RS66089B1 - Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca - Google Patents

Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca

Info

Publication number
RS66089B1
RS66089B1 RS20241188A RSP20241188A RS66089B1 RS 66089 B1 RS66089 B1 RS 66089B1 RS 20241188 A RS20241188 A RS 20241188A RS P20241188 A RSP20241188 A RS P20241188A RS 66089 B1 RS66089 B1 RS 66089B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
mouse
light chain
gene
heavy chain
Prior art date
Application number
RS20241188A
Other languages
English (en)
Inventor
John Mcwhirter
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Samuel Davis
David R Buckler
Karolina A Hosiawa
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS66089B1 publication Critical patent/RS66089B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Genetski modifikovani miševi, ćelije, ne-humani embrioni, tkiva i izolovane nukleinske kiseline za izradu antitela i sekvenci koje kodiraju varijabilne domene teškog lanca humanog imunoglobulina, uključujući bispecifična antitela, i uključujući bispecifična antitela koja sadrže univerzalne lake lance. Preparati i metode koje uključuju genetski modifikovane miševe sa zamenama na endogenom mišjem varijabilnom lokusu teškog lanca germinativne linije, koji sadrže modifikovane lokuse lakog lanca koji izražavaju lake lance izvedene iz ne više od jednog ili dva različita genska segmenta V lakog lanca, pri čemu su miševi dalje genetski modifikovani u svojoj germinativnoj liniji tako da su mužjaci miševa koji nose ove modifikacije plodni. Obezbeđeni su genetski modifikovani miševi koji izražavaju univerzalne lake lance i humanizovane varijabilne domene teškog lanca, pri čemu miševi sadrže aktivnost ADAM6 koja je funkcionalna kod mužjaka miša.
POZADINA
[0002] Razvoj antitela za upotrebu kao humanih terapeutika ima dugu i složenu istoriju. Značajan napredak bila je mogućnost da se u osnovi izrade potpuno humane sekvence antitela zа upotrebu u dizajniranju efikasnih humanih terapeutika sa smanjenim potencijalom imunogenosti. Sada postoje miševi koji su modifikovani u svojoj germinativnoj liniji za generisanje humanih sekvenci antitela izvedenih iz neuređenih segmenata gena (teškog i lakog) bilo kao transgeni ili kao zamene na endogenim mišjim imunoglobulinskim lokusima. Zamena mišjih varijabilnih sekvenci sa humanim varijabilnim sekvencama na endogenim lokusima miševa, kao sa VELOCIMMUNE® humanizovanim miševima, omogućava da mišji imunski sistem u osnovi normalno funkcioniše. Kao rezultat, izlaganje ovih miševa antigenu od izbora generiše čudesno raznoliku, bogatu populaciju klonski odabranih B ćelija koje ispoljavaju visok afinitet somatski mutiranih humanih varijabilnih domena koji mogu biti korišćeni u izradi potpuno humanih antitela usmerenih protiv izabranog antigena.
[0003] Humani varijabilni domeni izrađeni u humanizovanim miševima, mogu biti korišćeni za konstruisanje potpuno humanih bispecifičnih antitela, tj., vezivnih proteina koji su heterodimeri teških lanaca, pri čemu se identičnosti i specifičnosti vezivanja varijabilnih domena teškog lanca razlikuju. Ali odabiranje lakih lanaca koji se mogu efikasno povezati i izraziti sa heterodimerima teškog lanca nema lako rešenje. Razvijanje varijabilnih domena humanog lakog lanca za upotrebu u humanim terapeuticima je sigurno moguće kod humanizovanih miševa, ali ne postoje laka rešenja vezano za odabir koji će se laki lanci efikasno povezati i izraziti sa teškim lancima koji imaju željene karakteristike vezivanja, pri čemu laki lanci nisu štetni za ekspresiju ili vezujuće ponašanje oba teška lanca.
[0004] Stoga, u struci ostaje potreba za preparatima i metodama za razvoj humanih imunoglobulinskih varijabilnih regiona za upotrebu u humanim terapeuticima, uključujući humane imunoglobulinske varijabilne regione generisane iz sekvenci nukleinskih kiselina na endogenim mišjim imunoglobulinskim lokusima.
SAŽETAK
[0005] Opisani su miševi koji izražavaju humane imunoglobulinske varijabilne domene koji su pogodni za upotrebu u bispecifičnim vezivnim proteinima, uključujući bispecifična antitela, pri čemu miševi obuhvataju humanizaciju endogenog mišjeg varijabilnog lokusa teškog lanca, gde su mužjaci miševa koji obuhvataju humanizaciju plodni i pri čemu miševi dalje uključuju humanizaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa lakog lanca koja rezultira time da miš izražava repertoar lakog lanca imunoglobulina koji je izveden iz ne više od jednog ili ne više od dva genska segmenta V λ i / ili κ.
[0006] Obezbeđeni su genetski konstruisani miševi koji biraju pogodno afinitetno-zrele varijabilne domene teškog lanca humanog imunoglobulina izvedene iz repertoara neuređenih segmenata V, D i J humanog teškog lanca, pri čemu se afinitetno zreli varijabilni domeni humanog teškog lanca udružuju i izražavaju sa humanizovanim univerzalnim lakim lancem. Humanizovani univerzalni laki lanac je izražen iz lokusa koji sadrži bilo ne više od jednog ili ne više od dva V segmenta humanog lakog lanca i humani J segment operativno povezan sa konstantnim genom lakog lanca, ili ne više od jedne ili ne više od dve preuređene (Vλ / Jλ, Vκ / Jκ, Vλ / Jκ ili Vκ / Jλ) sekvence humane nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilni domen lakog lanca operativno povezan sa konstantnim genom lakog lanca. U različitim realizacijama, univerzalni humanizovani parovi domena lakog lanca sa mnoštvom afinitetno sazrelih varijabilnih domena humanog teškog lanca, gde mnoštvo varijabilnih domena teškog lanca specifično vezuje različite epitope ili antigene. Posebno, obezbeđen je miš čiji genom sadrži:
(a) najmanje jedan neuređeni segment humanog gena VH, najmanje jedan neuređeni segment humanog gena DHi najmanje jedan neuređeni segment humanog gena JHkoji je operativno povezansaendogenim genom konstantnog regiona teškog lanca na endogenom lokusu teškog lanca;
<(b)>lokus koji sadrži ne više od jedne, ili ne više od dve, preuređene humane V/J sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilni domen lakog lanca operativno povezane sa genom konstantnog lakog lanca; i
<(c)>sekvenca ektopične nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji protein ADAM6a ili funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili njegov funkcionalni fragment i ektopična sekvenca nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji protein ADAM6b ili njegov funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili funkcionalni fragment, pri čemu ADAM6 proteini, ortolozi, homolozi ili fragmenti koji su funkcionalni kod muškog miša, pri čemu je navedena funkcija povezana sa plodnošću muškog miša,
pri čemu miš:
ima eliminisanu ili smanjenu funkciju endogenog ADAM6.
[0007] Takođe je obezbeđen postupak za pravljenje bispecifičnog antitela koji sadrži:
(a) izlaganje prvog miša prema pronalasku prvom antigenu od interesa koji sadrži prvi epitop; (b) izlaganje drugog miša prema pronalasku drugom antigenu od interesa koji sadrži drugi epitop;
(c) omogućavanje prvom i drugom mišu da svaki pokrene imunske odgovore na antigene od interesa;
(d) identifikacija kod prvog miša prvog humanog varijabilnog regiona teškog lanca koji se veže za prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikovanje u drugim mišu drugog humanog varijabilnog regiona teškog lanca koji se veže za drugi epitop drugog antigena od interesa, pravljenje prvog potpuno humanog gena teškog lanca koji kodira prvi težak lanac koji se veže za prvi epitop prvog antigena od interesa i koji sadrži prvi humani varijabilni region teškog lanca, pravljenje drugog potpuno humanog gena teškog lanca koji kodira drugi teški lanac koji se veže za drugi epitop drugog antigena od interesa i koji sadrži drugi humani varijabilni region teškog lanca;
(e) ekspresiju prvog teškog lanca i drugog teškog lanca u ćeliji koja eksprimira pojedinačni potpuno humani laki lanac koji je dobijen od segmenta gena humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 da se obrazuje antitelo; i
(f) izolovanje bispecifičnog antitela.
[0008] Takođe je obezbeđena upotreba miša prema pronalasku da se dobije aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena humanog teškog lanca ili varijabilnog domena humanog lakog lanca antitela.
[0009] Dalje je obezbeđena upotreba miša prema predmetnom pronalasku da se dobije sekvenca nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region imunoglobulina ili njegov fragment.
[0010] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju miša čiji genom sadrži:
(a) najmanje jedan neuređeni segment humanog gena VH, najmanje jedan neuređeni segment humanog gena DHi najmanje jedan neuređeni segment humanog gena JHkoji je operativno povezansaendogenim genom konstantnog regiona teškog lanca na endogenom lokusu teškog lanca;
<(b)>lokus koji sadrži ne više od jedne, ili ne više od dve, preuređene humane V/J sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilni domen lakog lanca operativno povezane sa genom konstantnog lakog lanca; i
<(c)>sekvenca ektopične nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji protein ADAM6a ili funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili njegov funkcionalni fragment i ektopična sekvenca nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji protein ADAM6b ili njegov funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili funkcionalni fragment, pri čemu ADAM6 proteini, ortolozi, homolozi ili fragmenti koji su funkcionalni kod muškog miša, pri čemu je navedena funkcija povezana sa plodnošću muškog miša,
pri čemu pomenuta ćelija ima eliminisanu ili smanjenu funkciju endogenog ADAM6.
[0011] Takođe su opisani konstrukti nukleinskih kiselina, ćelije, ne-humani embrioni, miševi i obezbeđene su metode za izradu miševa koji sadrže humanizovani varijabilni lokus teškog lanca imunoglobulina i humanizovani varijabilni lokus lakog lanca imunoglobulina, pri čemu miš izražava jedan od ne više od dva univerzalna laka lanca i miševi koji su mužjaci ispoljavaju plodnost divljih vrsta.
[0012] Takođe je opisan modifikovani miš koji u svojoj germinativnoj liniji sadrži humanizovani varijabilni lokus imunoglobulinskog teškog lanca na endogenom lokusu teškog lanca miša i humanizovani varijabilni lokus imunoglobulinskog lakog lanca, pri čemu miš izražava univerzalni laki lanac i pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog, homolog ili funkcionalni fragment. U različitim slučajevima humanizovani imunoglobulinski varijabilni lokus lakog lanca je na lokusu endogenog mišjeg lakog lanca.
[0013] U jednoj realizaciji, humanizovani varijabilni lokus teškog lanca imunoglobulina sadrži zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih segmenata gena mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca V, D i J, sa jednim ili više humanih V, humanih D, i humanih J genskih segmenata na endogenom mišjem varijabilnom lokusu teškog lanca, pri čemu su jedan ili više humanih V, D i J segmenata operativno povezani i sposobni da se preuređuju tako da obrazuju preuređeni V / D / J gen koji je operativno povezan sa konstantnom sekvencom teškog lanca.
[0014] U jednoj realizaciji, miš sadrži lokus lakog lanca koji je konstruisao da izradi univerzalni laki lanac, pri čemu je univerzalni laki lanac laki lanac koji je izveden iz lokusa lakog lanca koji sadrži V/J sekvencu pojedinačnog preuređenog lakog lanca. Takođe je opisan miš koji sadrži lokus imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži V segment pojedinačnog humanog imunoglobulinskog lakog lanca koji je sposoban za preuređivanje sa J genskim segmentom humanog lakog lanca (izabranog iz jednog ili više J segmenata) i koji kodira varijabilni domen humanog lakog lanca. U drugom primeru, miš ne sadrži više od dva V segmenta humanog lakog lanca na lokusu lakog lanca, čiji je svaki V segment sposoban za preuređivanje sa segmentom humanog J gena (izabranog iz jednog ili više J segmenata lakog lanca) i kodirajući varijabilni domen preuređenog humanog lakog lanca.
[0015] U jednom primeru, V segment pojedinačnog humanog lakog lanca je operativno povezan sa J segmentom humanog lakog lanca odabranog od Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 i Jκ5, pri čemu je V segment pojedinačnog humanog lakog lanca sposoban za preuređivanje da formira sekvencu koja kodira gen varijabilnog regiona lakog lanca sa bilo kojim od jednog ili više J segmenata humanog lakog lanca.
[0016] U jednoj realizaciji, miš sadrži endogeni lokus lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili suštinski svih mišjih segmenata gena V i J sa ne više od jedne ili ne više od dve, preuređene sekvence (V / J) nukleinskih kiselina. U jednoj realizaciji, ne više od jedne ili ne više od dve preuređene (V / J) sekvence nukleinskih kiselina su izabrane od humane Vκ1-39Jκ5, Vκ3-20Jκ1 i njihove kombinacije.
[0017] U jednoj realizaciji, mišu nedostaje funkcionalni endogeni lokus lakog lanca koji je sposoban da izražava varijabilni domen lakog lanca miša. U jednoj realizaciji, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline
koja kodira varijabilni domen univerzalnog lakog lanca na κ lokusu. U jednoj realizaciji, miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen univerzalnog lakog lanca na lokusu λ.
[0018] U jednoj realizaciji, humana preuređena V / J sekvenca je operativno povezana sa vodećom sekvencom čoveka ili miša. U jednoj realizaciji, vodeća sekvenca je vodeća sekvenca miša. U specifičnoj realizaciji, liderska sekvenca miša je mišja Vκ3-7 liderska sekvenca.
[0019] U jednoj realizaciji, preuređena V / J sekvenca je operativno povezana sa imunoglobulinskom promoterskom sekvencom. U jednoj realizaciji, promoterska sekvenca je humana promoterska sekvenca. U specifičnoj realizaciji, promoter humanog imunoglobulina je humani Vκ3-15 promoter.
[0020] U jednoj realizaciji, preuređena (V / J) sekvenca je operativno povezana sa mišjim Cκ genom.
[0021] U jednoj realizaciji, preuređena (V/J) sekvenca se nalazi na lokusu lakog lanca κ, i lokus lakog lanca κ sadrži mišji κ intronski pojačivač, mišji κ 3' pojačivač ili oba intronski pojačivač i 3' pojačivač. U specifičnoj realizaciji κ lokus je endogeni κ lokus.
[0022] U jednoj realizaciji, miš sadrži κ lokus koji sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen univerzalnog lakog lanca, a miš sadrži nefunkcionalni imunoglobulinski lokus lakog lanca lambda (λ). U specifičnoj realizaciji, lokus lakog lanca λ sadrži brisanje jedne ili više sekvenci lokusa, pri čemu jedna ili više delecija čine lokus lakog lanca nesposobnim za preuređivanje da obrazuje gen lakog lanca. U drugoj realizaciji, obrisani su svi ili suštinski svi V segmenti lokusa lakog lanca λ. U još jednom izvođenju, miš sadrži brisanje svih, ili suštinski svih, varijabilnih lokusa endogenog lakog lanca.
[0023] U jednoj realizaciji, miš dalje sadrži u svojoj germinativnoj liniji sekvencu odabranu od mišjeg κ intronskog pojačivača 5' u odnosu na preuređenu sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca ili neuređene genske segmente, mišji κ 3' inhenser i njihovu kombinaciju.
[0024] U jednoj realizaciji, sekvenca varijabilnog domena univerzalnog lakog lanca miša sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija; u jednoj realizaciji, sekvenca varijabilnog domena sadrži mnoštvo somatskih hipermutacija.
[0025] U jednoj realizaciji, miš čini univerzalni laki lanac koji sadrži somatski mutirani humani varijabilni domen. U jednoj realizaciji, laki lanac sadrži somatski mutiran humani varijabilni domen izveden od humanog V segmenta, humanog J segmenta i mišjeg Cκ gena. U jednoj realizaciji, miš ne izražava laki lanac λ.
[0026] U jednoj realizaciji, humana varijabilna sekvenca je preuređena humana Vκ1-39Jκ5 sekvenca, a miš izražava reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) varijabilni domen izveden iz Vκ1-39Jκ5 i (ii) mišji<CL; pri>čemu je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CHi (ii)somatski mutiranvarijabilni domen humanog teškog lanca. U jednoj realizaciji, miš izražava laki lanac koji je somatski mutiran. U jednoj realizaciji CLje mišji Cκ.
[0027] U jednoj realizaciji, humana varijabilna sekvenca je preuređena humana Vκ3-20Jκ1 sekvenca, a miš izražava reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) varijabilni domen izveden iz Vκ3-20Jκ1, i (ii) mišji<CL; pri>čemu je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CHi (ii)somatskimutirani varijabilni domen humanog teškog lanca.
[0028] U jednoj realizaciji, miš sadrži i preuređenu humanu Vκ1-39Jκ5 sekvencu i preuređenu humanu Vκ3-20Jκ1 sekvencu, a miš izražava reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) laki lanac koji sadrži<varijabilni>domen izveden iz Vκ1-39Jκ5 sekvence ili Vκ3-20Jκ1 sekvence i (ii) mišji CL; pri čemu je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CHi (ii) somatski mutiranivarijabilni domenhumanog teškog lanca. U jednoj realizaciji, miš izražava laki lanac koji je somatski mutiran. U jednoj realizaciji CLje mišji Cκ.
6
[0029] U jednoj realizaciji, miš izražava reverzno himerno antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži mišji Cκ i somatski mutirani humani varijabilni domen izveden iz preuređene humane Vκ1-39Jκ5 sekvence ili preuređene humane Vκ3-20Jκ1 sekvence i teški lanac koji sadrži mišji CHi somatski mutirani varijabilni domen humanog teškog lanca, pri čemu miš ne izražava potpuno mišje antitelo i ne izražava potpuno humano antitelo. U jednoj realizaciji, miš sadrži lokus lakog lanca κ koji sadrži zamenu endogenih mišjih segmenata gena lakog lanca κ sa preuređenom humanom Vκ1-39Jκ5 sekvencom ili preuređenom humanom Vκ3-20Jκ1 sekvencom i sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih mišjih genskih segmenata V, D i J teškog lanca sa potpunim ili suštinski kompletnim repertoarom genskih segmenata V, D i J humanog teškog lanca.
[0030] U jednom aspektu, obezbeđeni genetski modifikovani miš izražava pojedinačni laki lanac κ izveden iz ne više od jedne ili ne više od dve, preuređene sekvence lakog lanca κ, pri čemu miš nakon imunizacije sa antigenom ispoljava serumski titar koji je poredben sa divljim tipom miša imunizovanog sa istim antigenom. U specifičnoj realizaciji, miš izražava pojedinačnu sekvencu lakog lanca κ, pri čemu je pojedinačna sekvenca lakog lanac κ izvedena iz ne više od jedne preuređene sekvence lakog lanca κ. U jednoj realizaciji, serumski titar je okarakterisan kao ukupni imunoglobulin. U specifičnoj realizaciji, serumski titar je okarakterisan kao titar specifičan za IgM. U specifičnoj realizaciji, serumski titar je okarakterisan kao titar specifičan za IgG. U specifičnijoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je izabrana od Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 sekvence. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je Vκ1-39Jκ5 sekvenca. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je Vκ3-20Jκ1 sekvenca.
[0031] U jednom aspektu, obezbeđen je genetski modifikovan miš koji izražava mnoštvo teških lanaca imunoglobulina povezanih sa pojedinačnom sekvencom lakog lanca. Teški lanac sadrži humanu sekvencu. Humana sekvenca uključuje najmanje varijabilnu sekvencu i može takođe da sadrži humanu sekvencu izabranu od CH1, šarke, CH2, CH3 i njihove kombinacije. Pojedinačni laki lanac sadrži humanu sekvencu. Humana sekvenca uključuje najmanje varijabilnu sekvencu i može takođe da sadrži humanu sekvencu izabranu od konstantne sekvence, i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, miš sadrži onesposobljeni endogeni imunoglobulinski lokus i izražava laki lanac iz transgenog ili ekstrahromozomalnog epizoma. U jednoj realizaciji, miš sadrži zamenu na mišjem endogenom lokusu nekih ili svih endogenih segmenata gena teškog lanca miša (tj. V, D, J) i / ili nekih ili svih endogenih mišjih konstantnih sekvenci teškog lanca (npr. CH1, šarke, CH2, CH3 ili njihove kombinacije) i / ili nekih ili svih endogenih sekvenci lakog lakog miša (npr. V, J, konstanta ili kombinacija istih), sa jednom ili više sekvenci humanog imunoglobulina.
[0032] U jednoj realizaciji, miš nakon reorganizovanja jednog ili više V, D i J genskih segmenata, sadrži u svom genomu najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednoj realizaciji, nakon reorganizovanja, miš sadrži u svom genomu najmanje dve sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mišji gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednoj realizaciji, nakon reorganizovanja, miš sadrži u svom genomu najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji gen ADAM6 ili njegov homolog, ortolog ili funkcionalni fragment. U jednoj realizaciji, miš sadrži gen ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment u B ćeliji.
[0033] [Obrisan]
[0034] Takođe su opisani mužjaci miševa koji sadrže ADAM6 sekvencu ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment na lokaciji u mišjem genomu koja približava lokaciju endogenog mišjeg alela ADAM6, npr.3' krajnje sekvence V genskog segmenta i 5' inicijalnog D genskog segmenta.
[0035] U jednoj realizaciji, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment bočno povezan ushodno, nishodno ili ushodno i nishodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6 sekvence) sekvence nukleinske kiseline koja kodira genski segment varijabilnog regiona imunoglobulina. U specifičnoj realizaciji, genski segment imunoglobulinskog varijabilnog regiona je humani genski segment. U jednoj realizaciji, genski segment imunoglobulinskog varijabilnog regiona je humani genski segment, a sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili njegov fragment funkcionalan kod miša je između humanih V genskih segmenata; u jednoj realizaciji, miš sadrži dva ili više humanih V genskih segmenata, a sekvenca je na položaju između krajnjeg V genskog segmenta i predzadnjeg V genskog segmenta; u jednoj realizaciji sekvenca je na položaju koji sledi krajnji V genski segment i prvi D genski segment. U ovde opisanim realizacijama referenca na "ADAM6" označava " ADAM6 i ADAM6b"
[0036] U jednoj realizaciji humanizovanom varijabilnom lokusu teškog lanca imunoglobulina nedostaje endogeni mišji gen ADAM6. U jednoj realizaciji, humanizovani varijabilni lokus imunoglobulina teškog lanca sadrži gen ADAM6 koji je funkcionalan kod mužjaka miša. U specifičnoj realizaciji, gen ADAM6 koji je funkcionalan kod mužjaka miša je mišji gen ADAM6, a mišji gen ADAM6 je lokalizovan unutar ili odmah pored humanizovanog imunoglobulinskog varijabilnog lokusa teškog lanca.
[0037] U jednoj realizaciji, humanizovanom imunoglobulinskom varijabilnom lokusu teškog lanca nedostaje endogeni mišji gen ADAM6, a miš sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja je funkcionalna kod mužjaka miša. U jednoj realizaciji, ektopični gen ADAM6 koji je funkcionalan kod mužjaka miša je mišji gen ADAM6. U jednoj realizaciji, mišji gen ADAM6 je na istom hromozomu kao i humanizovani varijabilni lokus imunoglobulinskog teškog lanca. U jednoj realizaciji, mišji gen ADAM6 je na različitom hromozomu od humanizovanog varijabilnog lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednoj realizaciji, mišji gen ADAM6 je na epizomu.
[0038] U jednom slučaju, miš sadrži prvi endogeni alel teškog lanca i drugi endogeni alel teškog lanca, a prvi endogeni alel teškog lanca sadrži deleciju mišjeg lokusa ADAM6, a prvi endogeni alel teškog lanca sadrži zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih mišjih V, D i J segmenata sa jednim ili više humanih V, D i J segmenata. U jednoj realizaciji, prvi i drugi endogeni aleli teškog lanca sadrže deleciju endogenog lokusa ADAM6 miša, i prvi i drugi endogeni aleli teškog lanca sadrže zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih mišjih V, D i J segmenata sa jednim ili više humanih V, D i J segmenata. U jednoj realizaciji, prvi i / ili drugi alel sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. U jednoj realizaciji, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je smeštena 3' (u odnosu na transkripcionu usmerenost varijabilnog lokusa teškog lanca) krajnjeg mišjeg V genskog segmenta i smeštena 5' (u odnosu na transkripcionu usmerenost konstantne sekvence) mišjeg (ili himernog humanog /mišjeg) konstantnog gena teškog lanca ili njegovogfragmenta (npr. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani i / ili mišji: CH1 i / ili šarku i / ili CH2 i / ili CH3). U jednoj realizaciji, ektopična sekvenca nukleinske<kiseline je smeštena nishodno (u odnosu na>smer transkripcije lokusa V segmenta) od V segmenta i ushodno od D segmenta. U jednoj realizaciji, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je smeštena između pretposlednjeg V segmenta najviše 3' i krajnjeg najviše 3' V segmenta. U specifičnoj realizaciji, ektopičnasekvenca nukleinske kiseline jesmeštena između humanog V segmenta VH1-2 i humanog V segmenta VH6-1.<U jednoj realizaciji,>nukleotidna sekvenca između dva humana V genska segmenta je postavljena u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji u odnosu na humane V genske segmente. U specifičnoj realizaciji, nukleotidna sekvenca kodira, od 5' do 3' u odnosu na smer transkripcije gena ADAM6, i ADAM6a sekvence praćene ADAM6b sekvencom. U specifičnoj realizaciji, ADAM6 gen(i) su orijentisani u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji u poređenju sa ushodnim i nishodnim bočnim V segmentima.
[0039] Opisana je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a ili njegov funkcionalni fragment i / ili sekvenca koja kodira mišji ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu su ADAM6a i / ili ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment(i) operativno povezan(i) sa promoterom. Promoter može biti humani promoter. Promotor može biti mišji ADAM6 promoter. Promoter ADAM6<može da sadrži sekvencu>smeštenu između prvog kodona prvog ADAM6 gena najbližeg mišjem DHgenskom segmentu koji je najviše 5' i rekombinacione signalne sekvence 5'-najviše DH genskog segmenta,pri čemu je 5' naznačeno u odnosu nasmer transkripcije gena imunoglobulina miša. Promoter može biti virusni promoter. Virusni promoter može biti promoter citomegalovirusa (CMV). Promoter može biti ubikvitinski promoter.
[0040] U jednoj realizaciji, mišji ADAM6a i / ili ADAM6b su izabrani od ADAM6a SEK ID BR: 1 i / ili ADAM6b sekvence SEK ID BR: 2. U jednoj realizaciji, mišji ADAM6 promoter je promoter od SEK ID BR: 3. U specifičnoj realizaciji, mišji ADAM6 promoter sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEK ID BR: 3 direktno ushodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) od prvog kodona ADAM6a i protežući se do kraja SEK ID BR: 3 ushodno od kodirajućeg regiona ADAM6. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter ADAM6 je fragment koji se proteže od oko 5 do oko 20 nukleotida ushodno od početnog kodona ADAM6a do oko 0,5kb, 1kb, 2kb ili 3kb ili više ushodno od početnog kodona ADAM6a.
[0041] U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEK ID BR: 3 ili njen fragment koji kada je smešten kod miša koji je neplodan ili ima nisku plodnost usled nedostatka ADAM6, poboljšava plodnost ili vraća plodnost do oko divljeg tipa plodnosti. U jednoj realizaciji, SEK ID BR: 3 ili njen fragment obezbeđuje mužjaku miša sposobnost da proizvede ćeliju sperme koja je sposobna da pređe jajovod ženke miša u cilju oplodnje mišjeg jajeta.
[0042] Miševi sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6, ili njegov ortolog, homolog ili fragment, koji je funkcionalan kod mužjaka miša. U specifičnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je unutar ili susedna sa sekvencom humane nukleinske kiseline koja sadrži jedan ili više genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulina. U jednoj realizaciji, jedan ili više segmenata gena varijabilnog regiona imunoglobulina je na modifikovanom endogenom mišjem varijabilnom lokusu teškog lanca imunoglobulina. U jednoj realizaciji, modifikacija obuhvata zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sa mnoštvom neuređenih genskih segmenata humanog teškog lanca koji su operativno povezani sa endogenim mišjim genom konstantnog regiona. U specifičnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je između dva humana V segmenta. U specifičnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je između humanog V segmenta i humanog D segmenta. U specifičnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je između humanog D segmenta i humanog J segmenta. U specifičnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je ushodno od najvišeg 5' (u odnosu na smer transkripcije V segmenta) humanog V segmenta. U specifičnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je između humanog J segmenta i endogene mišje genske sekvence konstantnog regiona teškog lanca.
[0043] U jednoj realizaciji, mužjaci miševa su sposobni da parenjem generišu potomstvo, sa frekvencijom koja je približno ista kao kod miševa divljeg tipa. U jednoj realizaciji, mužjaci miševa proizvode spermu koja može proći iz mišje materice kroz jajovod miša da oplodi mišje jaje; u specifičnoj realizaciji, sperma miševa prolazi kroz jajovod približno jednako efikasno kao i sperma miša divljeg tipa. U jednoj realizaciji, oko 50% ili više sperme proizvedene kod miša pokazuje sposobnost ulaska i / ili tranzita jajovoda za oplodnju mišjeg jajeta.
[0044] Mišu nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja nadopunjuje gubitak mišje ADAM6 funkcije kod mužjaka miša. U jednoj realizaciji, ektopična nukleotidna sekvenca daje mužjaku miša sposobnost da proizvodi potomstvo koje je uporedivo sa odgovarajućim mužjakom miša divljeg tipa koji sadrži funkcionalni endogeni gen ADAM6. U jednoj realizaciji, sekvenca daje mišu sposobnost da obrazuje kompleks ADAM2 i / ili ADAM3 i / ili ADAM6 na površini ćelije sperme miša. U jednoj realizaciji, sekvenca daje mišu mogućnost da putuje od materice miša kroz mišji jajovod do mišjeg jajašca za oplodnju jajašca.
[0045] U jednoj realizaciji, mišu nedostaje funkcionalni endogeni lokus ADAM6 i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša i gde mužjak miša proizvodi najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% broja legla miša divljeg tipa iste starosti i soja tokom šestomesečnog vremenskog perioda.
[0046] U jednoj realizaciji, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi najmanje oko 1,5 puta, oko 2 puta, oko 2,5 puta, oko 3 puta, oko 4 puta, oko 6 puta, oko 7 puta, oko 8 puta, ili oko 10 puta ili više potomstva kada se uzgaja tokom šestomesečnog vremenskog perioda nego miš iste starosti i istog ili sličnog soja kojem nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i kojem nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca koji je uzgajan suštinski u toku istog perioda i pod suštinski istim uslovima.
[0047] U jednoj realizaciji, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi prosečno najmanje oko 2 puta, 3 puta ili 4 puta veći broj mladunaca po leglu u 4- ili 6- mesečnom periodu razmnožavanja nego miš kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca, i koji je uzgajan u istom vremenskom periodu.
[0048] U jednoj realizaciji, miš kojem nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu je mužjak miša, a mužjak miša proizvodi spermu koja kada je oporavljena iz jajovoda, oko 5-6 sati nakon kopulacije, održava migraciju iz jajovoda koja je najmanje 10 puta, najmanje 20 puta, najmanje 30 puta, najmanje 40 puta, najmanje 50 puta, najmanje 60 puta, najmanje 70 puta, najmanje 80 puta, najmanje 90 puta, 100 puta, 110 puta ili 120 puta ili viša nego sperma miša kome nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.
[0049] U jednoj realizaciji, mišu kojem nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu kada se pari sa ženkom miša stvara spermu koja je sposobna da pređe uterus i ulazeći i prelazeći jajovod unutar oko 6 sati pri efikasnosti koja je približno jednaka spermi miša divljeg tipa.
10
[0050] U jednoj realizaciji, miš kojem nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6 i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi oko 1,5 puta, oko 2 puta, oko 3 puta ili oko 4 puta ili više legla u uporedivom vremenskom periodu nego miš kojem nedostaje funkcionalni gen ADAM6 i kojem nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.
[0051] Takođe je opisan miš koji sadrži humanizovani endogeni mišji varijabilni imunoglobulinski lokus teškog lanca i modifikaciju mišjeg imunoglobulinskog lokusa lakog lanca, pri čemu miš izražava B ćeliju koja sadrži preuređenu humanu sekvencu imunoglobulina teškog lanca koja je operativno povezana sa genskom sekvencom konstantnog regiona humanog ili mišjeg teškog lanca, a B ćelija sadrži u svom genomu (npr. na B ćelijskom hromozomu) gen koji kodira ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša (npr., mišji gen ADAM6, npr., mišji ADAM6a i / ili mišji ADAM6b), pri čemu su varijabilni domeni imunoglobulinskih λ ili κ lakih lanaca miševa izvedeni iz ne više od jednog ili ne više od dva segmenta gena V lakog lanca.
[0052] U jednom slučaju, reorganizovana sekvenca imunoglobulina operativno povezana sa sekvencom gena konstantnog regiona teškog lanca sadrži V, D i / ili J sekvencu teškog lanca čoveka; V, D i / ili J sekvencu teškog lanca miša; V i / ili J sekvencu humanog ili mišjeg lakog lanca. U jednom primeru, genska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca sadrži sekvencu humanog ili mišjeg teškog lanca<odabranu iz grupe koja se>sastoji od CH1, šarke, CH2, CH3 i njihove kombinacije.
[0053] U jednom aspektu, obezbeđen je miš pogodan za izradu antitela koja imaju isti laki lanac koji je obezbeđen, pri čemu su sva ili suštinski sva antitela izrađena kod miša izražena sa istim lakim lancem, pri čemu laki lanac sadrži humani varijabilni domen i pri čemu antitela sadrže teški lanac koji sadrži humani varijabilni domen.
[0054] U jednom aspektu, obezbeđeni miš je karakterisan nemogućnošću miša da izradi B ćeliju koja izražava varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina koji je izveden iz preuređene sekvence lakog lanca koja nije humana Vκ1-39Jκ5 ili humana Vκ3-20Jκ1 sekvenca.
[0055] U jednoj realizaciji, miš pokazuje odnos lakog lanca κ: λ koji je približno isti kao miš koji sadrži komplement divljeg tipa genskih segmenata V i J imunoglobulinskog lakog lanca.
[0056] U jednom aspektu, kao što je ovde opisano, obezbeđen je miš koji izražava imunoglobulinski laki lanac izveden iz humane Vκ1-39Jκ5 ili humane Vκ3-20Jκ1 sekvence, pri čemu miš sadrži zamenu svih ili u osnovi svih endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca miša sa jednim ili više genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca čoveka, a miš pokazuje odnos (a) CD19<+>B ćelija koje izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac λ, prema (b) CD19<+>B ćelijama koji izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac κ, od oko 1 do oko 20.
[0057] U jednoj realizaciji, miš izražava pojedinačni laki lanac κ, pri čemu je pojedinačni laki lanac κ izveden iz humane Vκ1-39Jκ5 sekvence, a odnos CD19<+>B ćelija koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac λ prema CD19<+>B ćelijama koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac κ je oko 1 do oko 20; u jednoj realizaciji, odnos je oko 1 do najmanje oko 66; u specifičnoj realizaciji, odnos je oko 1 do 66.
[0058] U jednoj realizaciji, miš izražava pojedinačni laki lanac κ, pri čemu je pojedinačni laki lanac κ izveden iz humane Vκ3-20Jκ5 sekvence, a odnos CD19<+>B ćelija koji izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac λ prema CD19<+>B ćelijama koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac κ je oko 1 do oko 20; u jednoj
11
realizaciji, odnos je oko 1 do oko 21. U specifičnim realizacijama, odnos je 1 do 20 ili 1 do 21.
[0059] U jednoj realizaciji, procenat Igκ<+>Ig λ<+>B ćelija kod miša je približno isti kao i kod miša divljeg tipa. U specifičnoj realizaciji, procenat Igκ<+>Igλ<+>B ćelija kod miša je oko 2 do oko 6 procenata. U specifičnoj realizaciji, procenat Igκ<+>Igλ<+>B ćelija kod miša gde je pojedinačni preuređeni laki lanac κ izveden iz Vκ1-39Jκ5 sekvence je oko 2 do oko 3; u specifičnoj realizaciji, oko 2,6. U specifičnoj realizaciji, procenat Igκ<+>Igλ<+>B ćelija kod miša gde je pojedinačni preuređeni laki lanac κ izveden iz Vκ3- 20Jκ1 sekvence je oko 4 do oko 8; u specifičnoj realizaciji, oko 6.
[0060] U jednoj realizaciji, miš je ne sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše sposobnost miša da somatski mutira bilo koji funkcionalni lokus lakog lanca miša. U jednoj realizaciji, jedini funkcionalni lokus lakog lanca u mišu izražava laki lanac koji sadrži humani varijabilni domen izveden iz preuređene sekvence izabrane iz humane Vκ1-39Jκ5 sekvence, humane Vκ3-20Jκ1 sekvence i njihove kombinacije.
[0061] U jednom aspektu, obezbeđeni genetski modifikovani miš koji izražava pojedinačni laki lanac κ izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve, preuređene sekvence lakog lanca κ, pri čemu miš ispoljava upotrebu lakog lanca κ koja je oko 100 puta više, najmanje oko 200 puta ili više, najmanje oko 300 puta ili više, najmanje oko 400 puta ili više, najmanje oko 500 puta ili više, najmanje oko 600 puta ili više, najmanje oko 700 puta ili više, najmanje oko 800 puta ili više, najmanje oko 900 puta ili više, najmanje oko 1000 puta ili više veća nego upotreba istog lakog lanca κ (tj. izvedenog iz istog V segmenta i istog J segmenta, ili izvedenog iz istog preuređenog V / J segmenta) ispoljena od miša koji nosi kompletan ili u osnovi kompletan humani lokus lakog lanca κ. U specifičnoj realizaciji, mišu koji nosi potpun ili u osnovi kompletan lokus humanog lakog lanca κ nedostaje funkcionalna neuređena sekvenca lakog lanca κ miša. U specifičnoj realizaciji, miš izražava pojedinačni laki lanac κ od ne više od jedne preuređene sekvence lakog lanca κ. U jednoj realizaciji, miš sadrži jednu kopiju preuređene sekvence lakog lanca κ (npr. heterozigot). U jednoj realizaciji, miš sadrži dve kopije preuređene sekvence lakog lanca κ (npr. homozigot). U specifičnijoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je izabrana od Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 sekvence. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je Vκ1-39Jκ5 sekvenca. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je Vκ3-20Jκ1 sekvenca.
[0062] U jednom aspektu, obezbeđen je genetski modifikovani miš koji izražava pojedinačni laki lanac izveden iz ne više od jedne ili ne više od dve, preuređene sekvence lakog lanca κ, pri čemu laki lanac u genetski modifikovanom mišu ispoljava nivo ekspresije koji je najmanje 10 puta do oko 1,000 puta, 100 puta do oko 1,000 puta, 200 puta do oko 1,000 puta, 300 puta do oko 1,000 puta, 400 puta do oko 1,000 puta, 500 puta do oko 1,000 puta, 600 puta do oko 1,000 puta, 700 puta do oko 1,000 puta, 800 puta do oko 1,000 puta ili 900 puta do oko 1,000 puta viši od ekspresije istog preuređenog lakog lanca ispoljene od strane miša koji nosi potpun ili u osnovi potpun varijabilni lokus humanog κ lakog lanca. U jednoj realizaciji, laki lanac sadrži humanu sekvencu. U jednoj realizaciji, pojedinačni laki lanac je izveden iz preuređene sekvence lakog lanca κ odabrane od humane Vκ1-39Jκ5, humane Vκ3-20Jκ1 i njihove kombinacije.
[0063] U jednoj realizaciji, nivo ekspresije lakog lanca, radi poređenja ekspresije lakog lanca sa ekspresijom kod miša koji u osnovi sadrži potpuno humanizovani varijabilni lokus lakog lanca, karakterisan je kvantifikovanjem mRNK transkribovane sekvence lakog lanca (iz jedne ili dve preuređene sekvence) i poredeći ga sa transkribovanom sekvencom lakog lanca miša koji nosi potpun ili u osnovi potpun lokus lakog lanca.
[0064] Takođe je opisan postupak za izradu antitela, koji uključuje ekspresiju u ćeliji (a) sekvence nukleinske kiseline varijabilnog domena prvog humanog teškog lanca imunizovanog miša, kao što je ovde<opisano, spojene>sa sekvencom humanog gena CH; (b) sekvence nukleinske kiseline varijabilnog domenahumanog lakog lancaimunizovanog miša, kao što je ovde opisano, spojene sa sekvencom humanog gena<CL; i (c) održavanje ćelije>u uslovima dovoljnim za ekspresiju potpuno humanih antitela i izolovanjeantitela. U jednoj realizaciji, ćelijasadrži sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog domena drugog humanog teškog lanca drugog imunizovanogmiša, kao što je ovde opisano, spojene sa sekvencom<humanog gena C>H<, prva sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca kodira prvi varijabilni domen teškog>lanca koji prepoznaje prvi epitop, a druga sekvenca nukleinske kiseline teškog lanca kodira drugi varijabilni domen teškog lanca koji prepoznaje drugi epitop, pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.
[0065] Takođe je opisan postupak za izradu proteina za vezivanje epitopa, koji obuhvata izlaganje miša, kao što je ovde opisano, antigenu koji sadrži epitop od interesa, održavanje miša pod uslovima dovoljnim da miš generiše imunoglobulinski molekul koji specifično vezuje epitop od interesa i izolovanje imunoglobulinskog molekula koji specifično vezuje epitop od interesa; pri čemu protein koji vezuje epitop<sadrži teški lanac koji>sadrži somatski mutirani humani varijabilni domen i mišji CH, povezan sa lakim lancem koji sadrži mišji CLi humani varijabilni domen izveden iz preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ilipreuređenog humanog Vκ3-20Jκ1.
[0066] Takođe je opisan postupak za izradu bispecifičnog proteina koji se vezuje za antigen, koji uključuje izlaganje prvog miša, kao što je ovde opisano, prvom antigenu od interesa koji sadrži prvi epitop, izlaganje drugog miša, kao što je ovde opisano, drugom antigenu od interesa koji sadrži drugi epitop, omogućavajući prvom i drugom mišu da svaki montira imunske odgovore prema antigenima od interesa, identifikujući u prvom mišu prvi humani varijabilni region teškog lanca koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikujući u drugom mišu drugi humani varijabilni region teškog lanca koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, stvarajući prvi potpuno humani gen teškog lanca koji kodira prvi teški lanac koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, stvarajući drugi potpuno humani gen teškog lanca koji kodira drugi teški lanac koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, izražavajući prvi teški lanac i drugi teški lanac u ćeliji koja izražava pojedinačni potpuno humani laki lanac izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta da obrazuje bispecifični protein za vezivanje antigena i izolovanje bispecifičnog antigenvezujućeg proteina.
[0067] U jednom primeru, prvi antigen i drugi antigen nisu identični.
[0068] U jednom primeru, prvi antigen i drugi antigen su identični, a prvi epitop i drugi epitop nisu identični. U jednom primeru, vezivanje prvog varijabilnog regiona teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje drugog varijabilnog regiona teškog lanca za drugi epitop.
[0069] U jednom primeru, prvi antigen je odabran od rastvorljivog antigena i antigena ćelijske površine (npr., tumorskog antigena), a drugi antigen sadrži receptora ćelijske površine. U specifičnoj realizaciji, ćelijski površinski receptor je imunoglobulinski receptor. U specifičnoj realizaciji, imunoglobulinski receptor je Fc receptor. U jednom primeru, prvi antigen i drugi antigen su isti ćelijski površinski receptor, a vezivanje prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje drugog teškog lanca za drugi epitop.
[0070] U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca u lakom lancu sadrži 2 do 5 somatskih mutacija. U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca je somatski mutiran srodni laki lanac izražen u B ćeliji prvog ili drugog imunizovanog miša bilo sa prvim ili drugim varijabilnim domenom teškog lanca.
[0071] U jednom aspektu, obezbeđena je ćelija koja izražava protein za vezivanje epitopa, pri čemu ćelija sadrži: (a) humanu nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni domen humanog lakog lanca koja je izvedena iz preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ili preuređenog humanog Vκ3-20Jκ1, pri čemu je sekvenca humane nukleinske kiseline spojena (direktno ili preko linkera) sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog domena lakog lanca humanog imunoglobulina (npr. DNK sekvenca humanog κ konstantnog domena); i (b) sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog domena prvog humanog teškog lanca koja kodira varijabilni domen humanog teškog lanca, izvedenu iz nukleotidne sekvence varijabilnog domena prvog humanog teškog lanca, pri čemu je nukleotidna sekvenca varijabilnog domena prvog humanog teškog lanca fuzionisana (direktno ili preko linkera) za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina (npr. humanu IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili IgE sekvencu); pri čemu protein koji vezuje epitop prepoznaje prvi epitop. U jednoj realizaciji, protein koji se vezuje za epitop vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije nižom od 10<-6>M, nižom od 10<-8>M, nižom od 10<-9>M, nižom od 10<-10>M, nižom od 10<-11>M, ili nižom od 10<-12>M. U jednoj realizaciji, ćelija sadrži drugu humanu nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni domen drugog humanog teškog lanca, pri čemu je druga humana sekvenca spojena (direktno ili preko linkera) na sekvencu nukleinske kiseline konstantnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina, i gde drugi humani varijabilni domen teškog lanca ne prepoznaje posebno prvi epitop (npr. ispoljava konstantu disocijacije od, npr. 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, ili višu), i gde protein za vezivanje epitopa vezuje i prvi epitop i drugi epitop, i pri čemu se prvi i drugiteški lanci imunoglobulinasvaki udružuju sa lakim lancem prema (a). U jednoj realizaciji, drugi VH domen<vezuje drugi epitop sa>konstantom disocijacije koja je niža od 10<-6>M, niža od 10<-7>M, niža od 10<-8>M, niža od 10<-9>M, niža od 10<- 10>M, niža od 10<-11>M, ili niža od 10<-12>M.
[0072] U jednoj realizaciji, protein za vezivanje epitopa sadrži prvi teški lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglobulina, svaki povezan sa univerzalnim lakim lancem (npr., lakim lancem izvedenim iz preuređene varijabilne sekvence humanog lakog lanca odabrane od humane Vκ1-39Jκ5 ili humane Vκ3- 20Jκ1), pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom (npr.
1 nM do 100 nM) do pikomolarnom opsegu (npr. 1 pM do 100 pM), a drugi imunoglobulinski teški lanac vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu (npr.1 pM do 100 nM), prvi epitop i drugi epitop nisu identični, prvi imunoglobulinski teški lanac ne vezuje drugi epitop ili vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije slabijom od mikromolarnog opsega (npr. milimolarni opseg), drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje prvi epitop ili vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije slabijom od mikromolarnog opsega (npr. milimolarni opseg) i jedan ili više varijabilnih domena (tj. jedan ili više varijabilnih domena lakog lanca, varijabilni domen teškog lanca prvog imunoglobulinskog teškog lanca i varijabilni domen teškog lanca) drugog imunoglobulinskog teškog lanca je somatski mutiran. U jednoj realizaciji, vezivanje proteina za vezivanje epitopa za prvi epitop ne blokira vezivanje proteina za vezivanje epitopa za drugi epitop.
[0073] U jednoj realizaciji, prvi teški lanac imunoglobulina sadrži determinantu za vezivanje proteina A divljeg tipa, a drugom teškom lancu nedostaje determinanta vezivanja proteina A divljeg tipa. U jednoj realizaciji, prvi teški lanac imunoglobulina vezuje protein A u uslovima izolacije, a drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje protein A ili vezuje protein A najmanje 10 puta, sto puta ili hiljadu puta slabije nego što prvi teški lanac imunoglobulina vezuje protein A u uslovima izolacije. U specifičnoj realizaciji, prvi i drugi teški lanci su IgG1 izotipa, pri čemu drugi teški lanac sadrži modifikaciju izabranu od 95R (EU 435R), 96F (EU 436F) i njihove kombinacije, i gde prvom teškom lancu nedostaje takva modifikacija.
[0074] U aspektu, miš, ne-humani embrion ili ćelija, kao što je ovde opisano, sadrži lokus lakog lanca κ koji zadržava endogene regulatorne ili kontrolne elemente, npr., mišji κ intronski pojačivač, mišji κ 3' pojačivač ili oba intronski pojačivač i 3' pojačivač, pri čemu regulatorni ili kontrolni elementi olakšavaju somatsku mutaciju i afinitetno sazrevanje izražene sekvence lokusa lakog lanca κ.
[0075] U jednom aspektu, obezbeđena je mišja ćelija koja je izolovana iz miša, kao što je ovde opisano. U jednoj realizaciji, ćelija je ES ćelija. U jednoj realizaciji, ćelija je limfocit. U jednoj realizaciji, limfocit je B ćelija. U jednoj realizaciji, B ćelija izražava himerni teški lanac koji sadrži varijabilni domen izveden iz humanog V genskog segmenta; i laki lanac izveden iz (a) preuređene humane Vκ1-39/J sekvence, (b) preuređene humane Vκ3-20/J sekvence, ili (c) njihove kombinacije; pri čemu je varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom, a varijabilni domen lakog lanca je fuzionisan sa mišjim ili humanim konstantnim regionom. U jednoj realizaciji ćelija je B ćelija, a B ćelija sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen imunoglobulina preuređenog humanog teškog lanca i sekvencu koja kodira varijabilni domen univerzalnog lakog lanca, pri čemu B ćelija sadrži na hromozomu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša; u jednoj realizaciji, mišja B ćelija sadrži dva alela sekvence nukleinske kiseline.
[0076] U jednom aspektu, obezbeđena ćelija miša, sadrži prvi hromozom koji sadrži humanizovani imunoglobulinski lokus teškog lanca koji sadrži neuređene humane V, D i J segmente; drugi hromozom koji sadrži humanizovani imunoglobulinski lokus lakog lanca koji kodira ili je sposoban da se preuredi da kodira laki lanac, pri čemu lokus lakog lanca ne sadrži više od jedne ili više od dve preuređene V/J sekvence lakog lanca operativno povezane sa konstantnim genom lakog lanca; i treći hromozom koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili njegov homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. U jednoj realizaciji, prvi i treći hromozomi su isti. U jednoj realizaciji, drugi i treći hromozomi su isti. U jednoj realizaciji, prvi, drugi i treći hromozom su svaki različiti. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je prisutna u dve kopije. U jednoj realizaciji, ćelija je somatska ćelija. U specifičnoj realizaciji, somatska ćelija je B ćelija. U jednoj realizaciji, ćelija je germinativna ćelija.
[0077] U jednom aspektu, obezbeđen je hibridom, gde je hibridom izrađen sa B ćelijom miša, kao što je ovde opisano. U specifičnoj realizaciji, B ćelija je iz miša, kao što je ovde opisano, koji je imunizovan sa antigenom koji sadrži epitop od interesa, a B ćelija izražava vezivni protein koji vezuje epitop od interesa, vezivni protein ima somatski mutiran varijabilni domen humanog teškog lanca i konstantni region teškog lanca miša, i ima varijabilni domen humanog lakog lanca izveden iz preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ili<preuređenog humanog>i mišjeg CL.
[0078] Takođe je opisana ćelija koja sadrži potpuno humani gen teškog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi varijabilni domen teškog lanca miša, kao što je ovde opisano, i potpuno humani gen lakog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu univerzalnog lakog lanca, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi varijabilni domen teškog lanca miša, kao što je ovde opisano, pri čemu su prvi i drugi varijabilni domeni teškog lanca različiti. U jednoj realizaciji, ćelija je izabrana između CHO, COS, 293, HeLa i retinalne ćelije koja eksprimira virusnu sekvencu nukleinske kiseline (npr., PERC.6 ™ ćelija).
[0079] Takođe je opisan mišji embrion, pri čemu embrion sadrži donorsku ES ćeliju koja je dobijena iz miša, kao što je ovde opisano.
[0080] Takođe je opisana upotreba embriona miša koji sadrži genetsku modifikaciju, kao što je ovde opisano, pri čemu upotreba uključuje pravljenje genetski modifikovanog miša, kao što je ovde opisano.
[0081] Takođe su opisani varijabilni domen humanog teškog lanca i varijabilni domen humanog lakog lanca aminokiselinske sekvence od izrađenog antitela kod miša, kao što je ovde opisano.
[0082] Takođe su opisane nukleotidna sekvenca varijabilnog domena humanog teškog lanca i nukleotidna sekvenca varijabilnog domena humanog lakog lanca od antitela napravljenog kod miša, kao što je ovde opisano.
[0083] Takođe je opisano antitelo ili protein za vezivanje antigena ili njegov fragment koji vezuje antigen<(npr.>Fab, F(ab)2, scFv) izrađen kod miša, kao što je ovde opisano.
[0084] U jednom aspektu, obezbeđen je miš napravljen korišćenjem vektora za ciljanje, nukleotidnog konstrukta ili ćelije, kao što je ovde opisano.
[0085] U jednom aspektu, obezbeđeno je potomstvo parenjem prvog miša, kao što je ovde opisano, sa drugim mišem koji je miš divljeg tipa ili genetski modifikovan.
[0086] Takođe je opisana upotreba miša, kao što je ovde opisano, za izradu potpuno humanog antitela, ili potpuno humanog proteina za vezivanje antigena koji sadrži imunoglobulinski varijabilni domen ili njegov funkcionalni fragment.
[0087] Takođe je opisana upotreba miša ili tkiva ili ćelije, kao što je ovde opisano, za izradu potpuno humanih bispecifičnih antitela.
[0088] Takođe opisana je upotreba sekvence nukleinske kiseline napravljene od miša, kao što je ovde opisano je obezbeđena, pri čemu upotreba uključuje izražavanje sekvence nukleinske kiseline u proizvodnji humanog terapeutika.
[0089] Takođe je opisana upotreba miša, kao što je ovde opisano, da bi se napravila besmrtna ćelijska linija.
[0090] Takođe je opisana upotreba miša, kao što je ovde opisano, da se napravi hibridom ili kvadrom koji je obezbeđen.
[0091] Takođe je opisana upotreba miša, kao što je ovde opisano, da se izradi sekvenca nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski varijabilni region ili njegov fragment koji je obezbeđen. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je korišćena za izradu humanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U jednom primeru, miš je korišćen za izradu antigen-vezujućeg proteina izabranog od antitela, multispecifičnog antitela (npr. bispecifičnog antitela), scFv, bis-scFV, diatela, triatela, tetratela, V-NAR,<VHH, VL, F(ab),>F(ab)2, DVD (tj. antigen-vezujućeg proteina dvostrukog varijabilnog domena), SVD (tj.antigen-vezujućegproteina jednostrukog varijabilnog domena), ili bispecifičnog T-ćelijskog angaživača (BiTE).
[0092] Takođe je opisana upotreba miša, kao što je ovde opisano, za proizvodnju leka (npr. proteina za vezivanje antigena) ili za proizvodnju sekvence koja kodira varijabilnu sekvencu leka (npr., protein koji vezuje antigen), obezbeđenog za lečenje humane bolesti ili poremećaja.
[0093] Bilo koja od ovde opisanih realizacija i aspekata se može koristiti zajedno sa drugima, osim ako je iz konteksta drugačije naznačeno ili vidljivo. Ostale realizacije biće očigledne onima koji su stručni u ovoj oblasti iz pregleda sledećeg opisa.
KRATAK OPIS SLIKA
[0094]
SL. 1A prikazuje opštu ilustraciju, ne za merenje, za direktnu genomsku zamenu oko tri
megabaze (Mb) mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog lokusa gena teškog lanca (zatvoreni
simboli) sa oko jednom megabazom (Mb) varijabilnog lokusa gena humanog
imunoglobulinskog teškog lanca (otvoreni simboli).
SL. 1B prikazuje opštu ilustraciju, ne za procenu, za direktnu genomsku zamenu oko tri
megabaze (Mb) mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa lakog lanca κ
(zatvoreni simboli) sa oko 0,5 megabazom (Mb) prvog, ili proksimalnog, ili dva gotovo
identična ponavljanja varijabilnog genskog lokusa humanog imunoglobulina lakog lanca κ
(otvoreni simboli).
SL.2A prikazuje detaljnu ilustraciju, ne za skalu, za tri početna koraka (A-C) za
direktnu genomsku zamenu varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina<miša>
koja rezultira brisanjem svih mišjih segmenata gena VH, DHi JHi zamenu
sa tri humana VH, svih humanih DHi JHsegmenata gena. Prikazan je ciljni vektor za prvo
umetanje genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina (3hVHBACvec) sa5'
homolognim krakom miša od 67 kb, selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), mestom
rekombinacije specifičnim za lokaciju (otvoreni trougao), humanim genomskim fragmentom
od 145 kb i 3' homolognim krakom miša od 8 kb. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i
mišji (zatvoreni simboli) segmenti gena imunoglobulina, dodatne selekcione kasete (otvoreni
pravougaonici) i mesta specifična za rekombinaciju (otvoreni trouglovi) ubačeni iz sledećih
ciljajućih vektora.
Slika 2B prikazuje detaljnu ilustraciju, ne za procenu, za šest dodatnih koraka (D-I) za
direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa<teškog>
lanca koja rezultira ubacivanjem 77 dodatnih humanih VHgenskih segmenata i uklanjanje
konačne selekcione kasete. Ciljajući vektor za umetanje dodatnih humanih VHgenskih
segmenata (18hVHBACvec) prema početnom ubacivanju genskih segmenata humanog
teškog lanca (3hVH-CRE hibridni alel) je prikazan mišjim homolognim krajem5' od 20 kb,
selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), humanim genomskim fragmentom od 196
17
kb i humanim homolognim krajem od 62 kb koji se preklapa sa 5' krajem početnog ubacivanja genskih segmenata humanog teškog lanca koji je prikazan sa rekombinacionim mestom specifičnim za lokaciju (otvoreni trougao) smeštenim 5' prema humanim genskim segmentima. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti i dodatne kasete za selekciju (otvoreni pravougaonici) koje su umetnute naknadnim vektorima ciljanja.
SL. 2C prikazuje detaljnu ilustraciju, ne za procenu, za tri početna koraka (A-C), za direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa lakog lanca κ koja rezultira brisanjem svih mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata (Igκ-CRE hibridni alel). Prikazane su selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesta rekombinacije specifična za mesto (otvoreni trouglovi) ubačena iz ciljajućih vektora.
SL. 2D prikazuje detaljnu ilustraciju, ne za procenu, za 5 dodatnih koraka (D-H), za direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa lakog lanca κ koja rezultira ubacivanjem svih humanih Vκ i Jκ genskih segmenata u proksimalnom ponavljanju i brisanje finalne selekcione kasete (40hVκdHig hibridni
alel). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti i dodatne kasete za selekciju (otvoreni pravougaonici) ubačene naknadnim vektorima ciljanja.
SL. 3A prikazuje opštu ilustraciju lokacija kvantitativnih PCR (qPCR) setova prajmera / proba za skrining ES ćelija za umetanje genskih sekvenci humanog teškog lanca i gubitak genskih sekvenci teškog lanca miša. Strategija skrininga u ES ćelijama i miševima za prvo ubacivanje humanog teškog gena je prikazana sa qPCR setovima prajmera / proba za obrisani region ("gubitak" probe C i D), ubačeni region ("hIgH" probe G i H) i bočni regioni ("retencione" probe A, B, E i F) na nemodifikovanom hromozomu miša (vrh) i pravilno ciljanom hromozomu (dno).
SL. 3B prikazuje reprezentativno izračunavanje broja posmatranih kopija proba u roditeljskim i modifikovanim ES ćelijama za prvo ubacivanje segmenata gena teškog lanca humanog imunoglobulina. Posmatrani broj kopija proba za probe od A do F
je izračunat kao 2/2△△Ct. △△Ct se izračunava kao prosek [△Ct (uzorak) - med△Ct (kontrola)] gde je △Ct razlika u Ct između ispitivanih i referentnih proba (između 4 i 6 referentnih proba u zavisnosti od testa). Izraz med△Ct (kontrola) je srednji △Ct od više ( > 60) ne-ciljanih uzoraka DNK iz roditeljske ES ćelije. Svaki modifikovani ES ćelijski klon je analiziran u sekstuplikatu. Da bi se izračunao broj kopija IgH proba G i H u roditeljskim ES ćelijama, pretpostavlja se da ove probe imaju broj kopija od 1 u modifikovanim ćelijama ES i korišćen je maksimalni Ct od 35 iako nije primećena amplifikacija.
SL. 3C prikazuje reprezentativno izračunavanje broja kopija za četiri miša od svakog genotipa, izračunato je na sličan način korišćenjem samo proba D i H. Miševi divljeg tipa: WT miševi; Miševi heterozigotni za prvo ubacivanje genskih segmenata humanog imunoglobulina: HET Miševi; Miševi homozigotni za prvo ubacivanje genskih segmenata humanog imunoglobulina: Homo Miševi.
SL. 4A prikazuje ilustraciju tri koraka korišćenih za konstrukciju 3hVHBACvec bakterijskom homolognom rekombinacijom (BHR). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti, kasete za selekciju (otvoreni pravougaonici) i mesta rekombinacije specifična za lokaciju (otvoreni trouglovi) ubačeni iz ciljajućih vektora.
SL. 4B prikazuje elektroforezu gela sa pulsnim poljem (PFGE) tri BAC klona (B1, B2 i B3) nakon Notl digestije. Markeri M1, M2 i M3 su PFG markeri niskog dometa, srednjeg dometa i lambda skale, respektivno (New England BioLabs, Ipswich, MA).
SL. 5A prikazuje shematsku ilustraciju, ne za procenu, sekvencijalnih modifikacija mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca sa povećanim količinama genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina. Homozigotni miševi su napravljeni iz svake od tri različite faze humanizacije teškog lanca. Otvoreni simboli odražavaju humanu sekvencu; zatvoreni simboli odražavaju sekvencu miša.
SL. 5B prikazuje shematsku ilustraciju, ne za procenu, sekvencijalnih modifikacija mišjeg imunoglobulinskog lokusa lakog lanca κ sa povećanim količinama segmenata gena lakog lanca κ humanog imunoglobulina. Homozigotni miševi napravljeni su iz svake od tri različite faze humanizacije lakog lanca κ. Otvoreni simboli odražavaju humanu sekvencu; zatvoreni simboli odražavaju sekvencu miša.
SL. 6 prikazuje dijagrame FACS tačaka B ćelijske populacije kod miševa divljeg tipa i VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa. Ćelije iz slezine (gornji red, treći red iz gornjeg i donjeg reda) ili ingvinalni limfni čvor (drugi red odozgo) divljeg tipa (wt) ili VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) ili VELOCIMMUNE® 3 (V3) miševi su obojeni za površinske B ćelije koje eksprimiraju IgM (gornji red i drugi red od vrha), površinski imunoglobulin koji sadrži ili κ ili λ lake lance (treći red od vrha) ili površinski IgM specifičnih haplotipova (donji red), i populacije odvojene pomoću FACS.
SL. 7A prikazuje reprezentativne CDR3 sekvence teškog lanca nasumično odabranih VELOCIMMUNE® antitela oko VH-DH-JH(CDR3) spoja, prikazujući raznolikostspajanja inukleotidne dodatke. CDR3 sekvence teškog lanca su grupisane prema<korišćenju genskog>segmenta DH, čija je germinativna linija obezbeđena iznad svake grupe u boldu. Segmenti gena VHza svaku CDR3 sekvencu teškog lanca su notirani u zagradama na 5' kraju svake sekvence (npr. 3-72 je humani VH3-72). Segmenti gena JHza svaki CDR3 teškog lanca suzabeleženi u zagradama na 3' kraju svake sekvence (npr.<3 je humani J>H<3). SEK ID BR-a za>svaku prikazanu sekvencu su kao što sledi prostupakod vrha prema dnu: SEK ID BR: 21;SEK ID BR: 22; SEK ID BR: 23; SEK ID BR: 24;
SEK ID BR: 25; SEK ID BR: 26; SEK ID BR: 27; SEK ID BR: 28; SEK ID BR: 29; SEK ID BR: 30; SEK ID BR: 31; SEK ID BR: 32; SEK ID BR: 33; SEK ID BR: 34; SEK ID BR: 35; SEK ID BR: 36; SEK ID BR: 37; SEK ID BR: 38; SEK ID BR: 39.
SL. 7B prikazuje reprezentativne CDR3 sekvence lakog lanca nasumično izabranih antitela VELOCIMMUNE® oko Vκ-Jκ (CDR3) spajanja, demonstrirajući raznolikost spajanja i nukleotidnih dodavanja. Segmenti Vκ gena za svaku CDR3 sekvencu lakog lanca su zabeleženi u zagradama na 5' kraju svake sekvence (npr.1-6 je humani Vκ1-6). Segmenti Jκ gena za svaki CDR3 lakog lanca su zabeleženi u zagradama na 3' kraju svake sekvence (npr.
1 je humani Jκ1). SEK ID BR-a za svaku prikazanu sekvencu su kao što sledi postupak od vrha prema dnu: SEK ID BR: 40; SEK ID BR: 41; SEK ID BR: 42; SEK ID BR: 43; SEK ID BR: 44; SEK ID BR: 45; SEK ID BR: 46; SEK ID BR: 47; SEK ID BR: 48; SEK ID BR: 49; SEK ID BR: 50; SEK ID BR: 51; SEK ID BR: 52; SEK ID BR: 53; SEK ID BR: 54; SEK ID BR: 55; SEK ID BR: 56; SEK ID BR: 57; SEK ID BR: 58.
SL. 8 prikazuje frekvencije somatskih hipermutacija teških i lakih lanaca VELOCIMMUNE® antitela ocenjenih (nakon poravnanja do uparivanja sekvenci germinativne linije) kao procenat sekvenci promenjenih na položaju svakog nukleotida (NT; leva kolona) ili aminokiseline (AA; desna kolona) među kompletima od 38 (neimunizovani IgM), 28 (neimunizovani IgG), 32 (neimunizovani Igκ od IgG), 36 (imunizovani IgG) ili 36 (imunizovani Igκ iz IgG) sekvence. Osenčeni barovi označavaju lokacije CDR-a.
SL. 9A prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgM i IgG izotipove kod divljih vrsta (otvoreni barovi) ili VELOCIMMUNE® miševa (zatvoreni barovi).
SL. 9B prikazuje nivo serumskog imunoglobulina za IgA izotip kod divljeg tipa (otvoreni barovi) ili VELOCIMMUNE® miševa (zatvoreni barovi).
SL. 9C prikazuje nivo serumskog imunoglobulina za IgE izotip kod divljeg tipa (otvoreni barovi) ili VELOCIMMUNE® miševa (zatvoreni barovi).
SL. 10A prikazuje antigen specifične IgG titre protiv interleukin-6 receptora u serumu od sedam VELOCIMMUNE® (VI) i pet divljih vrsta (WT) miševa nakon dva (krvarenje 1) ili tri (krvarenje 2) kruga imunizacije sa ektodomenom receptora interleukin-6.
SL. 10B prikazuje anti-interleukin-6 receptor specifične IgG izotip-specifične titre iz sedam VELOCIMMUNE® (VI) i pet divljih vrsta (WT) miševa.
SL. 11A prikazuje afinitetnu raspodelu monoklonskih antitela anti-interleukin-6 receptora generisanih u VELOCIMMUNE® miševima.
SL. 11B prikazuje antigen-specifično blokiranje monoklonskih antitela anti-interleukin- 6 receptora generisanih u VELOCIMMUNE® (VI) miševima i divljem tipu (WT).
SL. 12 prikazuje shematsku ilustraciju, ne za procenu, mišjih ADAM6a i ADAM6b gena u mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Vektor ciljanja (mADAM6 ciljajući vektor) korišćen za ubacivanje mišjeg ADAM6a i ADAM6b u humanizovani endogeni lokus teškog lanca je prikazan selekcionom kasetom (HYG: higromicin) okruženom rekombinacionim mestima specifičnim za lokaciju (Frt), uključujući konstruisana restrikciona mesta na 5' i 3' krajevima.
SL. 13 prikazuje shematsku ilustraciju, ne za procenu, humanog ADAM6 pseudogena (hADAM6Ψ) smeštenog između varijabilnih segmenata gena 1-2 (VH1-2) i 6-1 (VH6-1) humanog teškog lanca. Vektor ciljanja za bakterijsku homolognu rekombinaciju (hADAM6Ψ ciljajući vektor) za brisanje humanog pseudogena ADAM6 i umetanje jedinstvenih restrikcionih mesta u lokusu humanog teškog lanca je prikazan selekcionom kasetom (NEO: neomicin) okruženom sa mestima rekombinacije specifičnim za lokaciju (loxP) uključujući konstruisana mesta ograničenja na krajevima 5' i 3'. Prikazana je ilustracija, ne za procenu, nastalog ciljanog humanizovanog lokusa teškog lanca koji sadrži genomski fragment koji kodira mišje ADAM6a i ADAM6b gene, uključujući selekcionu kasetu okruženu rekombinacionim mestima specifičnim za lokaciju.
SL. 14A prikazuje FACS konturne dijagrame limfocita sakupljenih na singletima za površinsku ekspresiju IgM i B220 u koštanoj srži za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog κ lakog lanca i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ubačen genomski fragment miša koji sadrži mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). Procenat nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<high>IgM<+>) B ćelija je zabeležen na svakom konturnom dijagramu.
SL. 14B prikazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<high>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanoj iz femura miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za
varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju ektopični fragment genoma miša koji kodira mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6).
SL. 15A prikazuje FACS konturne dijagrame CD19<+>- sakupljenih B ćelija za površinsku ekspresiju c-kompleta i CD43 u koštanoj srži, za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševe homozigotne
za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju ektopični fragment genoma miša koji kodira za mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). Procenat pro-B (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre-B (CD19<+>CD43-ckit-) ćelija je zabeležen u gornjem desnom i donjem levom kvadrantu, respektivno, svakog konturnog dijagrama.
SL. 15B prikazuje ukupan broj pro-B ćelija (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre-B ćelija (CD19<+>CD43-ckit-) u koštanoj srži izolovanoj iz femura miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju ektopični fragment genoma miša koji uključuje mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6).
SL. 16A prikazuje FACS konturne dijagrame limfocita sakupljenih na singletima za površinsku ekspresiju CD19 i CD43 u koštanoj srži za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju ektopični fragment genoma miša koji kodira za mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). Procenat nezrelih B (CD19<+>CD43-), pre-B (CD19<+>CD43<int>) i pro-B (CD19<+>CD43<+>) ćelija je zabeležen na svakom konturnom dijagramu.
SL.16B prikazuje histograme nezrelih B (CD19<+>CD43-) i pre-B (CD19<+>CD43<int>) ćelija u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju dislociran mišji genomski fragment koji kodira za mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6).
SL. 17A prikazuje FACS konturne dijagrame limfocita sakupljenih na singletima za površinsku ekspresiju CD19 i CD3 u splenocitima za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju dislocirani fragment genoma miša koji kodira za mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). Procenat B (CD19<+>CD3-) i T (CD19-CD3<+>) ćelija je zabeležen na svakom konturnom dijagramu.
SL. 17B prikazuje konturne dijagrame FACS-a za CD19<+>-sakupljene B-ćelije za površinsku ekspresiju Igλ i Igκ lakog lanca u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju dislocirani fragment genoma miša koji uključuje mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). Procenat Igλ<+>(gornji levi kvadrant) i Igκ<+>(donji desni kvadrant) B ćelija je zabeležen na svakom konturnom dijagramu.
SL. 17C prikazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju dislocirani fragment mišjeg genoma koji uključuje mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). SL. 18A prikazuje konturne dijagrame FACS-a CD19<+>- zadržanih B ćelija za površinsku ekspresiju IgD i IgM u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju dislocirani fragment mišjeg genoma koji uključuje mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6). Procenat zrelih B ćelija (CD19<+>IgD<high>IgM<int>) je zabeležen za svaki konturni dijagram.
Strelica na desnom konturnom dijagramu prikazuje proces sazrevanja B ćelija u odnosu na površinsku ekspresiju IgM i IgD.
SL. 18B prikazuje ukupan broj B ćelija u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (Η/κ) humanog teškog i humanog lakog lanca κ i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog lakog lanca κ koji imaju dislocirani fragment mišjeg genoma kodirajući za mišje gene ADAM6 (Η/κ-Α6) tokom sazrevanja od CD19<+>IgM<high>IgD<int>do CD19<+>IgM<int>IgD<high>.
SL. 19 ilustruje strategiju ciljanja za zamenu endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša sa humanim genskim regionom Vκ1-39Jκ5. SL. 20 ilustruje strategiju ciljanja za zamenu endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša sa humanim genskim regionom Vκ3-20Jκ1. SL. 21 ilustruje strategiju ciljanja za zamenu endogenih mišjih imunoglobulinskih genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca sa humanim genskim regionom VpreB/Jλ5.
SL. 22 prikazuje procenat CD19<+>B ćelija (y osa) iz periferne krvi za miševe divljeg tipa
(WT), homozigotne miševe za konstruisani humani preuređeni region Vκ1-39Jκ5 lakog
lanca (Vκ1-39Jκ5 HO) i homozigotne miševe za dizajnirani humani preuređeni region Vκ3-20Jκ1 lakog lanca (Vκ3-20Jκ1 HO).
SL. 23A prikazuje relativnu ekspresiju mRNK (y-osa) lakog lanca izvedenog od Vκ1- 39 u
kvantitativnom PCR testu korišćenjem proba specifičnih za spajanje konstruisanog humanog
preuređenog regiona lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (Vκ1-39Jκ5 spojne probe) i humanog genskog
segmenta Vκ1-39 (proba Vκ1-39) kod homozigotnog miša za zamenu endogenih segmenata
gena Vκ i Jκ sa humanim segmentima gena Vκ i Jκ (Ηκ), miša divljeg tipa (WT) i
heterozigotnog miša za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (Vκ1-39Jκ5 HET). Signali su normalizovani za ekspresiju mišjeg Cκ. N.D.: nije otkriveno.
SL. 23B prikazuje relativnu ekspresiju mRNK (y-osa) lakog lanca izvedenog od Vκ1- 39 u
kvantitativnom PCR testu korišćenjem proba specifičnih za spajanje konstruisanog humanog
preuređenog regiona lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (proba spajanja Vκ1-39Jκ5) i humanog Vκ1-39
genskog segmenta (proba Vκ1-39) kod homozigotnog miša za zamenu endogenih segmenata
gena Vκ i Jκ sa humanim segmentima gena Vκ i Jκ (Ηκ), miša divljeg tipa (WT) i
homozigotnog miša za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (Vκ1-39Jκ5 HO). Signali su normalizovani za ekspresiju mišjeg Cκ.
SL. 23C prikazuje relativnu ekspresiju mRNK (y-osa) lakog lanca izvedenog od Vκ3-20 u
kvantitativnom PCR testu korišćenjem proba specifičnih za spajanje konstruisanog humanog
preuređenog regiona lakog lanca Vκ3-20Jκ1 (proba spajanja Vκ3-20Jκ1) i humanog Vκ3-20
genskog segmenta (proba Vκ3-20) kod homozigotnog miša za zamenu endogenih segmenata
gena Vκ i Jκ sa humanim segmentima gena Vκ i Jκ (Ηκ), miša divljeg tipa (WT) i miša
heterozigotnog (HET) i homozigotnog (HO) za konstruisani humani preuređeni region lakog
lanca Vκ3-20Jκ1. Signali su normalizovani za ekspresiju mišjeg Cκ.
SL.24A prikazuje titar IgM (levo) i IgG (desno) kod divljeg tipa (WT; N = 2) i homozigotnih
miševa za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (Vκ1-39Jκ5 HO;
N = 2) imunizovanih sa β- galatozidazom.
SL.24B prikazuje ukupni titar imunoglobulina (IgM, IgG, IgA) kod divljeg tipa (WT; N
= 5) i homozigotnih miševa za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca (Vκ3-20Jκ1 HO; N = 5) imunizovanih sa β-galatozidazom.
DETALJAN OPIS
[0095] Izraz "antitelo", kako se ovde koristi, uključuje molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama.<Svaki teški lanac>sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i konstantni region teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni<region lakog lanca (C>L<). V>H<i V>L<regioni mogu biti dalje subpodeljeni na>regione hipervarijabilnosti, nazvaneregionima koji određuju komplementarnost (CDR), isprepletane sa<regionima koji su više očuvani, nazvanim okvirnim regionima (FR). Svaki V>H<i V>L<sadrži tri CDR-a i>četiri FR-a, raspoređena od amino-završetka dokarboksi-završetka sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR-ovi teškog lanca mogu biti skraćeni kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; CDR-ovi lakog lanca mogu biti skraćeni kao LCDR1,LCDR2 i LCDR3. Izraz antitelo "visokog afiniteta"<se odnosi se na antitelo koje ima K>D<u odnosu na njegov>ciljni epitop od oko 10<-9>M ili niže (npr., oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). U jednoj realizaciji, KDje izmerena površinskom plazmonskom rezonancom, npr. BIACORE ™; u drugoj realizaciji, KDje izmerena pomoću ELISA.
[0096] Izraz "bispecifično antitelo" uključuje antitelo sposobno da selektivno vezuje dva ili više epitopa. Bispecifična antitela obično sadrže dva teška lanca koja nisu identična, sa svakim teškim lancem koji specifično vezuje različiti epitop bilo na dva različita molekula (npr., različiti epitopi na dva različita imunogena) ili na istom molekulu (npr., različiti epitopi na istom imunogenu). Ako je bispecifično antitelo sposobno za selektivno vezivanje dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet prvog teškog lanca za prvi epitop će generalno biti najmanje jedan do dva ili tri ili četiri ili više reda veličine niži od afiniteta prvog teškog lanca za drugi epitop i obrnuto. Epitopi koji su specifično vezani bispecifičnim antitelom, mogu biti na istom ili različitom cilju (npr. na istom ili različitom proteinu). Bispecifična antitela se mogu dobiti, na primer, kombinovanjem teških lanaca koji prepoznaju različite epitope istog imunogena. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne sekvence teškog lanca koje prepoznaju različite epitope istog imunogena, mogu biti spojene sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju iste ili različite konstantne regione teškog lanca, a takve sekvence mogu biti eksprimirane u ćeliji koja izražava imunoglobulinski laki lanac. Tipično bispecifično antitelo ima dva teška lanca od kojih svaki<ima tri CDR-a teškog lanca, praćena>pomoću (N-terminala do C-terminala) CH1 domena, zgloba, CH2 domena i CH3 domena i laki lanac imunoglobulina koji ili ne daje specifičnost za vezivanje epitopa, alikoji se može udružiti sa svakim teškimlancem, ili koji se može povezati sa svakim teškim lancem i koji može da veže jedan ili više epitopa vezanih regionima za vezivanje epitopa teškog lanca, ili koji se može povezati sa svakim teškim lancem i omogućiti vezivanje jednog ili oba teška lanca za jedan ili oba epitopa.
[0097] Izraz "ćelija" uključuje bilo koju ćeliju koja je pogodna za ekspresiju sekvence rekombinantne nukleinske kiseline. Ćelije uključuju one od prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr. sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. itd.), ćelije mikobakterija, ćelije gljivica, ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), životinjske ćelije koje nisu humane, ljudske ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim realizacijama ćelija je ćelija čoveka, majmuna, majmuna, hrčka, pacova ili miša. U nekim realizacijama ćelija je eukariotska i odabrana je od sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr. BHK21),
Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562,
Sertolijevih ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, tumorskih ćelija i ćelijske linije izvedene iz gore pomenute ćelije.
U nekim realizacijama ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr., ćelija retine koja eksprimira virusni gen (npr. ćelija PER.C6 ™).
[0098] Izraz "region za određivanje komplementarnosti", ili izraz "CDR", uključuje aminokiselinsku sekvencu kodiranu pomoću sekvence nukleinske kiseline imunoglubilinskih gena organizma koji se normalno (tj. kod životinje divljeg tipa) pojavljuju između dva okvirna regiona u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca molekule imunoglobulina (na primer, antitelo ili T ćelijski receptor). CDR može biti kodiran od strane, na primer, sekvence germinativne linije ili preuređene ili neuređene sekvence, i, na primer, naivnom ili zrelom B ćelijom ili T ćelijom. CDR može biti somatski mutiran (npr., varira od sekvence kodirane u životinjskoj germinativnoj liniji), humanizovan i / ili modifikovan sa aminokiselinskim supstitucijama, dodavanjima ili brisanjima. U nekim okolnostima (npr., za CDR3), CDR regioni mogu biti kodirani od strane dve ili više sekvenci (npr., sekvence germinativne linije) koje nisu susedne (npr., u neuređenoj sekvenci nukleinske kiseline), ali su povezane u sekvenci nukleinske kiseline iz B ćelije., npr., kao rezultat spajanja ili povezivanja sekvenci (npr. V-D-J rekombinacija za obrazovanje CDR3 teškog lanca).
[0099] Izraz "konzervativan", kada se koristi za opisivanje konzervativne supstitucije aminokiselina, uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naboj ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalna svojstva od interesa za protein, na primer, sposobnost varijabilnog regiona da specifično vezuje ciljni epitop sa željenim afinitetom. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju, alifatične bočne lance poput glicina, alanina, valina, leucina i izoleucina; alifatične- hidroksilne bočne lance, kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovne bočne lance kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su aspartanska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim realizacijama, konzervativna supstitucija aminokiselina može biti supstitucija bilo kog nativnog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, mutagenezi za skeniranje alanina. U nekim realizacijama, napravljena je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u matrici log- verovatnoće PAM250 prikazanoj od strane Gonnet i sar. (1992) Iscrpno uparivanje celokupne baze podataka proteinske sekvence, Science 256: 1443-45. U nekim realizacijama, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima vrednost koja nije negativna u matrici log-verovatnoće PAM250.
[0100] U nekim realizacijama, položaji ostataka u lakom ili teškom lancu imunoglobulina razlikuju se pomoću jedne ili više konzervativnih supstitucija aminokiselina. U nekim realizacijama, položaji ostataka u lakom lancu imunoglobulina ili njegovom funkcionalnom fragmentu (npr., fragment koji omogućava ekspresiju i izlučivanje iz npr. B ćelije) nisu identični lakom lancu čija je aminokiselinska sekvenca ovde navedena, ali se razlikuje pomoću jedne ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija.
[0101] Izraz "protein za vezivanje epitopa" uključuje protein koji ima najmanje jedan CDR i koji je sposoban da selektivno prepoznaje epitop, npr., sposoban je za vezivanje epitopa sa konstantnom<disocijacije KD koja je>oko jedan mikromolarna ili niža (npr., KDkoji je oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). Terapeutski proteini koji se vezuju za<epitope (npr., terapeutska antitela)>često zahtevaju KDkoji je u nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu.
[0102] Izraz "funkcionalni fragment" uključuje fragmente proteina za vezivanje epitopa koji se mogu eksprimirati, izlučiti i specifično vezati za epitop sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu. Specifično prepoznavanje uključuje KD koji je najmanje u mikromolarnomopsegu, nanomolarnom ilipikomolarnom opsegu.
[0103] Izraz "germinativna linije" uključuje referencu na sekvencu nukleinske kiseline imunoglobulina u nesomatski mutiranim ćelijama, npr., B ćelija koja nije somatski mutirana ili pre-B ćelija ili hematopoetska ćelija.
[0104] Izraz "teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina" uključuje sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz bilo kojeg organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri CDR-a teškog lanca i četiri regiona FR, osim ako nije drugačije navedeno. Fragmenti teških lanaca uključuju CDR regione, CDR regione i FR regione i njihove kombinacije. Tipični teški lanac ima, prateći varijabilni<domen (od N-terminala>do C-terminala), CH1 domen, šarku, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalnifragment teškog lanca uključujefragment koji je sposoban za specifično prepoznavanje epitopa (npr.,<prepoznavanje epitopa sa KD u>mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu), koji može dase eksprimira i izlučuje iz ćelije, ikoji sadrži najmanje jedan CDR region.
[0105] Izraz "identičnost" kada je korišćen u vezi sa sekvencom, uključuje identičnost kao što je određeno brojem različitih algoritama poznatih u struci, koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotidnih i/ili aminokiselinskih sekvenci. U nekim ovde opisanim realizacijama, identičnosti se određuju korišćenjem ClustalW v.1.83 (sporo) poravnanja korišćenjem kaznenog otvorenog razmaka od 10,0, kaznenog produženog razmaka od 0,1 i korišćenjem Gonnet-ove matrice sličnosti (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužine sekvenci poređenih u odnosu na identičnost sekvenci zavisiće od određenih sekvenci, ali u slučaju konstantnog domena lakog lanca, dužina treba da sadrži sekvencu dovoljno dužine da se uvije u konstantni domen lakog lanca koji je sposoban za samo-povezivanje da obrazuje pravilan konstantni domen lakog lanca, npr., sposoban za obrazovanje dva beta lista koji sadrže<beta lance i sposobne da stupaju u interakciju sa>najmanje jednim CH1 domenom čoveka ili miša. U slučaju CH1 domena, dužina sekvence treba da sadrži<sekvencu dovoljne dužine da se preklopi u C>H<1 domen koji>može da obrazuje dve beta ploče koje sadrže betalance i sposobne da stupaju u interakciju sa najmanje jednim konstantnim domenom lakog lanca miša ili čoveka.
[0106] Fraza "molekul imunoglobulina" uključuje dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina. Teški lanci mogu biti identični ili različiti, a laki lanci mogu biti identični ili različiti.
[0107] Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu lakih lanaca imunoglobulina iz bilo kojeg organizma, i ako nije drugačije naznačeno, uključuje humane κ i λ lake lance i VpreB, kao i lake lance surogata. Varijabilni<domeni>lakog lanca (VL) obično uključuju tri CDR-a lakog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, osim akonije drugačijespecifikovano. Generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino završetka do<karboksilnog završetka,>VL domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i konstantnidomen lakog lanca. Laki lanciuključuju one, npr., koji ne vezuju selektivno ili prvi ili drugi epitop selektivno vezan od strane proteina koji vezuje epitope u kome se oni pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju, one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu u vezivanju i prepoznavanju, jednog ili više epitopa selektivno vezanih proteinom koji se vezuje za epitope u kome se oni pojavljuju.
[0108] Univerzalni laki lanci ili zajednički laki lanci, odnose se na lake lance napravljene u miševima, kao što je ovde opisano, pri čemu su miševi visoko ograničeni u izboru genskih segmenata koji su dostupni za izradu varijabilnog domena lakog lanca. Kao rezultat, takvi miševi prave laki lanac izveden iz, u jednoj realizaciji, ne više od jednog ili dva neuređena V segmenta lakog lanca i ne više od jednog ili dva neuređena J segmenta lakog lanca (npr., jedan V i jedan J, dva V i jedan J, jedan V i dva J, dva V i dva J). U jednoj realizaciji, ne više od jedne ili dve preuređene V/J sekvence lakog lanca, npr., preuređena humana Vκ1-39Jκ5 sekvenca ili preuređena humana Vκ3-20Jκ1 sekvenca. U različitim realizacijama univerzalni laki lanci uključuju somatski mutirane (npr., afinitetno sazrele) verzije.
[0109] Izraz "somatski mutirana" uključuje referencu na sekvencu nukleinske kiseline iz B ćelije koja je prošla klasno prebacivanje, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina (npr., varijabilnog domena teškog lanca, ili uključujući sekvencu CDR ili FR teškog lanca) u klasno- prebačenoj B-ćeliji nije identična sekvenci nukleinske kiseline u B ćeliji pre prebacivanja klase, kao što je, na primer, razlika u sekvenci nukleinske kiseline CDR-a ili okvira između B ćelije koja nije prošla klasno prebacivanje i B ćelije koja je prošla klasno prebacivanje. "Somatski mutirane" uključuju referencu na sekvence nukleinskih kiselina iz B ćelija sazrelih prema afinitetu koje nisu identične prema odgovarajućim sekvencama varijabilnog regiona imunoglobulina u B ćelijama koje nisu sazrele prema afinitetu (tj. sekvencama u genomu ćelija germinativne linije). Izraz "somatski mutirana" takođe uključuje referencu na sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina iz B ćelije nakon izlaganja B ćelije epitopu od interesa, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline razlikuje od odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline pre izlaganja B ćelije epitopu od interesa. Izraz "somatski mutirana" se odnosi na sekvence antitela koje su generisane u životinji, npr., mišu koji ima sekvence nukleinskih kiselina varijabilnog regiona humanog imunoglobulina, kao odgovor na izazov imunogena, i koji rezultira iz selekcionih postupaka inherentno operativnih u takvoj životinji.
[0110] Izraz "neuređena", sa referencom prema sekvenci nukleinske kiseline, uključuje sekvence nukleinskih kiselina koje postoje u germinativnoj liniji životinjske ćelije.
[0111] Izraz "varijabilni domen" uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog ili teškog lanca imunoglobulina (modifikovan kao što je željeno) koji sadrži sledeće regione aminokiselina, u sekvenci od N-terminala do C-terminala (osim ako nije drugačije naznačeno): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Miševi sa humanizovanim imunoglobulinskim lokusima
[0112] Miš kao genetski model je uveliko poboljšan transgenskim i knockout tehnologijama, koje su omogućile proučavanje efekata usmerene prekomerne ekspresije ili brisanja specifičnih gena. Uprkos svih njihovih prednosti, miš i dalje predstavlja genetske prepreke koje ga čine nesavršenim modelom za humane bolesti i nesavršenu platformu za testiranje humanih terapeutika ili za njihovo pravljenje. Prvo, iako oko 99% humanih gena ima mišjeg homologa (Waterston, R.H., i sar. (2002). Početno sekvenciranje i uporedna analiza mišjeg genoma. Nature 420, 520-562.), potencijalni terapeutici često ne uspevaju da reaguju unakrsno ili neadekvatno reaguju unakrsno, sa mišjim ortolozima određenih humanih ciljeva. Da bi se otklonio ovaj problem, odabrani ciljni geni mogu biti „humanizovani“, to jest, mišji gen može biti eliminisan i zamenjen odgovarajućom humanom ortolognom sekvencom gena (npr. US 6,586,251, US 6,596,541 i US 7,105,348). Inicijalno, napori za humanizacijom mišjih gena od strane strategija „knockout plus-transgena humanizacija“ podrazumevali su ukrštanje miša koji nosi deleciju (tj. knockout) endogenog gena sa mišom koji nosi slučajno integrisani humani transgen (videti, npr., Bril, W.S. i sar. (2006). Tolerancija na faktor VIII u transgenom mišu koji izražava cDNK humanog faktora VIII koja nosi Arg (593) do Cis supstitucije. Thromb Haemost 95, 341-347; Homanics, G.E. i sar. (2006). Proizvodnja i karakterizacija modela miševa klasičnih i srednjih bolesti urina mirisa javorovog sirupa. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D. i sar. (2006). Humani BAC transgeni / knockout model miša za HbE / beta-talasemiju. Genomics 88 (3): 309-15; Pan, Q. i sar. (2006). Različita uloga za mišji i humani CD3delta/epsilon heterodimer u preT ćelijskoj receptorskoj (preTCR) funkciji: humani CD3delta/epsilon heterodimer obnavlja oštećenu funkciju preTCR kod miševa sa nedostatkom CD3gamma i CD3gammadelta. Mol Immunol 43, 1741-1750). Ali ti napori su ometani ograničenjima veličine; konvencionalne knockout tehnologije nisu bile dovoljne da direktno zamene velike mišje gene sa njihovim velikim humanim genomskim duplikatima. Pravi pristup direktne homologne zamene, u kome je endogeni gen miša direktno zamenjen humanom kopijom gena na istoj preciznoj genetskoj lokaciji mišjeg gena (tj., na endogenom lokusu miša), se retko pokušava zbog tehničkih poteškoća. Do sada su napori u direktnoj zameni uključivali razrađene i teške postupke, ograničavajući tako dužinu genetskog materijala kojim se može rukovati i preciznost sa kojom se njime može manipulisati.
[0113] Egzogeno uvedeni humani imunoglobulinski transgeni se preuređuju u prekursorskim B-ćelijama u miševima (Alt, F.W., Blackwell, T.K., i Yancopoulos, G.D., 1985). Imunoglobulinski geni u transgenim miševima. Trends Genet 1, 231-236). Ovo otkriće je iskorišćeno pomoću konstruisanih miševa koristeći knockout-plus-transgeni pristup za eksprimiranje humanih antitela (Green, L.L. i sar. (1994). Humana monoklonska antitela specifična za antigen od miševa proizvedenih sa humanim Ig teškim i lakim lancem YACs. Nat Genet 7, 13-21; Lonberg, N. (2005). Humana antitela transgenih životinja. Nat Biotechnol 23, 1117-1125; Lonberg, N. i sar. (1994). Humana antitela specifična za antigen od miševa, koja sadrže četiri različite genetske modifikacije. Nature 368, 856-859; Jakobovits, A. i sar. (2007). Od Ksenomišje tehnologije do panitumumaba, prvog potpuno humanog proizvoda antitela iz transgenih miševa. Nat Biotechnol 25, 1134-1143). Teški lanac endogenog imunoglobulina miša i lokusi lakog lanca κ su inaktivirani kod ovih miševa ciljanom delecijom malih, ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, praćenom uvođenjem humanih imunoglobulinskih genskih lokusa kao slučajno integrisani veliki transgeni, kao što je gore opisano, ili minihromozomi (Tomizuka, K. i sar. (2000). Dvostruki transhromozomski miševi:
održavanje dva pojedinačna fragmenta humanog hromozoma koji sadrže Ig teške i kappa lokuse i ekspresija potpuno humanih antitela. Proc Natl Acad Sci USA 97, 722-727). Takvi miševi su predstavljali važan napredak u genetskom inženjeringu; potpuno humana monoklonska antitela izolovana od njih dala su obećavajući terapeutski potencijal za lečenje različitih humanih bolesti (Gibson, T.B. i sar. (2006). Randomizovani rezultati ispitivanja faze III panitumumaba, potpuno humanog monoklonskog antitela, receptora protiv epidermalnog faktora rasta kod metastatskog kolorektalnog karcinoma. Clin Colorectal Cancer 6, 29-31; Jakobovits i sar., 2007; Kim, Y.H. i sar. (2007). Klinička efikasnost zanolimumaba (HuMax-CD4): dve studije faze II kod refraktornog kožnog T-ćelijskog limfoma. Blood 109 (11): 4655- 62; Lonberg, 2005; Maker, A.V., i sar. (2005). Regresija tumora i autoimunost kod pacijenata lečenih blokadom antigena 4 povezanom sa citotoksičnim T limfocitima i interleukinom 2: faza I/II studije. Ann Surg Oncol 12, 1005-1016; McClung, M.R., i sar. (2006). Denosumab kod žena u postmenopauzi sa niskom mineralnom gustinom kostiju. N Engl J Med 354, 821-831). Ali, kao što je gore razmatrano, ovi miševi pokazuju kompromitovani razvoj B-ćelija i imunski deficit u poređenju sa miševima divljeg tipa. Takvi problemi potencijalno ograničavaju sposobnost miševa da podrže snažan humoralni odgovor i, sledstveno tome, stvaraju potpuno humana antitela protiv nekih antigena. Nedostaci mogu biti posledica:
(1) neefikasne funkcionalnosti usled nasumičnog uvođenja humanih imunoglobulinskih transgena i rezultirajući pogrešnom ekspresijom usled nedostatka ushodnih i nishodnih kontrolnih elemenata (Garrett, F.E. i sar. (2005). Hromatinska arhitektura blizu potencijalnog 3' kraja Igh lokusa uključuje modularnu regulaciju histonskih modifikacija tokom razvoja B ćelija i in vivo zauzimanje na CTCF lokacijama. Mol Cell Biol 25, 1511-1525; Manis, J. P., i sar. (2003).
Tumačenje nishodne granice 3' IgH regulatornog regiona. Mol Immunol 39, 753-760; Pawlitzky, I., i sar. (2006). Identifikacija potencijalnog regulatornog elementa unutar 5' bočnog regiona mišjeg Igh lokusa definisanog pro-B ćelijskom specifičnom hipersenzibilnošću povezanom sa vezivanjem PU.1, Pax5 i E2A. J Immunol 176, 6839-6851); (2) neefikasna interakcija među tipovima između humanih konstantnih domena i mišjih komponenata signalnog kompleksa receptora B ćelija na ćelijskoj površini, koja može narušiti signalizacijske procese potrebne za normalno sazrevanje, proliferaciju i opstanak B ćelija (Hombach, J., i sar. (1990). Molekularne komponente receptorskog kompleksa B ćelijskog antigena klase IgM. Nature 343, 760-762); i (3) neefikasne interakcije među tipovima između rastvorljivih humanih imunoglobulina i mišjih Fc receptora koja može umanjiti selekciju afiniteta (Rao, S.P., i sar. (2002). Diferencijalna ekspresija inhibitornog IgG Fc receptora FcgammaRIIB na ćelijama germinalnog centra: implikacije za selekciju B ćelija visokog afiniteta. J Immunol 169, 1859-1868) i serumske koncentracije imunoglobulina (Brambell, F.W., i sar. (1964). Teoretski model katabolizma gama-globulina. Nature 203, 1352-1354; Junghans, R.P., i Anderson, C.L. (1996). Zaštitni receptor za IgG katabolizam je neonatalni intestinalni transportni receptor koji sadrži beta2-mikroglobulin. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512- 5516; Rao i sar., 2002; Hjelm, F. i sar. (2006). Regulacija imunskog odgovora posredovana antitelom. Scand J Immunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F. i Ravetch, J. V. (2007). Fc-receptori kao regulatori imuniteta. Adv Immunol 96, 179-204). Ovi nedostaci se mogu ispraviti in situ humanizacijom samo varijabilnih regiona mišjeg imunoglobulinskog lokusa unutar njihovih prirodnih lokacija na endogenim lokusima teškog i lakog lanca. Ovo bi efektivno rezultiralo miševima koji stvaraju reverzna himerna (tj. humana V: mišja C) antitela koja bi bila sposobna za normalne interakcije i selekciju sa mišjim okruženjem, bazirano na zadržavanja konstantnih regiona miša.
Dalje, takva reverzna himerna antitela se lako ponovo formatiraju u potpuno humana antitela za terapeutske svrhe.
[0114] Opisana je metoda za veliku in situ genetsku zamenu imunoglobulinskih varijabilnih gena germinativne linije miša sa imunoglobulinskim varijabilnim genima humane germinativne linije uz održavanje sposobnosti miševa da stvaraju potomstvo. Specifično je opisana precizna zamena šest megabaza varijabilnih genskih lokusa imunoglobulina oba mišjeg teškog lanca i κ lakog lanca sa njihovim humanim kopijama, ostavljajući nepromenjene konstantne regione miša. Kao rezultat, stvoreni su miševi koji imaju preciznu zamenu njihovog celokupnog imunoglobulinskog varijabilnog repertoara germinativne linije sa ekvivalentnim imunoglobulinskim varijabilnim sekvencama humane germinativne linije, uz zadržavanje konstantnih regiona miša. Humani varijabilni regioni su povezani sa mišjim konstantnim regionima da obrazuju himerne humanemišje imunoglobulinske lokuse koji se preuređuju i izražavaju pri fiziološki podesnim nivoima. Izražena antitela su "reverzne himere", tj. ona sadrže sekvence humanog varijabilnog regiona i sekvence mišjeg konstantnog regiona. Ovi miševi koji imaju humanizovane imunoglobulinske varijabilne regione koji izražavaju antitela koja imaju humane varijabilne regione i mišje konstantne regione se nazivaju VELOCIMMUNE® humanizovani miševi.
[0115] VELOCIMMUNE® humanizovani miševi pokazuju potpuno funkcionalan humoralni imunski sistem koji se u osnovi ne razlikuje od onog kod divljih miševa. Oni prikazuju normalnu ćelijsku populaciju u svim fazama razvoja B ćelije. Oni pokazuju normalnu morfologiju limfoidnih organa. Sekvence antitela humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® pokazuju normalno preuređivanje varijabilnog segmenta i normalnu somatsku hipermutaciju. Populacije antitela u ovim miševima odražavaju izotipske distribucije koje su rezultat prebacivanja normalne klase (npr., normalno izotipsko cis-prebacivanje). Imunizacija humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® rezultira snažnim humoralnim odgovorima koji stvaraju veliku raznolikost antitela koja imaju humane imunoglobulinske varijabilne domene pogodnih kao terapeutski kandidati. Ova platforma obezbeđuje obilje izvora sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sazrelih u afinitetu, za izradu farmaceutski prihvatljivih antitela i drugih proteina za vezivanje antigena.
[0116] Precizna zamena varijabilnih sekvenci imunoglobulina miša sa varijabilnim sekvencama humanog imunoglobulina omogućava izradu VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa. Ipak, čak i precizna zamena endogenih mišjih imunoglobulinskih sekvenci na lokusima teškog i lakog lanca sa ekvivalentnim sekvencama humanog imunoglobulina, sekvencijalnom rekombinacijom veoma velikih raspona sekvenci humanog imunoglobulina može predstavljati određene izazove usled divergentne evolucije imunoglobulinskih lokusa između miša i čoveka. Na primer, međugenske sekvence rasute unutar imunoglobulinskih lokusa nisu identične između miševa i ljudi, i u nekim slučajevima, ne mogu biti funkcionalno ekvivalentne. Razlike između miševa i ljudi u njihovim imunoglobulinskim lokusima mogu još uvek rezultirati abnormalnostima kod humanizovanih miševa, posebno kada se humanizuje ili manipuliše određenim delovima endogenih mišjih lokusa teškog lanca imunoglobulina. Neke modifikacije mišjeg lokusa imunoglobulinskog teškog lanca su štetne. Štetne modifikacije mogu uključivati, na primer, gubitak sposobnosti modifikovanih miševa da se pare i stvaraju potomstvo.
[0117] Izvršena je precizna in situ, velike razmere, zamena šest megabaza varijabilnih regiona imunoglobulinskih lokusa mišjeg teškog i lakog lanca (VH-DH-JHi Vκ-Jκ) sa odgovarajućim humanim genomskim sekvencama od 1,4 megabaze, ostavljajući bočne sekvence miša netaknutim i funkcionalnim unutar hibridnog lokusa, uključujući sve gene sa konstantnim lancem miša i lokusne transkripcione<kontrolne>regione (Slika 1). Specifično, humane sekvence gena VH, DH, JH, Vκ i Jκ su uvedene postupnimumetanjem 13himernih BAC vektora za ciljanje koji nose preklapajuće fragmente varijabilnih lokusa humane germinativne linije u mišje ES ćelije, koristeći VELOCIGENEO tehnologiju genetskog inženjeringa (videti npr. Američki patent br.6,586,251 i Valenzuela, DM i sar. (2003). Inženjering visoko propusne moći mišjeg genoma zajedno sa analizom ekspresije visoke rezolucije. Nat Biotechnol 21, 652- 659).
[0118] Humanizacija gena mišjeg imunoglobulina predstavlja najveću genetsku modifikaciju mišjeg genoma do danas. Dok su se prethodni napori sa nasumično integrisanim transgenima humanog imunoglobulina susreli sa izvesnim uspehom (gore razmatrano), direktna zamena gena mišjeg imunoglobulina sa njihovim humanim kopijama dramatično povećava efikasnost kojom potpuno humana antitela mogu biti efikasno generisana u inače normalnim miševima. Dalje, takvi miševi pokazuju dramatično povećanu raznolikost potpuno humanih antitela koja se mogu dobiti nakon imunizacije sa zapravo bilo kojim antigenom, u poređenju sa miševima koji nose onesposobljene endogene lokuse i transgene potpuno humanih antitela. Višestruke verzije zamenjenih, humanizovanih lokusa pokazuju potpuno normalne nivoe zrelih i nezrelih B ćelija, za razliku od miševa sa nasumično integrisanim ljudskim transgenima, koji pokazuju značajno smanjenu populaciju B ćelija u različitim fazama diferencijacije. Iako su napori da se poveća broj segmenata humanog gena u humanim transgenim miševima smanjili takve nedostatke, prošireni imunoglobulinski repertoari nisu zajedno korigovali smanjenja u populacijama B ćelija u poređenju sa divljim tipom miševa.
[0119] Uprkos humoralne imunske funkcije blizu divljeg tipa, primećene kod miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima, susreću se i drugi izazovi kod korišćenja direktne zamene imunoglobulina koji se ne susreće u nekim pristupima koji koriste slučajno integrisane transgene. Razlike u genetskom sastavu imunoglobulinskih lokusa između miševa i ljudi doveli su do otkrića sekvenci korisnih za razmnožavanje miševa sa zamenjenim segmentima gena imunoglobulina. Specifično, mišji ADAM geni smešteni unutar endogenog lokusa imunoglobulina su optimalno prisutni kod miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima, usled njihove uloge u plodnosti.
Genomska lokacija i funkcija mišjeg ADAM6
[0120] Mužjaci miševa kojima nedostaje sposobnost ekspresije bilo kojeg funkcionalnog proteina ADAM6 pokazuju ozbiljne nedostatke u sposobnosti miševa da se pare i stvaraju potomstvo. Miševima nedostaje sposobnost ekspresije funkcionalnog ADAM6 proteina zahvaljujući zameni svih ili suštinski svih genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulina miša sa genskim segmentima humanog varijabilnog regiona. Gubitak ADAM6 funkcije rezultira zato što se lokus ADAM6 nalazi unutar regiona genskog lokusa varijabilnog regiona endogenog mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, proksimalno 3'<kraju lokusa VH>genskog segmenta koji je ushodno od segmenta gena DH. Da bi se uzgajali miševi koji suhomozigotni zazamenu svih ili suštinski svih endogenih mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sa varijabilnim genskim segmentima humanog teškog lanca, generalno je glomazan pristup za postavljanje mužjaka i ženki koji su svaki homozigotni za zamenu i čekaju produktivno parenje. Uspešna legla su relativno retka, a prosečna veličina legla je vrlo niska. Umesto toga, heterozigotni mužjaci za zamenu su angažovani za parenje sa homozigotnim ženkama za zamenu kako bi se generisalo potomstvo koje je heterozigotno za zamenu, a potom od njih uzgajao homozigotni miš. Pronalazači su utvrdili da je verovatni uzrok gubitka plodnosti kod mužjaka miševa odsustvo funkcionalnih proteina ADAM6 u homozigotnim mušjacima miševa.
[0121] ADAM6 protein je član proteinske familije ADAM, gde je ADAM skraćenica za A Disintegrin And Metalloprotease. Familija ADAM proteina je velika i raznolika, sa raznim funkcijama. Neki članovi familije ADAM su umešani u spermatogenezu i oplodnju. Na primer, ADAM2 kodira podjedinicu proteina fertilin,
31
koji je umešan u interakcijama sperma-jaje. ADAM3, ili ciritestin, čini se potrebnim za vezivanje sperme za zonu pellucida. Odsustvo ADAM2 ili ADAM3 rezultira neplodnošću. Pretpostavljeno je da ADAM2, ADAM3 i ADAM6 obrazuju kompleks na površini ćelija mišje sperme.
[0122] Čini se da je humani gen ADAM6, koji se obično nalazi između humanih VHsegmenata gena VH1- 2 i VH6-1 pseudogen (slika 12). Kod miševa, postoje dva gena ADAM6 - ADAM6a i ADAM6b koji se nalaze u međugenskom regionu između mišjih VHi DHgenskih segmenata, a kod miša su a i b geniorijentisani utranskripcionoj orijentaciji suprotno onoj transkripcionoj orijentaciji okolnih segmenata gena imunoglobulina (slika 11). Kod miševa je za normalnu oplodnju očigledno potreban funkcionalni ADAM6 lokus. Funkcionalni ADAM6 lokus ili sekvenca, zatim, odnosi se na ADAM6 lokus ili sekvencu koja može dopuniti ili spasiti drastično smanjenu oplodnju ispoljenu kod mužjaka miševa sa nedostajućim ili oštećenim endogenim ADAM6 lokusima.
[0123] Položaj intergenske sekvence kod miševa koja kodira ADAM6a i ADAM6b čini intergensku sekvencu podložnom modifikaciji prilikom modifikacije endogenog mišjeg teškog lanca. Kada su obrisani<ili zamenjeni>segmenti gena VHili kada su obrisani ili zamenjeni segmenti gena DH, postoji velikaverovatnoća da ćerezultirajući miš ispoljiti ozbiljan deficit plodnosti. Da bi se nadoknadio deficit, miš je modifikovan tako da uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji će dopuniti gubitak u aktivnosti ADAM6 usled modifikacije endogenog mišjeg lokusa ADAM6. U različitim realizacijama, komplementirajuća nukleotidna sekvenca je ona koja kodira mišji ADAM6a, mišji ADAM6b ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji spašava deficit plodnosti.
[0124] Nukleotidna sekvenca koja spašava plodnost, može biti smeštena u bilo kom pogodnom ektopičnom položaju. Može biti smeštena u bilo kom pogodnom ektopičnom položaju u genomu. U jednoj realizaciji, nukleotidna sekvenca može biti uvedena u transgenu koji se nasumično integriše u mišji genom. U jednoj realizaciji, sekvenca može biti održavana epizomalno, to jest na odvojenoj nukleinskoj kiselini, radije nego na mišjem hromozomu. Pogodni položaji uključuju položaje koji su transkripciono dozvoljeni ili aktivni, na primer, ROSA26 lokus.
[0125] Izraz "ektopičan" je namenjen da uključuje pomeranje ili postavljanje na položaj koji se u prirodi obično ne nalazi (npr., postavljanje sekvence nukleinske kiseline na položaj koji nije isti položaj kao što je sekvenca nukleinske kiseline nađena kod miša divljeg tipa). Izraz je u različitim realizacijama korišćen u smislu da njegov objekt nije u njegovom normalnom ili pravilnom položaju. Na primer, fraza "ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira ..." odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se pojavljuje na položaju u kojem se obično ne nalazi kod miša. Na primer, u slučaju ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji protein ADAM6 (ili njegov ortolog, homolog ili njegov fragment koji obezbeđuje istu ili sličnu korist plodnosti kod mužjaka miševa), sekvenca se može postaviti na različitom položaju u mišjem genomu nego što je obično nađeno kod miševa divljih vrsta. Funkcionalni homolog ili ortolog mišjeg ADAM6 je sekvenca koja omogućava spasavanje od gubitka plodnosti (npr. gubitak sposobnosti mužjaka miša da generiše potomstvo parenjem) koji je primećen kod ADAM6<-/->miša. Funkcionalni homolozi ili ortolozi uključuju proteine koji imaju najmanje oko 89% identičnosti ili više, na primer, do 99% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6a i / ili sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6b, a koji mogu dopuniti ili spasiti sposobnost za uspešno parenje, kod miša koji ima genotip koji uključuje brisanje ili nokaut ADAM6a i / ili ADAM6b.
32
[0126] Ektopičan položaj može biti bilo gde (npr., kao sa slučajnim ubacivanjem transgena koji sadrži mišju ADAM6 sekvencu), ili može biti, na primer, na položaju koji približava (ali nije precizno isti) njegovu lokaciju kod divljeg tipa miša (npr., u modifikovanom endogenom lokusu imunoglobulina miša, ali bilo ushodno ili nishodno od njegovog prirodnog položaja, npr., unutar modifikovanog lokusa imunoglobulina, ali između različitih segmenata gena, ili na različitom položaju u sekvenci intergena V- D miša). Jedan primer ektopičnog postavljanja je smeštanje unutar humanizovanog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. Na primer, miš kojisadrži zamenu jednog ili više segmenata endogenog<gena V>H<sa segmentima humanog gena V>H<, pri čemu>zamena uklanja endogenu ADAM6 sekvencu, može biti konstruisan da ima mišju ADAM6 sekvencu smeštenu<unutar sekvence koja sadrži humane V>H<genske>segmente. Rezultujuća modifikacija bi generisala (ektopičnu)mišju ADAM6 sekvencu unutar sekvence humanog gena, a (ektopično) postavljanje mišje ADAM6 sekvence unutar sekvence humanog gena može približiti položaj humanog pseudogena ADAM6 (tj. između dva V segmenta) ili može aproksimirati položaj mišje ADAM6 sekvence (tj. unutar V-D međugenskog regiona).
[0127] U različitim aspektima, miševi koji sadrže delecije ili zamene endogenog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca ili njegovih delova, mogu biti napravljeni da sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji daje slične koristi plodnosti sa mišjim ADAM6 (npr., ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša). Ektopična nukleotidna sekvenca može da uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji je homolog ili ortolog ADAM6 (ili njegov fragment) različitog mišjeg soja ili različitih vrsta, npr., različitih vrsta glodara i koji daje dobit plodnosti, npr., povećani broj legla tokom određenog vremenskog perioda i / ili povećani broj mladunaca po leglu i / ili sposobnost spermatozoida mužjaka miša da pređe kroz jajovod miša da oplodi mišje jaje.
[0128] U jednoj realizaciji, ADAM6 je homolog ili ortolog koji je najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6 proteinom (npr., najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6a ili mišjim ADAM6b). U jednoj realizaciji, ektopična nukleotidna sekvenca kodira jedan ili više proteina nezavisno izabranih iz proteina koji je najmanje 89% identičan mišjem ADAM6a, proteina koji je najmanje 89% identičan mišjem ADAM6b i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, homolog ili ortolog je protein pacova, hrčka, miša ili morskog praseta koji je ili modifikovan da bude približno identičan 89% ili više mišjem ADAM6a i / ili mišjem ADAM6b. U jednoj realizaciji, homolog ili ortolog je identičan 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% mišjem ADAM6a i / ili mišjem ADAM6b.
Ektopični ADAM6 kod miševa sa humanizovanim teškim lancem
[0129] Miševi koji proizvode humana antitela su sada dostupni već neko vreme. Iako predstavljaju važan napredak u razvoju humanih terapijskih antitela, ovi miševi pokazuju niz značajnih abnormalnosti koje ograničavaju njihovu korisnost. Na primer, oni prikazuju kompromitovani razvoj B ćelija. Kompromitovani razvoj može biti usled niza razlika između transgenih miševa i miševa divljeg tipa.
[0130] Humana antitela možda neće optimalno stupati u interakciju sa mišjim preB ćelijskim ili B ćelijskim receptorima na površini ćelija miša koji signaliziraju sazrevanje, proliferaciju ili opstanak tokom klonske selekcije. Potpuno humana antitela možda neće optimalno intereagovati sa mišjim sistemom Fc receptora; miševi izražavaju Fc receptore koji ne prikazuju slaganje jedan na jedan sa humanim Fc receptorima. Konačno, razni miševi koji prave potpuno humana antitela ne uključuju sve izvorne mišje sekvence, npr., elemente za nishodno poboljšanje i druge elemente za kontrolu lokusa, koji mogu biti potrebni za razvoj B ćelija divljeg tipa.
[0131] Miševi koji generišu potpuno humana antitela obično sadrže endogene imunoglobulinske lokuse koji su na neki način onesposobljeni, a humani transgeni koji sadrže varijabilne i konstantne segmente gena imunoglobulina su uvedeni na slučajnu lokaciju u mišjem genomu. Sve dok je endogeni lokus dovoljno onemogućen toliko u svojstvu da ne preuređuje genske segmente da bi obrazovao funkcionalni gen imunoglobulina, cilj izrade potpuno humanih antitela kod takvog miša se može postići iako uz kompromitovani razvoj B ćelija.
[0132] Iako su prisiljeni da izrađuju potpuno humana antitela iz humanog transgenog lokusa, generisanje humanih antitela u mišu je očigledno nepodesan proces. Kod nekih miševa, postupak je toliko nepovoljan da rezultira formiranjem humanih varijabilnih / mišjih konstantnih teških lanaca (ali ne lakih lanaca) preko mehanizma trans-prebacivanja. Ovim mehanizmom, transkripti koji kodiraju potpuno humana antitela prolaze izotipsko prebacivanje u trans iz humanog izotipa do mišjeg izotipa. Proces je u trans, jer se potpuno humani transgen nalazi nezavisno od endogenog lokusa koji zadržava neoštećenu kopiju gena konstantnog regiona teškog lanca miša. Iako je kod takvih miševa trans-prebacivanje brzo očigledno, fenomen je još uvek nedovoljan za spasavanje B ćelijskog razvoja, koji i dalje ostaje iskreno oslabljen. U svakom slučaju, antitela trans-prebačena generisana u takvim miševima zadržavaju potpuno humane lake lance, pošto se fenomen trans-prebacivanja naizgled ne pojavljuje u odnosu na lake lance; trans- prebacivanje se verovatno oslanja na prekidačke sekvence u endogenim lokusima koji se koriste (mada drugačije) u normalnom prelasku izotipa u cis. Stoga, čak i kada miševi konstruisani da izrađuju potpuno humana antitela biraju mehanizam transprebacivanja kako bi napravili antitela sa mišjim konstantnim regionima, strategija još uvek nije dovoljna da spasi normalan razvoj B ćelija.
[0133] Osnovna briga u izradi humanih terapeutika zasnovanih na antitelima je stvaranje dovoljno velike raznolikosti sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina da bi se identifikovali korisni varijabilni domeni koji specifično prepoznaju određene epitope i vezuju ih sa poželjnim afinitetom, obično ali ne uvek sa visokim afinitetom. Pre razvoja VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa, nije bilo indikacija da bi miševi koji izražavaju humane varijabilne regione sa mišjim konstantnim regionima ispoljili bilo koje značajne razlike od miševa koji su napravili humana antitela od transgena. Međutim, ta pretpostavka nije bila tačna.
[0134] VELOCIMMUNE® humanizovani miševi, koji sadrže preciznu zamenu varijabilnih regiona mišjeg imunoglobulina sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima na endogenim mišjim lokusima, pokazuju iznenađujuću i izvanrednu sličnost sa divljim miševima u pogledu razvoja B ćelija. U iznenađujućem i zapanjujućem razvoju, VELOCIMMUNE® humanizovani miševi su prikazali suštinski normalan, odgovor divljeg tipa na imunizaciju koji se razlikovao samo u jednom značajnom pogledu od miševa divljeg tipa, generisani varijabilni regioni kao odgovor na imunizaciju su potpuno humani.
[0135] VELOCIMMUNE® humanizovani miševi sadrže preciznu, zamenu velikog opsega varijabilnih regiona germinativne linije teškog lanca mišjeg imunoglobulina (IgH) i imunoglobulinskog lakog lanca (npr. laki lanac κ, Igκ) sa odgovarajućim humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima, na endogenim lokusima. Ukupno, oko šest megabaza mišjih lokusa je zamenjeno sa oko 1,4 megabaze humane genomske sekvence. Ova precizna zamena rezultira mišem sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji čine teške i lake lance koji imaju humane varijabilne regione i mišji konstantni region.<Precizna zamena mišjih VH-DH-JH>i Vκ-Jκ segmenata ostavlja netaknute i funkcionalne bočne mišjesekvence na hibridnim lokusimaimunoglobulina. Humoralni imuni sistem miša funkcioniše poput miša divljeg tipa. Razvoj B ćelija je neometan u bilo kom značajnom pogledu i generisana je bogata raznolikost humanih varijabilnih regiona kod miša nakon izazivanja antigenom.
[0136] VELOCIMMUNE® humanizovani miševi su mogući jer se imunoglobulinski genski segmenti za teške i lake lance κ slično preuređuju kod ljudi i miševa, što ne znači da su njihovi lokusi isti ili čak bliže tako jasno da nisu. Međutim, lokusi su dovoljno slični da se humanizacija varijabilnog lokusa gena teškog lanca može postići zamenom oko 3 miliona baznih parova susednih sekvenci miša koji sadrže sve<segmente gena VH, DH>i JH sa oko 1 milion baza susedne humane genomske sekvence koja u osnovipokriva ekvivalentnu sekvencuiz humanog imunoglobulinskog lokusa.
[0137] U nekim realizacijama, dalja zamena određenih sekvenci gena konstantnog regiona miša sa<sekvencama>humanog gena (npr., zamena mišje CH1 sekvence sa humanom CH1 sekvencom i zamena mišje CLsekvence sa humanom CLsekvencom) rezultira kod miševa sa hibridnim imunoglobulinskimlokusima koji stvarajuantitela koja imaju humane varijabilne regione i delimično humane konstantne regione, pogodne za, na primer, pravljenje fragmenata potpuno humanih antitela, npr., potpuno humanih Fab-ova. Miševi sa hibridnim lokusima imunoglobulina pokazuju normalno preuređenje varijabilnog segmenta gena, normalnu somatsku hipermutaciju i normalno prebacivanje klase. Ovi miševi ispoljavaju humoralni imuni sistem koji se ne razlikuje od miševa divljeg tipa i prikazuju normalne ćelijske populacije u svim fazama razvoja B ćelija i normalne strukture limfoidnih organa, čak i tamo gde miševima nedostaje kompletan repertoar segmenata gena humanog varijabilnog regiona. Imunizovanje ovih miševa rezultira snažnim humoralnim odgovorima koji pokazuju široku raznolikost upotrebe varijabilnih genskih segmenta.
[0138] Precizna zamena segmenata gena varijabilnog regiona mišje germinativne linije omogućava pravljenje miševa koji delimično imaju humane imunoglobulinske lokuse. Pošto se delimično humani imunoglobulinski lokusi preuređuju, hipermutiraju i normalno prebacuju klasu, delimično humani imunoglobulinski lokusi stvaraju antitela kod miša koji sadrže humane varijabilne regione. Nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione, mogu biti identifikovane i klonirane, zatim fuzionisane (npr., u in vitro sistemu) sa bilo kojim sekvencama po izboru, npr., bilo koji imunoglobulinski izotip pogodan za određenu upotrebu, rezultirajući antitelom ili proteinom za vezivanje antigena dobijenim u potpunosti iz humanih sekvenci.
[0139] Humanizacija velikih razmera pomoću metoda rekombinacije je korišćena za modifikovanje mišjih embrionskih matičnih (ES) ćelija, za preciznu zamenu mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca do<3>megabaze koji je obuhvatao u osnovi sve mišje segmente gena VH, DHi JHsa ekvivalentnim humanim segmentima gena sa humanom genomskom sekvencom do 1 megabaze koja sadrži neke ili suštinski sve humane VH, DHi JHsegmente gena. Segment humanog genoma do 0,5 megabaze koji sadrži jedan od dva ponavljanja koji kodiraju u osnovi sve segmente gena humanog Vκ i Jκ, korišćen je za zamenu 3 megabaznog segmenta mišjeg imunoglobulinskog lokusa lakog lanca κ koji sadrži u osnovi sve mišje Vκ i Jκ genske segmente.
[0140] Miševi sa takvim zamenjenim lokusom imunoglobulina mogu da sadrže poremećaj ili deleciju endogenog mišjeg lokusa ADAM6, koji se obično nalazi između VHgenskog segmenta najviše 3' i DH genskogsegmenta najviše 5' na lokusu teškog lanca mišjeg imunoglobulina. Dezorganizacija u ovom regionu može dovesti do smanjenja ili eliminacije funkcionalnosti endogenog lokusa ADAM6 miša. Ako<su u zameni>korišćeni VHgenski segmenti najvećim delom 3' iz repertoara humanog teškog lanca,intergenski region kojisadrži pseudogen koji izgleda kao humani pseudogen ADAM6 prisutan je između<ovih segmenata gena VH,>tj., između humanog VH1-2 i VH1-6. Međutim, mužjaci miševa koji sadrže ovuhumanu intergensku sekvencuispoljavaju malu plodnost ili odsustvo plodnosti.
[0141] Opisani su miševi koji sadrže zamenjene lokuse, kao što je gore opisano, i koji takođe sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6, pri čemu miševi pokazuju uglavnom normalnu plodnost. U jednoj realizaciji, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je SEK ID BR: 3,<smeštena između>humanog VH1-2 i VH1-6 na modifikovanom endogenom mišjem lokusu teškog lanca.Smer transkripcijeADAM6 gena iz SEK ID BR: 3 je suprotan u odnosu na smer transkripcije okolnih<humanih segmenata gena>VH. Iako ovde prikazani primeri pokazuju spasavanje plodnosti postavljanjem ektopične sekvence između naznačenih humanih VH genskih segmenata, stručnjaci će prepoznati dapostavljanje ektopične sekvence nabilo koji pogodan transkripciono-dozvoljeni lokus u genomu miša (ili čak ekstrahromozomalno) bude očekivan za slično spasavanje plodnosti kod mužjaka miša.
[0142] Fenomen dopunjavanja miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom koja sadrži mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili njegov homolog ili njegov funkcionalni fragment je opšta metoda koja je primenljiva za spasavanje bilo kojih miševa sa nefunkcionalnim ili minimalno funkcionalnim endogenim ADAM6 lokusima. Stoga, veliki broj miševa koji sadrže modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina koja oštećuje ADAM6 može biti spasen sa preparatima i postupcima prema pronalasku. Shodno tome, pronalazak obuhvata miševe sa širokim mnoštvom modifikacija lokusa imunolobulinskog teškog lanca koji kompromituju endogenu ADAM6 funkciju prisutnu ektopično. Neki (neograničavajući) primeri su dati u ovom opisu. Pored opisanih VELOCIMMUNE® humanizovanh miševa, preparati i postupci koji se odnose na ADAM6, mogu biti korišćeni u velikom broju primena, npr., pri modifikovanju lokusa teškog lanca na najrazličitije načine.
[0143] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili ortolog, homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili<suštinski svih>segmenata gena mišjeg VHsa jednim ili više segmenata gena humanog VH, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHgenskih segmenata i JHgenskih segmenata sa humanim DHi humanim JHgenskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i / ili region šarke. U jednoj realizaciji, miš čini protein koji sevezuje za pojedinačnivarijabilni domen koji je dimer lanaca imunoglobulina odabran od: (a) humanog<VH - mišjeg CH1 - mišjeg CH2>- mišjeg CH3; (b) humanog VH- šarke miša - mišjeg CH2 - mišjeg CH3; i (c) humanog VH- mišjeg CH2 - mišjeg CH3.
[0144] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja spasava plodnost je smeštena unutar sekvence varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina (npr., između humanih VH1-2 i VH1-6genskihsegmenata) kod miša koji ima zamenu svih ili u osnovi svih mišjih imunoglobulinskih varijabilnih<genskih>segmenata teškog lanca (mVH, mDHi mJH) sa jednim ili više varijabilnih genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina (hVH, hDHi hJH), a miš dalje sadrži zamenu svih ili u osnovi svihmišjihimunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata lakog lanca κ (mVκ, mJκ) sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata lakog lanca κ (hVκ i hJκ). U jednoj<realizaciji, nukleotidna>sekvenca je smeštena između humanog segmenta gena VH1-2 i humanog segmenta gena VH1-6 u humanizovanom VELOCIMMUNE® mišu (US 6,596,541 i US 7,105,348). U jednojrealizaciji, humanizovanimiš VELOCIMMUNE® tako modifikovan sadrži zamenu sa svim ili suštinski<svim varijabilnim genskim>segmentima teškog lanca humanog imunoglobulina (svi hVH, hDH i hJH) i svimili suštinski svim varijabilnimgenskim segmentima lakog lanca κ humanog imunoglobulina (hVκ i hJκ).
[0145] U jednom aspektu, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili ortolog, homolog ili njegov funkcionalni fragment) može biti postavljen u sredini humanih VHgenskih segmenata koji zamenjuju endogene mišje VHgenske segmente. U jednoj realizaciji, svi ili suštinski svi segmenti gena VHmiša su uklonjeni i zamenjeni sa jednim ili više humanih VHgenskih segmenata, a mišji ADAM6 lokus je smešten odmah pored 3' kraja humanih VHgenskih segmenata, ili između dva humana VHgenska segmenta. U specifičnoj realizaciji, mišji ADAM6 lokus je smešten između dva segmenta VHgena blizu 3' završetka umetnutih segmenata humanog VHgena. U specifičnoj realizaciji, zamena uključuje humane VH genske segmente VH1-2 i VH6-1, a mišji lokus ADAM6 je smešten nishodno od segmenta gena VH1-2 i ushodno od VH6-1 genskog segmenta. U specifičnoj realizaciji, raspored humanih VHgenskih segmenata je onda sledeći (od ushodno do nishodno u odnosu na smer transkripcije humanih VHgenskih segmenata): humani VH1-2 - mišji ADAM6 lokus - humani VH6-1. U specifičnoj realizaciji, pseudogen ADAM6 između humanog VH1-2 i humanog VH6-1 je zamenjen sa mišjim ADAM6 lokusom. U jednoj realizaciji, orijentacija jednogili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer<transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih V>H<genskih>segmenata. Alternativno, mišji ADAM6 lokus može biti smešten u intergenskom regionu između humanog VHgenskog segmenta najviše 3' i DHgenskog segmenta najviše 5'. Ovo može biti slučaj bez obzira da li je DHsegment najviše 5' mišji ilihumani.
[0146] Slično, miš modifikovan sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata (npr., Vκ ili Vλ segmenti) koji zamenjuju sve ili suštinski sve endogene mišje VHsegmente gena, može biti modifikovantako da iliodržava endogeni mišji ADAM6 lokus, kao što je gore opisano, npr., korišćenjem vektora za ciljanje koji ima nishodni homologni krak koji uključuje mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment, ili zamenjuje oštećeni mišji ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom koja je smeštena između<dva humana VL genska>segmenta ili između humanih VLgenskih segmenata i DHgenskog segmenta (bilo da je humani ili mišji, npr., Vλ m / hDH) ili J genskog segmenta (bilo da je humani ili mišji, npr. Vκ JH). U jednoj realizaciji, zamena uključuje dva ili više humanih VLgenskih segmenata, i mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment je smešten između dva VLgenska segmenta najviše 3'. U specifičnoj realizaciji, raspored humanih VLgenskih segmenata je onda sledeći (od ushodno ka nishodno u odnosu na smer transkripcije segmenata humanog gena): humani VL3'-1 - mišji ADAM6 lokus - humani VL3'. U jednoj realizaciji, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju<sa orijentacijom humanih V>L<genskih>segmenata. Alternativno, mišji ADAM6 lokus može biti smešten u međugenskom regionu između 3'-najviše humanog VL segmenta gena i 5'-najviše DH segmenta gena. Ovo može biti slučaj bez obzira je li DHsegment koji je najviše 5' mišji ili humani.
[0147] U jednom aspektu, opisan je miš sa zamenom jednog ili više endogenih mišjih VHgenskih segmenata, a koji sadrži najmanje jedan endogeni mišji DHgenski segment. Kod takvog miša, modifikacija endogenih mišjih VHgenskih segmenata može da sadrži modifikaciju jednog ili više 3'- najviše VHgenskih segmenata, ali ne i 5'-najviše DHgenskog segmenta, pri čemu se vodi računa da se modifikacija jednog ili više 3'-najviše VHgenskih segmenata ne ometa ili čini endogeni mišji ADAM6lokus nefunkcionalnim. Na primer, u jednom primeru, miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih<mišjih V>H<genskih segmenata sa jednim ili više>humanih VHgenskih segmenata, a miš sadrži jedan ili više endogenih DHgenskih segmenata i funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus.
[0148] Obrisano
[0149] Korišćenje miševa koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni homolog je korisno tamo gde modifikacije narušavaju funkciju endogenog mišjeg ADAM6. Verovatnoća da će doći do poremećaja endogene mišje ADAM6 funkcije je velika prilikom modifikovanja lokusa imunoglobulina miša, naročito kod modifikovanja varijabilnih regiona teškog lanca imunoglobulina miša i okolnih sekvenci. Zbog toga, takvi miševi pružaju posebnu korist prilikom pravljenja miševa sa imunoglobulinskim lokusima teških lanaca koji su izbrisani u celosti ili delimično, humanizovani u celosti ili delimično ili su zamenjeni (npr., sa Vκ ili Vλ sekvencama) u celosti ili delimično. Postupci za izradu opisanih genetskih modifikacija, za miševe opisane u daljem tekstu su poznati stručnjacima.
[0150] Miševi koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6, ili suštinski identičan ili sličan protein koji daje prednost plodnosti mišjem ADAM6 proteinu, posebno su korisni u vezi sa modifikacijama mišjeg imunoglobulinskog genskog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca koji raskida ili briše endogenu mišju sekvencu ADAM6. Iako su prvenstveno opisani u vezi sa miševima koji izražavaju antitela sa varijabilnim regionima čoveka i konstantnim regionima miša, takvi miševi su korisni u vezi sa bilo kojim genetskim modifikacijama koje remete endogeni gen ADAM6 miša. Stručnjaci će prepoznati da ovo uključuje široku raznovrsnost genetski modifikovanih miševa koji sadrže modifikacije mišjih imunoglobulinskih genskih lokusa varijabilnog regiona teškog lanca. Oni uključuju, na primer, miševe sa delecijom ili zamenom svih ili dela mišjih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca, bez obzira na druge modifikacije.
[0151] Opisani su genetski modifikovani miševi koji sadrže ektopični mišji, glodarski ili drugi gen ADAM6 (ili ortolog ili homolog ili fragment) funkcionalan kod miša i jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata varijabilnog i / ili konstantnog regiona.
[0152] Opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni protein ADAM6, zamenu svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VHgenskih segmenata; zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih DHgenskih segmenata; i zamenu svih ili suštinski svih mišjih JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih JHgenskih segmenata.
[0153] U jednom primeru, miš dalje sadrži zamenu mišje CH1 nukleotidne sekvence sa humanom CH1 nukleotidnom sekvencom. U jednoj realizaciji, miš dalje sadrži zamenu nukleotidne sekvence šarke miša sa
38
nukleotidnom sekvencom humane šarke. U jednom primeru, miš dalje sadrži zamenu varijabilnog<lokusa lakog>lanca imunoglobulina (VL i JL) sa varijabilnim lokusom lakog lanca humanogimunoglobulina. U jednomprimeru, miš dalje sadrži zamenu nukleotidne sekvence konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša sa nukleotidnom sekvencom konstantnog regiona lakog lanca humanog<imunoglobulina. U specifičnom>slučaju, VL, JLi CLsu imunoglobulinske sekvence lakog lanca κ. U specifičnom slučaju, miš sadrži mišje CH2 i mišje CH3 imunoglobulinske sekvence konstantnog regiona fuzionisane sa humanom zglobnom i humanom<C>H<1 sekvencom, tako da se mišji imunoglobulinski lokusi>preuređuju da bi obrazovali gen koji kodira vezivni protein koji sadrži (a) teški lanac koji ima humani<varijabilni region, humani C>H<1 region, humani zglobni region, i mišji C>H<2 i mišji C>H<3 region; i (b) gen>koji kodira laki lanac imunoglobulina koji sadrži humanivarijabilni domen i humani konstantni region.
[0154] Opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni protein ADAM6, zamenu svih ili suštinski svih VHgenskih segmenata miša sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, i opciono zamenu svih ili suštinski svih DHgenskih segmenata i / ili JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih DHgenskih segmenata i / ili humanih JHgenskih segmenata, ili opciono zamenu svih ili suštinski svih DHgenskih segmenata i / ili JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih JL genskih segmenata.
[0155] Opisan je miš koji sadrži zamenu svih ili suštinski svih mišjih segmenata gena VH, DHi JHsa jednim ili više VL, jednim ili više DHi jednim ili više J genskih segmenata (npr., Jκ ili Jλ), pri čemu susegmenti genaoperativno povezani sa endogenim mišjim zglobnim regionom, pri čemu miš formira<preuređen gen>imunoglobulinskog lanca koji sadrži, od 5' do 3' u smeru transkripcije, humani VL- humani ili mišji DH- humani ili mišji J - mišju šarku - mišji CH2 - mišji CH3. U jednom slučaju, J region je humani Jκ region. U jednom slučaju, J region je humani JHregion. U jednom slučaju, J region je humani Jλ region. U jednom slučaju, humani VLregion je izabran od humanog Vλ regiona i humanog Vκ regiona.
[0156] U specifičnim slučajevima, miš izražava antitelo pojedinačnog varijabilnog domena koje ima mišji<ili>humani konstantni region i varijabilni region izveden iz humanog Vκ, humanog DHi humanog Jκ; humani Vκ, humani DHi humani JH; humani Vλ, humani DHi humani Jλ; humani Vλ, humani DHi humani JH; humani Vκ, humani DH i humani Jλ; humani Vλ, humani DH i humani Jκ. U specifičnom slučaju,sekvence prepoznavanjarekombinacije su modifikovane tako da omoguće produktivno preuređivanje između nabrojanih V, D i J segmenata gena ili između nabrojanih V i J segmenata gena.
[0157] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili ortolog, homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili<suštinski svih mišjih>VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHgenskih segmenata i JHgenskih segmenata sa humanim JLgenskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i / ili region šarke.
[0158] U jednoj realizaciji, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen. U jednoj realizaciji, mišu nedostaje sekvenca koja kodira zglobni region. U jednoj realizaciju, mišu nedostaje sekvenca koja kodira<CH1>domen i zglobni region.
[0159] U specifičnoj realizaciji, miš eksprimira vezivni protein koji sadrži humani imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca (λ ili κ) fuzionisan sa mišjim CH2 domenom koji je vezan za mišji CH3domen.
[0160] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili ortolog, homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili<suštinski svih mišjih>VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHi JHgenskih segmenata sa humanim JLgenskim segmentima.
[0161] U jednoj realizaciji, miš sadrži deleciju sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koja kodira CH1 region, zglobni region, CH1 i zglobni region, ili CH1 region i zglobni region i CH2 region.
[0162] U jednoj realizaciji, miš izrađuje protein za vezivanje pojedinačnog varijabilnog domena koji<sadrži>homodimer izabran od sledećeg: (a) humani VL- mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VL
– mišji zglob - mišji CH2 - mišji CH3; (c) humani VL- mišji CH2 - mišji CH3.
[0163] U jednom aspektu, mišu je obezbeđen onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina teškog lanca, koji sadrži onemogućeni ili izbrisani endogeni mišji lokus ADAM6, pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja izražava humano ili mišje, humano / mišje ili drugo himerno antitelo. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna na integrisanom transgenu koji je nasumično integrisan u mišjem genomu. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline je na epizomu (npr., hromozomu) koji se ne nalazi kod miša divljih vrsta.
Zajednički, ili univerzalni, laki lanac
[0164] Prethodni napori za izradu korisnih multispecifičnih proteina za vezivanje epitopa, npr., bispecifičnih antitela, ometani su raznim problemima koji često dele zajedničku paradigmu: in vitro selekciju ili manipulaciju sekvencama da racionalno konstruišu ili konstruišu preko probe i greške, pogodan format za sparivanje heterodimernog bispecifičnog humanog imunoglobulina. Nažalost, većina ako ne svi in vitro inženjerski pristupi obezbeđuju uglavnom ad hoc popravke koje su, ako su uopšte, pogodne za pojedinačne molekule. S druge strane, in vivo metode za angažovanje složenih organizama za odabiranje odgovarajućih uparivanja koja su sposobna da dovedu do humanih terapeutika nisu realizovane.
[0165] Generalno, prirodne sekvence miša često nisu dobar izvor za humane terapeutske sekvence. Barem iz toga razloga, generisanje imunoglobulinskih varijabilnih regiona teškog lanca miša koji se spajaju sa uobičajenim humanim lakim lancem je ograničene praktične koristi. Više in vitro inženjerskih napora bi trebalo upotrebiti u postupku ispitivanja i greške da se pokuša da se humanizuju varijabilne sekvence teškog lanca miša uz nadu da će zadržati specifičnost epitopa i afinitet uz zadržavanje sposobnosti spajanja sa uobičajenim humanim lakim lancem, sa neizvesnim ishodom. Na kraju takvog procesa, krajnji proizvod može zadržati određenu specifičnost i afinitet i povezati se sa zajedničkim lakim lancem, ali će na kraju imunogenost kod čoveka verovatno ostati duboki rizik.
[0166] Zbog toga bi pogodan miš za izradu humanih terapeutika uključivao prikladno veliki repertoar genskih segmenata varijabilnog regiona humanog teškog lanca umesto endogenih mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca. Genski segmenti varijabilnog regiona humanog teškog lanca bi trebalo da budu sposobni za preuređivanje i rekombinovanje sa endogenim mišjim konstantnim domenom teškog lanca tako da obrazuju reverzni himerni teški lanac (tj., teški lanac koji sadrži humani varijabilni domen i mišji konstantni region). Teški lanac bi trebao da bude sposoban za klasno prebacivanje i somatsku hipermutaciju tako da je mišu dostupan prikladno veliki repertoar varijabilnih domena teškog lanca da odabere onaj koji može biti udružen sa ograničenim repertoarom varijabilnih regiona humanog lakog lanca.
[0167] Miš koji bira zajednički laki lanac za više teških lanaca ima praktičnu korisnost. U različitim realizacijama, antitela koja se eksprimiraju u mišu koji može izraziti samo zajednički laki lanac, imaće teške lance koji se mogu udružiti i eksprimirati sa identičnim ili suštinski identičnim lakim lancem. Ovo je posebno korisno u izradi bispecifičnih antitela. Na primer, takav miš može biti imunizovan sa prvim imunogenom da generiše B ćeliju koja izražava antitelo koje specifično vezuje prvi epitop. Miš (ili miš genetski isti) može biti imunizovan sa drugim imunogenom da stvori B ćeliju koja izražava antitelo koje specifično vezuje drugi epitop. Varijabilni teški regioni, mogu biti klonirani iz B ćelija i izražavaju se sa istim konstantnim regionom teškog lanca i istim lakim lancem, a izraženi su u ćeliji da bi napravili bispecifično antitelo, pri čemu je komponenta lakog lanca bispecifičnog antitela odabrana od strane miša da se poveže i izrazi sa komponentom lakog lanca.
[0168] Pronalazači su konstruisali miša za generisanje lakih lanaca imunoglobulina koji će pogodno da se vezuju sa prilično raznovrsnom familijom teških lanaca, uključujući teške lance čiji varijabilni regioni odstupaju od sekvenci germinativne linije, npr., afinitetno sazreli ili somatski mutirani varijabilni regioni. U različitim realizacijama, miš je pronađen za uparivanje varijabilnih domena humanog lakog lanca sa varijabilnim domenima humanog teškog lanca koji sadrže somatske mutacije, omogućavajući tako put do vezivnih proteina visokog afiniteta koji su pogodni za upotrebu kao humani terapeutici.
[0169] Genetski konstruisan miš, preko dugačkog i složenog procesa odabira antitela u organizmu, pravi biološki pogodne izbore u uparivanju raznolike kolekcije varijabilnih domena humanog teškog lanca sa ograničenim brojem opcija humanog lakog lanca. Da bi se ovo postiglo, miš je projektovan da predstavi ograničeni broj opcija varijabilnog domena humanog lakog lanca u vezi sa širokom raznovrsnošću opcija varijabilnih domena humanog teškog lanca. Nakon izazivanja sa antigenom, miš maksimizira broj rešenja u njegovom repertoaru kako bi razvio antitelo na antigen, ograničen velikim delom ili isključivo brojem ili opcijama lakog lanca u njegovom repertoaru. U različitim realizacijama, ovo uključuje omogućavanje mišu da postigne pogodne i kompatibilne somatske mutacije varijabilnog domena lakog lanca koje će, međutim, biti kompatibilne sa relativno velikim brojem varijabilnih domena humanog teškog lanca, uključujući posebno somatsko mutirane varijabilne domene humanog teškog lanca.
[0170] Da bi se postigao ograničeni repertoar opcija lakog lanca, miš je dizajniran da izvede nefunkcionalnom ili suštinski nefunkcionalnom njegovu sposobnost da napravi, ili preuredi prirodni mišji varijabilni domen lakog lanca. Ovo se može postići, npr., brisanjem mišjih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca. Endogeni mišji lokus, može zatim biti modifikovan egzogenim pogodnim genskim segmentom varijabilnog regiona humanog lakog lanca od izbora, operativno povezan sa konstantnim domenom endogenog lakog lanca miša, na takav način da se egzogeni humani genski segmenti varijabilnog regiona mogu kombinovati sa endogenim mišjim genom konstantnog regiona lakog lanca i obrazovati reorganizovani reverzni himerni gen lakog lanca (humani varijabilni, mišji konstantni). U različitim realizacijama, varijabilni region lakog lanca može biti somatski mutiran. U različitim realizacijama, da se maksimalizuje sposobnost varijabilnog regiona lakog lanca da stekne somatske mutacije, odgovarajući inhenser(i) je/su zadržan(i) u mišu. Na primer, u modifikovanju lokusa mišjeg lakog lanca κ za zamenu endogenih mišjih genskih segmenata lakog lanca κ sa segmentima gena humanog lakog lanca κ, mišji κ intronski inhenser i mišji κ 3' inhenser su funkcionalno očuvani, ili neraskinuti.
[0171] Obezbeđeni genetski konstruisan miš, može da izrazi ograničen repertoar reverznih himernih (humanih varijabilnih, mišji konstantnih) lakih lanaca povezanih sa raznovrsnim reverznim himernim (humanim varijabilnim, mišjim konstantnim) teškim lancima. U različitim realizacijama, genski segmenti endogenog mišjeg lakog lanca κ su obrisani i zamenjeni sa jednim (ili dva) preuređena regiona humanog lakog lanca, operativno povezanih sa endogenim mišjim Cκ genom. U realizacijama za maksimiziranje somatske hipermutacije preuređenog regiona humanog lakogg lanca, očuvani su mišji κ intronski pojačivač i mišji κ 3' pojačivač. U različitim realizacijama, miš takođe sadrži nefunkcionalni lokus lakog lanca λ, ili njegovu deleciju ili deleciju koja čini lokus nesposobnim da napravi laki lanac λ.
[0172] Obezbeđen genetski konstruisan miš, može u različitim realizacijama, da sadrži lokus varijabilnog regiona lakog lanca kojem nedostaju segmenti gena VLi JLendogenog mišjeg lakog lanca i koji sadrži preuređeni varijabilni region humanog lakog lanca, u jednoj realizaciji preuređenu humanu VL/JL sekvencu,operativno povezanu sa konstantnim regionom miša, pri čemu je lokus sposoban da prolazi<somatsku>hipermutaciju, i gde lokus izražava laki lanac koji sadrži humanu VL/JLsekvencu povezanu sakonstantnimregionom miša. Stoga, u različitim realizacijama, lokus sadrži mišji κ 3' pojačivač, koji je u korelaciji sa normalnim ili divljim tipom, nivoa somatske hipermutacije.
[0173] Genetski konstruisan miš u različitim realizacijama kada je imunizovan sa antigenom od interesa stvara B ćelije koje pokazuju raznolikost preuređenja varijabilnih regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji izražavaju i funkcionišu sa jednim ili sa dva preuređena laka lanca, uključujući realizacije gde jedan ili dva laka lanca sadrže varijabilne regione humanog lakog lanca koji sadrže, na primer, 1 do 5 somatskih mutacija. U različitim realizacijama, tako izraženi humani laki lanci sposobni su za povezivanje i izražavanje sa bilo kojim varijabilnim regionom teškog lanca humanog imunoglobulina izraženom u mišu.
Proteini za vezivanje epitopa koji vezuju više od jednog epitopa
[0174] Preparati i postupci ovde opisani, mogu biti korišćeni za izradu vezivnih proteina koji vezuju više od jednog epitopa sa visokim afinitetom, npr., bispecifična antitela. Prednosti iz pronalaska uključuju sposobnost za odabiranje pogodnih visoko vezivnih (npr., afinitetno sazrelih) imunoglobulinskih lanaca teškog lanca od kojih će svaki biti povezan sa jednim lakim lancem.
[0175] Sinteza i ekspresija bispecifičnih vezujućih proteina je bila problematična, delom zbog problema povezanih sa identifikovanjem pogodnog lakog lanca koji se može povezati i eksprimirati sa dva različita teška lanca, a delom i zbog problema izolacije. Ovde opisani postupci i preparati omogućavaju genetski modifikovanom mišu da odabere, kroz drugačije prirodne procese, odgovarajući laki lanac koji može da se udruži i izrazi sa više od jednim teškim lancem, uključujući teške lance koji su somatski mutirani (npr.,<sazreli>u afinitetu). Humane VLi VHsekvence iz pogodnih B ćelija imunizovanih miševa, kao što je ovdeopisano,koje izražavaju antitela sazrela u afinitetu, koja imaju reverzne himerne teške lance (tj. humani varijabilni i
42
mišji konstantni) mogu biti identifikovane i klonirane u okviru u ekspresionom vektoru sa pogodnom genskom sekvencom humanog konstantnog regiona (npr., humani IgG1). Mogu se pripremiti dva takva konstrukta, pri čemu svaki konstrukt kodira varijabilni domen humanog teškog lanca koji vezuje<različiti epitop. Jedan od>humanih VL (npr., humani Vκ1-39Jκ5 ili humani Vκ3-20Jκ1), u sekvencigerminativne linije ili iz B ćelije ukojoj je sekvenca somatski mutirana, može biti fuzionisan u okviru sa pogodnim genom humanog konstantnog regiona (npr. humani κ konstantni gen). Ova tri teška i laka konstrukta potpuno humana, mogu biti smeštena u pogodnu ćeliju za ekspresiju. Ćelija će izraziti dve glavne vrste: homodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem i heterodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem. Da bi se omogućilo lako odvajanje ovih glavnih vrsta, jedan od teških lanaca je modifikovan da izostavi determinantu za vezivanje proteina A, što rezultira različitim afinitetom homodimernog vezujućeg proteina od heterodimernog vezujućeg proteina. Preparati i postupci koji se bave ovim pitanjem su opisani u USSN 12/832,838, podnetom 25. juna 2010, pod nazivom „Lako izolovana bispecifična antitela sa nativnim imunolobulinskim formatom“, objavljen kao US 2010/0331527A1.
[0176] Opisan je protein za vezivanje epitopa, pri čemu su humane VLi VHsekvence izvedene iz ovdeopisanihmiševa koji su imunizovani sa antigenom koji sadrži epitop od interesa.
[0177] Opisan je protein za vezivanje epitopa koji sadrži prvi i drugi polipeptid, prvi polipeptid koji sadrži, od N-završetka do C-završetka, prvi region za vezivanje epitopa koji selektivno vezuje prvi epitop, praćen konstantnim regionom koji sadrži prvi CH3 region humanog IgG odabranog od IgG1, IgG2, IgG4, injihovekombinacije; i, drugi polipeptid koji sadrži, od N-završetka do C-završetka, drugi region za<vezivanje epitopa>koji selektivno vezuje drugi epitop, praćen konstantnim regionom koji sadrži drugi CH3 region humanog IgG izabran od IgG1, IgG2, IgG4, i njihove kombinacije, pri čemu drugi CH3 region sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog CH3 domena za protein A.
[0178] U jednom slučaju, drugi region CH3 sadrži modifikaciju H95R (prema IMGT egzonskom numerisanju; H435R prema EU numerisanju). U drugoj realizaciji, drugi CH3 region dalje sadrži Y96Fmodifikaciju (IMGT;Y436F pomoću EU).
[0179] U jednom slučaju, drugi CH3 region je iz modifikovanog humanog IgG1, i dalje sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU).
[0180] U jednom slučaju, drugi CH3 region je iz modifikovanog humanog IgG2 i dalje sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU).
[0181] U jednom slučaju, drugi CH3 region je iz modifikovanog humanog IgG4 i dalje sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU).
[0182] Jedan postupak za izradu proteina za vezivanje epitopa koji vezuje više od jednog epitopa je imunizacija prvog miša u skladu sa pronalaskom sa antigenom koji sadrži prvi epitop od interesa, pri čemu<miš sadrži>endogeni imunoglobulinski lokus varijabilnog regiona lakog lanca koji ne sadrži endogeni Vk
<L>miša koji je sposoban za preuređivanje i formiranje lakog lanca, pri čemu je na endogenom mišjem imunglobulinskom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca jedan preuređeni humani VLregion operativno povezan sa mišjim endogenim genom konstantnog regiona lakog lanca, a preuređeni humani VLregion je izabran od humanog Vκ1-39Jκ5 i humanog Vκ3-20Jκ1, a endogeni mišji segmenti gena VHsu zamenjeni u celini ili delimično sa segmentima humanog gena VH, tako da su teški lanci imunoglobulina napravljeniodstrane miša jedini ili suštinski teški lanci koji sadrže humane varijabilne domene i mišje konstantne domene. Kada je imunizovan, takav miš će napraviti reverzno himerno antitelo, koje će sadržati samo jedan od dva varijabilna domena humanog lakog lanca (npr., jedan od humanog Vκ1-39Jκ5 ili humanog<Vκ3-20Jκ1).>Jednom kada je identifikovana B ćelija koja kodira VHkoji vezuje epitop od interesa, nukleotidna sekvenca VH (i opciono, VL) može biti ponovo pronađena (npr., pomoću PCR-a) i kloniranau ekspresionom konstruktuu okviru sa pogodnim humanim imunoglobulinskim konstantnim domenom.<Ovaj postupak se može ponoviti>da bi se identifikovao drugi VHdomen koji vezuje drugi epitop, a druga VHgenska sekvenca može biti pronađena i klonirana u ekspresionom vektoru u okviru sa drugimpogodnim imunoglobulinskim konstantnimdomenom. Prvi i drugi imunoglobulinski konstantni domeni mogu biti isti ili različiti izotipi, a jedan od imunoglobulinskih konstantnih domena (ali ne i drugi) može biti modifikovan, kao što je ovde opisano, ili u US 2010/0331527 A1 i protein za vezivanje epitopa može biti eksprimiran u pogodnoj ćeliji i izolovan na osnovu njegovog različitog afiniteta za protein A u poređenju sa homodimernim proteinom za vezivanje epitopa, npr., kao što je opisano u US 2010/0331527A1.
[0183] Opisan je postupak za izradu bispecifičnog proteina za vezivanje epitopa, koji obuhvata identifikovanje prve afinitetno sazrele (npr., koja sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija) humane<VH>nukleotidne sekvence (VH1) iz miša, kao što je ovde opisano, identifikovanje druge afinitetno sazrele (npr. koja sadrže jednu ili više somatskih hipermutacija) humane VHnukleotidne sekvence (VH2) iz miša, kao što je ovde opisano, kloniranje VH1 u okviru sa humanim teškim lancem kojem nedostaje modifikacijadeterminanteproteina A, kao što je opisano u US 2010/0331527A1 da obrazuje teški lanac 1 (HC1),<kloniranje VH2 u okviru>sa humanim teškim lancem koji sadrži determinantu proteina A, kao što je opisanou US 2010/ 0331527A1 daobrazuje teški lanac 2 (HC2), uvodeći ekspresioni vektor koji sadrži HC1 i isti ili različiti ekspresioni vektor koji sadrži HC2 u ćeliju, pri čemu ćelija takođe izražava laki lanac humanog imunoglobulina koji sadrži humani Vκ1-39/humani Jκ5 ili humani Vκ3-20/ humani Jκ1 fuzionisan sa humanim konstantnim domenom lakog lanca, omogućavajući ćeliji da eksprimira bispecifični protein koji<se vezuje za epitope koji sadrži V>H<domen kodiran pomoću V>H<1 i V>H<domen kodiran pomoću V>H<2, i>izolovanje bispecifičnog proteina koji vezuje epitopna osnovu njegove diferencijalne sposobnosti da vezuje protein A u poređenju sa monospecifičnim homodimernim proteinom za vezivanje epitopa. U specifičnoj realizaciji, HC1 je IgG1, a HC2 je IgG1 kojisadrži modifikaciju H95R (IMGT; H435R premaEU) i dalje sadrži modifikaciju Y96F (IMGT; Y436F prema EU). U jednoj realizaciji, VHdomen kodiran od strane VH1, VHdomen kodiran od strane VH2 ili oba, su somatski mutirani.
Humani VHgeni koji se izražavaju sa zajedničkim humanim VL
[0184] Različiti humani varijabilni regioni iz antitela sazrelih u afinitetu, izazvanih protiv četiri različita antigena su izraženi bilo sa njihovim srodnim lakim lancem, ili najmanje jednim humanim lakim lancem odabranim od humanog Vκ1-39Jκ5, humanog Vκ3-20Jκ1, ili humanog VpreBJλ, 5 (videti Primer 10). Za antitela prema svakom od antigena, somatski mutirani teški lanci visokog afiniteta iz različitih porodica gena su uspešno upareni sa preuređenim humanim regionima Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 germinativne linije<i izlučeni>iz ćelija koje izražavaju teške i lake lance. Za Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1, VHdomeni izvedeni iz sledećih humanih VHporodica gena izražavaju povoljno: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15,
3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 i 6-1. Stoga, miš koji je konstruisan da izražava<ograničeni>repertoar humanih VLdomena iz jednog ili oba Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 generisaće raznoliku populaciju somatski mutiranih humanih VHdomena iz VHlokusa modifikovanog da zameni mišje segmente gena VHsa humanim VHsegmentima gena.
[0185] Miševi genetski konstruisani da eksprimiraju reverzne himerne (humane varijabilne, mišje konstantne) imunoglobulinske teške lance udružene sa pojedinačnim preuređenim lakim lancem (npr., Vκ1-39/J ili Vκ3-20/J), kada su imunizovani sa antigenom od interesa, generisane B ćelije koje su sadržale<raznolikost humanih>VHpreuređivanja i izražavale raznolika antitela visokog afiniteta specifičnih zaantigen, sa različitimsvojstvima u odnosu na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena za njegov ligand, i s obzirom na njihovu sposobnost da vezuju varijante antigena (videti primere 14 do 15).
[0186] Stoga su ovde opisani miševi i postupci korisni u izradi i izboru varijabilnih domena teškog lanca humanog imunoglobulina, uključujući somatski mutirane varijabilne domene humanog teškog lanca, koji nastaju iz raznolikosti preuređivanja, koji pokazuju široku raznovrsnost afiniteta (uključujući ispoljavanje<KD>od oko nanomolarne ili niže), široki niz specifičnosti (uključujući vezivanje za različite epitope istogantigena),i koji se povezuju i izražavaju sa istim ili suštinski istim varijabilnim regionom lakog lanca humanog imunoglobulina.
[0187] Prvi miš koji sadrži humanizovani lokus varijabilnog regiona teškog lanca, može biti gajen sa drugim mišem koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira zajednički, ili univerzalni lokus lakog lanca, kao što je ovde opisano. Prvi ili drugi miš može da sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. Potomci su razmnožavani da dobiju miševe homozigotne za lokus humanizovanog teškog lanca, i homozigotne za univerzalni lokus lakog lanca. Prvi miš ili drugi miš mogu da sadrže modifikaciju endogenog mišjeg lokusa lakog lanca da naprave endogeni mišji lokus lakog lanca nefunkcionalnim (npr., brisanje ili nokaut, npr., endogenog lokusa λ i/ili κ). Prvi miš može da sadrži zamenu svih ili suštinski svih funkcinoalnih endogenih mišjih segmenata gena V, D i J sa jednim ili više neuređenih humanih V, D i J genskih segmenata (npr., svi ili suštinski svi funkcionalni humani V, D i J genski segmenti); a miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih segmenata gena V i J lakog lanca sa ne više od jedne ili ne više od dve preuređene V/J sekvence lakog lanca. Prvi miš može dalje sadržati ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. U jednom slučaju, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je na humanizovanom lokusu teškog lanca imunoglobulina.
[0188] U jednom primeru, miševi koji sadrže ektopičnu sekvencu i koji su homozigotni za lokus univerzalnog lakog lanca i za lokus humanizovanog teškog lanca, imunizovani su sa antigenom od interesa da generišu antitela koja sadrže mnoštvo somtatski mutiranih humanih varijabilnih domena koji se udružuju i izražavaju sa univerzalnim lakim lancem. U jednom primeru, sekvence nukleinskih kiselina varijabilnih domena humanog teškog lanca identifikovane u mišu korišćene su u sistemu ekspresije da bi se izradilo potpuno humano antitelo koje sadrži varijabilni domen humanog teškog lanca i laki lanac koji sadrži sekvencu univerzalnog lakog lanca
45
miša.
[0189] Sledeći primeri su dati kako bi opisali prosečnim stručnjacima u struci kako da izrade i upotrebe metode i preparate prema pronalasku. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperature, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekularna težina je prosečna molekulska težina, temperatura je navedena u Celzijusu, a pritisak je na ili blizu atmosferskom.
PRIMERI
Primer I
Humanizacija mišjih imunoglobulinskih gena
[0190] Bakterijski veštački hromozomi čoveka i miša (BAC) korišćeni su za dizajniranje 13 različitih BAC ciljnih vektora (BACvecs) za humanizaciju mišjih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca i lakog lanca κ. U tabelama 1 i 2 navedeni su detaljni opisi koraka koji su izvedeni za izgradnju svih BAC vektora koji su korišćeni za humanizaciju mišjih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca i lakog lanca κ, respektivno.
Identifikacija humanih i mišjih BAC-a.
[0191] Mišji BAC-ovi koji spajaju 5' i 3' krajeve lokusa imunoglobulinskog teškog lanca i lakog lanca κ, identifikovani su pomoću hibridizacije filtera prepoznatih sa BAC bibliotekom ili PCR skriningom mišjih DNK bazenčića BAC biblioteke. Filteri su hibridizovani pod standardnim uslovima korišćenjem proba koje odgovaraju regionima od interesa. Bazenčići biblioteke su pregledani pomoću PCR-a korišćenjem jedinstvenih parova prajmera koji okružuju ciljani region od interesa. Izvršen je dodatni PCR korišćenjem istih prajmera kako bi se rastavio dati bazenčić i izolovao odgovarajući BAC od interesa. I BAC filteri i bazeni biblioteke su generisani iz mišjih ES ćelija 129 SvJ (Incyte Genomics/Invitrogen). Humani BAC- ovi koji pokrivaju kompletne lokuse teškog lanca imunoglobulina i lakog lanca κ su identifikovani bilo hibridizacijom filtera uočenih sa BAC bibliotekom (Caltech B, C ili D biblioteke & RPCI-11 biblioteka, Research Genetics/Invitrogen) preko skrininga bazenčića humane BAC biblioteke (Caltech library, Invitrogen) metodom zasnovanom na PCR-u ili korišćenjem BAC baze podataka završne sekvence (Caltech D biblioteka, TIGR).
Konstrukcija BAC vektora (Tabele 1 i 2).
[0192] Bakterijska homologna rekombinacija (BHR) je izvedena kao što je opisano (Valenzuela i sar., 2003; Zhang, Y., i sar. (1998). Nova logika za DNK inženjering korišćenjem rekombinacije u bakteriji Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). U većini slučajeva, generisani su linearni fragmenti ligacijom homolognih kutija dobijenih PCR-om u klonirane kasete praćene gel izolacijom ligacionih proizvoda i elektroporacijom u bakterije sposobne za BHR koje udomljavaju ciljni BAC. Nakon selekcije na odgovarajućim Petrijevim sudovima sa antibioticima, pravilno rekombinovani BAC-i su identifikovani pomoću PCR-a kroz oba nova spajanja, praćeni restrikcionom analizom na gelovima sa pulsnim poljem (Schwartz, D.C. i Cantor, C.R. (1984) Odvajanje DNK veličine hromozoma kvasca pomoću gel elektroforeze sa gradijentom pulsnog polja. Cell 37, 67-75) i proveravanjem položaja pomoću PCR-a korišćenjem prajmera raspoređenih duž humanih sekvenci.
[0193] Konstruisan je 3hVHBACvec korišćenjem tri uzastopna BHR koraka za početni korakhumanizacijelokusa teškog lanca imunoglobulina (SL.4A i tabela 1). U prvom koraku (korak 1), kaseta<je uvedena u humani>roditeljski BAC ushodno od humanog VH1-3 segmenta gena koji sadrži područjehomologije sa mišjimimunoglobulinskim lokusom teškog lanca (HB1), gen koji daje otpornost na kanamicin u bakterijama i G418 rezistenciju u ćelijama životinje (kanR) i mesto rekombinacije specifično za lokaciju (npr., loxP). U drugomkoraku (korak 2), uvedena je druga kaseta neposredno nishodno od<poslednjeg J>H<segmenta koji sadrži drugi>region homologije sa mišjim imunoglobulinskim lokusom teškoglanca (HB2) i genom koji bakterijama dajeotpornost na spektinomicin (specR). Ovaj drugi korak<uključuje brisanje sekvence lokusa teškog lanca humanog imunoglobulina nishodno od J>H<6 i gena>rezistencije na hloramfenikol BAC vektora (cmR). U trećemkoraku (korak 3), dvostruko modifikovani humani BAC (B1) je zatim linearizovan korišćenjem I-CeuI položaja koji su dodati tokom prva dva koraka i integrisan u mišji BAC (B2) pomoću BHR-a kroz dva regiona homologije (HB1 i HB2). Izbor lekova za prvi (cm/kan), drugi (spec/kan) i treći (cm/kan) korak je dizajniran tako da bude specifičan za željene proizvode. Modifikovani BAC klonovi su analizirani pomoću gel elektroforeze pulsnog polja (PFGE) nakon digestije sa restrikcionim enzimima radi određivanja odgovarajuće konstrukcije (SL.4B).
[0194] Na sličan način, dizajnirano je 12 dodatnih BAC vektora za humanizaciju lokusa teškog lanca i lakog lanca κ. U nekim slučajevima, BAC ligacija je izvedena umesto BHR-a kako bi spojila dva velika BAC-a kroz uvođenje retkih restrikcionih mesta u oba roditeljska BACvek-a od strane BHR-a, uz pažljivo postavljanje selektivnih markera. To je omogućilo opstanak željenog ligacionog proizvoda nakon odabira sa specifičnim kombinacijama markera lekova. Rekombinantni BAC-ovi dobijeni ligacijom nakon digestije sa retkim restrikcionim enzimima su identifikovani i prikazani na sličan način kao oni dobijeni pomoću BHR-a (kao što je gore opisano).
Tabela 1
Tabela 2
Modifikacija embrionskih matičnih (ES) ćelija i generisanje miševa.
[0195] Ciljanje ES ćelija (F1H4) je izvršeno korišćenjem metode VELOCIGENEO genetskog inženjeringa, kao što je opisano (Valenzuela i sar., 2003). Izvođenje miševa iz modifikovanih ES ćelija bilo blastocistom (Valenzuela i sar., 2003) ili osmoćelijskim ubrizgavanjem
(Poueymirou i sar., 2007) je bilo kao što je opisano. Ciljane ES ćelije i miševi su potvrđeni skriningom DNK iz ES ćelija ili miševa sa jedinstvenim setovima proba i prajmera u testu zasnovanom na PCR-u (npr., SL.3A, 3B i 3C). Sve studije na mišu su nadgledane i odobrene Regeneronovim Institucionalnim komitetom za negu i koriščenje životinja (IACUC).
Analiza kariotipa i fluorescentna hibridizacija in situ (FISH).
[0196] Analizu kariotipa su izvršili Coriell Cell Repositories (Coriell Institute for Medical Research, Camden, Nj). FISH je izveden na ciljanim ES ćelijama kao što je opisano (Valenzuela i sar., 2003). Probe koje odgovaraju bilo mišoj BAC DNK ili humanoj BAC DNK označene obeleženom translacijom (Invitrogen) sa fluorescentno obeleženim dUTP nukleotidnim spektrom narandžaste boje ili spektrom zelene boje (Vysis).
Varijabilni genski lokus teškog lanca imunolobulina.
[0197] Humanizacija varijabilnog regiona lokusa teškog lanca je postignuta u devet uzastopnih koraka direktnom zamenom oko tri miliona baznih parova (Mb) susednih genomskih sekvenci miša koje sadrže<sve>segmente gena VH, DHi JHsa oko 1 Mb susedne humane genomske sekvence koja sadrži ekvivalentnesegmentehumanog gena (SL. 1A i tabela 1) koristeći tehnologiju genetskog inženjeringa VELOCIGENE® (videti, na primer, Američki patent br.6,586,251 i Valenzuela i sar., 2003).
[0198] Intron između JHgenskih segmenata i gena konstantnog regiona (J-C intron) sadrži transkripcioni pojačivač (Neuberger, M.S. (1983). Ekspresija i regulacija gena teškog lanca imunoglobulina koji je transfektovan u limfoidne ćelije. EMBO J 2, 1373-1378), praćen regionom jednostavnih ponavljanja potrebnih za rekombinaciju tokom prebacivanja izotipa (Kataoka, T. i sar. (1980) Preuređivanje gena imunoglobulinskog gama 1- lanca i mehanizam za prebacivanje klase teškog lanca. Proc Natl Acad Sci U<S A 77, 919-923). Spoj>između humanog VH-DH-JH regiona i mišjeg CH regiona (proksimalni spoj) jeizabran za održavanje mišjegintronskog pojačivača teškog lanca i domena prebacivanja, kako bi se očuvala i efikasna ekspresija i klasno prebacivanje humanizovanog lokusa teškog lanca unutar miša. Tačan nukleotidni položaj ovog i sledećih spajanja u svim zamenama bio je moguć korišćenjem metode genetskog inženjeringa VELOCIGENE® (supra), koja je koristila bakterijsku homolognu rekombinaciju vođenu sintetizovanim oligonukleotidima.Stoga je proksimalni spoj postavljen oko 200 bp nishodno od<poslednjeg segmenta gena J>H<, a distalni spoj je>postavljen nekoliko stotina ushodno od najviše 5' VHgenskog segmenta humanog lokusa i oko 9 kb nishodno od mišjeg VH1-86 genskog segmenta, takođe poznat kao J558.55. Mišji VH1-86 (J558.55) genski segment je<najdistalniji varijabilni genski segment>teškog lanca, za koji se navodi da je pseudogen u miševima C57BL6, ali potencijalno aktivan, iako sa lošom RSS sekvencom, u ciljanom 129 alelu. Distalni kraj lokusa teškog lanca miša navodno može sadržati kontrolne elemente koji regulišu ekspresiju i / ili preuređivanje lokusa (Pawlitzky i sar., 2006).
[0199] Prvo ubacivanje humane imunoglobulinske sekvence DNK u mišu je postignuto korišćenjem 144<kb>proksimalnog kraja lokusa teškog lanca čoveka koji sadrži 3 VH, svih 27 DHi 9 JHhumanih genskihsegmenatakoji su ubačeni u proksimalni kraj mišjeg IgH lokusa, sa istovremenom 16,6 kb delecijom mišje genomske sekvence, koristeći oko 75 kb mišjih homolognih krajeva (korak A, SL.2A; Tabele 1 i<3, 3hVH). Ova velika>144kb umetanja i prateće brisanje od 16,6 kb je izvedeno u jednom koraku (korakA) koji se dogodio safrekvencijom od 0,2% (Tabela 3). Ispravno ciljane ES ćelije su ocenjene testom gubitka urođenog alela (LONA) (Valenzuela i sar., 2003) korišćenjem, proba unutar i okružujući obrisanu mišju sekvencu i unutar umetnute humane sekvence, a integritet velikog humanog umetka je verifikovan pomoću višestrukih proba koje obuhvataju čitavo umetanje (SL. 3A, 3B i 3C). Budući da je predviđeno mnogo krugova sekvencijalnog ciljanja ES ćelija, ciljani klonovi ES ćelija kod toga, i svi naredni koraci su podvrgnuti kariotipskoj analizi (supra) i samo su oni klonovi koji pokazuju normalne kariotipe u najmanje 17 od 20 širenja korišćeni za naredne korake.
[0200] Ciljane ES ćelije iz koraka A su ponovo ciljane sa BACvec koji je proizveo deleciju od 19 kb na distalnom kraju lokusa teškog lanca (korak B, SL. 2A). Korak B BACvec je sadržao gen otpornosti na higromicin (hig) za razliku od gena za neomicinsku rezistenciju (neo) sadržanog u BACvec iz koraka A. Geni rezistencije iz dva BAC vektora su dizajnirani tako da, nakon uspešnog ciljanja na isti hromozom,<približno>tri Mb varijabilnog genskog lokusa mišjeg teškog lanca koji sadrži sve mišje segmente gena VHosim VH1-86 i sve segmente gena DHosim DQ52, kao i dva gena otpornosti, bili su okruženi loxP položajima; DQ52 i svi segmenti gena mišjeg lanca JHsu bili izbrisani u koraku A. Identifikovani su ES ćelijski klonovi dvostruko ciljani na istom hromozomu vođenjem 3hVH proksimalne kasete dohomozigotnosti u visokom G418(Mortensen, R.M. i sar. (1992) Proizvodnja homozigotnih mutantnih ES ćelija sa jednim ciljanim konstruktom. Mol Cell Biol 12: 2391-2395) i praćenje sudbine distalne hig kasete. Segmenti miša veličine do četiri Mb, modifikovani na način da budu okruženi pomoću loxP položaja, uspešno su obrisani u ES ćelijama prolaznom ekspresijom CRE rekombinaze sa visokom efikasnošću (do ~ 11%), čak i u odsustvu selekcije leka (Zheng, B., i sar. (2000). Konstruisanje mišjih hromozoma sa Cre-loxP: domet, efikasnost i somatske primene. Mol Cell Biol 20: 648-655). Na sličan način, pronalazači su postigli deleciju od tri Mb u 8% ES ćelijskih klonova nakon prolazne Cre ekspresije (Korak C, SL.2A; Tabela 3). Brisanje je ocenjeno LONA testom koriščenjem proba na oba kraja izbrisane mišje sekvence, kao i gubitka neo i hig i pojave PCR proizvoda duž tačke brisanja koja sadrži jedino preostalo mesto loxP. Nadalje, brisanje je potvrđeno fluorescencijom in situ hibridizacije (podaci nisu prikazani).
[0201] Ostatak varijabilnog regiona humanog teškog lanca je dodat 3hVHalelu u serijama od 5 koraka korišćenjem metode genetskog inženjeringa VELOCIGENE® (Koraci EH, SL.2B), sa svakim korakom koji uključuje precizno ubacivanje do 210 kb humanih sekvenci gena. Za svaki korak, proksimalni kraj svakog novog BACvec je dizajniran tako da preklopi najviše distalne humane sekvence iz prethodnog koraka, a distalni kraj svakog novog BACvec je sadržao isti distalni region homologije miša kao što je korišćeno u koraku A. BAC vektori iz koraka D, F i H su sadržali kasete za neo selekciju, dok su oni iz koraka E i G sadržali kasete za hig selekciju, tako da su selekcije bile naizmenične između G418 i higromicina. Ciljanje u koraku D je testirano gubitkom jedinstvenog PCR proizvoda preko distalnog loxP<položaja 3hVH hibridnog>alela. Ciljanje za korake od E preko I je testirano gubitkom prethodne kasete zaselekciju. U završnom koraku(korak I, SL. 2B), kaseta za selekciju neo, okružena Frt položajima (McLeod, M. i sar. (1986) Identifikacija mesta prelaza tokom rekombinacije posredovane FLP-om u krugu od 2 mikrona plazmida Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 6, 3357-3367), uklonjen je prolaznom FLPe ekspresijom (Buchholz, F. i sar. (1998) Poboljšana svojstva FLP rekombinaze razvijena cikličnom mutagenezom. Nat Biotechnol 16, 657-662). Humane sekvence BAC vektora za korake D, E i G su izvedene iz dva roditeljska humana BAC-a, dok su oni iz koraka F i H bili iz pojedinačnih BAC. Zadržavanje humanih sekvenci je potvrđeno na svakom koraku korišćenjem višestrukih proba koje obuhvataju ubačene humane sekvence (kao što je gore opisano, npr. SL.
3A, 3B i 3C). Samo oni klonovi sa normalnim kariotipom i potencijalom germinativne linije se dalje prenose u svakom koraku. ES ćelije iz poslednjeg koraka su još uvek mogle da doprinesu germinativnoj liniji posle
52
devet uzastopnih manipulacija (Tabela 3). Miševi homozigotni za svaki od alela teškog lanca bili su održivi, izgledali su zdravi i demonstrirali su u osnovi divlji tip humoralnog imunološkog sistema (videti Primer 3).
Tabela 3
Imunoglobulinski varijabilni genski lokus lakog lanca κ.
[0202] Varijabilni region lakog lanca κ je humanizovan u osam sekvencijalnih koraka direktnom zamenom oko tri Mb mišje sekvence koja sadrži sve Vκ i Jκ genske segmente sa oko 0,5 Mb humane sekvence koja sadrži proksimalne humane Vκ i Jκ genske segmente na način sličan onom iz teškog lanca (SL.1B; Tabele 2 i 4).
[0203] Varijabilni region lokusa humanog lakog lanca κ sadrži dva skoro identična ponavljanja od 400 kb odvojena razmakom od 800 kb (Weichhold, G.M. i sar. (1993) Humani imunoglobulinski kappa lokus se sastoji od dve kopije koje su organizovane u suprotnom polaritetu, Genomics 16: 503-511). Pošto su ponavljanja toliko slična, skoro sva raznolikost lokusa može biti reprodukovana kod miševa korišćenjem proksimalnog ponavljanja. Dalje, prijavljen je prirodni humani alel lokusa lakog lanca κ kojem nedostaje distalno ponavljanje
(Schaible, G. i sar. (1993) Imunoglobulinski kappa lokus: polimorfizam i haplotipi Kavkazoidnih i ne-Kavkazoidnih osoba, Hum Genet 91: 261-267). Oko tri Mb varijabilne sekvence gena lakog lanca κ miša je zamenjeno sa oko 0,5 Mb humane varijabilne genske sekvence lakog lanca κ da bi se efikasno zamenili<svi>mišji Vκ i Jκ genski segmenti sa proksimalnim humanim Vκ i svim segmentima humanog gena JK.(SL.2C i2D; Tabele 2 i 4). Za razliku od postupka opisanog u Primeru 1 za lokus teškog lanca, celokupni<mišji VK genski>region, koji sadrži sve Vκ i Jκ genske segmente, izbrisan je u postupku od tri koraka predodavanja bilo kojehumane sekvence. Prvo, uvedena je neo kaseta na proksimalnom kraju varijabilnog regiona (korak A, SL.2C). Zatim je na distalni kraj κ lokusa ubačena hig kaseta (korak B, SL.2C). LoxP mesta su ponovo bila smeštena unutar svake selekcione kasete tako da je Cre tretman izazvao brisanje preostalih 3 Mb mišjeg Vκ regiona zajedno sa oba gena rezistencije (korak C, SL.2C).
[0204] Humani genomski fragment veličine oko 480 kb koji sadrži celokupni varijabilni region lakog lanca κ imunoglobulina je ubačen u četiri sekvencijalna koraka (SL.2D; Tabele 2 i 4), sa do 150 kb sekvence lakog lanca κ humanog imunoglobulina ubačene u jednom koraku, koristeći metode slične onima korišćenim za teški lanac (videti Primer 1). Krajnji gen rezistentnosti na higromicin je uklonjen prolaznom FLPe ekspresijom. Kao i sa teškim lancem, ciljani ES ćelijski klonovi su procenjeni na integritet celokupnog humanog inserta, normalni kariotip i potencijal germinativne linije nakon svakog koraka. Miševi homozigotni za svaki od alela lakog lanca κ su generisani i nađeno je da su zdravi i normalnog izgleda.
Tabela 4
Primer II
Generacija potpuno humanizovanih miševa kombinacijom višestruko humanizovanih imunolobulinskih alela
[0205] U nekoliko tačaka, ES ćelije koje nose deo varijabilnih repertoara humanog imunoglobulinskog teškog lanca ili lakog lanca κ, kao što je opisano u Primeru 1, bile su mikroinjektovane i dobijeni miševi uzgajani da bi stvorili više verzija humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® sa progresivno većim frakcijama humanih imunoglobulinskih repertoara germinativne linije (tabela 5; SL. 5A i 5B).<VELOCIMMUNE® 1 (V1)>humanizovani miševi poseduju 18 humanih VHgenskih segmenata i sve humane DHi JHgenske segmente kombinovane sa 16 humanih Vκ genskih segmenata i svim humanim Jκgenskim segmentima.
VELOCIMMUNE® 2 (V2) humanizovani miševi i VELOCIMMUNE® (V3) humanizovani miševi su povećali varijabilni repertoar noseći ukupno 39 VHi 30 Vκ, i 80 VHi 40 Vκ, respektivno. Pošto su genomski regioni koji kodiraju segmente gena VH, DHi JHmiša i segmente gena Vκ i Jκ potpunozamenjeni, antitelaproizvedena bilo kojom verzijom humanizovanih VELOCIMMUNE® miševa sadrže humane varijabilne regione povezane sa konstantnim regionima miša. Mišji lokusi lakog lanca λ ostaju netaknuti u svim verzijama humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® i služe kao komparator za efikasnost ekspresije različitih VELOCIMMUNE® humanizovanih lokusa lakog lanca κ.
[0206] Miševi dvostruko homozigotni, za obe humanizacije imunoglobulinskog teškog lanca, i lakog lanca κ, generisani su iz podskupova alela opisanih u Primeru 1. Svi genotipovi posmatrani tokom uzgajanja kako bi se generisali dvostruko homozigotni miševi javljali su se u otprilike Mendelovim proporcijama. Muški potomci homozigotni za svaki od alela humanog teškog lanca su pokazali smanjenu plodnost. Smanjena plodnost je rezultat gubitka mišje ADAM6 aktivnosti. Varijabilni genski lokus teškog lanca miša sadrži dva ugrađena funkcionalna gena ADAM6 (ADAM6a i ADAM6b). Tokom humanizacije varijabilnog genskog lokusa teškog lanca miša, ubačena sekvenca humanog genoma sadrži pseudogen ADAM6. Za plodnost može biti potreban mišji ADAM6, i stoga nedostatak mišjih ADAM6 gena u humanizovanim genskim lokusima varijabilnih teških lanaca može dovesti do smanjene plodnosti kod ovih miševa bez obzira na prisustvo humanog pseudogena. Primeri 7-9 opisuju preciznu zamenu izbrisanih mišjih gena ADAM6 nazad u humanizovani varijabilni genski lokus teškog lanca i obnavljanje divljeg tipa plodnosti kod miševa sa humanizovanim lokusom teškog lanca imunoglobulina.
Tabela 5
Primer III
Populacije limfocita kod miševa sa humanizovanim genima imunoglobulina
[0207] Populacije zrelih B ćelija u tri različite verzije VELOCIMMUNE® miševa ocenjene su protočnom citometrijom.
[0208] Ukratko, izrađene su ćelijske suspenzije iz koštane srži, slezine i timusa korišćenjem standardnih metoda. Ćelije su resuspendovane pri 5x10<5>ćelija/mL u puferu za bojenje BD Pharmingen FACS, blokirane sa anti-mišjim CD16/32 (BD Pharmingen), obojene sa odgovarajućim koktelom antitela i fiksirane sa BD CYTOFIX ™, sve prema uputstvima proizvođača. Finalne ćelijske pelete su resuspendovane u 0,5 ml pufera za bojenje i analizirane korišćenjem BD FACSCALIBUR ™ i BD CELLQUEST PRO ™ softvera. Sva antitela (BD Pharmingen) su pripremljena u masenom razblaženju / koktelu i dodata su u krajnjoj koncentraciji od 0,5 mg/10<5>ćelija. Kokteli antitela za bojenje koštane srži (A-D) bili su sledeći: A: anti-mišji IgM<b>-FITC, antimišji IgM<a>-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; B: anti-mišji CD43(S7)-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; C: anti-mišji CD24(HSA)-PE; anti-mišji CD45R(B220)-APC; D: anti-mišji BP-1-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC. Kokteli sa antitelima za bojenje slezine i ingvinalnih limfnih čvorova (E-H) bili su sledeći: E: anti-mišji IgM<b>-FITC, anti-mišji IgM<a>-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; F: anti-mišji Ig, λ1, λ2, λ3 laki lanac-FITC, anti-mišji Igκ laki lanac-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; G: anti-mišji Li6G/C-FITC, anti-mišji CD49b(DX5)-PE, anti- mišji CD11b-APC; H: anti-mišji CD4(L3T4)-FITC, anti-mišji CD45R(B220)-PE, anti-mišji CD8a-APC.
Rezultati su prikazani na Sl.6
[0209] Limfociti izolovani iz slezine ili limfnog čvora homozigotnih VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa su obojeni za površinsku ekspresiju markera B220 i IgM i analizirani protočnom citometrijom (Slika 6). Veličine zrelih B ćelijskih populacija B220<+>IgM<+>u svim verzijama ispitivanih humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® bile su zapravo identične onima od miševa divljeg tipa, bez obzira na broj<VH genskih>segmenata koji su oni sadržali. Dodatno, miševi koji sadrže homozigotne hibridne humanizovane lokuse teškog lanca imunoglobulina, čak i oni sa samo 3 VHgenskih segmenata, alinormalnim mišjimimunoglobulinskim lokusima lakog lanca κ ili miševi koji sadrže homozigotne hibridne humanizovane lokuse lakog lanca κ sa normalnim mišjim imunoglobulinskim lokusima teškog lanca, takođe su imali normalan broj B220<+>IgM<+>ćelija u njihovim perifernim odeljcima (nisu prikazane). Ovi rezultati pokazuju da himerni lokusi sa humanim varijabilnim genskim segmentima i mišjim konstantnim regionima mogu u potpunosti naseliti odeljke zrele B ćelije. Nadalje, broj varijabilnih genskih segmenata bilo u lokusima teškog lanca ili lakog lanca κ, a samim tim i teorijska raznolikost repertoara antitela, nije u korelaciji sa sposobnošću generisanja populacija divljih vrsta od zrelih B ćelija. Suprotno, miševi sa slučajno integrisanim transgenima imunoglobulina koji su potpuno humani i inaktiviranim lokusom imunoglobulina miša imaju smanjen broj B ćelija u ovim odeljcima, sa težinom deficita u zavisnosti od broja varijabilnih genskih segmenata koji su uključeni u transgene (Green, LL, i Jakobovits, A. (1998) Regulacija razvoja B ćelija varijabilnom složenošću gena kod miševa rekonstituisanih sa veštačkim hromozomima kvasca humanog imunoglobulina, J Exp Med 188: 483-495). Ovo pokazuje da strategija „in situ genetske humanizacije“ rezultira bitno drugačijim funkcionalnim ishodom od slučajno integrisanih transgena postignutih u „knockout-plus-transgenic“ pristupu.
Alelsko isključenje i izbor lokusa.
[0210] Sposobnost održavanja isključenja alela je ispitivana kod heterozigotnih miševa za različite verzije humanizovanog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca.
[0211] Humanizacija imunoglobulinskih lokusa je izvedena u F1 ES liniji (F1 H4 (Valenzuela i sar., 2003)), izvedenih iz heterozigotnih embriona 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac. Varijabilne sekvence gena germinativnih linija humanog teškog lanca su ciljane na alel 129S6, koji nosi IgM<a>haplotip, dok nemodifikovani mišji alel C576BL/6N alel nosi IgM<b>haplotip. Ovi alelni oblici IgM-a se mogu razlikovati protočnom citometrijom koristeći antitela specifična za polimorfizme nađene u alelima IgM<a>ili IgM<b>. Kao što je prikazano na Sl. 6 (donji red), B ćelije identifikovane kod heterozigotnih miševa za svaku verziju humanizovanog lokusa teškog lanca izražavaju samo jedan alel, bilo IgM<a>(humanizovani alel) ili IgM<b>(alel divljeg tipa). Ovo pokazuje da su mehanizmi koji su uključeni u isključenje alela netaknuti kod VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa. Dodatno, relativni broj B ćelija pozitivnih za humanizovani<alel>(IgM<a>) je otprilike proporcionalan broju prisutnih segmenata VHgena. Humanizovaniimunoglobulinski lokusje izražen u oko 30% B ćelija u VELOCIMMUNE® 1 humanizovanim<heterozigotnim miševima, koji imaju 18 humanih V>H<genskih segmenata i u 50% B ćelija u>VELOCIMMUNE® 2 i 3 (nije prikazano)humanizovanom heterozigotnim miševima, sa 39 i 80 humanih<V>H<segmenata gena, respektivno. Značajno,>odnos ćelija koje izražavaju humanizovani prema alelu mišadivljeg tipa (0,5 za VELOCIMMUNE® 1humanizovane miševe i 0,9 za VELOCIMMUNE® 2 humanizovane miševe) je veći od odnosa broja varijabilnih genskih segmenata sadržanih u humanizovanim u odnosu na divlje vrste lokusa (0,2 za VELOCIMMUNE® 1 humanizovane miševe i 0,4 za VELOCIMMUNE® 2 humanizovane miševe). Ovo može ukazivati da je verovatnoća izbora alela posredovana između slučajnog izbora jednog ili drugog hromozoma i slučajnog izbora bilo kog posebnog V segmenta RSS. Dalje, može biti frakcija B-ćelija, ali ne potpuna, u kojoj jedan alel postaje dostupan za rekombinaciju, kompletira proces i isključuje rekombinaciju pre nego što drugi alel postane dostupan. Dodatno, ravnomerna raspodela ćelija koje imaju površinski IgM (sIgM) izvedene bilo iz hibridnog humanizovanog lokusa teškog lanca ili lokusa teškog lanca miša divljeg tipa je dokaz da hibridni lokus deluje pri normalnom nivou. Suprotno tome, nasumično integrisani humani imunoglobulinski transgeni se slabo takmiče sa lokusima imunoglobulina miša divljeg tipa (Bruggemann, M., i sar. (1989) Repertoar monoklonskih antitela sa humanim teškim lancima iz transgenih miševa. PNAS 86, 6709-6713; Green i sar. (1994); Tuaillon, N. i sar. (1993) Rekombinacija minilokusa teškog lanca humanog imunoglobulina u transgenim miševima: upotreba genskog segmenta u mu i gama transkriptima, Proc Natl Acad Sci USA 90: 3720-3724). Ovo dalje pokazuje da su imunoglobulini proizvedeni od VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa funkcionalno različiti od onih proizvedenih slučajno integrisanim transgenima kod miševa dobijenim „knockout-plus-transgenim“ pristupima.
[0212] Polimorfizmi Cκ regiona nisu dostupni u 129S6 ili C57BL/6N da bi se ispitala alelna isključenost humanizovanih nasuprot nehumanizovanim lokusima lakog lanca κ. Međutim, svi VELOCIMMUNE® humanizovani miševi poseduju lokuse lakog lanca λ miša divljeg tipa, pa je moguće uočiti da li preuređivanje i ekspresija humanizovanih lokusa lakog lanca κ mogu sprečiti ekspresiju lakog lanca λ miša. Odnos broja ćelija koje izražavaju humanizovani laki lanac κ u odnosu na broj ćelija koje izražavaju laki lanac miša λ bio je relativno nepromenjen u humanizovanim miševima VELOCIMMUNE® u poređenju sa miševima divljeg tipa, bez obzira na broj humanih Vκ genskih segmenata koji su ubačeni na lokusu lakog lanca κ (slika 6, treći red odozgo). Pored toga, nije došlo do povećanja broja dvostruko pozitivnih (κ plus λ) ćelija, što ukazuje da produktivna rekombinacija na hibridnim lokusima lakog lanca κ rezultira odgovarajućom supresijom rekombinacije mišjih lokusa lakog lanca λ. Suprotno tome, miševi koji sadrže nasumično integrisane transgene lakog lanca κ sa inaktiviranim mišjim lokusima lakog lanca κ - ali lokusima lakog lanca λ miša divljeg tipa -pokazuju dramatično povećane odnose λ / κ (Jakobovits, 1998), implicirajući da uvedeni transgeni lakog lanca κ ne funkcionišu dobro kod takvih miševa. Ovo dalje pokazuje različiti funkcionalni ishod primećen u imunoglobulinama napravljenim od strane humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® u poređenju sa onima koje su napravili „knockout plus-transgeni“ miševi.
Razvoj B ćelija.
[0213] Pošto populacija zrelih B ćelija u VELOCIMMUNE® humanizovanim miševima liči na one od miševa divljeg tipa (gore opisane), moguće je da se oštećenja u ranoj diferencijaciji B ćelija nadoknađuju ekspanzijom populacija zrelih B ćelija. Različite faze B ćelijske diferencijacije su ispitivane analizom B ćelijskih populacija korišćenjem protočne citometrije. Tabela 6 prikazuje odnos frakcije ćelija u svakoj B ćelijskoj liniji definisan FACs-om, korišćenjem određenih ćelijskih površinskih markera, kod VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa u poređenju sa leglima divljih vrsta.
[0214] Rani razvoj B ćelija se događa u koštanoj srži, a različite faze diferencijacije B ćelija su karakterisane promenama u tipovima i količinama ekspresije površinskog ćelijskog markera. Ove razlike u površinskoj ekspresiji su u korelaciji sa molekularnim promenama koje se dešavaju na imunoglobulinskim lokusima unutar ćelije. Prelaz pro-B u pre-B ćeliju zahteva uspešno preuređivanje i ekspresiju funkcionalnog proteina teškog lanca, dok je prelazak iz pre-B u zreli B stadijum vođen pravilnim preuređivanjem i ekspresijom lakog lanca κ ili λ. Stoga, neefikasan prelaz između stadijuma diferencijacije B ćelija može biti otkriven promenama relativnih populacija B ćelija u datoj fazi.
Tabela 6
[0215] Nisu uočena veća oštećenja u diferencijaciji B ćelija kod bilo kojih od VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa. Čini se da uvođenje genskih segmenata humanog teškog lanca ne utiče na pro-B u pre-B tranziciju, a uvođenje genskih segmenta humanog lakog lanca κ ne utiče na pre-B u B tranziciju kod VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa. Ovo pokazuje da „reverzno himerni“ imunoglobulinski molekuli koji poseduju humane varijabilne regione i mišje konstantne regione normalno funkcionišu u kontekstu B ćelijske signalizacije i ko-receptorskih molekula što dovodi do odgovarajuće diferencijacije B ćelija u mišjem okruženju. Suprotno tome, ravnoteža između različitih populacija tokom diferencijacije B ćelija je poremećena do različitih stepena kod miševa koji sadrže nasumično integrisane imunoglobulinske transgene i inaktivirane endogene lokuse teškog lanca ili lakog lanca κ (Green i Jakobovits (1998)).
Primer IV
Varijabilni genski repertoar kod humanizovanih imunolobulinskih miševa
[0216] Korišćenje humanih varijabilnih genskih segmenata u repertoaru humanizovanih antitela od humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® je analizirano reverznom transkriptazom-lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR) humanih varijabilnih regiona iz više izvora, uključujući splenocite i ćelije hibridoma. Određene su sekvence varijabilnog regiona, upotreba genskih segmenata, somatska hipermutacija i različitost spajanja preuređenih segmenata gena varijabilnog regiona.
[0217] Ukratko, ukupna RNK je ekstrahovana iz 1 x 10<7>- 2 x 10<7>splenocita ili oko 10<4>- 10<5>ćelija hibridoma koristeći TRIZOL ™ (Invitrogen) ili Qiagen RNEASY ™ Mini Kit (Qiagen) i prajmovana sa specifičnim prajmerima konstantnog regiona miša korišćenjem SUPERSCRIPT™ III RT-PCR sistema u jednom koraku (Invitrogen). Reakcije su izvedene sa 2-5 μL RNK iz svakog uzorka koristeći gore pomenute 3' konstantne specifične prajmere uparene sa udruženim vodećim prajmerima za svaku familiju humanih varijabilnih regiona za oba teški lanac i za laki lanac κ, odvojeno. Zapremine reagenasa i prajmera i RT-PCR/PCR uslovi su izvedeni prema uputstvima proizvođača. Sekvence prajmera su zasnovane na višestrukim izvorima (Wang, X. i Stollar, B.D. (2000) Analiza gena varijabilnog regiona humanog imunoglobulina pomoću pojedinačne ćelije RT-PCR, J Immunol Methods 244: 217-225; Ig- prajmer setovi, Novagen). Gde je to prikladno, uklopljene sekundarne reakcije PCR su izvedene su sakupljenim familijarnim specifičnim okvirnim prajmerima i istim mišjim 3' imunoglobulinskim konstantno specifičnim prajmerom korišćenim u primarnoj reakciji. Alikvoti (5 μL) iz svake reakcije su analizirani agaroznom elektroforezom i reakcioni proizvodi su prečišćeni od agaroze korišćenjem MONTAGE™ gel ekstrakcionog kompleta (Millipore). Prečišćeni proizvodi su klonirani pomoću sistema za kloniranje TOPO ™ TA (Invitrogen) i transformisani u ćelije DH10β E.coli elektroporacijom. Individualni klonovi su odabrani iz svake reakcije transformacije i gajeni u 2ml kulturama LB bujona sa selekcijom antibiotika preko noći na 37 ° C. DNK plazmida je prečišćena iz bakterijskih kultura pomoću pristupa na bazi kompleta (Qiagen).
Upotreba varijabilnog gena imunoglobulina.
[0218] DNK plazmida oba klona teškog i lakog lanca κ su sekvencirane bilo sa T7 ili M13 reverznim prajmerima na ABI 3100 genetičkom analizatoru (primenjeni biosistemi). Podaci o sirovoj sekvenci su uneseni u SEQUENCHER ™ (v4.5, genetski kodovi). Svaka sekvenca je sastavljena u kontige i poravnana sa humanim imunoglobulinskim sekvencama korišćenjem IMGT V-Quest (Brochet, X. i sar. (2008) IMGT / V-QUEST: visoko prilagođeni i integrisani sistem za IG i TR standardizovanu analizu V-J i V- D-J sekvenci. Nucleic Acids Res 36: W503-508) funkcija pretraživanja za identifikaciju korišćenja<humanog VH, DH, JH i Vκ, Jκ>segmenta. Sekvence su upoređivane sa sekvencama germinativne linije zasomatsku hipermutaciju i analizurekombinacionog spajanja.
[0219] Miševi su generisani iz ES ćelija koje sadrže početnu modifikaciju teškog lanca (3hVH-CREhibridnialel, dno slike 2A) RAG komplementacijom (Chen, J. i sar. (1993) Komplementacija blastociste sa nedostatkom RAG-2: test funkcije gena u razvoju limfocita, Proc Natl Acad Sci USA 90: 4528-4532), a cDNK je pripremljena iz RNK splenocita. cDNK je amplifikovana korišćenjem setova prajmera (opisanih gore) specifičnih za predviđenu himernu mRNA teškog lanca koja bi nastala V(D)J rekombinacijom unutar umetnutih segmenata humanog gena i posledičnim spajanjem na bilo koji mišji IgM ili IgG konstantni domen. Sekvence izvedene iz ovih klonova cDNK (nisu prikazane) su pokazale da je došlo do odgovarajuće V(D)J rekombinacije unutar sekvenci humanih varijabilnih gena, da su preuređeni segmenti humanog V(D)J gena pravilno spojeni unutar okvira sa konstantnim domenima miša i da je došlo do rekombinacije prebačaja klase. Izvršena je dalja analiza sekvenci proizvoda mRNA sledećeg hibridnog lokusa imunoglobulina.
[0220] U sličnom eksperimentu, B ćelije iz neimunizovanih miševa divljeg tipa i humanizovanih VELOCIMMUNE® miševa su razdvojene protočnom citometrijom na osnovu površinske ekspresije<B220 i>IgM ili IgG. B220<+>IgM<+>ili površinske IgG<+>(sIgG<+>) ćelije su objedinjene i sekvence VHi VKsudobijenenakon RT-PCR amplifikacije i kloniranja (gore opisano). Reprezentativna upotreba gena u kompletu RT-PCR amplifikovanih cDNK iz neimunizovanih humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® 1 (Tabela 7) i humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® 3 (Tabela 8) je zabeležena (*nepotpun RSS;
†nedostajući ili pseudogen).
Tabela 7
Tabela 8
[0221] Kao što je prikazano u tabelama 7 i 8, korišćeni su skoro svi funkcionalni humani segmenti gena<VH,>DH, JH, Vκ i Jκ. Od opisanih funkcionalnih varijabilnih genskih segmenata, ali ne i otkrivenih kod VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa iz ovog eksperimenta, za nekoliko njih je prijavljeno da poseduju nepotpune rekombinacione signalne sekvence (RSS), pa se, stoga, ne očekuje da budu eksprimirani (Feeney, A.J. (2000) Faktori koji utiču na formiranje B ćelijskog repertoara. Immunol Res 21: 195-202). Analiza nekoliko drugih setova imunoglobulinskih sekvenci iz različitih humanizovanih miševa VELOCIMMUNE®, izolovanih iz oba naivnih i imunizovanih repertoara, pokazala je upotrebu ovih segmenata gena, iako na nižim frekvencijama (podaci nisu prikazani). Sakupljeni podaci o korišćenju<gena pokazuju da su svi funkcionalni humani V>H<, D>H<, J>H<, Vκ i Jκ genski segmenti sadržani u>humanizovanim miševima VELOCIMMUNE® primećeni u različitim prirodnim i imunizovanim<repertoarima (podaci nisu prikazani). Iako je humani V>H<7-81 genski segment identifikovan u analizi>sekvenci lokusa humanog teškog lanca (Matsuda, F. i sar. (1998) kompletna nukleotidna sekvenca humanog imunoglobulinskog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca, J Exp Med 188: 2151-2162), nije prisutna u humanizovanim miševima VELOCIMMUNE®, što je potvrđeno ponovnim sekvenciranjem potpuno humanizovanog genoma miša VELOCIMMUNE® 3.
[0222] Poznato je da sekvence teških i lakih lanaca antitela pokazuju izuzetnu varijabilnost, posebno u kratkim polipeptidnim segmentima unutar reorganizovanog varijabilnog domena. Ovi regioni, poznati kao hipervarijabilni regioni ili regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) stvaraju vezivno mesto za antigen u strukturi molekula antitela. Umešane polipeptidne sekvence se nazivaju okvirnim regionima (FR). Postoje tri CDR-a (CDR1, CDR2, CDR3) i 4 FR-a (FR1, FR2, FR3, FR4) u teškim i lakim lancima.<Jedan CDR, CDR3>je jedinstven po tome što je ovaj CDR stvoren rekombinacijom oba VH, DHi JHi Vκ iJκ segmenata gena istvara značajnu količinu repertoarske raznolikosti pre susreta sa antigenom. Ovo spajanje je neprecizno usled obe nukleotidne delecije putem aktivnosti egzonukleaze i dodataka kodiranih bez šablona preko terminalne deoksinukleotidil transferaze (TdT) i, stoga, omogućava novim sekvencama da nastanu iz procesa rekombinacije. Iako FR-ovi mogu da pokazuju značajne somatske mutacije usled visoke mutabilnosti varijabilnog regiona u celini, varijabilnost nije, međutim, distribuirana ravnomerno duž varijabilnog regiona. CDR regioni su koncentrovani i lokalizovani regioni visoke varijabilnosti na površini molekula antitela koja omogućavaju vezivanje antigena. Sekvence teškog i lakog lanca odabranih
antitela iz humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® oko CDR3 spoja pokazujući raznolikost spajanja su prikazane na Sl.7A i 7B, respektivno.
[0223] Kao što je prikazano na Sl.7A, dodaci nukleotida kodirani bez šablona (N-adicije) su primećeni<na oba>spoja VH-DHi DH-JHu antitelima iz humanizovanih miševa VELOCIMMUNE®, što ukazuje na ispravnu funkciju TdT sa humanim segmentima. Završne tačke VH, DHi JHsegmenata u odnosu na njihovekopijegerminativne linije pokazuju da je takođe došlo do aktivnosti egzonukleaze. Za razliku od lokusa teškog lanca, rekonstrukcija humanog lakog lanca κ pokazuje malo ili nimalo dodavanja TdT na CDR3, koji nastaje rekombinacijom Vκ i Jκ segmenata (slika 7B). Ovo je očekivano zbog nedostatka TdT ekspresije kod miševa tokom preuređenja lakog lanca na prelazu pre-B u B ćelije. Raznolikost koja je uočena u CDR3 preuređenih humanih Vκ regiona je uvedena pretežno putem aktivnosti egzonukleaze tokom događaja rekombinacije.
Somatska hipermutacija.
[0224] Dodatna raznolikost je dodata varijabilnim regionima preuređenih imunoglobulinskih gena tokom reakcije germinalnog centra procesom nazvanim somatskom hipermutacijom. B ćelije koje izražavaju somatsko mutirane varijabilne regione takmiče se sa drugim B ćelijama za pristup antigenu predstavljenom od strane folikularnih dendritičkih ćelija. One B ćelije sa većim afinitetom prema antigenu će se dalje proširiti i podvrgnuti prelasku klase pre izlaska na periferiju. Stoga, B ćelije koje eksprimiraju prebačene izotipove su obično susrele antigen i pretrpele reakcije germinalnog centra i imaće povećan broj mutacija u odnosu na prirodne B ćelije. Nadalje, očekuje se da će sekvence varijabilnog regiona iz pretežno naivnih sIgM<+>B ćelija imati relativno manje mutacija nego varijabilne sekvence iz sIgG<+>B ćelija koje su prošle selekciju antigena.
[0225] Sekvence iz slučajnih VHili Vκ klonova iz sIgM<+>ili sIgG<+>B ćelija neimunizovanih humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® ili sIgG<+>B ćelija imunizovanih miševa su poređene sa njihovim varijabilnim genskim segmentima germinativne linije i zabeležene su promene u odnosu na sekvence germinativne linije. Dobijene nukleotidne sekvence su prevedene in silico i mutacije koje vode do promena aminokiselina su takođe zabeležene. Podaci su prikupljeni iz svih varijabilnih regiona i izračunat je procenat promene na datom položaju (SL. 8).
[0226] Kao što je prikazano na SL. 8, varijabilni regioni humanog teškog lanca izvedeni iz sIgG<+>B ćelija neimunizovanih VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa ispoljavaju mnogo više nukleotida u odnosu na sIgM<+>B ćelije iz istih bazena splenocita, a varijabilni regioni teškog lanca dobijeni od imunizovanih miševa ispoljavaju još više promena. Broj promena je povećan u regionima koji određuju komplementarnost (CDR) u odnosu na okvirne regione, što ukazuje na izbor antigena. Odgovarajuće sekvence aminokiselina iz varijabilnih regiona humanog teškog lanca takođe pokazuju značajno veći broj mutacija u IgG vs IgM i još više u imunizovanom IgG. Ove mutacije se izgleda ponovo pojavljuju kao češće u CDR regionima u poređenju sa sekvencama okvira, što sugeriše da su antitela odabrana od strane
antigena in vivo. Sličan porast u broju mutacija nukleotida i aminokiselina je viđen u Vκ sekvencama dobijenim iz IgG<+>B ćelija imunizovanih miševa.
[0227] Uočena upotreba gena i somatska hipermutacija kod humanizovanih miševa VELOCIMMUNE® pokazuju da su u osnovi svi prisutni segmenti gena sposobni za preuređivanje da obrazuju potpuno funkcionalno reverzna himerna antitela kod ovih miševa. Dalje, antitela dobijena iz humanizovanog miša VELOCIMMUNE u potpunosti učestvuju u mišjem imunološkom sistemu da bi prošla selekciju afiniteta i sazrevanje radi stvaranja potpuno zrelih humanih antitela koja mogu efikasno neutralizovati njihov ciljni antigen. VELOCIMMUNE® humanizovani miševi su sposobni da podignu snažne imunološke odgovore na više klasa antigena koji rezultiraju upotrebom širokog niza humanih antitela koja su i visokog afiniteta i pogodna za terapeutsku upotrebu (podaci nisu prikazani).
Primer V
Analiza limfoidne strukture i serumskih izotipa
[0228] Grube strukture slezine, ingvinalnih limfnih čvorova, Peyer-ovih flastera i timusa od uzoraka tkiva divljih vrsta ili VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa obojenih H&E su ispitani svetlosnom mikroskopijom. Nivoi imunoglobulinskih izotipa u serumu prikupljeni od divljih vrsta i VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa su analizirani korišćenjem LUMINEX ™ tehnologije.
Struktura limfoidnih organa.
[0229] Struktura i funkcija limfoidnih tkiva delom zavise od pravilnog razvoja hematopoetskih ćelija. Greška u razvoju ili funkciji B ćelija može biti ispoljena kao promena u strukturi limfoidnih tkiva. Analizom obojenih isečaka tkiva nije utvrđena značajna razlika u izgledu sekundarnih limfoidnih organa između divljeg tipa i VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa (podaci nisu prikazani).
Nivoi serumskih imunoglobulina.
[0230] Nivo ekspresije svakog izotipa je sličan kod divljeg tipa i VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa (SL. 9A, 9B i 9C). Ovo pokazuje da humanizacija varijabilnih genskih segmenata nije imala očigledan neželjeni efekat na klasno prebacivanje ili ekspresiju i sekreciju imunoglobulina i stoga očigledno održava sve endogene mišje sekvence potrebne za ove funkcije.
Primer VI
Imunizacija i proizvodnja antitela kod humanizovanih imunolobulinskih miševa
[0231] Različite verzije VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa su imunizovane antigenom da bi se ispitao humoralni odgovor prema izazivanju stranog antigena.
Imunizacija i razvoj hibridoma.
[0232] VELOCIMMUNE® humanizovani i divlji miševi mogu biti imunizovani sa antigenom u obliku proteina, DNK, kombinacije DNK i proteina ili ćelija koje eksprimiraju antigen. Životinje se obično pojačavaju svake tri nedelje ukupno dva do tri puta. Nakon svakog pojačanja antigena, sakupljaju se uzorci seruma svake životinje i analiziraju na antigen specifične odgovore antitela određivanjem titra seruma. Pre fuzije, miševi su primili konačno pojačanje pre fuzije od 5 μg proteina ili DNK, kao što je željeno, intraperitonealnim i / ili intravenskim injekcijama. Splenociti su sakupljeni i fuzionisani sa ćelijama mijeloma Ag8.653 u elektrofuzionoj komori, u skladu sa protokolom predloženim od strane proizvođača (Cyto Pulse Sciences Inc., MD Glen Bumie, MD). Deset dana nakon kulture, hibridomi se pretražuju na specifičnost antigena korišćenjem ELISA testa (Harlow, E. i Lane, D. (1988): Antitela: Laboratorijski priručnik. Cold Spring Harbor Press, Njujork). Alternativno, B ćelije specifične za antigen su izolovane direktno iz imunizovanih VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa i pregledane korišćenjem standardnih tehnika, uključujući i one ovde opisane, za dobijanje humanih antitela specifičnih za antigen od interesa.
Određivanje serumskog titra.
[0233] Da bi se pratio životinjski serumski odgovor protiv antigena, uzorci seruma su sakupljeni oko 10 dana nakon svakog pojačanja, a titri su određeni korišćenjem ELISA specifične za antigen. Ukratko, ploče Nunc MAXISORP ™ sa 96 bazenčića su obložene sa 2 μg/mL antigena preko noći na 4 ° C i blokirane sa goveđim serumskim albuminom (Sigma, St. Louis, MO). Uzorci seruma u serijskim trostrukim razblaženjima su ostavljeni da se vežu za ploče tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane sa PBS-om koji sadrži 0,05% Tween-20, a vezani IgG se detektuje korišćenjem kozjeg anti-mišjeg Fc konjugovanog sa HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) za ukupni titar IgG, ili izotipski specifična ili specifična za laki lanac poliklonska antitela obeležena biotinom (SouthernBiotech Inc.) za titre specifične za izotip, respektivno. Za antitela obeležena biotinom, nakon ispiranja ploče, dodat je HRP-konjugovani streptavidin (Pierce, Rockford, IL). Sve ploče su razvijene korišćenjem kolorimetrijskih podloga kao što su BD OPTEIA ™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Nakon zaustavljanja reakcije sa 1M fosfornom kiselinom, zabeležene su optičke apsorpcije na 450 nm i podaci su analizirani korišćenjem PRISM ™ softvera od Graph Pad-a. Razblaženja potrebna za dobijanje dvostrukog pozadinskog signala su definisana kao titar.
[0234] U jednom eksperimentu, humanizovani VELOCIMMUNE® miševi su imunizovani humanim interleukin-6 receptorom (hIL-6R). Reprezentativni set serumskih titara za
VELOCIMMUNE® i miševe divljeg tipa imunizovane sа hIL-6R prikazani su na SL.10A I 10B.
[0235] VELOCIMMUNE® humanizovani i miševi divljeg tipa su uspostavili snažne odgovore prema IL- 6R sa sličnim rasponima titra (SL.10A). Nekoliko miševa iz VELOCIMMUNE® humanizovanih i kohorti divljeg tipa postiglo je maksimalan odgovor nakon pojedinačnog pojačanja antigenom. Ovi rezultati ukazuju da su snaga i kinetika imunog odgovora na ovaj antigen bili slični kod humanizovanih VELOCIMMUNE® i divljih vrsta miševa. Ovi odgovori antitela specifični za antigen su dalje analizirani da bi se ispitali određeni izotipovi antitela specifičnih za antigen koji su pronađeni u serumima. Obe VELOCIMMUNE® humanizovane i divlje grupe su pretežno izazvale IgG1 odgovor (SL. 10B), sugerišući da je prebacivanje klase tokom humoralnog odgovora slično kod miševa od svakog tipa.
Određivanje afiniteta vezivanja antitela za antigen u rastvoru.
[0236] Test takmičenja u rastvoru na bazi ELISA je obično dizajniran za određivanje afiniteta vezivanja antitela za antigen.
[0237] Ukratko, antitela u kondicioniranom medijumu su pomešana sa serijskim razblaženjima antigenskog proteina u rasponu od 0 do 10 mg/mL. Rastvori smeše antitela i antigena su zatim inkubirani tokom dva do četiri sata na sobnoj temperaturi da se postigne ravnoteža vezivanja. Količine slobodnog antitela u smešama su zatim izmerene korišćenjem kvantitativne sendvič ELISA. Devedeset-šest bazenčića MAXISORB ™ ploča (VWR, West Chester, PA) je obloženo su 1 μg/mL antigenskog proteina u PBS rastvoru preko noći na 4 ° C, praćeno BSA nespecifičnim blokiranjem. Rastvori smeše antitelo- antigen su zatim prebačeni u ove ploče nakon čega je usledila jednočasovna inkubacija. Ploče su zatim isprane sa puferom za pranje i detektovana su antitela vezana za ploču sa HRP-konjugovanim reagensom kozjeg anti-mišjeg IgG poliklonskog antitela (Jackson Immuno Research Lab) i razvijena korišćenjem kolorimetrijskih podloga kao što je BD OPTEIA ™ (BD Biosciences Pharmingen, San Dijego, Kalifornija). Nakon zaustavljanja reakcije sa 1M fosfornom kiselinom, zabeležene su optičke apsorpcije na 450 nm i podaci su analizirani korišćenjem PRISM ™ softvera od Graph Pad-a.
Zavisnost signala od koncentracije antigena u rastvoru je analizirana analizom podešavanja 4 parametra i prijavljena kao IC50, koncentracija antigena potrebna za postizanje 50% smanjenja signala iz uzorakaantitelabez prisustva antigena u rastvoru.
[0238] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE® humanizovani miševi su imunizovani hIL-6R (kao što je gore opisano). SL. 11A i 11B prikazuju reprezentativan skup merenja afiniteta za antitela protiv hIL6R iz humanizovanih VELOCIMMUNE® i divljih miševa.
[0239] Nakon što su imunizovani miševi primili treće antigensko pojačanje, serumski titri su određeni pomoću ELISA. Splenociti su izolovani iz odabranih kohorti divljeg tipa i VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa i spojeni sa mijelomskim ćelijama Ag8.653 da bi formirali hibridome i uzgajali se selekcijom (kao što je gore opisano). Od ukupno proizvedenih 671 anti-IL-6R hibridoma, pronađeno je da 236 eksprimira antitela specifična za antigen. Medijumi sakupljeni iz bazenčića pozitivnih na antigen su korišćeni za određivanje afiniteta antitela za vezivanje za antigen, korišćenjem ELISA kompeticije u
rastvoru. Antitela dobijena iz VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa pokazuju širok raspon afiniteta u vezivanju za antigen u rastvoru (SL 11A). Pored toga, za 49 od 236 anti-IL-6R hibridoma je nađeno da blokiraju vezivanje IL-6 za receptor u in vitro biološkom testu (podaci nisu prikazani). Dalje, ovih 49 anti- IL-6R blokirajućih antitela ispoljava niz visokih afiniteta u rastvoru sličnih onima od blokirajućih antitela izvedenih iz paralelne imunizacije miševa divljeg tipa (SL.11B).
Primer VII
Izgradnja mišjeg vektora za ciljanje ADAM6
[0240] Ciljajući vektor za ubacivanje mišjih ADAM6a i ADAM6b gena u humanizovani lokus teškog lanca je konstruisan korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (supra) za modifikaciju bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) 929d24, dobijenog od dr. Fred Alta (Univerzitet Havard). Konstruisana je DNK BAC 929d24 da sadrži genomske fragmente koji sadrže mišje ADAM6a i ADAM6b gene i higromicinsku kasetu za ciljano brisanje humanog pseudogena ADAM6 (hADAM6Ψ)<smeštenog>između humanih VH1-2 i VH6-1 genskih segmenata humanizovanog lokusa teškog lanca (SL.12).
[0241] Prvo, subkloniran je genomski fragment koji sadrži mišji gen ADAM6b, -800 bp od ushodne (5') sekvence i -4800 bp od nishodne (3') sekvence iz klona 929d24 BAC. Drugi genomski fragment koji sadrži mišji ADAM6a gen, ~ 300 bp od ushodne (5') sekvence i -3400 bp od nishodne (3') sekvence, odvojeno je subkloniran iz klona 929d24 BAC. Dva genomska fragmenta koji sadrže mišje ADAM6b i ADAM6a gene su vezana za higromicinsku kasetu okruženu sa Frt rekombinacionim položajima da bi se stvorio vektor ciljanja (Mišji ADAM6 ciljajući vektor, Slika 20; SEK ID BR: 3). Različiti položaji restrikcionih enzima su konstruisani na 5' kraju ciljanog vektora prateći mišji gen ADAM6b i na 3' kraju prateći mišji gen ADAM6a (dno SL.12) za vezivanje u humanizovani lokus teškog lanca.
[0242] Posebna modifikacija je izvršena za BAC klon koji sadrži zamenu lokusa teškog lanca miša sa<lokusom>humanog teškog lanca, uključujući humani pseudogen ADAM6 smešten između humanih VH1- 2 i VH6-1 genskih segmenata humanizovanog lokusa za naknadno vezivanje mišjeg ADAM6 ciljajućegvektora (SL 13).
[0243] Ukratko, dizajnirana je neomicinska kaseta okružena sa rekombinacionim položajima loxP da<sadrži>homologne krake koji sadrže humanu genomsku sekvencu na položajima 3' humanog VH1-2 genskog segmenta (5' u odnosu na hΑDΑΜ6Ψ) i 5' segmenta humanog gena VH6-1. (3' u odnosu nahΑDΑΜ6Ψ; videti sredinuSL. 13). Lokacija mesta umetanja ovog ciljanog konstrukta je bila oko 1,3 kb 5' i -350 bp 3' od humanog ADAM6 pseudogena. Konstrukt ciljanja je takođe uključivao ista mesta restrikcije kao mišji ADAM6 ciljani vektor da se omogući naknadna BAC ligacija između modifikovanog BAC klona koji sadrži deleciju humanog ADAM6 pseudogena i mišjeg ADAM6 ciljanog vektora.
[0244] Nakon digestije BAC DNK izvedene iz oba konstrukta, genomski fragmenti su vezani zajedno da bi se konstruisao BAC klon koji sadrži humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopično postavljenu genomsku sekvencu koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b nukleotidne sekvence. Konačni ciljajući konstrukt za deleciju humanog gena ADAM6 unutar humanizovanog lokusa teškog lanca i umetanje sekvenci mišjeg ADAM6a i ADAM6b u sadržane ćelije ES, od 5' do 3', 5' genomski fragment koji sadrži<-13 kb humane>genomske sekvence 3' iz segmenta humanog gena VH1-2, ~ 800 bp mišje genomskesekvence nishodno odmišjeg gena ADAM6b, mišjeg ADAM6b gena, ~ 4800 bp genomske sekvence ushodno od mišjeg gena ADAM6b, 5' Frt mesta, kaseta higromicina, 3' Frt položaj, -300 bp mišje genomske sekvence nishodno od mišjeg gena ADAM6a, mišjeg ADAM6a gena, ~ 3400 bp mišje genomske sekvence ushodno od mišjeg gena ADAM6a i 3' genomski fragment koji sadrži ~ 30 kb humane<genomske sekvence 5' segmenta humanog gena>VH6-1 (dno na SL.13).
[0245] Konstruisani BAC klon (gore opisan) je korišćen za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje su sadržale humanizovani lokus teškog lanca da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže mišju genomsku sekvencu ektopično smeštenu, a koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence unutar humanizovanog lokusa teškog lanca. Pozitivne ES ćelije koje sadrže ektopični mišji genomski fragment u humanizovanom lokusu teškog lanca su identifikovane kvantitativnim PCR testom korišćenjem TAQMAN ™ proba (Lie, Y.S. i Petropoulos, C.J. (1998). Napredak u kvantitativnoj PCR tehnologiji: testovi 5' nukleaze. Curr Opin Biotechnol 9 (1): 43-48). Ushodni i nishodni regioni izvan modifikovanog dela humanizovanog lokusa teškog lanca su potvrđeni PCR-om, korišćenjem prajmera i proba smeštenih u modifikovanom regionu da bi se potvrdilo prisustvo ektopične genomske sekvence miša u humanizovanom lokusu teškog lanca, kao i higromicinske kasete. Nukleotidna sekvenca duž ushodne tačke umetanja uključivala je sledeće, što ukazuje na genomsku sekvencu humanog teškog lanca ushodno od tačke umetanja i I-CeuI mesto restrikcije (sadržano u zagradama dole), neposredno povezanu sa genomskom sekvencom miša prisutnom u tački umetanja: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEK ID BR: 4). Nukleotidna sekvenca duž nishodne tačke umetanja na 3' kraju ciljanog regiona uključivala je sledeće, što ukazuje na genomsku sekvencu miša i mesto restrikcije PI-SceI (koje se nalaze u zagradama dole), neposredno povezanu sa genomskom sekvencom humanog teškog lanca nishodno od tačke umetanja: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAG- CTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEK ID BR: 5).
[0246] Ciljane ES ćelije, gore opisane, korišćene su kao donorske ES ćelije i uvođene su u embrion miša osmoćelijskog stadijuma pomoću metode inženjeringa miša VELOCIMOUSE® (videti npr., US Pat. Br.
7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopičnu genomsku sekvencu miša koja sadrži ADAM6a i ADAM6b sekvence miša, identifikovani su genotipizacijom pomoću modifikacije alelnog testa (Valenzuela i sar., 2003) koja je otkrila prisustvo mišjih ADAM6a i ADAM6b gena unutar humanizovanog lokusa teškog lanca.
[0247] Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b gene su uzgajani se mišjim sojem FLPe deletora (videti npr., Rodriguez, C.I. i sar. (2000) Miševi za deleciju visoke efikasnosti pokazuju da je FLPe alternativa za Cre-loxP. Nature Genetics 25: 139-140) radi uklanjanja bilo koje FRT-ovane kasete higromicina uvedene od strane ciljajućeg vektora koja nije uklonjena, npr., u ES ćelijskom stadijumu ili u embrionu. Opciono, kaseta sa higromicinom je zadržana u miševima.
[0248] Mladunci su genotipovani, a heterozigotno mladunče za humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopični mišji genomski fragment, koji sadrži sekvence mišjeg ADAM6a i ADAM6b je odabrano za karakterizaciju mišje ADAM6 genske ekspresije i plodnost.
Primer VIII
Karakterizacija miševa za spasavanje ADAM6
Protočna citometrija.
[0249] Tri miša starosti 25 nedelja, homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (Η/κ) i tri miša starosti 18-20 nedelja, homozigotnih za humani teški i humani laki lanac koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6a i ADAM6b unutar oba alela humanog lokusa teškog lanca (H/K-A6) su žrtvovana za identifikaciju i analizu populacije limfocitnih ćelija od strane FACs na BD LSR II sistemu (BD Bioscience). Limfociti su sakupljeni za određene ćelijske linije i analizirani na progresiju kroz različite faze razvoja B ćelija. Tkiva prikupljena od životinja uključuju krv, slezinu i koštanu srž. Krv je sakupljena u BD microtainer epruvetama sa EDTA (BD Biosciences). Koštana srž je sakupljena iz butnih kosti ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom dopunjenim sa fetalnim telećim serumom, natrijumpiruvatom, HEPES, 2-merkaptoetanolom, ne- esencijalnim aminokiselinama i gentamicinom. Crvena krvna zrnca iz preparata iz krvi, slezine i koštane srži su lizirana puferom za lizu na bazi amonijum-hlorida (npr., ACK pufer za lizu), praćeno ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom.
[0250] Za bojenje ćelijskih populacija, 1 x 10<6>ćelija iz različitih izvora tkiva je inkubirano sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, praćeno obeležavanjem sa jednom ili kombinacijom sledećih koktela antitela tokom 30 minuta na ledu.
[0251] Koštana srž: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c. 2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).
[0252] Periferna krv i slezina: anti-mišji FITC-κ (187.1, BD Biosciences), ΡΕ-λ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). Nakon inkubacije sa obeleženim antitelima, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvršeno na protočnom citometru LSRII i analizirano sa FlowJo. Rezultati od reprezentativnog miša Η/κ i Η/κ-Α6 su prikazani na SL.
14-18.
[0253] Rezultati pokazuju da B ćelije Η/κ-Α6 miševa napreduju kroz faze razvoja B ćelija na sličan način kao Η/κ miševi u koštanoj srži i perifernim odeljcima, i pokazuju normalne obrasce sazrevanja nakon što uđu na periferiju. Η/κ-Α6 miševi su pokazali povećanu CD43<int>CD19<+>ćelijsku populaciju u poređenju sa Η/κ miševima (SL.16B). Ovo može ukazivati na ubrzanu ekspresiju IgM iz humanizovanog lokusa teškog lanca koji sadrži ektopični mišji fragment genoma koji sadrži sekvence mišjeg ADAM6a i ADAM6b kod Η/κ-Α6 miševa. Na periferiji, B i T ćelijske populacije miševa Η/κ-Α6 izgledaju normalno i slično miševima Η/κ.
Morfologija testisa i karakterizacija sperme.
[0254] Da bi se utvrdilo da li je neplodnost kod miševa koji imaju humanizovane imunoglobulinske varijabilne lokuse teškog lanca usled oštećenja testisa i/ili produkcije sperme, ispitivana je morfologija testisa i sadržaj sperme u epididimisu.
[0255] Ukratko, testisi iz dve grupe od po pet miševa po grupi (grupa 1: miševi homozigotni za varijabilne genske lokuse humanog teškog i κ lakog lanca, mADAM6<-/->; Grupa 2: miševi heterozigotni za varijabilne genske lokuse humanog teškog lanca i homozigotni za varijabilne genske lokuse lakog lanca κ, mADAM6<+/->sekcirani su sa nepromenjenim epididimisom i izmereni. Uzorci su zatim fiksirani, ugrađeni u parafin, presečeni i obojeni bojama hematoksilinom i eozinom (HE). Delovi testisa (2 testisa po mišu, za ukupno 20) su pregledani na nedostatke u morfologiji i dokazu proizvodnje sperme, dok su preseci epididimisa pregledani na prisustvo sperme.
[0256] U ovom eksperimentu, nisu uočene razlike u težini ili morfologiji testisa između mADAM6<-/->miševa i mADAM6<+/->miševa. Sperma je uočena kod svih genotipova, kako u testisima, tako i u epididimisu. Ovi rezultati utvrđuju da odsustvo mišjih ADAM6a i ADAM6b gena ne dovodi do detektabilnih promena u morfologiji testisa i da se sperma proizvodi kod miševa u prisustvu i odsustvu ova dva gena. Nedostaci plodnosti kod mužjaka miševa ADAM6<-/->stoga nisu verovatni da budu usled niske proizvodnje sperme.
Motilitet i migracija sperme.
[0257] Miševi kojima nedostaju drugi članovi familije ADAM gena su neplodni zbog oštećenja pokretljivosti ili migracije sperme. Migracija sperme je definisana kao sposobnost sperme da prolazi iz materice u jajovod, i normalno je neophodna za oplodnju kod miševa. Da bi se utvrdilo da li brisanje mišjih ADAM6a i ADAM6b utiče na ovaj proces, migracija sperme je procenjena kod mADAM6<-/->miševa. Ispitivana je i pokretljivost sperme.
[0258] Ukratko, sperma je dobijena iz testisa (1) miševa heterozigotnih za humane varijabilne lokuse gena teškog lanca i homozigotnih za humane varijabilne lokuse gena lakog lanca κ (ADAM6<+/->); (2) miševa homozigotnih za humane varijabilne lokuse gena teškog lanca i homozigotnih za humane varijabilne lokuse gena lakog lanca κ (ADAM6<-/->) (3) miševa homozigotnih za humane varijabilne genske lokuse teškog lanca i homozigotnih za laki laki κ divljeg tipa (ADAM6<-/->mκ); i (4) miševa divljeg tipa C57 BL/ (WT). Inspekcijom nisu uočene značajnije nepravilnosti u broju spermatozoida ili ukupnoj pokretljivosti sperme. Za sve miševe primećeno je kumulusno širenje, što ukazuje da je svaki uzorak sperme mogao da prodre u ćelije kumulusa i da in vitro veže zonu pellucida. Ovi rezultati utvrđuju da ADAM6<-/->miševi imaju spermu koja je sposobna da prodire u kumulus i vezuje zonu pellucida.
[0259] In vitro oplodnja mišjih jaja (IVF) izvedena je korišćenjem sperme miševa, kao što je gore opisano. Nešto manji broj otcepljenih embriona bio je prisutan za ADAM6<-/->dan nakon IVF-a, kao i smanjena količina sperme vezane za jajašca. Ovi rezultati utvrđuju da sperma iz ADAM6<-/->miševa, jednom izložena jajovodu, sposobna je da prodre u kumulus i vežu zonu pellucida.
[0260] U drugom eksperimentu, sposobnost sperme da migrira iz materice i kroz jajovod kod ADAM6<-/->miševa je određena u testu migracije sperme.
[0261] Ukratko, postavljena je prva grupa od pet superovuliranih ženki miševa sa pet mužjaka ADAM6<-/->. Postavljena je druga grupa od pet superovuliranih ženki miševa sa pet mužjaka ADAM6<+/->. Parovi parenja su posmatrani za kopulaciju, a pet do šest sati nakon kopulacije uklonjeni su materica i prišvršćeni jajovod svih ženki i ispirani za analizu. Rastvori ispiranja su provereni za jajašca da bi se potvrdila ovulacija i dobijen broj spermatozoida. Migracija sperme je procenjena na dva različita načina. Prvo su oba jajovoda uklonjena iz materice, isprana fiziološkom rastvorom, a prebrojane su sve identifikovane spermije. Zabeleženo je i prisustvo jajašaca kao dokaz ovulacije. Drugo, jajovodi su ostavljeni pričvršćeni na matericu i obe tkiva su fiksirana, ugrađena u parafin, presečena i obojena (kao što je gore opisano). Isečci su ispitivani na prisustvo sperme, i u materici i u oba jajovoda.
[0262] Za pet ženki parenih sa pet mužjaka ADAM6<-/->, pronađeno je vrlo malo sperme u rastvoru od ispiranja iz jajovoda. Rastvori ispiranja iz jajovoda pet ženki parenih sa pet mužjaka ADAM6<+/->pokazuju nivo sperme za oko 25 do 30 puta veći (avg, n = 10 jajovoda) od prisutnih u rastvorima ispiranja iz jajovoda pet ženki parenih sa pet mužjaka ADAM6<-/->mužjaka.
[0263] Pripremljeni su histološki preseci materice i jajovoda. Isečci su ispitivani na prisustvo sperme u materici i jajovodu (colliculus tubarius). Pregledom histoloških preseka jajovoda i materice otkriveno je da je kod ženki miševa ženki parenih sa ADAM6<-/->miševima pronađena sperma u materici, ali ne i u jajovodu. Dalje, isečci ženki parenih sa miševima ADAM6<-/->otkrili su da spermatozoidi nisu pronađeni na uterotubalnom spoju (UTJ). U isečcima ženki parenih sa ADAM6<+/->miševima, identifikovana je sperma u UTJ i jajovodu.
[0264] Ovi rezultati utvrđuju da miševi kojima nedostaju geni ADAM6a i ADAM6b čine spermu koja ispoljava in vivo defektnu migraciju. U svim slučajevima, sperma je primećena unutar materice, što ukazuje da se kopulacija i oslobađanje sperme očigledno događaju normalno, ali malo ili nije premećena sperma u jajovodima nakon kopulacije, mereno ili količinom sperme ili histološkim posmatranjem. Ovi
rezultati utvrđuju da miševi sa nedostatkom gena ADAM6a i ADAM6b proizvode spermu koja ispoljava nemogućnost migracije iz materice u jajovod. Ovaj defekt očigledno dovodi do neplodnosti, jer spermatozoidi nisu u stanju da pređu spojnicu materice i tubula u jajovod, gde su jaja oplođena. Uzeto zajedno, svi ovi rezultati se poklapaju sa hipotezom da mišji ADAM6 geni pomažu usmeravanje sperme sa normalnom pokretljivošću za migraciju van materice, kroz uterotubalni spoj i jajovod i na taj način se približe jajetu da bi se postigla oplodnja. Mehanizam pomoću kojeg ADAM6 to postiže može biti direktno dejstvom ADAM6 proteina, ili koordinacionom ekspresijom s drugim proteinima, npr., drugim ADAM proteinima, u ćeliji sperme, kao što je opisano u daljem tekstu.
Ekspresija familije gena ADAM.
[0265] Poznato je da kompleksi ADAM proteina postoje kao kompleksi na površini zrele sperme. Miševi kojima nedostaju drugi članovi porodice ADAM gena gube ovaj kompleks kako sperma sazreva i pokazuju redukciju višestrukih ADAM proteina u zreloj spermi. Da bi se utvrdilo da li nedostatak gena ADAM6a i ADAM6b na sličan način utiče na druge ADAM proteine, analizirani su Western blot-ovi proteinskih ekstrakata iz testisa (nezrela sperme) i epididimisa (zrela sperma) da bi se odredili nivoi ekspresije drugih članova porodice ADAM gena.
[0266] U ovom eksperimentu, proteinski ekstrakti su analizirani iz četiri ADAM6<-/->i "četiri ADAM6<+/->miševa. Rezultati su pokazali da ekspresija ADAM2 i ADAM3 nije pogođena u ekstraktima testisa. Međutim, i ADAM2 i ADAM3 su dramatično smanjeni u ekstraktima epididimisa. Ovo pokazuje da odsustvo ADAM6a i ADAM6b u spermi ADAM6<-/->miševa može imati direktan uticaj na ekspresiju i možda funkciju ostalih ADAM proteina kako sperma sazreva (npr., ADAM2 i ADAM3). Ovo sugeriše da su ADAM6a i ADAM6b deo kompleksa ADAM proteina na površini sperme, što može biti kritično za pravilnu migraciju sperme.
Primer IX
Korišćenje varijabilnih gena humanog teškog lanca u miševima za spasavanje ADAM6
[0267] Odabrana upotreba varijabilnog gena humanog teškog lanca je određena za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i κ lakog lanca bilo da im nedostaju mišji ADAM6a i ADAM6b geni (mADAM6<-/->) ili da sadrže ektopični genomski fragment koji kodira mišje ADAM6a i ADAM6b gene (ADAM6<+/+>; videti primer 1), kvantitativnim PCR testom koristeći TAQMAN ™ probe (kao što je gore opisano).
[0268] Ukratko, B ćelije CD19<+>su prečišćene iz slezina mADAM6<-/->i ADAM6<+/+>miševa korišćenjem mišjih CD19 Mikrozrnaca (Miltenyi Biotec), a ukupna RNK je prečišćena korišćenjem RNEASY ™ Mini kit-a (Qiagen). Genomska RNK je uklonjena korišćenjem tretmana DNaze na koloni bez RNaze (Qiagen). Oko 200 ng mRNK je reverzno transkribovano u cDNK korišćenjem kompleta za sintezu prvog lanca
cDNK (Invitrogen), a zatim amplifikovano sa TAQMAN ™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) korišćenjem ABI 7900 sistema za detekciju sekvence (Applied Biosystems). Relativna ekspresija svakog gena je normalizovana sa mišjim κ konstantnim (mCκ). Tabela 9 dalje smisaone / antismisaone / TAQMAN ™ MGB kombinacije proba korišćenih u ovom eksperimentu.
Tabela 9
[0269] U ovom eksperimentu, primećena je ekspresija sva četiri humana VHgena u analiziranim uzorcima. Dalje, nivoi ekspresije su bili uporedivi između miševa mADAM6<-/->mADAM6<+/+>. Ovi rezultati pokazuju<da>su humani VHgeni koji su oba bili distalni prema položaju modifikacije (VH3-23 i VH1 -69) i proksimalni položaju modifikacije (VH1-2 i VH6-1) bili su sposobni da se rekombinuju da bi formiralifunkcionalnoeksprimirani humani teški lanac. Ovi rezultati pokazuju da ektopični genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence umetnute u genomsku sekvencu humanog teškog lanca nije uticao na V (D) J rekombinaciju segmenata gena humanog teškog lanca unutar lokusa, a ovi miševi su u stanju da rekombinuju genske segmente humanog teškog lanca na normalan način za proizvodnju funkcionalnih proteina imunoglobulina teškog lanca.
Primer X
Identifikacija humanih varijabilnih regiona teškog lanca koji se udružuju sa odabranim humanim varijabilnim regionima lakog lanca
[0270] Konstruisan je in vitro ekspresioni sistem da bi se odredilo da li jedan preuređeni laki lanac humane germinativne linije može biti zajedno eksprimiran sa humanim teškim lancima iz antigen specifičnih humanih antitela.
[0271] Poznati su postupci za generisanje humanih antitela kod genetski modifikovanih miševa (videti npr., US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® humanizovani miševi). Tehnologija VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa uključuje, generisanje genetski modifikovanog miša koji poseduje jedan genom koji sadrži varijabilne regione humanog teškog i lakog lanca koji su operativno povezani sa endogenim lokusima konstantnog regiona miša, tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži jedan humani varijabilni region i jedan mišji konstantni region u odgovoru na stimulaciju antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela proizvedenih od VELOCIMMUNE® humanizovanog miša su potpuno humana. U početku su izolovana himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je niže opisano, antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se dobilo potpuno humano antitelo koje sadrži izotip koji nije IgM, na primer, divlji tip ili modifikovani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Dok izabrani konstantni region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike visokog afiniteta za vezivanje antigena i ciljne specifičnosti se nalaze u varijabilnom regionu.
[0272] VELOCIMMUNE® humanizovani miš je imunizovan sa faktorom rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i antigen-specifična humana antitela su izolovana i sekvencionirana za upotrebu V gena, korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u struci. Izabrana antitela su klonirana na konstantne regione humanog teškog i lakog lanca i 69 teških lanaca je odabrano za uparivanje sa jednim od tri humana laka lanca: (1) srodni κ laki lanac povezan sa humanim κ konstantnim regionom, (2) preuređeni Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije povezan sa humanim κ konstantnim regionom, ili (3) preuređeni Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije povezan sa humanim κ konstantnim regionom. Svaki par teškog lanca i lakog lanca je kotransfektovan u CHO-K1 ćelijama koristeći standardne tehnike. Prisustvo antitela u supernatantu je detektovano pomoću anti-humanih IgG u ELISA testu. Titar antitela (ng/ml) je određen za svaki par teškog lanca / lakog lanca, a titri sa različitim preuređenim lakim lancima germinativne linije su bili poređeni sa titrima dobijenim sa molekulom roditeljskog antitela (tj. teškim<lancem uparenim sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat nativnog titra (Tabela 10). V>H<:>Varijabilni gen teškog lanca. ND: nije otkrivena ekspresijapod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 10
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
[0273] U sličnom eksperimentu, VELOCIMMUNE® humanizovani miševi su imunizovani sa nekoliko različitih antigena i izabrani teški lanci od antigen specifičnih humanih antitela su ispitivani na njihovu sposobnost da se uparuju sa različitim reorganizovanim lakim lancima humane germinativne linije (kao što je gore opisano). Antigeni korišćeni u ovom eksperimentu uključivali su enzim koji je uključen u homeostazu holesterola (Antigen A), serumski hormon koji je uključen u regulisanju homeostaze glukoze (Antigen B), faktor rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i receptor na površini ćelije (Antigen D). Antigen specifična antitela su izolovana iz miševa svake imunizacione grupe i varijabilni regioni teškog i lakog lanca su klonirani i sekvencionirani. Od sekvence teških i lakih lanaca, određena je upotreba V gena i odabrani teški lanci su upareni ili sa njihovim srodnim lakim lancem ili sa reorganizovanim regionom Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije. Svaki par teškog/lakog lanca je ko-transfektovan u CHO-K1 ćelijama i prisustvo antitela u supernatantu je detektovano anti-humanim IgG u ELISA testu. Titar antitela (μg/ml) je određen za svako uparivanje teškog lanca/lakog lanca, a titri sa različitim reorganizovanim lakim lancima humane germinativne linije su upoređivani sa titrima dobijenim sa molekulom roditeljskog antitela (tj., teški lanac uparen sa srodnimlakim lancem) i izračunat je procenat<prirodnog titra (Tabela 11). V>H<: Varijabilni gen teškog lanca. Vκ: varijabilni gen κ lakog lanca. ND: nije>otkrivena ekspresija pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 11
(nastavak)
(nastavak)
[0274] Rezultati dobijeni iz ovih eksperimenata pokazuju da su somatski mutirani, visoko afinitetni teški lanci iz različitih familija gena sposobni da se uparuju sa reorganizovanim regionima humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 i da budu sekretovani iz ćelije kao normalna molekula antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 10, titar antitela je povećan za oko 61% (42 od 69) teških lanaca kada su upareni sa preuređenim humanim Vκ1-39Jκ5 lakim lancem i oko 29% (20 od 69) teških lanaca kada su upareni sa preuređenim humanim Vκ3-20Jκ1 lakim lancem, u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Za oko 20% (14 od 69) teških lanaca, oba preuređena laka lanca humane germinativne linije su dala povećanje u ekspresiji, u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 11, preuređeni region Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije daje povećanje ekspresije nekoliko teških lanaca specifičnih za niz različitih klasa antigena, u poređenju sa srodnim lakim lancem za roditeljska antitela. Titar antitela je povećan za više od dva puta za oko 35% (15/43) teških lanaca, u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskih antitela. Za dva teška lanca (315 i 316), povećanje je bilo veće od deset puta u poređenju sa roditeljskim antitelom. Unutar svih teških lanaca koji su pokazali povećanje ekspresije u odnosu na srodni laki lanacroditeljskog antitela, trifamilijarna (VH3) teška lanca su više zastupljena u poređenju sa drugim genskim familijama varijabilnog regiona teškog lanca. Ovo pokazuje povoljan odnos humanih VH3 teških lanaca za<uparivanje sa>preuređenim lakim lancima humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1.
Primer XI
Generisanje lokusa preuređenog lakog lanca humane germinativne linije
[0275] Napravljeni su različiti ciljajući vektori preuređenog lakog lanca humane germinativne linije korišćenjem VELOCIGENEO tehnologije genetskog inženjeringa (videti, npr., US patent br. 6,586,251 i Valenzuela i sar. (2003) Visokoprolazni inženjering mišjeg genoma u kombinaciji sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech.21 (6): 652-659) za modifikovanje klonova 302g12 i 254m04 (Invitrogen) mišjeg genomskog bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC). Korišćenjem ova dva BAC klona, genomski konstrukti su konstruisani tako da sadrže jedan preuređeni region lakog lanca humane germinativne linije i ubačeni u endogeni lokus lakog lanca κ koji je prethodno modifikovan da izbriše endogene κ varijabilne i vezivne genske segmente.
Izgradnja vektora za ciljanje preuređenog lakog lanca humane germinativne linije.
[0276] Napravljena su tri različita reorganizovana regiona lakog lanca humane germinativne linije korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije koje su priznate u struci. Humani varijabilni genski segmenti koji su korišćeni za konstruisanje ova tri regiona su uključili preuređenu humanu sekvencu Vκ1-39Jκ5, preuređenu humanu sekvencu Vκ3-20Jκ1 i preuređenu sekvencu humanog V preβJλ5.
[0277] DNK segment koji sadrži ekson 1 (koji kodira vodećeg peptida) i intron 1 mišjeg Vκ3-7 gena je napravljen de novo sintezom DNK (Integrisane DNK Tehnologije). Deo 5' neprevedenog regiona do položaja prirodnog Blpl restrikcionog enzima je bio uključen. Eksoni humanih Vκ1-39 i Vκ3-20 gena su PCR amplifikovani iz humanih genomskih BAC biblioteka. Prednji prajmeri su imali 5' ekstenziju koja je sadržala spojno akceptorsko mesto introna 1 mišjeg Vκ3-7 gena. Reverzni prajmer koji je korišćen za PCR humane Vκ1-39 sekvence uključivao je produžetak koji kodira humani Jκ5, dok je reverzni prajmer koji je korišćen za PCR humane Vκ3-20 sekvence uključivao produžetak koji kodira humani Jκ1. Humana VpreBJλ5 sekvenca je napravljena de novo sintezom DNK (Integrisane DNK Tehnologije). Deo humanog Jκ-Cκ introna uključujući mesto spoja donora je PCR amplifikovan iz plazmida pBS-296-HA18-PIScel. Prednji PCR prajmer je uključivao deo za kodiranje produžetka bilo sekvence humanog Jκ5, Jκ1 ili Jλ5. Reverzni prajmer je uključivao i PI-SceI mesto, koje je prethodno konstruisano u intronu.
[0278] Mišji Vκ3-7 ekson 1/ intron 1, eksoni humanog varijabilnog lakog lanca i humani Jκ-Cκ intronski fragmenti su pripojeni zajedno pomoću preklapajuće ekstenzione PCR, digestovani sa BIpI i PI-SceI, i vezani u plazmidu pBS-296-HA18-PISceI koji sadrži promoter iz humanog Vκ3-15 varijabilnog segmenta
gena. Loksigenovana higromicinska kaseta u plazmidu pBS-296-HA18-PISceI je zamenjena sa FRT- ovanom higromicinskom kasetom koja je okružena NotI i AscI položajima. NotI/PI-SceI fragment ovog plazmida je ligiran u modifikovani mišji BAC 254m04, koji je sadržao deo mišjeg Jκ-Cκ introna, mišjeg Cκ egzona i oko 75 kb genomske sekvence nishodno od mišjeg κ lokusa, koji je obezbedio 3' homologni kraj za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama. NotI/AscI fragment ovog BAC-a je zatim ligiran u modifikovani mišji BAC 302g12, koji je sadržao FRT-ovanu neomicinsku kasetu i oko 23 kb genomske sekvence ushodno od endogenog κ lokusa za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama.
Vektor za ciljanje reorganizovanog Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije (SL.19).
[0279] Položaji restrikcionih enzima su uvedeni na 5 'i 3' krajevima konstruisanog umetka lakog lanca, za kloniranje u vektor za ciljanje: AscI položaj na 5' kraju i PI-SceI položaj na 3' kraju. Unutar 5' AscI položaja i 3' PI-SceI položaja konstrukt za ciljanje od 5' do 3' je uključivao 5' homologni kraj koji sadrži sekvencu 5' prema endogenom lokusu mišjeg lakog lanca κ dobijenog iz mišjeg BAC klona 302g12, FRT- ovani gen neomicinske rezistencije, genomsku sekvencu uključujući humani Vκ3-15 promoter, vodeću sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, sekvencu introna mišjeg Vκ3-7 varijabilnog segmenta gena, otvoreni okvir za čitanje od preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5, genomsku sekvenca koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i 3' homologni kraj koji sadrži sekvencu 3' endogenog mišjeg Jκ5 genskog segmenta dobijenog iz mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 19, sredina). Geni i / ili sekvence ushodno od endogenog lokusa mišjeg lakog lanca κ i nishodno od najviše 3' Jκ genskog segmenta (npr., endogeni 3' inhenser) su bili nemodifikovani od strane ciljnog konstrukta (videti Sliku 19). Sekvenca konstruisanog humanog Vκ1-39Jκ5 lokusa je prikazana u SEK ID BR: 59.
[0280] Ciljano ubacivanje preuređenog regiona Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije u BAC DNA je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze (PCR), korišćenjem prajmera lokalizovanih na sekvencama unutar reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije. Ukratko, intronska sekvenca 3' za mišju Vκ3-7 lider sekvencu je potvrđena sa prajmerima ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEK ID BR: 60) i ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEK ID BR: 61). Otvoreni okvir za čitanje preuređenog regiona Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije je potvrđen sa prajmerima 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEK ID BR: 62) i 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEK ID BR: 63). Neomicinska kaseta je potvrđena sa prajmerima neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEK ID BR: 64) i neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEK
ID BR: 65). Ciljana BAC DNA je zatim korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija u nastale modifikovane ES ćelije, za generisanje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni region Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije.
[0281] Pozitivni ES ćelijski klonovi su potvrđeni TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, koriščenjem proba specifičnih za konstruisani region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 ubačen u endogeni lokus. Ukratko, proba neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEK ID BR: 66) koja se vezuje unutar neomicin marker gena, proba ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEK ID BR:
67) koja se vezuje unutar sekvence introna 3' za mišju Vκ3-7 vodeću sekvencu, i proba 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEK ID BR: 68) koja se vezuje unutar preuređenog otvorenog okvira za čitanje Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije. Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 germinativne linije.
[0282] Alternativno, ES ćelije koje nose preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije su transfektovane sa konstruktom koji izražava FLP kako bi se uklonila FRT-ovana neomicinska kaseta uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, neomicinska kaseta je uklonjena odgajanjem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
Vektor za ciljanje reorganizovanog Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije (SL.20).
[0283] Na sličan način, konstruisani lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni region Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije je izrađen korišćenjem konstrukta za ciljanje uključujući, od 5' do 3', homologni kraj 5' koji sadrži sekvencu 5' prema endogenom mišjem lokusu lakog lanca κ dobijenog iz mišjeg BAC klona 302g12, FRTed gen za neomicinsku rezistenciju, genomsku sekvencu, uključujući humanog Vκ3-15 promotera, vodeću sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, sekvencu introna mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, otvoreni okvir za čitanje preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i homologni kraj 3' koji sadrži sekvencu 3' endogenog mišjeg Jκ5 genskog segmenta dobijenog iz mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 20, sredina). Sekvenca konstruisanog humanog Vκ3-20Jκ1 lokusa je prikazana u SEK ID BR: 69.
[0284] Ciljano ubacivanje preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1 u BAC DNA je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze (PCR), korišćenjem prajmera lokalizovanih u sekvencama unutar preuređenog regiona lakog lanca humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1. Ukratko, sekvenca introna 3' prema Vκ3-7 lider sekvenci miša je potvrđena sa prajmerima ULC-m1F (SEK ID BR: 60) i ULC-m1R (SEK ID BR: 61). Otvoreni okvir čitanja preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1 je potvrđen sa prajmerima 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEK ID BR: 70) i 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEK ID BR: 71). Neomicinska kaseta je
potvrđena sa prajmerima neoF (SEK ID BR: 64) i neoR (SEK ID BR: 65). Ciljana BAC DNA je zatim korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija u nastale modifikovane ES ćelije, za generisanje himernih miševa koji eksprimiraju reorganizovani laki lanac Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije.
[0285] Pozitivni ES ćelijski klonovi su potvrđeni TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, koriščenjem proba specifičnih za konstruisani region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 ubačen u endogeni lokus lakog lanca κ. Ukratko, proba neoP (SEK ID BR: 66) koja se vezuje unutar neomicin markerskog gena, proba ULC-m1P (SEK ID BR: 67) koja se vezuje unutar mišje Vκ3-7 vodeće sekvence, i proba 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEK ID BR: 72) koja se vezuje unutar otvorenog okvira za čitanje humanog Vκ3-20Jκ1. Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije.
[0286] Alternativno, ES ćelije koje nose preuređeni region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije, mogu biti transfektovane sa konstruktom koji izražava FLP kako bi se uklonila FRT-ovana neomicinska kaseta uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, neomicinska kaseta može biti uklonjena odgajanjem do miševa koji izražavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
Reorganizovani vektor ciljanja VpreBJλ5 humane germinativne linije (SL.21).
[0287] Na sličan način, konstruisani lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni region humane germinativne linije VpreBJλ5 je izrađen korišćenjem ciljnog konstrukta uključujući, od 5' do 3', homologni kraj 5' koji sadrži sekvencu 5' do endogenog mišjeg lokusa lakog lanca κ dobijenog iz mišjeg BAC klona 302g12, FRT-ovani gen neomicinske rezistencije, genomsku sekvencu uključujući humani Vκ3-15 promoter, vodeću sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, intronsku sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, otvoreni okvir za čitanje od preuređenog regiona humane germinativne linije VpreBJλ5, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i 3' homologni kraj koji sadrži sekvencu 3' endogenog mišjeg Jκ5 segmenta gena dobijenog iz mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 21, sredina). Sekvenca konstruisanog humanog VpreBJλ5 lokusa je prikazana u SEK ID BR: 73.
[0288] Ciljano ubacivanje preuređenog regiona humane germinativne linije VpreBJλ5 u BAC DNA je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze (PCR), korišćenjem prajmera lokalizovanih na sekvencama unutar reorganizovanog regiona lakog lanca VpreBJλ5 humane germinativne linije. Ukratko, intron sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 liderske sekvence je potvrđena sa prajmerima ULC-m1F (SEK ID BR: 60) i ULC-m1R (SEK ID BR: 61). Otvoreni okvir za čitanje preuređenog regiona VpreBJλ5 humane germinativne linije je potvrđen sa prajmerima 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEK ID BR: 74) i 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEK ID BR: 75). Neomicinska kaseta je potvrđena sa prajmerima neoF (SEK ID BR: 64) i neoR (SEK ID BR: 65). Ciljana BAC DNA je zatim korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija do kreiranih modifikovanih ES ćelija, za generisanje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni laki lanac VpreBJλ5 humane germinativne linije.
[0289] Pozitivni ES ćelijski klonovi su potvrđeni TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, korišćenjem proba specifičnih za konstruisani VpreBJλ5 region lakog lanca umetnut u endogeni lokus lakog lanca κ. Ukratko, proba neoP (SEK ID BR: 66) koja se vezuje unutar neomicin markerskog gena, proba ULC-m1P (SEK ID BR: 67) koja se vezuje unutar mišje IgVκ3-7 vodeće sekvence, i proba 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEK ID BR: 76) koja se vezuje unutar humanog VpreBJλ5 otvorenog okvira za čitanje. Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca germinativne linije.
[0290] Alternativno, ES ćelije koje nose preuređeni region lakog lanca VpreBJλ5 humane germinativne linije su transfektovane sa konstruktom koji eksprimira FLP da bi se uklonila FRT-ovana neomicinska kaseta uvedena pomoću ciljnog konstrukta. Opciono, neomicinska kaseta je uklonjena odgajanjem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr. US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
Primer XII
Generisanje miševa koji izražavaju pojedinačni reorganizovani humani laki lanac
[0291] Ciljane ES ćelije, gore opisane, korišćene su kao donorske ES ćelije i uvođene u mišji embrion 8 ćelijskog stadijuma pomoću VELOCIMOUSE® metode (videti, npr., US patent br.7,294,754 i Poueymirou i sar. 2007) F0 generacije miševa koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz donorskih, genski ciljanih ES ćelija omogućavaju neposrednu fenotipsku analizu Nature Biotech.25(1): 91-99. VELOCIMICE® nezavisno nose konstruisani region lakog lanca humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5, region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 ili region lakog lanca VpreBJλ5, identifikovani su genotipizacijom pomoću testa modifikacije alela (Valenzuela i sar., supra) koji otkriva prisustvo jedinstvenog reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije.
[0292] Mladunci su genotipovani i heterozigotno ili homozigotno mladunče za jedinstveni reorganizovani region lakog lanca humane germinativne linije je izabrano za karakterizaciju ekspresije reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije.
Protočna citometrija.
[0293] Ekspresija preuređenog regiona humanog lakog lanca u normalnom repertoaru antitela miševa zajedničkog lakog lanca, validirana je analizom imunoglobulinske κ i λ ekspresije u splenocitima i perifernoj krvi miševa zajedničkog lakog lanca. Ćelijske suspenzije iz sakupljenih slezina i periferne krvi divljeg tipa (n = 5), heterozigota Vκ1-39J κ 5 zajedničkog lakog lanca (n = 3), homozigota Vκ1-39Jκ5 zajedničkog lakog lanca (n = 3), heterozigota Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca (n = 2), i homozigota Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca (n = 2) miševa su napravljeni korišćenjem standardnih metoda i obojeni sa CD19<+>, Ig □<+>i Ig □<+>koriščenjem fluorescentno obeleženih antitela (BD Pharmigen).
[0294] Ukratko, 1x10<6>ćelija je inkubirano sa anti-mišjim CD16/CD32 (klon 2.4G2, BD Pharmigen) na ledu, tokom 10 minuta, praćeno obeležavanjem sa sledećim koktelom antitela, tokom 30 minuta na ledu: APC konjugovani anti-mišji CD19 (klon 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 konjugovani anti-mišji CD3 (klon 17A2, BioLegend), FITC konjugovani anti-mišji Igκ (klon 187.1, BD Pharmigen), PE konjugovani anti-mišji Igλ (klon RML-42, BioLegend). Nakon bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvedeno na LSRII protočnom citometru i analizirano sa FlowJo<TM>. Sakupljanje: ukupne B ćelije (CD19<+>CD3-), Ig □<+>B□ ćelije (Ig □<+>Ig □<->CD19<+>CD3-), Ig □<+>B ćelije (Igκ-Ig □<+>CD19<+>CD3-). Podaci prikupljeni iz uzoraka krvi i splenocita su pokazali slične rezultate. Tabela 12 prikazuje procenat pozitivnih CD19<+>B ćelija iz periferne krvi jednog reprezentativnog miša iz svake grupe koje su Ig □<+>, Ig □<+>, ili Ig □<+>Ig □<+>. Procenat CD19<+>B ćelija u perifernoj krvi divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih ili za Vκ1-39Jκ5 ili Vκ3-20Jκ1 zajednički laki lanac su prikazani na Slici 22.
TABELA 12
Ekspresija zajedničkog lakog lanca.
[0295] Ekspresija svakog zajedničkog lakog lanca (Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1) je analizirana u heterozigotnim i homozigotnim miševima, korišćenjem kvantitativnog PCR testa (npr. TAQMAN ™).
[0296] Ukratko, CD19<+>B ćelije su prečišćene iz slezina divljeg tipa, miševa homozigotnih za zamenu lokusa varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca i lakog lanca κ sa odgovarajućim lokusima varijabilnog regiona humanog teškog lanca i lakog lanca κ (Ηκ), kao i homozigotnih i heterozigotnih miševa za svaki preuređeni region humanog lakog lanca (Vκ1-39Jκ5 ili Vκ3-20Jκ1), korišćenjem mišjih CD19 mikrozrnaca (Miltenyi Biotec) prema specifikacijama proizvođača. Ukupna RNK je prečišćena iz CD19<+>B ćelija korišćenjem RNeasy Mini kompleta (Qiagen) prema specifikacijama proizvođača i genomska RNK je uklonjena upotrebom tretmana DNaze bez RNaze na koloni (Qiagen). 200 ng mRNK je reverzno- transkriptovano u cDNK korišćenjem kompleta sinteze prvog lanca cDNK (Invitrogen) i dobijena cDNK je amplifikovana sa Taqman Universal PCR Master mešavinom (Applied Biosystems). Sve reakcije su izvedene korišćenjem ABI 7900 sistema za otkrivanje sekvence (Applied Biosystems), korišćenjem prajmera i Taqman MGB proba koje obuhvataju (1) Vκ-Jκ spoj za oba zajednička laka lanca, (2) samostalni Vκ gen (tj., Vκ1-39 i Vκ3-20), i (3) mišji Cκ region. Tabela 13 prikazuje sekvence prajmera i proba koje su korišćene za ovaj test. Relativna ekspresija je normalizovana na ekspresiju Cκ regiona miša. Rezultati su prikazani na Slikama 23A, 23B i 23C.
TABELA 13
Antigen specifična antitela zajedničkog lakog lanca.
[0297] Miševi sa zajedničkim lakim lancem koji nose ili Vκ1-39Jκ5 ili Vκ3-20Jκ1 zajednički laki lanac, na endogenom lokusu mišjeg lakog lanca κ, imunizovani su sa β-galaktozidazom i izmeren je titar antitela.
[0298] Ukratko, β -galaktozidaza (Sigma) je emulgovana u TITERMAX<TM>adjuvansu (Sigma), prema uputstvima proizvođača. Divlji tip (n = 7), homozigoti Vκ1-39Jκ5 zajedničkog lakog lanca (n = 2) i homozigoti Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca (n = 5) su imunizovani subkutanom injekcijom sa 100 μg βgalaktozidaze/TITERMAX<TM>. Miševi su podsticani subkutanom injekcijom dva puta, u razmaku od 3 nedelje, sa 50 μg β-galaktozidaze/TITERMAX<TM>. Nakon drugog pojačanja, krv je sakupljena od anesteziranih miševa koristeći retro-orbitalno krvarenje u epruvetama za separaciju seruma (BD Biosciences), prema uputstvima proizvođača. Za merenje anti-β galaktozidaznih IgM ili IgG antitela, ELISA ploče (Nunc) su obložene sa 1 μg/mL β-galaktozidaze preko noći na 4 ° C. Višak antigena je ispran pre blokiranja sa PBS-om sa 1% BSA, tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Serijska razblaženja seruma su dodata na ploče i inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi pre pranja. Ploče su zatim inkubirane sa HRP konjugovanim anti-IgM (Southern Biotech) ili anti-IgG (Southern Biotech), tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon drugogispiranja, ploče su razvijene sa TMB supstratom (BDBiosciences). Reakcije su zaustavljene sa 1N sumpornom<kiselinom, a OD>450<je očitan korišćenjem Victor>X5 čitača ploče (Perkin Elmer). Podaci su analizirani saGRAPHPAD<TM>Prism i signal je izračunat kao razblaženje seruma koje je dva puta više od podloge. Rezultati su prikazani na Slikama 24A i 24B.
[0299] Kao što je prikazano u ovom Primeru, odnos κ/λ B ćelija u slezinskim i perifernim odeljcima Vκ1- 39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca kod miševa je pokazao model blizu divljeg tipa (Tabela 12 i Slika 22). Međutim, miševi VpreBJλ5 zajedničkog lakog lanca su pokazali manje perifernih B ćelija, od kojih oko 1-2% eksprimira konstruisani humani region lakog lanca (podaci nisu prikazani). Nivoi ekspresije Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 reorganizovanih humanih regiona lakog lanca iz endogenog lokusa lakog lanca κ su bili povišeni u poređenju sa endogenim lokusom lakog lanca κ koji sadrži kompletnu zamenu mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Slika 23A, 23B i 23C). Ekspresioni nivoi VpreBJλ5 reorganizovanog regiona humanog lakog lanca pokazuju sličnu visoku
ekspresiju iz endogenog lokusa lakog lanca κ i u heterozigotnim i homozigotnim miševima (podaci nisu prikazani). Ovo pokazuje da u direktnoj kompeticiji sa mišjim λ, κ, ili oba endogena lokusa lakog lanca, pojedinačna reorganizovana humana VL/JLsekvenca može dati bolji nivo ekspresije od divljeg tipa, iz endogenog lokusa lakog lanca κ i dovesti do povećanja frekvencije normalnih B ćelija slezine i krvi. Dalje, prisustvo konstruisanog lokusa lakog lanca κ koji ima bilo humanu Vκ1-39Jκ5 ili humanu Vκ3-20Jκ1 sekvencu je bio dobro tolerisan od strane miševa i izgleda da funkcioniše na način divljeg tipa, tako što predstavlja značajan deo repertoara lakog lanca u humoralnoj komponenti imunskog odgovora (Slika 24A i 24B).
Primer XIII
Gajenje miševa koji izražavaju pojedinačni preuređeni laki lanac humane germinativne linije
[0300] Ovaj primer opisuje nekoliko drugih sojeva genetski modifikovanih mišjih koji se mogu uzgajati do bilo kojih od miševa zajedničkog lakog lanca, ovde opisanih, da bi se stvorili višestruki genetski modifikovani mišji sojevi koji sadrže višestruke genetski modifikovane imunoglobulinske lokuse.
Endogeni Igλ nokaut (KO).
[0301] Da bi se optimizovala upotreba lokusa konstruisanog lakog lanca, miševi koji nose jedan od preuređenih regiona lakog lanca humane germinativne linije su uzgajani do drugog miša koji sadrži deleciju u endogenom lokusu lakog lanca λ. Na ovaj način, dobijeno potomstvo će izraziti, kao njihov jedini laki lanac, preuređeni region lakog lanca humane germinativne linije, kao što je opisano u Primeru 2. Uzgajanje je izvršeno standardnim tehnikama koje su priznate u struci i alternativno, komercijalnim odgajivačem (npr., The Jackson Laboratory). Mišji sojevi koji nose lokus konstruisanog lakog lanca i deleciju endogenog lokusa lakog lanca λ su ispitivani na prisustvo jedinstvenog regiona lakog lanca i odsustvo endogenih mišjih lakih lanaca λ.
Lokus humanizovanog endogenog teškog lanca.
[0302] Miševi koji nose konstruisani lokus lakog lanca humane germinativne linije su uzgajani sa miševima koji sadrže zamenu endogenog mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca sa humanim varijabilnim lokusom gena teškog lanca (videti US 6,596,541; VELOCIMMUNE® humanizovani miš, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® humanizovani miš sadrži genom koji sadrži varijabilne regione humanog teškog lanca operativno povezane sa endogenim mišjim lokusima konstantnog regiona, tako da miš proizvodi antitela koja sadrže varijabilni region humanog teškog lanca i konstantni region teškog lanca miša, kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških lanaca antitela je izolovana i operativno povezana sa DNK koja kodira konstantne regione humanog teškog lanca. DNK je zatim izražena u ćeliji sposobnoj za izražavanje potpuno humanog teškog lanca antitela.
[0303] Dobijeni su miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg VHlokusa sa humanim VHlokusom i jednim
88
preuređenim VLregionom humane germinativne linije na endogenom lokusu lakog lanca κ. Reverzna himerna antitela koja sadrže somatski mutirane teške lance (humani VHi mišji CH) sa pojedinačim humanim lakim lancem (humani VLi mišji CL) su dobijena nakon imunizacije sa antigenom od interesa. Identifikovane su VHi VLnukleotidne sekvence B ćelija koje eksprimiraju antitela i potpuno humana antitela su napravljena fuzijom<V>H<i V>L<nukleotidnih sekvenci sa humanim C>H<i C>L<nukleotidnim>sekvencama u pogodnom ekspresionomsistemu.
Primer XIV
Generisanje antitela od miševa koji izražavaju humane teške lance i jedan preuređeni region lakog lanca humane germinativne linije
[0304] Nakon uzgajanja miševa koji sadrže konstruisani humani region lakog lanca do različitih željenih sojeva koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih Ig lokusa (kao što je opisano u Primeru 12), odabrani miševi mogu biti imunizovani sa antigenom od interesa.
[0305] Generalno, VELOCIMMUNE® humanizovani miš koji sadrži jedan od preuređenih regiona lakog lanca humane germinativne linije je izazvan sa antigenom, a limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su oporavljene iz seruma životinja. Limfatične ćelije su fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile besmrtne ćelijske linije hibridoma, a takve ćelijske linije hibridoma su ispitane i odabrane da identifikuju hibridomske ćelijske linije koje proizvode antitela koja sadrže varijable humanog teškog lanca i preuređene lake lance humane germinativne linije koji su specifični za korišćenog antigena za imunizaciju. DNK koje kodiraju varijabilne regione teških lanaca i lakog lanca su izolovane i povezane sa poželjnim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Zbog prisustva endogenih mišjih sekvenci i bilo kojih dodatnih cisdelujućih elemenata prisutnih u endogenom lokusu, pojedinačni laki lanac od svakog antitela može biti somatski mutiran. Ovo dodaje dodatnu raznolikost antigen- specifičnom repertoaru koji obuhavata jedan pojedinačni laki lanac i različite sekvence teškog lanca. Dobijene sekvence kloniranih antitela su naknadno izražene u ćeliji, kao što je jedna CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela ili varijabilne domene lakog i teških lanaca je identifikovana direktno iz limfocita specifičnih za antigen.
[0306] Početno su izolovana himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je gore opisano, antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisalo potpuno humano antitelo koje sadrži jedan somatski mutiran humani teški lanac i jedan pojedinačni laki lanac izveden iz reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije prema pronalasku. Pogodni humani konstantni regioni uključuju, na primer divljeg tipa ili modifikovani IgG1 ili IgG4.
[0307] Odvojene kohorte VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa koji sadrže zamenu endogenog<mišjeg>lokusa teškog lanca sa humanim VH, DHi JHgenskim segmentima i zamenu endogenog mišjeglokusa lakoglanca κ bilo sa konstruisanim regionom humanog lakog lanca germinativne linije Vκ1-39Jκ5 ili sa
89
konstruisanim regionom humanog lakog lanca germinativne linije Vκ3-20Jκ1 (gore opisano) su bile imunizovane sa jednim humanim receptorskim proteinom na površini ćelije (Antigen E). Antigen E je primenjen direktno na zadnju šapu miševa sa šest uzastopnih injekcija svakih 3-4 dana. Dva do tri mikrograma Antigena E su pomešana sa 10 μg CpG oligonukleotida (Kat # tlrl-modn-ODN1826 oligonukleotid; InVivogen, San Diego, CA) i 25 μg Adju-Phos (aluminijum fosfatni gel adjuvans, Kat # H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Danska) pre injekcije. Ukupno šest injekcija je dato pre konačnog ukidanja antigena, koji je dat 3-5 dana pre žrtvovanja. Sakupljena su krvarenja nakon 4. i 6. injekcije i imunološki odgovor antitela je praćen standardnim antigen-specifičnim imuno testom.
[0308] Kada je postignut željeni imunski odgovor, splenociti su sakupljeni i fuzionisani sa mišjim mijelomskim ćelijama da bi se sačuvala njihova održivost i formirale ćelijske linije hibridoma. Ćelijske linije hibridoma su ispitane i odabrane da identifikuju ćelijske linije koje proizvode antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene teškog lanca, isti humani varijabilni domen lakog lanca i mišje konstantne domene).
[0309] Alternativno, antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su izolovana direktno iz antigenpozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S.2007/0280945 A1. Koristeći ovu metodu, dobijeno je nekoliko potpuno humanih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E (tj., antitela koja poseduju varijabilne domene humanog teškog lanca, bilo konstruisanog humanog regiona lakog lanca Vκ1-39Jκ5 ili konstruisanog humanog regiona lakog lanca Vκ3-20Jκ1 i humane konstantne domene).
[0310] Biološka svojstva primernih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E generisanih u skladu sa metodama iz ovog Primera, detaljno su opisana u odeljcima koji su niže navedeni.
Primer XV
Upotreba genskog segmenta teškog lanca u antigen-specifičnim antitelima zajedničkog lakog lanca
[0311] Da bi se analizirala struktura proizvedenih humanih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E, klonirane su i sekvencirane nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca antitela. Od sekvenci nukleinskih kiselina i predviđenih aminokiselinskih sekvenci antitela, identifikovana je upotreba gena za varijabilni region teškog lanca (HCVR) od izabranih antitela zajedničkog lakog lanca, dobijenih iz imunizovanih VELOCIMMUNE® humanizovanih miševa koji sadrže ili konstruisani humani region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 ili konstruisani humani region lakog lanca Vκ3-20Jκ1. Rezultati su prikazani u tabelama 14 i 15, a oni pokazuju da miševi u skladu sa ovim pronalaskom generišu antigen-specifična antitela zajedničkog lakog lanca iz različitih genskih segmenata humanog teškog lanca, usled različitih preuređivanja, kada se koristi ili miš koji izražava laki lanac samo iz jednog humanog Vκ1-39-<izvedenog ili jednog humanog Vκ3->20-izvedenog lakog lanca. Humani VHgenski segmenti od 2, 3, 4 i 5 familija su preuređeni sa različitim humanim DH segmentima i humanim JH segmentima da bi se dobilaantigen-specifična antitela.
TABELA 14
(nastavak)
TABELA 15
Primer XVI
Određivanje blokirajuće sposobnosti antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca pomoću LUMINEX ™ testa
[0312] Devedeset osam antitela zajedničkog humanog lakog lanca, potstaknutih protiv Antigena E je testirano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje prirodnog liganda Antigena E (Liganda Y) za Antigen E, u testu na bazi zrnaca.
[0313] Ekstracelularni domen (ECD) antigena E je konjugovan sa dve myc oznake epitopa i oznakom histidina 6X (Antigen E-mmH) i kuplovan aminom za karboksilirane mikrosfere, pri koncentraciji od 20 μg/mL u MES puferu. Smeša je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila deaktivacija zrnaca sa 1 M Tris pH 8,0 praćeno ispiranjem u PBS-u sa 0,05% (v/v) Tween-20. Zrnca su zatim blokirana sa PBS-om (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrže 2% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 bazenčića, supernatanti koji sadrže antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca su razblaženi 1: 15 u puferu. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži jedan lažni supernatant sa istim komponentama medijuma kao za supernatant antitela. Supernatantima su dodata zrnca obeležena sa antigenom E i inkubirana preko noći na 4 ° C. Biotinilovani-Ligand Y protein je dodat do konačne koncentracije od 0,06 nM i inkubiran tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotinilovanog-liganda Y vezanog za antigen E-myc-myc-6His obeležena zrnca je određena sa R- fikoeritrinom konjugovanim sa Streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) praćeno merenjem u LUMINEX ™ analizatoru na bazi protočne citometrije. Srednji intenzitet fluorescencije podloge (MFI) od uzorka bez liganda Y je oduzet od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem pozadinski oduzete MFI od svakog uzorka sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0314] U sličnom eksperimentu, istih 98 antitela humanog zajedničkog lakog lanca potstaknutih protiv Antigena E je ispitivano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena E za zrnca obeležena ligandom Y.
[0315] Ukratko, ligand Y je aminski kuplovan sa karboksiliranim mikrosferama, pri koncentraciji od 20 μg/mL razblažen u MES puferu. Smeša je inkubirana dva sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je izvršena deaktivacija kuglica sa 1 M Tris pH 8, zatim ispiranjem u PBS sa 0,05% (v/v) Tween-20. Zrnca su zatim blokirana sa PBS-om (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 2% (m/v) BSA (Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 bazenčića, supernatanti koji sadrže antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca su razblaženi 1: 15 u puferu. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži jedan lažni supernatant sa istim komponentama medijuma kao za supernatant antitela. Biotinilovani-Antigen E-mmH je dodat u finalnoj koncentraciji od 0,42 nM i inkubiran tokom noći na 4 °
C. Zrnca obeležena sa ligandom Y su zatim dodata smeši antitela/antigena E i inkubirana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi Detekcija biotinilovanog-Antigen E-mmH vezanog za Ligand-Y kuglice je određena sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa Streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) praćeno merenjem u LUMINEX ™ analizatoru baziranom na protočnoj citometriji. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije podloge (MFI) od uzorka bez Antigena E je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat tako što je pozadinski oduzeta MFI od svakog uzorka podeljena sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0316] Tabele 16 i 17 pokazuju procenat blokiranja za svih 98 antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E, ispitivanih u oba LUMINEX™ testa. ND: nije određeno pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 16
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
TABELA 17
[0317] U prvom LUMINEX™ eksperimentu, gore opisanom, ispitivano je 80 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 1-39Jκ5 konstruisani laki lanac, na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje liganda Y za kuglice obeležene Antigenom E. Od ovih 80 antitela zajedničkog lakog lanca, 68 je pokazalo
> 50% blokiranja, dok je 12 pokazalo < 50% blokiranja (6 pri 25- 50% blokiranja i 6 pri <25% blokiranja). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ3-20Jκ1 konstruisani laki lanac, 12 je pokazalo> 50% blokiranja, dok je 6 pokazalo <50% blokiranja (3 pri 25-50% blokiranja i 3 pri <25% blokiranja) vezivanja liganda Y za zrnca obeležena Antigenom E.
[0318] U drugom eksperimentu LUMINEX ™ koji je gore opisan, istih 80 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 1-39Jκ5 konstruisani laki lanac su ispitivana na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena E za zrnca obeležena ligandom Y. Od ovih 80 antitela zajedničkog lakog lanca, 36 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 44 pokazalo <50% blokiranja (27 pri 25-50% blokiranja i 17 pri <25% blokiranja). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 3-20Jκ1 konstruisani laki lanac, 1 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 pri 25-50% blokiranja i 12 pri <25% blokiranja) vezivanja Antigena E za zrnca obeležena ligandom Y.
[0319] Podaci iz tabela 16 i 17 utvrđuju da su preuređivanja opisana u tabelama 14 i 15 generisala antitela zajedničkog lakog lanca, specifična protiv antigena E, koja su blokirala vezivanje liganda Y za njegov srodni receptor Antigen E sa različitim stepenom efikasnosti, što je u skladu sa antitelima zajedničkog lakog lanca protiv Antigena E iz Tabela 14 i 15 koja sadrže antitela sa preklapajućom i ne-preklapajućom specifičnošću epitopa u odnosu na Antigen E.
Primer XVII
Određivanje sposobnosti blokiranja antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca pomoću ELISA
[0320] Antitela humanog zajedničkog lakog lanca potstaknuta protiv Antigena E su ispitivana na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje Antigena E za površinu obloženu Ligandom Y u ELISA testu.
[0321] Ligand Y je obložen na ploče sa 96 bazenčića, pri koncentraciji od 2 μg/mL, razblažen u PBS-u i inkubiran preko noći, praćeno ispiranjem četiri puta u PBS-u sa 0,05% Tween-20. Ploča je zatim blokirana sa PBS-om (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 0,5% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. U odvojenoj ploči, supernatanti koji sadrže anti- antigen E antitela zajedničkog lakog lanca su razblaženi 1:10 u puferu. Kao negativna kontrola je korišćen lažni supernatant sa istim komponentama antitela. Antigen E-mmH (gore opisan) je dodat u finalnoj koncentraciji od 0,150 nM i inkubiran tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Smeša antitelo/antigen E-mmH je zatim dodata na ploču koja sadrži ligand Y i inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Detekcija antigena E-mmH vezanog za ligand Y je određena sa peroksidazom rena (HRP) konjugovanom sa anti-Penta-His antitelom (Qiagen, Valencia, CA) i razvijena standardnim kolorimetrijskim odgovorom, korišćenjem tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (BD Biosciences, San
Jose, CA) neutralisanog sumpornom kiselinom. Apsorbanca je očitana na OD450 tokom 0,1 sek. Apsorbanca podloge od uzorka bez Antigena E je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem pozadinski-oduzete MFI od svakog uzorka sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0322] Tabele 18 i 19 prikazuju procenat blokiranja za svih 98 antitela zajedničkog lakog lanca protiv Antigena E ispitivanih u ELISA testu. ND: nije određeno pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 18
(nastavak)
TABELA 19
Antitela zajedničkog lakog lanca
Vκ 3-20Jκ1
Antitelo % Blokiranja antigena E u Antitelo % Blokiranja antigena u rastvoru rastvoru
[0323] Kao što je opisano u ovom Primeru, od 80 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ1-39Jκ5 konstruisani laki lanac ispitivanih na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje Antigena E za površinu obloženu Ligandom Y, 22 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 58 pokazalo <50 % blokiranja (20 pri 25- 50% blokiranja i 38 pri <25% blokiranja). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ3-20Jκ1 konstruisani laki lanac, jedno je pokazalo > 50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 pri 25-50% blokiranja i 12 pri <25% blokiranja) vezivanja Antigena E na površinu obloženu Ligandom Y.
[0324] Ovi rezultati su takođe u skladu sa antigen E-specifičnim bazenom antitela zajedničkog lakog lanca koji sadrži antitela sa preklapajućom i ne-preklapajućom specifičnošću epitopa u odnosu na Antigen E.
Primer XVIII
BIACORE ™ određivanje afiniteta za antigen specifična antitela zajedničkog lakog lanca
[0325] Konstante ravnoteže disocijacije (KD) za odabrane supernatante antitela su određene pomoću SPR (Površinske plazmonske rezonance) korišćenjem BIACORE™ T100 instrumenta (GE Healthcare). Svi podaci su dobijeni korišćenjem HBS-EP (10mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) kao i pufera za proticanje i uzorkovanje, na 25 ° C. Antitela su uhvaćena iz uzoraka sirovog supernatanta na površini CM5 senzorskog čipa, prethodno derivatizovana sa anti-humanim Fc antitelima visoke gustine koristeći standardnu hemiju za kuplovanje amina. Tokom koraka hvatanja, supernatanti su injektovani duž površine anti-humanog Fc, pri brzini protoka od 3 μL/min, za ukupno 3 minuta. Korak hvatanja je praćen injekcijom pufera za proticanje ili analita, u koncentraciji od 100 nM tokom 2 minuta,
pri brzini protoka od 35 μL/min. Disocijacija antigena iz zarobljenog antitela je praćena tokom 6 minuta. Zarobljeno antitelo je uklonjeno kratkom injekcijom od 10 mM glicina, pH 1,5. Svi senzogrami su dvostruko referencirani oduzimanjem senzograma iz injektiranih pufera od senzograma analita, čime se uklanjaju veštački proizvodi uzrokovani disocijacijom antitela sa površine za hvatanje. Podaci vezivanja za svako antitelo su bili prilagođeni modelu vezivanja 1: 1 sa masenim transportom, korišćenjem BIAcore T100 softvera za evaluaciju v2.1. Rezultati su prikazani u tabelama 20 i 21.
TABELA 20
(nastavak)
TABELA 21
[0326] Afiniteti vezivanja antitela zajedničkog lakog lanca, koja sadrže reorganizovanja prikazana u<tabelama>14 i 15 variraju, a skoro sva ispoljavaju KDu nanomolarnom opsegu. Podaci o afinitetu su uskladu sa antitelimazajedničkog lakog lanca koja nastaju iz kombinatorne asocijacije preuređenih varijabilnih domena opisanih u tabelama 14 i 15, koja su visoko afinitetna, klonalno selektovana i somatski mutirana. Zajedno sa prethodno prikazanim podacima, antitela zajedničkog lakog lanca opisana u tabelama 14 i 15, sadrže kolekciju različitih, visoko afinitetnih antitela koja ispoljavaju specifičnost za jedan ili više epitopa na antigenu E.
Primer XIX
Određivanje specifičnosti vezivanja antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca pomoću LUMINEX ™ testa
[0327] Odabrana antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su ispitivana na njihovu sposobnost da se vezuju za ECD antigena E i ECD varijante antigena E, uključujući ortologa
cynomolgous majmuna (Mf Antigen E), koji se razlikuje od humanog proteina u približno 10% njegovih aminokiselinskih ostataka; delecionog mutanta Antigena E kome nedostaju poslednjih 10 aminokiselina iz C-terminalnog kraja ECD-a (Antigen E-ΔCT); i dva mutanta koji sadrže supstituciju alanina na lokacijama za koje se sumnja da stupaju u interakciju sa Ligandom Y (Antigen E-Ala1 i AntigenE-Ala2). Proteini antigena A su proizvedeni u CHO ćelijama i svaki je sadržao myc-myc-His C-terminalnu oznaku.
[0328] Za studije vezivanja, Antigen E ECD protein ili varijantni protein (gore opisan) je uhvaćen inkubacijom iz 1 mL medijuma kulture, tokom 2 h na sobnoj temperaturi sa 1 x 10<6>mikrosfera (LUMINEX ™) zrnaca, kovalentno obloženih sa anti-myc monoklonskim antitelom (MAb 9E10, ćelijska linija hibridoma CRL-1729 ™; ATCC, Manassas, VA). Zrnca su zatim isprana sa PBS-om pre upotrebe. Supernatanti koji sadrže antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su bili razblaženi 1: 4 u puferu i dodati u filterske ploče sa 96 bazenčića. Kao negativna kontrola je korišćen lažni supernatant bez antitela. Zrnca koja sadrže uhvaćene Antigen E proteine su zatim dodata uzorcima antitela (3000 zrnaca po bazenčiću) i inkubirana preko noći na 4 ° C. Sledećeg dana, zrnca uzorka su isprana i vezano antitelo zajedničkog lakog lanca je detektovano sa antihumanim IgG antitelom konjugovanim sa R-fikoeritrinom. Intenzitet fluorescencije zrnaca (približno 100 izbrojanih zrnaca za svaki uzorak antitela koji se vezuje za svaki antigen E protein) je izmeren sa LUMINEX ™ analizatorom, baziranim na protočnoj citometriji, i zabeležen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za najmanje 100 izbrojanih zrnaca po interakciji zrno/antitelo. Rezultati su prikazani u tabelama 22 i 23.
TABELA 22
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
TABELA 23
[0329] Supernatanti antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su ispoljili visoko specifično vezivanje za zrnca povezana sa Antigenom E-ECD. Za ova zrnca, lažni supernatant negativne kontrole je rezultirao zanemarljivim signalom (<10 MFI) kada je kombinovan sa uzorkom zrnca antigena E-ECD, dok su supernatanti koji sadrže antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E ispoljili snažan vezivni signal (prosečan MFI od 2627 za 98 supernatanata antitela; MFI > 500 za uzorke antitela 91/98).
[0330] Kao mera sposobnosti odabranih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E za identifikaciju različitih epitopa na ECD-u antigena E, određena su relativna vezivanja antitela za varijante. Sve četiri varijante antigena E su uhvaćene na zrncima anti-myc LUMINEX ™, kao što je gore opisano za studije vezivanja prirodnog antigena E-ECD, i određeni su relativni odnosivezivanja(MFIvarijanta/MFIAntigen E-ECD). Za 98 testiranih supernatanta antitela zajedničkog lakog lanca, prikazanih u tabelama 21 i 22, prosečni odnosi (MFIvarijanta/ MFIAntigen E-ECD) su se<razlikovali za svaku varijantu,>verovatno odražavajući različite količine proteina zadržane na zrncima (prosečan odnos od 0,61, 2,9, 2,0 i 1,0 za Antigen E-ΔCT, Antigen E-Ala1, Antigen E-Ala2, i Mf Antigen E, respektivno). Za svaku varijantu proteina, vezivanje za podgrupu od 98 ispitivanih antitela zajedničkog lakog lanca je pokazalo značajno redukovano vezivanje, ukazujući na osetljivost prema mutaciji koja karakteriše datu varijantu.<Na primer, 19 uzoraka>antitela zajedničkog lakog lanca vezanih za Mf Antigen E sa MFIvarijanta/ MFIAntigen E-ECDod <8%. Pošto mnogi u ovoj grupi uključuju antitela visokog ili umereno visokog afiniteta (5 sa KD<5 nM, 15 sa KD<50 nM), verovatno je da niži signal za ovu grupu rezultira iz osetljivosti prema razlikama
sekvence (epitopa) između nativnog antigena E-ECD i date varijante, pre nego od nižih afiniteta.
[0331] Ovi podaci dokazuju da antitela zajedničkog lakog lanca, opisana u tabelama 14 i 15 predstavljaju različitu grupu antitela zajedničkog lakog lanca, specifičnih za antigen-E koja specifično prepoznaju više od jednog epitopa na Antigenu E.
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc
<120> HUMANIZED UNIVERSAL LIGHT CHAIN MICE
<130> 1380A-WO
<140> To be assigned
<141> Filed herewith
<150> 61/515,374
<151> 2011-08-05
<160> 91
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 754
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val 1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val 20 25 30
Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser 35 40 45
Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln 50 55 60
Ala Gln Arg Leu Leu Ser Tyr Ser Leu Arg Phe Arg Gly Gln Arg His 65 70 75 80
Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu 85 90 95
Leu Thr Thr Gln Asp Asp Gln Gly Ala Leu Gln Met Glu Tyr Pro Phe 100 105 110
Phe Pro Val Asp Cys Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Leu Gln 115 120 125
Ser Met Val Thr Val Asp Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Val Ile 130 135 140
Lys Leu Asp Asn Leu Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Asn Asp Ser Gln 145 150 155 160
Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr 165 170 175
Gly Pro Met Asn Ala Trp Lys His Trp Ser His Asn Thr Gly Ser Pro 180 185 190
Ser Ser Arg Leu Glu Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Arg Leu Ser Ser Lys 195 200 205
Asn Tyr Ala Thr His Pro Ala Ala Ile Lys Gly His Phe Gln Ala Thr 210 215 220
His Ser Val Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Asp Lys Leu Se 1r1 S2er Thr Val 225 230 235 240
Asp Pro Phe Ser Gln Asp Phe Arg Val Pro Gly Gly Gln Ala His Thr 275 280 285
Phe Tyr Glu Arg Val Phe Tyr Ala His Phe Arg Pro Asp Ala Gly Ala 290 295 300
Ile Ile Asn Lys Asn Ser Pro Gly Asp Asp Ala Val Asn Pro Ala Glu 305 310 315 320
Arg Ser Ile Cys Ser Pro Ser Ala Leu Ile Cys Leu Gly Gln His Gly 325 330 335
Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Ile Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg 340 345 350
Ser Leu Gly Leu Lys His Asp Glu Gly Tyr Cys Ile Cys Gln Arg Arg 355 360 365
Asn Thr Cys Ile Met Phe Lys Asn Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser 370 375 380
Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Asp Leu 385 390 395 400
Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu 405 410 415
Thr Tyr Lys Phe Cys Gly Asn Phe Lys Val Asp Asn Asn Glu Gln Cys 420 425 430
Asp Cys Gly Ser Gln Lys Ala Cys Tyr Ser Asp Pro Cys Cys Gly Asn 435 440 445
Asp Cys Arg Leu Thr Pro Gly Ser Ile Cys Asp Lys Glu Leu Cys Cys 450 455 460
Ala Asn Cys Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Thr Leu Cys Arg Pro Ile Gln 465 470 475 480
Asn Ile Cys Asp Leu Pro Glu Tyr Cys Ser Gly Ser Lys Phe Ile Cys 485 490 495
Pro Asp Asp Thr Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Pro Cys Ser Glu Glu Gly 500 505 510
Tyr Cys Tyr Lys Gly Asn Cys Thr Asp Arg Asn Ile Gln Cys Met Glu 515 520 525
Ile Phe Gly Val Ser Ala Lys Asn Ala Asn Ile Lys Cys Tyr Asp Ile 530 535 540
Asn Lys Gln Arg Phe Arg Phe Gly His Cys Thr Arg Ala Glu Glu Ser 545 550 555 560
Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu 565 570 575
Gln Cys Thr Asn Val Thr Asn Leu Pro Phe Leu Gln Glu His Val Ser 580 585 590
Phe His Gln Ser Val Ile Ser Gly Val Thr Cys Phe Gly Leu Asp Glu 595 600 605
His Arg Gly Thr Glu Thr Ala Asp Ala Gly Leu Val Arg His Gly Thr 610 615 620
Pro Cys Ser Arg Gly Lys Phe Cys Asp Arg Gly Ala Cys Asn Gly Ser 625 630 635 640
Leu Ser Arg Leu Gly Tyr Asp Cys Thr Pro Glu Lys Cys Asn Phe Arg 645 650 655
Gly Val Cys Asn Asn Arg Arg Asn Cys His Cys His Phe Gly Trp Ser 660 665 670 113
Pro Pro Lys Cys Lys Glu Glu Gly His Ser Gly Ser Ile Asp Ser Gly Val Tyr Leu Arg Ile Leu Phe Gly Arg Ile Tyr Phe Leu Phe Val Ala 705 710 715 720
Leu Leu Phe Gly Ile Ala Thr Arg Val Gly Val Thr Lys Ile Phe Arg 725 730 735
Phe Glu Asp Leu Gln Ala Ala Leu Arg Ser Trp Gln Glu Gln Ala Lys 740 745 750
Asp Lys
<210> 2
<211> 756
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val 1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val 20 25 30
Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser 35 40 45
Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln 50 55 60
Ala Gln Arg Leu Leu Ser Tyr Ser Leu His Phe Arg Gly Gln Arg His 65 70 75 80
Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu 85 90 95
Leu Thr Thr Gln Asp Asp Gln Gly Ala Leu Gln Met Asp Tyr Pro Phe 100 105 110
Phe Pro Val Asp Cys Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Pro Gln 115 120 125
Ser Met Val Thr Val Asp Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Val Met 130 135 140
Lys Leu Asp Asp Leu Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Asn Asp Ser Gln 145 150 155 160
Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr 165 170 175
Gly Pro Met Asn Ala Trp Lys His Trp Ser His Asn Thr Gly Ser Pro 180 185 190
Ser Ser Arg Leu Glu Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Arg Ile Ser Ser Lys 195 200 205
Asn Tyr Ala Thr His Pro Ala Ala Ile Lys Gly His Phe Gln Ala Thr 210 215 220
Asn Ser Val Tyr Asn Ser Ala Ala Gly Asp Lys Leu Ser Ser Thr Val 225 230 235 240
Gly Tyr Leu Phe Gln Val Ile Ser Leu Met Asp Thr Tyr Leu Thr Asn 245 250 255
Leu His Met Arg Tyr Tyr Val Phe Leu Met Thr Val Tyr Thr Asn Ser 260 265 270
Asp Pro Phe Arg Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Gly S 1e14r Ala Tyr Asn 275 280 285
Arg Ser Ile Cys Ser Ser Leu Ala Leu Ile Cys Ile Gly Lys Tyr Asp 325 330 335
Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Pro Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg 340 345 350
Ser Leu Gly Leu Lys Tyr Asp Glu Gly Tyr Cys Val Cys Gln Arg Arg 355 360 365
Asn Thr Cys Ile Met Phe Arg His Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser 370 375 380
Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Gly Leu 385 390 395 400
Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu 405 410 415
Thr Tyr Lys Phe Cys Gly Asn Phe Lys Val Asp Asn Asp Glu Gln Cys 420 425 430
Asp Cys Gly Ser Gln Lys Ala Cys Tyr Ser Asp Pro Cys Cys Gly Asn 435 440 445
Asp Cys Arg Leu Thr Pro Gly Ser Ile Cys Asp Lys Glu Leu Cys Cys 450 455 460
Ala Asn Cys Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Thr Leu Cys Arg Pro Ile Gln 465 470 475 480
Asn Ile Cys Asp Leu Pro Glu Tyr Cys Asn Gly Thr Lys Tyr Ile Cys 485 490 495
Pro Asp Asp Thr Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Pro Cys Ser Glu Asp Gly 500 505 510
Tyr Cys Tyr Lys Gly Asn Cys Thr Asp Arg Asn Ile Gln Cys Met Glu 515 520 525
Ile Phe Gly Val Ser Ala Lys Asn Ala Asn Ile Lys Cys Tyr Asp Ile 530 535 540
Asn Lys Gln Arg Phe Arg Phe Gly His Cys Thr Arg Ala Glu Glu Ser 545 550 555 560
Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu 565 570 575
Gln Cys Thr Asn Val Thr Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Glu His Val Ser 580 585 590
Phe His Gln Ser Ile Ile Ser Gly Phe Thr Cys Phe Gly Leu Asp Glu 595 600 605
His Arg Gly Thr Glu Thr Thr Asp Ala Gly Met Val Arg His Gly Thr 610 615 620
Pro Cys Ser Lys Ser Lys Phe Cys Asp Gln Gly Ala Cys Ser Gly Ser 625 630 635 640
Leu Ser His Leu Gly Tyr Asp Cys Thr Pro Glu Lys Cys Ser Phe Arg 645 650 655
Gly Val Cys Asn Asn His Arg Asn Cys His Cys His Phe Gly Trp Lys 660 665 670
Pro Pro Glu Cys Lys Glu Glu Gly Leu Ser Gly Ser Ile Asp Ser Gly 675 680 685
Ser Pro Pro Val Gln Arg His Thr Ile Lys Gln Lys Gln Glu Pro Val 690 695 700
Val Tyr Leu Arg Ile Leu Phe Gly Arg Ile Tyr Phe Leu Phe Val Ala 705 710 715 720 115
Leu Leu Phe Gly Ile Ala Thr Arg Val Gly Val Thr Lys Ile Phe Arg Asp Lys Pro Lys
755
<210> 3
<211> 13894
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 3
gtcctaaggt agcgagggat gacagattct ctgttcagtg cactcagggt ctgcctccac 60 gagaatcacc atgccctttc tcaagactgt gttctgtgca gtgccctgtc agtggaaatc 120 tggagagcat gcttccatga gcttgtgagt agtatatcta gtaagccatg gctttgtgtt 180 aatggtgatg ttctacatac cagttctctg gcttaataat gaggtgatga ttctatgttc 240 ctgtaacgct tcctcaactg ggtcctaagt ctttcttcac tccatctatt cctctaagga 300 atgatcctga aaatcccatc acaaactata ggagatggga accatcaaaa aacacagtga 360 caaagaggtg ggaacgcatc agggttcagg aaccatattt taaaaagata tcgtaaataa 420 cttcttaaaa gagatataga caaatctcca ttaatacgga gaccagaggc ctaaggctaa 480 gaaccaatgg tggctcaagg tctcctgcta cccgaggagc aaacgtagag cagtttctaa 540 tgatttattt aaaatataga atcaaaagta ccagtttgca attttgaaag atttatttca 600 gcaatgcaac aacatcaggt ggtgccgagt ccaacacgtc ttatgtccca tgatataaac 660 aaaggccatc cagaactgtg gactggagtt ctaccttgtc ccctaatgac attcagattt 720 tttttccatt ctctttatct tagaggagac agggggctaa ctcattttac ttgtcctttg 780 cttgttcttg ccaagaacgt aaagcagctt gcaagtcttc aaacctaaat atcttagtaa 840 ctcctacacg agtggcaatg ccaaagagca gtgcaacaaa gaggaagtaa atacgaccaa 900 agagtattct taaatacact actggctcta ggttctgttt tattatgcgc ctttgaaccg 960 gaggggaccc actgtctatg ctcccactgt gtccctcttc tttgcacttt ggagggctcc 1020 aaccaaaatg gcaatggcaa ttccgacgat tgttacacac tcctctgaaa ttgcattttt 1080 ctggggtgca gtcataaccc aaacgagata aacttccatt gcaagctcct cgatcacaga 1140 acttacccct tgaacacggg gtaccatgtc tcaccaatcc agcatctgct gtttctgtcc 1200 cacgatgttc atcaagccca aagcaggtaa ccccagagat aaccgattga tggaatgaaa 1260 catgttcttg caaaaatgga agattggtga cattggtaca ctgcaacctt ccacacagct 1320 tgtcctgatc agcacaagca ttgaatgtga ggctttcttc tgctctagta caatgcccaa 1380 atcgaaaccg ttgtttgttg atgtcatagc acttaatatt agcattctta gcacttacac 1440 caaagatttc catgcattgt atgttgcgat cagtgcagtt acctttatag cagtaaccct 1500 cttctgagca tggtgtccca tcttgcagat aagtgtcatc tgggcaaatg aacttagagc 1560 cactacagta ctctggaaga tcacatatgt tctggatagg tctgcagagt gtcccagaag 1620 gactgtaagt gcaatttgca cagcataatt ctttatcaca aatgctacca ggtgttaacc 1680 tgcaatcatt tccacagcag ggatctgaat aacatgcctt ttgggagcca cagtcacact 1740 gctcattgtt atctactttg aagtttccac aaaacttata agtcaatgat gtattataat 1800 aaacatgacg gtcatagaaa agacatggca tcagatcagg agtattaagt atgttgctta 1860 tctctgcaag ggaacaattg ctgaaagcat ctgttaattg aggatttttg aacatgatgc 1920 aggtgttcct tctctggcag atacagtacc cctcatcatg ttttaggcct aaactccttc 1980 caacacgatt ggttattata atagataaaa ataaaggatt tcgaccatgt tgaccaagac 2040 aaattagggc tgagggagaa catatactcc tctcagctgg attaacagca tcatctcctg 2100 gcgaattctt gttaattata gctcctgcat caggcctaaa atgagcataa aatactctct 2160 catagaaagt atgagcctgc cctcctggaa ctcgaaaatc ttgtgaaaat ggatcagcct 2220 cggtatacac agtcatgaga aagacatagt accgcatatg aaga 1tt1g6gtc agataggtgt 2280 ccattaaact aatgacttta aacaaatact caacagtaga tgaaagtttg tcacctccag 2340 atactatctg agaaacaagg tgttcaaagc tctgtgaatc attgaggggt ttgatttcat 2580 aggtaaggtt atccaacttt atgacccctg acaggccccc ataacaagta tccacagtga 2640 ccatggattg caggatcccc tccaggtagc caatatagta acaatctaca ggaaaaaagg 2700 ggtactccat ctgtaaggct ccttggtcat cttgagttgt cagcaacaag tgtctgggcc 2760 aaatgagtgt ctttctccgc aggtggatga tatgtctctg gccccgaaaa cgcaagctat 2820 acgagagcag tctttgtgct tgaagtcctt tggtatggta gatctccttc cgaggaataa 2880 ccacctccga tgagatgtaa cgccaagtgg gatggccttg agaacaccag actggaacca 2940 ggaggagcag ccagagtgca aatagcaaga ggaggaccct ggggaccaca ggtctttcca 3000 ctagcctcat gccccaggtc agagataaca tcctgggtgg agctaactcc ctctgctgtg 3060 gccactgcct ggtctagaaa atactgacag aggactaaaa acctcctcag gctcccaacc 3120 taagtggtta cccagacaac tggagttagg taacagtcac tgggtgtggc aggaattgag 3180 tctgaatgtg ttagctgagg ttgaggttaa atattgtcaa aagggatgtc tataaatgtg 3240 cctggacaag aaaagtcaga agcagcaagg agtgtctctg acaggctcaa tcctttcttt 3300 tctttttttg aagttcaaaa tatcatttcc acgtgaatgt atttggttcc cagtgtgact 3360
ctgggtctct ttctaggagt caatatttct ttatatcttg gctcatgttt ttcacagttg 3420
ttctaacttc ttgttttgtt ttgtttgttt gtttgtttga aagttagaag taaatactgt 3480
ctatattagc cttttagcta taaatgattg tttttatttc ttctaatcat gttttgtttg 3540
agttttggtt aaactattta caaatgagtt ttttttttcc ttttgggtgt tgctcgaaag 3600
tttggagctt tctgttaata ttgtgttgtt gtttctccaa tattattaga cctgagaatt 3660
ctacctgggt acctgtgaac tccagaattt ttaaaaattc catctcttgg gaacattatc 3720 tctgaccccg tctgaggccg aagtggctgt ccccctccaa cctttagtat ctttctttcc 3780 tgactattgg gatttcttca agcaatcagg ctgatgggtt ctcagcagtg agaccagtag 3840 actgtcggta tgaacgtcga agagtctgcc acacactccg ggttcatcaa cagtgctttc 3900 gcgtctctta cttttgtaga aggaaatgca gcctctgagt tttctccaag aaatcattga 3960 tgaaagggtg aaaagatggg tatcacccgg agttcatgac aagccctggc tcagacacgt 4020 gagcaaggtc tacagcccca aagataggct gccctgcaac atgtatttat aagataggag 4080 aaaaaaatgg gtagttggag ggttgatcaa cttacttcct ctcaaacata tatatctcat 4140 ctaagtgtgc aggggaaaac tctgtagaac tactgggata cctgctcacc cccaggagcc 4200 tcatgaataa gtctctgctt ctgccttgta gccatgagca ttactgcacc tgatacccct 4260 gcagcttcct agggaagagg gaggaagtga cttggcccct gtctggttaa ggtaagagga 4320 gataaatccc ttctcattga ttagggtgag aggggtcatg tgctctatca ttggtgaccc 4380 agttgggaca tgggtttata ccaaagtcat cactctgagg ttctgtgtac caccaggctg 4440 aactcccata tcctacatgg acataggaca acaccaagca gaaggaggtt ttaggactaa 4500 actgaaggac agagatgcgg tttctaaaca actagggagt gccagggcca gcctctctaa 4560 ccactatagg acactgtgga gtctggttac aaagagagat tactcaaggt ccttagcact 4620 gattacagag catatctcag atgccttctg ctgaccagat gtatctttgc ataatctgcc 4680 tatccagatt cagaaaattg atgccacata gccaagtgga ctttcaggaa cagacgattt 4740 aaaaacaggc agagagatgt gagagaaagg agaaggagag agagaaggga gagggagaga 4800 agagagaggg agacggagaa ggaaagaggg agaaggagaa ggagagaagg ggcatggaca 4860 gagggaggga cagaaggaga gaggagatag agagggggat aaggaagaag ggagggaggg 4920 agagagagag aaggctaagt ctttccatac ctgggtccca atacctctta taacccaagc 4980 acatggtttc acatatcaca atgcggttgg gatatagata actgtaaata cttgtgaaaa 5040 taatggggct gagatctggg gttttcatga tagtttcaaa gtcaccgtac tgactaaaac 5100 cttccactgg cccatctcca gcttcctaat ctgagggtat caaatttccc actaagtgtg 5160 tttagaaaga tctccacctt tttgcccttg tcttccagtg ccccacctac gttctggtct 5220 cccacatctg atgtcttctc agtgattctg gccctgcctg ctccacagct acaaacccct 5280 tcctataatg agctctgtgc tgagccatca tcctgaatca atccacctta agcagatgtt 5340 ttgcttattt ttcctgtgtc catactacag aggaaaggta ggcatgtaga agctgaagca 5400 tctcacctca ttccaagcac cctcagtctc taaatgtgcc cccttgtttc cagaagtgca 5460 acctcaagca tcttttattc attcatctta gagggccaca tgtgctgtag tgttataaga 5520 tgaaatttaa agcattaatt attcctaaca agccaattaa acaagcc 1a17aa aacattcatc 5580 agtcattccc atggaacctc tgaagcatct tcctgctcta accttgggtt ttccagggct 5640 catcgatgaa gaaaccaaga tattccatta caagtccaaa tttacacaat atctttccat 5880 aaatccagcc ctacaaagga tagcagatgg aaaactccaa cacaggtagg aaaactacac 5940 cctagaaaga gcactaaagt aatcatcttt caacacactc aaaagaagat aaccacacaa 6000 acataattcc acctctaaca acaaaaataa agtaggcaac aatcactatt ccttaatatc 6060 tcttttaaca tcaatggact caattctcca ataaaaagac atagactaac agactgaata 6120 cataaacagg acacagcatt ttgctgcata aagcaaacac agcgttactt ttttttttct 6180 aaatgacatt ttttattaga tattgtcttt attgacattt caaatgttat cccctttcct 6240 ggtttaccct ctgaaatccc ctatctcctc cccctccccc tgctcaccaa tccacccact 6300 cccacttcca ggccctggca atcccctata tttgggcata gagccttcac aggaccaagg 6360 tactctcctt gcattgatga ccaactagtc cattctctgc tacaaatgca gctagatcta 6420 tgagtcccac catgttttct tttgttggtg gtttcatgcc agggagctct tggagtactg 6480 attggttcat attgttgttc tccctatggg gttacaaaac ccttcaactt cttgggtcct 6540 ttctctggct gcctcattgg ggaccttgtg cgaagtccaa tggatgactg tgagcatcca 6600 cttctgtatt tgccaggcac tggcagagcc tctcagaaga cagctatatc aagatcctgg 6660 cagcaagctc ttgttggtat ccacaaaagt gtctggtggt tgtctatggg atggatcccc 6720 aaaggggcag tctctggatg gtcattcctt cagtctctgt tccacacttt gtctctttaa 6780 ctccttccat gactatttta ttcctccctc taagaaggac cgaagtattc atactttggt 6840 cttccttctt gaaattcatg tgttttgtga attgtatctt tgatattccg aacttctggg 6900 ctaatatcca cttatcagtg agtgaatatc atgtgtgttc ttatgtgatt gagttacctc 6960 actcaggatg atatcctcca gaaccatcca tttgtctaag aatttaatga attcattgtt 7020 tttaatagct gaggagtact ccattgtgta aatgtaccac attttctgta cccattgttc 7080 tcttgaggga catctgggtt ctttaaagct tctggacatt aaatataagg ctgctatgga 7140 aatagtggag aatgtgtcct tattacatgt tggagcatct tctgggtata tgcccaggag 7200 tgctattgct ggatcctctg atagtactat gtccaatttt ctgaggaact gccaaactga 7260 tttacagagt ggttgtacca gcttgcaatt ccaccagcaa tggagaaatg ttccccttcc 7320 tccacatcct caccaacatc tgctgtcacc tcaatttgtt cttagtgatt cagacaggtg 7380 tgaggtggaa tatcagggtt gtttggcatt tccctgatga ctagtgatat tgaaaaaaat 7440 tttaagtgtt tctcagccat tcagtattct tcagttgaga attcactgtt tagctctgta 7500 ctcaggtttt tttaataggg ttatttggtt ttctggagtc taacgtcttg aattctttct 7560 atatattgga tattagccct ctgtcatatt taggattggt aaagatcttt cccaatatgt 7620 tggctgcctt tttgtgtcct ttgccttaca gaaccttttt aattttatga ggtcccattt 7680 gctaattctt cattttacag cacaagccat tggtgttctg ttcaaaaatc tttccccctg 7740 aaccctatct tcgaggatct tccccacttt ctcctctata agtttcagtg tctctattat 7800 tgtgctgagg ggtaccgaag ttcctattcc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa 7860 cttccctagg gtttaaaccc gcggtggagc tctgatgtgg gaacgcttca gtgttcagga 7920 accatatgat ttatttaaaa tatagaatca aaagtaccaa tttgcagttt tgaaagattt 7980 attccagtgt aagcattagc aatgcaccaa catcaggtga tttctgaatc caacacgtct 8040 tatgtcctca tgatattaaa aaaaaaaaaa ggccatccag aactgtgaac ttgagttcta 8100 ccttgttccc tactgacatt cagattttct tttttgcatt ctctttatct tacaggagac 8160 aggaggggag ggctaactca ttttactttg gcttgtccct tgctggtcct tgcccagaac 8220 gtaaagtagc ttgcaagtct tcaaatctaa aaatcttagt aactcctaca cgagtggcaa 8280 tgccaaagag cagtgcaaca aagaggaagt aaatacgacc aaagagtatt cttaaataca 8340 ccactggctc ttgtttttgt tttattgtgt gcctttgaac tggaggggac ccactgtcta 8400 tgctcccact tagtccctct tctttgcact ctggaggctt ccaaccaaaa tgacaatggc 8460 aattccgatg attgttacac actcctctaa aactgcattt ttctggggtg cagtcataac 8520 ccaaatgaga taaacttcca ctgcaagctc cttgatcaca gaacttactt ttggagcagg 8580 gggtaccatg tctcaccatt ccagcatctg ttgtttctgt cccacgatgt tcatcaagcc 8640 caaagcaggt aaacccagag ataatcgatt gatggaatga aacatgttct tgcaaatatg 8700 gaagattggt gacattggta cactgcaacc ttccacacag cttgtcctga tcagcacaag 8760 cattgaatgt gaggctttct tctgctctag tacaatgccc aaatcgaaac cgttgtttgt 8820 tgatgtcata gcacttaata ttagcattct tagcacttac accaaaga 1t1t8 tccatgcatt 8880 gtatgttgcg atcagtgcag ttacctttat agcagtaacc atcttctgag catggtgtcc 8940 agggatctga ataacatgcc ttttgggagc cacagtcaca ctgctcatcg ttatctactt 9180 tgaagtttcc acaaaactta taagtcaatg atgtattata ataaacatga cggtcataga 9240 aaagacatgg catcagacca ggagtattaa gtatgttgct tatctctgca agggaacaat 9300 tgctgaaagc atctgttaat tgaggatgtc tgaacataat gcaggtgttc cttctctggc 9360 agacacagta cccctcatca tattttaagc ctaaactcct tccaacacga ttggttatta 9420 taggagataa aaataaagga tttcgatcat atttaccaat acaaattagg gctaaggaag 9480 aacatatact cctctcagct ggattaacct ggttatcttg tggcccatac ttattaagta 9540 aaactcctgc atcaggctta aatttattat aaaagactga cacatagtaa ttataagccg 9600 accctcctgg aactgcaaac tcaagtcgaa atggatcaga attggtgtac acagtcatga 9660 gaaagacata gtaccgcata tgaagattgg tcagataggt gtccattaaa ctaatgactt 9720 gaaacaaata cccaacagta gatgaaagtt tgtcacctgc agcagaatta tatacagaat 9780 tggttgcttg aaagtggcct tttatagcag ctggatgtgt agcgtagttc ttactagata 9840 ttctgggagc tccatctgca tattccaatc tggaggaggg agaacctgta ttatggctcc 9900 agtgcttcca tgcattcata ggccctgtgt catcagactc agatactatc tgagaaacaa 9960 ggtgttcaaa gctctgtgaa tcattgaggg gtttgatttc ataggtaagg tcatctaact 10020 tcatgacccc tgacaggccc ccataacaag tatccacagt gaccatggat tgtgggatcc 10080 cctccaggta gccaatatag taacaatcta caggaaaaaa ggggtaatcc atctgtaagg 10140 ctccttggtc atcttgagtt gtcagcaaca agtgtctggg ccaaatgagt gtctttctcc 10200 gcaggtggat gatatgtctc tggccccgaa aatgcaagct atatgagagc agtctttgtg 10260 cttgaagtcc tttggtatgg tagatctcct tccgaggaat aaccacctcc gatgagatgt 10320 aacgccaagt aggatggcct tgagaacacc agactggaac caggaggagc agccagagtg 10380 caaatagcaa gaggaggacc ctggggacca caggtctttc cactagcctc atgccccagg 10440 tcagagataa catcctgggt ggagctaaat ccctctgctg tggccactgc ctggtctaga 10500 aaatactgac agaggactaa aaacctcctc aggctcccaa cctaagtggt tacccagaca 10560 actggagtta ggtaacagtc actgggtgtg gcaggaattg agtctgaatg tgttagctga 10620 ggttgaggtt aaatattgtc aaaagggatg tctataaatg tgcctggaca agaaaagtca 10680 gaagcagcaa ggagtgtctc tgacaggctc aatcctttct tttctttttt tgaagttcaa 10740 aatatcattt ccacgtgaat gtatttggtt cccagtgtga ctctgggtct ctttctagga 10800 gtcaatattt ctttatatct tggctcatgt ttctcacagt tgttctaatt tcttgttttg 10860
ttttgtttgt ttgtttgaac gttagtagta aatactgtct atattagcct tttagctata 10920 aatgattgtt tttatttctt ctaatcatat tttgtttgag ttttggttaa actatttaca 10980
aatgagtttt ttttttttcc ttttgggtgt tgctcgaaag tttggagctt tctgttaata 11040
ttgtgttgtt atttttccaa tattattaga cctgagaatt ctatctgggt acctgtgaac 11100 tctagaattt ttaaaaattc catctcttgg gaacattacc tctgaccccg tctgaggccg 11160 aagtggctgt ccccctccaa cctttagtat ctttctttcc tgactattgg gatttcttca 11220 agcaatcagg ctgatgggtt ctcagcagtg agaccagtag actgccggta tgaacgtcga 11280 agagactgcc acacactcca ggttcatcaa cagtgctttc gcgtctctta cttttgtaga 11340 aggaaaagca gcctctgagt tatctccaag aaatcattaa tgaaagagtt aaaagatggg 11400 tatcacccgg agttcatgac aagccctggc tcagacacgt gagcaaggtc tacagcccca 11460 aagataggct gccctgcaac atgtatttat aagatagaag aaaaaaatgg gtggttggag 11520 ggttgatcaa cttacttcct ctcaaacata tatatctcat ctaagtgtgc aggggaaaac 11580 tctgtaggac tactgggatt gttattatca ttattattat tattattatt attattatta 11640
ttattattat tattaactta aggcatttta ttagatattt tcttcattta gttttcaaat 11700
gttatccccg gaacctccta tactctctcc ctgccctgct ccccaaccca cccactccta 11760 catcctggcc ctggcattcc cctatactgt ggcagatgat cttcgtaaga ccaagagcct 11820 ttcctcccat tgatggccta ctaggctatc ctcttttaca tatgcaacta gagtcacagc 11880 tctggggagg tattgcttag ttcatattgt ttttcctcct atagggttgc agatcccttt 11940 agctccttgg gtactttctc tagctcctcc attgggggcc ctgtgttcca tccaatagat 12000 gactgtgagc atccacttct gtatttgcca ggtattggca tggatcttac tgcaccttct 12060 gaactctcta agcagctttc ctggtcacct ccaggagcct catgaataag tctctgcttc 12120 ccccttgtgg ctatgagcat tactgcacct gatacaccct gcagcttc 1c19t agggaagagg 12180 gaggaagtgg cttggcccct gtctggttaa ggtaagagga gataaatccc ttctcatgaa 12240 tctaaacaac tagggagtgc cagggccagc ctctctaacc actataggac actatggagt 12480 ctggttacaa agagagatta ctcaaggtcc ttagcactga ttacagagca tatctcagat 12540 gccttctgct gaccagatgt atctttgcat aatctgccta tccagattca gaaaattgat 12600 gccacatagc caagtggact ttcaggaaca gacgatttaa aaacaggcag agagatgtga 12660 gagaaaggag aaggagagag agaagggaga gggagagaag agagagggag acggagaagg 12720 aaagagggag aaggagaagg agagaagggg catggacaga gggagggaca gaaggagaga 12780 ggagatagag agggggataa ggaagaaagg agggagggag agagagagaa ggctaagtct 12840 ttccatacct gggtcccaat acctcttata acccaagcac atggtttcag atatcacaat 12900 gcggttggga tatagataac tgtaaatact tgtgaaaata atggggctga gatctggggt 12960 tttcatgata gtttcaaagt cactgtactg actaaaacct tccactggcc catctccagc 13020 ttgttaatct gagggtatca aatttcccac taagtgtgtt tagaaagatc tccacctttt 13080
tgccctagtc ttccagtgcc ccacctacgt tctggtctcc cacatctgat gtcttctcag 13140 tgattctggc cctgcctgct ccacagctac aaaccccttc ctataatgag ctctgtgctg 13200 agccatcatc ctgaatcaat ccaccttaag cagatgtttt gcttattttt cctgtgtcca 13260 tactacagag gaagggtagg catgtagaag ctgaggcatc tcatctcact ctaagcaccc 13320 tcagtctcta aatgtgcccc tttgtttcca gcagttcagc ctcaagcatc ttttattcac 13380
tcgtcttaga gggacacatg tgctgtagtg ttataagatg aaatttaaag cattagttat 13440 tcccaacaag ccaattaaac aagccaaaaa cattcatcag tcattcccat ggaacctctg 13500 aagcatcttc ctgctctaac cttgagtttc ctagggctgc tgtgggatca caggagctgt 13560 cctgtttacc agcctatcct gtcccacggg attcagttat tagtgggtgc gagggggacc 13620 gcaaacctgg aagaaaatgg gattggaaga gaaaagagaa acgaagacca agtagatctt 13680 ttcctatcaa ggtcttcgtt tattaggctg aggtgcctgg tgtaaagcat gcatcgcggg 13740 gaataggaag gggtcgaggg ggaattttac aaagaacaaa gaagcgggca tctgctgaca 13800 tgagggccga agtcaggctc caggcagcgg gagctccacc gcggtggcgc catttcatta 13860 cctctttctc cgcacccgac atagataaag ctta 13894
<210> 4
<211> 251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 4
ccagcttcat tagtaatcgt tcatctgtgg taaaaaggca ggatttgaag cgatggaaga 60 tgggagtacg gggcgttgga agacaaagtg ccacacagcg cagccttcgt ctagaccccc 120 gggctaacta taacggtcct aaggtagcga ggggatgaca gattctctgt tcagtgcact 180 cagggtctgc ctccacgaga atcaccatgc cctttctcaa gactgtgttc tgtgcagtgc 240 cctgtcagtg g 251
<210> 5
<211> 245
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 5
aggggtcgag ggggaatttt acaaagaaca aagaagcggg cat 1c2t0gctga catgagggcc 60 gaagtcaggc tccaggcagc gggagctcca ccgcggtggc gccatttcat tacctctttc 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 6
caggtacagc tgcagcagtc a 21 <210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 7
ggagatggca caggtgagtg a 21 <210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 8
tccaggactg gtgaagc 17 <210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 9
tagtcccagt gatgagaaag agat 24 <210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 121 <223> synthetic
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 11
tgagtccagt ccaggga 17 <210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 12
aaaaattgag tgtgaatgga taagagtg 28 <210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 13
aaccctggtc agaaactgcc a 21 <210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 14
agagaaacag tggatacgt 19 <210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 122 <223> synthetic
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 16
gctcgtggat ttgtccgc 18 <210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 17
cagagtcacg attacc 16 <210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 18
tgagcagcac cctcacgtt 19 <210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 19
gtggcctcac aggtatagct gtt 23 <210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 123 <223> synthetic
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
gctagtagtg gggcctacag gccttttgat atc 33 <210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
gcaaaagccc aggggagtgg gagctactac acctatgctt ttgatatc 48 <210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
gcgagagagg gtatagtggg aactactgag gactttgatt ac 42 <210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
gcgagaggga cagtgggagc cctctttgac tac 33 <210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 124 <223> synthetic
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 26
gcgagaggag gagggtataa ctggaactcg aatgcttttg atatc 45 <210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 27
gcgagaggat ataactggaa ctactttgac tac 33 <210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 28
gcgaaagagt ataactggaa ccactggtac tttgactac 39 <210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
gcgagagaga taactggaac cccctttgac tac 33 <210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 125 <223> synthetic
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 31
gcgagaggta actggaactc tctgggcttt gactac 36 <210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
gcgaaaaggg ctactatggt tcggggagct cttgactac 39 <210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
gcgagagata ttactatggt tcggggagtt attataacga aggtctacgg tatggacgtc 60
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 34
gcgagagagt atagcagctt tgactac 27
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
126
<220>
gcgagagaga gtatagcagc tcgttgtgac tac 33 <210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 36
gcaagagagg ataggagctc gcccctcggg tactttgact ac 42 <210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 37
gcgagagatc ttggggaagg ctac 24 <210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 38
accacccata actggggagg gtttgactac 30 <210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 39
gcgagagata ggggaccg 18 <210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
127
<220>
caacagagtt atagtacccc tccggagacg 30 <210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 41
caacagctta atagttaccc tcggacg 27 <210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 42
caacagctta atagttacca ttcact 26 <210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 43
caacatttta atagttaccc gctcact 27 <210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 44
cagcagtata ataactggcc tctcact 27 <210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
128
<220>
ctacagcata atagttaccc gtggacg 27 <210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 46
ctacagcata atagttaccc tcggacg 27 <210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 47
cagcagtatg gtagctcacc tcggacg 27 <210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 48
atgcaaggta cacactggcc gtggacg 27 <210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 49
atgcaaggtt cacactggcc gtacact 27 <210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
129
<220>
atgcaaggta cacactggcc gctcact 27 <210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 51
caacagtatg ataatctccc tcccact 27 <210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 52
caacagtatg ataatctccc attcact 27 <210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 53
caacagtatg ataatctccc cgtcact 27 <210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 54
caacagtatg ataatctccc gatcacc 27 <210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
130
<220>
caacggattt acaatgccga cacc 24
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 56
caacagagtt acagtacccc catgtacact 30
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 57
caacagagtt acagtacccc tctcact 27
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 58
caacagagtt acagtactcc tcccact 27
<210> 59
<211> 3155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 59
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgt 1a31 tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tgacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 2400 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 2460 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 2520 ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 2580 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 2640 acccctccga tcaccttcgg ccaagggaca cgactggaga ttaaacgtaa gtaatttttc 2700 actattgtct tctgaaattt gggtctgatg gccagtattg acttttagag gcttaaatag 2760 gagtttggta aagattggta aatgagggca tttaagattt gccatgggtt gcaaaagtta 2820 aactcagctt caaaaatgga tttggagaaa aaaagattaa attgctctaa actgaatgac 2880 acaaagtaaa aaaaaaaagt gtaactaaaa aggaaccctt gtatttctaa ggagcaaaag 2940 taaatttatt tttgttcact cttgccaaat attgtattgg ttgttgctga ttatgcatga 3000 tacagaaaag tggaaaaata cattttttag tctttctccc ttttgtttga taaattattt 3060 tgtcagacaa caataaaaat caatagcacg ccctaagatc tagatgcatg ctcgagtgcc 3120 atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagat 3155
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
132
<400> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 61
tgacaaatgc cctaattata gtgatca 27 <210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 62
gggcaagtca gagcattagc a 21 <210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 63
tgcaaactgg atgcagcata g 21 <210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 64
ggtggagagg ctattcggc 19 <210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
133
<400> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 66
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 67
ccattatgat gctccatgcc tctctgttc 29
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 68
atcagcagaa accagggaaa gcccct 26
<210> 69
<211> 3166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 69
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacc 1c3a4a tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400 ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460 gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520 atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580 cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640 agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700 agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760 ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820 tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880 aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940 aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000 attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060 ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120 gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 70
tccaggcacc ctgtctttg 19
135
<210> 71
<223> Synthetic
<400> 71
aagtagctgc tgctaacact ctgact 26
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 72
aaagagccac cctctcctgc aggg 24
<210> 73
<211> 3187
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 73
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagtta 1c36ac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tgttgtggtc ctcagccggt gctgcatcag ccgccggcca 2400 tgtcctcggc ccttggaacc acaatccgcc tcacctgcac cctgaggaac gaccatgaca 2460 tcggtgtgta cagcgtctac tggtaccagc agaggccggg ccaccctccc aggttcctgc 2520 tgagatattt ctcacaatca gacaagagcc agggccccca ggtcccccct cgcttctctg 2580 gatccaaaga tgtggccagg aacagggggt atttgagcat ctctgagctg cagcctgagg 2640 acgaggctat gtattactgt gctatgcata actcagtgac gcatgtgttt ggcagcggga 2700 cccagctcac cgttttaagt aagtaatttt tcactattgt cttctgaaat ttgggtctga 2760 tggccagtat tgacttttag aggcttaaat aggagtttgg taaagattgg taaatgaggg 2820 catttaagat ttgccatggg ttgcaaaagt taaactcagc ttcaaaaatg gatttggaga 2880 aaaaaagatt aaattgctct aaactgaatg acacaaagta aaaaaaaaaa gtgtaactaa 2940 aaaggaaccc ttgtatttct aaggagcaaa agtaaattta tttttgttca ctcttgccaa 3000 atattgtatt ggttgttgct gattatgcat gatacagaaa agtggaaaaa tacatttttt 3060 agtctttctc ccttttgttt gataaattat tttgtcagac aacaataaaa atcaatagca 3120 cgccctaaga tctagatgca tgctcgagtg ccatttcatt acctctttct ccgcacccga 3180 catagat 3187
<210> 74
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 74
tgtcctcggc ccttgga 17
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 75
ccgatgtcat ggtcgttcct 20
<210> 76
<211> 23 137
<212> DNA
<223> Synthetic
<400> 76
acaatccgcc tcacctgcac cct 23 <210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 77
agcagtctgc aacctgaaga ttt 23 <210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 78
gtttaatctc cagtcgtgtc cctt 24 <210> 79
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 79
cctccgatca ccttc 15 <210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
aaaccaggga aagcccctaa 20 <210> 81
<211> 18 138 <212> DNA
<223> synthetic
<400> 81
atgggacccc actttgca 18 <210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 82
ctcctgatct atgctgcat 19 <210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 83
cagcagactg gagcctgaag a 21 <210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 84
tgatttccac cttggtccct t 21 <210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 85
tagctcacct tggacgtt 18 <210> 86
<211> 22 139 <212> DNA
<223> synthetic
<400> 86
ctcctcatct atggtgcatc ca 22 <210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 87
gacccactgc cactgaacct 20 <210> 88
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 88
ccactggcat ccc 13 <210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 89
tgagcagcac cctcacgtt 19 <210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 90
gtggcctcac aggtatagct gtt 23 <210> 91
<211> 18 140 <212> DNA
<223> synthetic
<400> 91
accaaggacg agtatgaa 18

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Miš čiji genom obuhvata:
(a)najmanje jedan nepreraspoređen humani VHsegment gena, najmanje jedan nepreraspoređeni humani DHsegment gena, i najmanje jedan nepreraspoređeni humani JHsegment gena funkcionalno povezan na endogeni gen konstantnog regiona teškog lancana endogenom lokusuteškog lanca;
(b) lokus koji sadrži ne više od jedne, ili ne više od dve, preraspoređene humane V/J sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen lakog lanca funkcionalno povezane na gen konstantnog regiona lakog lanca; i
(c) ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni ortolog i ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili funkcionalni fragment, pri čemu ADAM6 proteini, ortolozi, homolozi, ili fragmenti su funkcionalni kod mužjaka miša, pri čemu je pomenuta funkcija povezana sa plodnošću mužjaka miša,
pri čemu miš ima eliminisanu ili smanjenu endogenu funkciju ADAM6.
2. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su ektopične sekvence nukleinske kiseline na poziciji koja nije unutar endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina.
3. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu genom tog miša obuhvata ne više od dve preraspoređene humane Vκ/Jκ sekvence.
4. Miš prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne više od dve preraspoređene humane Vκ/Jκ sekvence izabrano iz grupe koja obuhvata preraspoređenu humanu Vκ1-39/Jκ sekvencu i preraspoređenu humanu Vκ3-20/Jκ sekvencu.
5. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu genom tog miša obuhvata ne više od
jedne preraspoređene humane Vκ/Jκ sekvence.
6. Miš prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je ne više od jedne preraspoređene humane Vκ/Jκ sekvence izabrano iz grupe koja obuhvata preraspoređenu humanu Vκ1-39/Jκ sekvencu i preraspoređenu humanuVκ3-20/Jκ sekvencu.
7. Miš prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je preraspoređena humana Vκ1-
39/Jκ sekvenca preraspoređena humana Vκ1-39/Jκ5 sekvenca.
8. Miš prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je preraspoređena humana Vκ3-
20/Jκ sekvenca preraspoređena humana Vκ3-20/Jκ1 sekvenca.
9. Miš prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu ne više od jedne,
ili ne više od dve, preraspoređene humane V/J sekvence lakog lanca su
funkcionalno povezane na mišji gen konstantnog regiona lakog lanca.
10. Postupak za pravljenje bispecifičnog antitela koji obuhvata:
(a) izlaganje prvog miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 prvom antigenu od interesa koji sadrži prvi epitop;
(b) izlaganje drugog miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 drugom antigenu od interesa koji sadrži drugi epitop;
(c) omogućavanje prvom i drugom mišu da svaki pokrene imunske odgovore na antigene od interesa;
(d) identifikacija kod prvog miša prvog humanog varijabilnog regiona teškog lanca koji se veže za prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikovanje u drugim mišu drugog humanog varijabilnog regiona teškog lanca koji se veže za drugi epitop drugog antigena od interesa, pravljenje prvog potpuno humanog gena teškog lanca koji kodira prvi težak lanac koji se veže za prvi epitop prvog antigena od interesa i koji sadrži prvi humani varijabilni region teškog lanca, pravljenje drugog potpuno humanog gena teškog lanca koji kodira drugi teški lanac koji se veže za drugi epitop drugog antigena od interesa i koji sadrži drugi humani varijabilni region teškog lanca; (e) ekspresiju prvog teškog lanca i drugog teškog lanca u ćeliji koja eksprimira pojedinačni potpuno humani laki lanac koji je dobijen od segmenta gena humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 da se obrazuje antitelo; i
(f) izolovanje bispecifičnog antitela.
11. Upotreba miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 da se napravi aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena humanog teškog lanca ili varijabilnog domena humanog lakog lanca antitela.
12. Upotreba miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 da se dobije sekvenca nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region imunoglobulina ili njegovog fragmenta.
13. Mišja ćelija čiji genom obuhvata:
a.najmanje jedan nepreraspoređeni humani VHsegment gena, najmanje jedan nepreraspoređeni humani DHsegment gena, i najmanje jedan nepreraspoređeni humani JHsegment gena funkcionalno povezan na endogeni gen konstantnog regiona teškog lancana endogenom lokusuteškog lanca;
b. lokus koji sadrži ne više od jedne, ili ne više od dve, preraspoređene humane V/J sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilni domen lakog lanca funkcionalno povezan na gen konstantnog lakog lanca; i c. ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni mišji ADAM6a protein ili funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili njegov funkcionalni fragment i ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkvionalni mišji ADAM6b protein ili funkcionalni ortolog, funkcionalni homolog ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu su ADAM6 proteini, ortolozi, homolozi, ili fragmenti funkcionalni kod mužjaka miša, pri čemu je pomenuta funkcija povezana sa plodnošću mužjaka miša,
pri čemu pomenuta ćelija ima eliminisanu ili smanjenu endogenu funkciju ADAM6.
RS20241188A 2011-08-05 2012-08-03 Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca RS66089B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161515374P 2011-08-05 2011-08-05
EP21157152.6A EP3865581B1 (en) 2011-08-05 2012-08-03 Humanized universal light chain mice

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66089B1 true RS66089B1 (sr) 2024-11-29

Family

ID=46650953

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241188A RS66089B1 (sr) 2011-08-05 2012-08-03 Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca
RS20210708A RS61946B1 (sr) 2011-08-05 2012-08-03 Humanizovani miševi univerzalnog lakog lakca
RS20191651A RS59728B1 (sr) 2011-08-05 2012-08-03 Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210708A RS61946B1 (sr) 2011-08-05 2012-08-03 Humanizovani miševi univerzalnog lakog lakca
RS20191651A RS59728B1 (sr) 2011-08-05 2012-08-03 Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca

Country Status (27)

Country Link
US (3) US10130081B2 (sr)
EP (4) EP4477671A3 (sr)
JP (7) JP6510234B2 (sr)
CN (2) CN103917650B (sr)
AU (5) AU2012294624B2 (sr)
BR (1) BR112014002713B1 (sr)
CA (1) CA2844070A1 (sr)
CY (2) CY1122435T1 (sr)
DK (3) DK2739740T3 (sr)
ES (3) ES2758051T3 (sr)
FI (1) FI3865581T3 (sr)
HR (3) HRP20241480T1 (sr)
HU (3) HUE068728T2 (sr)
IL (5) IL273982B2 (sr)
LT (3) LT3865581T (sr)
MX (3) MX357623B (sr)
MY (1) MY172718A (sr)
NZ (3) NZ743520A (sr)
PL (3) PL3572517T3 (sr)
PT (3) PT2739740T (sr)
RS (3) RS66089B1 (sr)
RU (1) RU2664232C2 (sr)
SG (3) SG10201606158TA (sr)
SI (3) SI2739740T1 (sr)
SM (3) SMT201900748T1 (sr)
WO (1) WO2013022782A1 (sr)
ZA (1) ZA201401006B (sr)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
RU2580017C2 (ru) 2010-07-26 2016-04-10 Трианни, Инк. Трансгенные животные и способы применения
CA2807282A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
HUE047687T2 (hu) 2011-02-25 2020-05-28 Regeneron Pharma ADAM6 egér
FI3865581T3 (fi) 2011-08-05 2024-11-02 Regeneron Pharma Humanisoituja universaaleja kevytketjun hiiriä
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
WO2013045916A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
KR102762747B1 (ko) 2011-10-17 2025-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
US20180295821A1 (en) * 2011-12-02 2018-10-18 Kymab Limited Transgenic Animals
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9706759B2 (en) 2011-12-20 2017-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
EP3912465A1 (en) * 2012-02-01 2021-11-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
RS57118B1 (sr) 2012-03-16 2018-06-29 Regeneron Pharma Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih
CN104302170B (zh) 2012-03-16 2016-09-28 瑞泽恩制药公司 生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
NZ730271A (en) 2012-03-16 2022-09-30 Regeneron Pharma Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
AU2013271737A1 (en) * 2012-06-05 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for making fully human bispecific antibodies using a common light chain
KR102266274B1 (ko) * 2012-06-12 2021-06-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
TR201810255T4 (tr) * 2013-02-20 2018-08-27 Regeneron Pharma Modifiye edilmiş immunoglobulin ağır zincir sekanslarına sahip olan insan olmayan hayvanlar.
LT3501272T (lt) * 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US20150033372A1 (en) * 2013-05-01 2015-01-29 Kymab Limited Human VpreB & Chimaeric Surrogate Light Chains in Transgenic Non-Human Vertebrates
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10034463B2 (en) 2014-01-24 2018-07-31 Children's Medical Center Corporation High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities
SG11201607015VA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS
CA3124228C (en) * 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
WO2016149678A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
WO2017035252A1 (en) * 2015-08-24 2017-03-02 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
TWI752920B (zh) 2015-10-12 2022-01-21 美商再生元醫藥公司 活化瘦素受體的抗原結合蛋白
CN105274116B (zh) * 2015-10-21 2020-09-29 重庆金迈博生物科技有限公司 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
EP3411476B1 (en) 2016-02-04 2024-04-24 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
US11530277B2 (en) 2016-04-20 2022-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for making antibodies based on use of an expression-enhancing locus
EP4368637A3 (en) 2016-05-20 2024-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
KR102784608B1 (ko) 2016-06-03 2025-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물
IL268667B2 (en) 2017-02-10 2024-12-01 Regeneron Pharma Radiolabeled antibodies against LAG3 for immuno-PET imaging
SMT202500038T1 (it) 2018-03-24 2025-03-12 Regeneron Pharma Topi o ratti geneticamente modificati per la generazione di anticorpi terapeutici contro complessi peptide-mhc, metodi di produzione e loro utilizzo
SI3773713T1 (sl) 2018-04-06 2025-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Protitelo, agonist leptinskega receptorja, za uporabo pri povečanju kostne mase pri osebi, ki trpi zaradi presnovne disfunkcije ali hipoleptinemije
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
TW202110323A (zh) 2019-06-05 2021-03-16 美商再生元醫藥公司 具有表現自κ 基因座的有限λ 輕鏈組庫的非人類動物及其用途
CA3163549A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
US10994021B1 (en) * 2020-04-11 2021-05-04 Bliss Biopharmaceutical (Hangzhou) Co., Ltd. Tetravalent antibody-drug conjugates and use thereof
CA3182925A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
JP2023541216A (ja) * 2020-06-25 2023-09-29 ヒューマブ カンパニー リミテッド ヘテロ接合型トランスジェニック動物
KR20230066386A (ko) 2020-09-11 2023-05-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항원 특이적 항체의 확인 및 제조
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
CA3165366A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
WO2022225985A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to artemin and methods of use thereof
EP4554977A1 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to ciliary neurotrophic factor receptor (cntfr) and methods of use thereof
TWI897189B (zh) * 2023-01-18 2025-09-11 美商基利科學股份有限公司 具有經改變重鏈基因座之嵌合基因轉殖免疫球蛋白小鼠及其製造及使用方法
US20240299601A1 (en) 2023-02-17 2024-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
CN117587070B (zh) * 2024-01-19 2024-04-30 北京仁源欣生生物科技有限公司 一种经遗传修饰的非人哺乳动物的制备方法及应用
WO2025166904A1 (zh) * 2024-02-07 2025-08-14 赛业（苏州）生物科技有限公司 用于制备抗体的基因修饰小鼠及其制备方法

Family Cites Families (189)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8626413D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Gilliland L K Antibodies
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
CA1341351C (en) 1988-09-06 2002-03-26 Marc D. Better Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US5574205A (en) 1989-07-25 1996-11-12 Cell Genesys Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP0502976B1 (en) 1989-12-01 1996-07-03 Pharming B.V. Production of recombinant polypeptides by bovine species and transgenic methods
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7084260B1 (en) 1996-10-10 2006-08-01 Genpharm International, Inc. High affinity human antibodies and human antibodies against human antigens
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US7067284B1 (en) 1992-01-27 2006-06-27 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
SG48760A1 (en) 1992-07-24 2003-03-18 Abgenix Inc Generation of xenogenetic antibodies
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
PL309249A1 (en) 1992-12-01 1995-10-02 Protein Design Labs Humanised antibodies against l-selectin
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5877396A (en) 1993-04-23 1999-03-02 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Mice mutant for functional Fc receptors and method of treating autoimmune diseases
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
EP0739412B1 (en) 1993-12-23 2002-02-27 Infigen, Inc. ungulate EMBRYONIC STEM CELLS AS NUCLEAR DONORS AND NUCLEAR TRANSFER TECHNIQUES TO PRODUCE CHIMERIC AND TRANSGENIC ANIMALS
GB9401380D0 (en) 1994-01-25 1994-03-23 Pharmaceutical Proteins Ltd Embryonic cell isolation
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US7119248B1 (en) 1994-04-12 2006-10-10 Miltenyi Biotec Gmbh Antibodies against epitopes with homology to self antigens, methods of preparation and applications thereof
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1997032603A1 (en) 1996-03-05 1997-09-12 The Scripps Research Institute Recombinant constructs encoding t cell receptors specific for human hla-restricted tumor antigens
DK0826696T3 (da) 1996-09-03 2002-09-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Anvendelse af bi- og trispecifikke antistoffer til inducering af en tumorimmunitet
ES2301183T3 (es) 1996-12-03 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpo completamente humano que se une al receptor del egfr.
BR9808192A (pt) 1997-03-06 2000-10-24 Infigen Inc Processo de clonagem de animais
CN1203922A (zh) 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
CN100387621C (zh) 1997-04-14 2008-05-14 麦可麦脱股份公司 抗人抗原受体的新的生产方法及其用途
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
ATE373712T1 (de) 1997-10-03 2007-10-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Natürlicher menschlicher antikörper
ES2245487T3 (es) 1997-11-18 2006-01-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas.
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
RU10506U1 (ru) 1999-04-08 1999-08-16 Кривулин Виталий Николаевич Ручной культиватор
CA2370477C (en) 1999-04-15 2010-06-29 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein
CA2373638A1 (en) 1999-05-27 2000-12-07 Human Genome Sciences, Inc. Adam polynucleotides and polypeptides
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
AU2001245358A1 (en) 2000-02-29 2001-09-12 Auburn University Production of antibodies in transgenic plastids
CN101498731A (zh) 2000-05-18 2009-08-05 日本烟草产业株式会社 抗协同刺激信号转导分子ailim的人单克隆抗体及其药物用途
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
MXPA03000634A (es) 2000-07-21 2004-12-03 Us Agriculture Metodos para el reemplazo, el desplazamiento y acumulacion de adn en genomas eucarioticos.
CA2422155A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Wim Van Schooten Production of humanized antibodies in transgenic animals
EP1184458A1 (en) 2000-08-28 2002-03-06 U-BISys B.V. Differentially expressed CD46 epitopes, proteinaceous molecules capable of binding thereto, and uses thereof
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2002040685A2 (en) 2000-11-16 2002-05-23 Cornell Research Foundation, Inc. Vectors for conditional gene inactivation
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
DE10064750A1 (de) 2000-12-22 2002-06-27 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von 1,6-Hexandiolen
MA26040A1 (fr) 2001-01-05 2004-04-01 Pfizer Des anticorps pour recepteur i de facteur de croissance insulinique
US6961875B2 (en) 2001-03-22 2005-11-01 International Business Machines Corporation Method and apparatus for capturing event traces for debug and analysis
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
US7074611B2 (en) 2001-04-27 2006-07-11 Gie-Cerbn, Centre Europeen De Recherche En Biologie Et En Medecine (Gie) Method for the stable inversion of DNA sequence by site-specific recombination and DNA vectors and transgenic cells thereof
WO2002092812A1 (fr) 2001-05-11 2002-11-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha CHROMOSOME HUMAIN ARTIFICIEL CONTENANT LE GENE A CHAINE LEGERE DE L'ANTICORPS HUMAIN $g(l)
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
JP2005538706A (ja) 2001-07-12 2005-12-22 ジェファーソン フーテ， スーパーヒト化抗体
EP1578917A4 (en) 2001-07-19 2008-01-23 Perlan Therapeutics Inc MULTIMEDIA PROTEINS AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
ES2350248T3 (es) 2001-10-01 2011-01-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Procedimiento de producción de bibliotecas de proteínas y de selección de proteínas a partir de las mismas.
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
EP3269235B1 (en) 2001-11-30 2022-01-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic mice bearing human ig lambda light chain genes
GB0130267D0 (en) 2001-12-19 2002-02-06 Neutec Pharma Plc Focussed antibody technology
US20050095712A1 (en) 2002-01-17 2005-05-05 Alberto Martin Mutations caused by activation-induced cytidine deaminase
JP2005527490A (ja) 2002-01-18 2005-09-15 イノヴィオ アーエス 筋肉内投与のための二重特異性抗体ｄｎａ構築物
DE60327199D1 (de) 2002-04-26 2009-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zum screening auf agonistische antikörper
AU2003243190A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of inducing formation of functional and organized lymphatic vessels
CN1675245B (zh) 2002-06-14 2011-01-12 免疫医疗公司 人源化单克隆抗体hPAM4
CN101962408A (zh) 2002-07-12 2011-02-02 杰斐逊·富特 超人源化抗体
CN105884893A (zh) 2002-07-18 2016-08-24 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
CL2003002461A1 (es) 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
GB0230201D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
EP1439234A1 (en) 2003-01-08 2004-07-21 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Targeted transgenesis using the rosa26 locus
DE602004021095D1 (de) 2003-01-21 2009-06-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zum screening der leichten kette eines antikörpers
JP2006518372A (ja) 2003-01-28 2006-08-10 セレクティス 脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびその応用
US20070009957A1 (en) 2003-03-04 2007-01-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Vectors used to create hybrid constant regions
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
WO2005001087A2 (en) 2003-06-11 2005-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying genes in eukaryotic cells
CN1852925A (zh) 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
US20050153392A1 (en) 2003-08-11 2005-07-14 Roland Buelow Transgenesis with humanized immunoglobulin loci
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
WO2005038001A2 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer
JP4906094B2 (ja) 2004-01-16 2012-03-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド レセプターを活性化し得る融合ポリペプチド
EP1723235B1 (en) 2004-02-12 2012-06-27 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Modified cells that co-express blimp1 and a reporter molecule and methods of using the same
CN1560081A (zh) 2004-02-17 2005-01-05 大连帝恩生物工程有限公司 用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用
US7625549B2 (en) 2004-03-19 2009-12-01 Amgen Fremont Inc. Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice
DK1802193T3 (da) 2004-10-19 2014-06-10 Regeneron Pharma Fremgangsmåde til frembringelse af en homozygot mus til genetisk modifikation
US20080184380A1 (en) 2004-10-22 2008-07-31 Therapeutic Human Polyclonals Inc. Suppression of Endogenous Immunoglobulin Expression in Non-Human Transgenic Animals
WO2007001422A2 (en) * 2004-10-22 2007-01-04 Medimmune, Inc. High affinity antibodies against hmgb1 and methods of use thereof
DK1815001T3 (da) 2004-11-26 2011-05-16 Helmholtz Zentrum Muenchen Genfældekassetter til tilfældig og målrettet konditioneret geninaktivering
EP1662005A1 (en) 2004-11-26 2006-05-31 FrankGen Biotechnologie AG Enhancer-containing gene trap vectors for random and targeted gene trapping
US20110041370A1 (en) 2005-04-21 2011-02-24 Saint Andre M Face sheet, identification band, and related methods
WO2006117699A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Innate Pharma Transgenic animals and methods of making recombinant antibodies
CN101297031B (zh) 2005-05-14 2013-06-05 复旦大学 在脊椎动物中作为遗传操作和分析工具的piggyBac
CA2609142C (en) 2005-05-27 2016-02-09 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Therapeutic gene vectors comprising mirna target sequences
ATE416465T1 (de) 2005-06-30 2008-12-15 Borealis Tech Oy Überzug-schicht für energie- oder kommunikationskabel
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP2314619A1 (en) 2005-12-05 2011-04-27 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
US20090307787A1 (en) 2006-01-25 2009-12-10 Franklin Gerardus Grosveld Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
GB2434578A (en) 2006-01-26 2007-08-01 Univ Basel Transgenic animals
US7462759B2 (en) 2006-02-03 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brittle stalk 2 gene family and related methods and uses
GB0615327D0 (en) 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
PL2374818T3 (pl) 2006-06-02 2013-05-31 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
WO2007149246A2 (en) 2006-06-12 2007-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Cre-lox based gene knockdown constructs and methods of use thereof
US8084024B2 (en) 2006-08-22 2011-12-27 G2 Inflammation Pty Ltd Method for producing antibodies
WO2008027986A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
PL2069403T3 (pl) 2006-10-02 2015-08-31 Regeneron Pharma Przeciwciała ludzkie o wysokim powinowactwie wobec receptora ludzkiej IL-4
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
GB0700194D0 (en) 2007-01-05 2007-02-14 Univ Edinburgh Humanisation of animals
CN101688228B (zh) 2007-03-13 2014-12-24 国家犾太健康中心 抗体产生的方法
US9043994B2 (en) 2007-03-13 2015-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Cre-lox based gene knockdown constructs and methods of use thereof
GB0706628D0 (en) 2007-04-04 2007-05-16 Univ Erasmus Germ-line manipulation 1
EP2336329B8 (en) 2007-06-01 2012-11-21 Omt, Inc. Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenis human idiotype antibodies
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
ITMI20071522A1 (it) 2007-07-27 2009-01-28 Areta Internat S R L Vaccino idiotipico
US9693539B2 (en) 2007-08-10 2017-07-04 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. HCO32 and HCO27 and related examples
BRPI0815416A2 (pt) 2007-08-15 2014-10-21 Amunix Inc Composições e métodos para modificar propriedades de polipeptídeos biologicamente ativos
CN101970491A (zh) 2007-08-30 2011-02-09 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院 树突状细胞标记物及其用途
CN101855242B (zh) 2007-09-14 2014-07-30 阿迪马布有限责任公司 合理设计的合成抗体文库及其用途
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US8536310B2 (en) 2007-10-17 2013-09-17 Arca Biopharma, Inc. Antibodies to CLL-1
US7659842B2 (en) 2007-10-24 2010-02-09 Infineon Technologies Ag Quantization error reduction in PWM full-MASH converters
KR101615935B1 (ko) 2007-12-14 2016-04-28 노보 노르디스크 에이/에스 인간 ｎｋｇ2ｄ에 대한 항체 및 그것의 용도
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US20090271884A1 (en) 2008-03-07 2009-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ES Cell-Derived Mice From Diploid Host Embryo Injection
CA2721231C (en) 2008-04-14 2015-10-06 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
KR20110020860A (ko) 2008-05-23 2011-03-03 알리바 바이오파마수티컬스, 아이엔씨. 유전자 삽입동물에서 단일 ｖｌ 도메인 항체를 생산하는 방법
PL3456190T3 (pl) * 2008-06-27 2022-06-06 Merus N.V. Wytwarzające przeciwciała transgeniczne zwierzę z gatunku myszy
LT2346994T (lt) 2008-09-30 2022-03-10 Ablexis, Llc Knock-in pelė, skirta chimerinių antikūnų gamybai
CA2742969A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
US8497325B2 (en) 2008-12-15 2013-07-30 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Thermoplastic polyolefin blends and films therefrom
AU2009329365B2 (en) 2008-12-18 2016-01-14 Roger Kingdon Craig Non-human transgenic animals expressing humanised antibodies and use thereof
EP2401298A1 (en) 2009-02-24 2012-01-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
KR20140056401A (ko) 2009-05-07 2014-05-12 볼보 컨스트럭션 이큅먼트 에이비 작업 기계 및 작업 기계를 작동하기 위한 방법
SG175407A1 (en) 2009-05-29 2011-11-28 Morphosys Ag A collection and methods for its use
ES2865648T3 (es) 2009-06-26 2021-10-15 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecíficos fácilmente aislados con formato de inmunoglobulina nativa
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
CN102803488A (zh) 2009-11-17 2012-11-28 协和发酵麒麟株式会社 人类人工染色体载体
SMT201900251T1 (it) 2009-12-10 2019-07-11 Regeneron Pharma Topi che producono anticorpi della catena pesante
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA2802591A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN104404050B (zh) 2010-06-22 2018-06-08 瑞泽恩制药公司 杂交轻链小鼠
CA2807282A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Regeneron Pharamaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP2638155A1 (en) 2010-11-08 2013-09-18 Kymab Limited Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination
HUE047687T2 (hu) 2011-02-25 2020-05-28 Regeneron Pharma ADAM6 egér
FI3865581T3 (fi) 2011-08-05 2024-11-02 Regeneron Pharma Humanisoituja universaaleja kevytketjun hiiriä
US20130044257A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Lattice Energy Technology Corporation Mobile device with side-mounted camera module
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
KR102762747B1 (ko) 2011-10-17 2025-02-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9706759B2 (en) 2011-12-20 2017-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
EP3912465A1 (en) 2012-02-01 2021-11-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
PT2838917T (pt) 2012-04-20 2019-09-12 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas similares a ig heterodiméricas
KR102266274B1 (ko) 2012-06-12 2021-06-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
LT3501272T (lt) 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką
CN105189545A (zh) 2013-03-13 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 常见轻链小鼠

Also Published As

Publication number Publication date
IL297371B1 (en) 2024-10-01
HUE068728T2 (hu) 2025-01-28
PT3572517T (pt) 2021-06-23
SG10201914002RA (en) 2020-03-30
IL297371A (en) 2022-12-01
LT2739740T (lt) 2019-11-11
AU2020277108B2 (en) 2024-05-02
AU2018203592B2 (en) 2020-12-10
ZA201401006B (en) 2015-04-29
LT3572517T (lt) 2021-04-26
EP3865581A1 (en) 2021-08-18
DK3572517T3 (da) 2021-06-14
JP2014524243A (ja) 2014-09-22
IL273982B (en) 2022-11-01
NZ743520A (en) 2022-12-23
IL230766A0 (en) 2014-03-31
ES2758051T3 (es) 2020-05-04
AU2024205242A1 (en) 2024-08-22
US20130198879A1 (en) 2013-08-01
CN107602696B (zh) 2022-05-13
JP2017006146A (ja) 2017-01-12
MX2021001074A (es) 2022-06-14
JP7585277B2 (ja) 2024-11-18
IL273982B2 (en) 2023-03-01
US11357217B2 (en) 2022-06-14
HUE055276T2 (hu) 2021-11-29
CN103917650A (zh) 2014-07-09
NZ710301A (en) 2017-05-26
EP2739740B1 (en) 2019-10-02
NZ620586A (en) 2015-08-28
AU2015255276B2 (en) 2018-02-22
CY1124341T1 (el) 2022-07-22
RU2014108208A (ru) 2015-09-10
RU2664232C2 (ru) 2018-08-15
CY1122435T1 (el) 2021-01-27
HRP20241480T1 (hr) 2025-01-03
ES2990067T3 (es) 2024-11-28
RS61946B1 (sr) 2021-07-30
SMT202100357T1 (it) 2021-07-12
CN107602696A (zh) 2018-01-19
EP3865581B1 (en) 2024-09-25
JP2024116409A (ja) 2024-08-27
JP2020072695A (ja) 2020-05-14
FI3865581T3 (fi) 2024-11-02
JP7174805B2 (ja) 2022-11-17
US10130081B2 (en) 2018-11-20
EP4477671A2 (en) 2024-12-18
PL3865581T3 (pl) 2024-12-23
IL268413A (en) 2019-09-26
CA2844070A1 (en) 2013-02-14
HUE047278T2 (hu) 2020-04-28
DK2739740T3 (da) 2019-12-09
SI3572517T1 (sl) 2021-09-30
IL268413B (en) 2020-05-31
BR112014002713B1 (pt) 2023-01-17
IL297371B2 (en) 2025-02-01
JP2019062906A (ja) 2019-04-25
JP6510234B2 (ja) 2019-05-08
HRP20210916T1 (hr) 2021-09-03
SMT201900748T1 (it) 2020-03-13
US20190133094A1 (en) 2019-05-09
JP6724126B2 (ja) 2020-07-15
PT2739740T (pt) 2020-01-09
NZ727084A (en) 2022-08-26
AU2012294624B2 (en) 2015-08-13
DK3865581T3 (da) 2024-10-21
AU2018203592A1 (en) 2018-06-14
AU2020277108A1 (en) 2020-12-24
SI2739740T1 (sl) 2019-12-31
AU2012294624A1 (en) 2013-05-02
LT3865581T (lt) 2024-10-25
IL273982A (en) 2020-05-31
EP2739740A1 (en) 2014-06-11
WO2013022782A1 (en) 2013-02-14
CN103917650B (zh) 2017-10-24
NZ781020A (en) 2023-01-27
IL230766B (en) 2019-10-31
JP2023011882A (ja) 2023-01-24
BR112014002713A2 (pt) 2020-10-27
SMT202400413T1 (it) 2024-11-15
ES2872081T3 (es) 2021-11-02
SG2014007686A (en) 2014-03-28
AU2015255276A1 (en) 2016-01-28
RS59728B1 (sr) 2020-02-28
PL2739740T3 (pl) 2020-06-01
HRP20192255T1 (hr) 2020-03-06
MX2014001454A (es) 2014-06-04
JP2021118746A (ja) 2021-08-12
EP3572517A1 (en) 2019-11-27
SI3865581T1 (sl) 2024-12-31
NZ796161A (en) 2024-07-26
MX357623B (es) 2018-07-17
PL3572517T3 (pl) 2021-10-04
IL315571A (en) 2024-11-01
PT3865581T (pt) 2024-10-04
US20220394959A1 (en) 2022-12-15
SG10201606158TA (en) 2016-09-29
JP6886002B2 (ja) 2021-06-16
EP3572517B1 (en) 2021-03-24
EP4477671A3 (en) 2025-03-19
MX379533B (es) 2025-03-11
MY172718A (en) 2019-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220394959A1 (en) Humanized universal light chain mice
EP4067496B1 (en) Adam6 mice
HK40120049A (en) Humanized universal light chain mice
HK40057104A (en) Humanized universal light chain mice
HK40057104B (en) Humanized universal light chain mice
HK40073129A (en) Adam6 mice
RU2787781C2 (ru) Мыши с гуманизированной универсальной легкой цепью
HK40073129B (en) Adam6 mice
HK40041879A (en) Adam6 mice
HK40018196A (en) Humanized universal light chain mice
HK40018196B (en) Humanized universal light chain mice
NZ620586B2 (en) Humanized universal light chain mice
HK1196850B (en) Humanized universal light chain mice
HK1196850A (en) Humanized universal light chain mice
HK1177226A (en) Adam6 mice
HK1201292B (en) Adam6 mice
HK1193631A (en) Adam6 mice
HK1193632A (en) Adam6 mice
HK1174490B (en) Adam6 mice