）。

【０００７】澱粉は２つのタイプの多糖類すなわち直鎖
の澱粉および分枝鎖の澱粉を含み、そして穀類における
基本的な貯蔵された栄養成分である（T.Akazawa et al.
(1985),Ann.Rev.Plant Pysiol., 36:441-472）。穀類の
種子の初期の発芽期間の間に、糊粉層（ａｌｅｕｒｏｎ
ｅ ｌａｙｅｒ) の細胞は合成してα−アミラーゼを形
成するであろう。アルファ−アミラーゼ、α−グルコシ
ダーゼおよびデキストリナーゼを制限する酵素は胚乳
（ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ) の中に分泌され、そして一緒に
なって澱粉を加水分解してグルコースおよびマルトース
を形成して、胚芽の成長に要求される栄養を提供する
（Rogers,J.C.,J.Biol.Chem., 259 (19):12234-12240,1
985;Roger J.G. J.Biol.Chem. 260 :3731-3738,1985)。

【０００８】加水分解に寄与する他の酵素は、澱粉を加
水分解してマルトースおよびグルコースのわずかの部分
を形成するβ−アミラーゼを包含する。β−アミラーゼ
は、通常乾燥した種子においては、タンパク質とのジサ
ルファイド結合の組み合わせにより胚乳の中に不活性の
形態で存在する。種子が発芽するとき、糊粉層の細胞は
また、ＧＡ₃ により誘導され、これによりプロテアーゼ
を生産し、これはジサルファイド結合を破壊し、そして
活性な形態のβ−アミラーゼを解放することができる。
上の４つの酵素は、種子の発芽の間に、澱粉の加水分解
に参加する。しかしながら、α−アミラーゼが大部分の
量を生産し、そして大部分の重要な役割を保持する（Ak
azawa et al.(1985),Ann.Rev.Plant Pysiol., 36:441-4
72）。

【０００９】ＧＡ₃ はα−アミラーゼの発現に直接の影
響を発揮する（Chandler,P.M.et al.(1984),Mol.Biol.
３:401-418）。イネの種子をＧＡ₃ で処理するとき、糊
粉層の細胞により新しく合成されたα−アミラーゼのｍ
ＲＮＡは正常値の５０〜１００倍に増加する（O'Neill,
S.D.et al.(1990),Mol.Gen.Genet. 221:235-244）。実
際には、ＧＡ₃ によるα−アミラーゼ遺伝子の発現の調
節は、植物における遺伝子の発現のホルモンの調節メカ
ニズムを研究するための、非常に理想的なモデルを提供
した（Ho,T.H.D.et al.(1987),"Regulation of gene ex
pression in barley a eurone layers,":Molecular Bio
logy of Plant Growth Control,Liss,A.R.（編）pp．35
−49、ミゾリー州ルイス）。

【００１０】従来、イネ、オオムギおよびコムギからの
α−アミラーゼ遺伝子は大量にクローニングされ、そし
てさらに研究および分析されてきている。その結果、こ
れらの穀類型α−アミラーゼのイソ酵素またはイソ形態
のすべてはいくつかの型のα−アミラーゼ遺伝子により
生産されることが示された（Baulcombe,D.C.(1987),Mo
l.Gen.Genet. 209:33-40）;Haung,N.et al.(1990a)。Pl
ant Mol.Biol. 14:655-668;Knox,C.A.P.et al.(1987),
Plant Mol.Biol. ９:3-17 ）。

【００１１】オオムギおよびコムギの種子の発芽期間の
間に糊粉層の細胞から分泌されたα−アミラーゼは、２
つのクラス、すなわち高い等電点および低い等電点のも
のを含む。オオムギにおいて、高い等電点に属する約７
つのα−アミラーゼ遺伝子および低い等電点に属する約
３〜４つの遺伝子が存在する（B.Khursheed およびJ.C.
Robers,J.Biol.Chem. 263;18593-18960, 1988）。

【００１２】現在、オオムギの７つのα−アミラーゼの
ｃＤＮＡおよび９つのα−アミラーゼのゲノムＤＮＡの
群がクローニングされている（Chandler,P.M.et al.(19
84),Plant Mol.Biol. ３:401-418;J.DeikmanおよびR.L.
Jones,Plant Physiol.78:192-198,1985;Khrusheed およ
びRogers(1988), 前掲:Knox,C.A.P.et al.(1987)前掲)
。コムギのα−アミラーゼ遺伝子はα−Ａｍｙ１、α
−Ａｍｙ２およびα−Ａｍｙ３のグループに分けられ
る。

【００１３】アルファ−Ａｍｙ１は高い等電点を有する
が、α−Ａｍｙ２は低い等電点を有し、そして両者の少
なくとも各々は発芽する種子において発現される１０以
上の遺伝子を有する。アルファ−アミラーゼα−Ａｍｙ
３は未熟の種子の中で発現される３〜４遺伝子を含む
（Baulcombe et al.(1987)前掲）。

【００１４】イネのα−アミラーゼ遺伝子の研究に関
し、そのα−アミラーゼ遺伝子は、オオムギおよびコム
ギと同様に、高い等電点の群および低い等電点の群とし
て分類される。実際には、マクグレゴール（ＭａｃＧｒ
ｅｇｏｒ）A.W.et al.（CerealChem.65:326,1988 ）は
等電点の電気泳動の分析法を適用し、そしてイネのα−
アミラーゼのイソマーが５．５より小さいｐＩ値を有す
ることを発見した。

【００１５】したがって、イネは高い等電点のイソ形態
をもたない可能性がある。フアング（Huang ）,N.et a
l.(Nucl.Acids Res. 18:7007-7014,1990b）は、１０の
イネのα−アミラーゼ遺伝子を交差ハイブリダイゼーシ
ョン実験により５つの群に分け、そして５つの染色体の
中のその分布を確認した（Ranjhan et al.、オリジナル
の原稿はまだ作成中である）。オー’ネイル（O'Neill
）et al.(Mol.Gen.Genet. 221:235-244, 1990）は、
イネのα−アミラーゼのｃＤＮＡ ｐＯＳ１０３および
ｐＯＳ１３７の最初のいっそう詳細な研究を行った。ｐ
ＯＳ１０３およびｐＯＳ１３７から作ったα−アミラー
ゼは、４８ＫＤａの分子量の前駆体タンパク質を有す
る。

【００１６】この酵素が細胞の中から外に分泌されると
き、前駆体タンパク質のシグナルペプチド鎖は切断され
るであろう。したがって、成熟α−アミラーゼの分子量
は約４５〜４６ＫＤａであり、そしてその等電点は約
６．０であると予測される。しかしながら、クマガイ、
M.H.et al.(Gene,94:209-216, 1990）は、サッカロミセ
ス（Saccharomyces ）の細胞の中にｐＯＳ１０３をサブ
クローニングして、サッカロミセス（Saccharomyces ）
がα−アミラーゼを培地の中に分泌するようにし、そし
てα−アミラーゼの分子量が約４４〜４５ＫＤａであ
り、そして等電点が約４．７〜５．０であることが見出
された。

【００１７】他方において、双子葉植物のアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による形質転換はよく確
立されそして広く使用されている。アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中のＴｉプラスミド
のＴ−ＤＮＡの境界の間に担持された多数の外来遺伝子
は植物細胞に供給され、染色体の中に組み込まれ、そし
て引き続く世代により安定に遺伝される。しかしなが
ら、これは一般に単子葉植物に当てはまらなかった。過
去において、単子葉、とくにイネ科の作物種はアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主領域の
外にあると考えられてきている（Bevan,M.W.,Nucl.Acid
s Res.12:8711-8721,1984;Declene,M.,Phytopathol.Z.
113:81-89）。経済的に重要な単子葉種から開発された
遺伝子転移法は、原形質体の中への方向づけられたＤＮ
Ａの転移、あるいは胚のカルスの完全な細胞または懸濁
細胞の中への直接のＤＮＡの転移の粒子放出法に制限さ
れてきている。

【００１８】近年、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する単子葉の形質転換について
のデータは段々蓄積されてきている。アスパラガス・オ
フィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａ
ｌｉｓ）（Bytebier,B.et al.(1987),Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,85:5345-5349)およびジオスコレア・ブルフィフ
ェラ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｂｕｌｂｉｆｅｒａ）（Sc
hafer,W.et al.(1987)) のゲノムＤＮＡの中へのアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮ
Ａの組み込みの実証は、いくつかの単子葉種がアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質
転換される可能性を有することを最初に示した。

【００１９】後に、イネ、すなわちオリザ・サチバ（Ｏ
ｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のゲノムＤＮＡの中へのＴ−
ＤＮＡの組み込みの報告（Raineri,D.M.et al.(1990),B
io／Technology 8:33-38）は、イネ科作物の植物をアグ
ロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により
形質転換できることをさらに示した。最近、外来遺伝子
がトウモロコシの中に首尾よく形質転換され、そして植
物の再生およびＦ１子孫において形質転換された遺伝子
の検出が実証された（Gould,J.et al.(1991),Plant Phy
siol.95:426-434)。したがって、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子転移系は単
子葉植物の形質転換に適用可能であるように思われる。

【００２０】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）仲介形質転換は複雑なプロセスであり、そし
ていくつかの因子が関係する（概観について、参照、Ho
oykaas,P.J.J.,Plant Mol.Biol.13:327-336,1986）。ビ
ルレンス系の活性化は植物腫瘍の誘導における初期の重
要な段階である（Garfinkrl,D.J.,J.Bacteriol.144:732
-743,1980)。Ｔｉプラスミド上のｖｉｒ遺伝子は、それ
らがある種の植物因子により誘導されるようになるま
で、サイレントであり、これはタバコにおいてフェノー
ル系化合物であるアセトシリンゴンおよびα−ヒドロキ
シアセトシリンゴンとして同定された（Stachel,S.E.et
al.(1985),Nature,318:624-629)。これらの化合物は植
物組織から、ことに創傷後、解放され、これらはアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を経る植
物の腫瘍発生のための前提条件であると知られてきてい
る。

【００２１】最初に、一般に、単子葉種はアグロバクテ
リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感受性でな
く、ある単子葉種（例えば、アスパラガス）はＴ−ＤＮ
Ａの転移後腫瘍を形成する傾向がある（Hernalsteens,
J.P. et al.(1984),EMBO J.3:3039-3041)。アグロバク
テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による単子葉
のヤマイモ・ヤーム・オニドコロ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅ
ａ）（ｙａｍ）のディスク上の腫瘍の形成は、双子葉植
物からの滲出物との予備インキュベーションを必要とし
（Schafer,W.et al.(1987),Nature,327:529-531)、いく
つかの単子葉植物はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換されたＴｉプラスミド
上のｖｉｒ遺伝子の発現を活性化するために十分な誘導
因子を多分生産しないことが示される。

【００２２】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）の増殖およびＴｉプラスミド上のｖｉｒ遺伝子の発
現を阻害する毒素または阻害因子がコムギ（Usami,S.et
al.(1988)Proc.Natl,Acad.Sci.USA,85:3748-3752)およ
びトウモロコシ（Sahi,S.U.et al.(1991),Proc.Natl,Ac
ad.Sci.USA,87:3879-3883)の中に存在することが示さ
れ、そして単子葉植物をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で形質転換しようと試みる間に問
題を引き起こすことがあるであろう。それにもかかわら
ず、コムギおよびカラスムギはＴｉプラスミドのｖｉｒ
位置の発現およびＴ−ＤＮＡのプロセシング反応を誘導
する物質を含有することが示されたが、コムギの誘導物
質はアセトシリンゴンと異なる（Usami,S.et al.(198
8)、前掲）。

【００２３】従来、ジャガイモの懸濁培養（ＰＳＣ）が
インジカ型イネのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換のために必須であることが
報告された（Chan,M.T.et al.,"Transformation of ind
ica rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriu
m."Plant Cell Physiol.(1992),33:577-583。その開示
を本発明の開示の一部分としてここに引用によって加え
る）。ＰＳＣはフェノール系化合物のアセトシリンゴン
（ＡＳ）およびシナピン酸（ＳＡ）に富んでいる。形質
転換の成功または効率におけるこれらの化合物の役割は
まだ知られていないが、結果はアグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する単子葉植物、少
なくともイネの形質転換をある種の物質の添加により改
良することができることを意味する。

【００２４】植物組織の年令および生理学的状態はアグ
ロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形
質転換のために重要であることが示された（An,G.et a
l.(1986),Plant Physiol.81:301-305;Chan,M.T.et al.
(1992)前掲);H.H.Chang およびM.T.Chan,Bot.Bull.Acad
emia Sinica 32:171-178,1991 、これらを本発明の開示
の一部分としてここに引用によって加える;Dale,P.J.et
al.(1989),Plant Sci.63：237 ;Gould,J.et al.(１９
９１）、前掲;Hernalsteens J.P.et al.(1984)、前
掲）。

【００２５】これが示唆するように、アグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による感染およびＴ
−ＤＮＡの転移は、適当な組織を形質転換のために使用
する場合、単子葉植物において起こる。イネの根の若い
組織は、適当な条件を適用する場合、アグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換され
る、より大きい可能性を有することが以前に示され(Cha
n,M.T.et al.(1992)前掲) 、そして若い組織は比較的よ
り少ない阻害因子またはよりビルレンスの誘導因子を含
有できることが仮定された。したがって、イネの形質転
換のための未熟の胚およびＰＳＣの組み合わせを本発明
において使用することができる。

【００２６】本発明は、イネの発芽する種子におけるジ
ベレリン酸（ＧＡ₃ ）による調節に加えて、イネの懸濁
培養した細胞の中のα−アミラーゼ遺伝子の発現は培地
の中に存在する炭水化物のレベルにより調節されるとい
う本発明者らの発見に基づく（Yu,SuMay et al.(1991),
J.Biol.Chem. 266:21131-2137 、これらを本発明の開示
の一部分としてここに引用によって加える）。

【００２７】α−アミラーゼの合成およびそれらのｍＲ
ＮＡのレベルはショ糖の枯渇下に大きく誘導される。α
−アミラーゼ合成の増加は、外因性炭素源が消耗された
とき、エネルギー源として細胞の澱粉の加水分解を加速
すると仮定される。培地の中に糖を適切に供給した通常
の成長条件下で、α−アミラーゼ遺伝子の発現は代謝物
抑制（metabolic repression）にかかる。さらに、培養
したイネ細胞により合成されたα−アミラーゼは培地の
中に分泌され、そして培地の中に存在する全タンパク質
の約１５〜２０％に達することがあることが観察され
た。

【００２８】したがって、α−アミラーゼ遺伝子のプロ
モーターおよびシグナルペプチドを利用して、植物宿主
細胞の中で発現可能なベクターを構成することによっ
て、植物細胞培養における遺伝子発現系を開発すること
は有利であろう。任意の外来遺伝子を前記プロモーター
およびシグナルペプチドをコードする配列の下流に連結
することができる。次いで、この構成体を使用して適合
性の植物宿主細胞を形質転換することができる。

【００２９】理論的には、α−アミラーゼのプロモータ
ーは前記植物細胞の中の外来遺伝子の発現および培地の
中へのタンパク質の分泌を制御するであろう。したがっ
て、このような発現系は大量の重要なタンパク質を発現
するおよび／または発現されたタンパク質の精製を大き
く促進するように培地の中に分泌する、高い可能性を有
する。

【００３０】スクリーニングの手順を助け、そして／ま
たは上に構成した遺伝子の発現系の発現効率をさらに増
強するために、前記遺伝子発現系はさらに適当なマーカ
ー遺伝子、リポーター遺伝子、抗生物質耐性遺伝子およ
び／またはエンハンサー遺伝子を含むことができ、それ
らのすべては関係する分野の専門家によく知られている
遺伝子である（Manatis,T.et al.,"Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,",Cold Spring Harbor Laborator
y 、第２版、１９８９）。

【００３１】

【発明の概要】したがって、本発明の１つの面におい
て、植物宿主細胞の中で発現可能なベクターを構成し、
前記ベクターは植物のα−アミラーゼ遺伝子から誘導さ
れたプロモーター領域、および所望の遺伝子産生物をコ
ードする遺伝子を含んでなり；適合性の植物宿主細胞を
前記ベクターで形質転換し；生ずる形質転換体の宿主細
胞を培養し；前記培養した形質転換体の宿主細胞を糖消
耗または糖不含条件に暴露して、前記プロモーター領域
の制御下に前記遺伝子の発現を促進し；そして発現され
た遺伝子産生物を回収する、ことを含んでなる、遺伝子
産生物をコードする遺伝子を植物宿主細胞の中で発現さ
せることによって遺伝子産生物を生産する方法が提供さ
れる。

【００３２】本発明の他の面において、植物宿主細胞の
中で発現可能なベクターを構成し、前記ベクターは植物
のα−アミラーゼ遺伝子から誘導されたプロモーター領
域、および所望の遺伝子産生物をコードする遺伝子から
なり、α−アミラーゼ遺伝子から誘導された前記プロモ
ーター領域はプロモーターおよびシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を含み；適合性の植物宿主細胞を前
記ベクターで形質転換し；生ずる形質転換体の宿主細胞
を培地中で培養し；発現された遺伝子産生物を前記培地
から回収する、ことを含んでなる遺伝子産生物をコード
する遺伝子を植物宿主細胞の中で発現させることによっ
て遺伝子産生物を生産する方法が提供される。

【００３３】イネのα−アミラーゼは少なくとも１０の
別々のメンバーを含む多遺伝子（multi gene）族により
コードされる。ＧＡおよび糖がイネにおけるα−アミラ
ーゼ遺伝子の発現を調節する方法を理解するために、異
なるα−アミラーゼ遺伝子を代表するα−アミラーゼｃ
ＤＮＡクローンを同定することが重要である。これらの
クローンは、それらの対応するゲノムのクローンを分離
するために使用される。

【００３４】本発明において、異なる制限パターンを示
すα−アミラーゼｃＤＮＡクローンをプラスミドベクタ
ーｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）中で
のサブクローニングのために選択した。生ずるクローン
を、それぞれ、０．６，１．０，１．４および１．５kb
の挿入部の大きさをもつ、αＡｍｙ６−Ｃ（Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ α−アミラーゼｃＤＮＡ）、αＡｍｙ
７−Ｃ、αＡｍｙ８−ＣおよびαＡｍｙ１０−Ｃと表示
した。

【００３５】これらのｃＤＮＡクローンの３′末端領域
をさらにサブクローニングし、そして配列決定した。α
Ａｍｙ６−Ｃ、αＡｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ８−Ｃの
配列決定した３′領域は、それぞれ、報告されたイネα
−アミラーゼ遺伝子ＲＡｍｙ３Ｂ（Sutliff et al.,199
1)、ＲＡｍｙ１Ａ（Huang et al.,1990a）およびＲＡｍ
ｙ３Ｅ（Huang et al.,1990b）のそれらと同一であるこ
とが見出された。ｐＯＳＡｍｙ１０−Ｃに相当するゲノ
ムＤＮＡはまだ報告されていない。

【００３６】イネの培養した懸濁細胞の中でのこれらの
４つのα−アミラーゼ遺伝子の発現パターンは、構成さ
れた遺伝子特異的プローブを使用して決定された。αＡ
ｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ８−Ｃの発現は１２日に、そ
れぞれ、６倍および３７倍誘導され、そして１４日に増
加し続けた。αＡｍｙ１０−Ｃの発現は１４日に５倍の
増加で後誘導された。Ａｍｙ６−Ｃの発現もまた、１２
日に４倍に増加したが、それは１４日に基底レベルに減
少した。他のアルファ−アミラーゼ遺伝子、αＡｍｙ３
−Ｃの発現は、糖の枯渇後、５倍に増加した（Ｓ．
Ｍ．，Ｙｕ、発表されない結果）。

【００３７】したがって、これまで検査してきた５つの
アルファ−アミラーゼ遺伝子の間で、αＡｍｙ８−Ｃは
糖の枯渇後に最も豊富に発現される遺伝子である。さら
に、αＡｍｙ８−Ｃは、ｐＯＳＡｍｙ−Ｃのプローブで
検出したとき、全アミラーゼ転写体の４０倍の増加を構
成する主要な遺伝子の１つであることに注意することは
価値がある。結果は、培養した細胞における炭水化物の
枯渇に応答するアルファ−アミラーゼ遺伝子の発現が一
時的かつ量的に調節されることを示す。

【００３８】結局、イネのアルファ−アミラーゼ遺伝子
（αＡｍｙ８）のプロモーター領域を含有する発現ベク
ターを構成して、形質転換されたイネの細胞の中でβ−
グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を発現させた。ＣａＭＶ
３５Ｓ ＲＮＡプロモーターの下流に配置されたヒグロ
マイシン耐性遺伝子ｈｐｈを選択マーカーとして使用し
た。異なる形質転換法、例えば、原形質体または完全な
細胞のエレクトロポレイション、粒子の衝突、マイクロ
インジェクション法、超音波法、ポリエチレングリコー
ル仲介原形質体形質転換、ポリ−Ｌオルニヒン法、リン
酸カルシウム法（Hain,R.et al.(1985),Mol.Gen.Genet.
199:161-168）、およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換系を適用してプラス
ミドＤＮＡをイネの細胞の中に供給することができる。
ＧＵＳの発現は、形質転換後２日に、衝突されたまたは
エレクトロポレイションした細胞の中で検出された。こ
の結果は、α−アミラーゼプロモーター−ＧＵＳキメラ
遺伝子がイネの細胞において機能的であることを示す。

【００３９】α−アミラーゼのプロモーターにより駆動
されるリポーター遺伝子は、ジャポニカ型のイネ（オリ
ザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）L.cv.Tainung
62）において、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子転移系を使用して、トランスフ
ェクトおよび発現される。この系はβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）およびネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ（ＮＰＴＩＩ）のキメラ遺伝子を含むプラスミドを
含んでなり、そしてこのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換効率はジャガイモ懸濁
培養物（ＰＳＣ）の同時インキュベーションにより改良
された。

【００４０】ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩ遺伝子は、それぞ
れ、イネのアルファ−アミラーゼ遺伝子（αＡｍｙ８）
およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）ノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）のプロモータ
ーの制御下にあるとき、両者共トランスジェニックのカ
ルスおよび植物の中で発現された。実験のデータは、首
尾よい遺伝子の転移および本発明により作られたキメラ
遺伝子の性的遺伝を実証する。

【００４１】

【発明の具体的な説明】本発明の特徴および利点は、添
付図面を参照する以下の詳細な説明において明らかとな
るであろう。本発明は、植物細胞中のα−アミラーゼプ
ロモーター、さらに詳しくはイネのα−アミラーゼプロ
モーターによる発現の調節に関する。アルファ−アミラ
ーゼは、穀類の発芽の間の胚乳の中に貯蔵された澱粉の
加水分解のための主要な澱粉加水分解酵素である。すで
にわれわれが示したように、イネにおけるα−アミラー
ゼ遺伝子の発現は２つの異なる調節のモード下にある：
Ｉ）発芽する種子におけるホルモンの調節およびＩＩ）
利用可能な炭水化物の栄養物質により培養した細胞にお
ける代謝抑制（metabolic reprssion)（Yu,S.M.et al.
(1991),J.Biol.Chem. 266:21131-21137）。われわれの
前の観察は高等植物における炭水化物の代謝の潜在的に
重要な制御のメカニズムを示唆し、これは発芽するイネ
の種子の胚の中のα−アミラーゼ遺伝子の抑制を説明す
ることができる（Karrer,E.E.et al.(1991),Plant Mol.
Biol. 16:797-805）。

【００４２】こうして、イネにおけるα−アミラーゼ遺
伝子の発現を調節する分子のメカニズムを理解するため
に、われわれはα−アミラーゼ遺伝子の中の調節要素の
機能の分析にα−アミラーゼのプロモーターの制御下に
リポーター遺伝子を有するトランスジェニックイネを使
用した。これを実施するために、４つのα−アミラーゼ
ｃＤＮＡクローンを、ジベレリン酸（ＧＡ₃ ）処理した
イネの糊粉層のポリ（Ａ） ⁺ＲＮＡから誘導されたｃＤ
ＮＡライブラリーから分離した。ヌクレオチド配列の分
析は、４つのｃＤＮＡが異なるα−アミラーゼ遺伝子か
ら誘導されたことを示す。イネの発芽する種子および懸
濁培養した細胞における個々のα−アミラーゼ遺伝子の
発現を、遺伝子特異的プローブを使用して研究した。

【００４３】発芽する種子において、α−アミラーゼ遺
伝子の発現は、一時的に共同するが量的に別個の方法で
ＧＡ₃ によりポジティブに調節される。対照的に、培養
した懸濁細胞において、α−アミラーゼ遺伝子の発現は
培地の中に存在する糖によりネガティブにかつ差別的に
調節される。さらに、１つの強いおよび１つの弱い炭水
化物の枯渇に応答性のα−アミラーゼ遺伝子が同定され
る。

【００４４】イネのα−アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域（ＨＳ５０１）とイネの糊粉細胞の中のＧＡ₃ 誘
導性ＤＮＡ結合性タンパク質との間の相互作用もまた研
究される。ＤＮＡの移動シフトアッセイは、糊粉タンパ
ク質がＨＳ５０１内の２つの特異的ＤＮＡ断片と相互作
用することを示した。一方の断片は、２つの不完全な直
接に反復したピリミジンボックスおよび推定上のジベレ
リンの応答要素を含有する、位置−１３１〜−１７０の
間に位置する。他方の断片は推定上のエンハンサー配列
を含有する位置−９２〜−１３０の間に位置する。糊粉
タンパク質とこれらの２つの断片との間の相互作用は、
配列特異的およびＧＡ応答性である。

【００４５】さらに、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子転移系を使用してジャポ
ニカ型のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｃｖ．
Ｔａｉｎｕｎｇ６２）の中のα−アミラーゼのプロモー
ターにより駆動されるリポーター遺伝子をわれわれは首
尾よく転移させそして発現させた。未熟のイネの胚（開
花後１０〜１２日）を、β−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）およびニオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎ
ＰＴＩＩ）のキメラ遺伝子を含有するプラスミドを有す
るアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
菌株で感染させた。ジャガイモ懸濁培養物（ＰＳＣ）と
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）接
種物との同時インキュベーションは、イネの形質転換効
率を有意に改良した。

【００４６】ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩの遺伝子は、それ
ぞれ、イネのα−アミラーゼ遺伝子（αＡｍｙ８）のプ
ロモーターおよびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）ノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）の
制御下にあり、両者共トランスジェニックのカルスおよ
び植物において発現された。トランスジェニック植物の
ゲノムの中への外来遺伝子の導入は、サザンプロット分
析により確証された。１つのトランスジェニック植物
（ＴＩ）におけるＧＵＳ活性の組織化学的局在化は、成
熟した葉、茎、鞘および根のすべての細胞型において機
能するが、非常に若い葉において機能しない。

【００４７】このトランスジェニック植物は、野生型植
物よりゆっくり成長し、そしてより少ない種子を生産し
た。ＧＵＳ活性は、また、この植物の子孫（Ｒ１）から
誘導されたカルスにおいて検出された。ＧＵＳ遺伝子断
片を、同一トランスジェニック植物のＲ１子孫から分離
されたＤＮＡを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により
増幅した。これらのデータは、キメラ遺伝子の首尾よい
遺伝子の転移および有性遺伝を実証する。

【００４８】したがって、本発明において、アグロバク
テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるイネの
形質転換および再生した植物およびジャポニカ型遺伝子
のイネのＲ１子孫におけるα−アミラーゼのプロモータ
ー駆動リポーター遺伝子の首尾よい発現をわれわれは記
載する。われわれが知るかぎりでは、これはイネのアグ
ロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形
質転換を代表しかつトランスジェニックイネの子孫によ
り転移されたＤＮＡの遺伝を実証する最初の報告であ
る。したがって、本発明において使用する選択された外
来遺伝子（ＧＵＳ）は本発明の遺伝子の発現系において
次の２つの役割を演ずることが理解されるであろう：本
発明の遺伝子発現系の中に挿入すべき外来遺伝子として
および前記遺伝子発現系の首尾よい形質転換を示すため
のリポーター遺伝子として。

【００４９】実施例Ｉ：方法 ： ａ）糊粉ＲＮＡの調製、ｃＤＮＡライブラリーの作製、
およびα−アミラーゼｃＤＮＡクローンのスクリーニン
グするための条件は次の通りであった：イネ（Ｏｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｃｖ．Ｌａｂｅｌｌｅ）の種子
を２．５％の次亜塩素酸ナトリウムの中で２０分間表面
滅菌し、無菌の蒸留水でよく洗浄し、そして無菌の１０
μモルのＧＡ₃ ／２０ミリモルのＣａＣｌ₂ ／２０ミリ
モルのクエン酸ナトリウムの中で異なる長さの時間の間
インキュベーションした。

【００５０】発芽する胚を切断し、そして糊粉層を胚乳
から剥離した。集めた糊粉層を液体Ｎ₂ の中で直ちに凍
結させ、そして使用するまで−７０℃において貯蔵し
た。全ＲＮＡをベランガー（ｂｅｌａｎｇｅｒ）、F.C.
ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1354-1358, 1986）の
方法に従い凍結した糊粉層から分離した。ポリ（Ａ） ⁺
ＲＮＡをＨＹＢＯＮＤ−ｍＡＰ親和性紙（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）で精製した。１μｇのポリ（Ａ） ⁺ＲＮＡを使用
して、ラムダーｇｔｌｌの中でアマーシャム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）のｃＤＮＡ合成およびクローニング系を使用
してｃＤＮＡライブラリーを構成した。

【００５１】ｃＤＮＡライブラリーはほぼ２×１０⁷ の
独立の組み換えクローンから成っていた。ほぼ２×１０
⁴ プラークをイネのゲノムのクローン、ｐＯＳＡｍｙ−
Ｃの³²Ｐ標識した１．５kbの断片を使用してスクリーニ
ングした（J.K.Kim およびR.Wu(1922),Plant Mol.Biol.
18:399-402）。ラムダーｇｔｌｌの中のｃＤＮＡクロー
ンをＥｃｏＲＩで切断し、そしてｐブルースクリプト
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）の中にサブクローニング
し、そしてＥ． ｃｏｌｉ菌株ＸＬ１−Ｂ（Ｓｔｒａｔ
ｇｅｎｅ）の中で維持した。

【００５２】ＤＮＡ配列決定をジデオキシヌクレオチド
連鎖停止技術を使用して実施した。ヌクレオチド配列の
分析および比較は、ウィスコンシン大学の遺伝学のコン
ピューター・グループ（the Genetics Computer Group,
University of Wisconcin)の配列分析のソフトウェアの
パーケージ（バージョン５．０、１９８７年６月）。ヌ
クレオチド配列を整列させ、そしてギャップ（破線）を
導入して配列の類似性を最大にする。４つのクローンの
間の相同性配列を星印（＊）により示す。

【００５３】翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグ
ナルに下線が引かれている。遺伝子特異的領域の５′境
界を矢印により示し、そしてＤＮＡの切頭のために使用
した制限酵素をそれらの対応する部位の下に示す。ヌク
レオチド配列を配列決定した領域の最初の塩基から番号
を付す。ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）、ＥＭＢＬ
およびＤＤＢＪにおけるｐＯＳＡｍｙ−Ｃについての受
け入れ番号はＭ８１１４３である。

【００５４】ｂ）³²Ｐ標識した遺伝子特異的プローブの
調製のための条件は次のようにして実施した：４つのα
−アミラーゼｃＤＮＡは、図１に示す制限酵素を使用し
て遺伝子特異的領域の５′末端において切断した。Ｔ３
ＲＮＡポリメラーゼによる４つの切断ｃＤＮＡの試験
管内転写は、それぞれ、Ａｍｙ６−Ｃ−３′，αＡｍｙ
７−Ｃ−３′およびαＡｍｙ１０−Ｃ−３′を代表す
る、大きさ２１０，１１２，１１９および５０ヌクレオ
チドのアンチセンス鎖の転写体を生ずる。³²Ｐ−ＵＴＰ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ、試験したＳＰ−６）を使用してプ
ローブ標識した。

【００５５】α−アミラーゼ遺伝子特異的プローブの特
異性を実証するサザンプロット分析を図２に示すように
実施し、ここで：パネル１：α−アミラーゼｃＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＯＳＡｍｙ−ＣをＢａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで１％のアガロー
スゲル上で電気泳動させ、そして臭化エチジウムで染色
した。パネル２〜５：パネル１に示すのと同一のゲルの
４つの複製をジーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅ
ｎ）膜にプロッティングし、³²Ｐ標識した遺伝子特異的
プローブと４２℃において１２時間ハイブリダイゼーシ
ョンした。

【００５６】ハイブリダイゼーション後、膜を０．１×
ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中で５５℃において４０
分間洗浄した。ベクターを、また、ハイブリダイゼーシ
ョンさせた。なぜなら、アンチセンスＲＮＡプローブ
は、ｃＤＮＡが挿入される、ＥｃｏＲＩ部位とＴ３プロ
モーターとの間に多数クローニング部位６２bpの配列を
含有したからである。分子量マーカーを左に示す。

【００５７】ｃ）イネのゲノムの中のα−アミラーゼ遺
伝子のサザンブロット分析を次のようにして実施した：
全体のイネのゲノムＤＮＡを発声後２ヵ月の室温で成長
させた植物から分離した。イネの葉を液体Ｎ₂ の中で微
細粉末に粉砕し、尿素抽出緩衝液〔４２ｇ／mlの尿素、
５モルのＮａＣｌ、１モルのトリス−Ｃｌ（pH８．
０）、０．５モルのＥＤＴＡ（pH８．０）、および２０
％のサルコシン〕および等しい体積のフェノール−クロ
ロホルムで室温において１５分間抽出した。遠心後、酢
酸アンモニウム（pH５．２）およびイソプロパノールを
上澄み液に添加した。

【００５８】ＤＮＡは直ちに沈澱し、そしてガラスフッ
クでスプールにし、７５％および１００％のエタノール
中ですすぎ、そして空気乾燥した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液
の中に再懸濁させ、そして４℃において貯蔵した。１０
μｇのゲノムＤＮＡを６つの制限酵素で消化し、０．８
％のアガロースゲルを使用して電気泳動により分画し、
そしてジーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ）膜
（ＤｕＰｏｎｔ）に移した。膜をαＡｍｙ１０−Ｃの³²
Ｐ標識した１．５kbのα−アミラーゼｃＤＮＡの挿入で
プロービングした。分子量マーカーを左に示す。

【００５９】ｄ）イネの発芽する種子および懸濁培養し
た細胞の中のα−アミラーゼｍＲＮＡの蓄積。イネの種
子を10μモルのＧＡ₃ の中で異なる時間の間発芽させ
た。発芽する胚を切断し、そして全糊粉ＲＮＡをベラン
ガー（Ｂｅｌａｎｇｅｒ）、F.C.et al.（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 83:1354-1358, 1986）の方法に従い胚不含
む種子から精製した。イネの懸濁細胞を従来記載された
ように培養した（Yu,S.M.et al.(1991),J.Biol.Chem. 2
66:21121-21137）。ＲＮＡをショ糖を含有する培地の中
で８，１０，１２および１４日間成長させた細胞から精
製した。

【００６０】全ＲＮＡの５μｇを各レーンに適用した。
ＲＮＡのブロット分析はトマス（Thomas)P.S.(Methods
Enzymol. 100:255-266, 1983）の方法に従い実施した。
ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）の中の
全体のα−アミラーゼの解読領域を含有するプラスミド
ｐＯＳＡｍｙ−Ｃを、イネのゲノムのクローンＯＳＡｍ
ｙ−Ｃから本来サブクローニングした（J.K.Kim および
R.Wu(1992),Plant Mol.Biol.18:399-402）。

【００６１】ｐＯＳＡｍｙ−Ｃの１．５kbのα−アミラ
ーゼＤＮＡの挿入を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ
Ｉによりプラスミドのベクターから切除し、マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）et al.(Molecular Cloning;A Lab
oratory Manual、コールド・スプリングス・ハーバー・
ラボラトリー、１９８２）に記載されているようにゲル
精製し、そして〔ａ−³²Ｐ〕−ｄＣＴＰでランダムプラ
イマー法により標識した（A.P.FeinbergおよびB.Vogels
tein(1983), Analyt.Biochem. 132:6-13 ）。４つのイ
ネのα−アミラーゼｃＤＮＡの各々に相当する遺伝子特
異的プローブを調製し、そして図２に記載するように標
識した。プローブのすべてにより検出されたｍＲＮＡの
大きさは１．６kbである。

【００６２】ｅ）イネをα−アミラーゼ遺伝子の５′特
異的ＤＮＡ断片への糊粉タンパク質抽出物の結合、ここ
で糊粉層の抽出物の調製法およびＤＮＡ移動−シフト
（ゲル遅延）アッセイは従来記載されたものであった
（Yu,S.M.et al.(1990）前掲）。結果を図５に示す。こ
こで：（Ａ）断片Ａ，ＢおよびＣはＨＳ５０１の５′末
端における３つの連続する４０bpの合成ＤＮＡ断片であ
った。充填したボックスは、２つの不完全な直接に反復
したピリミジンのボックスの位置およびＧＡＲＥ様要素
を示す。

【００６３】オープンボックスは１１bpの推定上の要素
を示す。（Ｂ）糊粉タンパク質の断片Ａ，ＢおよびＣと
の相互作用。（＋）および（−）は、それぞれ、タンパ
ク質抽出物の存在または不存在下の反応を示す。Ｂ１，
Ｂ２およびＢ３は３つのタンパク質−ＤＮＡ複合体の位
置を示す。Ｆは遊離のＤＮＡプローブを示す。（Ｃ）断
片Ａ，ＢおよびＣのヌクレオチド配列。番号は転写開始
部位に関する３つの断片の位置を示す。下線はピリミジ
ンのボックスの位置を示す。破線はエンハンサー様要素
の位置を示す。

【００６４】結果： （Ａ）イネｃＤＮＡのクローニングおよび特性決定 イネｃＤＮＡライブラリーを、プローブとしてα−グル
コシダーゼＯＳＡｍｙ−Ｃ（J.K.Kim およびR.Wu(199
2),Plant Mol.Biol.18:399-402）を用いてスクリーニン
グした。異なる制限パターンを示すα−アミラーゼｃＤ
ＮＡクローンの４つを選択して、プラスミドベクターｐ
ブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）の中にサ
ブクローニングした。生ずるクローンをＡｍｙ６−Ｃ
（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ α−アミラーゼｃＤＮ
Ａ）、αＡｍｙ７−Ｃ，αＡｍｙ８−ＣおよびαＡｍｙ
１０−Ｃ（それぞれ、０．６，１．０，１．４および
１．５kbの大きさをもつ）と表示した。

【００６５】これらのｃＤＮＡクローンの３′末端領域
をさらにサブクローニングしそして配列決定した（図
１）。Ａｍｙ６−Ｃ、αＡｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ８
−Ｃの配列決定した３′領域は、それぞれ、α−アミラ
ーゼ遺伝子のＲＡｍｙ３Ｂ（Sutliff,T.D. et al.(199
1),Plant Mol.Biol. 16:579-591）：ＲＡｍｙ１Ａ（Hua
ng,N.et al.(1990a)Plant Mol.Biol.14:655-668）およ
びＲＡｍｙ３Ｅ（Huang,N.et al.(1990b)Nucl.Acids Re
s.18:7007-7014）のそれらと同一であることが発見され
た。αＡｍｙ６−Ｃ、αＡｍｙ７−Ｃ、αＡｍｙ７−Ｃ
およびαＡｍｙ１０−Ｃの詳細な配列情報は配列表の配
列番号：１，２，３および４にそれぞれ示し、ここでα
Ａｍｙ１０−Ｃは１回のみ配列決定された。

【００６６】（Ｂ）イネのα−アミラーゼ遺伝子特異的
プローブの構成 ３′未翻訳領域のヌクレオチド配列の比較は、６９％の
同一性を示すαＡｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ１０−Ｃを
除外して、４つのα−アミラーゼｃＤＮＡクローンの間
で非常に低い同一性（２３〜２７％）を示す（図１）。
これらの４つのｃＤＮＡクローンの相同性領域からの非
相同性（遺伝子特異的）領域の分離およびアンチセンス
ＲＮＡプローブの調製のために、制限部位を選択した。
使用した制限酵素および遺伝子特異的領域のヌクレオチ
ド配列を図１に示す。

【００６７】４つのｃＤＮＡの各々に相当する遺伝子特
異的領域を、Ａｍｙ６−Ｃ−３′，αＡｍｙ７−Ｃ−
３′，αＡｍｙ８−Ｃ−３′およびαＡｍｙ１０−Ｃ−
３′と表示する。適当な領域をαＡｍｙ１０−Ｃ−３′
のために選択し、ここでαＡｍｙ７−Ｃ−３′と非常に
低い相同性が存在する。次いで交差ハイブリダイゼーシ
ョンを実施して遺伝子特異性を決定し、そして結果は各
プローブがそれらのそれぞれの親のｃＤＮＡのみにハイ
ブリダイゼーションすることを示した（図２）。これら
の遺伝子特異的プローブのいずれも、本来ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングにプローブとしてを使用した
ｐＯＳＡｍｙ−Ｃにハイブリダイゼーションしなかっ
た。結果は、４つの遺伝子特異的プローブが異なるα−
アミラーゼ遺伝子を識別することができることを実証し
た。

【００６８】（Ｃ）イネのα−アミラーゼは１つの遺伝
子族によりコードされる４つの別個のα−アミラーゼｃ
ＤＮＡの同定は、イネのα−アミラーゼが１つの遺伝子
族によりコードされることを示す。イネの中のα−アミ
ラーゼ遺伝子の数を決定するために、イネの葉から分離
した全ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、そして
全体のαＡｍｙ１０−Ｃ配列で低いストリンジェンシイ
でプロービングした（図３）。全ＤＮＡをＥｃｏＲＩで
消化したとき、８または９つの制限断片が観察された。

【００６９】結果は一般のイネにα−アミラーゼ遺伝子
の報告された制限地図と一致する（Huang,N.et al.(199
0a）前掲) 。２つのα−アミラーゼ遺伝子が１つのＥｃ
ｏＲＩ断片上に連鎖することが示された（Huang,N.et a
l.(1990b）前掲) ので、イネの全ゲノムは少なくとも１
０の遺伝子を含有すると推定される。平行なゲノムＤＮ
Ａのブロットを、また、４つのイネのα−アミラーゼ遺
伝子特異的プローブとハイブリダイゼーションさせた。
各遺伝子特異的プローブはただ１つの制限断片に特異的
にハイブリダイゼーションし（データは示されていな
い）、各プローブが１つのα−アミラーゼ遺伝子から誘
導されることがさらに確認された。

【００７０】（Ｄ）イネの発芽する種子の中のα−アミ
ラーゼ遺伝子の発現 α−アミラーゼ遺伝子族の異なるメンバーの発現が種子
の発芽の間に同一方法で調節されるかどうかを決定する
ために、遺伝子特異的プローブを使用して、ＧＡ₃ 処理
した発芽する種子の中の個々のα−アミラーゼ遺伝子の
発現を研究した。ＧＡ₃ 添加後の時間の関数として糊粉
の中のα−アミラーゼｍＲＮＡの蓄積をＲＮＡブロット
分析により決定した（図４Ａ）。

【００７１】イネのα−アミラーゼのコード領域を含有
するｐＯＳＡｍｙ−Ｃから作ったプローブは、全部でな
いにしても、α−アミラーゼ遺伝子の大部分のｍＲＮＡ
にハイブリダイゼーションすると思われた。α−アミラ
ーゼｍＲＮＡは１日にめったに検出されず、急速に蓄積
し、そして４日にそれらの最大レベルに到達し、４日と
５日との間で急速にターンオーバーした。イネのアクチ
ンのｃＤＮＡクローン、ｐｃＲＡｃｌ．３（McElroy,D.
et al.(1990),Plant Mol.Biol.14:163-171）、その発現
はＧＡにより影響を受けない、を、内部の対照として使
用した。

【００７２】図４Ａに示すｍＲＮＡのレベルは、デンシ
トメーターを使用してオートラジオグラムのシグナルの
強度を測定することによって定量した。各々の日におけ
る各α−アミラーゼ遺伝子の相対的ｍＲＮＡの蓄積は、
ｍＲＮＡのレベルを４日におけるそれらのピークのレベ
ルと比較することによって決定した。各α−アミラーゼ
遺伝子のｍＲＮＡは同様な速度で蓄積したが、ただしα
Ａｍｙ８−Ｃのそれは３日にほとんどピークのレベルに
到達した。

【００７３】しかしながら、Ａｍｙ６−ＣおよびαＡｍ
ｙ８−ＣのｍＲＮＡは、αＡｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ
１０−Ｃのそれらより高い（２倍）速度でターンオーバ
ーした。αＡｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ１０−ＣのｍＲ
ＮＡレベルは、５日におけるそれらの最高レベルの、１
／２に減少したが、対照的に、Ａｍｙ６−ＣおよびαＡ
ｍｙ８−Ｃのそれらは１／４に減少した。次いで、すべ
てのｍＲＮＡレベルは同様に低い速度で減少した。結果
が示すように、発芽する種子の中の４つのα−アミラー
ゼ遺伝子の発現は一時的に対等であるが、定量的に区別
される。

【００７４】（Ｅ）イネの培養した懸濁細胞の中でのα
−アミラーゼ遺伝子の発現 前に、われわれが示したように、イネの培養した懸濁細
胞の中のα−アミラーゼ遺伝子の発現は炭水化物の栄養
の剥奪により誘導される（Yu,S.M.et al.(1991）前
掲）。その報告において、ｐＯＳＡｍｙ−Ｃをプローブ
として使用して、懸濁培養した細胞の中の全体のα−ア
ミラーゼ遺伝子族の発現を研究した。ここで、遺伝子特
異的プローブを使用して、異なるα−アミラーゼ遺伝子
の発現パターンを決定した。

【００７５】われわれが示したように、ショ糖を含有す
る培地の中の糖（アントロン反応により分析した）は、
１２日にほとんど検出できないレベルに消耗した。α−
アミラーゼｍＲＮＡの同時の増加が１２日に観測された
（Yu,S.M.et al.(1991）前掲）。したがって、８，１
０，１２および１４日についてのショ糖を含有する培地
の中で成長した細胞から精製したＲＮＡをＲＮＡのブロ
ット分析のために使用した（図４Ｂ）。ｃＤＮＡクロー
ン、ｐＯＳｃｘ、これは同一ｃＤＮＡライブラリーから
不規則的に選択しそしてその発現は糖の消耗により影響
を受けなかった、を、内部の対照として使用した。

【００７６】図４Ｂに示すｍＲＮＡのレベルは、また、
定量し、そして各々の日における各α−アミラーゼ遺伝
子の相対的ｍＲＮＡの蓄積をｍＲＮＡを８日におけるそ
れらの基底レベルと比較することによって決定した（表
２）。αＡｍｙ７−ＣおよびαＡｍｙ８−Ｃの発現は、
１２日において、それぞれ、６および３７倍に誘導さ
れ、そして１４日まで増加し続けた。

【００７７】αＡｍｙ１０−Ｃの発現はより遅く、１４
日に５倍増加した。Ａｍｙ６−Ｃの発現は１２日に４倍
増加したが、それは１４日に基底レベルに減少した。他
のα−アミラーゼ遺伝子、αＡｍｙ３−Ｃ、の発現は、
糖の枯渇後、５倍に増加した（Yu,S.M. 、発表されない
結果）。したがって、これまで検査した５つのα−アミ
ラーゼ遺伝子の間で、αＡｍｙ８−Ｃは、糖の枯渇後、
最も豊富に発現される遺伝子である。

【００７８】さらに、αＡｍｙ８−Ｃは１つの主要な遺
伝子であり、その転写体はｐＯＳＡｍｙ−Ｃのプローブ
で検出して全体のα−アミラーゼ転写体の４０倍の増加
を構成することに注意することは価値がある。結果が示
すように、培養した細胞の中の炭水化物の枯渇に応答す
る４つのα−アミラーゼ遺伝子の発現は一時的でありそ
して定量的に調節される。

【００７９】（Ｆ）イネのα−アミラーゼ遺伝子のプロ
モーターの特定の領域はＧＡ処理した糊粉層の中のタン
パク質因子と相互作用する。ＨＳ５０１はイネのα−ア
ミラーゼ遺伝子、ＯＳＡｍｙ−ｂの５′末端プロモータ
ー領域に位置するＤＮＡ断片であり（Ou-Lee,T.M.et a
l.(1988) 前掲）、そしてそのＤＮＡ配列は提供された
（Yu,S.M.et al.(1990）、前掲）。後に、ＨＳ５０１の
ヌクレオチド配列は、完全なイネのα−アミラーゼのイ
ソ酵素をコードするＲＡｍｙ３Ｃのそれと同一であるこ
とが発見された（Sutliff,T.D. et al.(1991）、前
掲）。

【００８０】ＨＳ５０１のＤＮＡ配列は、５′非解読領
域の２６０ヌクレオチド、および第２エクソンの最初お
よび一部分の中の２７０ヌクレオチドを含む。ＨＫ３５
０はＨＳ５０１の３′末端欠失誘導体であり、そしてＨ
Ｓ５０１の全体の５′非解読（２６０bp）および最初の
エクソン領域（９０bp）を含有する。ＲＮＡブロット分
析により、ＨＫ３５０とのプロービングにより検出され
た糊粉細胞のα−アミラーゼｍＲＮＡは、また、ＧＡ₃
処理後に増加したことが示された。

【００８１】前に、われわれが示したように、ＨＳ５０
１の５′末端は安定なタンパク質−ＤＮＡ複合体の形成
のために重要である（Ou-Lee,T.M.(1988),supra;Yu,S.
M.etal.(1990）、前掲）。ＨＳ５０１の中のタンパク質
結合部位をより正確に局在化するために、われわれは３
つの連続の二本鎖４０bpのオリゴヌクレオチドを合成
し、これらはＡ，ＢおよびＣと設計し、ＨＳ５０１の
５′末端に位置する（図５Ａ）。タンパク質をＧＡ₃ 処
理した発芽する種子の糊粉組織から抽出し、そして糊粉
タンパク質と合成ＤＮＡ断片との間の相互作用をゲル遅
延アッセイにより検出した（図５Ｂ）。

【００８２】抽出物と断片ＢおよびＣとの相互作用は複
合体Ｂ１，Ｂ２およびＢ３の形成を生じた（図５Ｂ、レ
ーン４および６）。存在する場合、非常に弱い結合がタ
ンパク質抽出物と断片Ａとの間に検出された（図５Ｂ、
レーン２）。ＤＮＡ断片Ａ，ＢおよびＣの比較は、これ
らの断片が多少の類似性を共有することを明らかにする
（図５Ｃ）。タンパク質への断片Ａの弱い結合が低い親
和性または非特異的結合のためであるかどうかは明らか
ではない。それにもかかわらず、結果は断片ＢおよびＣ
内にタンパク質部位が存在することを示された。

【００８３】（Ｇ）ＨＳ５０１に結合するＧＡ依存性お
よび配列特異的タンパク質因子 われわれは他のタンパク質／ＤＮＡ結合アッセイを実施
して、ＤＮＡ結合性タンパク質がＧＡ誘導可能であるか
否かを決定した。３日間ＧＡ₃ で処理したか、あるいは
していない脱胚した種子の糊粉組織からタンパク質を抽
出した。ＧＡ処理した糊粉抽出物のみは、断片Ｂを使用
して３つの複合体を産生した（図６、レーン４）または
Ｃ（データは示されていない）。糊粉抽出物は断片Ａに
結合しなかった（データは示されていない）。ＧＡ未処
理の糊粉抽出物と断片Ｂとの間にＤＮＡ／タンパク質の
相互作用は検出されなかった（図６、レーン２）。結果
が示すように、断片ＢおよびＣに結合する糊粉タンパク
質はＧＡ依存性である。

【００８４】結論： （１）４つのα−アミラーゼｃＤＮＡの各々に相当する
遺伝子特異的プローブの利用可能性は、特定のα−アミ
ラーゼイソ酵素をコードするｍＲＮＡの存在量の検査を
可能とした。個々のα−アミラーゼ遺伝子の発現は対等
に調節されることが発見され、そしてそれらのｍＲＮＡ
はイネの発芽する種子の糊粉層の中に同様な速度および
レベルで蓄積された。しかしながら、異なるα−アミラ
ーゼ遺伝子のｍＲＮＡのターンオーバー速度の差は、発
芽する種子の中の異なるα−アミラーゼ遺伝子の発現に
対する可能な異なる調節を示す。

【００８５】発芽する種子の中で発現された４つのα−
アミラーゼ遺伝子は、糖がなお培地の中に存在すると
き、培養した細胞において低いレベルで構成的に発現さ
れた。４つのα−アミラーゼ遺伝子のうちの３つの発現
は、糖が培地から消耗されたのち、誘導され、そしてＡ
ｍｙ６−Ｃのみは他の３つの遺伝子と異なる発現のパタ
ーンを表す。

【００８６】異なるα−アミラーゼイソ酵素が澱粉の加
水分解において異なる機能を実施するかどうか、および
調節機構が同様な構造および／または機能を有する１組
のα−アミラーゼ遺伝子に示差的に作用しているかどう
かは知られていない。異なる組織におけるα−アミラー
ゼ遺伝子族の異なるメンバーの調節および発現、および
それらの構造および機能的関係についてのそれ以上の研
究は、イネにおけるα−アミラーゼの生理学的役割の理
解の助けとなるであろう。

【００８７】（２）ＧＡおよび糖は同一α−アミラーゼ
遺伝子の発現を調節する。２つの調節モードが同一ある
いは異なる分子のメカニズムにより働くかどうかは知ら
れていない。αＡｍｙ８−Ｃの発現は発芽する種子にお
いてＧＡ調節され、そして懸濁培養した細胞における主
要な代謝調節遺伝子の１つであるので、それはこのよう
な研究のためのすぐれたモデルの遺伝子であろう。調節
の２つの異なるモードおよびそれらの間の相互作用を引
き起こす分子のメカニズムはそれ以上の研究の焦点であ
ろう。

【００８８】（３）糊粉組織は、ＧＡの存在下にのみＨ
Ｓ５０１の断片ＢおよびＣと相互作用するタンパク質を
含有する。断片Ｃは、動物のコアエンハンサー〔ＧＴＧ
ＧＴＴＴ（Ｔ）Ｇ〕、〔ＧＴＧＧＡＡＡ（Ｔ）Ｇ〕に類
似する位置−１０８〜−１１８からの１１bpの断片（Ｇ
ＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴ）を含有する（Gillies, S.D.et
al.,Cell (1983) , 33 : 717-728 ; Weiher, H.et al.
(1983) Science, 219: 629-631)。断片Ｂは位置−１４
５〜−１５２および位置−１５７〜−１６４からの２つ
のピリミジンのボックス（ＣＣＴＣＣＴＴＴ）（ＣＣＴ
ＣＴＴＴＴ）を含有し、これらはイネ、コムギ、オオミ
ギのいくつかのα−アミラーゼ遺伝子および他のＧＡ誘
導可能な遺伝子、例えば、β−グルカナーゼ、カルボキ
シペプチダーゼおよびアレウラインの中に見いだされる
コンセンサス配列（ＣＣＴＴＴＴＣ）（ＴＣＴＴＴＴ
Ｔ）に類似する（Huang, N.et al. (1990a), supra) 。

【００８９】プロモーター欠失分析において、コムギの
α−アミラーゼ遺伝子、α−Ａｍｙ２／５４、のプロモ
ーター領域における３つのピリミジンのボックスのうち
の２つを含む配列はこの遺伝子の高いレベルの発現およ
びＧＡ₃ の調節に要求されることが示された。オオミギ
のα−アミラーゼ遺伝子、Ａｍｙ３２ｂ、のプロモータ
ー領域におけるピリミジンのボックスの突然変異は、発
現の絶対レベルおよび発現へのＧＡの作用の両者を有意
に減少する（Lanahan, M.V.et al. (1992), Plant Cell
４ : 203-211) 。

【００９０】さらに、ＨＳ５０１の断片Ｂにおける第２
ピリミジンボックスに対して直ぐに３′の配列は、−１
３８〜−１４５からＴＡＡＡＴＧＡＧを読み取り、推定
上のＧＡＲＥ要素ＴＡＡＣＡＧＡＧと保存を共有する
（Huang, N.et al. (1990a) 、前掲；Lanahan, M.V.et
al. (1992)、前掲）、これはα−アミラーゼ遺伝子のホ
ルモンの調節を仲介することが示された（Lanahan, M.
V.et al. (1992), supra; Skriver, K.et al. (1991)、
前掲）。ＧＡ応答性タンパク質、ピリミジンボックス、
推定上のＧＡＲＥ要素がイネのα−アミラーゼ遺伝子の
ＧＡ刺激の原因となるトランス−およびシス−調節を表
すか否かはまだ決定されていない。

【００９１】実施例II：この実験において、上の４つの
α−アミラーゼ遺伝子からαＡｍｙ８遺伝子を、さらな
る研究のために選択した。ＧＵＳ／ＮＰＴＩＩを含有す
るキメラ遺伝子の構成その発現は前記αＡｍｙ８遺伝子
およびノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）のコントロ
ール下にある。

【００９２】Ａ）材料および方法： １）植物の材料：形質転換に使用したイネの品種はオリ
ザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）Ｌ．ｃｖ．Ｔ
ａｉｎｕｎｇ ６２であった。開花後１０〜１２日に、
種子の皮を取り、１％のＮａＯＣｌおよび１滴のツイー
ン２０で９０分間滅菌し、そして無菌の蒸留水でよく洗
浄した。未熟の胚を無菌的に層流ベンチで切除した。切
除した胚をＮ６塩類（Chu, C.C et al.,Scientia Sinic
a 18 : 659-668, 1975) 、Ｎ６ビタミン、３％のショ
糖、０．８％のアガロース（ｗ／ｖ）、２μｇ２，４−
Ｄを含有するＮ６ＲＤ培地（Chan, M.T.et al. (1992)
、前掲）上に配置し、そして２５℃において１６時間
光（１０００ルックス）の下で培養した。２日後、未熟
の胚にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）を接種した。

【００９３】２）バクテリア菌株およびプラスミド：イ
ネのα−アミラーゼ遺伝子αＡｍｙ８のコード領域のち
ょうど上流の、分離した１．２kbの断片を、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Jefferson, R.
A.,Plant Mol.Biol.Rotr.５ : 387-405, 1987) にノパ
リンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターと供
に連結して、プロモーターの活性を試験した。このキメ
ラ遺伝子〔αＡｍｙ８（１．２kb）／ＧＵＳ〕をバイナ
リーベクターのプラスミドｐＢＩＮ１９（Bevan, M.W.,
Nucl.Acids Res. 12 : 8711-8721, 1984) のマルチクロ
ーニング領域の制限部位ＸｂａＩおよびＳａｌＩの間に
挿入して、新しいプラスミドｐＡＧ８を発生させた（図
７）。

【００９４】プラスミドｐＡＧ８をアグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株Ａ２８１（Hood, E.F.,Bio
／Technology ２ : 702-709, 1984) の中に凍結−融解
法（Holster, M.et al. (1978), Mol.Gen.Genet.163 :
181-187)を使用して移動化させた。アグロバクテリウム
・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、１００mg／ｌのカナマイシ
ンを含有するＹＥＢ培地（Zaenen, J.,J.Mol.Biol.86 :
109-127, 1974) の中で２８℃において一夜増殖させ
た。

【００９５】Ｂ）形質転換：２５の未熟の胚を滅菌した
ピンセットおよびメスで傷をつけ、そして１０μｌのジ
ャガイモ懸濁培養物（ＰＳＣ）を含有するペトリ皿の中
で２５μｌの一夜培養したアグロバクテリウム（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物と一夜同時培養し、次い
で暗所で２６℃において一夜インキュベーションした。
対照のために、ジャガイモ懸濁細胞を添加しない１０ml
の新鮮なジャガイモ懸濁培養培地（Chang, H.H. (199
0)、前掲）を使用した。ジャガイモ懸濁培養のための条
件は前に記載されている（Chang, H.H. (1991)、前
掲）。

【００９６】感染した未熟の胚を５００μｇ／mlのセフ
ォタクシムを含有するジャガイモ懸濁培養培地で１回洗
浄してアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）を殺し、次いでＮ６塩、Ｎ６ビタミン、４２．５μ
ｇ／mlの４−フルオロフェノキシ酢酸（４−ＦＰＡ）、
３％のショ糖、０．８％（ｗ／ｖ）のアガロース、４０
μｇ／mlのＧ−４１８および５００μｇ／mlのセフォタ
クシムを含有するＮ６ＲＦ培地に移した。この培地のpH
を５．７に調節した後、オートクレーブ処理した。胚を
２５℃において１６時間光（２０００ルックス）下に培
養し、そして毎週の間隔で継代培養した。

【００９７】Ｃ）形質転換体の選択および再生 アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）接
種後３週に培養した胚からカルスが生成した。カルスを
Ｎ６ＲＦＢ（Ｎ６ＲＦに類似するが、１３μｇ／mlの４
−ＦＰＡ、１μｇ／mlの６−ベンジルアミノ−プリン
（６−ＢＡＰ）、４０μｇ／mlのＧ−４１８および２０
０mg／mlのセフォタクシムを含有する）に形質転換体の
選択のために移した。３数週選択後、カルスをＮ６培地
にシュートの発生および根の発育のために移した。再生
した植物を温室内のポットの土に究極的に移し、そして
自家受粉に成長させた。子孫におけるカナマイシン耐性
表現型の分離は、３００μｇ／mlのカナマイシンを含有
するＭＳ培地上でＲ１種子を発芽させることによって分
析した。

【００９８】Ｄ）ＤＮＡの分離および遺伝子の組み込み トランスジェニック植物からのＤＮＡをＣＴＡＢ法に従
い分離した（M.G.Murry およびW.F.Thompson, Nucl.Aci
ds Res.8 : 4321-4325, 1980) 。ＤＮＡブロット分析は
マニアチス（Maniatis) et al. (Molecular Cloning :
A Laboratory Manual 、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、１９８２）に記載されているように
実施した。ＧＵＳのためのプローブは、ｐＢＩ２２１プ
ラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ
制限断片から作った。ＤＮＡプローブはランダムブライ
マー法を使用して〔ａ³²Ｐ〕ｄＣＴＰで標識した（A.P.
FeinbergおよびB.Vogelstein, Anal.Biochem. 132 : 6
-13, 1983)。

【００９９】形質転換された植物の中のアグロバクテリ
ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の汚染の不存在を
実証するために、ＧＵＳ ＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンさせた同一のナイロンのフィルターをストライピン
グし、そしてｐＴｉＣ５８のｖｉｒＢおよびｖｉｒＤ領
域を含有するＨｉｎｄＩＩＩ １８およびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ ２７ ＤＮＡ断片から作られたプローブと再ハイブ
リダイゼーションさせた（Depicker, A et al. (1980),
Plasmid 3 : 193-211 ; Jansscns, A.et al.(1986), P
lant Sci.47 : 185-193) 。

【０１００】Ｅ）ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）活性についてのアッセイ 推定的に形質転換されたカルスおよび植物におけるＮＰ
ＴＩＩ活性を、少なくとも４回の反復実験において、ラ
ドケ（Ｒａｄｅ）Ｓ．Ｅ．らの方法（Theor.Appl.Gene
t.75 : 685-694)の変法を使用してアッセイした。葉の
組織（１００mgの新鮮な重量）を１．５mlのエッペンド
ルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管内で等しい体積（１００
μｌ）の抽出緩衝液（２．５ミリモルのトリス（pH６．
８）、０．１４３ミリモルのβ−メルカプトエタノー
ル、０．２７ミリモルのレウペプチン）で粉砕し、そし
て４℃において１５分間遠心した。３０μｇのタンパク
質を１０mlの反応緩衝液Ａ（６７ミリモルのトリス−マ
レエート、４２ミリモルのＭｇＣｌ₂ 、４００ミリモル
のＮＨ₆ Ｃｌ、１．７ミリモルのジチオスレイトール、
および０．４mg／mlの硫酸カナマイシン）または反応緩
衝液Ｂ（緩衝液Ａと同一であるが、カナマイシンを含有
しない）と混合した。

【０１０１】５μｌのＡＴＰ溶液（緩衝液Ｂ中の１．０
μＣｉの〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰおよび０．７５ミリモルの
ＡＴＰ〕を添加した。試料を３０℃の水浴中で３０分間
インキュベーションし、次いで１片のワットマン（Ｗｈ
ａｔｍａｎ）３ＭＭ紙の上に配置された３層のワットマ
ン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｐ８１イオン交換紙の上に「ハイ
ブリ−ドット（Ｈｙｂｒｉ−Ｄｏｔ）」ブロッティング
装置（ＢＲＬ）を使用してブロッティングした。

【０１０２】すべてのイオン交換紙を蒸留水で２回合計
４分間洗浄し、そして１mg／mlのプロテイナーゼＫおよ
び１％のＳＤＳを含有する１０mlの溶液中で６５℃にお
いて６０分間インキュベーションした。次いで紙を蒸留
水で室温において４分間洗浄し、そして蒸留水で３回８
５℃において４分間洗浄した。３片の紙を空気乾燥し、
それらのもとの位置に積み重ね、そして増強スクリーン
を使用してＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露出した。

【０１０３】Ｆ）β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性
のアッセイ 推定的に形質転換されたカルスおよび植物におけるＧＵ
Ｓ活性を測定するために、各試料の少なくとも２つの複
製をR.A.ジェファーソン（Jefferson)の方法（“Analys
is of Gene Organization and Gene Expression, A Lab
oratory Manual, ”Blackwell Scientfic Publication,
oxford, Draper, J.et al.(編) pp.263-339, 1988) に
従いアッセイした。

【０１０４】試料をＧＵＳ抽出緩衝液（５０ナノモルの
リン酸ナトリウム（pH７．０）、１０ミリモルのＥＤＴ
Ａ、１０ミリモルのトリトンＸ−１００、０．１％のサ
ルコシル、および１０ミリモルのβ−メルカプトエタノ
ール）で均質化した。２０μｇのタンパク質を等しい体
積のＳＤＳ試料緩衝液（６２．５％のトリス−ＨＣｌ、
０．２３％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、５０ミリ
モルのβ−メルカプトエタノール、および０．００１％
のブロモフェノールブルー）と室温において１５分間イ
ンキュベーションした。電気泳動を一夜室温および３Ｖ
／cmにおいて実施した。

【０１０５】ゲルを１００mlのＧＵＳ抽出緩衝液で４回
２時間以内に洗浄し、氷上でＧＵＳ蛍光測定緩衝液（Ｇ
ＵＳ抽出緩衝液中の１mlのメチルウンベリノェリルグル
クロニド）と３０分間インキュベーションし、そして暗
所で３７℃において３０分間インキュベーションした。
反応を０．２モルのＮａ₂ ＣＯ₃ で停止させた。ゲルを
３６５nmの紫外線ランプによりコダック（Ｋｏｄａｋ）
２Ｅラッテン・フィルターを使用して照明し、そして写
真撮影した。

【０１０６】形質転換された植物の中のＧＵＳ発現の局
在化は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグル
クロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）の組織化学的アッセイにより
評価した（Benfey, P.N.et al. (1989), EMBO J.8 : 21
95-2202)。形質転換しないか、あるいは形質転換され
た、発生後４月の植物の葉身、鞘、茎または根の切片を
ビブラトーム（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）（Ｏｘｆｏｒｄ）
切断装置で切断した。１００〜２００ミクロンの切片
を、１ミリモルのＸ−ｇｌｕｃ、１０ミリモルのＥＤＴ
Ａ、１００ナノモルのＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ（pH７．
０）および０．１％のトリトンＸ−１００を含有する溶
液中で３７℃において１２〜１７時間インキュベーショ
ンした。

【０１０７】染色後、切片を７０％のエタノール中で５
分間すすぎ、そして切片の中のクロロフィルを５％のホ
ルムアルデヒド、５％の酢酸および２０％のエタノール
の溶液中で１０分間インキュベーションし、次いで５０
％のエタノール中で２分間インキュベーションし、そし
て蒸留水中で２回洗浄することによって透明にした。切
片を顕微鏡により検査した。Ｒ１子孫におけるＧＵＳ活
性を染色によりアッセイした。Ｒ１の種子をまず２μｇ
／mlの２，４−Ｄおよび３００μｇ／mlのカナマイシン
を含有するＭＳ培地の中で発芽させてカルスの形成を誘
導した。

【０１０８】カルスは１週後発芽する種子から形成し
た。各カルスの一部分を除去し、そして変更したＧＵＳ
組織化学的染色アッセイにかけた（Benfey, P.N.et al.
(1989), supra) 。簡単に述べると、Ｒ１子孫または対
照のカルスを１ミリモルのＸ−ｇｌｕｃ、１０ミリモル
のＥＤＴＡ、１００ミリモルのＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ
（pH７．０）および０．１％のトリトンＸ １００を含
有する溶液中で３７℃において１２〜１７時間インキュ
ベーションした。コダカラー６４フィルムで解剖顕微鏡
（オリンパス）下に写真撮影した。

【０１０９】Ｇ）ＰＣＲ ＧＵＳコード領域の中の２つの配列を選択して、遺伝子
内で４１０bpの断片を増幅した。５′プライマー（ＡＣ
ＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＡ）および３′プ
ライマー（ＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＴＣＡＣＡ
ＣＡ）は、それぞれ、翻訳開始部位の３bpおよび４１７
bp下流にＧＵＳコード領域において位置した。１００μ
ｇのｐＡＧ８を陽性の対照として使用した；Ｒ１子孫の
若い葉からの１００ngの全体のイネＤＮＡを使用した。

【０１１０】ＰＣＲは、５０ミリモルのＫＣｌ、１０ミ
リモルのトリス−ＨＣｌ、１５ミリモルのＭｇＣｌ₂ 、
０．１％のゼラチン（ｗ／ｖ）、１％のトリトンＸ−１
００、０．２ミリモルの各デオキシヌクレオチドトリホ
スエート（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）および０．２５ミリモルの各プライマーを含
有する５０μｌの溶液中で実施した。

【０１１１】試料を９４℃の予熱し、そして２７サイク
ルのＰＣＲ増幅にかけた。サイクリングは、次の条件で
プログラミングした。プログラム可能な熱サイクラー
（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｃ．）によりコントロー
ルした：変性、９４℃で１分間；アニーリング、５８℃
で２分間；伸長、７２℃で３分間。５μｌのＰＣＲ産生
物を１％のアガロースゲルの中で電気泳動させ、そして
臭化エチジウムで染色して検出した。ＰＣＲ産生物のサ
ザンブロットをＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩのＧＵＳ断片から
作られたプローブとハイブリダイゼーションさせた。

【０１１２】結果 Ａ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による未
熟のイネの胚の形質転換 前に、われわれが示したように、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用するイネの形質
転換はＰＳＣの添加により改良された（Chan, M.T. (19
92) 、前掲）。ここで、ＰＳＣおよびアグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）接種物の存在は形質
転換の効率をほとんど３倍に増加した（表３）。アグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で接種し
た未熟のイネの胚のほぼ６．８％はカルスを形成し、そ
して選択的培地上で増殖した。接種しないか、あるいは
接種したが、形質転換しない未熟の胚は褐色となり、そ
して３週以内に死亡した。

【０１１３】カルスの培養後、シュートは急速に発育
し、そして４週後根は自発的に形成した（図８Ｂ）。接
種した２５０の未熟の胚の間で、１７のカルスおよび４
つの植物は培養物から回収された。４つのトランスジェ
ニック植物をＴ１，Ｔ２，Ｔ３およびＴ４と表示した。
これらの植物は、９週の培養後、土の中に移植できる状
態であった（図８Ｃ）。

【０１１４】１つの植物、Ｔ１、のみは生き残って開花
し、そして子孫を生産した（図８Ｄ〜Ｆ）。このトラン
スジェニック植物は正常の表現型を示し、そして繁殖能
力があったが、それは野生型植物よりいっそうゆっくり
成長し（１２１cmの長さの植物から花成まで約１４週）
そしてより少ない種子（合計７５の種子）を生産した。
他方の３つのトランスジェニック植物は、また、土の中
に移植したが、生き残らなかった。

【０１１５】Ｂ）形質転換体のＤＮＡ分析 ゲノムの中への外来ＤＮＡの組み込みについての物理的
証拠を提供するために、４つのトランスジェニック植物
（Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３およびＴ４）の葉からのゲノムＤＮ
Ａの制限消化物のサザンブロット分析を、プローブとし
てｐＢＩ２１１からのＧＵＳ ＤＮＡを使用して実施し
た（図９）。消化しないイネゲノムＤＮＡ（Ｕｎｃ）の
大きさは５０kbであった。（図９、レーン２および
６）。

【０１１６】ＢａｍＨＩで消化した後（Ｂ）、ＧＵＳ
ＤＮＡは期待した大きさ２．３kbの断片として検出され
（図９、レーン３，７および９）これはｐＡＧ８の中に
存在するものと同一の大きさであった（図９、レーン
１）。ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）またはＰｓｔｌ（Ｐ）で消
化した後、５０kbのバンドは消失し、そしてより低い分
子量のＤＮＡ断片が現れた（図９、レーン４，５，８，
１０および１１）。

【０１１７】ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化したとき、
２つのハイブリダイゼーションバンドが検出されたの
で、トランスジェニック植物Ｔ４はＧＵＳ遺伝子のため
の組み込み部位を有するように思われた（図９、レーン
１１）。ＧＵＳ ＤＮＡプローブは４つのトランスジェ
ニック植物からのＤＮＡのみにハイブリダイゼーション
したが、形質転換しない対照植物（ＮＴ）にハイブリダ
イゼーションしなかった（図９、レーン１２）ので、こ
れはＧＵＳ遺伝子がイネのゲノムの中に組み込まれたこ
とを示す。

【０１１８】図９において検出されたＧＵＳ ＤＮＡが
トランスジェニック植物の中のアグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の汚染から生じなかったこ
と証明するために、同一ナイロンフィルターをｖｉｒＢ
およびｖｉｒＤＮＡで再プロービングした。ｖｉｒ遺伝
子はＴｉプラスミド上に位置しないので、プローブとし
てｖｉｒＤＮＡを使用するサザンブロット分析はアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の汚染を
検出する信頼性ある方法を提供するであろう。この実験
において使用したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）菌株Ａ２８１はｐＴｉＣ５８を有する菌
株Ｃ５８から誘導された。

【０１１９】ｐＴｉＣ５８のｖｉｒＢおよびｖｉｒＤ領
域を含有するＨｉｎｄＩＩＩ １８およびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ ２７ ＤＮＡから作られたプローブは、こうして、
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の
ＤＮＡにハイブリダイゼーションするであろう。しかし
ながら、プローブとしてｖｉｒＤＮＡを使用するとき、
ハイブリダイゼーションバンドは検出されず（データは
示されていない）、トランスジェニック植物のゲノムに
おいて検出されたＧＵＳ ＤＮＡはイネ組織の中の存続
するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）細胞のためではないことを明瞭に実証する。

【０１２０】Ｃ）トランスジェニックのカルスおよび植
物におけるＧＵＳおよびＮＰＴＩＩの発現 ｐＡＧ８の中のＧＵＳコード配列をα−アミラーゼ遺伝
子（αＡｍｙ８）の推定上の５′プロモーター領域の下
流に配置し、転写の融合をつくった。このα−アミラー
ゼ遺伝子の１．５kbの長さの５′領域のプロモーター機
能を研究するために、ＧＵＳ遺伝子の発現をトランスジ
ェニックのカルスおよび植物の中のＧＵＳ活性の存在に
より決定した。

【０１２１】細胞抽出物の中に存在するＧＵＳは、６９
kdの見掛けの分子量で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
の中を移動した（図１０Ａ）。４つのトランスジェニッ
クの植物およびカルスＣ１において検出することができ
たＧＵＳ活性のレベルは類似した（図１０Ａ、レーン２
〜６）。トランスジェニックカルスＣ２の中のＧＵＳ活
性のより低いレベル（図１０Ａ、レーン７）は、ＮＰＴ
ＩＩ活性のそのより低いレベルと関係があるように思わ
れる（図１０Ｂレーン６）。

【０１２２】ＧＵＳ活性は形質転換しないカルス（Ｎ
Ｔ）において検出されなかった（図１０Ａ、レーン
８）。結果が示唆するように、αＡｍｙ８の１．２kbの
５′領域はＧＵＳ遺伝子発現を調節するための効率よい
プロモーターを含有する。

【０１２３】プラスミドｐＡＧ８はノパリンシンターゼ
プロモーターにより推進されるＮＰＴＩＩコード領域を
含有する。結局、外来遺伝子を有する植物についての選
択はＧ４１８を含有する培地を使用して達成すべきであ
る。さらに、ＮＰＴＩＩ活性を８つの不規則的に選択し
た形質転換したカルス（ＲＯ）および３つのトランスジ
ェニック植物（Ｔ１，Ｔ２およびＴ３）において決定し
た。８つのトランスジェニック細胞のすべてはＮＰＴＩ
Ｉ活性を発現し、そしてそれらのうちの２つ（Ｃ１およ
びＣ２）についてのデータが表されている（図１０Ｂ、
レーン５および６）。ＮＰＴＩＩ活性は、また、３つの
トランスジェニック植物において検出された（図１０
Ｂ、レーン１，２および３）。活性は形質転換しないカ
ルス（図１０Ｄ、レーン７）植物（図１０Ｂ、レーン
４）において観測されなかった。

【０１２４】Ｄ）トランスジェニックイネ植物における
ＧＵＳの組織化学的局在化 αＡｍｙ８の５′領域により推進されるＧＵＳ遺伝子の
細胞の発現パターンを局在化するために、トランスジェ
ニック植物（Ｔ１）の種々の組織を切片にし、そして組
織化学的に染色した（図１１及び図１６）。切片のブル
ーの染色は、基質の中で１７時間インキュベーションし
た後に現れた。ＧＵＳの発現は葉身（図１１Ｂ，Ｃ）、
茎（図１１Ｅ，Ｆ）および鞘（図１６Ｇ）のすべての細
胞の型において観察された。

【０１２５】形質転換しない対照植物からの葉身および
茎の組織の切片は染色を示さなかった（図１１Ａ，
Ｄ）。根の横方向の切片は表皮細胞がブルーに染色さ
れ、そして皮膚細胞が淡く染色されることを明らかにし
た（図１６Ｉ）。切片にしない根毛は、維管円筒におけ
る強い染色および皮膚細胞における軽度の染色を示した
（図１６Ｊ）。鞘の内側に埋め込まれた、非常に若い葉
身の切片において、ＧＵＳの発現は見いだされなかった
（図１６Ｈ）。

【０１２６】Ｅ）Ｒ１子孫の分析 トランスジェニック植物Ｔ１から収穫した７５の種子の
うちで、３６の種子は選択的培地（３００μｇ／mlのカ
ナマイシンを含有する）上で発芽してカルスの形成を誘
導した。１０日以内に、３２の発芽する種子はカルスを
形成しそして成長し続け、そして耐性とスコアを付され
た。他方の４つの発芽する種子は、また、種子を形成し
た、褐色となり、後に死亡した。各カナマイシン耐性の
約半分を取り出し、そしてＧＵＳ活性についてアッセイ
した。

【０１２７】アッセイした３２のカルスのうちで、２８
はブルーの染色を示しそして４つのカルスは黄色に止ま
り、形質転換しない対照に類似した（それらのうちの４
つについてのデータを図１２に示す）。異なるトランス
ジェニックＲ１種子から誘導されたカルスは、異なる程
度のブルー染色により明らかにされるように、ＧＵＳ活
性のかなりの変動を示した（図１２）。

【０１２８】Ｔ１の残りの３９の種子の間で、１８の種
子を温室内で発芽させそして成長させた。１０cmの高さ
であるとき、これらのＲ１植物のうちの１３の若い葉か
らＤＮＡを分離した。ＤＮＡをＧＵＳコード領域内の４
１０bpの断片のＰＣＲ増幅にかけた（図１３Ａ）。増幅
したＤＮＡの同定は³²Ｐ標識ＧＵＳ ＤＮＡプローブへ
のブロットハイブリダイゼーションにより確立された
（図１３Ｂ）。これらのＲ１子孫の中のＧＵＳ遺伝子の
存在をさらに確証した。

【０１２９】考察 原形質体または懸濁細胞を使用するイネの形質転換のい
くつかの方法は現在利用可能であるが、多数のイネの変
種の形質転換された原形質体または懸濁細胞から成熟植
物を再生する試みは不成功に終わった。土のバクテリア
のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用に
基づく方法は多くの場合においてなお好ましい。なぜな
ら、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）仲介形質転換は原形質体を必要とせずそして、一般
に、他の形質転換技術より高い形質転換効率およびより
予測可能な外来ＤＮＡの組み込みのパターンを生ずるか
らである（Czernilofsky, A.P.et al. (1986), DNA, 5
: 101-113)。ここでわれわれが示すように、トランス
ジェニックイネアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）仲介ＤＮＡ転移系を使用して首尾よく生産
される。

【０１３０】２つの因子がイネの形質転換および再生に
おける成功に寄与することができる。第１の因子はアグ
ロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と未熟
のイネｅｍｇとの同時培養の間のＰＳＣの添加であるこ
とができる。ＰＳＣは多分アグロバクテリウム（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介Ｔ−ＤＮＡ転移プロセスを
増強する物質を含有する。なぜなら、ＰＳＣは１週速い
カルスの形成を誘導し、そして形質転換の頻度を３倍増
大したからである（表３）。

【０１３１】ＰＳＣは、一般に種々の植物種の形質転換
を増強する（Stafer, W.et al. (1985) 、前掲）と信じ
られる、アセトシリンゴンおよびシナピン酸に富む（Ch
ang,H.H.et al. (1991)、前掲）。しかしながら、形質
転換の成功および効率におけるこれらの２つの化合物の
役割は現在明らかではない。トランスジェニック植物の
生産についてわれわれが得た１．６％の形質転換の百分
率は、遺伝子をイネの中に転移するためのアグロバクテ
リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の使用をいっそ
う可能とするであろう。

【０１３２】首尾よい形質転換および再生のための第２
因子は、形質転換材料として未熟のイネの胚（受粉後１
０〜１２日）の使用であることができる。なぜなら、そ
れらはＴ−ＤＮＡの転移に対する阻害因子またはよりビ
ルレンスの誘導因子を成熟胚より少なく含有するからで
ある。トウモロコシの未熟の胚は、また、アグロバクテ
リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子の転
移について能力があること示されそしてその能力は遺伝
子型および発育段階に依存する。未熟の胚の分裂組織
は、最初の１〜２葉の初生の分化と相関関係がある発育
段階において受容能力をもつようになる（M.Schlappiお
よびB.Horn (1992), Plant Cell, 4 : 7-16)。

【０１３３】したがって、ある発育段階における未熟の
胚はＴ−ＤＮＡの転移の成功を増加する条件、例えば、
（ａ）ｖｉｒ遺伝子誘導物質の利用可能性、（ｂ）バク
テリア毒性物質の低い生産、（ｃ）好適な内因性ホルモ
ンのレベル、および（ｄ）癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）の取り付けのための受容体の利用可能性（M.
SchlappiおよびB.Horn (1992) 、前掲）。ただ４つの植
物をこの実験において形質転換したカルスから再生する
ことができたが、すべてのこれらの植物は現実の形質転
換体であることが証明された、４つのトランスジェニッ
ク植物のゲノムの中へのキメラ遺伝子の組み込みは、制
限されたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションにより
確証された。さらに、われわれの実験は、ハイブリダイ
ゼーションバンドの可能な源として、イネ組織のアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の汚染の
可能性を除外した。

【０１３４】トランスジェニック植物におけるＨｐｔお
よびＧＵＳの活性の検出は、組み込まれた遺伝子が発現
されたことを示す。また、われわれの結果が示すよう
に、カナマイシンを使用して、形質転換された細胞およ
び形質転換しない細胞の混合した集団から形質転換され
たイネの細胞を選択することができる。カナマイシンが
逃げるのを防止するために、選択は同時培養後直ちに適
用することが重要である。

【０１３５】４つの再生した植物のうちで、ただ１つの
植物（Ｔ１）は生き残って花成し、そして子孫を生産し
た。トランスジェニック植物Ｔ１は、温室内の室温が２
０℃以下であったとき、１２月に花成したが、これがそ
の低い収量（７５の種子）についての理由であったかど
うかわれわれは知らない。トランスジェニックＲ１子孫
は、カナマイシン耐性およびＧＵＳ活性の発現により示
されるように、ＮＰＴＩＩおよびＧＵＳ遺伝子を遺伝し
かつ発現した。遺伝子が単一の優生位置として輸送され
たと仮定すると、自家受粉から子孫において３：１の比
が期待された。

【０１３６】３２のＲ１子孫の未熟の胚から誘導された
カルスのカナマイシン選択と関連してＧＵＳ染色のアッ
セイにおいて、２８はＧＵＳ陽性およびカナマイシン耐
性であり、４つはＧＵＳ陰性であるが、カナマイシン耐
性であり、そして４つはＧＵＳ陰性であるかつカナマイ
シン感受性であった。この２８：２または３．５：１の
比が示すように、トランスジェニック植物Ｔ１のＲ１子
孫におけるＧＵＳの分離は、ヘテロ接合体×ヘテロ接合
体交雑における予測した３：１のメンデル遺伝のパター
ンと一致する。

【０１３７】カナマイシン選択したＲ１におけるＧＵＳ
活性の欠如は、ＧＵＳ遺伝子が存在しないか、あるいは
存在するが、非機能的であったことを示し得る。カナマ
イシン耐性Ｒ１中のＧＵＳ遺伝子の不存在は、ＤＮＡ再
配置を経るＧＵＳ遺伝子の欠失のためであることがあ
る。ＧＵＳのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅は、試験した１８
のＲ１植物のうちの１３のＤＮＡから達成された。１
３：５または２．６：１は、また、理論的なメンデルの
分離パターンに近い。

【０１３８】イネのα−アミラーゼは、少なくとも１０
の明確なメンバーを含有する多重遺伝子によりコードさ
れる（Huang N.et al. (1990), Plant Mol.Biol.14 : 6
55-668) 。α−アミラーゼ遺伝子族の異なるメンバーを
表すゲノムおよびｃＤＮＡのクローンはわれわれの実験
室において分離された。α−アミラーゼ遺伝子、αＡｍ
ｙ８、の発現は発芽する種子においてＧＡ調節される。

【０１３９】この遺伝子は、また、イネの培養した懸濁
細胞の中の主要な代謝調節された遺伝子の１つである
（Yu, S.M.et al., 発表されない結果）。われわれの実
験において、αＡｍｙ８の１．２kbの５′領域のリポー
ター遺伝子への融合はイネの中に形質転換された。トラ
ンスジェニックイネにおけるＧＵＳの発現は、この１．
２kbの断片が機能的プロモーターを含有することを示
す。

【０１４０】こうして、α−アミラーゼのプロモーター
のコントロール下にリポーター遺伝子を有するトランス
ジェニックイネの使用は、α−アミラーゼのプロモータ
ーの中の調節要素を分析するための新しい道具を提供し
た。このような研究はイネにおけるα−アミラーゼ遺伝
子の発現の調節の理解に導くであろう。

【０１４１】驚くべきことには、ＧＵＳ活性の組織化学
的局在化は、αＡｍｙ８のプロモーターがトランスジェ
ニックイネ植物の成熟した葉、茎、鞘および回転のすべ
ての細胞のタイプにおいて機能的であることを示した。
ＧＵＳを発現しない唯一の組織は、鞘の内側に埋め込れ
た非常に若い葉であった。それは、また、回転の表皮、
皮層、および維管円筒において活性であった。

【０１４２】したがって、αＡｍｙ８／ＧＵＳの発現は
組織特異的ではない。むしろ、それはトランスジェニッ
ク植物において一時的に調節されるが、葉のどの成長段
階においてαＡｍｙ８がその発現を開始するか知られて
いない。われわれの組織化学的研究は、土へ移植された
後生き残る単一のトランスジェニック植物であるＴ１の
みを使用して実施された。

【０１４３】外来遺伝子の組織特異的発現の高いレベル
の発現または損失を起こさせ得る、イネのゲノムの非常
に活性なエンハンサーに密接してαＡｍｙ８／ＧＵＳが
挿入される可能性を除外することができなかった。しか
しながら、αＡｍｙ８は明らかに培養した懸濁細胞の中
の主要な代謝調節された遺伝子の１つであり（Yu, S.M.
et al. (1992), Gene 、印刷中）、こうしてイネの栄養
成長の炭水化物の代謝において重要な役割を演ずる。

【０１４４】したがって、αＡｍｙ８により推進される
ＧＵＳ遺伝子がトランスジェニック植物の異なる組織の
すべての細胞のタイプにおいて構成的に発現されること
は、完全には驚くべきことではない。これは、また、野
生型植物の中に天然に存在するαＡｍｙ８について真実
である場合、イネにおけるαＡｍｙ８の生理学的機能を
知ることは興味あることであろう。安定に形質転換され
たイネ植物における得られたＧＵＳ活性の一般的分布お
よびレベルは、トランスジェニックイネにおける遺伝子
の活性の研究のための陽性の対照として、αＡｍｙ８プ
ロモーターの可能性を示す。

【０１４５】結論すると、実験において、未熟のイネの
胚はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）仲介形質転換に感受性であること、そして形質転換
された外来遺伝子は形質転換体の次の発生により遺伝さ
れることが示された。この実験において使用したイネの
変種タイヌング（Ｔａｉｎｕｎｇ）６２（ジャポニカ
（Ｊａｐｎｉｃａ）型）に加えて、Ｔ−ＤＮＡは、ま
た、同一アプローチ（M.T.Chan, H.H.Chang およびS.M.
Yu、発現されない結果）を使用して、タイナン（Ｔａｉ
ｎａｎ）５（ジャポニカ型）およびタイチュング・ネイ
ティブ（Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｎａｔｉｖｅ）ｎｏ．１
（ジャポニカ型）を包含する他のイネの変種のゲノムの
中に首尾よく転移された。したがって、この簡単なアプ
ローチを他のイネの変種および、変更を加えて、他の単
子葉種の形質転換に適用することができることが提案さ
れる。

【０１４６】実施例III 最初から認められるように、本発明の１つの目的は植物
宿主細胞における新しい遺伝子発現系を提供し、これに
より発現された遺伝子産生物を培地から直接回収するこ
とができるようにすることである。この目的を達成する
ために、実施例IIにおいて得られた結果に基づき、さら
に実験を実施して、本発明のトランスジェニックイネ細
胞の中の外来遺伝子ＧＵＳの発現に関する、αＡｍｙ８
のプロモーター領域の調節を研究した。

【０１４７】さらに詳しくは、前記ＧＵＳ遺伝子の発現
が前記プロモーターのコントロール下に糖消耗または糖
不含条件により影響を受けるか否かを研究した。次の実
験は実施例IIに記載する材料および方法を採用した。未
熟の胚をαＡｍｙ８／ＧＵＳキメラ遺伝子（ｐＡＧ８）
を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で
形質転換した。次いで、形質転換した胚から誘導された
カルスを２μモルの２，４−Ｄを含有する液体ＭＳ培地
の中で成長させて、イネの懸濁培養を確立した。

【０１４８】細胞の培養物を５日毎にサブクローニング
した。この実験のために、懸濁細胞をショ糖を含む
（＋）または含まない（−）培地に２日間移した。ＲＮ
Ａを処理した細胞から精製し、そしてＧＵＳ ｍＲＮＡ
を³²Ｐ標識したＧＵＳのＤＮＡをプローブとして使用し
てノザンブロット分析により検出した。１０μｇの合計
のＲＮＡを各レーンに負荷した。結果を図１４に示し
た。発現されたＧＵＳタンパク質が形質転換された細胞
の中で維持されるか、あるいは培地の中に分泌されるか
どうかを決定するために、イネの懸濁細胞を上の実験と
同一の条件下に成長させそして処理した。タンパク質を
処理した細胞から抽出するか、あるいは培地から集め、
ウェスタンブロット分析し、そしてＧＵＳ抗体で検出し
た。２０μｇの合計のタンパク質を各レーンに負荷し
た。結果を図１５に示した。

【０１４９】結果および考察 図１４を参照すると、ＮＴは形質転換しない細胞を示
す；Ｃ３，Ｃ７およびＣ１１は３つの独立の形質転換さ
れた細胞系である。ショ糖の存在または不存在のいずれ
においても形質転換しない細胞の中にＧＵＳ ｍＲＮＡ
は検出されなかった（レーン１および２）。ＧＵＳ ｍ
ＲＮＡはショ糖を含有する培地の中で成長させた３つの
細胞系において検出された（レーン３，５および７）。
ｍＲＮＡレベルはショ糖不含培地の中で成長させた細胞
において増加した（レーン４，６および８）。

【０１５０】図１４の説明 イネの未熟の胚をαＡｍｙ８／ＧＵＳキメラ遺伝子（ｐ
ＡＧ８）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）で形質転換した。次いで、形質転換された胚から
誘導されたカルスを２μモルの２，４−Ｄを含有する液
体ＭＳ培地の中で成長させてイネの懸濁培養を確立し
た。細胞の培養物を５口毎に継代培養した。

【０１５１】この実験のために、懸濁細胞をショ糖を含
む（＋）か、あるいは含まない（−）培地の中で成長さ
せた。ＲＮＡを処理した細胞から精製し、そしてＧＵＳ
ｍＲＮＡをノザンブロット分析により³²Ｐ標識ＧＵＳ
ＤＮＡをプローブとして使用して検出した。１０μｇ
の合計のＲＮＡを各レーンに負荷した。ＮＴは形質転換
しない細胞を示す；Ｃ３，Ｃ７およびＣ１１は３つの独
立に形質転換された細胞系である。前記キメラ遺伝子を
担持する形質転換されたイネ植物の細胞（Ricecell Ｃ1
1）は、ブタペスト条約に基き、工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研条寄第４０６４号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４０６４）として寄託されている。

【０１５２】結果：形質転換しない細胞においてショ糖
存在または不存在下にＧＵＳ ｍＲＮＡは検出されなか
った（レーン１および２）。ＧＵＳ ｍＲＮＡはショ糖
を含有する培地の中で成長させた３つの系統の細胞にお
いて検出された（レーン３，５および７）。ｍＲＮＡの
レベルはショ糖不含培地の中で成長させた細胞において
増加した（レーン４，６および８）。

【０１５３】図１５において、矢印（−−）はＧＵＳタ
ンパク質の位置を示す。ＧＵＳタンパク質は形質転換し
ない細胞およびそれらの培地においてショ糖の存在また
は不存在下に検出されなかった（レーン１，２，８およ
び９）。ＧＵＳタンパク質は形質転換した細胞および培
地のいずれにおいてもショ糖の存在下に検出されなかっ
た（レーン３，５，１０および１２）。期待するよう
に、ＧＵＳタンパク質は形質転換した細胞および培地に
おいてショ糖の不存在下に検出された（レーン４，６，
１１および１３）。

【０１５４】図１５の説明 イネの懸濁細胞を図１における条件と同一の条件下に成
長および処理した。タンパク質を処理した細胞から抽出
するか、あるいは培地から集め、ウェスタンブロット分
析にかけ、そしてＧＵＳ抗体で検出した。２０μｇの合
計のタンパク質を各レーンに負荷した。矢印はＧＵＳタ
ンパク質の位置を示す。

【０１５５】結果：形質転換しない細胞およびそれらの
培地の中にショ糖の存在または不存在下にＧＵＳタンパ
ク質は検出されなかった（レーン１，２，８および
９）。形質転換された細胞および培地の中でショ糖の存
在下にＧＵＳタンパク質は検出されなかった（レーン
３，５，１０および１２）。形質転換された細胞および
培地の中でショ糖の不存在下にＧＵＳタンパク質は容易
に検出された（レーン４，６，１１および１３）。

【０１５６】したがって、上で得られた結果から、本発
明の遺伝子発現系は少なくとも２つの主要な利点を達成
できることを確証することができる。第１に、αＡｍｙ
８／ＧＵＳキメラ遺伝子の発現は、αＡｍｙ８のプロモ
ーター領域により、ことに培地の糖消耗または糖不含条
件下に、よくコントロールされる。それゆえ、α−アミ
ラーゼ遺伝子のプロモーターからなる本発明の遺伝子発
現系は、所望の遺伝子産生物、例えば、ここにおいて例
示するＧＵＳタンパク質の、糖消耗または糖不含条件下
に、定量的生産を促進することができる。

【０１５７】第２に、前記キメラ遺伝子のプロモーター
領域が、また、α−アミラーゼのシグナル配列をコード
するＤＮＡ配列を含むかぎり、発現された遺伝子産生物
（ＧＵＳ）は培地の中に分泌され、こうして前記遺伝子
産生物は培地から回収することができる。その結果、所
望の遺伝子産生物の回収および精製手順を簡素化するこ
とができ、そしてその中の汚染を、また、減少させるこ
とができる。

【０１５８】実施例IV：イネ以外のトランスジェニック
植物、例えば双子葉植物において、外来遺伝子、例えば
ＧＵＳレポーター遺伝子の発現に関してα−アミラーゼ
遺伝子のプロモーター領域の制御がなおうまく働くか否
かを検討するため、更なる実験を行った。この目的のた
め、植物宿主としてタバコ及びポテトを選択し、そして
以下の実施例において試験した。得られた実験結果がよ
く示すところによれば、実施例Ｉにおいて得られたイネ
αＡｍｙ８遺伝子からの１．２kbプロモーター領域を含
んで成る、本発明により確立された発現系は、それによ
り形質転換された植物宿主細胞中での所望の外来性蛋白
質の大規模生産のための簡単で便利な手段を提供する。

【０１５９】実験方法 Ｉ．プラスミド及び細菌株 ここで使用したプラスミドは、実施例IIに記載されたよ
うにしてあらかじめ作製された。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＫＳ⁺ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に１．４kbのα
−アミラーゼｃＤＮＡ挿入部を担持するプラスミドαＡ
ｍｙ８−Ｃはもともと、実施例Ｉに詳細に記載したよう
にイネゲノムクローンＯＳＡｍｙ８Ｃからサブクローニ
ングされた。アグロバクテリウム・チュメファシエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）Ａ２８１株（ｐＴｉＢＯ５４２＋ｐＡＧ８）の発生
は実施例IIに記載されている。

【０１６０】II．植物材料 この研究において、ポテトの品種Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕ
ｂｅｒｏｓｕｍ Ｌｃｖ．ＡｐＨ６９及びタバコの品種
ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）Ｌ．ｃｖ．Ｐｅｆｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１を
用いた。タバコのセルラインＴ０１及びＴ０２は、葉の
ディスクをアグロバクテリウムにより形質転換すること
により得られた（Horschら、「Plant Molecular Biolog
y Manual」１−９頁、Klwer Academic Publishers, Dor
drecht, 1988) 。ポテトのセルラインＰ１及びＰ２は、
マイクロチューバーをアグロバクテリウムにより形質転
換することにより得られた（Chang 及び Chang, Bat. B
ull. Acad. Sin. , 32：63-70, 1991)。

【０１６１】さらに、実施例IIに記載したのと同様にし
てアグロバクテリウムにより未成熟イネ胚を形質転換す
ることにより得られた、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ）Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｎａｎ ５からのイ
ネのセルラインＣ５１及びＣ５２並びに実施例III のイ
ネのセルラインＣ７及びＣ１１も、この実験において比
較のために検出した。懸濁細胞培養物はすでに記載され
ているようにして増加させた（Yuら、J. Biol. Chem.,
266 ：21131-21137, 1991)。懸濁細胞を４００メッシュ
のナイロン篩による濾過により集め、紙タオル上でブロ
ット乾燥し、そして秤量した。培地はワットマンNo１濾
紙を通しての濾過により集めた。集めた細胞及び培地は
液体窒素により急速凍結し、そして使用するまで−７０
℃にて貯蔵した。

【０１６２】III ．サザンブロット分析 推定上のトランスジェニック・セルラインの懸濁細胞か
ら全ＤＮＡを単離した。５μｇのＤＮＡをＨｉｎｄIII
により消化し、アガロースゲル（０．８％）電気泳動に
より分画し、そしてＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ膜（Ｄｕ Ｐ
ｏｎｔ）に移した。プローブとして使用したＧＵＳ Ｄ
ＮＡは、プラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
のＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ制限酵素処理から作り、そして
ランダムプライマー法（Feinberg及びVogelstein, Ana
l. Biochem, 132 : 6-13, 1983)を用いて〔α−³²Ｐ〕
ｄＣＴＰにより標識した。

【０１６３】IV．ノーサンブロット分析 Ｂｅｌａｎｇｅｒの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 83：1354-1358, 1986)に従って懸濁細胞から全ＲＮ
Ａを精製した。Ｔｈｏｍａｓ（Methods Enzymol., 100
: 255-266, 1983)により記載されているようにしてＲ
ＮＡブロット分析を行った。プローブとして使用した
１．４kb α−アミラーゼｃＤＮＡ挿入部はプラスミド
ベクターから制限酵素ＥｃｏＲＩにより切り出し、そし
てランダムプライマー法(Feinberg and Vogelstein, An
al. Biochem., 132 : 6-13, 1983) を用いて〔α³²Ｐ〕
ｄＣＴＰにより標識した。

【０１６４】Ｖ．ＧＵＳ活性測定及びウエスタンブロッ
ト分析 ５００mlのＧＵＳ抽出緩衝液（５０mMリン酸ナトリウム
緩衝液、pH７．０，１０mM ＥＤＴＡ，０．２０％ Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００，０．１％ Ｓａｒｋｏｓｙｌ，
１０mM β−メルカプトエタノール）中で０．１〜０．
２ｇの細胞を破砕することにより全蛋白質を抽出した。
ＧＵＳ活性測定は、R. A. Jefferson (1982)により「Pl
ant Genetic Transformation and Gene Expression, A
Laboratory Manual.」２６３−３３９頁、Blackwell Sc
ientific Publications, Oxfordに記載されているよう
にして行った。イムノブロッティング用途のため、α−
アミラーゼポリクローナル抗体を、培地から精製された
イネα−アミラーゼに対してラビット中で生じさせ、そ
してＧＵＳポリクローナル抗体はMolecular Probes, In
c.から購入した。

【０１６５】実験の結果： Ｉ．他のイネ・カルチバー（ｃｕｌｔｉｖａｒ）及び植
物種におけるα−Ａｍｙ８／ＧＵＳの発現 α−Ａｍｙ８／ＧＵＳが異るイネ・カルチバー（ｃｕｌ
ｔｉｖａｒ）及び植物種において類似の態様で糖により
制御され得るか否かを検討するため、プラスミドｐＡＧ
８を、アグロバクテリウム−介在形質転換によりイネｃ
ｖ．Ｔａｉｎａｎ ５、タバコ及びポテトの細胞に導入
した。無作為に選択された推定上のトランスジェニック
セルラインへのキメラα−Ａｍｙ８／ＧＵＳ遺伝子の取
り込みがサザンブロット分析により示された（図１
７）。ＧＵＳ ＤＮＡは、イネのセルラインＧ５１及び
Ｃ５２（図１７のレーン２及び３）、タバコのセルライ
ンＴ０１及びＴ０２（図１７のレーン５及び６）、並び
にポテトのセルラインＰ１及びＰ２（図１７のレーン８
及び９）のゲノム中に検出された。

【０１６６】次に、各植物種の培養された懸濁細胞から
単離された全ＲＮＡについて、プローブとしてＧＵＳ
ＤＮＡを用いてノーサンブロット分析を行った（それぞ
れのデーターを図１８に示す）。この結果が示すところ
によれば、ショ糖を含有する培地中で増殖した細胞にお
いてはＧＵＳ ｍＲＮＡは検出されなかったが（図１８
のレーン３，７及び１１）、ショ糖を欠く培地中で増殖
した細胞においては、ＧＵＳ ｍＲＮＡが豊富に貯種さ
れた（図１８のレーン４，８及び１２）。ショ糖含有培
地及びショ糖不含有培地のいずれで増殖した非形質転換
細胞においてもＧＵＳ ｍＲＮＡは検出されなかった
（図１８のレーン１，２，５，６，９及び１０）。これ
らの結果が示すところによれば、イネα−アミラーゼプ
ロモーターはイネの細胞においてのみならずタバコ及び
ポテトの細胞においても機能的でありそして糖栄養によ
り制御される。

【０１６７】種々のトランスジェニックセルラインの懸
濁細胞中での及びそれらの培地でのＧＵＳ蛋白質の発現
もウエスタンブロット分析により決定した（図１９）。
その結果が示すところによれば、ＧＵＳの濃度は、細胞
がショ糖を含有する培地中で増殖した場合、トランスジ
ェニックイネＣ５１及びＣ５２の細胞中で低い（図１９
のＡのレーン３及び５）が、細胞がショ糖を欠く培地中
で増殖した場合には５〜７倍に増加した（図１９のＡの
レーン４及び６）。培地中のＧＵＳの蓄積の類似のパタ
ーンが観察された。すなわち、ショ糖不含有培地中のＧ
ＵＳの濃度（図１９のＡのレーン１１及び１２）は、シ
ョ糖含有培地中でのそれ（図１９のＡのレーン１０及び
１２）に比べて１５〜２０倍高かった。

【０１６８】トランスジェニックタバコ（図１９のＢ）
及びトランスジェニックポテト（図１９のＣ）における
ＧＵＳの発現は、トランスジェニックイネの場合と同様
であった。ショ糖飢餓のもとでの細胞又は培地中に蓄積
したＧＵＳの量は異るトランスジェニックセルライン又
は植物種間で異った。いずれの非−形質転換細胞の細胞
又は培地中でもＧＵＳは検出されなかった（図１９の
Ａ，Ｂ及びＣのレーン１，２，８及び９）。

【０１６９】II．トランスジェニック植物におけるＥＲ
ターゲッティング及びＧＵＳのグリコシル化 Ｎ−連結グリコシル化（Kornfeld及びKornfeld, Annu.
Rev. Biochem. , 54：631-664, 1985)のための２個の潜
在的な部位が、大腸菌ＧＵＳの推定されるアミノ酸配列
中に存在する（Jefferson ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 83：8447-8451, 1986)。トランスジェニックタバ
コ細胞の小胞体（Endoplasmic Reticulum ; ER) へのＧ
ＵＳのターゲッティングがＧＵＳのグリコシル化をもた
らすことが報告されている（Iturriaga ら、Plant Cel
l, １：381-390, 1989 ; Deneckeら、Plant Cell, ２：
51-59, 1990 ; Pangら、Gene, 112 ：229-234, 1992)。

【０１７０】αＡｍｙ８のシグナルペプチド配列がＧＵ
ＳをＲＥにターゲッティングすることができるか否か、
及びその中でＧＵＳのＮ−連結グリコシル化が起こるか
否かを決定するため、トランスジェニックセルラインの
懸濁細胞から蛋白質を抽出し、又はそれらの培地から蛋
白質を集め、そしてウエスタンブロット分析にかけた
（図２０のＡ）。トランスジェニックイネ、タバコ及び
ポテトの細胞抽出物中に存在するＧＵＳ（図２０のＡの
レーン１，３及び５）は７０kDの分子量を有することが
検出され、これは大腸菌からの精製された生来のＧＵＳ
（図２０のＡのレーン７）のそれと同一であった。

【０１７１】他方、これらの細胞の培地から集められた
ＧＵＳ（図２０のＡのレーン８，１０及び１２）は８５
kDの分子量を有することが見出された。分泌されたＧＵ
Ｓの分子量の増加は、おそらく、ＥＲのルーメン側に見
出されるオリゴサッカライド・トランスフェラーゼによ
るオリゴサッカライドの付加の結果であろう（Hirschba
rg及びSnider, Annu. Rev. Biochem. , 56, 63-87, 198
7)。ＥＲのレーメン中のオリゴサッカライド・トランス
フェラーゼによる蛋白質のＮＸＳ／Ｔ残基へのオリゴサ
ッカライド側鎖の移行をツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａ
ｍｙｃｉｎ；ＴＭ）が阻害することが知られている（El
bein, Annu. Rev. Biochem. , 56；1987) 。

【０１７２】ＴＭによる細胞の処理がＧＵＳのグリコシ
ル化をブロックし、そしてその結果分泌されたＧＵＳの
分子量を減少させるはずである。本発明のトランスジェ
ニックセルラインの懸濁細胞を１０μｇ／mlのＴＭによ
り２４時間処理することにより、その様な可能性を試験
した。その結果が示すところによれば、ＧＵＳの分子量
は、本発明のトランスジェニックイネ、タバコ及びポテ
トの細胞抽出物においては７０kDのままであった（図２
０のＡのレーン２，４及び６）が、培地から集められた
ＧＵＳの分子量は、これらの細胞のＴＭ処理の後８５kD
から７０kDに低下した。これらの結果が示すところによ
れば、αＡＭＹ８のシグナルペプチド配列に融合したＧ
ＵＳはＥＲに輸送され、ＥＲのルーメン内でグリコシル
化され、そして細胞外に分泌されることができた。

【０１７３】ＧＵＳのグリコシル化が酵素の触媒活性を
阻害し、そしてＴＭ処理がトランスジェニックタバコに
おける活性なＧＵＳの合成を可能にすることが報告され
ている (Iturriaga ら、(1989)、前掲；Pangら (1992)
前掲）。タバコにおけると同様にイネにおいても同じ現
象が起こるか否かを理解するため、前記のＴＭ−処理細
胞又はそれらの培地中のＧＵＳ活性を測定した。図２０
のＢに関し、タバコの懸濁細胞中のＧＵＳ活性はＴＭ処
理の後に２倍に上昇し、他方培地中のＧＵＳ活性はＴＭ
処理の後１０倍に上昇した。ＧＵＳ活性に対するＴＭ処
理の効果はイネの細胞について一層顕著であった。

【０１７４】ちなみに、イネの懸濁細胞中のＧＵＳ活性
はＴＭ処理後１．６倍に上昇したが、培地中の該活性は
ＴＭ処理後３０倍に上昇した（図２０のＣ）。ＧＵＳ活
性は非形質転換細胞又はその培地中ではバックグラウン
ドレベルにあった。これらの実験が示唆するところによ
れば、培地中のＧＵＳの低い活性は蛋白質のグリコシル
化のためであり、そして分泌されたＧＵＳはそれがグリ
コシル化されなければ活性であろう。さらに、ＧＵＳの
グリコシル化及び不活性化はイネの細胞のＥＲにおいて
も起った。

【０１７５】III 分泌蛋白質発現系としての能力 ＴＭ処理後に活性ＧＵＳが形成されることは、ＧＵＳが
ＥＲのルーメン中で活性な４量体に組立てられたことを
意味する。このことは重要である。なぜなら、現在植物
において発現されている幾つかの重要な外来蛋白質はＥ
Ｒにおいて修飾されそして組立てられることが必要だか
らである。観察された結果は、活性な転流された（ｔｒ
ａｎｓｌｏｃａｔｅｄ）蛋白質を得るためにαＡＭＹ８
のシグナルペプチドが有用であることを示している。

【０１７６】分泌蛋白質発現系としての能力を評価する
ため、異る植物種の培養細胞からのＧＵＳ分泌の効率を
測定しそして比較した。培地から全蛋白質を集め、そし
てウエスタンブロット分析にかけた（データーは示さな
い）。異るトランスジェニックセルラインにより分泌さ
れたＧＵＳの収量を算定するための標準として精製され
た大腸菌ＧＵＳを使用した。結果を表４に示す。

【０１７７】培地から集められた全蛋白質中のＧＵＳの
％は１０〜４０％の範囲であった。ＧＵＳの収量は同じ
植物種の異るトランスジェニックセルライン間及び異る
植物種間で異った。収量はイネｃｖ．Ｔａｉｎａｎ ５
（約３０３〜３７０μｇ／ｇ細胞）で最も高く、ポテト
（約３０〜３３μｇ／ｇ細胞）で最も低かった。イネｃ
ｖ．Ｔａｉｕｎｇ ６２についての収量（約１３５−１
５０μｇ／ｇ細胞）はポテトのそれ（約１５０−１６３
μｇ／ｇ細胞）と類似していた。これらのトランスジェ
ニックセルラインの収量の順序は次の通りであった。 イネ（Ｔａｉｎａｎ ５）＞イネ（Ｔａｉｎｕｎｇ ６
２）＞タバコ＞ポテト。

【０１７８】これらの結果が示唆するところによれば、
αＡＭＹ８のプロモーター及びシグナルペプチドは、種
々の植物細胞培養物における外来蛋白質の発現及び分泌
のための蛋白質発現系を開発するために使用することが
できる。しかしながら、異る植物種及び／又は異るトラ
ンスジェニックセルラインは外来蛋白質の発現及び分泌
の効率を異にするであろう。

【０１７９】考察 得られた実験結果が示すところによれば、αＡＭＹ８／
ＧＵＳキメラ遺伝子の発現がトランスジェニックポテト
及びタバコにおいて同様に制御され、イネα−アミラー
ゼプロモーター中の制御配列がこれらの２つの植物種に
おいて同定され得ることが示される。これはさらに、糖
飢餓のシグナルを伝達する経路及びα−アミラーゼプロ
モーターに対する糖抑制の制御機作が保存されており、
そして２つの被子植物の系統の分岐の間に、単子葉植物
と双子葉植物との間で共通の特徴が残っていることを示
唆している。

【０１８０】糖飢餓による培養細胞におけるα−アミラ
ーゼプロモーターの誘導性のため、このプロモーター
は、トランスフェクトされた遺伝子のための誘導性遺伝
子発現系の設計のために潜在的に有用である。植物にお
ける遺伝子の条件的発現のための理想的なプロモーター
は幾つかの規準を満たすべきである。１）非誘導条件下
での低レベルの発現、２）誘導条件下での高レベルの発
現、３）容易に可逆的な誘導、４）多くの異種系での適
切な抑制。ここに本発明は、細胞がショ糖を含有する培
地で増殖した場合には非常に低レベルのαＡＭＹ８／Ｇ
ＵＳ発現が起こるが、しかしながら、細胞がショ糖を欠
く培地中でインキュベートされた後、高レベルの発現が
達成され得ることを示す（図１８及び図１９）。

【０１８１】従って、培地中の糖レベルを操作すること
によってα−アミラーゼプロモーターの誘導又は抑制を
容易に逆転させることができる。さらに、前記のよう
に、イネα−アミラーゼプロモーターはイネ、タバコ及
びポテトにおいて発現されそして同様に制抑され得る。
従って、本発明のイネα−アミラーゼプロモーターは、
前記すべての規準を満足し、そして組織培養における誘
導的発現系を樹立するために使用され得るだろう。この
様な発現系は、ある種の遺伝子生成物の生理的機能を研
究する機会を得るのみならず、植物の代射及び発達の重
要な段階を制御する機会を提供するであろう。

【０１８２】αＡＭＹ８の１．２kb ５′−領域は、２
５アミノ酸からなる推定上のシグナルペプチド配列を含
有し（Yuら、1993）、この配列はトランスジェニックイ
ネ、タバコ、又はポテト細胞の外でＧＵＳの標的化を速
進する。植物細胞のＥＲを介してのＧＵＳの細胞膜への
転流の証拠は、αＡＭＹ８／ＧＵＳキメラ遺伝子により
形質転換された細胞が８５kDのＧＵＳを培地に分泌し
（図２０のＡ）、そして分泌されたＧＵＳの活性有意に
低下している（図２０のＢ及びＣ）という観察に基く。

【０１８３】ＴＭによるこれらの細胞の処理が分子量の
低下（７０kD）（図２０のＡ）、及び培地に分泌された
ＧＵＳの活性の増加を惹起し（図２０のＢ及びＣ）、Ｇ
ＵＳがＥＲに輸送され、ＥＲのルーメン中でグリコシル
化され、そして細胞外に分泌されることが示唆される。
従って、αＡＭＹ８のシグナルペプチド配列は、ＥＲに
おいて修飾されそして組立てられることが必要な発現さ
れたパッセンジャー蛋白質の発現を可能にする。タバコ
又はイネの懸濁細胞におけるＧＵＳ活性はわずかに増加
し（図２０のＢ及びＣ）、幾らかの細胞内ＧＵＳがグリ
コシル化されたことが示されたが、それはウエスタンブ
ロット分析において検出不能であった（図２０Ａ）。あ
るいは、ＴＭ処理が細胞内ＧＵＳを幾分安定化させるの
かもしれない。

【０１８４】結論として、上記の実験が示すところによ
れば、トランスジェニック植物の異る種におけるイネα
−アミラーゼプロモーター／ＧＵＳレポーター遺伝子の
発現は培地中の糖レベルにより制御することができ、こ
のことが糖制御への応答のために重要なプロモーター配
列の機能的分析を可能にする。α−アミラーゼプロモー
ターを操作して、トランスフェクトされた遺伝子の発現
のレベルを制御することによりその遺伝子の細胞生物学
的効果の基本的研究のための誘導性発現カセットにする
ことができる。α−アミラーゼのシグナルペプチド配列
と組合わせて、この発現カセットはまた、分泌される組
換え蛋白質の製造のために使用することができる。この
発現系は、植物生物学における基本的研究、及び遺伝子
操作された蛋白質の大量生産のための新しい可能性を提
供する。

【０１８５】

【表１】

【０１８６】

【表２】

【０１８７】

【表３】

【０１８８】

【表４】

【０１８９】上の教示から明らかなように、本発明の精
神および範囲から逸脱しないで種々の変化および変更が
可能である。したがって、本発明はそれ以外は詳しく記
載したよう実施することができる。

【０１９０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９９６bp 配列の型：核酸 鎖の表：二本鎖 トポロジー：直鎖状 鎖の型：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物：イネ（Ｏｒｙｚａｅ ｓａｔｉｖａ） 株：ＣＶ．Ｍ２０２ 直接の起源： ライブラリー：（ＥＭＢＬ）ｇｅｎｏｍｉｃ クローン：α−Ａｍｙ６−Ｃ 配列：

【０１９１】 AAGCTTCTGA AGCTGATGCG ATCAAACCTC AAAAGACCAT GGGCAGCAGC 50 ACGGAAGTTA CAAACCGAAG CCGCGCGGCG CGCATACGCA TCAGAAAGGC 100 GCGCAATAAC GGACCACCCA TACGGCGGCC GCGCTCTGTT CGCGGCGTCC 150 CTGCGCCTGC ATCGCACGCC ATCCAAGGCT GCATAGCACG ACGCATACAT 200 ATCTCACGCG CCCTTTTTAT CTGCTTATAA ATGAGATAGC CCACATAGCA 250 GCGCTGCCGT TTCTCCTCTT CTCTCGTTGG GGGCAACCGA ACTTATCCAA 300 CAACGATCCA TCCATTGGCC AAGTGGCTGC CGTGCTGCAC CTATAAATTC 350 ACATGCACCG GCATGCCACT CCACACAAGT GAGCTACTCG AAAGAAGCAG 400 CA ATG GCA AAG CGC ATA GCC TCA ATG AGC AGC CTC CTC CTT ATC 444 Met Ala Lys Arg Ile Ala Ser Met Ser Ser Leu Leu Leu Ile -25 -20 -15 GCC TTG CTC TGT CTG AGC TCT CAC TTG GCC CAA GCC CAG GTC CTC 489 Ala Leu Leu Cys Leu Ser Ser His Leu Ala Gln Ala Gln Val Leu -10 -5 1 TTC CAG GTA AGCATCCTGT AGTACAATGT CACATTACAT AAAAAAAAAT 538 Phe Gln 5 GACTTGCGTT TGACATGACT GTTCTTGGTG TAG GGG TTC AAC TGG GAG 586 Gly Phe Asn Trp Glu 10 TCG TGG AAG AAG CAG GGC GGG TGG TAC AAC TTC CTC CAT GGC CAC 631 Ser Trp Lys Lys Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Phe Leu His Gly His 15 20 25 GTC GAC GAC ATC GCC GCG ACC GGT GTC ACG CAC GTC TGG CTC CCA 676 Val Asp Asp Ile Ala Ala Thr Gly Val Thr His Val Trp Leu Pro 30 35 40 CCG CCG TCG CAC TCC GTC GCC CCG CAG GGA TAC ATG CCG GGC CGG 721 Pro Pro Ser His Ser Val Ala Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg 45 50 55 CTC TAC GAC CTG GAC GCT TCC AAG TAC GGC ACG GGG GCA GAG CTC 766 Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Lys Tyr Gly Thr Gly Ala Glu Leu 60 65 70 AGG TCG CTG ATC GCC GCC TTC CAC AGC AAA GGC ATC AAG TGC GTC 811 Arg Ser Leu Ile Ala Ala Phe His Ser Lys Gly Ile Lys Cys Val 75 80 85 GCC GAC ATC GTC ATC AAC CAC CGG TGC GCG GAT TAC AAG GAT AGC 856 Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Cys Ala Asp Tyr Lys Asp Ser 90 95 100 CGT GGC ATC TAC TGC ATT TTC GAG GGT GGC ACG CCG GAC AGC CGC 901 Arg Gly Ile Tyr Cys Ile Phe Glu Gly Gly Thr Pro Asp Ser Arg 105 110 115 CTC GAC TGG GGC CCC GAC ATG ATC TGC AGC GAC GAC ACG CAG TAC 946 Leu Asp Trp Gly Pro Asp Met Ile Cys Ser Asp Asp Thr Gln Tyr 120 125 130 TCC AAC GGC CGC GGT CAC CGC GAC ACC GGC GCA GAC TTC GGC GCG 991 Ser Asn Gly Arg Gly His Arg Asp Thr Gly Ala Asp Phe Gly Ala 135 140 145 GCG CCC GAC ATC GAC CAC CTC AAC ACG CGT GTG CAG ACA GAG CTG 1036 Ala Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Thr Arg Val Gln Thr Glu Leu 150 155 160 TCC GAC TGG CTC AAT TGG CTC AAG TCC GAC GTC GGC TTC GAC GGC 1081 Ser Asp Trp Leu Asn Trp Leu Lys Ser Asp Val Gly Phe Asp Gly 165 170 175 TGG CGC CTC GAC TTC GCC AAG GGA TAC TCG GCG GCC GTC GCC AAG 1126 Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Ala Ala Val Ala Lys 180 185 190 ACG TAC GTC GAC AAC ACC GAC CCG TCC TTC GTC GTC GCC GAG ATA 1171 Thr Tyr Val Asp Asn Thr Asp Pro Ser Phe Val Val Ala Glu Ile 195 200 205 TGG AGC AAC ATG CGT TAC GAC GGC AAC GGT GAG CCG TCG TGG AAC 1216 Trp Ser Asn Met Arg Tyr Asp Gly Asn Gly Glu Pro Ser Trp Asn 210 215 220 CAG GAC GGT GAC CGG CAG GAG CTG GTG AAC TGG GCG CAG GCC GTC 1261 Gln Asp Gly Asp Arg Gln Glu Leu Val Asn Trp Ala Gln Ala Val 225 230 235 GGT GGC CCT GCG TCA GCG TTC GAC TTC ACG ACC AAG GGC GAG CTG 1306 Gly Gly Pro Ala Ser Ala Phe Asp Phe Thr Thr Lys Gly Glu Leu 240 245 250 CAG GCG GCG GTG CAA GGT GAG CTG TGG CGG ATG AAG GAC GGC AAC 1351 Gln Ala Ala Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Met Lys Asp Gly Asn 255 260 265 GGC AAG GCG CCG GGG ATG ATT GGC TGG CTG CCA GAG AAG GCC GTC 1396 Gly Lys Ala Pro Gly Met Ile Gly Trp Leu Pro Glu Lys Ala Val 270 275 280 ACC TTC ATC GAC AAC CAT GAC ACT GGC TCC ACA CAG AAC TCA TGG 1441 Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Gln Asn Ser Trp 285 290 295 CCG TTC CCC TCC GAC AAG GTC ATG CAG GGC TAC GCC TAC ATC CTC 1486 Pro Phe Pro Ser Asp Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala Tyr Ile Leu 300 305 310 ACA CAC CCT GGA GTA CCC TGC ATT GTGA GTCCTCAGCT GCATGAATAC 1534 Thr His Pro Gly Val Pro Gys Ile 315 GAATGCCATA AAGAAAAATC TAATTTTCTC AACCAGTTTC TCCGACTAAA 1584 TTCTGTTTAT TGACTATGTG TGCAG TTC TAC GAC CAT GTA TTT GAC TGG 1633 Phe Tyr Asp His Val Phe Asp Trp 320 325 AAC CTG AAG CAG GAG ATC AGC ACA TTA GCT GCA GTG AGA TCA AGA 1678 Asn Leu Lys Gln Glu Ile Ser Thr Leu Ala Ala Val Arg Ser Arg 330 335 340 AAT GAG ATT CAT CCC GGG AGC AAG CTG AAA ATC CTT GCT GCT GAG 1723 Asn Glu Ile His Pro Gly Ser Lys Leu Lys Ile Leu Ala Ala Glu 345 350 355 GGA GAC GTC TAT GTC GCC ATG ATC GAT GAT AAG GTC ATA ACA AAG 1768 Gly Asp Val Tyr Val Ala Met Ile Asp Asp Lys Val Ile Thr Lys 360 365 370 ATT GGG ACA CGG TAT GAC GTG GGC AAC TTA ATC CCG TCA GAC TTC 1813 Ile Gly Thr Arg Tyr Asp Val Gly Asn Leu Ile Pro Ser Asp Phe 375 380 385 CAT GTC GTT GCT CAC GGC AAC AAT TAC TGC ATT TGG GAA AAG AGC 1858 His Val Val Ala His Gly Asn Asn Tyr Cys Ile Trp Glu Lys Ser 390 395 400 GGT CTC AGA GTT CCT GCA GGG CGG CAC CAC TAT TAG GCGAAG 1900 Gly Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His His Tyr 405 410 AAAATTTTTC AGGACTATTT GGTGCCTGGA ATAAGATTTG AATTATATCC 1950 TAAATAACCA GATTATGATT GTATGAGATT TCTTAATCTG AGCAAA 1996

【０１９２】配列番号：２ 配列の長さ：４２７６bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 鎖の型：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物：イネ（Ｏｒｙｚａｅ ｓａｔｉｖａ） 株：ＣＶ．Ｍ２０２ 直接の起源： ライブラリー：（ＥＭＢＬ）ｇｅｎｏｍｉｃ クローン：α−Ａｍｙ７−Ｃ 配列：

【０１９３】 GCATGCGAGA GGCACGGGGT TCGATTCCCC GCGTCTCCAT CGGCACTGTT 50 TTTTAACATC AAACGCTGTT CGATCCACTA TCTGTTAATT TCGCAAACAC 100 AACTAAATCT TTTTTTTTTT TTGCCGGTGC GTGCAGTGTG ACGTCCAAGG 150 CATGGCGCAT TGGCGCCTCC CCTCTTTCCC TTGATCTTTT CATCAGTTCG 200 TTCTTCTTGC AGAAAAGCTG TTCTGTTAAG TCGGTTCCGA TCTGCTCTTG 250 GGCTCTTGCC AGAAACAACC TGTGTACGCC AGACTTATCA AGCCAACCAT 300 CCTGATGAGC CTCTGCTTAT ACAAGCCTTT GACTCCAAAA AGGACGAGGC 350 GGCTTGCAGC CGCACGGAAA TAAGCCGACC GATCCTTTAT TGCTCTATCT 400 TTTTCCCTTG GAATAAAAAA CAGCCCAATT AAAATCTGGG ATGAAACTAT 450 GGCTAGCTGT TCGCGGTGTC AGTTCTCGGG ACGCTACCGT TGTTTTGTTT 500 GAACCGGAAT GTTCAGGGCG GTTCACACCA TAGACTTGGA GCCAAGTGGT 550 TCCATCCACA AAATTTTCTC ATCTTGAATA TTCTGTTATC TGCCTCGACA 600 GACGCGCCAT ATCCTGTGTT CAGGAATGAA TGTGCTACAG CCAACGTGCT 650 GCATGAAATT TGCTGAAATC GTGCTAAAAT GTGCATGGCA ACAGGAACCT 700 GATGCCCTGG TCCTGTGGAA CTGCCACGGG AAAGTATTTT TTATAGCTAG 750 GTGCAATCGT ATCTAGGTGT ATACATGTCA CCTACATAGC TACTCCCCTT 800 TATCTTAAAA TATAATAATT TTTAACTCTC AGTATTTGTC CTAAAATATA 850 ACAAATTCTC CATCAACATT ATCTTCCCAA CCAATCACAA CCCTTCATCA 900 TTAATTTTTT CCCCCTACCT CCACTACTCA TCTAATCACA ACCCTCCAAC 950 ACTCACTTCT ATCTACTTTC TTAATAACTG TCTTCAACCC TAAAACTTCT 1000 TATATTTTAG GACGGAGGGA GTATCTAAAT ATTTCATAAA AAAAATGTTA 1050 AGATAGATAA AGAAGATATA AACCCACTAT GCAAACATGC ACATCAAAAT 1100 TTAATTTACA GTAAAGAAAC AGAAATAACA TATTCTATTT GTGCTGGAGA 1150 TGTACTGTTC ACAATATTGT TTTTTTATTT TTTATTTATC TGATTATATA 1200 TCTGTTTCAG CCTTGCATGG TTGTGTATGT TTGTGTATAG ACTTATGCCA 1250 TTGTGATTGA TGCTACCAAT TATTTTCAGA CTATTTTTTT ATAGAGGAAT 1300 TTTATAGTTC TTGAGAAAAT ACCTTGAAGT ATCTAAATTT TACACTAAAA 1350 TTGTTGGTAC CTTGAGGTAC AAAGTACCTA GAGGTACCAA ATTTTACTAG 1400 AAAATTGTGG CACCTTTAGG TACCTTCTCA AAAATAGTAC AATTATGGGC 1450 CGTTTTGGAT TTAGTGCCAA AACGTGCTCT ACAAATATTT TGATAGTTTG 1500 AACAGTGCAT AAGACGGGTT TGGTTTGAAG CCAAATCATT GGCATTGCCA 1550 ATGTCCAATT TGATATTTTC TATATTATGC TAAAAGCTTG GTTCTAAATT 1600 GGCCTCCAAC CAAATACAAC TCTACTCTAC CAAAAAATTT GTAGTGCCAA 1650 AACTTGCCTA GGTTTTGTCA CTACCAACAT TTTGGTAAGT ATTAAACCAA 1700 ACAAGCCCTA CATTTTTTTA TGTACATTTA AGTTGTATGT AAATGATGGG 1750 TGCGGTTGCA CCTAGGTGAA AAAAAATACA TATTCGCCAC AACTCGCAAC 1800 ATGTACCAAT TCAGCAGCAA GTGTAAGAGA GAAGATTTCT CTCGTTTTAC 1850 ACGCGCACGT TCAATTCCTG AACTACTAAA CGGTATGATT TTTTGCAAAA 1900 ATTTTCTATA GGAAAGTTAC TTAAAAATTA TATTAATCTA TTTTTAAAAT 1950 TTAAAATAGT TAATACTCAA TTAATTATAC GTTAATGGCT CAGCTCGTTT 2000 TGCGTACATT CTCAATCGAT TCTTTTCCTC TGCTCTCAAA TGCTCTGTGT 2050 GCGATCAGGT ATTCATGTTC AGCTCGCACA AGCACAAGCA AGACAGATGG 2100 AATTCCTACT GACCTGCGCC TTTTGCATCG CTCCAACTCT CAAAGTCTCA 2150 AGGCCATTAA ATTGCCTATG GGCTCACCAG CCAATAACAA ACTCCGGCTG 2200 TTATCCATCC AATCCAGTGT CCCAAAGCAA CATTCAAGCC CAGCCAGGCC 2250 TCCAAAAGTT GCAAGTTGAG CATGGCAAAA TCCCCGGCAA TTCTCGACTA 2300 TAAATACCTG ACCAGACACA CCCAGGAGCT TCATCAATCA TCCATCTCCG 2350 AAGTGTGTCT GCAGCATGCA GGTGCTGAAC ACC ATG GTG AAC AAA CAC 2398 Met Val Asn Lys His -25 TTC TTG TCC CTT TCG GTC CTC ATC GTC CTC CTT GGC CTC TCC TCC 2443 Phe Leu Ser Leu Ser Val Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ser -20 -15 -10 AAC TTG ACA GCC GGG CAA GTC CTG TTT CAG GTA AGAGATCGCC 2486 Asn Leu Thr Ala Gly Gln Val Leu Phe Gln -5 1 5 ATGAGTTGGG TTTCAGGCTT CAGTGAACTG ATCCGGTTTT GTACTGAGCC 2536 TAAGAGAATG ATGCAGTGAT GCTCTTGTGT TTGATGATGA TGCAG GGA TTC 2587 Gly Phe AAC TGG GAC TCG TGG AAG GAG AAT GGC GGG TGG TAC AAC TTC CTG 2632 Asn Trp Glu Ser Trp Lys Glu Asn Gly Gly Trp Tyr Asn Phe Leu 10 15 20 ATG GGC AAG GTG GAC GAC ATC GCC GCA GCC GGC ATC ACC CAC GTC 2677 Met Gly Lys Val Asp Asp Ile Ala Ala Ala Gly Ile Thr His Val 25 30 35 TGG CTC CCT CCG CCG TCT CAC TCT GTC GGC GAG CAA GGTGCGGTG 2722 Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val Gly Glu Gln 40 45 CTCTGCTCTC TCGATCCCCT CGTCGTCGCA CCATTGCCGG CAAAATACAT 2772 GCACAGGTCG TTGAATTGCT TGAATGCTTC TGCA GGC TAC ATG CCT GGG 2821 Gly Tyr Met Pro Gly 50 CGG CTG TAC GAT CTG GAC GCG TCT AAG TAC GGC AAC GAG GCG CAG 2866 Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Lys Tyr Gly Asn Glu Ala Gln 55 60 65 CTC AAG TCG CTG ATC GAG GCG TTC CAT GGC AAG GGC GTC CAG GTC 2911 Leu Lys Ser Leu Ile Glu Ala Phe His Gly Lys Gly Val Glu Val 70 75 80 ATC GCC GAC ATC GTC ATC AAC CAC CGC ACG GCG GAG CAC AAG GAC 2956 Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Thr Ala Glu His Lys Asp 85 90 95 GGC CGC GGC ATC TAC TGC CTC TTC GAG GGC GGG ACG CCC GAC TCC 3001 Gly Arg Gly Ile Tyr Cys Leu Phe Glu Gly Gly Thr Pro Asp Ser 100 105 110 CGC CTC GAC TGG GGC CCG CAC ATG ATC TGC CGC GAC GAC CCC TAC 3046 Arg Leu Asp Trp Gly Pro His Met Ile Cys Arg Asp Asp Pro Tyr 115 120 125 GGC GAT GGC ACC GGC AAC CCG GAC ACC GGC GCC GAC TTC GCC GCC 3091 Gly Asp Gly Thr Gly Asn Pro Asp Thr Gly Ala Asp Phe Ala Ala 130 135 140 GCG CCG GAC ATC GAC CAC CTC AAC AAG CGC GTC CAG CGG GAC CTC 3136 Ala Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Lys Arg Val Gln Arg Glu Leu 145 150 155 ATT GGC TGG CTC GAC TGG CTC AAG ATG GAC ATC GGC TTC GAC GCG 3181 Ile Gly Trp Leu Asp Trp Leu Lys Met Asp Ile Gly Phe Asp Ala 160 165 170 TGG CGC CTC GAC TTC GCC AAG GGC TAC TCC GCC GAC ATG GCA AAG 3226 Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Ala Asp Met Ala Lys 175 180 185 ATC TAC ATC GAC GCC ACC GAG CCG AGC TTC GCC GTG GCC GAG ATA 3271 Ile Tyr Ile Asp Ala Thr Glu Pro Ser Phe Ala Val Ala Glu Ile 190 195 200 TGG ACG TCC ATG GCG AAC GGC GGG GAC GGC AAG CCG AAC TAC GAC 3316 Trp Thr Ser Met Ala Asn Gly Gly Asp Gly Lys Pro Asn Trp Asp 205 210 215 CAG AAC GCG CAC CGG CAG GAG CTG GTC AAC TGG GTC GAT CGT GTC 3361 Gln Asn Ala His His Gln Glu Leu Val Asn Trp Val Asp His Val 220 225 230 GGC GGC GCC AAC AGC AAC GGC ACG GCG TTC GAC TTC ACC ACC AAG 3406 Gly Gly Ala Asn Ser Asn Gly Thr Ala Phe Asp Phe Thr Thr Lys 235 240 245 GGC ATC CTC AAC GTC GCC GTG GAG GGC GAG CTG TGG CGC CTC CGC 3451 Gly Ile Leu Asn Val Ala Val Glu Gly Glu Leu Trp Arg Leu Arg 250 255 260 GGC GAG GAC GGC AAG GCG CCC GGC ATG ATC GGG TGG TGG CCG GCC 3496 Gly Glu Asp Gly Lys Ala Pro Gly Met Ile Gly Trp Trp Pro Ala 265 270 275 AAG GCG ACG ACC TTC GTC GAC AAC CAC GAC ACC GGC TCG ACG CAG 3541 Lys Ala Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Glu 280 285 290 CAC CTG TGG CCG TTC CCC TCC GAC AAG GTC ATG CAG GGC TAC GCA 3586 His Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala 295 300 305 TAC ATC CTC ACC CAC CCC GGC AAC CCA TGC ATC GTGAGTAGCC 3629 Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Asn Pro Cys Ile 310 315 320 AACTCGATCA GAAATTCTGA ATCATCCTGC AAACTGATCG ATGAACTGAT 3679 GATAAATTCT GTAAAATTGT TCAG TTC TAC GAC CAT TTC TTC GAT TGG 3727 Phe Tyr Asp His Phe Phe Asp Trp 325 GGT CTC AAG GAG GAG ATC GAG CGC CTG GTG TCA ATC AGA AAC CGG 3772 Gly Leu Lys Glu Glu Ile Glu Arg Leu Val Ser Ile Arg Asn Arg 330 335 340 CAG GGG ATC CAC CCG GCG AGC GAG CTG CGC ATC ATG GAA GCT GAC 3817 Gln Gly Ile His Pro Ala Ser Glu Leu Arg Ile Met Glu Ala Asp 345 350 355 AGC GAT CTC TAC CTC GCG GAG ATC GAT GGC AAG GTG ATC ACA AAG 3862 Ser Asp Leu Tyr Leu Ala Glu Ile Asp Gly Lys Val Ile Thr Lys 360 365 370 ATT GGA CCA AGA TAC GAC GTC GAA CAC CTC ATC CCC GAA GGC TTC 3907 Ile Gly Pro Arg Tyr Asp Val Glu His Leu Ile Pro Glu Gly Phe 375 380 385 CAG GTC GTC GCG CAC GGT GAT GGC TAC GCA ATC TGG GAG AAA ATC 3952 Gln Val Val Ala His Gly Asp Gly Tyr Ala Ile Trp Glu Lys Ile 390 395 400 TGAGC GCACGATGAC GAGACTCTCA GTTTAGCAGA TTTAACCTGC 3997 GATTTTTACC CTGACCGGTA TACGTATATA CGTGCCGGCA ACGAGCTGTA 4047 TCCGATCCGA ATTACGGATG CAATTGTCCA CGAAGTACTT CCTCCGTAAA 4097 TAAAGTAGGA TCAGGGACAT ACATTTGTAT GGTTTTACGA ATAATGCTAT 4147 GCAATAAAAT TTGCACTGCT TAATGCTTAT GCATTTTTGC TTGGTTCGAT 4197 TCTACTGGTG AATTATTGTT ACTGTTCTTT TTACTTCTCG AGTGGCAGTA 4247 TTGTTCTTCT ACGAAAATTT GATGCGTAG 4276

【０１９４】配列番号：３ 配列の長さ：３３１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 鎖の型：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物：イネ（Ｏｒｙｚａｅ ｓａｔｉｖａ） 株：ＣＶ．Ｍ２０２ 直接の起源： ライブラリー：（ＥＭＢＬ ｇｅｎｏｍｉｃ） クローン：α−Ａｍｙ８−Ｃ 配列：

【０１９５】 GATATCCCGC CAGCACAGTG CCGGAAACTT TAATGCCGAT GGGGCTTTTA 50 ATGCCGGTTG AGAGCATATC GATACGGTTA CGAATTGGCG GCACCCACAG 100 ATTCGCCAGC CCCGGCAGCC GCACGGTGTT ATCCAGTTCC TCAATGATTT 150 TGTCCATCGT CATGCCTGGC CGCCACTGCT CCTGCGGCTT AAGCTGGATG 200 GTCGTTTCTA CCATCTCCAG CGGACAGAAT CGGTGGCCGG TTTCCGTTTC 250 CCGGTTTTGC CAAATACCCG CGCCACTTCA GGTACGCTCA TAATTAGCTT 300 GTCGGTTTTT TGCAGCATAC CGCCGCCTCT GCTGCGGAAA TCCCCGGCAG 350 CGTCGATGGC ATATACACAA GTCGCCTTCA TTGATCTGCG GTAAAAATTC 400 CCGCCAACTT TATTGAGCGG CCAGAGAANN GTAGCACCGA AAGCNCCGCC 450 ACCAGCAGCG TGGTTTTNNN CCAGTGCAGT ACTTCAGCAA CACGGATGAT 500 AAACACGAAT CAAAAAGCGA TTGTGCGGGT TACTGCTTTC CGGCGGAATT 550 TTGCCACGGA TCTCCTTTCC AAAGAAAGTT TCCCTGCCGG CGCTTGATCC 600 GTCACACCGA TGACGCGACG CGGTAGAGGC CGGTACCTGT TCGAACAACC 650 AACTGATCTG CGGCTCCTCC GCTTGCGGCT TGCCTCTTAT CAACGTATCG 700 CCGTTTCCGT CATGCGTGAT CGGTGATCGA TCACCGAGAG AGACCGGACG 750 ACGAGTCGAG AGAGCTCGCG CCGCCTCGAT CGGCGCGGCG GTGACTCGAG 800 CAGGGCCTGA AGTAGCTGCA CGGCTCAAGG CGGCACTCCA TCACCGGACA 850 CCGGGGTCCA GACTACTCGT TTCCGTTGGA GAAATAACCA CCTTTATCCA 900 TGTTGCTTAT CCGTGAATTG CAACAGCATT GATTGTTCGC GTTTAATTCG 950 CCTCGGCCAT GTAACCTCCG ACCTGATCCT CTTGGACACT ATAAATAGAG 1000 GCCAGTTCAG GCAATGCAAG AGCAGAGAAG CAGAGTACAG CAGGCAGCTC 1050 TTCTTCTCTT TGCGAAGGTT GGCTACTTGG CCAGCCATTA GGAAACAAGT 1100 TAGTTTGGAG AAGAAGCAGA GTTGAGACTG CATTTGCATT GCTCTGTAGC 1150 C ATG GGC AAG CAC CAT GTC ACC CTG TGT TGT GTC GTT TTT GCT 1193 Met Gly Lys His His Val Thr Leu Cys Cys Val Val Phe Ala -20 -15 -10 GTG CTC TGC CTG GCG TCC AGC TTA GCA CAA GCC CAA GTT CTC TTC 1238 Val Leu Cys Leu Ala Ser Ser Leu Ala Gln Ala Gln Val Leu Phe -5 1 5 CAG GTAGTT TAATTTACTG ACGCCTTGGT GAAAGTTTGT TAATACTTGA 1287 Gln TAATAATAAT CTTGCACGGC AATATAATGT ACGCGCCGCA GTCAGGAAGC 1337 TTGATTTGAC CATGGGTTGC GTTTGGGTGT TTTTGCCGTA CGTGCAG GGG TTT 1390 Gly Phe 10 AAC TGG GAG TCG TGG AGG AAG CAA GGC GGG TGG TAC AAC TTT CTG 1435 Asn Trp Glu Ser Trp Arg Lys Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Phe Leu 15 20 25 CAC GAG AAG GTG GAG GAG ATC GCC AGC ACG GGC GCC ACC CAC GTC 1480 His Glu Lys Val Glu Glu Ile Ala Ser Thr Gly Ala Thr His Val 30 35 40 TGG CTC CCG CCG CCG TCG CAC TCT GTC TCG CCG CAG GGT TAC ATG 1525 Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val Ser Pro Gln Gly Tyr Met 45 50 55 CCG GGG CGG CTC TAC GAC CTG GAC GCG TCC AAG TAC GGC ACG GAG 1570 Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Lys Tyr Gly Thr Glu 60 65 70 GCG GAG CTC AAG TCG CTG ATC GAG GCA TTC CAC GAC AAG AAC GTC 1615 Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ile Glu Ala Phe His Asp Lys Asn Val 75 80 85 GAG TGC CTC GCC GAC ATC GTC ATC AAC CAC CGC TGC GCC GAC TAC 1660 Glu Cys Lys Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Cys Ala Asp Tyr 90 95 100 AAG GAC AGC CGC GGC GTG TAC TGC GTG TTC GAG GGC GGC ACG CCC 1705 Lys Asp Ser Arg Gly Val Tyr Cys Val Phe Glu Gly Gly Thr Pro 105 110 115 GAC GGC CGC CTC GAC TGG GGC CCC GAC ATG ATC TGC AGC GAC GAC 1750 Asp Gly Arg Leu Asp Trp Gly Pro Asp Met Ile Cys Ser Asp Asp 120 125 130 ACG CAG TAC TCC AAC GGC CGC GGC CAC CGC GAC ACC GGC GCC GGG 1795 Thr Gln Tyr Ser Asn Gly Arg Gly His Arg Asp Thr Gly Ala Gly 135 140 145 TTC GGC GCC GCG CCC GAC ATC GAC CAC CTC AAC CCG CGT GTC CAG 1840 Phe Gly Ala Ala Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Pro Arg Val Gln 150 155 160 CGG GAG CTC ACC GAC TGG CTC AAC TGG CTC AGG ACC CAC CTC GGC 1885 Arg Glu Leu Thr Asp Trp Leu Asn Trp Leu Arg Thr Asp Leu Gly 165 170 175 TTC GAC GGA TGG CGC CTC GAC TTC GCG AAG GGC TAC TCC GCG CCG 1930 Phe Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Ala Pro 180 185 190 CTG GCG AGG ATC TAC GTC GAC AAC ACC AAC CCG ACG TTC GTC GTC 1975 Leu Ala Arg Ile Tyr Val Asp Asn Thr Asn Pro Thr Phe Val Val 195 200 205 GGC GAG ATC TGG AGC TCG CTC ATC TAC AAC GGC GAC GGC AAG CCG 2020 Gly Glu Ile Trp Ser Ser Leu Ile Tyr Asn Gly Asp Gly Lys Pro 210 215 220 TCG ACC AAC CAG GAC GCG GAC AGG CAG GAG CTG GTG AAC TGG GTG 2065 Ser Thr Asn Gln Asp Ala Asp Arg Gln Glu Leu Val Asn Trp Val 225 230 235 GAG GGC GTC GGC AAG CCG GCG ACG GCG TTC GAC TTC ACC ACC AAG 2110 Glu Gly Val Gly Lys Pro Ala Thr Ala Phe Asp Phe Thr Thr Lys 240 245 250 GGC ATC CTC CAG GCC GCC GTG CAG GGC GAG CTG TGG AGG CTC CAC 2155 Gly Ile Leu Gln Ala Ala Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Leu His 255 260 265 GAC GGC AAC GGC AAG GCG CCC GGC CTC ATG GGG TGG ATG CCC GAT 2200 Asp Gly Asn Gly Lys Ala Pro Gly Leu Met Gly Trp Met Pro Asp 270 275 280 CAG GCC GTA ACC TTC GTC GAC AAC CAC GAC ACC GGC TCG ACC CAG 2245 Gln Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Gln 285 290 295 TCG CTC TGG CCG TTC CCT TCC GAC AAG GTC ATG CAG GGC TAC GCC 2290 Ser Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala 300 305 310 TAC ATC CTC ACT CAC CCT GGC ATC CCA TGC ATC GTAAGTATCA 2333 Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Ile Pro Cys Ile 315 320 CCACCGAAAT CTTTCTCATC AAATTCGTTC ATATTGGTGA GCTCATTGCT 2383 GGTGCATGTG TACGTGTGTA TGCAG TTC TAC GAC CAT GTG TTC GAC TGG 2432 Phe Tyr Asp His Val Phe Asp Trp 325 330 AAC CTG CAG CAC GAG ATC GCG ACG CTG GCT GAA ATC CGG TCA AGG 2477 Asn Leu Gln His Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Ile Arg Ser Arg 335 340 345 AAC GGG ATC CAT GCG GAG AGC ACG CTG GAC ATC CTC AAG GCC GAG 2522 Asn Gly Ile His Ala Glu Ser Thr Leu Asp Ile Leu Lys Ala Glu 350 355 360 GGG GAC ATC TAC GTC GCC ATG ATC GAC GGC AAG GTG ATC ACC AAG 2567 Gly Asp Ile Tyr Val Ala Met Ile Asp Gly Lys Val Ile Thr Lys 365 370 375 CTC GGG CCG AGG TAC GAC GCC GGC GGG ATC ATC CCC TCC GAC TTC 2612 Leu Gly Pro Arg Tyr Asp Ala Gly Gly Ile Ile Pro Ser Asp Phe 380 385 390 CAT GTC GTG GCG CAC GGC AAC GAC TAC TGC GTC TGG GAG AAG GAA 2657 His Val Val Ala His Gly Asn Asp Tyr Cys Val Trp Glu Lys Glu 395 400 405 GGC CTC AGG GTT CCT GCC GGT AGA AAG CAC TAT TAG CTTTAGCT 2701 Gly Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg Lys His Tyr 410 415 ATAGCGATCG AGTTGCATGG TGCTTTGCAA CCCTAGATAA TATATATACG 2751 TACGTGGCTC TAGCTATGAA TCATGCAATT TTGCTGCGAG ATGTGTACGA 2801 GCGAGCTTCG ATCGATGTAC GCTTCGTTAT AACTAGCGTT CTTCGGAAAT 2851 AAGTAATCGG AATGTACCCT GTTAATCCTG CAGAAATGTA GGATGAATGG 2901 AATTAACTAG CTACTGTTCG TTTCGATCCT CAAGAAAGAC TTGCAAGATC 2951 TTGTCCAGTT GACTTCAGTT TTTTACTCCC GCTTTTAGCG TCTGGATACC 3001 GTGGTGGATT GAAAGCTCAA CTTGATCCCG TTTGGCCCAG CAATATTAGG 3051 CCGTAAGTAA AACGAATGAC ACCTGCATAT TCCGGCCCAA AGCGCACGCT 3101 CGTTGTCTCT CATTTAGCGG TCCAAAGATA ATGGGACGAA TGTTCTTCAC 3151 AGCAACGATT TAGCCTAACT ATAATGGGGC ACCTTTCCTT TATAACCCAA 3201 GGAATAAGTT CACTGGTCCC TTAATTTATC AGCGAGTCTG AAATTTATCC 3251 CTAAACCGAA ATACTGTATA TAATTGGTCC CCCAATTTTC AAAACGGTTC 3301 ACTTAGAGGA CCC 3314

【０１９６】配列番号：４ 配列の長さ：１５１９bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 鎖の型：ｃＤＮＡ 起源： 生物：イネ（Ｏｒｙｚａｅ ｓａｔｉｖａ） 株：ＣＶ．Ｌａｂｅｌｌａ 直接の起源： ライブラリー：（Ｌａｍｄａ ｇｔ−１１）ｃＤＮＡ クローン：α−Ａｍｙ１０−Ｃ 配列：

【０１９７】 AGCAAACGCT TCTTGTCCCT GTCCCTGCTC ATCCTCCTCC TCGGCTTCTC 50 CTCCAGCTTG GCAGCCGGGC AAGTCCTGTT TCAGGGCTTC AACTGGGAGT 100 CGTGGAAGGA GAATGGCGGG TGGTACAACA TGCTGATGGG CAAGGTGGAC 150 GACATCGCCG CCGCCGGCAT CACCCACGTC TGGCTCCCTC CGCCGTCTCA 200 ATCTGTCGCC GAACAAGGCT ACATGCCGGG GCGGCTGTAC GATCTGGACG 250 CTTCCAAGTA CGGCAACGAG GCGCAGCTCA AGTCGCTGAT CGAGGCGTTC 300 CACGGCAAGG GCGTCCAGGT GATCGCCGAC ATCGTCATCA ACCACCGCAC 350 GGCGGCAGCA AGCACAGGAC GGCCGCGGCA TCTACTGCCT CTTCGAGGGC 400 GGGCAGCGCG ACTCCCGCCT CGACTGGGGC CCGCACATGA TCTGCCGCGG 450 CGACCCCTAC GGCGACGGCA CCGGCAACCG ACACCGCTAG CCGACTTGGC 500 CTGACATCGA CCACCTCAAC AAGCGCGTCA CGAGCTCATC GGCTGGCTCG 550 ACTGGCTCGA CTGGCTCAAG CATAGGAACC AATTGGGCCT TCGACCCTGA 600 CTGGCCTCCT CGACTTCCGC CAACGCGCGC GTTACTCCCG CCGTACGTAT 650 CTGCAAAGAG CTATCATCGA CTGCCACCGA GACCGGACTA TCGCCGATGG 700 CCGAGACTAT AGGACGTACG CTGGCGTAGC GAGCTGCGGG ACGGCTAAAG 750 CCGGACTATG ACCATGAACG CAACGACCGG CAGTAGCTGG TCAACTGGGT 800 CGACCGTGCG GCTGGACCAA CATCATTCTA AATGCTTCGA CTTCACCACC 850 TAATGGGCAT ACTCAACGAA TCGCCAGCTT GGTAGGTGCG AGCTATTGGC 900 GCCTCCTGGG CGTAGAGACG GCCAAGGCGC CACAGGCATG CATTACGGAG 950 TAGTGGCCGG CTAAGGGACG ACCTTTGATC TGACGAACCA CTGACTACCA 1000 GGCGTCGATC CGCAGCATCA TGTGGCTGTT TCCCTCCGAC AAGGTCATGC 1050 AGGGTACGCT ACAGTACTCA CCACCCGGCA ACCCATGCAC TTTCTACGAC 1100 CATTTCTTCG ACTGGGGCCA CAAGGAGGAG ATCGAGCGCC TGGTATCGAC 1150 TCAAGAAACC GCAGGGATCC ACCCGGCGAG CGAGCTGCGT ATCATGGAGG 1200 CTGACAGCGA TCTCTACCTC GCCGAGATCG ACGGAAAGGT CATCACGAAG 1250 GTCGGACCAA GATACGACGT CGAGCACCTC ATCCCGAAGC TTCCAGGTCG 1300 TCGCGCACGT GACGGCTACC GTCTGGGAGA AATTGAGCGG TGGAGAGGCC 1350 ATTAAAGCAG ATTTATTTCC TGCATTTTCA CCTCGACGTA TAACATATAC 1400 ATGTGATGGC AACGAGTTGT ATGCTGTATC TGATCTGAAC TATGTACGCG 1450 ATTGTCCACA AAGTACTACC TCCGTAAATA AAGTGAGGAT ATGGAACATG 1500 CGTTTGCATG CATGGTTTT 1519

【図面の簡単な説明】

【図１】イネのα−アミラーゼｃＤＮＡのクローンの
３′領域のヌクレオチド配列を示す。

【図２】α−アミラーゼ遺伝子特異的プローブの特異性
を実証するサザンブロット分析を示す。（電気泳動図で
あって図面に代る写真である。）

【図３】イネのゲノムの中のα−アミラーゼ遺伝子のサ
ザンブロット分析を示す。（電気泳動図であって図面に
代る写真である。）

【図４】イネの発芽する種子および懸濁培養した細胞の
中のα−アミラーゼｍＲＮＡの蓄積を示す。（Ａ）イネ
のＧＡ₃ 処理した糊粉細胞の中のα−アミラーゼｍＲＮ
Ａの経時的蓄積。（Ｂ）後期成長段階の間のイネの懸濁
培養した細胞の中のα−アミラーゼ遺伝子の相対的ｍＲ
ＮＡレベル。（電気泳動図であって図面に代る写真であ
る。）

【図５】イネのα−アミラーゼ遺伝子の５′特異的ＤＮ
Ａ断片への糊粉タンパク質抽出物の結合を示す。（電気
泳動図であって図面に代る写真である。）

【図６】ＨＳ５０１の特異的ＤＮＡ断片へのＧＡ誘導性
糊粉タンパク質の結合を示す。＋ＧＡおよび−ＧＡ：そ
れぞれ、ＧＡ₃ を使用してあるいは使用しないで吸収の
３日後の脱胚したイネの種子から調製したタンパク質抽
出物。（電気泳動図であって図面に代る写真である。）

【図７】αＡｍｙ８（１．２kb）／ＧＵＳキメラ遺伝子
を含有するバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ベクターｐＡＧ
８の構造を示す。α−アミラーゼ遺伝子αＡｍｙ８の
１．５kbの５′−上流断片を、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−グル
クロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）のコード領域に、ノパリ
ンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）のポリアデニル化シグナ
ルを使用して結合した。このキメラ遺伝子をｐＢＩＮ１
９の左の境界と選択可能なマーカー遺伝子との間に挿入
した。略号：ＲＢおよびＬＢ、それぞれ、Ｔ−ＤＮＡの
右および左の境界；ＮＰＴＩＩ、ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼＩＩ遺伝子；Ｐｎｏｓ、ＮＯＳ遺伝子
のプロモーター。

【図８】トランスジェニックイネ植物の選択および再
生。（Ａ）プレート後３週の、４０μｇ／mlのＧ４１８
を含有する選択的培地（Ｎ６ＲＦ）上の形質転換されて
いない対照カルス；（Ｂ）アグロバクテリウム（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を接種後８週のＧ４１８耐性細
胞からのシュートおよび根の再生；（Ｃ）接種後９週
の、Ｎ６／Ｇ４１８培地上で成長したトランスジェニッ
ク植物；（Ｄ）接種後１６週の、温室内のポットの土の
中で成長したトランスジェニック植物；（Ｅ）接種後１
８週のトランスジェニック植物の分葉枝；（Ｆ）接種後
２４週のトランスジェニック植物の種子の固定。（生物
の形態を表わす図面に代る写真である。）

【図９】トランスジェニックイネ植物の中のＧＵＳ遺伝
子の検出のためのＤＮＡブロット分析。ゲノムＤＮＡを
野生型植物およびトランスジェニック植物の若い葉から
分離した。種々の制限酵素で消化したＤＮＡの５μｇを
各レーンに負荷した。ｐＢＩ２２１の中にＧＵＳ遺伝子
を含有するＳｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片をプローブとして
使用した。レーン１：ＢａｍＨＩで消化したｐＡＧ８；
レーン２〜５：トランスジェニック植物Ｔ１からのＤＮ
Ａ；レーン６〜８：トランスジェニック植物Ｔ２からの
ＤＮＡ；レーン９〜１０：トランスジェニック植物Ｔ３
からのＤＮＡ；レーン１１：トランスジェニック植物Ｔ
４からのＤＮＡ；およびレーン１２：形質転換しない対
照植物からのＤＮＡ。制限酵素の略号：Ｂ，ＢａｍＨ
Ｉ；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；Ｕｎｃ、消化
せず。（電気泳動図であって図面に代る写真である。）

【図１０】トランスジェニックのカルスおよび植物にお
けるＧＵＳおよびＮＰＴＩＩ活性の分析を示す。（Ａ）
トランスジェニックイネにおけるＧＵＳ活性の分析。形
質転換されたおよび形質転換しないイネ植物およびカル
スからのタンパク質抽出物を７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを使用して分離した。ゲルを１ミリモルのメチルウベ
リフェリルグルクロニド（ＭＵＧ）と反応させ、そして
「材料および方法」に記載するように写真撮影した。レ
ーン１：標準の大腸菌β−グルクロニダーゼ；レーン２
〜５：形質転換した植物からのタンパク質抽出物；レー
ン６〜７：形質転換したカルスからのタンパク質抽出
物；レーン８：形質転換しないカルスからのタンパク質
抽出物。２０μｇ／レーンのタンパク質をレーン２〜８
に負荷した。（Ｂ）トランスジェニックイネにおけるネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ活性。形質転
換したまたは形質転換しないイネの植物およびカルスか
らの３０μｇのタンパク質抽出物を、「材料および方
法」に記載するように、〔γ−³²Ｐ〕−ＡＴＰと反応さ
せ、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｐ８１紙上にドット
ブロッテイングし、そしてオートラジオグラフにかけ
た。列Ａ：カナマイシンを伴う反応；列Ｂ：カナマイシ
ンを伴わない反応；レーン１〜３：トランスジェニック
植物からのタンパク質抽出物；レーン５〜６：形質転換
したカルスからのタンパク質抽出物；レーン４および
７：それぞれ、形質転換しない植物およびカルスからの
タンパク質抽出物。（電気泳動図であって図面に代る写
真である。）

【図１１】トランスジェニックイネ植物Ｔ１の種々の組
織におけるαＡｍｙ８（１．２kb）／ＧＵＳ遺伝子の発
現。高さが１００cmの形質転換したまたは形質転換しな
い植物の各器官の薄い切片を「材料および方法」に記載
するようにＸ−ｇｌｕｃで染色した。（Ａ）形質転換し
ない植物からの葉身の断面；（Ｂ）トランスジェニック
植物Ｔ１からの葉身の断面；（Ｃ）（Ｂ）のボックスの
区域の拡大；（Ｄ）形質転換しない植物の分葉枝の１つ
の茎の断面；（Ｅ）トランスジェニック植物Ｔ１からの
１つの分葉枝の茎の断面；（Ｆ）（Ｅ）のボックスの区
域の拡大。略号：ｐｈ、師部；ｍｘ、後生木部管状要
素；ｓｃ、厚壁組織；ｐａｒ、柔組織。（植物の形態を
表わす図面に代る写真である。）

【図１２】トランスジェニック植物Ｔ１のＲ１種子にお
けるＧＵＳ活性の分析を示す。種子をカナマイシンおよ
び２，４−Ｄを含有するＭＳ培地の中で発芽させてカル
スの形成を誘導する。カルスを「材料および方法」に記
載するようにＧＵＳ組織化学的染色アッセイにかける。
ＮＴ：形質転換しない植物の種子から誘導されたカル
ス；Ｔ：トランスジェニック植物Ｔ１の種子から誘導さ
れたカルス。（生物の形態を表わす図面に代る写真であ
る。）

【図１３】トランスジェニックイネ植物Ｔ１のＲ１子孫
からの４１０bpのＧＵＳ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を示
す。ＤＮＡをトランスジェニック植物Ｔ１のＲ１子孫の
若い葉から分離した。ＰＣＲは「材料および方法」に記
載するように実施した。（Ａ）増幅したＤＮＡを１％の
アガロースゲルの中で電気泳動させ、そして臭化エチジ
ウムにより検出した。（Ｂ）（Ａ）と同一のＤＮＡを遺
伝子スクリーンの膜上にブロッティングし、³²Ｐ標識Ｇ
ＵＳ ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、
そしてオートラジオグラフにかけた。レーン１：形質転
換しない植物（ＮＴ）からのＤＮＡ鋳型を陰性対照とし
て使用した；レーン２プラスミドｐＡＧ８からのＤＮＡ
鋳型；レーン３〜１０：トランスジェニックイネ植物Ｔ
１のＲ１子孫（ｎｏ．１−１〜１−８）からのＤＮＡ鋳
型。（電気泳動図であって図面に代る写真である。）

【図１４】トランスジェニックイネのカルスの中のＧＵ
Ｓの発現を示す。（電気泳動図であって図面に代る写真
である。）

【図１５】トランスジェニックイネ細胞および培地の中
のＧＵＳタンパク質の蓄積を示す。（電気泳動図であっ
て図面に代る写真である。）

【図１６】トランスジェニックイネ植物Ｔ１の種々の組
織におけるαＡｍｙ８（１．２kb）／ＧＵＳ遺伝子の発
現。高さが１００cmの形質転換したまたは形質転換しな
い植物の各器官の薄い切片を「材料および方法」に記載
するようにＸ−ｇｌｕｃで染色した。（Ｇ）トランスジ
ェニック植物Ｔ１からの葉鞘の断面：（Ｈ）トランスジ
ェニック植物Ｔ１からの分葉枝の１つの葉鞘の内側に埋
め込まれた若い葉の断面；（Ｉ）トランスジェニック植
物Ｔ１の根の断面；（Ｊ）トランスジェニック植物Ｔ１
からの切断しない根毛。（生物の形態を表わす図面に代
る写真である。）

【図１７】トランスジェニック植物におけるＧＵＳ Ｄ
ＮＡの検出のためのサザンブロット分析の結果を示す図
である。ゲノムＤＮＡを、推定上のトランスジェニック
植物のカルスから単離した。５μｇのＤＮＡをＨｉｎｄ
III で消化し、そして³²Ｐ−標識ＧＵＳ ＤＮＡプロー
ブとハイブリダイズさせた。イネｃｖ．Ｔａｉｎａｎ
５（Ｃ５１及びＣ５２）、タバコ（Ｔ０１及びＴ０２）
並びにポテト（Ｐ１及びＰ２）の推定上のトランスジェ
ニックセルラインからのＤＮＡ。ＮＴは、非形質転換対
照セルラインのＤＮＡを示す。（電気泳動図であって図
面に代わる写真である。）

【図１８】トランスジェニック植物の懸濁細胞における
ＧＵＳ遺伝子の発現のショ糖抑制を示す図である。トラ
ンスジェニックイネｃｖ．Ｔａｉｎａｎ ５（Ｃ５
１）、タバコ（Ｔ０１）及びポテト（Ｐ１）の懸濁細胞
を、ショ糖含有培地又はショ糖不含有培地中で２日間増
殖させた。懸濁細胞から全ＲＮＡを単離し、ノーサンブ
ロット分析にかけ、そして³²Ｐ−標識ＧＵＳ ＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズさせた。５μｇの全ＲＮＡを各
レーンに負荷した。レーン間のＲＮＡの負荷の同等性が
ｒＲＮＡの臭化エチジウム染色によって示された。（電
気泳動図であって図面に代わる写真である。）

【図１９】トランスジェニック植物の懸濁細胞及び培地
中のＧＵＳの蓄積を示す図である。懸濁細胞はショ糖含
有培地又はショ糖不含有培地で２日間増殖させた。蛋白
質を細胞から抽出し、又は培地から集めた。ＧＵＳをＧ
ＵＳ抗体を用いるウエスタンブロット分析により検出し
た。２０μｇの全細胞蛋白質をレーン１〜６の各レーン
に負荷した。培地からの５μｇの全蛋白質をレーン８〜
１３の各レーンに負荷した。ＮＴは非形質転換対照セル
ラインからの蛋白質を示す。＋及び−は培地中のショ糖
の存在又は不存在を示す。（Ａ）２種類のトランスジェ
ニックイネ（ｃｖ．Ｔａｉｎａｎ ５）セルライン（Ｃ
５１及びＣ５２）からの蛋白質。レーン７（Ｍ）は１μ
ｇの精製大腸菌ＧＵＳを含有する。（Ｂ）２種類のトラ
ンスジェニックタバコセルライン（Ｔ０１及びＴ０２）
からの蛋白質。レーン７（Ｍ）は４００ngの精製大腸菌
ＧＵＳを含有する。（Ｃ）２種類のトランスジェニック
ポテトセルライン（Ｐ１及びＰ２）からの蛋白質。レー
ン７（Ｍ）は４００ngの精製大腸菌ＧＵＳを含有する。
（電気泳動図であって図面に代わる写真である。）

【図２０】ＴＭで処理された懸濁細胞中のαＡＭＹ８／
ＧＵＳ融合蛋白質の分析の結果を示す図である。トラン
スジェニックイネ（Ｃ５１）、タバコ（Ｔ０１）及びポ
テト（Ｐ１）の懸濁細胞を、１０μｇ／mlのＴＭを含有
するショ糖不含有培地中で２４時間増殖させた。対照細
胞は、ＴＭを溶解するのに使用した同量の溶剤を含有す
るショ糖不含有培地中で増殖させた。蛋白質を細胞から
抽出し、又は培地から集めた。（Ａ）ＧＵＳ抗体を用い
てのＧＵＳのウエスタンブロット分析であり、８−１５
％グラジエントゲルを用いた。細胞からの２０μｇの全
蛋白質をレーン１〜６の各レーンに負荷した。培地から
の５μｇの全蛋白質をレーン８〜１３の各レーンに負荷
した。レーン７（Ｍ）は２００ngの精製大腸菌ＧＵＳを
含有した。＋及び−は、培地中のＴＭの存在又は不存在
を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ、タバコ（Ｔ０
１）及びイネ（Ｃ５１）におけるＧＵＳ活性の測定を示
す。（Ａは電気泳動図であって図面に代わる写真であ
る。）

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年６月２０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子産生物をコードする遺伝子を植物
   宿主細胞の中で発現させることによって遺伝子産生物を
   生産する方法であって、 ａ）植物宿主細胞の中で発現可能なベクターを構成し、
   前記ベクターは植物のα−アミラーゼ遺伝子から誘導さ
   れたプロモーター領域、および所望の遺伝子産生物をコ
   ードする遺伝子を含んでなり、 ｂ）適合性の植物宿主細胞を前記ベクターによって形質
   転換し、 ｃ）生ずる形質転換体宿主細胞を培養し、 ｄ）前記培養した形質転換体宿主細胞を糖が消耗された
   または糖不含の条件に暴露して、前記プロモーター領域
   のコントロール下に前記遺伝子の発現を促進し、そして ｅ）発現された遺伝子産生物を回収する、 ことを含んでなる方法。
2. 【請求項２】 前記プロモーター領域がイネ作物のα−
   アミラーゼ遺伝子族に由来するものである、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記プロモーター領域がイネ作物のαＡ
   ｍｙ６，αＡｍｙ７，αＡｍｙ８またはαＡｍｙ１０遺
   伝子に由来するものである、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記プロモーター領域がイネのαＡｍｙ
   ８遺伝子から誘導されたものである、請求項３に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 α−アミラーゼ遺伝子に由来する前記プ
   ロモーター領域が、プロモーターおよびシグナルペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 α−アミラーゼ遺伝子に由来する前記プ
   ロモーター領域がプロモーターおよびシグナルペプチド
   をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項２に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 前記遺伝子産生物を前記形質転換体の宿
   主細胞の培地から回収する、請求項５に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ベクターが、マーカー遺伝子、リポ
   ーター遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、エンハンサーまた
   は調節配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ベクターが抗生物質耐性遺伝子をさ
   らに含む、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記抗生物質がカナマイシンまたはヒ
    グロマイシンである、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ベクターがリポーター遺伝子をさ
    らに含む、請求項８に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記リポーター遺伝子がβ−グルクロ
    ニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である、請求項１１に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 前記適合性の植物宿主細胞の形質転換
    がジャガイモ懸濁培養物との同時培養により増強するこ
    とができる、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 宿主細胞への前記ベクターの転移が、
    エレクトロポレイション、ポリエチレングリコール仲介
    形質転換、粒子衝突、マイクロインジェクション法、超
    音波法、ポリ−Ｌオルニヒン法、リン酸カルシウム法ま
    たはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
    ｍ）仲介形質転換系により実施される、請求項１に記載
    の方法。
15. 【請求項１５】 宿主細胞への前記ベクターの転移がア
    グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介
    形質転換系により実施される、請求項１４に記載の方
    法。
16. 【請求項１６】 前記ベクターが植物に由来するα−ア
    ミラーゼ構造遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方
    法。
17. 【請求項１７】 前記遺伝子産生物をα−アミラーゼと
    一緒に回収するか、またはα−アミラーゼとの融合タン
    パク質として回収する、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記適合性の植物宿主細胞が、イネ、
    オオムギまたはコムギの懸濁培養した細胞である、請求
    項１に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記適合性の植物宿主細胞がイネの懸
    濁培養した細胞である、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記糖が消耗したまたは糖不含の条件
    がショ糖、グルコースまたはフルクトースが欠乏した条
    件である、請求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記遺伝子産生物が、動物、植物また
    は微生物由来のタンパク質である、請求項１に記載の方
    法。
22. 【請求項２２】 遺伝子産生物をコードする遺伝子を植
    物宿主細胞の中で発現させることによって遺伝子産生物
    を生産する方法であって、 ａ）植物宿主細胞の中で発現可能なベクターを構成し、
    前記ベクターは植物のα−アミラーゼ遺伝子に由来する
    プロモーター領域、および所望の遺伝子産生物をコード
    する遺伝子を含んでなり、α−アミラーゼ遺伝子に由来
    する前記プロモーター領域はプロモーターおよびシグナ
    ルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、 ｂ）適合性の植物宿主細胞を前記ベクターで形質転換
    し、 ｃ）生ずる形質転換体の宿主細胞を培地中で培養し、そ
    して ｄ）発現された遺伝子産生物を前記培地から回収する、 ことを含んで成る方法。
23. 【請求項２３】 前記プロモーター領域がイネ作物のα
    −アミラーゼ遺伝子族に由来する、請求項２２に記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 前記プロモーター領域がイネ作物のα
    Ａｍｙ６，αＡｍｙ７，αＡｍｙ８またはαＡｍｙ１０
    遺伝子に由来する、請求項２３の方法。
25. 【請求項２５】 前記プロモーター領域がイネのαＡｍ
    ｙ８遺伝子に由来する、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記ベクターが、マーカー遺伝子、リ
    ポーター遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、エンハンサーま
    たは調節配列をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記ベクターが抗生物質耐性遺伝子を
    さらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記抗生物質がカナマイシンまたはヒ
    グロマイシンである、請求項２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記ベクターがリポーター遺伝子をさ
    らに含む、請求項２６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記リポーター遺伝子がβ−グルクロ
    ニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である、請求項２９に記載の
    方法。
31. 【請求項３１】 前記適合性の植物宿主細胞の形質転換
    をジャガイモ懸濁培養物との同時培養により増強するこ
    とができる、請求項２２に記載の方法。
32. 【請求項３２】 宿主細胞への前記ベクターの転移が、
    エレクトロポレイション、ポリエチレングリコール仲介
    形質転換、粒子衝突、マイクロインジェクション法、超
    音波法、ポリ−Ｌオルニヒン法、リン酸カルシウム法ま
    たはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
    ｍ）仲介形質転換系により実施される、請求項２２に記
    載の方法。
33. 【請求項３３】 宿主細胞への前記ベクターの転移がア
    グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介
    形質転換系により実施される、請求項３２に記載の方
    法。
34. 【請求項３４】 前記ベクターが植物由来のα−アミラ
    ーゼ構造遺伝子を含んでなる、請求項２２に記載の方
    法。
35. 【請求項３５】 前記遺伝子産生物をα−アミラーゼと
    一緒に回収するか、またはα−アミラーゼとの融合タン
    パク質として回収する、請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記適合性の植物宿主細胞が、イネ、
    オオムギまたはコムギの懸濁培養した細胞である、請求
    項２２に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記適合性の植物宿主細胞がイネの懸
    濁培養した細胞である、請求項３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 発現された遺伝子産生物の回収前に、
    前記培養した形質転換体の宿主細胞を糖が消耗されたま
    たは糖不含の条件に暴露して、前記プロモーター領域の
    制御の下に前記遺伝子の発現を促進する、請求項２２に
    記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記糖が消耗されたまたは糖不含の条
    件がショ糖、グルコースまたはフルクトースが欠乏した
    条件である、請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記遺伝子産生物が、動物、植物また
    は微生物由来のタンパク質である、請求項２２に記載の
    方法。