CN115851736A - 一种在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子及其应用，属于植物基因工程与分子生物学技术领域；本发明中所述启动子记为ProBnaA07g27400D，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述启动子只在油菜的花器官中具有较强的表达能力，其可以驱动下游基因在植物花器官中特异性表达；所述启动子能够用于油菜菌核病抗病性研究、种质资源改良研究和基因工程研究。

Description

一种在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程与分子生物学技术领域，具体涉及一种在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子及其应用。

背景技术

植物基因表达主要是转录水平的调控，其受多种顺式作用元件和反式作用因子的协调控制。其中，植物基因的启动子在基因的表达调控中起关键作用。启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，其含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列元件，控制基因表达的强弱或者时空差异。按表达方式不同可将启动子分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。其中，组织特异性启动子只在特定的组织或器官中起作用的启动子，可在植物体内对外源基因进行精确调控，减少外源基因对植株正常生长发育的影响等。因此，对组织特异性启动子功能的研究在植物基因工程领域具有重要的科学意义。

油菜是世界上重要的油料作物之一，也是最早成功地进行基因转化的植物之一。自1986年Mathew等用农杆菌介导法首次把新霉素磷酸转移酶基因(NPT-II)转入芥菜型油菜中并获得转基因植株以来，转基因油菜研究与发展在世界范围内取得了举世瞩目的进展，油菜成为了基因工程模式植物。目前，国内外将相关外源基因导入油菜，培育出抗虫、抗除草剂、抗病、品质改良和功能性状优良等的油菜新品种、新品系。

花器官是油菜重要的器官，其与油菜产量和抗菌核病极其相关，想要通过转基因来提高油菜的产量、含油量和抗菌核病等性状以及表达高价值的外源蛋白，便需要筛选出油菜内源的花器官特异表达的启动子。目前尚未有文献报道油菜内源的花器官特异表达的启动子及其应用。

发明内容

针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子及其应用；本发明中所述启动子记为ProBnaA07g27400D，其核苷酸序列如SEQID No.1所示；所述启动子只在油菜的花器官中具有较强的表达能力，其可以驱动下游基因在植物花器官中特异性表达；所述启动子能够用于油菜菌核病抗病性研究、种质资源改良研究和基因工程研究。

本发明中提供了一种在花器官特异表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

进一步地，所述启动子的顺式作用元件包括TATA-box、CAAT-box、光响应元件G-box、厌氧诱导响应元件ARE、参与脂肪酸代谢的转录因子结合元件STRE和MYC转录因子结合位点CATGTG。

进一步地，所述花器官包括甘蓝型油菜的花器官。

本发明中还提供了检测上述启动子的引物，所述引物为：

正向引物ProBnaA07g27400D-F：5’-AAGAATTCACGCTTAGTGCTGTCTGGAAAC-3’(SEQID No.2)；

反向引物ProBnaA07g27400D-R：5’-TTAGATCTACACACGGAGCCATTTGGTAATAA-3’(SEQID No.3)。

本发明中还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述启动子。

进一步地，所述重组载体为植物GUS表达载体pCAMBIA1301中插入上述启动子。

本发明中还提供了重组菌，所述重组菌包含上述启动子或上述重组载体。

本发明中还提供了上述启动子、重组载体、重组菌在调控目的基因在植物花器官组织中特异性表达的应用。

其中，所述应用包括：调控抗菌核病基因在甘蓝型油菜的花器官中的特异表达，和/或提高甘蓝型油菜的菌核病抗性，和/或调节甘蓝型油菜的种子大小，和/或油菜菌核病抗性育种；和/或油菜种质资源改良。

进一步地，所述植物包括甘蓝型油菜。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明中通过启动子功能元件预测软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/htm1)对获得的在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子ProBnaA07g27400D(SEQ ID No.1)进行顺式作用元件预测，结果表明ProBnaA07g27400D除了包含TATA-box、CAAT-box等启动子核心序列以外，还有光响应元件G-box，厌氧诱导响应元件ARE，参与脂肪酸代谢的转录因子结合元件STRE；MYC转录因子结合位点CATGTG等其它功能元件。其中，TATA-box决定基因转录始的选择；CAAT-box控制着转录起始的频率；G-box作为蛋白结合的一个高度保守的位点。

本发明采用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜小芸，经潮霉素和PCR双重筛选获得转基因阳性植株，阳性转基因株系的GUS组织化学法染色结果表明：该启动子驱动的GUS基因在油菜花器官中表达，如在花瓣和雄蕊中均强烈表达。此外，采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测BnaA07g27400D基因在甘蓝型油菜不同组织中的相对表达量，发现BnaA07g27400D基因在花瓣和雄蕊中大量表达。由此可见，该启动子在花器官中有很强表达，这一特异性表达的启动子在油菜菌核病抗病性研究、种质资源改良研究和基因工程研究具有良好的应用价值。

本发明中所述在甘蓝型油菜花器官中特异表达的启动子可驱动下游目的基因BnaA07g27400D在植物花器官中的特异表达，因此，目的基因表达不会影响植株营养生长及发育，具有组织特异性。育种专家可利用其花器官特异表达特性表达目的基因来提高油菜的菌核病抗性、种子大小和油菜品质改良等性状，以及可利用花瓣来生产高价值的外源蛋白，次生代谢物等。

附图说明

图1为甘蓝型油菜BnaA07g27400D基因启动子ProBnaA07g27400D的电泳图，其中泳道1为DL5000的核酸Marker；泳道2为以基因组DNA为模板PCR扩增的启动子片段结果。

图2为ProBnaA07g27400D启动子元件分析结果图。

图3为植物表达载体pCAMBIA1301的图谱。

图4为表达载体pCAMBIA1301和pMD^TM19-T-ProBnaA07g27400D质粒进行双酶切的鉴定图，其中泳道1为DL15000的核酸Marker，泳道3为经EcoR I和Bgl II双酶切得到的pCAMBIA1301线性载体片段；泳道5为经EcoR I和Bgl II双酶切得到的2228bp的ProBnaA07g27400D启动子片段，泳道6为DL5000的核酸Marker。

图5为重组载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D的T-DNA区图谱。

图6为转基因植株PCR鉴定结果图，图中，泳道1为DL5000的核酸Marker，泳道2为正对照(pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D重组质粒)，泳道3-8为获得的6株油菜ProBnaA07g27400D-GUS转基因植株，泳道9和10为负对照(野生型小芸和水)。

图7为转基因油菜GUS组织化学染色结果图，图中A为4天幼苗；B为一月大的植株；C为茎；D为叶；E为花蕾；F为开放的花；G为花瓣；H为雄蕊；I为角果。

图8为BnaA07g27400D基因在甘蓝型油菜不同组织中的相对表达量。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均与首次表明的来源相同；所涉及的试剂、材料等无特殊说明，均为商业用途获得。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

本发明实施例中使用的所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，内切酶购自New England Biolabs，pMD^TM19-TVector、Solution I和DNA Marker购自TaKaRa，DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega，潮霉素购自VWR，qPCR SYBR Master Mix、反转录试剂盒和大肠杆菌感受态DH5α购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，农杆菌感受态GV3101购自上海唯地生物技术有限公司，Trizol Reagent购自ThermoFisher Scientific，DEPC水购自上海捷瑞，实验中所用的甘蓝型油菜小芸来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室；大肠杆菌感受态菌株DH5α、农杆菌感受态菌株GV3101和改造后的植物遗传表达载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D为本实验室保存。

LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g溶于800mL ddH₂O中，定容至1L，然后分装至10个锥形瓶用封口膜封口，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放至4℃保存。

LB固体培养基：称取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g溶于800mL ddH₂O中，然后定容至1L，然后分装至10个锥形瓶用封口膜封口，121℃高温高压灭菌15min，冷却后放至4℃保存。使用时放入微波炉中加热至融化，待液体冷却到50℃左右加入抗生素，摇匀后立刻倒至无菌平皿中，每皿约10mL。

M0培养基(1L)：MS粉4.4g，蔗糖30g，800mL ddH₂O充分溶解，调节pH值为5.84-5.88，定容至1L，最后加凝固剂Agar 10g，灭菌后分装到无菌平皿中,放于4℃冰箱待用。

DM培养基(1L)：MS粉4.4g，蔗糖30g，800mL ddH₂O充分溶解，调节pH值为5.84-5.88，定容至1L，灭菌,等培养基冷却后加入AS，1L中加入1mL AS(母液100μmol/mL)，放于4℃冰箱待用。

M1培养基(1L)：MS粉4.4g，蔗糖30g，甘露醇18g，2,4-D 1mg，KT 0.3mg，800mLddH₂O充分溶解，调节pH值为5.84-5.88，定容至1L，最后加凝固剂Agar 10g，灭菌后等培养基快冷却后加入AS，1L中加入1mL AS(母液100μmol/mL)，然后分装到无菌平皿中,放于4℃冰箱待用。

M2培养基(1L)：MS粉4.4g，蔗糖30g，甘露醇18g，2,4-D 1mg，KT 0.3mg，800mLddH₂O充分溶解，调节pH值为5.84-5.88，定容至1L，再加凝固剂Agar 10g，灭菌后等培养基快冷却后加入：特美汀300mg，STS 150μmol，卡那霉素25mg，然后分装到无菌平皿中,放于4℃冰箱待用。

M3培养基(1L)：MS粉4.4g，葡萄糖10g，木糖0.25g，MES 0.6g，800mL ddH₂O充分溶解，调节pH值为5.84-5.88，定容至1L，再加凝固剂Agar 10g，灭菌后等培养基快冷却后加入：ZT 2mg，IAA 0.1mg，特美汀300mg，AgNO₃ 150μmol，潮霉素7.5mg，然后分装到无菌平皿中,放于4℃冰箱待用。

M4培养基(1L)：MS粉4.4g，蔗糖10g，800mL ddH₂O充分溶解，调节pH值为5.84-5.88，定容至1L，凝固剂Agar 10g，灭菌后等培养基快冷却后加入：特美汀300mg，然后分装,放于4℃冰箱待用。

STS：[Ag(SO₃)²]^3-现用现配，时间过长有沉淀；母液：硫代硫酸钠，0.1M(2.48g溶于100mL ddH₂O)；AgNO₃，0.1M(1.7g溶于100mL ddH₂O)V_Na2SO3:V_AgNO3＝4：1，将AgNO₃溶于硫代硫酸钠中。

2，4-D(1mg/mL)：取1mL 10mg/mL的母液于12mL无菌管中，加入9mL灭菌后的双蒸水，混匀，保存于-20℃。

KT(1mg/mL)：0.02g KT先溶于1M HCL中，加水定容至20mL，保存于-20℃。

AS(100μmol/mL)：0.392g AS先溶于少量甲醇中，再加二甲基亚砜，定容至20mL，抽滤分装，保存于-20℃。

ZT(2mg/mL)：称0.02g ZT粉末溶于少量75％酒精中，加水定容至10mL，抽滤分装，保存于-20℃。

IAA(1mg/mL):0.1g IAA溶于少量1mol/L NaOH中，再加ddH₂O定容至100mL，抽滤分装，保存于-20℃。

TMT(300mg/mL):3.2g特美汀粉末溶于10.66mL灭菌的ddH₂O中，震荡混匀，抽滤分装，保存于-20℃。

HYG(50mg/mL)：1g潮霉素B溶于20mL灭菌的ddH₂O中，震荡混匀，抽滤分装，保存于-20℃。

Kana(100mg/mL)：10g卡那霉素粉末溶于100mL灭菌的ddH₂O中，震荡混匀，抽滤分装，保存于-20℃。

15％bleach溶液：10μL Triton X-100，1.875mL次氯酸钠(有效氯含量8％)，然后加入ddH₂O定容至10mL，此试剂需要现配现用，并全程在超净工作台中操作。

2×CTAB缓冲液：10g CTAB(C₁₆H₃₃(CH₃)₃NBr，十六烷基三甲基溴化铵)，40.85gNaCl，50mL浓度为1M的Tris-HCl，20mL浓度为0.5M的EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0)，然后加入ddH₂O定容至500mL。将上述试剂加热搅拌溶解，用1mol/L NaOH溶液调pH至8.0，121℃，15min高压蒸汽灭菌，冷却至室温备用。

下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：在植物花器官中特异表达启动子ProBnaA07g27400D的获得

(1)油菜基因组DNA的制备：

采集的0.1g甘蓝型油菜小芸的叶片并将其放入1.5mL的EP管中，液氮预冷后使用研磨枪将叶片磨成粉末，加入600μL的2×CTAB缓冲液摇匀，然后在65℃孵育30-60min使细胞裂解释放出DNA。孵育结束后将EP管冷却至室温，然后加入600μL氯仿/异戊醇(V:V＝24:1)混合液上下震荡直至充分混匀，接着在12,000rpm下离心10min，吸取400μL上清，转移到新的EP管中。向新的EP管中加入400μL异丙醇，轻轻混匀，然后在-20℃下醇沉20min，醇沉结束后在12,000rpm下离心10min，离心结束后弃上清，向沉淀中加入700μL冰乙醇，用移液枪将管底沉淀吹起，在2,000rpm下瞬旋，然后弃上清得到含有沉淀的EP管，将含有沉淀的EP管在超净台中吹风，一直到沉淀变透明，向其中加入50μL灭菌的ddH₂O，37℃孵育1h使DNA充分溶解，孵育结束后得到油菜基因组的DNA，保存于-20℃备用。

(2)甘蓝型油菜ProBnaA07g27400D启动子的克隆：

从http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/数据库获得甘蓝型油菜参考基因组DNA序列，利用primer5设计启动子ProBnaA07g27400D的特异性PCR扩增引物，其正向引物和反向引物分别如下所示。

正向引物ProBnaA07g27400D-F：5’-AAGAATTCACGCTTAGTGCTGTCTGGAAAC-3’(SEQID No.2)；

反向引物ProBnaA07g27400D-R：5’-TTAGATCTACACACGGAGCCATTTGGTAATAA-3’(SEQID No.3)。

利用特异性PCR扩增引物对步骤(1)中获得的油菜基因组的DNA进行PCR扩增，所用PCR反应体系及PCR反应程序如表1和表2所示：

表1.PCR反应体系(50μL)

组分	用量
		模板DNA(100ng/μL)	1μL
10×PCR buffer for KOD-Plus-	5μL
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3μL
2mM dNTPs	5μL
		正向引物(10μmol/L)	1.5μL
反向引物(10μmol/L)	1.5μL
		KOD-Plus-	1μL
ddH<sub>2</sub>O	To 50μL

表2.PCR反应条件

程序	温度	时间
			Hold	94℃	2min
	94℃	15s
			Cycle(36)	56℃	30s
	72℃	2min 30s
			Hold	72℃	7min
Keep	12℃	60min

将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图1所示。从图1中可以看出，PCR产物大小为2228bp。将上述得到的PCR产物按DNA凝胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，并检测到浓度为124ng/μL，然后将回收到的DNA片段连接至pMD^TM19-T Vector载体，转化DH5α，用PCR方法筛选阳性单克隆并进行测序，测得启动子ProBnaA07g27400D序列如SEQ IDNo.1所示。

SEQ ID No.1

ACGCTTAGTGCTGTCTGGAAACCGGTTTACAGGGAGAATACCGGAGGTCTATGGCTTAACCGGATTATTGATATTGGATCTAAGCAGGAATTTCTTCTCTGGACCGTTGCCTTTAAGCGTTGGAGGATTGAGTTCACTGCTGAAACTGGATGTTAGTAACAATTACTTGGAAGGAAAGGTACCTATAGAGCTACAGTTCTTAACGAATTTGACTCTTTTGGATCTTAGGAACAACAGATTCTCAGGAGGACTGACCAAAGAGATCCAAGAGATGAGTTCATTGGTTGAACTTGTTTTGTCCAGTAACCATCTCGAAGGGGACTTAACAGGAATAGAGTGGAGAAATCTGAAGAATTTGGTGGTTTTGGATCTCTCCAACACAGGGTTAAAAGGAGAGATTCCATGGTCAATCTTGGAGCTCAAGAAACTGAGGTTCTTAGGTCTAAGCAACAACAGTCTCGGAGGCAAACTCTTTCCTCAAATGGAAACTAAAATGCCTTGTCTCAACGCGCTCTATGTAAATGGAAATAACATCAGTGGAGAGCTGGGGTTCTCTAAAAAGTTCTATGAGAGGATGGGAAGAAGACTTGGTGCTTGGGGCAACCCTAATCTGTGTTACCACGGTGATGAAATCAAAAACCTTCGTGATCATGCTCCTTTTGGAGTGAACCAATGCAAGAGAATGAAGGCGGTGACTTTGGCTTAAGACAGAACCTGGAACTTGGAAAGTTACGAAGCTCTGGTCTTTTCAACCATGCATTTTATTCAACTTTGCCAATATATCTTGTGTGCATTTTCTTTTCTATTTTTGTTACTAGTAGTAGTAAGTATCAGACATAACATGTGTACGTATAAATAAAAGAAAGAAACCCCAATTGGAAAAAAAAATCGTTTATTGTATTTTTCTGCAGCGCCACCAAACAAGAAGGCGATCAAATGTAGTGAAATAACAAAACCAAACTACAAAATGATCAAATTTGATGGGTTTATTTTAATAAGAAATTACACTCGAAATTATCGTTTGGTTTTGAGCATTCCATAAAGATTATAAAGATGTGTTAGTATTTCATCAAAGGAGGGACTGTATGACTTTCTGCGACATGTCTAAACGTGGGAAGTATGTTTGAACTTTACTTTGGTTTGGCATTTTGTAAAATACAGAGAAAAGTCTATTCAAAGGAAGAAGAATTAAGTCCGATTTAAATGAAGAATCAGGTGGATATCCATATCAATAATGGAGTAAAGGAATAAAAACTGCTGTCAAATCAAATAGTGTATAAGCTAGTCAACCCTCCAAACTAACTTATTTGTCTTACTTTCTTAAAATACCTTCTCACGCAAAAGATTTAGGTTGGTATACATTGTTTTAACGTGTTTTCTGCATGAACTTTCAGTATTTTTCATACTTGTATTGAAAAGCACGTGTAATTAATTAATTCTACACATTCGTTTCATTAAACATAAGTTTTTTTTTCGTATCATGATCATCCTATATATACTAACTGTTACTTGTTCTAGTCTTTTTACAATATGGTATATAACATATCACTTTAGTGTCTAAGTTAAAATTATCATTATACTAGCGTTTTGGCATTTATATTAAGATTTCAGAAACTTAATATATTTTTGTGCCCGAAATATTTGATGTTTAAGCACAAGTCAAGTTTGATATTATGATACTTACGAAAGCGAAAAGATAAGCTTGCTTTACTATTCACGTATTCGACATCTTAGGATAATTACTGTTGAGAGTTTGAATATTACAACAACAAAACAAAACTAGCTAAACAGTAATGACGTCTATATAACTATTTAATATTCTCGTCAACGAACTTGGCATAATAAAATGTAAAATCTTGAAATAAACGACGGTCACCTCAAACCAGATTCCCATTTCCTAAGTATAAAATGGATCTGTTTACATTCTAAAATACATAAAATAAACAAAAGTTGACGACGGCGACCAAAACAAAACTCAATATTTAAAAATTTTGATACTAAATTAATATAGAAAATTCAAAGTCTTACATTAGCGTGGGATTCACTCCTCTCTCACCGTTCCACTCTTTCCCCCTCATTTCCGCTACACTTATTTCCATCAAATCCACACACACGCGCATATTATATAAACACATATACTTACACATTATTCATTCATCCATTACTAATAGAAGAACGAGTTAAACTAAAAAAAAAGCATAAACATTTATTACCAAATGGCTCCGTGT。

将上述测序正确的重组载体命名为pMD^TM19-T-ProBnaA07g27400D。

本实施例中采用在线网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/htm1)对获得的启动子序列ProBnaA07g27400D进行顺式作用元件预测。分析结果如图2所示，从图中可以看出，ProBnaA07g27400D除了TATA-box、CAAT-box等启动子核心序列以外，还有光响应元件G-box；厌氧诱导响应元件ARE；参与脂肪酸代谢的转录因子结合元件STRE；MYC转录因子结合位点CATGTG等其它功能元件。

实施例2：pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D重组载体构建

使用EcoR I和Bgl II对如图3所示的植物表达载体pCAMBIA1301进行酶切、电泳，得到如图4泳道3所示的pCAMBIA1301线性化载体片段，并对线性化载体片段胶回收。

对实施例1中提取得到的重组载体pMD^TM19-T-ProBnaA07g27400D进一步活化提取，使用EcoR I和Bgl II进行酶切、电泳，得到如图4中的泳道5所示的目的片段，即ProBnaA07g27400D启动子片段，并对ProBnaA07g27400D启动子片段进行胶回收。

将摩尔比为10:1的ProBnaA07g27400D启动子片段和pCAMBIA1301线性化载体片段用Solution I进行高效连接，通常情况下ProBnaA07g27400D启动子片段取0.3pmol，pCAMBIA1301线性化载体片段取0.03pmol。然后将连接后的产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性单克隆，将筛选到的阳性单克隆命名为pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D，其T-DNA区结构示意图如图5所示。图中黄色部分表示ProBnaA07g27400D启动子片段，深蓝色部分表示GUS报告基因，本研究将ProBnaA07g27400D启动子插入在GUS报告基因上游位置，可驱动该GUS基因在植物不同组织部位中进行表达，从而研究该启动子的表达模式。

实施例3：将重组载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转化油菜

1.将重组载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转入农杆菌

从超低温冰箱中拿出一管农杆菌感受态GV3101，待其部分溶化后放置在冰上并从中吸取33μL到EP管中。吸取3μL实施例2中获得的重组载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D加入到含有农杆菌感受态GV3101的EP管中，使用枪头轻轻混合均匀，然后将EP管放置在冰上等待5min，结束后立即置于液氮中放置5min，随后在37℃条件下水浴5min，水浴结束后放置于冰上等待五分钟。然后在超净台里吸取600μL LB液体培养基加入到EP管中，28℃震荡培养2-3h，培养结束后在6000rpm的条件下离心1min，在超净台中去掉500μL上清，剩余菌液吸打混匀涂布在含有Rif(利福平，50mg/mL)+Gen(庆大，50mg/mL)+Kana卡那霉素，50mg/mL)抗性的固体LB培养基上，在28℃下倒置避光培养36-48h。

待菌斑长出后，挑取肉眼可见的单菌落置于含有800μL Rif+Gen+Kana抗性的LB液体培养基的新EP管中，28℃震荡培养14-16h，然后用特异性引物采用如表3所示的PCR反应体系和表4所示的程序对pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D重组菌进行PCR鉴定，确定阳性克隆，得到含有重组载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D的农杆菌，备用。

所述特异性引物的序列如下所示：

ProBnaA07g27400D-F：5’-AAGAATTCACGCTTAGTGCTGTCTGGAAAC-3’(SEQ ID No.2)；

1301-GUSR：5’-TCCTGATTATTGACCCAC-3’(SEQ ID No.4)。

表3.PCR反应体系及程序如下：

组分	用量
		Template	2μL
正向引物(10μmol/L)	1μL
		反向引物(10μmol/L)	1μL
2×Premix Taq	10μL
		ddH<sub>2</sub>O	To 20μL

表4.PCR反应程序

2.农杆菌介导的油菜遗传转化

a.播种：

(1)挑选颗粒饱满，无霉变，无破损的小芸种子，将种子放置于12mL无菌管中；

(2)用体积分数为75％的乙醇浸泡种子30-45s，期间上下颠倒摇晃；

(3)倒掉75％乙醇，然后用无菌水冲洗4-5遍；

(4)冲洗结束后，倒掉无菌水，往管中加入提前配好的质量浓度15％的bleach消毒液，消毒6min，期间轻轻上下颠倒摇晃，不用使劲摇晃，避免产生大量泡沫；

(5)倒掉15％bleach，迅速用无菌水冲洗4-5遍，直到没有泡沫产生且无菌水呈清澈透明状后，倒掉无菌水；

(6)将消好毒的种子用已烧好预冷的镊子播到M0培养瓶中，每瓶播20-25粒，分散均匀；

(7)将培养瓶中置于培养箱中，24℃避光培养5-6天。

b.农杆菌的活化与侵染液的制备：

(1)从超低温冰箱中取出保存的含有重组载体pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D的农杆菌，在含有Rif(利福平，50mg/mL)+Gen(庆大，50mg/mL)+Kana(卡那霉素，50mg/mL)抗性的固体LB培养基上划线，28℃避光培养36-48h；

(2)挑取单菌落置于含有700μL Rif+Gen+Kana抗性的LB液体培养基的EP管中，28℃震荡培养14-16h，然后采用步骤1中所述的方法进行菌液PCR鉴定；

(3)将条带正确的菌液扩大培养(50μL+5mL含有Rif(利福平，50mg/mL)+Gen(庆大，50mg/mL)+Kana卡那霉素，50mg/mL)抗性LB液体培养基)，28℃震荡培养14-16h；

(4)用分光光度计测量菌液OD₆₀₀值，将OD₆₀₀值控制在0.4-0.6之间，最好在0.4左右；

(5)在超净台中，将OD₆₀₀值适宜的菌液吸取2mL到新的EP管中，在8,000rpm条件下离心10min；

(6)弃上清，加入2mLDM悬浮液，吸打混匀，然后在8,000rpm条件下离心10min；

(7)弃上清，重新加入2mLDM悬浮液，吸打混匀，制成侵染液，放入4℃备用。

c.外植体的制备与侵染：

(1)准备好M1液体培养基、M1固体培养基、DM悬浮液、灭菌的滤纸、5mL大枪头、剪刀、镊子、移液枪等物品，放入超净台中灭菌；

(2)在空的培养皿中倒入适量的M1液体培养基；

(3)用镊子夹取步骤a中得到的在M0中生长的小芸幼苗，用剪刀去掉根部和子叶，将下胚轴用剪刀倾斜45°剪成0.8-1cm长的小段放入装有M1液体培养基的培养皿中；

(4)待剪好的下胚轴差不多铺满培养皿即可，将培养皿中的M1培养基吸走，加入18mL DM悬浮液，将步骤b中制好的侵染液倒入培养皿中，侵染12-15min，期间时不时摇晃几次；

(5)侵染结束后，立即用移液枪将培养皿中的液体吸干，用镊子将下胚轴拨到滤纸上，待滤纸吸干下胚轴表面菌液时，将下胚轴夹到M1固体培养基上，用镊子将下胚轴摆放均匀，密封培养皿，24℃避光倒置培养36-48h，36h为最适宜时间。

(6)36h后将M1上的下胚轴转移到含有对应载体真核抗性的M2筛选培养基上，24℃光照条件下(16h光照，8h黑暗)倒置培养15天。

(7)15天后，将M2上有活性的下胚轴转移到M3出芽培养基上(含有Kana抗性，质量浓度为30mg/mL)，24℃光照条件下(16h光照，8h黑暗)正置培养15天，每15天继代一次，直至长出绿芽。

(8)将长大的绿苗转移至M4生根培养基，在24℃下培养，每天保持16h光照和8h黑暗直至生根。

(9)当生出适量的根后，将根上的培养基去除干净，将根部沾取加入多菌灵的水，然后将幼苗移栽到营养土中(蛭石：营养土＝2：1)，裹上保鲜膜，放入培养室在24℃下培养，每天保持16h光照和8h黑暗。

(10)观察幼苗长势，待适应外部环境后，将保鲜膜一点点去掉，得到pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转基因油菜。

3.pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转基因油菜的筛选及鉴定：

取上述遗传转化后获得的T0代组培苗(pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转基因油菜植株)的叶片0.1g，采用实施例1中所述的方法提取基因组DNA，然后以提取的叶片DNA为模板，利用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的特异性引物进行PCR检测，检测结果如图6所示，共筛选到三株阳性转基因植株(分别是#3、#7和#8)。泳道1为DL5000的核酸Marker，泳道2为正对照(pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D重组质粒)，泳道3-8获得的6株油菜ProBnaA07g27400D-GUS转基因植株。

实施例5：转基因油菜植株各组织器官中GUS基因表达的组织化学检测及BnaA07g27400D基因组织表达特性分析

1.转基因油菜植株各组织器官中GUS基因表达的组织化学检测：

将pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转基因T1代植株幼苗(由pCAMBIA1301-ProBnaA07g27400D转基因油菜收获的种子发育得到的植株)和以及转基因植株的不同组织器官放于培养皿中，加入适量GUS染液，于37℃保温反应过夜；然后转入体积分数为70％的乙醇中脱色后，在显微镜下观察拍照。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位，通过检测GUS基因的表达部位和表达强度来探索ProBnaA07g27400D的时空表达模式。图7为转基因油菜GUS组织化学染色结果图，从图中可以看出，图A和图B中的整株幼苗无蓝色部位，图C的茎无蓝色部位，图D的叶无蓝色部位，图E的花蕾无蓝色部位，图F的花呈现出蓝色，图G的花瓣呈现出蓝色，图H的雄蕊呈现出蓝色，图I的角果无蓝色部位。这表明启动子ProBnaA07g27400D诱导的GUS基因仅在植株的花瓣和雄蕊中高效表达。

2.BnaA07g27400D基因组织表达特性分析：

为了进一步确定BnaA07g27400D基因在甘蓝型油菜中特异表达情况，选取甘蓝型油菜小芸的根、茎、叶、花蕾、花瓣、雌蕊、雄蕊和角果，提取这些组织的总RNA并反转录成cDNA，然后以β-Actin作为内参基因，采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR,qRT-PCR)检测BnaA07g27400D基因在甘蓝型油菜不同组织中的相对表达量。

qRT-PCR扩增引物序列如下：

QA07F:5’-GTTCTGCTCTGTCTAGTTCTGT-3’，如SEQ ID NO.6所示；

QA07R:5’-TTCCTATTCTTCATCTCCACGG-3’，如SEQ ID NO.7所示。

Actin-Q-F1:5’-TGTTGCTATCCAGGCTGTTCTTTC-3’，如SEQ ID NO.8所示；

Actin-Q-R1:5’-GATAGCGTGAGGAAGAGCATAACC-3’，如SEQ ID NO.9所示。

qRT-PCR反应体系如表5所示，循环体系如表6所示：

表5.qRT-PCR的反应体系

组分	用量
		2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix	10μL
Primer-F	0.4μL
		Primer-R	0.4μL
模板cDNA(10×)	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	To 20μL

表6.qRT-PCR的循环体系

通过2^-△△Ct方法分析BnaA07g27400D基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达量，从图中可以得出以下结论：BnaA07g27400D基因在花瓣和雄蕊中大量表达；在其它组织中不表达或者有少量表达；上述结果表明BnaA07g27400D基因在甘蓝型油菜的花瓣和雄蕊中特异表达。

综上所述，本发明甘蓝型油菜启动子ProBnaA07g27400D及其应用，所述启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述启动子驱动目的基因在甘蓝型油菜花瓣和雄蕊中特异表达。将启动子ProBnaA07g27400D与目的基因连接后转入油菜中，通过该启动子在花器官中驱动目的基因的表达。

应当理解的是，上述具体实施方法仅用于示例性说明或解释本发明的基本原理，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.花器官特异表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的花器官中特异表达的启动子，其特征在于，所述启动子的顺式作用元件包括TATA-box、CAAT-box、光响应元件G-box、厌氧诱导响应元件ARE、参与脂肪酸代谢的转录因子结合元件STRE和MYC转录因子结合位点CATGTG。

3.根据权利要求1所述的花器官中特异表达的启动子，其特征在于，所述花器官包括甘蓝型油菜的花器官。

4.检测权利要求1所述启动子的引物，其特征在于，所述引物为：

正向引物ProBnaA07g27400D-F：5’-AAGAATTCACGCTTAGTGCTGTCTGGAAAC-3’(SEQ IDNo.2)；

反向引物ProBnaA07g27400D-R：5’-TTAGATCTACACACGGAGCCATTTGGTAATAA-3’(SEQ IDNo.3)。

5.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求1-3任一项所述的启动子。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为植物GUS表达载体pCAMBIA1301中插入权利要求1所述的启动子。

7.重组菌，所述重组菌包含权利要求1-3任一项所述的启动子或权利要求5所述的重组载体。

8.权利要求1-3任一项所述的启动子或权利要求5所述的重组载体或权利要求7所述的重组菌在调控目的基因在植物花器官组织中特异性表达的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

调控抗菌核病基因在甘蓝型油菜的花器官中的特异表达，和/或提高甘蓝型油菜的菌核病抗性，和/或调节甘蓝型油菜的种子大小，和/或油菜菌核病抗性育种，和/或油菜种质资源改良。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物包括甘蓝型油菜。

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