JPH09509565A - 植物におけるタンパク質産生のプロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物系における異種タンパク質の分泌を提供する。特に、本発明は、単子葉植物種子の麦芽化による異種タンパク質の生産を提供する。異種遺伝子は、種子の発芽の間に発現され、そして麦芽から単離される。本発明に関するキメラ遺伝子、ベクターおよび方法もまた開示される。細胞培養技術によるタンパク質生産もまた記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 植物におけるタンパク質産生のプロセス 発明の分野 本発明の分野は、麦芽化(malting)プロセスを用いる発芽植物種子におけるポ リペプチドの産生である。本発明はまた、植物発現ベクター、キメラ遺伝子およ び植物細胞培養方法に関する。 発明の背景 多種の供給源から広範囲のタンパク質をクローン化および産生する可能性は、 組換え技術の出現により可能になった。商業的バイオテクノロジータンパク質の ための発現宿主の選択は、発酵および精製の経済性ならびに組換えタンパク質の 十分な生物学的活性に必要な翻訳後修飾を達成するための宿主の能力に基づく。 これらの幾つかの翻訳後修飾は以下を含む：シグナルペプチドプロセシング、プ ロペプチドプロセシング、タンパク質の折り畳み、ジスルフィド結合の形成、グ リコシル化、γ-カルボキシル化およびβ-ヒドロキシル化。発現宿主の選択に影 響するいくつかの経済的な因子は以下を含む：バイオマス産生速度、設備コスト 、培地組成および費用、タンパク質回収および精製のプロセス、産物収量、およ び混入の可能性。 バイオテクノロジーにおける初期の研究の多くは、Escherichia coliおよびBa cillus subtilisなどの原核生物における組換えタンパク質または「異種」タン パク質の発現に方向づけられた。原核生物におけるこのような研究は、遺伝子操 作の容易さ、バッチ培養における生物の増殖、および大規模発酵の可能性を提供 した。 E.coliは、シグナルペプチドプロセッシング、タンパク質折り畳み、そしてジ スルフィド結合形成を実施し得る。しかし、タンパク質の細胞外分泌、グリコシ ル化、γ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化またはプロペプチドのプロセシン グを行い得ない。B.subtilisも、細胞外分泌が可能である以外は、E.coliと同様 の限界をこうむる。 細菌からの全産生コストはまた、産生物の回収および精製の問題、そして上記 された多くの翻訳後修飾の実施が細菌では不可能であるということのため、高い 。さらにE.coliおよび他の細菌は病原体であり、発熱物質やエンドトキシンなど の混入物質であり、これらは組換え的に産生されたタンパク質から除去されなく てはならない。さらに、精製後の広範囲な化学的および酵素的処置(例えば、タ ンパク質を活性な形態に再び折り畳む(refold)こと)が、生物学的に活性なタン パク質を得るために要求され得る。 タンパク質は、E.coliのような原核生物から分泌されないので、これらの細胞 は、産生物回収のために破壊されなくてはならない。続く細菌性混入物および他 のタンパク質の放出は、産生物の精製をより困難で高価にする。精製は、細菌に おける組換えタンパク質産生の全コストの最大90%にあたるので、組織プラスミ ノーゲンアクチベーター(tPA)のようなタンパク質は、E.coliから産生するため に１グラム当たり数千ドル掛かり得る。 原核生物宿主に関連する多くの欠点のために、バイオテクノロジー産業は、組 換えタンパク質の適切で効率的な発現のために、哺乳動物細胞組織培養、酵母、 菌類、昆虫細胞、およびトランスジェニック動物のような真核生物宿主に注目し た。しかし、これらの宿主は、以下の任意のまたは全ての不利益をこうむる：高 価な発酵、低収量、分泌問題、タンパク質プロセシングにおける不適切な修飾、 高い操作コスト、大量へのスケールアップにおける困難さ、および／または、宿 主細胞を殺すかまたは産生物の精製をより高価にするかのいすれかの混入物。こ れらの理由のため、既存の真核生物宿主は、組換えタンパク質の大量で、低コス トなタンパク質産生を提供し得ない。 治療的なおよび／または機能的な活性のための広範囲な翻訳後修飾を必要とす るこれらの大部分のタンパク質のために、哺乳動物細胞培養はE.coliの最も一般 的な代替物である。哺乳動物細胞は、生物学的に活性なタンパク質を正確な折り 畳みおよびグリコシル化することが可能であるが、グリコシル化の質および程度 は、同じ宿主細胞間の異なる培養条件で変化し得る。さらに哺乳動物培養は、極 度に高い発酵コスト(全産生費用の60〜80%)を有し、高価な培地を必要とし、そ してウイルスおよび他の病原体による潜在的な混入からの安全性の問題を持ち出 す。収量は一般的に低く、例えば細胞タンパク質の0.5〜1.5%の範囲であり、ま たは１リットル当たり最大約300〜400ミリグラムである。 酵母、菌類、昆虫細胞、およびトランスジェニック動物は、現在哺乳動物培養 細胞の代替物として使用される。しかし、酵母は過剰なマンノース残基および一 般的に限定された真核生物プロセシングを有する不適切なグリコシル化がされた タンパク質を産生する。さらに、バキュロウイルス昆虫細胞システムは、グリコ シル化タンパク質を高レベルに産生し得るが、これらは分泌されず、精製を複雑 、および高価にする。菌類は、大量で、低コストな産生の、現在最良のシステム を示すが、これらは多くの標的タンパク質を発現し得ない。トランスジェニック 動物は、遺伝学的に安定な群を開発するための長い誘導時間、高い操作コスト、 および動物ウイルスによる混入をこうむる。 原核生物および真核生物発現システムに存在する生化学的、技術的および経済 的限界は、組換えタンパク質のための新しい発現システムの開発の実質的な興味 を創造した。植物は、農場栽培作物の有利な経済性、塊茎、種子、果実および葉 などの貯蔵器官においてタンパク質を合成する能力、および前述された多くの翻 訳後修飾を実施する植物の能力のため、最も期待できる既存のシステムの代替物 を示す。しかし、既存の植物の発現システムは、低収量をこうむる(全細胞タン パク質の＜1.5%)。 さらに、標的タンパク質の発現は、解放耕地において(根、茎、葉、果実およ び種子中で)生じ、従って、組換えタンパク質が食物連鎖に入ることを防ぐこと を困難にしている。このことは政府の規制機関に対する多くの問題の論点である 。 タンパク質を発現するための植物培養細胞の使用が論じられてきたが、植物遺 伝子発現および分泌の遺伝学および生化学についての知識の不足は、このシステ ムを、商業的に可能なシステムに開発すことを妨げてきた。 関連文献 タンパク質を産生するための植物細胞培養物の使用の可能性は、Zenk、Phytoc hemistry 30:3861-3863(1991)に記載されている。イネアミラーゼ遺伝子の記載 は、Huangら、Proc.Natl.Sci．U.S.A．89:7526-7530(1992)；Huangら、Plant M olecular Biology 14:655-668(1990)；Huangら、Nucleic Acids Rsearch 18:700 7-7014(1990)；Huangら、Gene 11 1:223-228(1992)；Rodriguezら：イネα-アミ ラーゼマルチジーンファミリーの組織構造および発現、Second International R ice Genetics Symposium．Rice Genetics 11:417-429(1990)；Sutliffら、Plant Molecular Biology 16:579-591(1991)に見出され得る。イネアミラーゼ遺伝子 のプロモーター配列は、Huangら、Nucleic Acids Research 18:7007-7014(1990) に記載される。植物タンパク質シグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加 えてVaulcombeら、Mol．Gen．Genet．209:33-40(1987)；Chandlerら、Plant Mol ecular Biology 3:407-418(1984)；Rogersら、J.Biol.Chem．260:3731-3738(198 5)；Rothsteinら、Gene 55:353-356(1987)；Whittierら、Nucleic Acids Resear ch 1 5:251 5-2535(1987)；Wirselら、Molecular Microbiology 3:3-14(1989)； Yuら、Gene 122:247-253(1992)に見出され得る。 植物ホルモン、ジベレリン酸およびシベレリン酸によって誘導される分泌酵素 による植物遺伝子の発現調節の記載は、R.L.JonesおよびJ.MacMillin、ジベレリ ン：Advanced Plant Physiology、Malcolm B．Wilkins編，1984 Pitman Publish ing Limited，London，21-52ページに見出され得る。他の代謝的に調節された遺 伝子を記載する参考文献：Sheen、Plant Cell，2:1027-1038(1990)；Maasら、EM BO J．9:3447-3452(1990)；BenkelおよびHickey、Proc.Natl.Acad.Sci．84:1337 -1339(1987)。 発明の要旨 本発明は、２つの局面を有する。第一の局面において、本発明は麦芽化プロセ スの間の種子による高レベルな組換えタンパク質の産生を記載する。本発明は単 子葉植物種子におけるタンパク質またはポリペプチドの産生方法を含む。単子葉 植物種子は、代表的に、糊粉層および胚盤上皮層に囲まれた内胚乳を含む。胚発 生は内胚乳内で生じる。この方法において、少なくとも以下の組成を有するキメ ラ遺伝子を含む種子が提供される：(i)種子発芽の間に誘導可能な転写調節領域 、(ii)タンパク質をコードする第一異種DNA配列、および(iii)シグナルポリペプ チドをコードする第二DNA配列。第二DNA配列は、転写調節領域および第一DNA配 列 に作動可能に連結される。第二DNA配列にコードされるシグナルポリペプチドは 、タンパク質と翻訳フレームが合っており、そして糊粉層または胚盤上皮層を経 る内胚乳内への、タンパク質の分泌を促進するのに有効である。種子は転写調節 領域の発現、および問題のタンパク質またはポリペプチドの産生を誘導するため の条件下で麦芽化される。 この方法において、例えば、獣医学的使用が意図されるマッシュまたは麦芽化 された種子産物の産生のために、問題のタンパク質の分泌が必要とされなければ 、リーダー配列はキメラ遺伝子構築物から省略され得る。 上記の方法において、種子は穀物植物から獲得され得、この植物はコムギ、イ ネ、カラスムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウモロコシ、アワまたはオオム ギを含むが、限定されない。オオムギおよびイネの種子は好ましい実施態様であ る。 本発明の実施において使用されるキメラ遺伝子の転写調節領域は、例えば、以 下の群の１つから獲得され得る：α-アミラーゼ遺伝子、スクロースシンターゼ 遺伝子およびスクロース6-リン酸シンテターゼ遺伝子。α-アミラーゼ遺伝子の 例は、イネまたは他の単子葉植物の類似体から得られる以下の遺伝子を含む：RA my1A(配列番号２)、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3D、HV18(配列番号１)およびRAmy3E。 本発明の１つの実施態様において、RAmy3D遺伝子またはその類似体が使用される 。 キメラ遺伝子の転写調節領域の発現は、小分子によって特異的に調節され得る 。このような小分子の例は、植物ホルモン、サイトカインおよび代謝物を含む。 例示的な小分子は、アブシジン酸、ジベレリン酸、インドール酢酸、カイネチン 、酪酸、シュウ酸、酢酸、オカダ(okadakic)酸またはアラキドン酸を含むが、限 定されない。１つの実施態様において、転写調節領域はRAMY3D遺伝子またはその 類似体に由来し、小分子はアブシジン酸である。 本方法の麦芽化工程は、タンパク質の産生を刺激するために効果的な量での、 小分子の添加または除去を含む。 キメラ遺伝子の転写調節領域の他の実施態様は、スクロースシンターゼ遺伝子 またはスクロース6-リン酸シンテターゼ遺伝子の調節領域を含む。これらのプロ モーターと共に、有用な調節小分子は、糖(例えば、グルコースまたはスクロー ス)、糖リン酸または他の糖誘導体分子を含む。 本発明の方法によって産生されるタンパク質は、任意の多数の供給源から選択 され得る。タンパク質またはポリペプチドの例示的な群は以下を含むが、限定さ れない：酵素、抗体、成長因子、サイトカイン、ホルモン、または抗原(例えば 、ワクチン)。特定のタンパク質またはポリペプチドは、以下を含むが、限定さ れない：α抗トリプシン、抗トロンビン3、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミ ン、第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー 刺激因子。タンパク質はまた、産業的タンパク質(例えば、キシラナーゼ、オキ シドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、αアミラーゼ、フィター ゼまたはグルコースオキシダーゼ)であり得る。 シグナルペプチド(またはシグナル配列)は多くの供給源から獲得され得る。シ グナル配列の例示的な遺伝子供給源は、α-アミラーゼ遺伝子、スクロースシン ターゼ遺伝子およびスクロース-6リン酸シンテターゼ遺伝子である。αアミラー ゼ遺伝子の例は、イネまたは他の単子葉植物のそれらの類似体から獲得される以 下の遺伝子を含む：RAmy1A(配列番号２)、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3D、HV18(配列 番号１)およびRAmy3E。 本発明の方法はまた、問題のタンパク質またはポリペプチドの単離または部分 的な精製を含み得る。 別の実施態様において、本発明の方法は、種子の内胚乳からの胚の分離を含む 。この実施態様において、胚は、(i)他の種子部分から分離され、および(ii)転 写調節領域の発現およびタンパク質の産生を誘導する条件下で発芽される。麦芽 化プロセスで使用される種子は、遺伝子が同じまたは異なる転写調節領域を有す る場合、１以上のキメラ遺伝子を有し得る。この方法は、(i)第二キメラ遺伝子 の転写調節領域の発現を誘導し、そして(ii)第二キメラ遺伝子のポリペプチドの 産生を誘導する条件下での、胚の分離およびそれらの発芽を含む。転写調節領域 は、例えば、上記されたものから選択され得る。方法はまた、内胚乳から種子の 胚を分離する工程、発現カセットの発現を誘導する植物ホルモンと内胚乳を接触 させる工程、および内胚乳から異種タンパク質を単離する工程を含み得る。 本発明において、上記の方法による発芽される種子、麦芽化される種子および マッシュ産物(mash product)がまた、含まれる。これらの産物は、発現されたタ ンパク質またはポリペプチドの精製が必要とされない獣医学的適用において直接 に使用され得る(例えば、成長ホルモン、ワクチン)。 本発明の別の局面は、上記キメラ遺伝子構築物を含む。さらに、本発明はキメ ラ遺伝子を保有する植物発現ベクター、キメラ遺伝子を有する植物細胞またはこ のようなベクターで形質転換される植物細胞、およびキメラ遺伝子を有するトラ ンスジェニック植物を含む。トランスジェニック植物および植物細胞は、例えば 、以下の群から選択され得る：イネ、コムギ、カラスムギ、ライムギ、トウモロ コシ、サトウモロコシ、アワまたはオオムギ。 本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物によって産生されたトランス ジェニック種子を含む。このようなトランスジェニック種子は、本発明のキメラ 遺伝子を保有する。 本発明の第二の局面において、植物細胞培養システムが、組換えタンパク質産 生のために記載される。培養システムのための細胞は、好ましくは胚盤組織に由 来する。本発明のこの局面において使用される細胞は、トランスジェニックであ り、そしてキメラ遺伝子を含む。キメラ遺伝子は少なくとも以下の要素を含む： (i)種子発芽の間、誘導可能な転写調節領域(この領域によって媒介される発現が 小分子によって特異的に調節される)、および(ii)ポリペプチドをコードする異 種DNA配列(DNA配列は作動可能に転写調節領域またはプロモーターに連結される) 。 キメラ遺伝子は、転写調節領域、発現のためのタンパク質またはポリペプチド 、および調節小分子を含む上記の成分を用いて構築され得る。 本発明は、キメラ遺伝子を保有する植物発現ベクター、キメラ遺伝子を有する 植物細胞またはこのようなベクターで形質転換される植物細胞、およびキメラ遺 伝子を有するトランスジェニック植物を含む。トランスジェニック植物および植 物細胞は、例えば以下の群から選択され得る：イネ、コムギ、カラスムギ、ライ ムギ、トウモロコシ、サトウモロコシ、アワ、およびオオムギ。 １つの実施態様において、本発明の第二の局面は、植物組織培養細胞における ポリペプチドの発現調節のための方法を含む。この方法において、細胞はまさに 記載されるトランスジェニック細胞であり、代表的には胚盤上皮由来である。こ れらの細胞(キメラ遺伝子を有する)は、植物細胞の増殖を促進する条件下で培養 される。転写調節領域の発現は、植物細胞培養に調製小分子を添加または除去す ることによって調節される。 本発明のこの局面において用いられる細胞は、例えば、コムギ、イネ、カラス ムギ、ライムギ、トウモロコシ、ソルガム、アワ、またはオオムギに由来する単 子葉植物細胞である。 発現の調整は、阻害または誘導により行われ得る。１つの実施態様では、調整 は発現の阻害であり、そして小分子は糖または糖リン酸誘導体である。別の局面 では、調整は発現の誘導であり、そして小分子は植物ホルモンてある。選択され た植物ホルモンはまた、発現を阻害するためにも用いられ得る。 方法において、培養工程は、異種タンパク質の産生を刺激するに有効な量での 糖または糖誘導体の添加または除去をさらに包含する。別の実施態様では、調整 は植物組織細胞培養物におけるポリペプチドの発現の増強であり、そしてこの増 強は植物細胞培養物への小分子の添加により行われる。ここで、この小分子は、 特に転写調節領域からの発現を誘導する。このタイプの調整の代表的な実施態様 は、RAMY3D遺伝子、またはその相同体に由来する転写調節領域の使用であり、そ してここで小分子はアブシジン酸である。 本発明のこの局面は、目的とするタンパク質またはポリペプチドの産生および 単離または部分精製を包含する。 本発明はまた、植物細胞においてポリペプチドを産生する以下の方法を包含す る。上記のトランスジェニック植物細胞を、(i)植物細胞成長を促進する条件下 で、かつ(ii)転写調節領域からの発現を阻害する小分子の存在下で、インビトロ 培養する。この小分子は、転写調節領域からの発現を抑制するに有効な濃度で存 在する。次いで、この小分子の濃度を、転写調節領域からの発現を行わせ、そし てポリペプチドを産生させるレベルにまで、培養中で減少させる。本発明のこの 実施態様の実施のための代表的な小分子は、糖または糖リン酸誘導体を包含する 。阻害小分子を除去した後、第２の小分子が、キメラ遺伝子に存在するプロモー ターからの発現を誘導させるために添加され得る。 本発明はまた、(i)配列番号１または配列番号２に記載の核酸配列から本質的 になる単離されたDNA配列；配列番号１または配列番号２から得られる転写調節 領域から本質的になる単離されたDNA配列；および(iii)タンパク質をコードする 異種DNA配列に作動可能に連結されたこれらの単離されたDNA配列の１つを包含す る。このような単離されたDNA配列はまた、シグナルポリペプチドをコードする 第２DNA配列を包含し得る。この第２DNA配列は、転写調節領域および異種DNA配 列に作動可能に連結される。さらに、コードされたシグナルポリペプチドは、異 種DNA配列によりコードされたタンパク質と翻訳枠が一致している。 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明を添 付の図面と合わせて読むことにより、さらに十分に理解される。 図面の簡単な説明 図１Ａは、細胞培養物におけるGUS遺伝子発現のフルカラー写真である。図１ Ｂは、種子におけるGUS遺伝子発現のフルカラー写真である。 図２は、RAmy3Dプロモーターを用いるトランスジェニック種子の生産のための プラスミド構築を示す図である。 図３は、２つのサザンブロットハイブリダイゼーションを示す。左のパネル（ GUS）は3DG細胞から単離され、そしてGUS遺伝子プローブでプローブされたDNAを 示し、そして右のパネルはイネα-アミラーゼ遺伝子（AMY）由来のプローブでプ ローブされている。 図４は、GUS検出蛍光アッセイの結果を提供する。 図５は、スクロースを含有しない細胞からのGUSを検出する蛍光アッセイの結 果を提供する。 図６Ａは、３つの異なるα-アミラーゼプロモーターについてのG＋C含量の比 較を提供する。図６Ｂは、α-アミラーゼプロモーター間の配列相同性を比較す る表である。 図７のパネルＡは、イネ種子においてGUSを発現させるために用いられる２つ の遺伝子融合物の構築を示す図である。パネルＢおよびＣは、イネ子孫に対する GUS遺伝子の安定な伝達を示すサザンブロットの結果である。 図８のパネルＡおよびＢは、異なるトランスジェニックイネ種子におけるH4お よびE4構築物を用いるGUSの発現のフルオロメトリー測定である。 図９のパネルＡおよびＢは、H4およびE4の両GUS構築物を用いる４つのトラン スジェニックイネ種子系統におけるGUSの発現の４つのフルオロメトリー測定を 示す図である。 図１０のパネルＡおよびＢは、ジベレリン酸の添加によるGUSの誘導を定量し ている、４つのトランスジェニック種子系統におけるGUSの発現の４つのフルオ ロメトリー測定を示すグラフを提供する。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 「細胞培養物」とは、細胞および細胞クラスターであり、それらは、分化細胞 または器官を有さず、成長培地で増殖するプロトプラストおよびカルス組織を指 す。 「有効な量で」とは、測定可能でありかつ再現可能である量で、所望の効果を 生じるに適切である量を指す。 「誘導可能な」とは、細胞ホルモンまたは代謝物の存在または非存在によりオ ンにされるプロモーターを意味する。それは、間接的誘導または直接的誘導を包 含する。 「発芽の間誘導可能な」とは、発芽前は全体的にはサイレントではないが実質 的にサイレントであり、しかし種子における発芽および発達期間中は実質的に（ 25％より大きい）オンにされるプロモーターを指す。発芽の間誘導可能なプロモ ーターの例を以下に示す。 「相同DNA」とは、組換え手段によって植物または植物宿主に導入されるわけ ではないDNAを指す。 「異種DNA」とは、植物細胞中にトランスフェクトされたDNAを指す。代表的に は、異種DNAは、トランスフェクト細胞または形質転換細胞のゲノムDNAに本来由 来しないDNAを指す（例えば、GUS遺伝子配列）。DNA配列はまた、隣接DNA配列に 対して異種であり得る。例えば、プロモーターまたは転写調節領域が天然でない 、 すなわち目的のDNA配列に隣接して天然に存在しない場合、DNA配列は、そのプロ モーターまたは転写調節領域に対して異種である。 「転写調節領域」とは、代表的に、転写の開始に影響を及ぼすおよび／または これを促進する核酸配列、例えはプロモーターを指す。プロモーターは、代表的 にはエンハンサーまたはインデューサー要素のような調節領域を含む。 本発明の文脈において「キメラ遺伝子」は、代表的には、遺伝子産物をコード する非相同DNA配列に作動可能に連結されたプロモーター配列（例えば、ヒト血 清アルブミンをコードするDNA配列に隣接したRAmy3Dプロモーター）を含む。キ メラ遺伝子はまた、さらなる転写調節要素（例えば、転写終結シグナル）ならび に翻訳調節シグナル（例えば、終止コドン）を含み得る。 「作動可能に連結された」とは、異種タンパク質を発現する単位として機能す る、キメラ遺伝子または発現カセットの成分を指す。例えば、異種DNA（タンパ ク質をコードする）に作動可能に連結されたプロモーターは、異種DNAに対応す る機能性mRNAの産生を促進する。 DNA分子によりコードされた「産物」は、例えば、RNA分子およびポリペプチド を包含する。 ２つのヌクレオチド配列は、それらが適度にストリンジェントな条件（すなわ ち、0.1％SSC、室温）下で互いにハイブリダイズする場合、「機能的に相同性で ある」とみなされる。代表的には、２つの相同ヌクレオチド配列は、ALIGNプロ グラム（Dayhoff，M.O.、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE（1972）Vo 1．5，National Biomedical Research Foundation，101〜110頁、およびこの間 の補遺２、１〜10頁）を用いて最適に整列させたとき、約60％以上が同一である 。 ２つのアミノ酸配列は、それらのアミノ酸が上述のALIGNプログラムを用いて 最適に整列させたときに約60％以上が同一である場合に「相同である」とみなさ れる。 代謝物の文脈での「除去」は、洗浄によるような物理的な除去、および細胞に よる代謝物の吸収および代謝による代謝物の涸渇の両方を包含する。 「異種タンパク質を糊粉または胚盤上皮を通って分泌させるに適切なシグナル 配列」とは、タンパク質を単子葉種子の記載した器官を通って細胞から分泌させ る、単子葉植物、双子葉植物、動物、または微生物中の任意の天然に存在するシ グナル配列を指す。一般には、シグナル配列は、細胞からのタンパク質の分泌を 促進するアミノ酸配列である。 「小分子」は、代表的には、約１キロダルトン未満であり、そして生物学的化 合物、有機化合物、または無機化合物（すなわち、シスプラチン）でさえある。 このような小分子の例は、糖、糖リン酸誘導体（リン酸誘導体を包含する）、お よび植物ホルモン（例えば、ジベレリン酸またはアブシジン酸）を包含する。 「特異的に調節可能な」とは、小分子による細胞内の全体的な転写の増強また は低下のような非特異的効果とは逆に、小分子が１つのプロモーターまたはプロ モーター群（例えば、α−アミラーゼ遺伝子ファミリー）からの転写に選択的に 影響を及ぼす能力を指す。 「実質的に単離された」は、いくつかの文脈で用いられるが、これは、代表的 には、非関連成分または夾雑成分を全く含まないタンパク質またはポリペプチド の少なくとも部分的な精製を指す（例えば、ヒトα-1-アンチトリプシンを含有 する試料から取り出された植物タンパク質）。タンパク質またはポリペプチドの 単離または精製のための方法および手順は、当該分野で公知である。 II．麦芽化プロセスを用いる組換えタンパク質の産生 本明細書中に記載の発明は、本質的に２つの別の局面を有する。第１の局面に おいては、本発明は、麦芽化穀物種子における組換えタンパク質の調節発現の発 見に関する。麦芽化は、穀粒（代表的には、オオムギまたはイネ）が制御条件下 および収容施設中で発芽されて、ヒト消費物、動物飼料、およびアルコール飲料 の醸造のために用いられ得る生成物を生成するプロセスである。このプロセスは 、オオムギ種子を55°Ｆ水中に48時間浸漬することにより開始し、次いで麦芽化 箱またはドラム中で穀粒を４日間発芽させる。 この期間の間に、種子のデンプン部、すなわち内胚乳は、マルトースおよび他 の糖に転化される。麦芽製造者は、水、空気、およびいくつかの場合においては 植物ホルモン（例えばジベレリン）を用い、温度を制御し、麦芽化プロセスを最 適化する。麦芽化穀粒は、次いで、120°Ｆと130°Ｆとの間の温度で炉乾燥させ 、 発芽を終結し、そして水分を除去した。この時点で、麦芽化穀粒は貯蔵され得る か、または食品産業、飼料産業、または醸造業に対して販売され得る。麦芽化プ ロセスの製品は、マッシュ製品および種子処方製品(formulated seed product) を包含する。麦芽化プロセスの間、発芽種子もまた製造され得る。 麦芽化プロセスにおいて、デンプンから糖への迅速な転化は、α-アミラーゼ と称されるデンプン分解酵素の発現を生じる遺伝子活性をかなり大きく生じさせ ることにより行われる。発芽のピーク期の間は、α-アミラーゼが種子中の主要 タンパク質であり、デンプン内胚乳を取り巻く細胞の全タンパク質の60％までを 構成する。α-アミラーゼはこれらの細胞から内胚乳に分泌され、そこでデンプ ンを糖に消化する。 発芽期間中のα-アミラーゼの発現および分泌は大変豊富であるので、精製さ れ得、検査試薬として１グラム当たり約0.10ドルで販売され得る。本明細書中に 記載の組成物および方法は、トランスジェニック種子の麦芽化に基づいて、選択 された遺伝子産物（例えば、タンパク質およびポリペプチド）の低コストで高容 量の真核生物生産を可能にする。 本発明のこの局面は、単子葉植物種子におけるタンパク質の産生方法を包含す る。単子葉植物種子は、糊粉および胚盤上皮層により取り巻かれる内胚乳を含有 する。胚は、代表的には、内胚乳内で発芽および発達を開始する。種子は、例え ば、トランスジェニック植物から生産され、この植物は、少なくとも以下の成分 を有するキメラ遺伝子を含む： （i）種子発芽の間誘導可能な転写調節領域。このようないくつかの領域は以 下に詳細に記載する。α-アミラーゼ、スクロースシンターゼ、およびスクロー ス-6-リン酸シンターゼ遺伝子由来のプロモーターを包含する； （ii）目的の遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）をコード する異種の第１DNA配列。代表的なDNAコード配列を以下に記載する；および （iii）シグナル配列をコードする第２DNA配列、ここでこの第２DNA配列は、 転写調節領域および第１DNA配列に作動可能に連結されている。さらに、このシ グナルポリペプチド配列は、(ａ)目的のタンパク質またはポリペプチドと翻訳枠 が一致し、そして(ｂ)糊粉または胚盤上皮層を通る内胚乳へのタンパク質または ポリペプチドの分泌を促進するのに有効である。 これらの種子は、転写調節領域の発現および目的のタンパク質またはポリペプ チドの産生を誘導する条件下で麦芽化される。 本発明のプロセスにおいて用いられる植物（器官、種子、組織、および細胞を 包含する）は、単子葉植物、特にイネ科として知られる分類学的ファミリーのメ ンバーに由来する。このファミリーは、その食用品種が穀物として知られるイネ 科植物ファミリー（grass family）の全てのメンバーを包含する。穀物は、以下 のような広範な種を包含する：例えば、コムギ（Triticum sps.）、イネ（Oryza ,sps.）、オオムギ（Hordeum sps.）、オートムギ（Avena sps.）、ライムギ（S ecale sps.）、トウモロコシ（Zea sps.）、およびキビ（Pennisettum sps.）。 植物細胞または組織は、イネ科のメンバーに由来し、そして種々の標準技術（ 例えば、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、または微粒子ボンバー ドメント）を用いて発現構築物（すなわち、目的の遺伝子が挿入されたプラスミ ドDNA）で形質転換される。１つの実施態様では、発現構築物は、転写調節領域 （プロモーター）を含み、この転写調節配列は、その転写が小分子の存在または 非存在により特異的に調節される。 １つの実施態様では、組換えタンパク質をコードする遺伝子は、代謝調節プロ モーターの制御下に置かれる。代謝調節プロモーターは、mRNA合成または転写が 、糖または糖リン酸誘導体により抑制または誘導されるプロモーターである。代 謝調節プロモーターの例は、いくつかの穀物α-アミラーゼ遺伝子およびスクロ ースシンターゼ遺伝子を転写するプロモーターを包含する。 別の発現構築物は、ホルモン調節プロモーターを用いて、発芽または麦芽化さ れた種子における組換えタンパク質の発現を得る。ホルモン調節プロモーターは 、mRNA合成または転写が、植物ホルモン（例えばジベレリン酸またはアブシジン 酸）のような小分子により抑制または誘導されるプロモーターである。このよう な他の小分子は、インドール酢酸、カイネチン、酪酸、シュウ酸、酢酸、オカダ 酸(okadakic acid)、およびアラキドン酸を包含するが、これらに限定されない 。 ホルモン調節プロモーターの例は、いくつかの穀物α-アミラーゼ遺伝子を転 写するプロモーターを包含する。この出願に関連するプロモーターは、以下を包 含するが、それらに限定されない：イネ（Oryza sativa）α-アミラーゼ遺伝子 の発現を制御するプロモーター、RAmy1A、RAmy3D、およびRAmy3E；オオムギα- アミラーゼ遺伝子プロモーター、HV18；ならびにスクロースシンターゼおよびス クロース-6-リン酸シンターゼ（SPS）プロモーター（イネおよびオオムギ由来） 。 発現構築物は、付加調節DNA配列（すなわち、シグナルペプチド配列および好 ましい翻訳開始コドン）を利用して、標的タンパク質の効率的な翻訳および細胞 外分泌を促進する。組換えタンパク質についての遺伝子をこの列の調節DNA配列 に融合することにより、発芽トランスジェニック種子における組換えタンパク質 の発現は、代謝調節プロモーターまたはホルモン調節プロモーターの転写および 分泌制御下に置かれる。 穀物植物由来の細胞または組織を、単独にまたは発現構築物とともに(すなわ ち、共形質転換)形質転換し得る。このような形質転換細胞から、トランスジェ ニック植物を再生し得る。これらのトランスジェニック植物を生育させ、種子を 生成させ、そして発現構築物によりコードされた組換えタンパク質を、麦芽化さ れたトランスジェニック種子から回収し得る。 異なる穀物α−アミラーゼプロモーターを用いて、トランスジェニック種子に 組換えタンパク質を発現させる原理を図１Ｂに示す。この図では、RAmy1A遺伝子 のジベレリン酸誘導プロモーターを使用して、イネにおいて細菌レポーター遺伝 子であるgusAを発現させた(実施例２)。gusA遺伝子は、この遺伝子を発現する組 織中で青色発色団(blue chromophore)を産生する酵素β−グルクロニダーゼ(GUS )をコードする。この発色団は、組織化学染色法を使用して容易に検出し得る。R Amy1Aプロモーター/GUS融合物を含有するトランスジェニックイネの種子におい て、青色発色団は、発芽６日まで増加する。 本発明のキメラ遺伝子、ベクターおよび方法を使用して、穀物種(例えば、イ ネ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギおよび種々のイネ 科植物)を遺伝子操作して広範囲の組換えタンパク質を発現させ得る。本発明の 技術を十分に確立された生産方法(例えば、穀物栽培、麦芽化、および産物回収) と組み合わせることによって、組換えタンパク質を、生物製薬産業、工業プロセ ッシング産業、動物健康産業および生物治療(bioremediation)産業のために効率 的および経済的に産生し得る。 この発現系が、動物性または植物性病原体由来の遺伝子エレメントの使用を必 要としない事実は、規定合格(regulatory acceptance)を容易にするはずである 。 Ａ．植物発現ベクター 本発明に使用するための発現ベクターは、植物中での作動用に設計されたキメ ラ遺伝子(または発現カセット)を、この発現カセットの上流および下流にコンパ ニオン配列(companion sequence)とともに含む。このコンパニオン配列は、プラ スミドまたはウイルス起源からなり、そしてこのベクターに必要な特性を提供し てこのベクターが細菌由来のDNAを所望の植物宿主へ移動させることを可能にす る。 基本細菌/植物ベクター構築物は、好ましくは、広範囲の宿主の原核生物複製 起点；原核生物選択可能マーカー；およびAgrobacterium形質転換のために、植 物染色体へのAgrobacteriumを介するトランスファー用のT DNA配列を提供する。 異種遺伝子が容易に検出されない場合、構築物はまた、好ましくは、植物細胞が 形質転換されたかどうかを決定するに適した選択可能マーカー遺伝子有する。イ ネ科のメンバーに適切なマーカーの一般的な概説は、WilminkおよびDons、1993 、Plant Mol.Biol.Reptr、11(2)：165-185に見られる。 異種配列の植物ゲノムへの組込みを可能にするに適した配列もまた推奨される 。これらには、トランスポゾン配列など(相同組換え用)、および異種発現カセッ トの植物ゲノムへのランダムな挿入を可能にするTi配列が含まれる。 適切な原核生物選択可能マーカーには、アンピシリンまたはテトラサイクリン のような抗生物質に対する耐性が含まれる。当該分野において公知のように、別 の機能をコードする他のDNA配列もまたベクター中に存在する。 本発明の構築物には、目的のタンパク質を発現させるための発現ベクターが含 まれる。通常、唯一の発現カセットが存在するが、２またはそれ以上でも可能で ある。組換え発現カセットは、異種タンパク質をコードする配列に加えて、少な くとも以下のエレメントを含有する：プロモーター領域、植物5’非翻訳配列、 構造遺伝子が開始コドンを備えているか否かに依存して開始コドン、ならびに転 写 および翻訳終止配列。このカセットの5'末端部および3'末端部に独特な制限酵素 部位により、以前から存在する(pre-existing)ベクターへの容易な挿入が可能に なる。これらのエレメントを以下で詳細に議論する。 １．異種コード配列 異種コード配列は、目的の任意のタンパク質(原核生物性または真核生物性の いずれか、特に、真核生物性)のためであり得る。所望の産物を提供する遺伝子 は、特に、大容量の産物に関連する遺伝子である。従って、特定の目的の産物に は、キモシン、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、サッカライダーゼ(saccharidase) 、デヒドロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、 α−アミラーゼ、オキシドレダクターゼ(例えば、真菌ペルオキシダーゼおよび ラッカーゼ)、キシラナーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、およ びリパーゼのような酵素を含むが、これらに限定されない。さらに詳細には、本 発明を使用して、酵素、例えば、界面活性剤中で使用される酵素、レニン、西洋 ワサビペルオキシダーゼ、他の植物由来のアミラーゼ、土壌改良酵素、および他 のこのような産業用タンパク質を産生し得る。 他の目的のタンパク質は、哺乳動物タンパク質である。このようなタンパク質 には、血液タンパク質(例えば、血清アルブミン、第VII因子、第VIII因子(また は、改変第VIII因子)、第IX因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン因子、プロ テインＣ、フォン・ウィルブラント因子、抗トロンビンIII、およびエリトロポ イエチン)、コロニー刺激因子(例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マク ロファージコロニー刺激因子(M-CSF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激 因子(GM-CSF))、サイトカイン(例えば、インターロイキン)、インテグリン、ア ドレッシン(addressin)、セレクチン、ホーミングレセプター、表面膜タンパク 質(例えば、表面膜タンパク質レセプター)、Ｔ細胞レセプターユニット、免疫グ ロブリン、可溶性主要組織適合性複合体抗原、構造タンパク質(例えば、コラー ゲン、フィブロイン、エラスチン、チューブリン、アクチン、およびミオシン) 、成長因子レセプター、成長因子、成長ホルモン、細胞周期タンパク質、ワクチ ン、フィブリノーゲン、トロンビン、サイトカイン、ヒアルロン酸および抗体が 含まれる。 大抵、産物は、ペプチド産物であるが、細胞によって産生される非ペプチド産 物を改変するために働き得る遺伝子を導入し得る。これらのタンパク質、そのフ ラグメント(通常、少なくとも約30個のアミノ酸からなる)、融合した組み合せ体 、変異体および合成タンパク質(この合成タンパク質は、全体または一部が合成 したものであり得るかどうかにもかかわらず)は、その配列が天然タンパク質に 関連がある限り、産生され得る。 本発明はまた、獣医学的な使用(例えば、ワクチンおよび成長ホルモン）に有 用なポリペプチドを、本発明の麦芽化プロセスにより産生し得るという利点を提 供する。次いで、目的のポリペプチドを含有する麦芽化反応の生成物を、マッシ ュ製品に処方し得、または獣医学的適用に直接有用な種子製品に処方し得る。 ２．シグナル配列 本発明の方法の実施において使用されるキメラ遺伝子には、シグナル分泌配列 もまた含まれる。目的のタンパク質をコードすることに加えて、このキメラ遺伝 子はまた、このタンパク質の適切なプロセッシングおよび翻訳を可能にするシグ ナルペプチドをコードする。このキメラ遺伝子は、代表的には、所望のタンパク 質の膜への結合を生じ得るいかなる配列をも欠く。 代表的には、転写調節領域(すなわち、転写開始領域)は、その産物が発芽の間 に発現および転移する遺伝子に由来する。このような転写調節領域と相同なシグ ナルペプチドを用いることによって、目的のタンパク質の転移を達成する。この 方法において、目的のタンパク質を、それらが発現する細胞から転移し、効率的 に回収し得る。 タンパク質が、このタンパク質を産生する細胞から分泌される必要はないが、 このことは、組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。表１は、コムギ 、オオムギおよびイネ由来の公知のシグナル配列のリストを提供する。代表的に は、これらのシグナル配列は、種子中に発現されるタンパク質の、糊粉または胚 盤上皮層を横切る、種子の内胚乳への分泌を促進する。 当業者は、新たなシグナルペプチドを定まった手順で同定し得る。植物シグナ ルペプチドは、代表的には、３部分構造を有する。この３部分構造は、Ｎ末端部 に正に荷電したアミノ酸、続いての疎水性領域、およびその次の疎水性の低い領 域内にある切断部位を有する。このメカニズムの保存は、穀物α−アミラーゼシ グナルペプチドが、E.coliおよびS.cerevisiaeのような外来宿主において認識お よび切断されるという事実によって示される。 このメカニズムの柔軟性は、シグナルペプチドとして働き得る広範囲のポリペ プチド配列において反映される。従って、配列がシグナルペプチドとして機能す る能力は、アミノ酸配列の形だけの調査(casual inspection)からは明らかであ り得ない。シグナルペプチド切断部位を予想するために設計された方法は、分析 される配列の約75％のみについて正確な部位を同定する(Heijne Gv：タンパク質 標的配列における切断部位モチーフ。J．K．Setlow(編)Genetic Engineering、1 4巻、Plenum Press、New York(1992)を参照)。 配列相同性が、シグナルペプチドにおいて常に存在するわけではないが、親水 性プロットは、これら遺伝子のシグナルペプチドが比較的に疎水性であることを 示す。 ３．プロモーター (a)典型的な転写調節領域 好ましい転写調節領域またはプロモーター領域を、種子発芽の間以外には比較 的にサイレントであるように選択した。例えば、種子細胞における発現レベルは 、この植物の成長の間で他の植物組織における発現レベルの少なくとも約20倍で ある。このタイプの転写調節は、以下を含む種々の方法で達成され得る：(i)種 子発芽の間に単独または実質的に単独で産生されるタンパク質と関連する5'非コ ード領域を使用することによるか、または(ii)このような転写開始領域の調節部 分を異なるRNAポリメラーゼ結合領域と共に使用することによる。 種子発芽の間以外の時には「発現が実質的にない」とは、種子発芽の間を除い て、発現が非常に低いかまたは存在しないことを意図する。すなわち、キメラ遺 伝子によりコードされる、目的のタンパク質の発現は低く、(i)植物の成長に影 響もせず、重要な植物の資源を消費もせず、(ii)植物成長の活力を減少させず、 そして(iii)目的のタンパク質に応じて、植物およびマッシュがその意図した目 的のために使用されることを可能にする。 多くのタンパク質が、通常、種子発芽および種子生長の間に糊粉または胚盤の いずれかを横切って分泌される。ジベレリン酸によって誘導される分泌される植 物酵素のいくつかの例には以下が含まれるが、それらに限定されない：α−アミ ラーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、β−グルカナーゼ、、エステラーゼ 、酸ホスファターゼ(例えば、ｐ−ニトロフェニル、ホスファターゼ、ATPアーゼ 、フィターゼ、ナフトールAS-B1ホスファターゼ、およびGTPアーゼ)、ペントサ ナーゼ(pentosanase)、エンドキシラナーゼ、キシロピラノシダーゼ(xylopyrano sidase)、アラビノフラノシダーゼ(arabinofuranosidase)、グリコシダーゼ、お よびペルオキシダーゼ。 本明細書の教示を考慮して、当業者は、本発明の実施に有用なプロモーター/ シグナル配列組み合せ体を認識し実行し得る。多くの有用な配列が、進化論的に 関連するので、保存配列は、本発明の実施に有用な、新たなプロモーターおよび シグナル配列の同定を容易にする。 標準的な核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、他の単子葉植物のライ ブラリーをプローブし、予め同定されたプロモーターおよびシグナル配列を用い て、これらの単子葉植物において「相同体」を同定し得る。例えば、目的のプロ モーター領域を有する遺伝子を選択し、この遺伝子に特異的にハイブリダイズし 得るプローブを選択し、そして伝統的なクロスハイブリダイゼーション実験を、 種々の溶液のストリンジェンシーの下で行う。この方法は、イネRAmy1Aをプロー ブとして使用して、オオムギにおいて相同なプロモーター(HV18のオオムギプロ モーター(配列番号１))を同定するために使用された。 ポリメラーゼ連鎖反応技術(PCR；Mullis，K.B.、米国特許第4,683,202号、198 7年７月28日発行；Mullis，K.B.ら、米国特許第4,683,195号、1987年７月28日発 行)を使用しても、既知のプロモーターの相同体を同定し得る。例えば、選択さ れたプロモーターまたはシグナル配列の保存領域に結合し得るPCRプライマーを 使用して未知のプロモーターを増幅し得る。イネアミラーゼプロモーター領域に おける保存配列の例を表２に提供する。イネプロモーターの配列は、Huang N.ら 、1990、Nucl.Acids Res．18:7007-7014(1990)に報告されており、そしてAsperg illus oryzae由来のtakaプロモーターは、Wirsel、1989、Molecular Microbiolo gy、3:3-14に報告されている。 イネにおける状況は明白である。イネにおいて、α−アミラーゼアイソザイム は９個の遺伝子のファミリーによってコードされる(表３)。これらは、RAmy1A、 1B、1C、2A、3A、3B、3C、3D、および3Eと呼ばれる。イネα−アミラーゼ(Rise α-Amylase)遺伝子は、他の穀物種におけるα−アミラーゼ遺伝子サブファミリ ーに対してのDNA配列の類似性に基づいて、３つのサブファミリー(RAmy1、RAmy2 、およびRAmy3)に分類される(Huangら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:752 6-7530およびHuang Nら、1990、Plant Molecular Biology、14:655-668を参照) 。イネにおけるα−アミラーゼ遺伝子ファミリーの８つのメンバーが単離および 特徴付けられた。おそらくはRAmy1Cに対応する部分的なcDNA配列は、Yu S-Mら、 1992、Gene．122:247-253に報告されている。α−アミラーゼ遺伝子は、イネの ５つの異なる染色体にマッピングされている。 本発明の実施態様は、RAmy 1A、3D、および3Eのプロモーター／シグナル配列 組み合わせ体を包含し、ここで発現は、発芽の間高レベルである。3Eの5'非コー ド領域は、3Dで保存された領域により特徴付けられ、この領域は、31塩基のGCリ ッチ配列であり、そして２つのCGGC反復を含有する。１コピーのCGGC配列を含有 する保存された11塩基の配列も存在する。 3Dおよび3Eα−アミラーゼ遺伝子は、糖、特にスクロース、グルコース、フル クトース、およびマルトースによる発現の抑制にさらされる。従って、細胞発酵 の間、所望の産物の成熟前発現は、成長培地に糖、特にスクロースを用いること により避けられ得る。従って、スクロースは細胞によって炭素源として使用され 得、そしてスクロースが涸渇した場合、所望のタンパク質の発現が開始される。 用いられ得る他の転写開始調節領域は、糖によって誘導される領域（例えば、 スクロースシンセターゼ遺伝子の調節領域）を包含し得る。 複雑な転写開始領域は、異なる遺伝子のRNAポリメラーゼ結合領域とともに、 ある転写開始領域の調節部分を使用することにより用いられ得る。このようにし て、高レベルの発現を提供する間、発現を調節し得る。 本発明の好ましい実施態様は、発芽の間に調節されるプロモーターを使用する 。例えば、ホルモンであるアブシジン酸(ABA)およびジベレリン酸(GA)は、穀物 種子中のα−アミラーゼ遺伝子発現のコントロールにおいて重要な調節的役割を 果たす。ABAは、穀粒の充実(grain filling)の間に合成されるが、α−アミラー ゼおよび他の多くの遺伝子の転写の負の調節因子として作用する。成熟乾燥穀粒 では、ABAのレベルは低下し、従って発芽に必要なα−アミラーゼおよび他の遺 伝子の阻害が軽減される。 明らかに、異種タンパク質の過剰発現のためにアップレギュレーションが所望 され、そしてGA介在プロモーターが所望の実施態様である。穀物の幼植物の発育 中のGA調節の一般のモデルは、胚から糊粉層へのGAの拡散を包含する。次に、GA は、α−アミラーゼのような加水分解酵素の合成を誘導する。イネでは、GAは糊 粉組織のα−アミラーゼ遺伝子の発現を刺激する。 しかし、全てのα−アミラーゼプロモーターがGAによって誘導されるとは限ら す、そして培養に使用されたような未分化細胞に存在する場合、またはインタク トな種子から除去される場合も、全てのα−アミラーゼプロモーターが誘導可能 とは限らない。例えば、イネカルスまたは培養細胞のRAmy3DおよびRAmy3Eは、GA に影響されない。GA処理したイネカルスに、RAmy3DおよびRAmy3Eの発現レベルの 変化はほとんど検出されず、そしてジベレリン生合成のインヒビターであるパク ロブトラゾール(paclobutrazol)で処理したカルスは、未処理カルスと同量のα −アミラーゼタンパク質を産生したという報告がある。 最後に、GA欠損矯化変異体(品種、短銀坊主)の種子由来のカルス培養物は、外 因性GA処理によってあるいはよらずに同じレベルのα−アミラーゼ遺伝子の発現 を生じた。このことは、胚盤および培養細胞におけるRAmy3DおよびRAmy3E遺伝子 の発現は、GAの調節から独立していることを示唆する。 GA独立プロモーターは、GA誘導可能プロモーターに存在する短い配列を失って いるようである。DNA配列比較により、穀物α−アミラーゼプロモーター中の４ つの短い保存配列を同定した。TATAボックス(CTATAAATAG)は、RNAポリメラーゼI Iが転写を開始するために必要な結合部位である。ピリミジンボックス(YCTTTTY) およびボックスI(TATCCAT)は、胚盤および糊粉における遺伝子の発育上の調節(d evelopmental regulation)に関係し得る。 GAREボックス（GA応答エレメント）(TAACRRA)は、α−アミラーゼ遺伝子発現 のGA誘導およびABA抑制に必要である。RAmy1A遺伝子（ゲノムクローンlOSg2）の GAREボックス（GA応答エレメント）は、転写開始部位に対して-143塩基に位置す る。RAmy1A遺伝子（cDNAクローンpOS103）の発現は、外因性GAにより50〜100倍 刺激される。イネRAmy3DおよびRAmy3E遺伝子のプロモーターにGAREボックス配列 が存在しないことは、上で論じたようなこれらの遺伝子のGAから独立した発現と 一致している。 あるいは、発現を誘導する物質は、糖またはリン酸化された糖の代謝産物であ り得る。例えば、RAmy3D遺伝子の発現は、イネ胚組織では、代謝により調節され る。この証拠は、種子を湿らせて幼植物の発育を開始し、そして０〜48時間のイ ンキュベーション後に回収した研究に基づく。これらの種子から切り出した胚は 、RAmy3Dに関して低レベルの発現を有した。この発現パターンは、胚をまず時間 ０で種子から除去し、そして水中で０〜48時間インキュベートした場合には逆転 した。これらの条件下では、RAmy3D発現は、インタクトなイネ種子で観察される レベルの５倍に増加した。 単離した胚に使用したインキュベーション培地への糖の添加は、RAmy3D遺伝子 の正常な発現を回復した（実施例参照）。スクロース、グルコース、フルクトー ス、およびマルトースを包含する多くの糖は、単離された胚においてRAmy3D遺伝 子の発現を抑制し得た(KarrerおよびRodriguez，1992，The Plant Journal,2;51 7-523)。 イネ細胞の懸濁培養物では、α−アミラーゼ酵素活性は、培地からのスクロー ス涸渇後に増加する。この増加は、α−アミラーゼmRNAの蓄積パターンと一致し 、このmRNA蓄積もまた、培養培地が糖を涸渇した後、劇的に増加する。無糖培地 に移した細胞は、４時間以内に上昇したレベルの総α−アミラーゼmRNAを産生し 始める(Yu S-Mら,1991，J Biol.Chem．266:21131-21137(1991)参照)。 ドットブロットハイブリダイゼーションおよび遺伝子特異的プローブの両方を 使用して、糖が培養細胞においてRAmy3DおよびRAmy3Eの両方の発現をコントロー ルすることを立証した。細胞を、１％、３％、６％、または12％スクロース含有 培地で継代培養した。５日間培養した細胞から単離されたRNAは、RAmy3DおよびR Amy3Eの発現が、より高い糖濃度で抑制されることを示した。これら両方の遺伝 子の発現は、１％スクロース中で培養した細胞で、おそらくは、細胞の増殖によ り培地から糖が涸渇した後に誘導された。RAmy1AおよびRAmy3A遺伝子の発現は、 これらの処理に影響されなかった。従って、RAmy3DおよびRAmy3E遺伝子の発現は 、培養培地中の糖の濃度により代謝的に調節される。 この調節が転写のレベルで作用していることを確認するために、RAmy3Dプロモ ーターをGUSレポーター遺伝子に連結した。細胞により産生されるGUS酵素活性の 量が、設計されたRAmy3Dプロモーター発現の簡便な尺度を提供する。RAmy3Dプロ モーター/GUS遺伝子構築物は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する他のプラ スミドと同時にプロトプラストにエレクトロポレートされた。サザンブロットハ イブリダイゼーションは、ハイグロマイシン耐性細胞系列がRAmy3D/GUS遺伝子構 築物を含有することを示した。GUS活性は、上昇したスクロース濃度で増殖した 形質転換細胞株で減少した（実施例参照のこと）。GUS活性は、細胞を無糖培地 に継代後８時間から増加した。これらのデータは、ちょうど内因性RAmy3D遺伝子 がイネ種子内で調節されるように、GUSレポーター遺伝子が細胞培養内でRAmy3D プロモーターにより調節されていることを立証する。 RAmy3DおよびRAmy3E遺伝子のプロモーターは、配列類似性をほとんど有しない が、しかし、それらのプロモーター中に、これらの遺伝子の代謝的調節に関連し 得る２つの保存配列が存在する。RAmy3Dの31塩基からなるGCリッチな配列（表２ ）は、２つのCGGC反復（下線部）を含有する。31塩基配列内のこのタンデム反復 構造は、哺乳動物の転写調節タンパク質であるSp1のDNA結合部位と似ている。 11塩基配列（表２）は、RAmy3DおよびRAmy3Eの両方のプロモーターで保存され ているが、この配列は１コピーのCGGC配列を含有する。CGGC配列のタンデム重複 はまた、Aspergillus oryzaeのタカアミラーゼ遺伝子のプロモーターに見出され る。これらのCGGC配列は、これらの遺伝子の代謝的調節に関連づけられているタ カアミラーゼプロモーターの87塩基領域(-377位〜-290位)に見出される。 (b)プロモーターおよびシグナル配列の一般的な供給源 本開示の手引きの見地から、および数多くの標準的方法を使用して、当業者は 、上述したプロモーターおよびシグナル配列に加えて、本発明での使用に適切な プロモーターおよびシグナル配列を同定し得る。PCRを使用して遺伝子を直接mRN A抽出物から増幅し得るが、最初の工程は一般には、ゲノムライブラリーまたはc DNAライブラリーの作製である。 簡単に述べると、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーは、例えば、Sa mbrookら、Molecular Cloning -A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab oratory，Cold Spring Harbor，New York 1989に記載のように標準的技術に従っ て調製される。ゲノムライブラリーを構築するためには、ゲノムDNAの大きなセ グメントをランダムフラグメント化によって作成し、そしてベクターDNAにつな げて適当なベクターにパッケージされ得るコンカテマーを生成する。この目的に は、通常２種類のベクター（バクテリオファージλベクターおよびコスミド）が 使用される。あるいは、ゲノムライブラリーを商業的供給源(例えば、Clontech 、Palo Alto,，CA)から購入し得る。 本発明では、例えば、α−アミラーゼ分泌mRNA配列が富化されたcDNAライブラ リーを使用して、所望の遺伝子をスクリーニングする。適切に富化されたcDNAの 調製には、α−アミラーゼを過剰発現および分泌する植物器官（例えば、糊粉層 ）の使用が包含される。他の器官は、根、茎、葉、および円錐花序を包含し得 る。簡単に述べると、選択組織由来のmRNAを単離し、そしてcDNAを調製する。短 鎖のオリゴd-TヌクレオチドをmRNAのポリAテイルとハイブリダイズさせ、そして 、相補的DNA(cDNA)鎖を合成する酵素である逆転写酵素のプライマーとして供す る。 cDNAは、サブトラクションハイブリダイゼーション手順に従って、cDNAを標識 し、そしてそれを、所望のmRNAを発現しない組織由来のmRNAとハイブリダイズさ せることにより必要に応じて所望の配列をこの方法を用いて濃縮化し得る。Proc .Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:2194-2198(1984)。 反応しなかったcDNAを単離し、そしてスクリーニングのためのライブラリーを 調製するために使用した。こうすることにより、第１のcDNA鎖を鋳型として用い 第２のDNA鎖が合成される。E.coliで増殖するためのプラスミドまたはλファー ジベクターに挿入するために、２本鎖cDNAにリンカーが付加される。 所望の配列を持つクローンの同定は、発現ベクターが使用される場合、核酸ハ イブリダイゼーション、あるいはコードされるタンパク質の免疫学的検出のいず れかにより行われる。代表的には、目的の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド プローブを使用する。 目的の遺伝子に対応するcDNAの同定後、そのcDNA分子は、目的の遺伝子を含有 するゲノムDNAのプローブとして使用され得る。対応するゲノムクローンが同定 される。このアプローチで単離されたゲノムクローンは、プロモーター、コード 領域、イントロン、およびターミネーターを含む遺伝子配列を含有する。 あるいは、目的の遺伝子に特異的なプローブは、選択された植物由来のゲノム DNAライブラリーを直接プローブするために使用され得る。このプローブに相同 な配列は、ハイブリダイゼーションスクリーニングまたはポリメラーゼ連鎖反応 を包含する標準的な技法により単離され得る。 他のプロモーターおよびシグナル配列を同定するために有用なオリゴヌクレオ チドおよびcDNAプローブはまた、他の種における関連遺伝子の保存領域から調製 され得る。公知のタンパク質のヌクレオチド配列を比較することにより、遺伝子 中の保存配列を単に同定し、そしてこれらの配列をプローブとしてまたはPCRプ ライマーとして用い、他の植物のゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーに おいて相同配列を位置付ける。多くの参考文献で、分泌遺伝子とみなされるヌク レオチド相同性およびアミノ酸の同一性の領域を比較しており、そしてそれらは 以下に提供される。このような保存配列は、ホルモン応答性プロモーターまたは 他の代謝物応答性プロモーターを有する他の遺伝子を単離するために使用され得 る。 プローブは、代表的には、関連しているがしかしこれまで未知の標的配列を同 定するために使用され、配列が実際に関連していることを確証するために緊縮条 件下でハイブリダイズされ得る。代表的には、関連配列を見い出すために適切な 緊縮条件は、-15℃〜-20℃の間の融点(Tm)でハイブリダイゼーションを実施する ことであり得る。 (c)所望のDNA配列のクローニング いったん所望の配列をコードするDNAの位置が定められると、次の組換え操作 を容易にするために十分な量の遺伝子が産生されなければならない。配列をPCR によって直接増幅し得るとはいえ、配列は最も通常には中間の細菌宿主で複製さ れる。最も通常には、Escherichia、Bacillus、およびStreptomyces属の細菌で ある。中間ベクターの増幅のためのクローニングは、最も好ましくはE.coliで行 われる。なぜならこの生物は培養が容易であり、そして原核生物の他の種よりも 完全に理解されているからである。 Sambrook（上述）は、E.coliでクローニングを行うために十分な方法論を包含 している。HB101株は、有用な株であり、これは代表的にはグルコース含有Luria broth(LB)、DifcoのAntibiotic Medium #2、およびグルコースおよび酸加水分解 したカゼインアミノ酸を添加したM9培地で増殖する。抗生物質耐性を有する株は 、Sambrook（上述）に記載の薬剤濃度で維持される。 形質転換は、Morrison,D.A(1977),J．Bacteriol.，132:349-351;またはClark- Curtiss,J.E.およびCurtiss,R.，1983，in Methods in Enzymology，101:347-36 2，Wu,R.，Grossman,L.およびMoldave,K.，編，Academic Press，New Yorkによ り記載される方法によって行われる。代表的なベクターには、商業的供給源から 得られるpBR322およびpUCシリーズを包含される。 ４．転写および翻訳ターミネーター 本発明の発現カセットまたはキメラ遺伝子は、代表的には転写開始調節領域と は反対の末端に転写終了領域を有する。転写終了領域は、通常、転写開始領域、 または異なった遺伝子と連結され得る。転写終了領域は、発現を増強するために 特にmRNAの安定性について選択し得る。例示の転写終了領域は、Agrobacterium のTiプラスミド由来のNOSターミネーターおよびイネα−アミラーゼのターミネ ーターを包含する。 ポリアデニル化テイル(AlberおよびKawasaki，1982，Mol．and Appl．Genet． 1:419-434)はまた、通常、それぞれ高レベルの転写および適切な転写終了を最適 化するために発現カセットに付加される。ポリアデニル化配列は、Agrobacteriu mオクトピンシンセターゼのシグナル(Gielenら，EMBO J．3:835-846,1984)、ま たは同種のノパリンシンターゼのシグナル(Depickerら、Mol．Appl．Genet．1:5 61-573,1982)を包含するが、これに制限されない。 所望の遺伝子産物の最終的な発現は、真核細胞（例えば、イネ科のメンバー） 中であるので、クローン化された遺伝子の任意の部分が宿主のスプライセオソー ム機構により、イントロンとしてプロセッシングされる配列を含むかどうか決定 することが望ましい。そうである場合は、偽イントロンコードとしての遺伝メッ セージ部分の損失を避けるために、「イントロン」領域の部位特異的変異を行い 得る(ReedおよびManiatis，Cell 41:95-105，1985)。 ５．植物細胞の形質転換 （ａ）直接形質転換 本発明のキメラ遺伝子を含むベクターを種々の技術により植物細胞に導入し得 る。これらのベクターは植物細胞内で使用するための選択マーカー（例えば、np tIIカナマイシン耐性遺伝子）を含み得る。このベクターはまた、二次宿主にお ける選択および増殖を可能にする配列、例えば、複製起点および選択マーカーを 含む配列、を含み得る。代表的な二次宿主は細菌および酵母を含む。一つの実施 態様において、二次宿主はEscherichia coliであり、複製起点はcolE1タイプで あり、そして選択マーカーはアンピシリン耐性をコードする遺伝子である。この ような配列は当該分野で周知であり、さらに市販もされている（例えば、Clonte ch，Palo Alto,CA; Stratagene，La Jolla，CA）。 本発明のベクターはまた、改変されて植物形質転換プラスミドを仲介し得る。 このプラスミドは、Agrobacterium tumefaciensベクターに相同な領域、Agrobac terium tumefaciens由来のT-DNA境界領域、およびキメラ遺伝子または発現カセ ット（上記）を含んでいる。さらに、本発明のベクターは、Agrobacterium tume faciensの無害化した植物腫瘍誘導プラスミドを含み得る。 本発明の実施において有用なベクターは、マイクロピペットの使用により植物 細胞に直接マイクロインジェクトされ、組換えDNAを物理的に移入し得る。Cross way、Mol.Gen.Genet、202:179-185、1985。遺伝物質はまた、ポリエチレングリ コールを用いることにより植物細胞に移入され得る(Krensら、Nature,296,72-74 ,1982)。 核酸セグメントを導入する別の方法は、高速弾道貫通(high velocity ballist ic penetration)であり、小ビーズまたは粒子のマトリックス内部または表面に 核酸を伴う小粒子を用いる(Kleinら、Nature，327，70-73，1987およびKnudsen およびMuller，1991，Planta，185:330-336)（トランスジェニックオオムギを作 出するためのオオムギ内胚乳への粒子ボンバードメントを教示している）。 さらに別の導入方法は、プロトプラストと別の実体、ミニ細胞、細胞、ライソ ソームまたは他の融合性の脂質表面体(lipid surfaced body)のいずれかとの融 合であり得る(Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，1859-1863，1982)。 ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞に導入され得る。(F rommら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:5824，1985)。この技術において、植 物のプロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポ レートされる。高い電界強度の電気的衝撃は可逆的に生体膜を透過し、プラスミ ドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは、細胞 壁を再形成し、分裂し、そして植物カルスを形成する。 （ｂ）ベクターによる形質転換 ベクターを植物細胞に導入する一般的なベクター方法は、植物細胞を、先に遺 伝子で形質転換されたAgrobacterium tumefaciensで感染することである。当該 分野で公知の適切な条件下で、形質転換された植物細胞を増殖させ、シュートま たは根を形成させ、そしてさらに植物へと発達させる。 Agrobacteriumは、グラム陰性菌のファミリーであるRhizobiaceaeの代表的な 属である。この種は、クラウンゴールおよび根毛病(hairy root disease)のよう な植物腫瘍を引き起こす。腫瘍の特徴である脱分化した組織において、オパイン として知られているアミノ酸誘導体が産生され、異化代謝される。オパインの発 現を引き起こす細菌遺伝子は、キメラ発現カセットに対する制御エレメントの好 都合なソースである。 本発明のキメラ遺伝子のような異種遺伝子配列は、Agrobacterium tumefacien sのTiプラスミドによって適切な植物細胞に導入され得る。このTiプラスミドはA grobacterium tumefaciensによる感染で植物細胞に伝達され、そして植物ゲノム 中に安定に組み込まれ得る。J.Schnell，Science 237:1176-1183，1987。 Tiプラスミドは形質転換細胞の産生に必須の２つの領域を含む。このうち１つ はトランスファーDNA(transferred DNA:T-DNA)と命名され、植物の核に移入され 腫瘍形成を誘導する。もう一方は毒性領域と呼ばれ、このT-DNAの移入には必須 であるが、それ自身は移入されない。トランスファーDNA領域は、植物ゲノムに 移入され、第３群LEAタンパク質(group 3 LEA protein)をコードする遺伝子の挿 入によりサイズが増大され得るが、その移入される能力は影響を受けない。 改変されたTiプラスミドは、腫瘍を引き起こす遺伝子が欠失されており、本発 明の遺伝子構築物を適切な植物細胞に移入するためのベクターとして用いられ得 る。 組換えTiプラスミドの構築は一般に、pBR322のようなより一般的な細菌ベクタ ーと共に代表的に用いられる方法に従う。さらなる使用は、時には天然のプラス ミドと共に見出され、そして時には外来配列から構築されるアクセサリー遺伝エ レメントから成り得る。これらは「シャトルベクター」(RuvkunおよびAusubel、 1981，Nature 298:85-88)、プロモーター(Lawtonら、1987，Plant Mol.Biol.9:3 15-324)、および選択因子としての抗生物質耐性の構造遺伝子(Fraleyら、Proc.N atl．Acad．Sci．80:4803-4807，1983)を含むがこれに限定されない。 Agrobacteriumのための天然の植物宿主である種は、インビトロで形質転換可 能であり得る。単子葉植物、および特に、穀物およびイネ科植物は、Agrobacter iumに対する天然の宿主ではない。Agrobacteriumを用いてそれらを形質転換しよ うとする試みは最近まで成功していなかった。Hooykas-Van Slogterenら、Natur e 311:763-764，1984。特定の単子葉植物がAgrobacteriumにより形質転換され得 るという証拠が増えてきつつある。現在利用可能となった新規な実験アプローチ を用いて、穀物およびイネ科植物種は今や形質転換され得る。 植物の形質転換に用いられる選択マーカーの発現を行わせるプロモーター（例 えば、nptIII）は、植物宿主内で効果的に作動すべきである。そのようなプロモ ーターの１つは、天然のTiプラスミドに由来するnosプロモーターである（Herre ra-Estrellaら、Nature 303:209-213，1983）。他にはカリフラワーモザイクウ イルスの35Sおよび19Sプロモーター(Odellら、Nature 313:810-812，1985)およ び2'プロモーター(Veltenら、EMBO J．3，2723-2730，1984）が挙げられる。 ６．植物の再生 所望の遺伝子産物の存在および発現を測定した後は、植物体の再生が望まれる 。培養プロトプラストからの植物の再生はEvansら、Handbook of Plant Cell Cu ltures、第１巻：(MacMillan Publishing Co．New York，1983)；およびVasil I .R.編、Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants、Acad．Press，Or lando、第１巻、1984、および第３巻、1986に記載されている。 プロトプラストが単離され、培養されて、再生植物体が得られる全ての植物が 本発明により形質転換され得、その結果、移入された遺伝子を含む植物体が復元 される。事実上全ての植物が培養細胞または組織から再生され得、それらにはサ トウキビ、テンサイ、棉、果樹および他の樹木、マメ科植物および蔬菜、ならび に単子葉植物の全ての主要な種が挙げられるが、それらに限定されない。 いくつかの適切な植物には、例えば、各種のコムギ、イネ、カラスムギ、ライ ムギ、トウモロコシ、ソルガム、キビ、およびオオムギが挙げられる。 再生の手段は植物の種類によって異なるが、一般に異種遺伝子コピーを含有す る形質転換されたプロトプラストの懸濁液を最初に得る。カルス組織が形成され 、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根し得る。 あるいは、プロトプラスト懸濁液から胚形成が誘導され得る。これらの胚は天 然胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は一般に種々のアミノ酸およびホ ルモン（たとえば、オーキシンおよびサイトカイニン）を含む。特に、トウモロ コシおよびアルファルファのような種にはグルタミン酸およびプロリンを培地に 加えると有利である。シュートおよび根は通常同時に発達する。効果的な再生は 培地、遺伝子型、および培養歴に依存する。これらの３つの可変物を制御し得る ならば、再生は十分に再現性および反復性がある。 形質転換された植物細胞から成長した成熟植物は、自家受粉し、分離していな いホモ接合トランスジェニック植物が同定される。近交植物は、本発明のキメラ 遺伝子を含む種子を産生する。これらの種子は麦芽化して目的のタンパク質また はポリペプチドを産生し得る。 本発明による近交物を用いて、所望の特性を組み込んでいるハイブリッドまた は新規な変種を開発し得る。そのような植物は、従来の選択型交配を用いて開発 し得る。 本発明の方法により産生された種子は、種子製品に形成され得る。 Ｂ．アンチセンス適用 上記に示した遺伝子に加えて、内在的に発現されている遺伝子の不活性化を提 供する構築物も有し得る。特に関心があるのは、発芽および幼植物の伸長の間に 発現される遺伝子の不活性化である。これらの遺伝子には１以上のアミラーゼ、 例えば、RAmy3B、RAmy3C、RAmy3R、またはそれらの相同物を含むがそれに限定さ れない。 遺伝子発現の不活性化は多くの方法において達成され得る。最も好都合なのは アンチセンス配列の使用である。このアンチセンス配列は任意の部分のmRNA（非 コード領域およびコード領域を含む）に対して相同であり得る。通常、このアン チセンス配列は少なくとも約30nt、より通常には少なくとも約50ntであり、この アンチセンス配列がそれに対して相同なmRNAの配列と同じかまたはそれより大き い。 １つの実施態様では、アンチセンス配列の３'末端配列を選択してmRNAの安定 性を与え、mRNAを不安定化することが知られている多くの配列は回避され得る。 アンチセンス配列の転写開始領域は構成性または誘導性である。比較的強いプ ロモーター（例えば、35S CMVプロモーター、RUBISCOプロモーター、またはβ− コングリシニンプロモーター）を用い得る。好ましくは、この転写開始領域は、 麦芽化(malting)プロセスの間に誘導されるように、誘導性である。アンチセン ス配列の転写を促進するために、他のプロモーターと関連している種々のエンハ ンサーを用いてアンチセンス配列の転写率を増加させ得る。 麦芽化中に天然に産生される１以上のタンパク質の全ての発現が阻害される必 要はなく、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％の発現の減少で充分 であり、その結果、麦芽化産物中の所望のタンパク質の比率が増大する。使用が 見出されたエンハンサーには35S CMVエンハンサー、およびトウモロコシのアル コールデヒドロゲナーゼ遺伝子のイントロンが挙げられる。 III．麦芽化プロセス 麦芽化プロセスは多工程プロセスである。第１工程は浸漬工程である。浸漬の 間、種子を水に浸すか水を噴霧し、種子中の水分含量を35〜45％に増加させる。 これにより発芽が開始する。浸漬工程は代表的には浸漬タンク内で行われる。こ のタンクは代表的には円錐形の端部が取り付けられており、種子を自由に流出さ せる。浸漬工程を酸素付加するために圧縮空気を添加することは任意である。温 度は、種子に応じて約22℃に制御する。 浸漬工程の後、種子を発芽コンパートメントに移す。種子は湿っているかまた は乾燥した状態で移される。発芽ビンは水で飽和した空気を含み、制御された温 度および気流の下にある。代表的な温度は12〜25℃の間であり、発芽は３〜７日 間続けられる。 異種タンパク質が、糖または植物ホルモンのような代謝物を必要とする誘導性 プロモーターに作動可能に連結している場合、この代謝物は、浸漬水培地に添加 され、除去されるか枯渇し、そして／または発芽の間に用いられる水で飽和させ た空気に添加される。種子はこの水性培地を吸収し、発芽を開始し、異種タンパ ク質を発現させる。次いで、この培地を取り出し、種子を、加湿した温度制御し た曝気環境において維持することにより麦芽化を開始させ得る。このようにして 、種子は発現に先立って成長を開始し得、その結果、発現産物は、プロセスの間 に部分的に分解されるかまたは変性されることが少ない。吸収培地に含まれるほ かの成分は植物ホルモン（例えばジベレリン酸）であり、一般に約2.5〜100μM の量である。 プロモーターが糖によって誘導される場合、浸漬工程または発芽工程において 、グルコースまたはスクロースが吸収培地に添加され得る。糖濃度は培地の約12 重量％までの範囲であり得る。 より詳細には、吸収期または浸漬期の間の温度は、約15〜25℃の範囲に維持さ れるが、発芽期の温度は、通常約20℃である。吸収時間は通常約２〜４日間であ るが、発芽時間は通常さらに２日〜10日であり、より通常には３〜７日である。 通常、麦芽化の時間は約10日間を超えない。麦芽化期間は吸収の間に植物ホルモ ン、特にジベレリン酸を用いることにより減少させ得る。 この方法によって産生される発芽種子を用いて発芽種子製品を製造し得る。 麦芽化により組換えタンパク質の最大生産を達成するために、麦芽化プロセス を、外皮がなく(de-hulled)胚をもたない(de-embryonated)種子を供給するよう に改変する。標準的な手段を用いて外皮および胚を脱穀および除胚する。これら の手段には、ローラー、外皮および内胚乳から完全胚を破壊する他の機械的な手 段が挙げられる。代表的にはスクリーニングを用いて、胚を、所望でない種子の 破片から分離する。単離したトランスジェニック胚をCaCl₂(約10mM)を含む水に 浸漬して発芽させる。 内胚乳由来の糖がない場合、RAmy3Dプロモーター活性が５〜10倍増加し、その 結果異種タンパク質の発現が期待される。あるいは、無胚半種子を、10mMのCaCl₂ および５μmのジベレリン酸の中でインキュベートする場合、RAmy1Aプロモータ ー活性が50倍増加する。 このシステムでは、RAmy1A（HV18または他のホモログ）およびRAmy3Dプロモー ターの制御下にある組換えタンパク質が培地に分泌される。特別の麦芽化ビンま たは浸漬タンクが用いられ得る。胚および無胚半種子を機械的に破壊して細胞と 組織との間に任意の分泌タンパク質を放出させる。混合物を緩衝溶液に懸濁して 可溶性タンパク質を回収する。次いで、従来のタンパク質単離法および精製法を 用いて組換えタンパク質を精製する。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパ ラメーターはルーチンの方法により調整し、異種タンパク質の発現および回収を 最適化する。 選択的工程は発芽種子の炉乾燥(kiln)である。炉乾燥(kilning)は、低温乾燥 手順であり、水分濃度を４〜６％に減少させる。炉乾燥の間の温度は40〜85℃の 間である。代表的には、種子の水分含量が約10〜20％の間になるまで、60℃未満 の低い温度を用いる。最終乾燥は60℃より高い温度である。 次に、炉乾燥した物質（または麦芽化した種子）は、例えば組換えタンパク質 が獣医学的適用（例えば、増加したタンパク質価を含む動物飼料、成長ホルモン 、またはワクチン）に有用な場合、直接用いられ得る。マッシュはマッシュ製品 に処方され得る。 マッシュはまた種子の機械的破壊により処理され、全タンパク質を溶液にする 。次いで、細胞破片を任意の好都合な手段、例えば、沈澱、遠心分離、濾過など により分離し得る。上清または濾過物は、通常、培地中の全タンパク質の１〜40 重量％の、好ましくは少なくとも約30重量％の所望産物を含む。 所望産物が水溶性でない場合、都合の良い溶媒での所望産物の抽出を必要とす るか、または産物の所望の活性を失わずに産物の可溶化および／または抽出を可 能にする別の方法、あるいは再構成(renaturation)を可能にする方法を用いる必 要があり得る。 目的のタンパク質を水性培地から単離した後、次いで、従来の方法に従って産 物を精製し得る。産物は、混合物に存在する全タンパク質の実質的な部分であり 、しばしば任意の個々のタンパク質に最も高い割合で存在するので、精製は非常 に単純化される。さらに、精製後の産物の混入物は産物の多くの適用（治療的適 用を含む）には、生理学的に関わらないようである。 麦芽化を提供することにより、発芽種子内で所望の産物が産生され、麦芽化マ ッシュ中の全タンパク質に対して高い割合の所望のタンパク質を提供し得る条件 下で、種子を発芽させ得る。細胞を破壊し、細胞破片をタンパク質から分離し、 そしてマッシュから上清を単離することにより、タンパク質は容易に単離および 精製され、それは培地中の全タンパク質の主要成分である。 タンパク質を産生する他の方法と異なり、この方法は、容易に精製され得るク ルードな形態のタンパク質の高レベルの経済的な生産を提供する。このシステム では、原核生物に関連する、エンドトキシンおよびエキソトキシンの産生の可能 性がない。このシステムは、種子の生存性の著しい損失および産物の損失を伴わ ずに室温条件下の貯蔵を可能にする。このようにして、タンパク質は必要に応じ て産生され得、ここで、このタンパク質のソースは都合よくかつ安全に貯蔵され 得る。 １つの実施態様では、目的のタンパク質を含有する本発明の麦芽化トランスジ ェニック種子は、動物の麦芽化種子飼料として用いられ得る。麦芽化トランスジ ェニック種子は、通常の(すなわち、非トランスジェニック)種子と混合され、動 物飼料中で所望の濃度の目的のタンパク質が得られ得る。 以下は、本発明の麦芽化プロセスによるタンパク質産生の例である。α-1-ア ンチトリプシンのヒト遺伝子を含む種々のイネの変種(すなわち、トランスジェ ニックライス)は、同系交配され、同型接合体株を生産する。これらのトランス ジェニック系列は、野外で栽培され、そして成熟した種子は従来の農作業を用い て収穫される。 トランスジェニック種子は、麦芽製造施設(麦芽製造所)に輸送され、そこで種 子は、48時間水中に浸漬される(浸される(steeped))。次いで、種子は、麦芽製 造ビンに移され、そこで種子を２〜４日間発芽させる。発芽の間、種子床の温度 および湿度は、モニターされ、理想の発芽条件を確実にする。いくつかの場合で は、植物ホルモン、ジベレリン酸のような化学物質が添加され、ジベレリン酸誘 導性プロモーター(例えば、RAmy1A、RAm3C、HV18)の制御下にあるα-1-アンチト リプシン遺伝子の発現を増大し得る。 最適な発芽およびα-1-アンチトリプシン遺伝子の発現が達成された後、種子 はマッシュされ(例えば、穏やかな粉砕により)、組織が破壊され、そしてこれら の種子から籾殻を取り除かれる。この種子マッシュをタンパク質抽出緩衝液に懸 濁する。このような緩衝液は、代表的には、プロテアーゼインヒビター、還元剤 、および緩衝化剤(例えば、「TRIS」またはリン酸ナトリウムまたはリン酸カリ ウ ム)を含む。 マッシュは撹拌またはかき回され、全ての分泌したタンパク質が組織および細 胞から遊離することを確実にする。籾殻のような大きな粒子物質、植物組織、お よび他の残渣は、次いで、濾過または遠心分離により除去される。上清液を回収 し、そしてα-1-アンチトリプシンのタンパク質分解を減少するために冷却する 。 上清液を、ウエットミル(wet-milling)産業で用いる種々の精製スキーム(例え ば、ハイドロクローニングおよびイオン排除クロマトグラフィー)に供され、所 望でないタンパク質を除去し、そしてα-1-アンチトリプシンを濃縮する。ある いは、硫酸アンモニウム沈澱がまた、α-1-アンチトリプシンを濃縮するために 用いられ得る。 アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーが、上清液中の他のタン パク質からα-1-アンチトリプシンを精製するために用いられ得る。種々のクロ マトグラフィーの画分におけるα-1-アンチトリプシンの存在は、標準測光アッ セイを用いて検出され得る。 他の実施態様では、トランスジェニック種子が、麦芽製造施設(麦芽製造所)に 輸送された後、種子は、脱穀されそして脱胚される(すなわち、種子の胚および 内胚乳部分の機械的な分離)。胚および内胚乳は、別々に水中で48時間浸漬する( 浸す)。種子は、上記のとおり処理される。分離した胚は、以下のように処理さ れる。RAmy3Dプロモーターの発現は、糖の非存在下、および／または植物ホルモ ン、例えば、アブシジン酸のような化学物質の添加により誘導される。 最適な発芽およびα-1-アンチトリプシン遺伝子の発現が達成された後、胚お よび内胚乳部分が混合され、次いで、マッシュされ(例えば、穏やかな粉砕によ り)、種子組織が破壊される。次いで、マッシュを、上記のように、α-1-アンチ トリプシンポリペプチドの精製のために処理する。 IV．細胞培養プロセスを用いる組換えタンパク質の生産 第二の局面では、本発明は、穀物の細胞培養における組換えタンパク質の調節 された発現に関する。本発明の１つの実施態様では、この細胞は穀物植物の胚盤 上皮組織由来である。上記のキメラ遺伝子、ベクター、および方法は、本発明の この局面の実施で実行され得る。この局面では、本発明は、単子葉植物組織細胞 培養におけるポリペプチドの発現を調整することを含む。少なくとも以下の成分 を有するキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物細胞が生産される： （ｉ）種子の出芽の間誘導可能な転写調節領域、ここで、この領域により仲介 される発現は、小分子により特異的に調節され得る。このような領域および小分 子レギュレーターのいくつかの例を、以下に記載する；および （ii）ポリペプチドをコードする異種DNA配列、ここで、このDNA配列は、上記 プロモーターに作動可能に連結されている。キメラ遺伝子はまた、シグナル配列 を含み、異種DNA配列によりコードされたポリペプチドの細胞からの分泌を促進 し得る。 トランスジェニック細胞は、植物細胞の成長を促進する条件下て培養される。 目的のポリペプチドの発現は、少なくとも１つの小分子の植物細胞培養への添加 または除去により調整される。 例えば、組織培養細胞で組換えタンパク質を発現するための異なる穀物α-ア ミラーゼプロモーターが、図１Ａに示される。この図では、糖で抑制されるプロ モーターとして、イネα-アミラーゼ遺伝子であるRAmy3Dが、細菌のレポーター 遺伝子であるgusAをイネで発現するために用いた。gusA遺伝子は、酵素β-グル クロニダーゼ(GUS)をコードし、この遺伝子を発現している組織で青色発色団を 生産する。この発色団は組織化学染色法を用いて容易に検出され得る。この図に 見られるように、gusAの産物は、培養培地が３％糖を含む場合、イネ細胞で抑制 される。 穀物植物由来の細胞または組織は、単独または上記の発現構築物とともに(す なわち、同時形質転換)形質転換され得る。一旦、植物ゲノムに組み込まれると 、組換えタンパク質は、培養トランスジェニック細胞の培地から回収および精製 され得る。 本発明のベクターは、細胞培養中で異種タンパク質の発現および／または分泌 を促進するために用いられ得る。植物細胞は、懸濁培養に置かれ、そして維持さ れ、上記の種々のインデューサーにより誘導され、高レベルの所望の異種タンパ ク質を生産する。次いで、タンパク質は、従来技術を用いて単離される。 精製は、個々のタンパク質について劇的に変化するので、最初の精製プロセス は、代表的には、その宿主由来の天然タンパク質の精製プロセスに従うことを示 すことで十分である。植物懸濁培養の成長培地は、本発明で用いる場合、代表的 には、目的のタンパク質の通常の宿主環境より単純であるので、精製手順は、適 切に、当業者により改変および単純化され得る。 上記の結果から、植物細胞が加工され得、そしてこの細胞が植物を増殖するた めに用いられ得ることは明らかである。植物細胞は改変され、構築物中における コード配列の制御された発現を可能にし主要な産物として発現産物を提供し得る 発現構築物を提供する。 本発明の技術と十分に確立された生産方法(例えば、植物細胞発酵、穀物栽培 、および産物回収)を組み合わせることにより、組換えタンパク質が、生物製薬 産業、工業的加工産業、動物健康産業、およびバイオメディエーション産業に効 果的におよび経済的に生産され得る。 前記の発明は、理解を明確にする目的のために、例証および例示によりいくら か詳細に記載されているが、本発明の教示を考慮すれば、それに対する特定の変 化および改変が、添付の請求項の精神および範囲から逸脱することなく行われる ことは、当業者に容易に明らかであり得る。 以下の実施例は、例示のみとして提供されており限定としてでない。当業者は 、変化または改変され得る本質的に同様の結果を生じる種々の重要でないパラメ ーターを容易に認識する。 実施例 一般的方法 一般に、標準的組換えDNA技術に関する命名および実験室手順は、Sambrookら 、Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor，New York 1989ならびにS.B．GelvinおよびR.A．Schilpero ot,Plant Molecular Biology，1988に見い出され得る。他の一般の参考文献が、 本明細書中に提供される。ここでの手順は当業者に公知であり、そして読者の便 宜に提供される。 実施例１ イネ細胞培養におけるα-アミラーゼプロモーター制御下の β−グルクロニダーゼの発現 Ａ．胚盤カルスおよび懸濁培養物の開始 イネの種子(Oryza sativa L．cv．M202)は、M．Brandon博士(California Rice Experimental Station)により提供された。種子を脱穀し、水で３回洗浄し、70 ％エタノールで20秒間リンスし、次いで、数滴のTween20を含有する１％次亜塩 素酸ナトリウム中で真空下20分間表面殺菌した。殺菌した種子を滅菌蒸留水で３ 回洗浄した。2mg/l 2,4-Dおよび30g/lスクロースを含有するLS培地を含む15cmペ トリ皿に７つの種子を置いた。種子を暗室にて28℃でインキュベートし、そして 胚盤由来下ルスの成長をモニターするために定期的に調査した。胚盤組織および ／または胚由来のカルス形成が、５日後に肉眼で観察された。30〜40日後、直径 約１cmのもろいカルスの塊を失わないように、そして残りの組織を廃棄した。 懸濁培養を開始するために、Thompson JA，Abdullah RおよびCocking EC、イ ネ(Oryza sativa L.)のプロトプラスト培養により記載されるように、アガロー スで固めた培地を用いて(Plant Sci．47:123-133(1986)、もろいカルスを、液体 AA培地の入ったペトリ皿中で穏やかに振とうし、カルスを細胞の小さなクラスタ ーに変えた。次いで、約20〜30塊のカルス由来の細胞クラスターを、125ml Erle nmeyerフラスコに移し、液体を25mlの新鮮なAA培地と置き換えた。フラスコを暗 所にてロータリープラットフォームシェーカー上110rpmで、および28℃でインキ ュベートした。初期培養物を、小さな細胞培養物についてスクリーニングを繰り 返しながら、４〜５日毎に継代培養した。これは、培養物を1000μmおよび500μ mのポアサイズのナイロンフィルターを連続的に通過させることにより達成され た。２カ月の継代培養の後、細かく分割され、迅速に成長する懸濁培養物を得た 。この培養を、その後、３％スクロースを含むAA培地で毎週の継代培養により維 持した。 Ｂ．RAmy3D/GUS融合遺伝子の構築 図２に示されたRAmy3Dプロモーター/GUS融合遺伝子を、３つの工程により構築 した。第一に、プロモーターおよび（Huangら、1990a，Nucleic Acid Res.，.18 :7007-7014に記載の）イネゲノムクローンλOSglA由来のコード領域部分を含有 する1.5kb SallフラグメントをpBluescript KS-にサブクローン化し、プラスミ ドplAS1.5を産生した。876bpのプロモーターおよび66bpの５'非翻訳領域を含むp lAS1.5由来のAlu1フラグメントを「pBLUESCRIPT KS+」のEcoRI部位にサブクロー ン化し、plAluを形成した。 第二に、プロモーターのないGUSカセットを含むプラスミドを、pBl101（Jeffe rson RA，1987，植物におけるキメラ遺伝子のアッセイ：GUS融合遺伝子系。Plan t Mol．Biol．Reporter，5:387-405）由来のHindIII/EcoRI GUSカセットをpUC19 にサブクローン化することにより構築し、pB1201を形成した。GUSコード領域の 上流に存在するpUC19ポリリンカーは、プロモーターフラグメントの挿入に好都 合なクローニング部位を提供する。第三に、RAmy3Dプロモーターフラグメントを プロモーターのないGUSプラスミドに挿入し、プラスミドp3DGを産生した。plAlu 由来のXbal/Alul（HindIII部位中の）プロモーターフラグメントをXbal/Smal消 化したpB1201に結合した。RAmy3D ５'非翻訳領域の最後の11bpを、ポリリンカー 由来の21bpにより置換し、5.83kbのプラスミドp3DGを生じた。 RAmy3DプロモーターとGUS遺伝子の５'末端との間の連結部（junction）をDNA 配列決定により確認した。DNA制限消化、DNAゲル電気泳動、連結反応、形質転換 、プラスミドDNA単離、およびDNA配列決定は、標準的な手順（Sambrookら、Mole cular Cloning - A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York1989）に従った。 Ｃ．プロトプラスト単離およびDNA形質転換 継代培養３日後、60mlのイネ懸濁培養物に10分間、45℃の熱処理を実施し、そ して２つのガラス結晶皿に移した。AA培地を除去し、そして個々の皿中の細胞を 20mlの酵素混合物（Thompsonら、1986，Plant Sci．47:123-133に記載されたCPW 培地中１％ Cellulose RS，１％ Macerozyme R10）と混合した。細胞壁を、45rp mで撹拌しながら、28℃で15時間消化した。 消化後、プロトプラストを、150、50および20μmナイロンフィルターを通して スクリーニングし、10分間、80gで遠心分離することにより３回洗浄し、そして4 0mlのCPW培地中に穏やかに再懸濁した。次いで、懸濁液を500万プロトプラスト/ mlに調整した。 0.5ml容積中の250万プロトプラストを５μgのp3D2 DNA、25μgの仔ウシ胸腺キ ャリアーDNA、および５μgのpGL2プラスミドDNAと混合した。pGL2プラスミドDNA は、CaMV 35Sプロモーター/hph融合遺伝子を有し、この融合遺伝子は、Shimamot o K，Terada R，Izawa T、およびFujimoto H（形質転換プロトプラストから再生 した稔性トランスジェニックイネ植物 Nature 338:274-276(1989)）に記載のハ イグロマイシン耐性をコードする。この混合物をキュベットに移し、10分間、氷 上に置き、次いで「GENE PULSER」エレクトロポレーター(Bio-Rad)(300ボルト/c m、560mFおよび600オーム)を用いてエレクトロポレートした。 さらに約10分間、氷上で保持した後、プロトプラストを0.5mlの４× KPR培地 （Thompsonら、上記1986）および１mlの溶解した2.4％「SEA PLAQUE」低ゲル化 アガロースと混合し、ペトリ皿にプレートし、そして暗所において28℃でインキ ュベートした。 プレーティング10日後、それぞれのペトリ皿のアガロースを４片に分離し、そ して５mlの液体KPR培地を含有する６cmペトリ皿中に移した。４日後、ハイグロ マイシンを、それぞれの皿に50mg/mlの最終濃度まで加えた。ハイグロマイシン 耐性コロニーを選出し、そして液体AA培地中で成長させ、多数の細胞株を形成し た。次いで、各細胞株由来のサンプルを、X-gluを用いて細胞を染色することに より、GUS活性をアッセイした（Jeffersonら、上記 1987）。GUS活性を有する細 胞株を、保存した。均一な細胞株を、GUS発現の選択と組合わせた、さらなる２ 回の単一細胞クラスターの単離により得た。イネゲノムへのp3DG DNAの組み込み を、サザンブロット分析により確認した。 Ｄ．RNA単離およびドットブロットハイブリダイゼーション 全RNAを、フェノール/SDS手順（Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore D D，Seidman JG，Smith JA、およびStruhl K: Current Protocols in Molecular Biology．(1989)）の改変したものを用いて、細胞懸濁培養物から単離した。約 １gの培養イネ細胞を、砂および５mlの液体窒素を用いて全ての液体窒素が蒸発 するまで、細密な粉体に粉砕した。次いで2.5mlのTLE緩衝液（0.2M Tris pH．8. 2，0.1M LiCl，５mM EDTA，20mM メタ重亜硫酸ナトリウム）を添加し、そして粉 砕を、サンプルが完全に液化するまで継続した。 この時点で、0.5mlの10％ SDS、2.5mlのフェノールおよび2.5mlのクロロホル ムを、順次乳鉢に加え、そして粉砕により十分に混合した。サンプルを4000gで1 5分間遠心分離し、水層を取り出し、そしてクロロホルムを用いて抽出した。全R NAを1/3容積の８M LiClの添加により沈澱させ、そして混合物を４℃で一晩放置 した。RNAを16,000gで30分間、４℃で遠心分離することにより回収し、そしてRN Aペレットをジエチルピロカルボネートで処理した二重蒸留水0.5mlに溶解した。 このRNAを、クロロホルムを用いてもう一度抽出し、次いでエタノールで沈澱さ せた。RNA収量は、細胞１グラム（生の重量(fresh weight)）から約500μgであ った。 α-アミラーゼ群特異的な条件下での膜へのα-アミラーゼプローブのプレハイ ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、以下により既に記載され ているとおりであった：Huang N，Koizumi N，Reinl SおよびRodriguez RL（イ ネα-アミラーゼ遺伝子の構造的機構および特異な発現。Nucleic Acids Res．18 : 7007-7014(1990a)およびHuang N，Sutliff TD，Litts JCおよびRodriguez RL: イネα-アミラーゼマルチジーンファミリーの分類および特徴付け。Plant Mol ．Biol．14:655-668(1990b)）。 ４つの異なるイネα-アミラーゼ遺伝子をプローブとして用いた。RAmy1Aプロ ーブ（O'Neill SD，Kumagai MH，Majumdar A，Huang N，Sutliff TD、およびRod riguez RL（Oryza sativaのα-アミラーゼ遺伝子：cDNAクローンおよび種子発芽 の間のmRNA発現の特徴付け。Mol．Gen．Genet．221:235-244（1990）に記載のpO S103由来の1.6kb XbaIフラグメント）は、用いられた厳密な条件下で、密接に関 連する遺伝子RAmy1BおよびRAmy3Cとクロスハイブリダイズした。 RAmy3Dプローブ（pOS137由来（O'Neill，上記）の1.6kb XbaIフラグメント） を遺伝子特異的な条件下で用いた。RAmy3Aプローブ（λOS7D（Sutliff TD，Huan g N，Litts JC、およびRodriguez RL: イネにおけるα-アミラーゼマルチジーン クラスターの特徴付け。Plant Molecular Biology．16:579-591(1991)）由来の3 .5kb EcoRIフラグメント）を高度に厳密な、遺伝子特異的条件下で用いた。RAmy 3Eプローブ（２kb HindIIIフラグメント）は、２つのイントロンエキソンIIおよ びIII、ならびに３'末端(Huang N，Koizumi N，Reinl S、およびRodriguez RL( イネα-アミラーゼ遺伝子の構造的機構および特異な発現。Nucleic Acids Res． 18: 7007-7014(1990a))を含む。 Ｅ．DNA単離およびサザンブロットハイブリダイゼーション 全ゲノムDNAを、Rogers SOおよびBendich AJ（ミリグラム量の新鮮、ハーバリ ウム、およびミイラ化植物組織からのDNAの抽出。Plant Mol．Biol．5:69-76(19 85)）により記載の小規模CTAB手順を用いて単離した。形質転換培養細胞および 非形質転換培養細胞のサザンブロット分析は、Huang N，Sutliff TD，Litts JC およびRodriguez RL（イネα-アミラーゼマルチジーンファミリーの分類および 特徴付け。Plant Mol．Biol．14:655-668(1990b)）に以前記載と同様であった。 使用したDNAプローブは、GUS遺伝子のためのpBI201（Jefferson、上述）のHin dIII/EcoRIフラグメントおよびO'Neill SD，Kumagai MH，Majumdar A，Huang N, Sutliff TDおよびRodriguez RL（Oryza sativaのα-アミラーゼ遺伝子: cDNAク ローンおよび種子発芽中のmRNA発現の特徴付け。Mol．Gen．Genet．221:235-244 (1990)、イネα-アミラーゼ遺伝子RAmy1Aについて）に記載のpOS103であった。 Ｆ．全タンパク質の単離およびβ-グルクロニダーゼ（GUS）活性アッセイ 全水溶性タンパク質を、Jefferson、上述、に記載の手順に基づいて懸濁培養 細胞から単離した。懸濁培養細胞のサンプル200mgを、砂および0.5mlのGUS抽出 緩衝液（Jefferson、上述）の存在下で１分間、乳鉢および乳棒ですりつぶした 。スラリーを1.5mlマイクロ遠心チューブに移し、そして細胞破片を室温で５分 間の遠心分離の後除去した。上澄を水溶性タンパク質の粗抽出物として貯蔵した 。GUS活性を蛍光定量アッセイ手順（Jefferson、上述）により測定した。コント ロールの非形質転換細胞中のGUS活性のバックグラウンドレベルは、ごく僅か であった。 GUS活性を、培養細胞全体において比色定量法（Jefferson、上述）によっても アッセイした。新鮮または凍結培養細胞を、1.5mlチューブ、3.5cmペトリ皿、ま たはマイクロタイタープレートのいずれかの中に入れた。５容量の無菌X-glu溶 液を細胞に添加した。反応物を37℃で30分間以上インキュベートした。 Ｇ．トランスジェニックイネ細胞におけるRAmy1Aプロモーターを使用したGUS の培地中への分泌 懸濁細胞を濾過により除去して、濾過した培地をGUS活性についてアッセイし た。アッセイ方法は上記のとおりである。 Ｈ．結果 １．非形質転換イネ懸濁培養物におけるRAmy3DおよびRAmy3Eの代謝調節 上記の実験は、いずれのイネα-アミラーゼ遺伝子がイネ細胞培養物において 代謝的に調節されているかの決定を可能にする。全RNAを、８日間にわたってサ ンプリングした細胞培養物から単離した。RNAドットブロットを、４つの異なる α-アミラーゼ遺伝子プローブを用いて順次ハイブリダイズした。RAmy1A、RAmy1 B、およびRAmy1C遺伝子についてのmRNAレベルは、低くそして８日間の間有意に 変化しなかった。RAmy3A mRNAのレベルも低く、そして培養周期の間ほとんど変 化を示さなかった。RAmy3DおよびRAmy3E mRNAのレベルは最初低かったが、しか し５日後に顕著に増加し、それぞれ８日目および6.5日目に頂点に達した。これ らの結果は、RAmy3D（グループ２）およびRAmy3E（グループ５）mRNAはイネ細胞 培養物中で豊富に発現されたが、RAmy1A/RAmy1B/RAmy1C（グループ１）、RAmy2A （グループ４）、およびRAmy3A/RAmy3B/RAmy3C（グループ３）の発現は低いか検 出されないかのいずれかであったことを示した以前の研究と一致する。他の研究 者らは、RAmy1AおよびRamy1サブファミリーの別の遺伝子の中程度の発現を見出 しているが、しかしこれは14日齢の細胞培養物においてのみであった。 イネ細胞懸濁培養培地中の糖の濃度は、細胞により産生されるα-アミラーゼ 酵素の量と相関する。この効果を遺伝子レベルで研究するために、懸濁培養物 （通常は３%スクロースを含有する培地中に維持される）を、１%、３%、６%、ま たは12%スクロースを有する培地中に継代培養した。RNAは、継代培養後１日目お よび５日目に回収した細胞から単離した。RNAドットブロットを、α-アミラーゼ 遺伝子プローブを用いてハイブリダイズした。１日後に回収した全ての細胞は、 ほぼ同じレベルのα-アミラーゼ遺伝子発現を有していた。これはおそらくどの 培養物も、培地からスクロースを涸渇させなかったからであろう。 RAmy3DおよびRAmy3E遺伝子のmRNAレベルは、１%スクロース培地を用いた培養 物において５日後に顕著に増加した。このことは糖が培地から涸渇された後の遺 伝子発現の誘導を示す。より高い最初のスクロース濃度を有する培養物は、５日 後になお低いレベルのRAmy3DおよびRAmy3E遺伝子発現を有していた。RAmy1A、RA my1B、RAmy1C、およびRAmy3A遺伝子発現のレベルは、どの培養物においてもほと んど変化しなかった。 培養培地中のスクロース濃度を、α-アミラーゼ遺伝子抑制に対する効果を試 験するために変更した。３%の最初のスクロース濃度を有する培地中での４日間 の培養の後、培養物を分割してスクロース濃度を６%および12%に増加した。培養 物の１つを、洗浄し、そしてスクロースなしの培地（０%）再懸濁した。培養物 をさらに２日間インキュベートし、そしてRNAをスロットブロットハイブリダイ ゼーションによる分析のために単離した。 RAmy1A、RAmy1B、RAmy1C、およびRAmy3A発現レベルは、すべての継代培養物に おいて一様に低かった。RAmy3D遺伝子発現は、スクロースなしの継代培養物の発 現に比較して、６%または12%スクロースを添加した継代培養物において顕著に減 少した。RAmy3E遺伝子発現は、全ての処理において高く維持された。従って、培 養培地へのスクロースの添加後２日の間、RAmy3Dは高度に抑制されたが、RAmy3E 発現は比較的変化しなかった。この結果が、どの程度特異な転写調節および/ま たは特異なmRNA安定性によるかは明確ではない。 ２．RAmy3Dプロモーター/GUSのイネ細胞系統への形質転換 RAmy3Dプロモーター/GUS遺伝子融合体を構築し、これをイネプロトプラストの 形質転換に使用した。プラスミドp3DGは、876 bpのRAmy3D 5'フランキング領域 ＋GUSコード領域に連結した66 bpの5'非翻訳リーダー配列を含んでいた（図２） 。プラスミドp3DGを、イネプロトプラストに、ハイグロマイシン耐性遺伝子を保 有するプラスミドpGL2との同時エレクトロポレーションにより導入した。プロト プラスト由来のコロニーをハイグロマイシン含有培地上で選択し、そしてRAmy3D /GUS構築物との同時形質転換について、各々のコロニーからの少数の細胞をGUS 活性について染色することによって試験した。２サイクルのハイグロマイシン耐 性選択およびGUS活性スクリーニングを、3DG細胞系統を単離するために用いた。 DNAを3DG細胞系統および非形質転換コントロール細胞系統から単離し、BamHI で消化し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションに供した（図３）。ブ ロットをGUS遺伝子でプローブしたときに、3DG細胞系統（レーン２〜５）由来の DNAに対する強いハイブリダイゼーションシグナルが観察された。ハイブリダイ ゼーションは、コントロール細胞系統から単離したDNAでは見られなかった（図 ３のパネルGUS、レーン１）。 GUSパネルにおけるネガティブな結果（レーン１）は、メンブレンにトランス ファーしたDNAの損失によるのではなかった。同等量のDNAが、同じメンブレンを GUSプローブを剥がしてイネα-アミラーゼ遺伝子RAmy1A由来のプローブで再ハイ ブリダイズしたときに、すべてのレーンにおいて検出された（Amyパネル）。こ れらのα-アミラーゼプローブにハイブルダイズしているバンドは、RAmy1A遺伝 子のDNA配列から予想される分子量を有している。 GUSプローブを用いると、3DG細胞系統は、２サイクルの単一細胞クラスター選 択の前（GUSパネル１、レーン２）および後（レーン４）で同じハイブリダイゼ ーションパターンを有していた。このことは、プラスミドDNAが、細胞が増殖す るときに安定的に継承されていることを示す。 ２つのタイプの構造的な証拠が、RAmy3D/GUS DNAが3DG細胞系統の染色体中に 組み込まれていることを示す。第一に、サザンブロット分析は、GUS遺伝子プロ ーブがもっぱらp3DGプラスミドのサイズよりも大きい未消化ゲノムDNAにハイブ リダイズした（GUSパネル、レーン３および５）ことを明らかにした。 第二に、3DG細胞系統由来のDNAのエンドヌクレアーゼBamHIによる消化は、複 数のハイブリダイゼーションバンドを生じた（GUSパネル、レーン２および４） 。 BamHIはRAmy3D/GUS遺伝子構築物内で切断しないので、各々のバンドサイズは、p 3DGプラスミド中の唯一のBamHI部位と隣接する染色体DNA中のBamHI部位との間の 異なるサイズの連結フラグメントを表す。 従って、複数コピーのRAmy3D/GUS遺伝子構築物（および少なくとも１コピーの ハイグロマイシン耐性遺伝子）が、3DG細胞系統のゲノム中に組み込まれていた 。サザンブロットでのハイブリダイゼーションの低分子量のバンドおよび弱いバ ンドは、おそらくイネゲノム中に挿入されたRAmy3D/GUS遺伝子構築物のフラグメ ントを表している。 ３．トランスジェニックイネ細胞系統におけるRAmy3D/GUSの代謝調節 GUSについての遺伝子発現および酵素活性を3DG細胞系統においてアッセイして 、RAmy3D/GUS構築物中のプロモーターフラグメントが、遺伝子の適切な発現およ び代謝調節に必要なシスエレメントを全て含んでいるかどうかを決定した。GUS 遺伝子プローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションは、3DG細胞に おけるGUS遺伝子由来のmRNAレベルが、糖が培養培地から涸渇されたときに増加 したことを示した。 GUS酵素アッセイを用いて、培養培地中のスクロースの種々の濃度に応答したR Amy3D/GUSの発現について試験した。3DG細胞系統を０%、３%、または12%スクロ ースを含有する改変AA培地中に継代培養した。３日後、水溶性タンパク質を抽出 し、そしてGUSについて蛍光発色アッセイによりアッセイした（図４）。スクロ ースなしで培養した細胞中のGUS活性は、３%スクロース中で増殖した細胞の活性 よりも65倍高く、そして12%スクロース中で増殖した細胞の活性よりも130倍高か った。従って、RAmy3Dプロモーターの転写活性は高レベルのスクロースの存在下 では大きく抑制されていたが、糖涸渇の条件下では高度に誘導されていた。 糖涸渇に応答したRAmy3Dプロモーター誘導のタイミングを、3DG細胞をスクロ ースなしの培地中でインキュベートすることによって研究した。GUS活性の増加 は、インキュベーションの最初の８時間はほとんどまたは全くなかった（図５） 。GUS活性は、継代培養後８から32時間後の間に迅速に増加した。RAmy3D/GUS遺 伝子構築物の発現および代謝調節は、内在性RAmy3D遺伝子の発現および代謝調節 に 類似している。 これらの結果は、糖涸渇開始後４時間目からの全α-アミラーゼmRNAの増加を 観察した他の研究者らの結果に類似している。従って、代謝調節を担うシスエレ メントは、RAmy3D/GUS構築物上の942 bpプロモーター領域中に含まれているに違 いない。 GUS遺伝子産物の発現を、組織化学的染色法（Jefferson、上述）を用いて可視 化した。図IAに見られるように、糖の非存在でインキュベートした細胞培養物は 、明らかな相対的に高い青色染色で青色染色を示し、そして３%の糖がGUS遺伝子 産物の発現を抑制し、相対的により少ない青色染色を有することが明らかである 。 ４．プロモーター配列分析 RAmy3DおよびRAmy3Eのプロモーター配列を、これらの遺伝子の代謝調節にさら なる見識を得るために比較した。配列類似性を有する２つの領域が、これらの遺 伝子のプロモーターにおいて既に同定されている。これらの領域の１つは、RAmy 3D遺伝子とRAmy3E遺伝子との間で71%同一である31 bpのGC-リッチ配列からなる 。この配列はRAmy1Aプロモーターにおいて（図6A）または他のいかなるイネα- アミラーゼプロモーターにおいて見出されない。この配列はRAmy3D中の-264位に 見出され（図6B）、ＧおよびＣ残基のみからなるヘキサヌクレオチド配列の３つ のほぼ完全な反復を含む。 RAmy3Eプロモーターは、ヘキサヌクレオチド反復配列の１つの完全なコピーお よび１つの部分的なコピーを含んでいる。31 bp GC-リッチ配列中のGC-リッチヘ キサヌクレオチドの直列重複は、哺乳動物転写因子Sp1の結合部位を連想させる 。 GC-リッチヘキサヌクレオチドの部分を含む11 bpの配列も、RAmy3DおよびRamy 3Eプロモーター中に見出される（図6B）。これらの配列は、イネα-アミラーゼ 遺伝子の代謝調節に関与するシス作用性エレメントを表し得る。GC-リッチプロ モーター配列は、Aspergillus oryzaeの代謝調節されるα-アミラーゼ遺伝子に おいても同定されている。 実施例２RAmy1Aプロモーターを用いた完全なイネ種子の糊粉層を通った異種タンパク質の 分泌 A．プラスミド プラスミドを、標準的な組換えDNA方法を用いて構築した（Ausubelら、1989， Current Protocols in Molecular Biology，NY John Wiley and SonsおよびSamb rookら、上述、1989）。イネのRAmy1A遺伝子を、そのGAへの応答性から（O'Neil ら、1990 Mol．Gen．Genet.，221，235-224）そしてそれが種子発芽の間、最も α-アミラーゼ遺伝子発現が活発であるので（Ｋarrerら、1991，Plant Mol．Bio 1.，16，797-805）選択した。 RAmy1Aプロモーターの２つの領域をgus Aレポーター遺伝子に融合して、プラ スミドpH4/GUS（-748〜+31）およびpE4/GUS（-232〜+31）を生成した。両方のプ ロモーター領域は、今日までに検討された全てのGA-応答性穀物α-アミラーゼ遺 伝子において見出される３つの保存配列（^-214CCTTTT^-209、^-147TAACAAA^-141、 および^-130TATCCAT^-124）（Huangら、1990）を含んでいる。さらなるピリミジン ボックスが、pH4/GUS中に、-312位で存在する。 RAmy1A遺伝子のプロモーターを、イネゲノムDNAクローン（lOSg2）由来の2.3k b DNAフラグメントとして「pBLUESCRIPT M13+KS」にサブクローン化した。この プロモーターのヌクレオチド配列は、Huangら、1990 Nuc．Acids Res．18:7007- 7014に記載されている。これらの構築物の主な特徴は、β-グルクロニダーゼ遺 伝子（gusA）、およびそれと共に、Jefferson，1987 EMBO Journal 6:3901-3907 に報告されるpBI101由来のノパリンシンターゼ遺伝子の転写ターミネーターから なる。 発現カセットを「pBLUESCRIPT」のSmaI部位に挿入して、pBSGUSと命名した。R Amy1A(プロモーター）/gusA遺伝子融合体を、RAmy1Aプロモーターを含む制限フ ラグメントをpBSGUSに挿入することにより構築した。構築物を作製するために使 用した制限フラグメントは、PstI-HindIIIフラグメント（-748〜+31、pH4/GUS） およびPsfI-EcoRIフラグメント（-232〜+31、pE4/GUS）であった。これらの制限 フラグメントを記載するために使用する配置は、RAmy1Aの転写開始点（Huangら 、上述1990）に基づく。 B．イネ形質転換 RAmy1A/GUSプラスミドを、イネプロトプラスト（Oryza sativa L．japonica v arieties、日本晴、キヌヒカリ、およびトリデ１号）中に、以前に記載のように エレクトロポレーションにより（Shimamotoら、1989、形質転換されたプロトプ ラストから再生した稔性トランスジェニックイネ植物、Nature，338:274-276お よびKyozukaおよびShimamoto，1991 イネプロトプラストの形質転換および再生 、Plant tissue Culture Manual(Lindsey，K.編)．Dordrecht:Kluwer Academic Publishers B1:1-16）同時形質転換した。 hph遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を、これらの研究 において選択マーカーとして使用した。ハイグロマイシンＢ耐性カルスを、カル スの一部をX-グルクロニド溶液とインキュベートすることによってGUS活性につ いてスクリーニングした（Jefferson，1987、上述）。GUS陽性カルスをさらに培 養し、そして植物をこれらのカルス培養物から再生させた。 C．サザンブロット分析 GUS陽性R1植物（各々のH4/GUSおよびE4/GUS初代トランスジェニック系統の２ 系統由来）を、サザンブロット分析のために使用した。全ゲノムDNAを、成熟葉 から単離し、制限酵素EcoRIで消化し、そして正に荷電したナイロンメンブレン （Amersham）にトランスファーした。gusA遺伝子のコード領域を、ポリメラーゼ 連鎖反応によりジゴキシゲニン11-dUTPを用いて標識および増幅し、そしてこれ を使用して完全なRAmy1A/gusA遺伝子をプローブした。ハイブリダイゼーション および化学ルミネセンスシグナル検出は、製造者の仕様書（Boeringer Mannheim Biochemica）に従って実施した。 D．GUSアッセイ GUS活性の組織化学的な分析のために、発芽種子をかみそりを用いて手で切断 し、そしてKyozukaら、1991上述およびTeradaら、1993，Plant J．3:2412-252に 以前に記載されたように、X-グルクロニド（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルグ ルクロニド）溶液を用いて染色した。定量的な分析のために、トランスジェニッ クイネ種子由来の粗抽出物を、以前の記載（Kyozukaら、1991; Teradaら、1993 ）のようにGUS活性の蛍光定量アッセイに使用した。 発生研究のために、トランスジェニックR1種子の皮をむき、10%NaOClで10分間 滅菌し、そして蒸留水で洗浄した。種子を水を含むプラスチックウェル中で照明 下30℃で２、４、６、および８日間発芽させた。 GUS活性の定量的な測定のために、発芽種子を胚および内胚乳部分に分割した 。胚の場合、残りの量の内胚乳、根、およびシュートをアッセイの前に除去した 。 RAmy1A/gusAキメラ遺伝子のホルモン調節の分析のために、トランスジェニッ クR1種子を除胚して、無胚種子を縦に３断片にスライスした。各々のスライスを アセテート緩衝液（10 mM酢酸ナトリウムpH5.2）、アセテート緩衝液中の10^-7MG A3、アセテート緩衝液中の10^-7GA₃および10^-5M ABAで暗所において30℃で４日間 処理した。次いで、処理スライスを組織化学的アッセイおよび定量的GUSアッセ イのために用いた。 E．結果 １．トランスジェニックイネ植物のサザンブロット分析 サザンブロット分析は、イネゲノム中のH4/GUSおよびE4/GUS遺伝子融合体の存 在を、gusAのコード領域をプローブとして用いて確認した（図7A）。結果は、H4 /GUSおよびE4/GUSキメラ遺伝子の完全な配列がトランスジェニック植物中に存在 し、そしてgusA遺伝子が安定に子孫に伝達されたことを示した（図7Bおよび7C） 。トランスジーンの完全なコピーに加えて、いくつかの再配列された（rearrang e）コピーも検出された。完全なキメラ遺伝子のコピ一数は、半数体ゲノムあた り１〜３個と見積もった。 ２．トランスジェニックイネ種子におけるGUS活性 H4/GUSおよびE4/GUS遺伝子の相対的な発現レベルを比較するために、発芽した トランスジェニック種子の胚および内胚乳を分離し、そして各々の組織における GUS活性を蛍光定量的に測定した（図８）。内胚乳組織のGUSアッセイは、発芽の ６日目に実施した。これは糊粉層におけるαアミラーゼ発現が最も高くなる時点 である（図９）。 発芽６日目種子の組織化学的検討は、GUS活性が胚の胚盤および内胚乳の糊粉 層に制限されていることを示した。H4/GUS遺伝子で形質転換した４系統の全てに おいて、糊粉層の活性が胚盤の活性より高かった（図8A）。同様に、E4/GUS遺伝 子で形質転換した５系統の内の４系統が、GUS活性が胚盤においてよりも糊粉層 において高いことを示した（図8B）。H4/GUS形質転換系統とE4/GUS形質転換系統 との間の比較は、胚盤および糊粉層におけるGUS活性に有意な差がないことを示 した。 ３．トランスジェニックイネ種子の発芽中のRAmy1A/GUS発現の時間的および空 間的調節 イネ種子発芽中の異種遺伝子の時間的および空間的発現におけるRAmy1Aプロモ ーターの役割を研究するために、トランスジェニック種子において組織化学的ア ッセイおよび定量的GUSアッセイを実施した。H4/GUSキメラ遺伝子の組織化学的 分析は、GUS活性が胚盤上皮中で発芽２日後に検出され得、そしてこの活性が隣 接する糊粉層中に４日目までに広がることを示した。６日目に、糊粉層中のGUS 発現が種子の全部の部分を覆うほど増加した。 組織化学的分析で明らかになったGUS活性のレベルを定量するために、２つのH 4/GUSトランスジェニック系統（T21およびN33）由来の発芽種子のGUS活性を測定 した（図9A）。胚盤GUS活性（白丸）は２日目に出現し、４日目に頂点に達し、 それ以降減少した。 対照的に、糊粉層のGUS活性（黒丸）は、最初に４日目に検出され、６日目に 頂点に達し、そして８日目までに急速に減少した。これらの結果は、RAmy1A/GUS 融合遺伝子が、イネ種子発芽の間、胚盤および糊粉組織において分化的に調節さ れていることを示す。 同様の実験を、E4/GUS遺伝子融合体で形質転換したイネの２系統（K43およびT 62）由来の種子に対して実施した（図1B）。組織化学的アッセイは、発現のパタ ーンがH4/GUS遺伝子について観察されたパターンとほぼ同一であることを明らか にした。発芽種子の胚盤および糊粉層におけるGUS活性の定量的アッセイは、E4/ GUS遺伝子が胚盤中で２日目に発現し、４日目に頂点に達することを示した。糊 粉層中のGUS活性は、最初に４日目に検出され、６日目に頂点に達する（図9B） 。これらの結果は、H4/GUS遺伝子中の-748〜＋31領域およびE4/GUS遺伝子中の-2 32〜+31領域が、種子発芽の間の発現の局在化および発生的調節の点に関して同 じく機能することを示す。 ４．トランスジェニックイネ種子の糊粉層におけるRAmy1A/GUS遺伝子のホルモ ン調節 外因性GAおよびABAが種子中のH4/GUS遺伝子およびE4/GUS遺伝子におよぼす効 果を検討するために、除胚した種子を３つのスライスに切断し、各々のスライス をGAまたはGAおよびABAの組み合わせで処理した。GAを含まない緩衝液で処理し たH4/GUS種子スライスの組織化学的検討は、GUS活性を示さなかった。しかし、G Aで処理した種子スライスは、糊粉層中にGUS活性を示した。観察されたGAによる GUS発現の誘導は、ABAの添加により抑制された。pE4/GUS形質転換種子の糊粉層 中でも同様なGAのGUS誘導が観察された。 トランスジェニック種子中のRAmy1AプロモーターのGA誘導を定量する意図で、 GUS活性をGAおよびGA+ABA処理種子の両方について測定した（図10）。10〜40倍 のGUS活性の増加が、H4/GUS種子（図10A）およびE4/GUS種子（図10B）のGA処理 後に観察された。ABAをGAとともに添加した場合、GUS活性はバックグラウンドの 直ぐ上のレベルにまで抑制された。GA誘導およびABA抑制の程度は、H4/GUSおよ びE4/GUSの両方由来の種子について同様であった。 本発明は特定の方法および実施態様を参考に記載されるが、種々の改変および 変化が本発明から逸脱することなくなされることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単子葉植物種子におけるタンパク質の産生方法であって、該種子が糊粉ま たは胚盤上皮層によって囲まれた内胚乳を含み、 (i)種子発芽の間に誘導可能な転写調節領域、(ii)該タンパク質をコードする 異種の第１のDNA配列、および(iii)シグナルポリペプチドをコードする第２のDN A配列であって、該転写調節領域および該第１のDNA配列に作動可能に連結される 第２のDNA配列を有するキメラ遺伝子を含む種子を麦芽化する工程を包含し、そ してここで、該シグナルポリペプチドは該タンパク質と同じ翻訳フレームにあり 、かつ糊粉または胚盤上皮層を横切る内胚乳中への該タンパク質の分泌を促進す るために有効であり、 ここで、該種子が、該転写調節領域の発現および該タンパク質の産生を誘導す る条件下で麦芽化する、方法。 ２．前記種子が穀物植物由来である、請求項１に記載の方法。 ３．前記穀物種子が、コムギ、イネ、オートムギ、ライムギ、トウモロコシ、 ソルガム、アワおよびオオムギよりなる群から選択される、請求項２に記載の方 法。 ４．前記穀物種子がイネである、請求項１に記載の方法。 ５．前記転写調節領域が、αアミラーゼ遺伝子、スクロースシンターゼ遺伝子 およびスクロース-６-リン酸シンセターゼ遺伝子よりなる遺伝子の群から選択さ れるプロモーター領域を含む、請求項１に記載の方法。 ６．前記転写調節領域がαアミラーゼ遺伝子から得られる、請求項５に記載の 方法。 ７．前記αアミラーゼ遺伝子が、RAmy1A(配列番号２)、RAmy3B、RAmy3C、RAmy 3D、HV18(配列番号１)およびRAmy3Eよりなる群から選択される、請求項６に記載 の方法。 ８．前記プロモーターが、RAMY3D遺伝子またはその相同体由来である、請求項 ６に記載の方法。 ９．前記転写調節領域により仲介される発現が、小分子により特異的に調節可 能である、請求項１に記載の方法。 １０．前記小分子が植物ホルモンまたはサイトカインである、請求項９に記載 の方法。 １１．前記小分子が、アブシジン酸、ジベレリン酸、インドール酢酸、カイネ チン、酪酸、シュウ酸、酢酸、オカダ酸(okadakic acid)およびアラキドン酸よ りなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。 １２．前記転写調節領域が、RAMY3D遺伝子、またはその相同体由来であり、そ して前記小分子がアブシジン酸である、請求項１０に記載の方法。 １３．前記麦芽化工程が、前記タンパク質の産生を刺激するために有効な量の 前記小分子を添加または除去することをさらに包含する、請求項９に記載の方法 。 １４．前記転写調節領域が、スクロースシンターゼ遺伝子またはスクロース- ６-リン酸シンセターゼ遺伝子から得られる、請求項９に記載の方法。 １５．前記小分子が糖または糖リン酸誘導体である、請求項１４に記載の方法 。 １６．前記糖がグルコースまたはスクロースである、請求項１５に記載の方法 。 １７．前記タンパク質が、酵素、抗体、成長因子、サイトカイン、ホルモン、 および抗原よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 １８．前記タンパク質が、αアンチトリプシン、アンチトロンビン３、フィブ リノーゲン、ヒト血清アルブミン、第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子および 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子よりなる群から選択される、請求項１に 記載の方法。 １９．前記タンパク質が工業的タンパク質である、請求項１に記載の方法。 ２０．前記工業的酵素が、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシ ダーゼ、グルカナーゼ、αアミラーゼ、フィターゼおよびグルコースオキシダー ゼよりなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。 ２１．前記シグナルポリペプチドが、αアミラーゼ遺伝子、スクロースシンタ ーゼ遺伝子およびスクロース-６-リン酸シンセターゼよりなる群から選択される 穀物遺伝子由来である、請求項１に記載の方法。 ２２．前記シグナルポリペプチドがαアミラーゼ遺伝子由来である、請求項２ １に記載の方法。 ２３．前記アミラーゼ遺伝子がRAMY1A、RAMY3B、RAMY3C、RAMY3D、HV18または RAMY3Eである、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記麦芽化の後、前記タンパク質が実質的に純粋な形態で単離される、 請求項１に記載の方法。 ２５．前記種子が胚を含み、そして該胚が(i)他の種子部分から分離され、そ して(ii)前記転写調節領域の発現および前記タンパク質の産生を誘導する条件下 で発芽する、請求項１に記載の方法。 ２６．前記種子が、(i)種子発芽の間に誘導可能な転写調節領域、(ii)ポリペ プチドをコードする異種DNA配列であって、前記プロモーターに作動可能に連結 されるDNA配列を有する第２のキメラ遺伝子を含み、そして 前記分離された胚が、(i)該第２のキメラ遺伝子の転写調節領域の発現および( ii)該第２のキメラ遺伝子の該ポリペプチドを産生を誘導する条件下で発芽する 、請求項２５に記載の方法。 ２７．前記第２のキメラ遺伝子の転写調節領域が、αアミラーゼ遺伝子、スク ロースシンターゼ遺伝子およびスクロース-６-リン酸シンセターゼ遺伝子よりな る遺伝子の群から選択される遺伝子から得られる、請求項２６に記載の方法。 ２８．前記種子が胚を含み、そして前記麦芽化工程が、 前記内胚乳から該種子の胚を分離する工程； 該内胚乳を、発現カセットの発現を誘導する植物ホルモンと接触させる工程； および 該内胚乳から異種タンパク質を単離する工程、 を包含する、請求項１に記載の方法。 ２９．請求項１に記載の前記麦芽化種子から生産される、マッシュ製品。 ３０．前記ポリペプチドが獣医学用途に有用である、請求項２９に記載のマッ シュ製品。 ３１．請求項１の麦芽化種子から生産される、麦芽化種子製品。 ３２．前記ポリペプチドが獣医学用途に有用である、請求項３１に記載の麦芽 化種子製品。 ３３．請求項１に記載のように種子を麦芽化することにより生産される、発芽 種子。 ３４．請求項１、５から１０、および１７から２３のいずれかに記載のキメラ 遺伝子。 ３５．請求項３４に記載のキメラ遺伝子を含む、植物発現ベクター。 ３６．請求項３４に記載のキメラ遺伝子を含む、植物細胞。 ３７．前記植物が、イネ、コムギ、オートムギ、ライムギ、トウモロコシ、ソ ルガム、アワ、およびオオムギよりなる群から選択される、請求項３６に記載の 植物細胞。 ３８．請求項３６に記載の植物細胞を含む、トランスジェニック植物。 ３９．請求項３８に記載のトランスジェニック植物を成長させることにより生 産される、種子。 ４０．前記トランスジェニック植物が、イネ、コムギ、オートムギ、ライムギ 、トウモロコシ、ソルガム、アワ、およびオオムギよりなる群から選択される、 請求項３９に記載の種子。 ４１．(i)種子発芽の間に誘導可能な転写調節領域であって、該領域により仲 介される発現が小分子により特異的に調節可能である領域、および(ii)ポリペプ チドをコードする異種DNA配列であって、該DNA配列が該プロモーターに作動可能 に連結されるDNA配列を含む、キメラ遺伝子。 ４２．前記転写調節領域が、αアミラーゼ遺伝子、スクロースシンターゼ遺伝 子およびスクロース-６-リン酸シンセターゼ遺伝子よりなる群から選択されるプ ロモーター領域を含む、請求項４１に記載のキメラ遺伝子。 ４３．前記転写調節領域が、αアミラーゼ遺伝子のプロモーターである、請求 項４２に記載のキメラ遺伝子。 ４４．前記αアミラーゼ遺伝子が、RAmy1A(配列番号２)、RAmy3B、RAmy3D、HV 18(配列番号１)およびRAmy3Eよりなる群から選択される、請求項４３に記載のキ メラ遺伝子。 ４５．前記プロモーターが、RAMY3D遺伝子またはその相同体由来である、請求 項４４に記載のキメラ遺伝子。 ４６．前記DNA配列が、酵素、抗体、成長因子、ホルモン、サイトカイン、お よび抗原よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４１に記 載のキメラ遺伝子。 ４７．前記ポリペプチドが、αアンチトリプシン、アンチトロンビン３、フィ ブリノーゲン、ヒト血清アルブミン、第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子およ び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子よりなる群から選択される、請求項４ １に記載のキメラ遺伝子。 ４８．前記ポリペプチドが工業的タンパク質である、請求項４１に記載のキメ ラ遺伝子。 ４９．前記工業的酵素が、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシ ダーゼ、グルカナーゼ、αアミラーゼ、フィターゼおよびグルコースオキシダー ゼよりなる群から選択される、請求項４８に記載のキメラ遺伝子。 ５０．前記転写調節領域が、スクロースシンターゼまたはスクロース-６-リン 酸シンセターゼ遺伝子のプロモーターである、請求項４１に記載のキメラ遺伝子 。 ５１．前記キメラ遺伝子がさらにシグナル配列をコードし、ここで該シグナル 配列をコードする第２のDNA配列が前記転写調節領域および前記異種DNA配列に作 動可能に連結され、そして該シグナル配列が、(i)該異種DNA配列によりコードさ れるポリペプチドと同じ翻訳フレームにあり、かつ(ii)細胞から該ポリペプチド の分泌を促進するために有効である、請求項４１に記載のキメラ遺伝子。 ５２．前記シグナル配列が、αアミラーゼ遺伝子、スクロースシンターゼ遺伝 子、およびスクロース６リン酸シンセターゼよりなる群から選択される穀物遺伝 子由来である、請求項５１に記載のキメラ遺伝子。 ５３．前記シグナル配列がαアミラーゼ遺伝子由来である、請求項５２に記載 のキメラ遺伝子。 ５４．前記αアミラーゼ遺伝子が、RAmy1A、HV18、RAmy3DおよびRAmy3Eよりな る群から選択される、請求項５３に記載のキメラ遺伝子。 ５５．請求項４１〜５４のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む、植物発現ベ クター。 ５６．請求項４１〜５４のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む、植物細胞。 ５７．前記植物が、イネ、コムギ、オートムギ、ライムギ、トウモロコシ、ソ ルガム、アワ、およびオオムギよりなる群から選択される。請求項５６に記載の 植物細胞。 ５８．請求項５６に記載の植物細胞を含む、トランスジェニック植物。 ５９．前記植物が、イネ、コムギ、オートムギ、ライムギ、トウモロコシ、ソ ルガム、アワ、およびオオムギよりなる群から選択される、請求項５８に記載の トランスジェニック植物。 ６０．植物組織細胞培養物中でポリペプチドの発現を調整する方法であって、 該細胞が単子葉植物由来であり、 請求項５６に記載の植物細胞を、植物細胞成長を促進する条件下で培養する工 程、および 該植物細胞培養物への前記小分子の添加または除去によって前記転写調節領域 により仲介される発現を調整する工程、 を包含する、方法。 ６１．前記細胞が、穀物植物の胚盤上皮由来である、請求項６０に記載の方法 。 ６２．前記穀物が、コムギ、イネ、オートムギ、ライムギ、トウモロコシ、ソ ルガム、アワおよびオオムギを含む群から選択される。請求項６１に記載の方法 。 ６３．前記穀物がイネである、請求項６２に記載の方法。 ６４．前記調整する工程が発現の阻害であり、そして前記小分子が糖または糖 リン酸誘導体である、請求項６０に記載の方法。 ６５．前記糖がグルコースまたはスクロースである、請求項６４に記載の方法 。 ６６．前記調整する工程が発現の誘導であり、そして前記小分子が植物ホルモ ンである、請求項６０に記載の方法。 ６７．前記小分子が、アブシジン酸、ジベレリン酸、インドール酢酸、カイネ チン、酪酸、シュウ酸、酢酸、オカダ酸およびアラキドン酸よりなる群から選択 される、請求項６６に記載の方法。 ６８．前記培養工程が、前記異種タンパク質の産生を刺激するために有効な量 の糖または糖誘導体を添加することまたは除去することをさらに含む、請求項６ ０に記載の方法。 ６９．前記転写調節領域が、スクロースシンターゼまたはスクロース-６-リン 酸シンセターゼ遺伝子のプロモーターである、請求項６８に記載の方法。 ７０．前記調整が植物組織細胞培養物中のポリペプチドの発現の増強であり、 該増強が、該植物細胞培養物への前記小分子の添加により達成され、該小分子が 前記転写調節領域からの発現を特異的に誘導する、請求項６０に記載の方法。 ７１．前記小分子が植物ホルモンまたはサイトカインである、請求項７０に記 載の方法。 ７２．前記転写調節領域が、RAMY3D遺伝子、またはその相同体由来であり、そ して前記小分子がアブシジン酸である、請求項７１に記載の方法。 ７３．植物細胞中でポリペプチドを産生する方法であって、請求項５６に記載 の植物細胞をインビトロで植物細胞成長を促進する条件下で培養する工程、およ び該ポリペプチドの産生を特異的に誘導する小分子を該細胞に供給する工程を包 含する、方法。 ７４．前記産生する工程が、実質的に純粋な形態で前記ポリペプチドを単離す ることを包含する、請求項７３に記載の方法。 ７５．植物細胞においてポリペプチドを産生する方法であって、 請求項５６に記載の植物細胞をインビトロで(i)植物細胞成長を促進する条件 下、および(ii)前記転写調節領域からの発現を阻害する小分子の存在下で培養す る工程であって、該小分子が、該転写調節領域からの発現を抑制するために有効 な濃度で存在する工程、および 該培養物中の該小分子の濃度を、該転写調節領域からの発現を許容し、そして 該ポリペプチドの産生を可能にするレベルまで減少させる工程、 を包含する、方法。 ７６．前記小分子が糖または糖リン酸誘導体である、請求項７５に記載の方法 。 ７７．前記糖がグルコースまたはスクロースである、請求項７６に記載の方法 。 ７８．前記転写調節領域がRAMY3D遺伝子のプロモーターである、請求項７５に 記載の方法。 ７９．前記減少させる工程の後、前記培養がRAMY3Dプロモーターの発現を誘導 する第２の小分子の添加をさらに含む、請求項７８に記載の方法。 ８０．前記第２の小分子がアブシジン酸である、請求項７９に記載の方法。 ８１．配列番号１または配列番号２の核酸配列から本質的になる、単離された DNA配列。 ８２．配列番号１または配列番号２から得られる転写調節領域から本質的にな る、単離されたDNA配列。 ８３．タンパク質をコードする異種DNA配列に、作動可能に連結される、請求 項８２に記載の単離されたDNA配列。 ８４．シグナルポリペプチドをコードする第２のDNA配列をさらに含む請求項 ８３に記載の単離されたDNA配列であって、該第２のDNA配列が前記転写調節領域 および前記異種DNA配列に作動可能に連結され、そして該コードされたシグナル ポリペプチドが前記コードされたタンパク質と同じ翻訳フレームにある、DNA配 列。