HU217421B

HU217421B - Eljárás proteinszintézis-inhibitort kódoló DNS és a kódolt protein előállítására, valamint eljárás ezek alkalmazására patogének leküzdésében

Info

Publication number: HU217421B
Application number: HU035/91A
Authority: HU
Inventors: Guido Jach; Jürgen Logemann; John Mundy; Jeff Schell
Original assignee: Max-Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 2000-01-28
Also published as: EP0492536B1; ES2198401T3; IE914447A1; CA2057313A1; AU8971691A; AU657929B2; US5633442A; EP0492536A2; HUT60779A; ZA919630B; JPH06113856A; HU914035D0; EP0896059A2; EP0492536A3; US6271442B1; DE4040954C2; KR920012446A; IL100244A0; EP0896059A3; DE4040954A1

Abstract

A találmány tárgya eljárás specifikűs prőteinszintézis- inhibitőr-prőteint kódőló DNS, a fenti DNS-t tartalmazó expressziós vektőr, és afenti DNS által kódőlt prőtein előállítására, eljárás a prőteinttartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, a prőteint tartalmazómezőgazdasági készítmények, amelyek növénypatőgének leküzdésére vagypatőgénrezisztens tűlajdőnságők kialakítására alkalmazhatók, éseljárás patőgénekkel szemben rezisztens növények és növényi sejtekelőállítására a fenti DNS alkalmazásával, valamint eljárásnövénypatőgén gőmbák szapőrődásának gátlására a fenti prőteinalkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás specifikus proteinszintézisinhibitor-proteint kódoló DNS, a fenti DNS-t tartalmazó expressziós vektor, és a fenti DNS által kódolt protein előállítására, eljárás a proteint tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, a proteint tartalmazó mezőgazdasági készítmények, és eljárás patogénekkel szemben rezisztens növények és növényi sejtek előállítására a fenti DNS alkalmazásával, valamint eljárás növénypatogén gombák szaporodásának gátlására a fenti protein alkalmazásával.

Ismeretes, hogy a növények különféle mechanizmusokat alkalmaznak (hasznosítanak), hogy megvédjék magukat a patogének okozta fertőzések ellen. Ezekhez a mechanizmusokhoz tartoznak például: a sejtfal szerkezetében végbemenő változások; toxikusán ható fitoalexinek szintézise; az úgynevezett PR-fehérjék (patogenezissel kapcsolatos fehérjék) felhalmozódása; proteázgátlók; valamint hidrolitikusan működő enzimek [lásd például: Ann. Rév. Plánt Physiol. 30, 105 (1979); valamint ugyanott 35, 34 (1984)].

Ismert továbbá [lásd például: Biochem. J. 216, 617 (1983)], hogy különböző növények olyan fehéijéket termelnek, amelyek eukarióták riboszómáit gátolni képesek. Az ilyen, fehérjeszintézist gátló fehérjék jellemző sajátsága, hogy a növény saját riboszómáit nem befolyásolják, viszont az idegen riboszómákat hatástalanítják. Ezek a fehérjék főként „RIP”-fehéijék (riboszómákat gátló fehérjék) elnevezéssel váltak ismertté; legtöbbjének csupán a molekulatömegét és hatásmódját ismerik.

Azokhoz a növényekhez, amelyekben RlP-fehéijéket találtak, tartozik például az árpa is. A Carlsberg Rés. Commun. 51, 121 (1986) irodalmi helyen ismertetik a tisztított fehérjét, molekulatömegét és aminosavszekvenciáját.

Ismert az is [lásd például: Biochimica et Biophysica Acta 880,161 (1986)], hogy a RIP-fehérjék in vitro körülmények között képesek kórokozók gátlására.

Különösen árpanövények vizsgálata során azonosítottuk azokat a géneket, amelyek a fehérjeszintézist gátló anyagokat (PSI-anyagok) kódolják. Azt találtuk, hogy ezek a PSI-gének olyan PSI-fehérjéket kódolnak, amelyek növényi kórokozók fehérjeszintézisét hatékonyan képesek meggátolni.

Azt találtuk továbbá, hogy az árpanövényekből izolált PSI-gének a legkülönbözőbb aktív promotorokkal, például a wunl-promotorral [amelyet közelebbről leírnak a „The Plánt Cell 1” 151 (1989) irodalmi helyen] fuzionálhatok, az ilyen promotor-gén fúziós termékek növények öröklési állományába beépíthetők, és transzgén növények hozhatók létre, amelyek újonnan szerzett patogénrezisztenciát mutatnak.

Továbbá úgy találtuk, hogy a PSI-fehéije olyan gyógyászati készítmények előállítására is alkalmazható, amelyek gombás, baktériumos, vírusos vagy más kórokozók által megtámadott emberek és állatok kezelésére bevethetők.

A PSI-génnek bakteriális haltermelőkbe való bevezetése (beépítése) útján a PSI-fehérje nagy mennyiségben állítható elő. A tisztított PSI-fehérje infúziós oldatok alakjában juttatható az ember vagy állat vérpályáiba. A PSI-fehérje a patogén (például AIDS) vírusokat a szervezet károsítása nélkül gátolja. A PSI-fehéije patogénnel szemben mutatott specificitása (patogénspecificitása) adott esetben még tovább fokozható úgy, hogy a PSI-fehéijét patogénspecifikus antitestekkel kapcsoljuk.

PSI-fehérje alkalmazásával elfajult sejtek (rák) kezelése is lehetséges mind embereken, mind állatokon, így a tisztított PSI-fehéije vagy az antitesttel kapcsolt olyan fehérje, amely az elfajult sejteket specifikusan felismeri, bevezethető a vérpályába az elfajult sejtek elpusztítása céljából. Más gyógyszerformák, például kapszulák kialakítása is lehetséges.

Alkalmas infúziós oldatokat ugyanolyan módszerek segítségével állíthatunk elő, mint amelyek vizes infúziós oldatok előállítására szokásosak és ismertek.

Mindezek alapján a találmány tárgya eljárás gombákkal szemben ellenálló növények előállítására, amint ezt az igénypontokban ismertetjük; és eljárás új DNSátvivő vektorok és DNS-expressziós vektorok előállítására.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fehéijeszintézist gátló génnek bakteriális haltermelőbe beépítése útján kapott, fehérjeszintézist gátló fehérje alkalmazásával gyógyászati készítmények előállítására gombákkal szemben mutatott ellenállás kifejlesztésére, és/vagy gombás fertőzések leküzdésére és/vagy elfajult sejtek támadásának leküzdésére.

Tipikus növényi patogének - amelyek fehéijeszintézise a PSI-gén beépítésével gátolható - például a Trichoderma reesei és Fusarium sporotrichoioides nevű gombák. [Utalunk itt M. Klinkowski és munkatársai összefoglaló munkájára: „Phytopathologie und Pflanzenschutz” („Növénypatológia és növényvédelem”)

I. +11. köt. Akademie-Verlag, Berlin (1974)].

Ismeretes, hogy a Fusarium fajhoz tartozó gombák főként a gabonafajtákat és a kukoricanövényeket támadják meg; míg a Trichoderma fajhoz tartozó gombák főként kukoricamagvakon találhatók.

Meglepő módon kitűnt, hogy például árpanövényekből izolált PSI-gének patogéngátló sajátságai fajidegen növényekre is átvihetők. így például azt találtuk, hogy egy árpából izolált PSI-gén valamilyen aktív promotor - például a wunl -promotor - kontrollja mellett dohánynövények öröklési állományába építhető. Azok a dohánynövények, amelyek ezt követően a PSI-fehérjét termelik, újonnan szerzett rezisztenciasajátságokat mutatnak például a Rhizoctonia solani növényi patogénnel szemben. A Rhizoctonia idézi elő az úgynevezett gyökérölő betegséget (a kórokozó a növény szárát és gyökerét támadja meg) különböző növényeken, például burgonyán és dohányon. Ennek alapján a növényekben az újonnan szerzett rezisztenciasajátságok közvetlen korrelációban állnak a PSI-gének kifejezésével (expressziójával).

Fehérjeszintézist gátló gének az árpán kívül például valamennyi egyszikű és kétszikű növényből izolálhatok, és különböző aktív promotorokkal - például patogénekkel indukálható promotorokkal, konstitutív promotorokkal, fejlődésspecifikus promotorokkal, szervspeci2

HU 217 421 Β fikus promotorokkal, valamint indukálható promotorokkal - fuzionálhatok.

Példaként olyan növényekre, amelyek öröklési állományába az új, fehérjeszintézist gátló gének egy aktív promotor kontrollja mellett beépíthetők, megnevezzük az alábbiakat:

- valamennyi egyszikű haszonnövény, így például a gabonanövények;

- valamennyi kétszikű haszonnövény, például a Solanacea és Cucurbitacea fajok.

Ennek alapján a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas patogénrezisztens növények termelésére. A fehéijeszintézist gátló gén kifejezése útján azonban emberen és állatokon is elérhető a rezisztencia kialakítása rovarokkal, gombákkal, baktériumokkal, vírusokkal és viroidokkal szemben.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint egy fehéijeszintézist gátló olyan gént alkalmazunk, amelynek DNS-szekvenciáját a 3A. ábra mutatja. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány feladatának megoldására e DNS-szekvencián kívül hasonló DNS-szekvenciák - például a 3B. ábrában bemutatott DNS-szekvencia - is alkalmazhatók, amelyek az 5’-tartományban egy megfelelő cDNS-klónnal vannak kiegészítve.

A találmányt az alábbiakban példaként egy PSI-gén árpából történő izolálásával, e gén aktív promotorral végbemenő fúziójával és a fúziós terméknek a dohánynövények öröklési állományába való beépítésével közelebbről illusztráljuk. Ezek a példák a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

Az ábrák célja a találmány közelebbi megvilágítása. Részletesebben az ábrák a következőket mutatják:

1. ábra:

Árpából származó CHI-, BGL- és PSI-fehérjék tisztítása

Az ábrában bemutatjuk olyan fehéijefrakciók SDSgélen végzett elektroforetikus felbontását, amelyek árpamagvakból származó CHI-fehéqe (2-5. sor), PSI-fehéije (7-11. sor) és BGL-fehéqe (13-17. sor) tisztítása során keletkeztek. Specifikus antitestek segítségével kimutathatók a megfelelő fehérjék. A jelölések magyarázata a következő:

% (NH₄)₂SO₄:	fehérjék, amelyeket sóval csaptunk ki;
% sup.:	fehérjék, amelyek sóval nem csapódtak ki;
CM:	fehérjék, amelyek CM-oszlopon nem kötődtek meg;
fra.:	a CM-oszlopból származó fehéijefrakció;
pur.:	igen tiszta fehérje;
MW:	a fehérje nagyságának mértéke (molekulatömege) kilodaltonban kifejezve.

2. ábra:

Gombanövekedési teszt végrehajtása tisztított fehérjével

Trichoderma reesei spóráit (A) és Fusarium sporotrichoioides spóráit (B) üregenként 135 pl közeg össztérfogatban mikrotitráló lemezre vittük, és az adott fehéije 0,05—1,5 μg mennyiségével összekevertük. Minden egyes pont öt, egymástól független mérés eredménye, amelyek során a standard viszonylagos szórása az (A) esetében 3,6%, a (B) esetében 7,3%. A 100%-os gombanövekedés az (A) esetében 0,40 optikai sűrűséget ad (540 nm-en), míg (B) esetében ez az érték 0,41.

3. ábra:

Az izolált PSI-cDNS-klónok nukleotidszekvenciája

A) A cDNS-klón mérete 1078 nukleotid. Ez a klón tartalmaz: egy 42 bp (bázispár) méretű 5’-nemtranszlatált tartományt; egy nyitott, 843 bp méretű leolvasókeretet (a stopkodont * jelzi); valamint egy 193 bp méretű 3’-nemtranszlatált végződést. A lehetséges poliadenilező szignálokat aláhúztuk. A nyitott leolvasókeretből adódó aminosavszekvenciát a megfelelő szekvencia alatt megadtuk.

B) Egy nem teljes PSI-cDNS-klón nukleotidszekvenciája; a lehetséges poliadenilező szignálokat aláhúztuk.

4. ábra:

PSI-gének szerveződése az árpa genomjában

Árpaembriókból származó DNS-t különböző restrikciós enzimekkel hasítottunk, a kapott terméket gélelektroforézissel elválasztottuk, nejlonmembránokon vezettük át, és radioaktívan jelzett PSI-cDNS-val hibridizáltuk. A hibridizálósávok száma alapján következtetés vonható a PSI-másolatok számára a genomban. A nagyságmértéket kilobázispárban (kb) adtuk meg.

5. ábra:

PSI-RNS fejlődés- és szervspecifikus kifejezése árpában

Árpanövény különböző szerveiből, valamint árpamagvak különböző fejlődési stádiumaiban RNS-t izoláltunk. Az RNS-t gélelektroforetikus felvitel után a „Northern biot” módszer alkalmazásával radioaktívan jelzett PSI-cDNS-val hibridizáltuk. A PSI-RNS, mint 1,3 kb méretű RNS, specifikusan a keményítőtartalmú endospermiumban a mag fejlődésének késői stádiumában kimutatható. A DPS a teljes virágzás után több nappal mutatható ki.

6. ábra:

A wunl-PSI kiméra gén konstrukciós vázlata a pPR69-ben

A wunl-promotort („Pwunl”; mérete körülbelül 1200 bp) transzkripció útján fúzionáltuk a PSI-génnek („PSI”; mérete körülbelül 1070 bp). RNS-stabilitási okok alapján a PSI-gén 3’-végződését a CAT-gén egy maradékával („x”; mérete körülbelül 500 bp), valamint egy poliadenilező szignállal („pA”; 200 bp méretű) fúzionáltuk. Ezt a konstruktumot a pPR69 biner vektorba klónoztuk.

7. ábra:

Wunl-PSI-transzgén dohánynövények „Southern biot” elemzése

Abból a célból, hogy analizálni tudjuk a wunl-PSIDNS helyes integrálódását (beépülését) a dohánynövény genomjába, wunl-PSI-transzgén dohánynövényekből DNS-t izoláltunk, és EcoRI enzimmel hasítottuk. Gélelektroforézissel végzett felbontás, valamint a DNS-nejlonmembránokra történő átvitele után a DNS-t radioaktívan jelzett PSI-cDNS-val hibridizáltuk. A (+)

HU 217 421 Β jellel megjelölt növények a wunl-PSI-DNS helyes beépülését jelentik. A hibridizálósávok mérete 1,07 kb, és ez azonos a kontrollként felvitt wunl-PSI plazmidDNS-val a pPR69-ben (K). A (-) jellel jelölt növényeket a kiegészítő vagy nem helyes méretű DNS-sávok alapján elvetettük.

8. ábra:

Wunl-PSI-transzgén dohánynövények „Northerm biot” elemzése

Rhizoctonia solanival fertőzött dohánynövényből származó 100 pg levél-RNS-t gélelektroforézissel felbontottunk, nejlonmembránokra vittük át, és radioaktív PSI-cDNS-val hibridizáltuk. Az autoradiográfia segítségével wunl-PSI-transzgén dohánynövények esetében (”PSI-7; PSI-18) felismerhető egy PSI-RNS-sáv. A nemtranszformált dohánynövények esetében (K) PSI-RNS nem mutatható ki.

9. ábra:

Rhizoctonia solanival fertőzött dohánynövényegyedek növekedési aránya

Minden egyes ábrázolt oszlop egyetlen dohánynövény növekedését jelzi körülbelül 10 napos időszakban. A növekedési görbe görbületéből kiszámítottuk az In χ 100 értéket, s így a kapott érték a növekedés mértékét jelenti, „inf. SRI”: nemtranszformált dohánynövény, amelyet Rhizoctonia solani-val fertőztünk, „inf. RIP”: wunl-PSI-transzgén dohánynövény, amelyet Rhizoctonia solanival fertőztünk, „uninf. SRI”: nemtranszformált dohánynövény, amelyet nem fertőztünk.

10. ábra:

Rhizoctonia solanival fertőzött dohánynövények átlagos növekedési aránya

Azoknak az átlagos növekedési arányoknak az ábrázolása, amelyeket a 9. ábrában feltüntetett egyedi értékekből számítottunk ki.

11. ábra:

Rhizoctonia solanival fertőzött dohánynövények átlagos számövekedése

Az ábrában látható tíz, egymástól független wunlPSI-transzgén dohánynövény („PSI”) és tíz nemtranszformált dohánynövény („SRI”) átlagos viselkedése a növekedés során Rhizoctonia solanival végzett fertőzés után. Az abszcisszán tüntettük fel a szár hosszát (a vegetációs pontig), az ordinátán látható a fertőzés után eltelt napok száma.

12. ábra:

A lektin-RIP fúziós proteint kódoló DNS szekvenciája

13. ábra:

pGJl 12 plazmid géntérképe

14. ábra:

Egymástól független 35S-spLektin-RIP transzgén dohánynövénysejt-vonalak Westem-blot analízise

l. példa

A) Az alkalmazott anyagok

Közegek

Baktériumok tenyésztéséhez a T. Maniatis és munkatársai munkájában közelebbről leírt közegeket alkalmaztuk [„Molecular cloning: a laboratory manual” („Molekuláris klónozás; laboratóriumi kézikönyv”) Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York (1982)].

Növényi közegek

A T. Murashige és munkatársai munkájában megadott közegeket (MS) alkalmaztuk [,,A rapid method fór rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures” („Gyors módszer dohánynövény szövettenyészeteinek gyors szaporítására és biológiai mérésekre történő felhasználására”) Physiol. Plánt. 15, 473 (1962)].

3MS:	MS+3% szacharóz
3MSC:	MS+3% szacharóz, 500 pg/ml klaforán
3MC15:	MS+2% szacharóz, 500 pg/ml klaforán+100 pg/ml kanamicin-szulfát
MSC15:	MS+3% szacharóz (kalluszképző közeghez) vagy 1 % szacharóz (hajtásképző közeghez)

+vitaminok: 2 mg/1 glicin

0,5 mg/1 nikotinsav 0,5 mg/1 piridoxin-HCl 100 mg/1 mioinozit 0,4 mg/1 tiamin +antibiotikumok: 100 mg/1 kanamicin 500 mg/1 klaforán

MSC16:MS+0,5 pg/ml BAP+0,1 pg/mlNAA + 100 pg/ml kanamicin-szulfát + 500 pg/ml klaforán.

Szilárd közeg előállítására a fenti összetételt 8 g/1

Bacto-agarral egészítettük ki.

Törzsek és vektorok

E. coli-törzsek: BMH 71-18: delta(lac-proAB), thi, supE;

F’(laciq, ZdeltaM15, proA⁺B⁺)

Utalunk a következő közleményre: J. Messing és munkatársai: „Plánt Gene Structure” („Növényi gének szerkezete”) a következő helyen: F. Kosuge és munkatársai (szerkesztők): „Genetic engineering of plants” („Génsebészet növényeken”) Plenum Press, New York: 211-227. old. (1983).

Agrobaktérium-törzsek:LBA 4404 [Hoekema és munkatársai, Natúré 303,179 (1983)]

Plazmidok: pUC8 (Vieira és Messing a következő helyen: „The puc plasmid, an M13mp7derived system fór insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.” CA- puc-plazmid, egy M13mp7ből származó rendszer beépítő mutagenezis céljára, és szekvenciálása szintetikus univerzális primerekkel”), Gene 19, 259 (1982)].

pPR69 [a bin 19 származéka, lásd: M. Bevan: „Binary Agrobacterium vectors fór plánt transformation” („Növénytranszformáció céljára alkalmazható binér agrobaktérium-vektorok”), Nucl. Acids, Rés. 12, 8711 (1984)].

Növények: Hordenum vulgare L. cv. Piggy Nicotiana tabacum SRI

HU 217 421 Β

B) Az alkalmazott módszerek A molekuláris biológiai standard módszereket - így például a restrikciós elemzést, plazmidok izolálását, plazmid-DNS miniméretű előállítását, valamint baktériumok transzformálását - ha erre vonatkozóan más megjegyzést nem teszünk Maniatis és munkatársai fentebb idézett munkája szerint (1982) végeztük.

Növényanyag

Érett árpamagvakat (Hordeum vulgare L. cv. Piggy) a teljes virágzást követő különböző időpontokban benyűjtöttünk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és -80 °C-on tároltuk.

PSI-, CHI- és BGL-fehéije izolálása és tisztítása

A PSI- és CHI-fehéije kg érett árpamagot finom lisztté őröltünk (részecskeátmérő 0,5 mm-nél kisebb), hozzáadunk 100 liter extrakciópuffert (50 mM foszfátpuffer, pH 6,5; 100 mM NaCl; 2,5 mM aszkorbinsav; 2,5 mM EDTA; 3 mM béta-merkapto-etanol), az elegyet 2 órán át 4 °C hőmérsékleten kevertük, majd a felülúszót szűrtük. Erre a célra egy ultracentrifuga segítségével a felülúszó térfogatát 6 literre betöményítettük [szűrő: DDS-membrán (ultraszűrő-membránok, amelyek poliszulfonból készülnek), amely minden 20 kilodaltonnál kisebb molekulatömegű fehérjét visszatart]. Ezt követően a felülúszót 40-70%-os ammónium-szulfát-oldattal kicsaptuk. Az így kapott pelletet 80 mM PMSF-ben oldottuk, és 2 mM nátrium-szulfát-pufferral szemben (pH 6,5) - amelyhez 80 mM PMSF-t adtunk - dializáltuk. Ezután a fehérjeoldatot ioncserélő kromatográfiának vetettük alá CM52 oszlopon (beszerezhető a Whatman cégtől), és eluálószerként 50 mM nátrium-foszfátot alkalmaztunk, amely fokozatosan 0,05 M nátrium-kloridtól 1,0 M-ig emelkedő koncentrációban nátrium-kloridot tartalmazott. Az eluálást több mint 10 lépésben végeztük.

A BGL-fehérje

Árpamagvakat 12 napon át csíráztattunk, liofilizáltuk, és a fentebb megadott extrakciós pufferrel eldolgoztuk (1,6 kg magtömeghez 25 liter extrakciós pufferoldatot alkalmaztunk). 40%-os ammónium-szulfáttal végzett kicsapás után a felülúszót dializáltuk, és CM52, majd Mono-S oszlopon tisztítottuk. Az izolált BGL-fehérje egységességét Westem-blot-elemzéssel és N-terminális szekvenciálással vizsgáltuk.

PSI-antitestek előállítása

Az antitesteket tisztított PSI-II fehérje ellen nyulakban létesítettük hagyományos módszerek alkalmazásával, például az alábbi módon.

1. 400 pg PSI-hez 25 mmol/1 poszfátpufferben (pH 7) azonos térfogatú Freund-féle adjuvánst adunk, és az elegyet szubkután módon injektáljuk a nyulak hátába több helyen.

2. Az első injekció után 14 nappal megerősítő injekciót adunk az 1. pont szerinti készítménnyel.

3. További 10-14 nap után levesszük az első vérmintát (10-20 ml).

4. Az első vérminta levétele után 4 héttel második megerősítő injekciót adunk.

5. A második megerősítő injekció után 10-14 nappal ismét vérmintát veszünk.

6. Kívánt esetben a 4. és 5. lépést még néhányszor megismételjük.

7. Szérum előállítása: a vért levétel után először 45 percen keresztül 37 °C-on, majd 18 órán keresztül 4 °Con inkubáljuk. Végül az oldhatatlan anyagot centrifugálással (4 °C, 10 000 g, 10 perc) elválasztjuk, és az így kapott antiszérumot felhasználásig -20 °C-on tároljuk.

A gombanövekedési teszt végrehajtása tisztított fehérjével

Trichoderma reeseit és Furasium sporotrichioidest (ATCC-gyűjtemény, Rockville) 25 °C hőmérsékleten burgonya-dextróz-agarra (beszerezhető a Difco cégtől) vittünk. Nyolcnapos tenyésztésből származó spórákat Broekaert és munkatársai módszerével [,,An automated quantitative assay fór fungal growth inhibition” („A gombanövekedés gátlásának automatizált, kvantitatív mérése”), FEMS Microbiology Letters (1990)] begyűjtöttünk, és -20 °C hőmérsékleten 20%-os glicerinoldatban tároltuk. A gombanövekedési teszt keretében egy spóraszuszpenziót (10 000 spóra/ml) 100 μΐ burgonya-dextróz-oldattal, valamint 35 μΐ vizsgálandó fehérjefrakcióval elegyítettünk, és 25 °C-on inkubáltuk. Broekaert és munkatársai közlése szerint a gomba növekedése 540 nm hullámhosszon mérve lineárisan arányos az optikai sűrűség növekedésével. Ennek alapján a gombanövekedést gátló hatású fehérjefrakciók jelenlétében az optikai sűrűség kisebb meredekséggel növekedik, mint a hatástalan fehérjefrakciók jelenlétében.

A PSI-cDNS kiónok izolálása árpából

Érett árpamagvakból (Hordeum vulgare L cv. Piggy) poliA+-RNS-t izoláltunk, és lambda-gt-11 fágokban cDNS-expressziós bankot létesítettünk. Itt utalunk R. Leah és J. Mundy közleményére: „The biofunctional α-amylase/subtilisin inhibitor of barley: nucleotide sequence and pattems of seed-specific expression” („Az árpa biofunkcionális α-amiláz/szubtilizingátlója: a magspecifikus kifejezés nukleotidszekvenciája és lefutása”), Plánt Mól. Bioi. 12, 673 (1989). Monospecifikus PSI-antitestek segítségével [lásd G. Mundy és munkatársai: „Differential synthesis in vitro of barley aleurone and starchy endosperm proteins” („Az árpa-aleuron és keményítő-endospermium-fehérjék differenciális szintézise in vitro körülmények között”), Plánt Physiol. 81, 630 (1986)] azonosítottuk a PSI-t tartalmazó cDNS-klónokat.

A PSI-nukleotid szekvenciájának elemzése A PSI-pozitív lambda-gtll-fágokat elkülönítettük, szubklónoztuk, és Sanger és munkatársai didezoxi-szekvenciálási módszerével szekvenciáltuk [„DNA sequencing with chain-terminating inhibitors” („DNS-szekvenciálása lánczáró gátlókkal”) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)].

A DNS átvitele agrobaktériumokba Transzformáció

Az E. coli-ban klónozott DNS-t Van Haute és munkatársai munkájában leírt módszerrel [„Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322; a növel strategy fór reversed genetics of Ti-plasmids of Agrobacterium tumefaciens”

HU 217 421 Β („pBR322-ben klónozott restrikciós fragmentumok génközti átvitele és kicserélődéses rekombinációja: új stratégia az Agrobacterium tumefaciens Ti-plamidjainak reverz genetikájára”), EMBO J. 2, 411 (1983)] konjugációval vittük át A. tumefaciens LBA4404-be (lásd Hoekema és munkatársai: „A binary plánt vector strategy based on separation of vir- and T-region of Atumefaciens” („Az A. tumefaciens T-tartományának és vir-tartományának elválasztására alapozott bíner növényi vektor stratégia”), Natúré 303, 179 (1983)].

Az Agrobakterium LBA4404 törzset YEB közegben (összetétele: 0,5% húskivonat, 0,2% élesztőkivonat, 0,5% pepton, 0,5% szacharóz és 2 mmol/1 magnézium-szulfát) 28 °C-on 100 pg/ml rifampicin antibiotikumszelekció mellett egy éjszakán keresztül tenyésztettük. A kapott tenyészetből 4 ml-t 96 ml friss tápközeggel (YEB+rifampicin) összekevertünk, és az elegyet 28 °C-on 3-4 órán keresztül tovább inkubáltuk. A baktériumsejteket centrifugálással (10 perc, 5000 fordulat/perc, 4 °C) összegyűjtöttük, 1 ml azonos közegben felvettük, és végül jégen tartottuk. A plazmidDNS-sel történő transzformálás céljából a fenti baktériumszuszpenzióból 200 μΐ-t bemértünk egy Eppendorf-edénybe, hozzákevertünk 1-2 pg plazmid-DNS-t, és a keveréket cseppfolyós nitrogénben gyorsan lefagyasztottuk. 1 perc elteltével az edényt a nitrogénfurdőből kiemeljük, és azonnal 37 °C-on 5 percen keresztül inkubáltuk. Végül hozzáadtunk 1 ml fent említett közeget, és az elegyet 28 °C-on 2 órán keresztül tovább inkubáltuk. Végül a baktériumszuszpenziót szelektív agarlemezre (YBB + 100 pg/ml rifampicin+50 pg/ml kanamicin) kioltottuk.

A DNS elemzése

A DNS-nek Agrobacteriumba történt átvitelét úgy ellenőriztük, hogy agrobaktériumok DNS-ét lúgos lízissel Ebért és munkatársai módszerével izoláltuk [„Identification of an essential upstream element in the nopalin synthase promoter by stable and transient assays” („Esszenciális elem azonosítása a nopalinszintáz-promotorban stabilis és átmeneti mérések útján”), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 5745 (1987)].

A DNS-t restrikciós enzimmel hasítottuk. A wunlpromotor és PSI-gén kombinációjára a HindlII és EcoRI restrikciós enzimek alkalmazásával jellegzetes sávmintát kaptunk.

A PSI-specifikus szonda előllítására az összegyűjtött PSI-cDNS-t EcoRI fragmensként izoláltuk, és végül ³²P-a-dCTP-vel radioaktívan jeleztük véletlenszerű indítás (randomprime) módszer alkalmazásával.

A hibridizációs kísérleteket szintén ismert eljárásokkal hajtottuk végre (lásd Maniatis és munkatársai): a DNS-fragmenseket agarózgél-elektroforézissel választottuk szét, majd denaturálást (denaturálópuffer összetétele : 0,5 mol/1 NaOH, 1,5 mol/1 NaCl) és semlegesítést (semlegesítőpuffer összetétele: 1 mol/1 Tris-HCl (pH 8), 1,5 mol/1 NaCl) végeztünk (mindkettőt 30 percen keresztül szobahőmérsékleten), végül nitrocellulóz szűrőre vittük át kapilláris blottal (Southern biot), átvivőpufferként lOxSSC-t alkalmaztunk. A hibridizálóoldat összetétele: 0,2% poli(vinil-pirrolidon), 0,2% Ficoll,

0,2% marha szérumalbumin, 0,1 SDS, 50% formamid, 100 pg/ml lazacsperma-DNS, 12 χ SSPE és radioaktívan jelzett szonda. A hibridizálást 42 °C-on 18 órán keresztül végeztük. A szűrőt 68 °C-on háromszor 30 percen keresztül mostuk 1 xSSC-vel. Ezután végeztük az autoradiográfiás meghatározást.

A DNS restrikciós hasítása, a nitrocellulózra történt átvitel és hibridizálás a megfelelő radioaktív szondával igazolták, hogy a DNS Agrobacteriumba történt átvitele eredményes volt.

Dohánynövények transzformálása agrobaktériumokkal Agrobaktériumok tenyésztése A fertőzéshez szükséges LBA4404 agrobaktériumokat szelektív antibiotikum közegben növesztettük [lásd Zambrisky és munkatársai: „Ti-Plasmid vector fór the introduction of DNA intő plánt cells without alteration of their normál capacity” („Ti-plazmid vektor DNS bevezetése céljára növényi sejtekbe normális kapacitásuk módosítása nélkül”), EMBO J. 1, 147 (1983)], centrifugálással ülepítettük, és YEB közegben antibiotikumok nélkül mostuk. (A YEB közeg összetétele: 0,5% húskivonat; 0,2% élesztőkivonat; 0,5% pepton; 0,5% szacharóz; 2 mM MgSO₄). Ismételt ülepítés után 3MS közegben felvéve alkalmaztuk a baktériumokat a fertőzésre.

A levéllemezek fertőzése

A levéllemez-fertőzésre az SRI dohánynövénytörzs steril leveleit alkalmaztuk. Körülbelül 1 cm méretű levéldarabokat bemártottunk a fentiekben leírt agrobaktérium-szuszpenzióba, majd 3MS közegbe vittük át. Az elegyet 2 napig 16 órás megvilágítási periódussal 25-27 °C hőmérsékleten inkubáltuk, majd a levéldarabokat MSC16 közegbe vittük át. A 4-6 hét múlva megjelenő hajtásokat lemetszettük, és MSC15 közegbe helyeztük át. A gyökereket képző hajtásokat tovább elemeztük.

A növények DNS-elemzése

A növényanyagot folyékony nitrogén alatt porítottuk, tízszeres térfogatú extrakciós pufferrel [10 mM Tris-HCl (pH=8); 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, proteináz K; hasnyálmirigy-RNáz] elegyítettük és inkubáltuk, majd fenollal extraháltuk, és a felülúszót etanollal kicsaptuk. Az izolált DNS restrikciós hasítását, a DNS gélelektroforetikus felbontását agarózon, majd a DNS átvitelét nejlonmembránra Maniatis és munkatársai módszerével (1982) végeztük. A radioaktívan jelzett DNSpróbákkal végbemenő hibridizálást Logemann és munkatársai eljárásával vittük véghez [„Improved method fór the isolation of RNS írom plánt tissues” („Javított módszer RNS izolálására növényi szövetekből”), Anal. Biochem. 163, 16(1987)].

Növények RNS-elemzése

Árpanövények

Az összes RNS, valamint a poliA⁺RNS izolálását Leah és munkatársai módszerével [Plánt. Mól. Bioi. 12, 673 (1989)] végeztük. A gélelektroforetikus felbontást formaldehid gélekkel végeztük; a nejlonmembránra történő átvitelt és a radioaktívan jelzett DNS-szondákkal végbemenő hibridizálást Maniatis és munkatársai eljárásával (1982) hajtottuk végre.

HU 217 421 Β

Transzgén dohány- és burgonyanövények

Az összes RNS-t különböző szervekből izoláltuk, nejlonmembránokra vittük át, és radioaktívan jelzett DNS-szondákkal hibridizáltuk Logeman és munkatársai módszerével [Anal. Biochem. 163, 16 (1987)].

Közelebbről, az összes RNS izolálására a levélanyagot Z6 pufferben (összetétele: 8 mold guanidínium-klorid, 20 mmol/1 MES, 20 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 βmerkapto-etanol) homogenizáltuk, és az oldható felülúszót 1 térfogat PCI-vel (fenol/kloroform/izoamil-alkohol=24/23/l) extraháltuk. A vizes fázist egy másik lombikba átvittük, és az RNS szelektív kicsapására 0,05 térfogat 1 mol/1 ecetsav és 0,7 térfogat etanol hozzáadása után egy éjszakán keresztül -20 °C-on inkubáltuk. A csapadékot centrifugálással elválasztottuk, két egymást követő lépésben 3 mol/1 nátrium-acetáttal és 70%os etanollal mostuk, végül vízben oldottuk. Az RNS-t elektroforézissel választottuk szét agarózgélen, denaturáló körülmények között (2% agaróz, 16% formaldehid). Futtatópuffer: 1 xMEN (pH = 7), 20 mmol/1 MOPS, 5 mmol/1 nátrium-acetát, 1 mmol/1 EDTA. A membránra történő átvitelt és a hibridizálást a DNS-analízissel kapcsolatban ismertetett módon végeztük.

Transzgén növények fehérjeelemzése

Liofilizált levélanyagot extrakciós pufferban (10 mM Tris pH=8,0; 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% SDS) őröltünk, és a fehéije koncentrációját 1 mg/ml-re állítottuk be. A gélelektroforetikus fehéijeelválasztást a Phastgélrendszerrel végeztük (a Pharmacia cég terméke), ennek során lemezenként 1 pg fehéijét vittünk be. Az elválasztott fehéqéket nitrocellulózra vittük át (a diffúziós biotokat úgy alakítottuk ki, hogy a nitrocellulózt 20 percig 70 °C hőmérsékleten a fehéijegélre helyeztük), és specifikus antitestek alkalmazásával elemeztük (Westem-blot-elemzés a Promega cég Proto-Blot-rendszerével).

Transzgén növények fertőzése Rhizoctonia solanival

A Rhizoctonia solani gombát folyékony közegben (a Difco cég burgonya-dextróz-agarkészítménye) 28 °C hőmérsékleten 5-6 napig tenyésztettük, majd begyűjtöttük. A közeget Büchner-tölcsér és szívóflaska segítségével leszívattuk, és a szűrőn maradó gombamicéliumot skalpellummal a lehető legkisebb darabokra osztottuk. A kívánt mennyiségű gombamicéliumot bemértük, és 5 liter steril egységtalajjal (szabványtalajjal) alaposan elkevertük. Az így kapott földet csészébe helyeztük, és a vizsgálandó növényeket beültettük. A növények növekedését 24 óránként a hajtáshossz (a talaj és a vegetációs pont távolsága) meghatározása útján mértük.

Eredmények

Árpamagvakból származó PSI-, CHI- és BGL-fehéijék izolálása és tisztítása

A CHI- és PSI-fehérje izolálását érett árpamagvakból (Hordeum vulgare L. cv. Piggy) a „Módszerek” című részben írtuk le. A különböző tisztítási lépések során keletkezett fehérjeffakciókat denaturáló akrilamidgélre vittük fel, és ezüsttel jelzett CHI-, illetve PSI-antitestek segítségével mutattuk ki a CHI-, illetve PSI-fehéijéket (1. ábra). A CHI-, illetve PSI-fehéqe 40%-os, illetve

70%-os ammónium-szulfáttal végzett kicsapás után (2., 7. sor), ezt követő Whatman CM52-n végzett felbontás után (3., 4., 8. sorok), majd mono-S-oszlopon végzett tisztítás után (5., 9., 10., 11. sorok) kimutatható. Az

1. ábra 9., 10., 11. sorai azt mutatják, hogy három különböző PSI-izoformát (PSI I, II, III) izoláltunk, amelyek átfutási sebessége a CM52 oszlopon különböző.

A tisztított CHI-fehéije specifikus aktivitását Molano és munkatársai módszerével határoztuk meg [,,A rapid and sensitive assay fór chitinase using tritiated chitin” („Kitináz gyors és érzékeny mérése triciált kitin alkalmazásával”), Anal. Biochem. 88, 648 (1977)], ennek értéke 22 mg diacetil-kitobióz/perc/mg fehéije.

A tisztított PSI-fehérje aktivitása

3-30 pg PSI 50%-ban képes meggátolni az RNStranszlációt retikulocita-lizátumokban.

A BGL-fehérjét 12 napos árpamagoncokból kaptuk ammónium-szulfátos kicsapással, ezt követő felbontással CM52 oszlopon, majd mono-S-oszlopon tisztítottuk, és BGL-antitestekkel mutattuk ki (lásd az 1. ábra 13-17. sorait). A tisztított BGL-fehérje specifikus aktivitása 25 mg glükóz-ekvivalens/perc/mg enzim.

Gombanövekedési teszt tisztított fehérjékkel

Amint a „Módszerek” című részben leírjuk, különböző gombafajokat mikrotitráló lemezeken (lemezenként 96 rezervoár) 35 pl gomba közegben tenyésztettünk, és szaporodásukat fotometriásan követtük. Különböző fehérjék hozzáadásával elemeztük a fehéijék hatását a gombák növekedésére.

A 2A. ábrában ábrázoltuk a Trichoderma reesei gomba viselkedését a szaporodása során. Rezervoáronként 1,5 pg PSI-fehérje a gombák növekedését csak 20%-ban gátolta. Ezzel szemben a gátló hatás több mint 95%-os volt, ha mind a PSI-, mind a CHI- és BGL-fehérjéből 0,25 pg-ot kombinálva alkalmaztunk. 95%-os gátlást tudtunk elérni úgy is, hogy 1,0 pg PSI- és 1,0 pg BGL-fehérjét, illetve 1,5 pg PSI-fehérjét és 1,5 pg CHI-fehérjét kombináltan alkalmaztunk.

A gátló hatás a Fusarium sporotrichioides szaporodásának esetében is 95%-osnak adódott, ha a PSI-, CHI- és BGL-fehéijék mindegyikéből 0,25 pg mennyiséget kombinálva alkalmaztunk (2B. ábra). Ugyanilyen mértékben gátolta a gomba szaporodását 1,0 pg PSI- és 1, 0 pg CHI-fehéije kombinációja. Ha 1,5 pgPSI-, vagy CHI- vagy BGL-fehéijét önmagában alkalmaztunk, akkor a gátlás jelentősen csekélyebbnek adódott. A PSIés BGL-fehéqék kombinációja szintén csekélyebb gátló hatást fejtett ki.

A 2A. és 2B. ábrákban feltüntetett adatok azt mutatják, hogy a PSI egyedüli alkalmazása viszonylag csekély gátló hatást fejt ki az alkalmazott gombákkal szemben. Jelentős mértékben erősíti azonban a gátló hatást a kitináz-CHI-vel (2A„ B. ábra) vagy glukanázBGL-val (2A. ábra) alkotott kombináció.

PSI-cDNS-klón izolálása és szekvenciálása

A Hordeum vulgare L. cv. Piggy fajtának érett árpamagvaiból poliA⁺-RNS-t izoláltunk, cDNS-be írtuk át, és lambda-gt-11 fágokban klónoztuk (lásd az „Anyagok és módszerek” című részt). A PSI-antitestek alkalmazásával csaknem tökéletes PSI-cDNS-klónt tudtunk

HU 217 421 Β azonosítani. A PSI-cDNS-klón szekvenciálása a következő eredményekkel járt (3 A. ábra):

- a PSI-klón hossza 1087 bp;

- a GC-ben dús, nyitott olvasókeret egy 29 976 dalton molekulatömegű fehérjét kódol;

- a PSI-fehérje szignálpeptidet nem tartalmaz;

- a PSI-fehéije a metionin aminosawal kezdődik, s így összhangban van a természetes eredetű PSI-fehérje kezdetével. Várható tehát, hogy a PSI-fehérje citoszol-fehérje.

A 3B. ábrában bemutatott DNS-szekvencia nem teljes, azonban erős homológiát mutat a 3A. ábra szerinti cDNS-klónnal, és alkalmas a találmány céljául kitűzött feladat megoldására, ha a bemutatott DNS-szekvenciát az 5'-tartományban egy megfelelő cDNS-klónnal teljessé tesszük.

PSI-gének kimutatása az árpa genomjában

A PSI-cDNS-klón radioaktív szondaként való alkalmazása lehetővé teszi az árpagenom elemzését a PSI-gének szerveződésének és számának vonatkozásában. Az árpa embriójából DNS-t izoláltunk, különböző restrikciós enzimekkel hasítottuk, majd PSI-cDNS szondával hibridizáltuk. Amint a 4. ábra mutatja, főként három fragmentum hibridizált a PSI-vel; ennek alapján a haploid genom esetében három PSI-génnel kell számolnunk.

PSI-mRNS kimutatása árpamagvakban

A PSI-mRNS kifejeződését az árpanövény különböző szerveiben, valamint a mag fejlődése során a Northem-blot-elemzéssel határoztuk meg (lásd az „Anyagok és módszerek” című részt). Amint az 5. ábra mutatja, az árpa gyökerében, szárában és leveleiben, továbbá az árpamagvak aleuronrétegében PSI-mRNS nincsen. Ezzel szemben nagy mennyiségű PSI-mRNS található a magvakból származó, keményítőtartalmú endospermiumban, ha a mag késői fejlődési stádiumában van; a korai (fiatal) endospermiumban PSI-mRNS nincsen jelen.

PSI-gén fúziója a wunl-promotorral, és átvitele dohánynövényekre

Amint a 6. ábra mutatja, a PSI-cDNS-klónt a wundés patogén-indukálható wun-promotorral transzkripciós úton fuzionáltuk.

A wunl-promotort (1022 bp), valamint a wunl 5’nemtranszlatált tartomány 179 bp méretű szakaszát az EcoRI-val hasított, cDNS-bankból izolált 1,0 kb PSIcDNS-klónnal fuzionáltuk. A PSI-gén saját poliadenilező szignállal rendelkezik, amelynek szerepét kétszikű növényekben eddig csak sejteni lehetett. A PSI-gén után két kiegészítő elemet klónoztunk a PSI-mRNS stabilitásának növelésére. A PSI-gén 3’-végét egy körülbelül 500 bp hosszúságú, a CAT-gén (CAT=klóramfenikol-acetil-transzferáz) részszekvenciáját képező szakasszal fuzionáltuk. A CAT-részszekvencia 3’-végződésén a karfiol-mozaikvírus 35S-génjének poliadenilező szignálját alkalmaztuk terminációs szignálként, amelynek funkciója kétszikű növényben ismert.

A wunl-PSI kiméra gént a HindlII hasítási helyeinek útján a pPR69 biner vektorban klónoztuk, ennek jelölése tehát „wunl-PSI a pPR69-ben”. A pPR69-ben lévő wunl-PSI-t az Agrobacterium tumefaciens transzformációs rendszerrel dohánynövényekben transzformáltuk, és kanamicin-rezisztens dohánynövényeket regeneráltunk.

Wunl-PSI-gén kimutatása transzgén növényekben

A wunl-PSI helyes integrálódását a dohánynövény genomjába a Southern-blot-elemzéssel vizsgáltuk wunl-PSI-transzgén dohánynövényeken. Amint a 7. ábra mutatja, a transzgén dohánynövényből származó hibridizáló DNS-sáv mérete megfelel a beépített fragmentum méretének. Ennek alapján valószínű, hogy a wunlPSI megfelelően integrálódott (beépült) a dohánynövény genomjába.

PSI-gén kifejezésének kimutatása transzgén dohánynövényekben

Gombával fertőzött wunl-PSI-transzgén dohánylevelekből 50-50 pg összes RNS-t izoláltunk, és megvizsgáltuk bennük a PSI-mRNS jelenlétét (lásd a 8. ábrát). A nemtranszformált dohánylevelekben (K) nem mutattunk ki PSI-mRNS-t, függetlenül attól, hogy a levelek sértetlenek, sérültek vagy gombával fertőzöttek voltak. A gombával fertőzött, transzgén növények leveleiben egy PSI-vel hibridizáló RNS-sáv ismerhető fel. A PSI-fehérjék kimutatását transzgén dohány leveleiben Westem-blot-módszerrel végeztük.

Wunl-PSI transzgén dohánynövények fertőzése

Rhizoctonia solanival

Különböző, egymástól független, körülbelül 10 cm méretű wunl-PSI transzgén növényeket olyan talajba helyeztünk, amely 5 g/5 liter talajkoncentrációban Rhizoctonia solanival fertőzött volt. A növények méretének mindennapi mérése útján (eltávolításuk a növényi vegetációs pont talajából történt) a növények növekedését a következő, mintegy két héten át megállapítottuk. Kontrollnövényekként nemtranszformált olyan dohánynövényeket alkalmaztunk, amelyeket: 1. hasonlóképpen 5 g/5 liter talajkoncentrációban Rhizoctonia solanival fertőzött talajba ültettünk; vagy 2. Rhizoctonia solanit nem tartalmazó talajba ültettünk.

A 9. ábra mutatja az egyes növények növekedési viselkedését a megfelelő körülmények között. A nemtranszformált dohánynövények növekedési sebessége Rhizoctonia solanit tartalmazó talajban igen csekély. Ezzel szemben wunl-PSI-transzgén dohánynövények növekedési sebessége Rhizoctonia solanit tartalmazó talajokban lényegesen nagyobb.

A növekedés sebessége csak kissé kevesebb, mint olyan nemtranszformált dohánynövényeké, amelyeket gombamentes talajban növesztettünk.

A 10. ábra a 9. ábrában feltüntetett egyedi értékek statisztikai középértékét adja meg.

All. ábra mutatja dohánynövények átlagos növekedését a különböző körülmények között. Mintegy 10 napos időszakban a nemtranszformált dohánynövények Rhizoctonia solanit tartalmazó talajban körülbelül 1 cm-t növekszenek; wunl-PSI transzgén dohánynövények Rhizoctonia solanival fertőzött talajban 10 nap alatt 4 cm-rel növekednek. Rhizoctonia solani-mentes talajban tartott, nemtranszformált dohánynövények 10 nap alatt körülbelül 6 cm-rel növekszenek.

HU 217 421 Β

2. példa

Bakteriális túltermelőből származó PSI-fehérje izolálása és tisztítása

A PSI-fehérjék bakteriális túltermelésére alkalmas plazmid egy példája a pKK223-3 plazmid (a Pharmacia cég terméke).

Egy IPIG-vel (izopropil-p-D-tiogalaktoziddal) indukálható tac-promotor lehetővé teszi például a PSIfehérje termelését. Közvetlenül a tac-promotor mögött elhelyezkedő, különböző restrikciós helyek lehetővé teszik a PSI-génnek tac-promotorral végbemenő transzkripciós fúzióját. Egy erős riboszomális terminátor (rm) hajtja végre a transzkripció meghatározott befejezését.

A PSI-gént az EcoRI-hasítási hely segítségével 5’,3'-orientációban a pKK233-3 EcoRI-hasítási helyére klónoztuk, és JM 105-baktériumokba transzformáltuk. Ezeket a baktériumokat 100 ml LB-közegben (50 pg/ml ampicillin) 37 °C hőmérsékleten erélyes rázás közben 0,4 optikai denzitásig (550 nm) növesztettük, majd ezt követően IPIG-vel (2,5 mM végkoncentrációban) elegyítettük. Ezután 4 órán át 37 °C hőmérsékleten további inkubálást végeztünk, utána a 100 ml térfogatú baktériumtenyészetet 15 percig 2500 rpm sebességgel (Christ-centriíugán 4 °C hőmérsékleten) centrifugáltuk, és a baktériumpelletet 50 mM 8,0 pH-értékű Trisben vettük fel. A szuszpenziót ultrahanggal (ismételten 2 percen át 60%-os pulzussal) besugároztuk, míg viszkozitása jelentős mértékben csökkent.

Hasonló módon a „Módszerek” fejezetben leírt „PSI-fehérje izolálása és tisztítása” című részben közöltekhez a PSI-fehérjét ezután 40-70%-os ammóniumszulfát-oldattal kicsaptuk, és - például CM52 oszlopon végzett - ioncserélő kromatográfiával tisztítottuk.

A tisztított és sterilre szűrt fehérje alkalmas embereken és állatokon terápiásán alkalmazható infúziós oldatok előállítására.

3. példa

PSl-gén fúziós termékének bevezetése növények öröklődési anyagába

Csalán (Urtica dioica) UDA-génjéből PCR-módszerrel amplifikáltuk a csalán-lektint kódoló szekvenciát, és 271 bp NcoI/BspHI fragmensként a pGJ27-vektorba inszertáltuk, ezáltal egy szignálpeptidből, lektinből és a teljes RIP-proteinből álló fúziós proteint kódoló régiót kaptunk. A 12. ábrán látható a lektint kódoló szekvenciából és RIP-cDNS szekvenciából előállított fúziós termék szekvenciája. A 13. ábrán látható a kapott pGJl 12 plazmid térképe. Biner növénytranszformációs vektor előállítására a pGJl 12 vektorból HindlII fragmensként kivágtunk egy expressziós egységet, amely CaMV 35S promotorból, spLektinRIP-génből és egy poliadenilezési helyből állt, és ezt a biner pBIN 19 bázisvektorba beépítettük. A kapott konstruktumot (pGJl 17) végül agrobaktérium által közvetített transzformáció útján alkalmaztuk transzgén dohánynövény előállítására.

A 14. ábrán látható néhány, egymástól függetlenül előállított transzgén sejtvonal Westem-blot-analízise. A vizsgálati eredmények szerint a fúziós protein egyértelműen kimutatható a transzgén dohánynövények protein-extraktumában. Néhány további specifikus jel is megjelent azonban, amiből arra következtethetünk, hogy ez a fúziós protein nem teljesen stabil.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás

Μ A A K M A -1 1

K N V D K P 10 L F T A T F N V Q A S 20 S A D Y A T F I A 30 G I R N K L R N P A H 40 F S H N R P V L P 50 P V E P N V P P S R W 60 F H V V L K A S P 70 T s A G L T L A I R A 80 D N I Y L E G F K 90 S s D G T W W E L Τ P 100 G L I P G A T Y V 1 10 G F G G T Y R D L L G 120 D T D K L T N V A 130 L G R Q Q L A D A V T 140 A L H G R T K A D 150 K P S G P K Q Q Q A R 160 E A V T T L L L M 170 V N E A T R F Q T V S 180 G F V

HU 217 421 Β

A G L L Η P 190 K A V E K K S G K I 200 G N E M K A Q V N G W Q D L S A A L L K T D V K 2 10 220 P P P G K S P A K F A P I E K M G V R T 230 240 A V Q A A N T L G I L L F V E V P G G L 250 260 T V A K A L E L F H A S G G K *

aminosavszekvenciát tartalmazó, proteint kódoló DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a DNS-t szintetikus vagy enzimatikus úton előállítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a nyitott leolvasási keret

CTTAATAGCACATCTTGTCCGTCTTAGCTTTGCATTACATCCATGGCGGCAAAGATGGCG * M A A K M A

-1 1

AAGAACGTGGACAAGCCGCTCTTCACCGCGACGTTCAACGTCCAGGCCAGCTCCGCCGAC KNVDKPLFTATFNVQAS S AD

10 20 TACGCCACCTTCATCGCCGGCATCCGCAACAAGCTCCGCAACCCGGCGCACTTCTCCCAC

YATF IAGIRNKLRNPAHFSH 30 40

AACCGCCCCGTGCTGCCGCCGGTCGAGCCCAACGTCCCGCCGAGCAGGTGGTTCCACGTC

NRPVLPPVEPNVPPSRWFHV

50 60

GTGCTCAAGGCCTCGCCGACCAGCGCCGGGCTCACGCTGGCCATTCGGGCGGACAACATC

VLKASPTSAGLTLAIRADNI 70 80

TACCTGGAGGGCTTCAAGAGCAGCGACGGCACCTGGTGGGAGCTCACCCCGGGCCTCATC YLEGFKS SDGTWWELTPGL I

90 100

CCCGGCGCCACCTACGTCGGGTTCGGCGGCACCTACCGCGACCTCCTCGGCGACACCGAC

PGATYVGFGGTYRDLLGDTD 110 120

AAGCTGACCAACGTCGCTCTCGGCCGGCAGCAGCTGGCGGACGCGGTGACCGCCCTCCAC

KLTNVALGRQQLADAVTALH

130 140

GGGCGCACCAAGGCCGACAAGCCGTCCGGCCCGAAGCAGCAGCAGGCGAGGGAGGCGGTG

GRTKADKPSGPKQQQAREAV 150 160

ACGACGCTGCTCCTCATGGTGAACGAGGCCACGCGGTTCCAGACGGTGTCTGGGTTCGTG

TTLLLMVNEATRFQTVSGFV

170 180

GCCGGGTTGCTGCACCCCAAGGCGGTGGAGAAGAAGAGCGGGAAGATCGGCAATGAGATG

AGLLHPKAVEKKSGKIGNEM 190 200

AAGGCCCAGGTGAACGGGTGGCAGGACCTGTCCGCGGCGCTGCTGAAGACGGACGTGAAG KAQVNGWQDL SAALLKTDVK

210 220 CCTCCGCCGGGAAAGTCGCCAGCGAAGTTCGCGCCGATCGAGAAGATGGGCGTGAGGACG

PPPGKS PAKFAP I EKMGVRT 230 240

GCTGTACAGGCCGCCAACACGCTGGGGATCCTGCTGTTCGTGGAGGTGCCGGGTGGGTTG AVQAANTLG I LLFVEVPGGL

250 260

ACGGTGGCCAAGGCGCTGGAGCTGTTCCATGCGAGTGGTGGGAAATAGGTAGTTTTCCAG

TVAKALELFHASGGK*

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

HU 217 421 Β

GTATACCTGCATGGGTAGTGTAAAAGTCGAATAAACATGTCACAGAGTGACGGACTGATA 960 TAAATAAATAAATAAACGTGTCACAGAGTTACATATAAACAAATAAATAAATAATTAAAA 10 20 ATGTCCAGTTTA_{4 7} 1 078 nukleotidszekvenciáját tartalmazó DNS előállítására, 5 azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás

CTTAATAGCACATCTTGTCCGTCTTAGCTTTGCATTACATCCATGGCGGCAAAGATGGCG 6 0 AAGAACGTGGACAAGCCGCTCTTCACCGCGACGTTCAACGTCCAGGCCAGCTCCGCCGAC 12 0 TACGCCACCTTCATCGCCGGCATCCGCAACAAGCTCCGCAACCCGGCGCACTTCTCCCAC 180 AACCGCCCCGTGCTGCCGCCGGTCGAGCCCAACGTCCCGCCGAGCAGGTGGTTCCACGTC 240 GTGCTCAAGGCCTCGCCGACCAGCGCCGGGCTCACGCTGGCCATTCGGGCGGACAACATC 300 TACCTGGAGGGCTTCAAGAGCAGCGACGGCACCTGGTGGGAGCTCACCCCGGGCCTCATC 360 CCCGGCGCCACCTACGTCGGGTTCGGCGGCACCTACCGCGACCTCCTCGGCGACACCGAC 420 AAGCTGACCAACGTCGCTCTCGGCCGGCAGCAGCTGGCGGACGCGGTGACCGCCCTCCAC 480 GGGCGCACCAAGGCCGACAAGCCGTCCGGCCCGAAGCAGCAGCAGGCGAGGGAGGCGGTG 540 ACGACGCTGCTCCTCATGGTGAACGAGGCCACGCGGTTCCAGACGGTGTCTGGGTTCGTG 600 GCCGGGTTGCTGCACCCCAAGGCGGTGGAGAAGAAGAGCGGGAAGATCGGCAATGAGATG 660 AAGGCCCAGGTGAACGGGTGGCAGGACCTGTCCGCGGCGCTGCTGAAGACGGACGTGAAG 720 CCTCCGCCGGGAAAGTCGCCAGCGAAGTTCGCGCCGATCGAGAAGATGGGCGTGAGGACG 780 GCTGTACAGGCCGCCAACACGCTGGGGATCCTGCTGTTCGTGGAGGTGCCGGGTGGGTTG 840 ACGGTGGCCAAGGCGCTGGAGCTGTTCCATGCGAGTGGTGGGAAATAGGTAGTTTTCCAG 900 GTATACCTGCATGGGTAGTGTAAAAGTCGAATAAACATGTCACAGAGTGACGGACTGATA 960 TAAATAAATAAATAAACGTGTCACAGAGTTACATATAAACAAATAAATAAATAATTAAAA 1020 ATGTCCAGTTTA4 7 10 7 8 nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t egy növényekben aktív promotorral fuzionáljuk. 35
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promotorként patogénekkel indukálható promo7. Eljárás tort, konstitutív promotort, fejlődésspecifikus promotort, szervspecifikus promotort, indukálható promotort vagy wunl promotort alkalmazunk.

6. Eljárás DNS-expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított DNS-t egy vektorba építjük.

M A A -1 1

K N V D K P L F T A T F N V Q A S 10 20 Y A T F I A G I R N K L R N P A H 30 40 N R P V L P P V E P N V P P S R W 50 60 V L K A S P T s A G L T L A I R A 70 80 Y L E G F K S s D G T w W E L T P 90 100 P G A T Y V G F G G T Y R D L L G 110 120 K L T N V A L G R Q Q L A D A V T 130 140 G R T K A D K P s G P K Q Q Q A R 150 160 T T L L L M V N E A T R F Q T V S 170 180

K M A

S A D

F S H

F Η V

D N I

G L I

D T D

A L H

E A V

G F V

HU 217 421 Β

A G L L Η P 190 K A V E K K S G K I 200 K A Q V N G 210 W Q D L S A A L L K 220 P P P G K S 230 P A K F A P I E K M 240 A V Q A A N 250 T L G I L L F V E V 260 T V A K A L E L F H A S G G K

NEM

D V K

V R T

P G G L aminosavszekvenciát tartalmazó protein előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a tárgyi kör szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó proteint kódoló DNS-t tartalmazó DNS-fragmenst expresszáltatunk, és az expresszálódott proteint 15 kinyerjük, vagy

b) a tárgyi kör szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó protein aminosavszekvenciájának megfelelő aminosavakat a megfelelő sorrendben összekapcsoljuk.

8. Mezőgazdasági készítmény növénypatogének 20 szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a

7. igénypont szerinti eljárással előállított proteint és mezőgazdaságilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
9. Mezőgazdasági készítmény növények patogéninhibitor tulajdonságainak kialakítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított proteint és mezőgazdaságilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a patogén egy gomba.
11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a gomba a Trichoderma reesei, Rhizoctonia solani vagy Fusarium sporotrichoides.
12. Eljárás növénypatogén gombák szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított proteint a gombára felvisszük.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gombára árpából származó BGL-glukanázt és/vagy CHI-kitinázt is felviszünk.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felvitelt transzgén növényben történő expresszióval hajtjuk végre.
15. Eljárás patogénrezisztens növények előállítására, azzal jellemezve, hogy a növényt a 4. igénypont szerinti eljárással előállított DNS-sel vagy az abból nukleotidszubsztitúcióval nyert, árpából származó proteinszintézis-inhibitor proteint kódoló DNS-szekvenciával transzformáljuk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényt

GCGGTGACGACGCTGCTCCTCATGGTGAACGAGGCCACGCGGTTCCAGACGGTGTCGGGG 6 0

AVTTLLLMVNEATRFQTVSG

170 180

TTCGTGGCCGGGCTGCTGC'ACCCCAAGGCGGTGGAGAAGAAGAGCGGGAAGATCGGCAAT 120

FVAGLLHPKAVEKKSGK IGN 190 200

GAGATGAAGGCCCAGGTGAACGGGTGGCAGGACCTGTCCGCGGCGCTGCTGAAGACGGAC 18 0 EMKAQVNGWQDLSAALLKTD

210 220 GTGAAGCCCCCGCCGGGAAAGTCGCCAGCGAAGTTCACGCCGATCGAGAAGATGGGCGTG 240

VKP PPGKS PAKFTP I EKMGV 230 240

AGGACTGCTGAGCAGGCTGCGGCTACTTTGGGGATCCTGCTGTTCGTTGAGGTGCCGGGT 300 RTAEQAAATLG I LLFVEVPG

250 260

GGGTTGACGGTGGCCAAGGCGCTGGAGCTGTTTCATGCGAGTGGTGGGAAATAGGTAGTT 360

GLTVAKALELFHASGGK*

270 280

TTGCAGGTATACCTGCATGGGTAAATGTAAAAGTCGAATAAAAATGTCACAGAGTGACGG 420 ACTGATATAAATAAATTAATAAACATGTCATCATGAGTGACAGACTGATATAAATAAATA_{2 o} 4 9 9

DNS-szekvenciájú nyitott leolvasási kerettel transzformáljuk, amely 5’ régiójában ki van egészítve.
17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a patogén egy gomba.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gomba a Trichoderma reesei, Rhizoctonia solani vagy Fusarium sporotrichoides.
19. Eljárás patogén gombák szaporodását gátló 55 növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet a 4. igénypont szerinti eljárással előállított DNS-sel vagy az abból nukleotidszubsztitúcióval nyert és árpából származó proteinszintézisinhibitort kódoló DNS-szekvenciával transzformál60 juk.

HU 217 421 Β
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet

GCGGTGACGACGCTGCTCCTCATGGTGAACGAGGCCACGCGGTTCCAGACGGTGTCGGGG 6 0 AVTTLLLMVNEATRFQTVSG

170 180

TTCGTGGCCGGGCTGCTGCACCCCAAGGCGGTGGAGAAGAAGAGCGGGAAGATCGGCAAT 120

FVAGLLHPKAVEKKSGK I GN 190 200

GAGATGAAGGCCCAGGTGAACGGGTGGCAGGACCTGTCCGCGGCGCTGCTGAAGACGGAC 18 0 EMKAQVNGWQDL SAALLKTD

210 220 GTGAAGCCCCCGCCGGGAAAGTCGCCAGCGAAGTTCACGCCGATCGAGAAGATGGGCGTG 240

VKPPPGKSPAKFTP I EKMGV 230 240

AGGACTGCTGAGCAGGCTGCGGCTACTTTGGGGATCCTGCTGTTCGTTGAGGTGCCGGGT 300 RTAEQAAATLG I LLFVEVPG

250 260

GGGTTGACGGTGGCCAAGGCGCTGGAGCTGTTTCATGCGAGTGGTGGGAAATAGGTAGTT 360

GLTVAKALELFHASGGK*

270 280

TTGCAGGTATACCTGCATGGGTAAATGTAAAAGTCGAAIAAAAATGTCACAGAGTGACGG 420 ACTGATATAAATAAATTAATAAACATGTCATCATGAGTGACAGACTGATATAAATAAATA₂ „499

DNS-szekvenciájú nyitott leolvasási kerettel transzformáljuk, amely 5’ régiójában ki van egészítve.
21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejt egyszikű növény sejtje, gabonanövény sejtje, kukoricanövény sejtje, kétszikű növény sejtje, Solanacea sejtje vagy Cucurbitacea sejtje.
22. Mezőgazdasági készítmény növények gomba elleni rezisztenciájának kialakítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított proteinszintézis-inhibitort és mezőgazdaságilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.

25
23. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított proteint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal összekeveijük, és készítménnyé formáljuk.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez30 ve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított proteint antitesthez kötjük.
25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként patogénspecifikus, vagy emberi, vagy állati degenerált sejteket specifikusan felismerő

35 antitesteket alkalmazunk.