JPH06113856A - 耐病原性植物の生産方法 - Google Patents
耐病原性植物の生産方法Info
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- JPH06113856A JPH06113856A JP3338847A JP33884791A JPH06113856A JP H06113856 A JPH06113856 A JP H06113856A JP 3338847 A JP3338847 A JP 3338847A JP 33884791 A JP33884791 A JP 33884791A JP H06113856 A JPH06113856 A JP H06113856A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 耐病原性植物を生産することである。
【構成】 タンパク質合成阻害遺伝子、またはタンパク
質合成阻害遺伝子の融合生成物またはタンパク質合成阻
害タンパク質の細胞に特異的に付着するリガンドによる
融合生成物を植物の遺伝子型に活性プロモーターの制御
下で導入すること、およびタンパク質合成阻害遺伝子を
細菌過剰生産物に導入して得たタンパク質合成阻害タン
パク質を使用することである。
質合成阻害遺伝子の融合生成物またはタンパク質合成阻
害タンパク質の細胞に特異的に付着するリガンドによる
融合生成物を植物の遺伝子型に活性プロモーターの制御
下で導入すること、およびタンパク質合成阻害遺伝子を
細菌過剰生産物に導入して得たタンパク質合成阻害タン
パク質を使用することである。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は耐病原性植物の生産方法、この方
法により得られた植物または植物部分、新規なDNA トラ
ンスファー ベクターおよびDNA 発現ベクター、および
薬剤を調製するためのタンパク質合成阻害タンパク質の
使用方法に関する。
法により得られた植物または植物部分、新規なDNA トラ
ンスファー ベクターおよびDNA 発現ベクター、および
薬剤を調製するためのタンパク質合成阻害タンパク質の
使用方法に関する。
【０００２】
【背景技術】例えば、「Ann. Rev. Plant Physiol.」3
0：105 〜 130 (1979) および「Ann.Rev. Plant Physio
l.」35 : 34 〜 275 (1984) には、植物が病原体の感染
から防ぐのに多様な機構を利用していることについて記
載されている。これらの機構としては、例えば細胞壁構
造の変形；毒性的に作用するフィトアレキシンの合成；
いわゆる、PRタンパク質（病原−関連するタンパク質）
の蓄積；プロテアーゼインヒビター；および加水分解機
能を有する酵素を包含している。
0：105 〜 130 (1979) および「Ann.Rev. Plant Physio
l.」35 : 34 〜 275 (1984) には、植物が病原体の感染
から防ぐのに多様な機構を利用していることについて記
載されている。これらの機構としては、例えば細胞壁構
造の変形；毒性的に作用するフィトアレキシンの合成；
いわゆる、PRタンパク質（病原−関連するタンパク質）
の蓄積；プロテアーゼインヒビター；および加水分解機
能を有する酵素を包含している。
【０００３】また、例えば「Biochem. J. 」216 : 617
〜 625 (1983) には、種々の植物が真核細胞のリポソー
ムを抑制する能力を有するタンパク質を生成できること
について記載されている。タンパク質合成を抑制するか
かるタンパク質の特性としては、植物−固有リポソーム
に影響を及ぼさないが、しかし植物−異質リポソームを
不活性にすることである。このタンパク質は、特に「RI
P 」タンパク質（リポソーム−抑制タンパク質）として
知られている。これらの多くのタンパク質のうち、その
分子量および作用モードだけが知られている。
〜 625 (1983) には、種々の植物が真核細胞のリポソー
ムを抑制する能力を有するタンパク質を生成できること
について記載されている。タンパク質合成を抑制するか
かるタンパク質の特性としては、植物−固有リポソーム
に影響を及ぼさないが、しかし植物−異質リポソームを
不活性にすることである。このタンパク質は、特に「RI
P 」タンパク質（リポソーム−抑制タンパク質）として
知られている。これらの多くのタンパク質のうち、その
分子量および作用モードだけが知られている。
【０００４】植物のうち、RIP タンパク質について確め
られた植物としてはオオムギがある。「Carlsberg Res.
Commun.」Vol.51, p.129 〜 141 (1986) には、精製タ
ンパク質、その分子量およびアミノ酸配列について記載
されている。さらに、例えば「Biochemica et Biophysi
ca Acta 」880, p.161〜170 (1986)には、RIP タンパク
質が「インビトロ」病原体を抑制することについて記載
されている。
られた植物としてはオオムギがある。「Carlsberg Res.
Commun.」Vol.51, p.129 〜 141 (1986) には、精製タ
ンパク質、その分子量およびアミノ酸配列について記載
されている。さらに、例えば「Biochemica et Biophysi
ca Acta 」880, p.161〜170 (1986)には、RIP タンパク
質が「インビトロ」病原体を抑制することについて記載
されている。
【発明の開示】オオムギ植物の研究において、タンパク
質合成阻害物質(PSI) について暗号化する遺伝子を確認
した。これらのPSI 遺伝子が植物病原体のタンパク質合
成を効果的に阻止できるPSI タンパク質について暗号化
することを確めた。
質合成阻害物質(PSI) について暗号化する遺伝子を確認
した。これらのPSI 遺伝子が植物病原体のタンパク質合
成を効果的に阻止できるPSI タンパク質について暗号化
することを確めた。
【０００５】さらに、例えばオオムギ植物から分離した
PSI 遺伝子が多くの種類の活性プロモーター、例えばwu
n1−プロモーターと融合できることを確めた。このwun1
−プロモーターは「The Plant Cell 1」p.151 〜 158
(1989) に詳細に記載されており、かかる遺伝子融合は
植物の遺伝子型に移入し、新しく獲得された耐病原性を
示すトランスゲニック植物(transgenic plants) を生成
することができる。
PSI 遺伝子が多くの種類の活性プロモーター、例えばwu
n1−プロモーターと融合できることを確めた。このwun1
−プロモーターは「The Plant Cell 1」p.151 〜 158
(1989) に詳細に記載されており、かかる遺伝子融合は
植物の遺伝子型に移入し、新しく獲得された耐病原性を
示すトランスゲニック植物(transgenic plants) を生成
することができる。
【０００６】さらに、またPSI タンパク質は菌、細菌、
ウイルスまたは他の病原性剤によって感染されたヒトま
たは動物の処理に使用できる薬剤の調製に用いることが
できることを確めた。
ウイルスまたは他の病原性剤によって感染されたヒトま
たは動物の処理に使用できる薬剤の調製に用いることが
できることを確めた。
【０００７】PSI タンパク質はPSI 遺伝子を細菌過剰生
産物(bacterial overproducers) に導入することによっ
て多量に作ることができる。精製PSI タンパク質はヒト
または動物の血管に注入溶液 (infusion solutions) の
形態で導入することができる。PSI タンパク質は生体に
損傷を与えず病原体（例えばエイズ ウイルス）を抑制
する。PSI タンパク質の病原特異性はPSI タンパク質を
病原特異抗体に結合することによって、さらに高めるこ
とができる。
産物(bacterial overproducers) に導入することによっ
て多量に作ることができる。精製PSI タンパク質はヒト
または動物の血管に注入溶液 (infusion solutions) の
形態で導入することができる。PSI タンパク質は生体に
損傷を与えず病原体（例えばエイズ ウイルス）を抑制
する。PSI タンパク質の病原特異性はPSI タンパク質を
病原特異抗体に結合することによって、さらに高めるこ
とができる。
【０００８】また、ヒトまたは動物の変性細胞 (degene
rate cell)（ガン）をPSI タンパク質を用いて処理する
ことができる。それ故、特異的変性細胞を検出する抗体
と結合した精製PSI タンパク質またはPSI タンパク質を
変性細胞の破壊のために血管に導入することができる。
投与の他の形態としては、例えばカプセルにすることが
できる。適当な注入溶液は注入水溶液を作るのに普通、
知られている方法によって調製することができる。
rate cell)（ガン）をPSI タンパク質を用いて処理する
ことができる。それ故、特異的変性細胞を検出する抗体
と結合した精製PSI タンパク質またはPSI タンパク質を
変性細胞の破壊のために血管に導入することができる。
投与の他の形態としては、例えばカプセルにすることが
できる。適当な注入溶液は注入水溶液を作るのに普通、
知られている方法によって調製することができる。
【０００９】従って、本発明の目的は特許請求の範囲に
規定している耐病原植物の生産方法、新規なDNA トラン
スファー ベクターおよびDNA 発現ベクター、および本
発明の方法により得ることのできる植物および植物部分
(plant components) にある。
規定している耐病原植物の生産方法、新規なDNA トラン
スファー ベクターおよびDNA 発現ベクター、および本
発明の方法により得ることのできる植物および植物部分
(plant components) にある。
【００１０】さらに、本発明の目的は耐病原性を生ずる
薬剤の製造のために、病原感染および／または変性細胞
の撲滅のために、タンパク質合成阻害遺伝子を細菌過剰
生産物に導入して得たタンパク質合成阻害タンパク質の
使用方法にある。
薬剤の製造のために、病原感染および／または変性細胞
の撲滅のために、タンパク質合成阻害遺伝子を細菌過剰
生産物に導入して得たタンパク質合成阻害タンパク質の
使用方法にある。
【００１１】タンパク質合成をPSI 遺伝子の移入によっ
て抑制できる代表的な植物病原体としては、例えば菌ト
リコダーマ リーセイ (Trichoderma reesei) およびフ
サリウム スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrich
ioides) を示すことができる（Ｍ．クリンコウスキー，
Ｅ．ムヒレ，Ｅ．レインムスおよびＨ．ボッホワ氏「Ph
ytopathology and plant protection I + II」アカデミ
エ−ベルレグ，ベルリン (1974) 参照）。
て抑制できる代表的な植物病原体としては、例えば菌ト
リコダーマ リーセイ (Trichoderma reesei) およびフ
サリウム スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrich
ioides) を示すことができる（Ｍ．クリンコウスキー，
Ｅ．ムヒレ，Ｅ．レインムスおよびＨ．ボッホワ氏「Ph
ytopathology and plant protection I + II」アカデミ
エ−ベルレグ，ベルリン (1974) 参照）。
【００１２】知られているように、フサリウム菌は主と
して穀物およびトウモロコシ植物を侵すが、トリコダー
マ属の菌は主としてトウモロコシ粒において確められて
いる。例えばオオムギ植物から分離したPSI 遺伝子の病
原抑制特性は、また異なる種の植物に転移できることを
確めたことは、驚くべきことである。このために、活性
プロモーター、例えばwun1−プロモーターの制御下で、
オオムギから分離したPSI 遺伝子をタバコ植物の遺伝子
型に移入できることを確めた。それ故、PSI タンパク質
を生ずるタバコ植物は、例えば植物病原リゾクトニア
ソラニイ（Rhizoctonia solani) に対して新らたに獲得
した耐性を示す。リゾクトニアは、ジャガイモおよびタ
バコ植物を含む種々の植物において、いわゆる、根枯ら
し病 (root-killer disease)（茎および根障害）を生ず
る。それ故、植物における新らたに獲得した耐性はPSI
遺伝子の形質発現に直接に相関する。オオムギは別とし
て、タンパク質合成阻害遺伝子は、例えばすべての単子
葉および双子葉植物から分離することができ、多くの種
類の活性プロモーター、例えば病原誘導プロモーター、
構成プロモーター、発生特異性プロモーター、器官特異
性プロモーターおよび誘導プロモーターと融合すること
ができる。
して穀物およびトウモロコシ植物を侵すが、トリコダー
マ属の菌は主としてトウモロコシ粒において確められて
いる。例えばオオムギ植物から分離したPSI 遺伝子の病
原抑制特性は、また異なる種の植物に転移できることを
確めたことは、驚くべきことである。このために、活性
プロモーター、例えばwun1−プロモーターの制御下で、
オオムギから分離したPSI 遺伝子をタバコ植物の遺伝子
型に移入できることを確めた。それ故、PSI タンパク質
を生ずるタバコ植物は、例えば植物病原リゾクトニア
ソラニイ（Rhizoctonia solani) に対して新らたに獲得
した耐性を示す。リゾクトニアは、ジャガイモおよびタ
バコ植物を含む種々の植物において、いわゆる、根枯ら
し病 (root-killer disease)（茎および根障害）を生ず
る。それ故、植物における新らたに獲得した耐性はPSI
遺伝子の形質発現に直接に相関する。オオムギは別とし
て、タンパク質合成阻害遺伝子は、例えばすべての単子
葉および双子葉植物から分離することができ、多くの種
類の活性プロモーター、例えば病原誘導プロモーター、
構成プロモーター、発生特異性プロモーター、器官特異
性プロモーターおよび誘導プロモーターと融合すること
ができる。
【００１３】新規なタンパク質合成阻害遺伝子を活性プ
ロモーターの制御下で移入できる遺伝子型について、次
の植物を示すことができる： −すべての単子葉植物、例えば穀類、 −すべての双子葉植物、例えばナス科およびウリ科植
物。
ロモーターの制御下で移入できる遺伝子型について、次
の植物を示すことができる： −すべての単子葉植物、例えば穀類、 −すべての双子葉植物、例えばナス科およびウリ科植
物。
【００１４】従って、本発明の方法は、特に耐病原性植
物(pathogen-resistant plants) の生産に適当である。
しかしながら、タンパク質合成阻害遺伝子の形質発現に
より、また昆虫、菌、細菌、ウイルスおよびウイロイド
に対する耐性をヒトおよび動物において達成することが
できる。
物(pathogen-resistant plants) の生産に適当である。
しかしながら、タンパク質合成阻害遺伝子の形質発現に
より、また昆虫、菌、細菌、ウイルスおよびウイロイド
に対する耐性をヒトおよび動物において達成することが
できる。
【００１５】本発明の方法を実施する有利な他の改良手
段によると、図３Ａに示すDNA 配列を有するタンパク質
合成阻害遺伝子が適当である。しかしながら、このDNA
配列は別として、類似DNA 配列は問題セット(problem s
et) 、例えば５′領域において相当するcDNAクローンに
より完成した図３ＢによるDNA 配列を解くのに用いるこ
とができる。
段によると、図３Ａに示すDNA 配列を有するタンパク質
合成阻害遺伝子が適当である。しかしながら、このDNA
配列は別として、類似DNA 配列は問題セット(problem s
et) 、例えば５′領域において相当するcDNAクローンに
より完成した図３ＢによるDNA 配列を解くのに用いるこ
とができる。
【００１６】
【実施例】次に、本発明をPSI 遺伝子のオオムギからの
分離、この遺伝子の活性プロモーターによる融合、およ
び融合生成物のタバコ植物の遺伝子型への転移につい
て、例を挙げて説明する。
分離、この遺伝子の活性プロモーターによる融合、およ
び融合生成物のタバコ植物の遺伝子型への転移につい
て、例を挙げて説明する。
【００１７】図１はオオムギからのCHI, BGLおよびPSI
タンパク質の精製について示している。SDS −ゲル−電
子泳動分離は、オオムギ種子からのCHI タンパク質（列
２〜５）、PSI タンパク質（列７〜11）およびBGL タン
パク質（列13〜17）の精製において生成したタンパク質
フラクションを示している。特異的抗体により、相当す
るタンパク質を検出することができる。略語は次に示す
意味を有している： ％(NH4)2SO4 : 塩によって沈殿したタンパク質。 ％sup : 塩によって沈殿しないタンパク質。 CM : CMカラムに結合しないタンパク質。 fra. : CMカラムからのタンパク質フラクション。 pur. : 高純度タンパク質。 MW : タンパク質の大きさ標準キロダルトン(kDalto
n) 。
タンパク質の精製について示している。SDS −ゲル−電
子泳動分離は、オオムギ種子からのCHI タンパク質（列
２〜５）、PSI タンパク質（列７〜11）およびBGL タン
パク質（列13〜17）の精製において生成したタンパク質
フラクションを示している。特異的抗体により、相当す
るタンパク質を検出することができる。略語は次に示す
意味を有している： ％(NH4)2SO4 : 塩によって沈殿したタンパク質。 ％sup : 塩によって沈殿しないタンパク質。 CM : CMカラムに結合しないタンパク質。 fra. : CMカラムからのタンパク質フラクション。 pur. : 高純度タンパク質。 MW : タンパク質の大きさ標準キロダルトン(kDalto
n) 。
【００１８】図２は精製タンパク質による菌類の成長試
験の結果を示している。トリコダーマ リーセイ（Ａ）
およびフサリウム スポロトリチオイデス（Ｂ）の胞子
を全容量の135 μl 媒質／ウエル(well)の微量滴定プレ
ートにおいて成長させ、0.05〜1.5 μg の特定タンパク
質と混合した。図２に示すグラフにプロットした各点
は、（Ａ）については3.6 ％および（Ｂ）については7.
3 ％の相対標準偏差による５回の測定の結果を示してい
る。100 ％菌類の成長は（Ａ）0.40および（Ｂ）0.41の
O.D. 540 を示している。
験の結果を示している。トリコダーマ リーセイ（Ａ）
およびフサリウム スポロトリチオイデス（Ｂ）の胞子
を全容量の135 μl 媒質／ウエル(well)の微量滴定プレ
ートにおいて成長させ、0.05〜1.5 μg の特定タンパク
質と混合した。図２に示すグラフにプロットした各点
は、（Ａ）については3.6 ％および（Ｂ）については7.
3 ％の相対標準偏差による５回の測定の結果を示してい
る。100 ％菌類の成長は（Ａ）0.40および（Ｂ）0.41の
O.D. 540 を示している。
【００１９】図３および図４は分離PSI −cDNAクローン
のヌクレオチド配列を示している。 Ａ： cDNAクローンは1078ヌクレオチド大きさである。
これには42 bp 大きさの５′−非翻訳領域、843 bpの開
放型読み枠（終止暗号を星印で示している）および193
bp大きさの３′−非翻訳端を含んでいる。可能なポリア
デニル化シグナルにはアンダーラインを付けている。開
放型読み枠から生ずるアミノ酸配列は相当する配列の下
に示している。 図５： 不完全PSI −cDNAクローンのヌクレオチド配列
を示しており、可能なポリアデニル化シグナルにはアン
ダーラインを付けている。
のヌクレオチド配列を示している。 Ａ： cDNAクローンは1078ヌクレオチド大きさである。
これには42 bp 大きさの５′−非翻訳領域、843 bpの開
放型読み枠（終止暗号を星印で示している）および193
bp大きさの３′−非翻訳端を含んでいる。可能なポリア
デニル化シグナルにはアンダーラインを付けている。開
放型読み枠から生ずるアミノ酸配列は相当する配列の下
に示している。 図５： 不完全PSI −cDNAクローンのヌクレオチド配列
を示しており、可能なポリアデニル化シグナルにはアン
ダーラインを付けている。
【００２０】図６にはオオムギ ゲノムにおけるPSI 遺
伝子の組織化を示している。オオムギ胚からのDNA を種
々の制限酵素でカットし、ゲル−電気泳動分離し、ナイ
ロン膜に移動させ、放射性標識PSI −cDNAに対してハイ
ブリッド形成した。ハイブリッド形成バンド(hybridizi
ng bands) の数を基礎として、結論をゲノムにおけるPS
I コピー数について得ることができる。大きさの基準を
キロベースペア(kb)で示す。
伝子の組織化を示している。オオムギ胚からのDNA を種
々の制限酵素でカットし、ゲル−電気泳動分離し、ナイ
ロン膜に移動させ、放射性標識PSI −cDNAに対してハイ
ブリッド形成した。ハイブリッド形成バンド(hybridizi
ng bands) の数を基礎として、結論をゲノムにおけるPS
I コピー数について得ることができる。大きさの基準を
キロベースペア(kb)で示す。
【００２１】図７はオオムギにおけるPSI −RNA の発生
特異および器官特異発現を示している。RNA をオオムギ
植物の異なる器官から、異なる発生段階において分離し
た。RNA を放射性標識PSI −cDNAに関してノザン法を介
してゲル−電気泳動適用後にハイブリッド形成した。PS
I −RNA を引続く種子発生中、澱粉含有内乳において1.
3 kb大きさのRNA として特異的に検出することができ
る。
特異および器官特異発現を示している。RNA をオオムギ
植物の異なる器官から、異なる発生段階において分離し
た。RNA を放射性標識PSI −cDNAに関してノザン法を介
してゲル−電気泳動適用後にハイブリッド形成した。PS
I −RNA を引続く種子発生中、澱粉含有内乳において1.
3 kb大きさのRNA として特異的に検出することができ
る。
【００２２】図８はキメラ遺伝子wun1−PSI in pPR69の
構造地図を示している。wun1−プロモーター(Pwun1：約
1200 bp 大きさ）をPSI 遺伝子（「PSI 」：約1070 bp
大きさ）と転写的に融合した。RNA 安定性応答の場合、
CAT 遺伝子（「ｘ」：約500bp大きさ）の残留物および
ポリアデニル化シグナルをPSI 遺伝子の３′で融合し
た。この構造をバイナリー ベクター pPR69 にクロー
ン化した。
構造地図を示している。wun1−プロモーター(Pwun1：約
1200 bp 大きさ）をPSI 遺伝子（「PSI 」：約1070 bp
大きさ）と転写的に融合した。RNA 安定性応答の場合、
CAT 遺伝子（「ｘ」：約500bp大きさ）の残留物および
ポリアデニル化シグナルをPSI 遺伝子の３′で融合し
た。この構造をバイナリー ベクター pPR69 にクロー
ン化した。
【００２３】図９はwun1−PSI −トランスゲニック タ
バコ植物のサザンブロット分析の結果を示している。wu
n1−PSI −DNA を分析すべきタバコ ゲノムに正しく組
込む場合、DNA をwun1−PSI −トランスゲニック タバ
コ植物から分離し、 EcoRIでカットした。DNA のゲル−
電気泳動分離およびDNA のナイロン膜への転移後、ハイ
ブリット形成を放射性PSI −cDNAに関して行った。
（＋）で示した植物はwun1−PSI −DNA の正しい組込み
を示している。ハイブリッド形成バンドの大きさは1.07
kb であり、対照として用いたwun1−PSI in pPR69(K)
のプラスミド−DNAの大きさと一致する。付加のおよび
不正に大きいDNA バンドの存在のために、（−）で示し
た植物は廃棄した。
バコ植物のサザンブロット分析の結果を示している。wu
n1−PSI −DNA を分析すべきタバコ ゲノムに正しく組
込む場合、DNA をwun1−PSI −トランスゲニック タバ
コ植物から分離し、 EcoRIでカットした。DNA のゲル−
電気泳動分離およびDNA のナイロン膜への転移後、ハイ
ブリット形成を放射性PSI −cDNAに関して行った。
（＋）で示した植物はwun1−PSI −DNA の正しい組込み
を示している。ハイブリッド形成バンドの大きさは1.07
kb であり、対照として用いたwun1−PSI in pPR69(K)
のプラスミド−DNAの大きさと一致する。付加のおよび
不正に大きいDNA バンドの存在のために、（−）で示し
た植物は廃棄した。
【００２４】図１０はwun1−PSI −トランスゲニック
タバコ植物のノーザンブロット分析の結果を示してい
る。リゾクトニア ソラニイ−感染タバコ植物からの10
0 μgの葉RNA (leaf RNA)をゲル−電気泳動的に分離
し、ナイロン膜に移動させ、放射性PSI −cDNAに関して
ハイブリット形成した。オートラジオグラフィーにおい
て、wun1−PSI −トランスゲニック タバコ植物（「 P
SI−７： PSI−18」）の場合に PSI−RNA バンドを確認
できた。非形質転換(untransformed) タバコ植物では、
PSI−RNA は検出できなかった。
タバコ植物のノーザンブロット分析の結果を示してい
る。リゾクトニア ソラニイ−感染タバコ植物からの10
0 μgの葉RNA (leaf RNA)をゲル−電気泳動的に分離
し、ナイロン膜に移動させ、放射性PSI −cDNAに関して
ハイブリット形成した。オートラジオグラフィーにおい
て、wun1−PSI −トランスゲニック タバコ植物（「 P
SI−７： PSI−18」）の場合に PSI−RNA バンドを確認
できた。非形質転換(untransformed) タバコ植物では、
PSI−RNA は検出できなかった。
【００２５】図１１はリゾクトニア ソラニイで感染し
た個々のタバコ植物の成長速度の状態を示す棒グラフで
ある。各棒はタバコ植物の約10日間にわたる成長状態を
示している。成長曲線の勾配から、１ｎ×100 を計算し
て得られた数値が成長速度を表わす。「inf. SRI」はリ
ゾクトニア ソラニイで感染した非形質転換タバコを示
している。「inf. RIP」はリゾクトリア ソラニイで感
染したwun1−PSI −トランスゲニック タバコを示して
いる。「uninf. SRI」は感染しない非形質転換タバコを
示している。
た個々のタバコ植物の成長速度の状態を示す棒グラフで
ある。各棒はタバコ植物の約10日間にわたる成長状態を
示している。成長曲線の勾配から、１ｎ×100 を計算し
て得られた数値が成長速度を表わす。「inf. SRI」はリ
ゾクトニア ソラニイで感染した非形質転換タバコを示
している。「inf. RIP」はリゾクトリア ソラニイで感
染したwun1−PSI −トランスゲニック タバコを示して
いる。「uninf. SRI」は感染しない非形質転換タバコを
示している。
【００２６】図１２はリゾクトニア ソラニイ感染タバ
コ植物による平均成長速度の状態を示す棒グラフであ
る。図１１に示す個々の数値から計算した平均成長速度
を示している。
コ植物による平均成長速度の状態を示す棒グラフであ
る。図１１に示す個々の数値から計算した平均成長速度
を示している。
【００２７】図１３はリゾクトニア ソラニイ感染タバ
コ植物の茎の平均成長状態を示している。平均成長状態
は、リゾクトニア ソラニイで感染後、10本の個々のwu
n1−PSI −トランスゲニック タバコ植物（「PSI 」）
および10本の個々の非形質転換タバコ植物（「SRI 」）
について確めた。横軸に茎の長さをプロットし（植物的
成長点(vegetation point)、および縦軸に感染後の日数
を示している。
コ植物の茎の平均成長状態を示している。平均成長状態
は、リゾクトニア ソラニイで感染後、10本の個々のwu
n1−PSI −トランスゲニック タバコ植物（「PSI 」）
および10本の個々の非形質転換タバコ植物（「SRI 」）
について確めた。横軸に茎の長さをプロットし（植物的
成長点(vegetation point)、および縦軸に感染後の日数
を示している。
【００２８】例１ Ａ．使用材料 培地 細菌の培養のために、培地をマニアティス氏ほか「Mole
cular cloning: a laboratony manual」コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリース、コールドスプリン
グ ハーバー、ニューヨーク (1982) に記載されている
ように用いた。植物培地 使用培地をムラシゲＴ．氏ほか「迅速成長についての迅
速方法およびタバコ組織培養についてのバイオアッセ
イ」；Physiol. Plant. 15：473 〜 497 (1962)に記載
されている培地 (MS) から誘導した。 3MS : MS＋３％サッカロース 3MSC : MS＋３％サッカロース、500 μｇ／mlクラホ
ラン(clafran) 3MC15 : MS＋２％サッカロース、500 μｇ／mlクラホ
ラン＋100 μｇ／ml硫酸カナマイシン MSC16 : MS＋0.5 μｇ／ml BAP＋0.1 μｇ／ml NAA＋
100 μｇ／ml硫酸カナマイシン＋500 μｇ／mlクラホラ
ン 固体培地の場合、８ｇ／ｌのタバコ寒天をさらに加え
た。
cular cloning: a laboratony manual」コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリース、コールドスプリン
グ ハーバー、ニューヨーク (1982) に記載されている
ように用いた。植物培地 使用培地をムラシゲＴ．氏ほか「迅速成長についての迅
速方法およびタバコ組織培養についてのバイオアッセ
イ」；Physiol. Plant. 15：473 〜 497 (1962)に記載
されている培地 (MS) から誘導した。 3MS : MS＋３％サッカロース 3MSC : MS＋３％サッカロース、500 μｇ／mlクラホ
ラン(clafran) 3MC15 : MS＋２％サッカロース、500 μｇ／mlクラホ
ラン＋100 μｇ／ml硫酸カナマイシン MSC16 : MS＋0.5 μｇ／ml BAP＋0.1 μｇ／ml NAA＋
100 μｇ／ml硫酸カナマイシン＋500 μｇ／mlクラホラ
ン 固体培地の場合、８ｇ／ｌのタバコ寒天をさらに加え
た。
【００２９】菌株およびベクター Ｅ．コリ菌株： BMH 71-18: delta (lac-proAB), thi, supE; F′(lac
i q , ZdeltaM15 ,proA + B + ) 参照：メシングＪ．氏ほか「植物遺伝子構造」：コスゲ
Ｆ．，ナレディスＣ．Ｐ．，ホラエンダーＡ．氏編集に
よるGenetic engineering of plants , プレナムプレス
出版、ニューヨーク、211 〜227 (1983)。
i q , ZdeltaM15 ,proA + B + ) 参照：メシングＪ．氏ほか「植物遺伝子構造」：コスゲ
Ｆ．，ナレディスＣ．Ｐ．，ホラエンダーＡ．氏編集に
よるGenetic engineering of plants , プレナムプレス
出版、ニューヨーク、211 〜227 (1983)。
【００３０】アグロバクテリア 菌株 ：LBA 4404：（ホエケマ氏ほか、Nature 30
3：179 〜180 (1983) プラスミド：pUC8 (puc プラスミド、挿入突然変異誘発
(insertion mutagenesis) のためのM13mp7誘導系、シン
セテック ユニバーサル プライムスによる。「Gene」
19：259 〜 268 (1982) 。 ：pPR69 (bin 19 の誘導体、−植物形質転換のためのベ
バンＭ．バイナリー アグロバクテリウム ベクター
−、「Nucl. Acids, Res.」12：8711〜8721 (1984) 。 植物 ：ホルデウム ブルガレ(Hordeum vulgare)
Ｌ. cv. ビギイ ニコチアナ タバキウム(Piggy Nicot
iana tabacum) SRI
3：179 〜180 (1983) プラスミド：pUC8 (puc プラスミド、挿入突然変異誘発
(insertion mutagenesis) のためのM13mp7誘導系、シン
セテック ユニバーサル プライムスによる。「Gene」
19：259 〜 268 (1982) 。 ：pPR69 (bin 19 の誘導体、−植物形質転換のためのベ
バンＭ．バイナリー アグロバクテリウム ベクター
−、「Nucl. Acids, Res.」12：8711〜8721 (1984) 。 植物 ：ホルデウム ブルガレ(Hordeum vulgare)
Ｌ. cv. ビギイ ニコチアナ タバキウム(Piggy Nicot
iana tabacum) SRI
【００３１】Ｂ．適用方法 別に示さないかぎり、すべての分子生物学的標準方法、
例えば制限分析(restriction analysis)、プラスミド分
離、プラスミド−DNA の微量調製(minipreparations)、
細菌の形質転換などを上述するマニアティス氏ほか (19
82) の文献に記載されているようにして行った。
例えば制限分析(restriction analysis)、プラスミド分
離、プラスミド−DNA の微量調製(minipreparations)、
細菌の形質転換などを上述するマニアティス氏ほか (19
82) の文献に記載されているようにして行った。
【００３２】植物材料 よく実ったオオムギ種子（ホルデウム ブルガレＬ．c
v. ビギイ）を開花後、多くの時期で収穫し、液体窒素
中で冷凍し、−80℃で貯蔵した。
v. ビギイ）を開花後、多くの時期で収穫し、液体窒素
中で冷凍し、−80℃で貯蔵した。
【００３３】PSI , CHI およびBGL タンパク質の分離および精製 PSI およびCHI タンパク質：10 kg のよく実ったオオム
ギ種子を微粉（粒子大きさ：直径0.5 mm以下）にした。
これに、100 ｌの抽出緩衝剤（ 50 mM りん酸塩緩衝
剤、pH 6.5；100 mMNaCl；2.5 mM アスコルビン酸；2.
5 mM EDTA；３mM β−メルカプト−EtOH）を加えた
後、４℃で２時間内にわたり攪拌し、上澄み液を濾別し
た。この目的のために、超遠心機を用いて、上澄み液の
量を６ｌに減らした（使用フィルター：20 kDa以下のす
べてのタンパク質を残留するDDS 膜（ポリスルホンの限
外濾過膜）。上澄み液を40〜70％(NH4)2SO4 で沈殿させ
た。得られたペレットを 80 mMPMSFに溶解し、２mM Na
りん酸塩緩衝剤、 pH 6.5 について透析し、これに 80m
M PMSFを加えた。タンパク質溶液をイオン交換クロマ
トグラフィーを介してCM52（ワットマン）に装填し、高
められた濃度のNaClを含有する 50 mM Naりん酸塩（10
以上の溶離段階で0.05〜1.0 M NaCl ）で溶離した。
ギ種子を微粉（粒子大きさ：直径0.5 mm以下）にした。
これに、100 ｌの抽出緩衝剤（ 50 mM りん酸塩緩衝
剤、pH 6.5；100 mMNaCl；2.5 mM アスコルビン酸；2.
5 mM EDTA；３mM β−メルカプト−EtOH）を加えた
後、４℃で２時間内にわたり攪拌し、上澄み液を濾別し
た。この目的のために、超遠心機を用いて、上澄み液の
量を６ｌに減らした（使用フィルター：20 kDa以下のす
べてのタンパク質を残留するDDS 膜（ポリスルホンの限
外濾過膜）。上澄み液を40〜70％(NH4)2SO4 で沈殿させ
た。得られたペレットを 80 mMPMSFに溶解し、２mM Na
りん酸塩緩衝剤、 pH 6.5 について透析し、これに 80m
M PMSFを加えた。タンパク質溶液をイオン交換クロマ
トグラフィーを介してCM52（ワットマン）に装填し、高
められた濃度のNaClを含有する 50 mM Naりん酸塩（10
以上の溶離段階で0.05〜1.0 M NaCl ）で溶離した。
【００３４】BGL タンパク質：オオムギ種子を12日で発
芽させ、凍結乾燥し、抽出緩衝剤（上述する）で処理し
た（1.6 kg種子／25ｌ抽出緩衝剤）。40％(NH4)2SO4 に
よる沈殿後、上澄み液を透析し、CM52およびモノ−Ｓ
カラム上で精製した。分離したBGL タンパク質を、純度
に関してウエスターン法および末端配列により処理し
た。
芽させ、凍結乾燥し、抽出緩衝剤（上述する）で処理し
た（1.6 kg種子／25ｌ抽出緩衝剤）。40％(NH4)2SO4 に
よる沈殿後、上澄み液を透析し、CM52およびモノ−Ｓ
カラム上で精製した。分離したBGL タンパク質を、純度
に関してウエスターン法および末端配列により処理し
た。
【００３５】PSI 抗体の調製 抗体を、ウサギにおける精製PSI −IIタンパク質につい
て普通の方法で調製した。
て普通の方法で調製した。
【００３６】精製タンパク質による細菌の成長試験 トリコダーマ リーセイおよびフサリウム スポロトリ
チオイデス（ATCCコレクション、ロックビレ）をジャガ
イモ デキストロース寒天(Difco Co.) 上25℃で成長さ
せた。８日経過した培養物の胞子を「菌成長抑制につい
ての自動定量分析」FEMS Microbiology Letters (199
0) ブロエカエートＷ．Ｆ．氏らの方法で収穫し、20％
グリセロール中−20℃で貯蔵した。菌成長試験の範囲内
において、胞子懸濁物（10000 胞子／ml）を100 μl の
ジャガイモ デキストロース溶液および35μl の処理す
べきタンパク質フラクションと混合し、25℃で温置し
た。ブロエカエートＷ．Ｆ．氏ほかにより記載されてい
るように、菌の成長は540 nmにおいて光学密度の増加と
直線的に相関した。菌成長抑制効果を有するタンパク質
フラクションは効果を有しないタンパク質より光学密度
における増加が低くかった。
チオイデス（ATCCコレクション、ロックビレ）をジャガ
イモ デキストロース寒天(Difco Co.) 上25℃で成長さ
せた。８日経過した培養物の胞子を「菌成長抑制につい
ての自動定量分析」FEMS Microbiology Letters (199
0) ブロエカエートＷ．Ｆ．氏らの方法で収穫し、20％
グリセロール中−20℃で貯蔵した。菌成長試験の範囲内
において、胞子懸濁物（10000 胞子／ml）を100 μl の
ジャガイモ デキストロース溶液および35μl の処理す
べきタンパク質フラクションと混合し、25℃で温置し
た。ブロエカエートＷ．Ｆ．氏ほかにより記載されてい
るように、菌の成長は540 nmにおいて光学密度の増加と
直線的に相関した。菌成長抑制効果を有するタンパク質
フラクションは効果を有しないタンパク質より光学密度
における増加が低くかった。
【００３７】オオムギからPSI −cDNAクローンの分離 よく実ったオオムギ種子（ホルデウム ブルガレＬ．c
v. ビギイ）から、ポリＡ+ −RNA を分離し、λ−gt−1
1ファージにおけるcDNA形質発現バンドに堆積した（レ
アＲ．およびムンデイＪ．氏「オオムギの生物機能(bio
functional) α−アミラーゼ／スブチリンインヒビタ
ー：ヌクレオチド配列および種子−特異的形質発現のパ
ターン」、Plant Mol. Biol. 12: 673〜682 (1989)。単
一特異性抗体PSI （ムンディＩ．氏ほか「オオムギ ア
リューロンおよび澱粉質内乳タンパク質のインビトロ分
化合成(differential synthesis in vitro) 」Plant Ph
ysiol.81: 630〜636 (1986)により、PSI 含有cDNAクロ
ーンを確認した。
v. ビギイ）から、ポリＡ+ −RNA を分離し、λ−gt−1
1ファージにおけるcDNA形質発現バンドに堆積した（レ
アＲ．およびムンデイＪ．氏「オオムギの生物機能(bio
functional) α−アミラーゼ／スブチリンインヒビタ
ー：ヌクレオチド配列および種子−特異的形質発現のパ
ターン」、Plant Mol. Biol. 12: 673〜682 (1989)。単
一特異性抗体PSI （ムンディＩ．氏ほか「オオムギ ア
リューロンおよび澱粉質内乳タンパク質のインビトロ分
化合成(differential synthesis in vitro) 」Plant Ph
ysiol.81: 630〜636 (1986)により、PSI 含有cDNAクロ
ーンを確認した。
【００３８】PSI ヌクレオチド配列の分析 PSI −ポジティブλ− gh11 ファージを分離し、サブク
ローン化し、サンガー氏ほか「連鎖終止抑制剤によるDN
A 配列」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 :5463〜546
7 (1977) のジドキシ配列法により配列した。
ローン化し、サンガー氏ほか「連鎖終止抑制剤によるDN
A 配列」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 :5463〜546
7 (1977) のジドキシ配列法により配列した。
【００３９】アグロバクテリアにおけるDNA 転移 形質転換：Ｅ．コリにおいてクローン化したDNA を、ア
ァン ハウテ氏ほか「pBR322においてクローン化した制
限フラグメントの遺伝子間転移および交換組換え：アク
ロバクテリウム トゥメフアシェンス(Agrobacterium t
umefaciens) のTi−プラスミドの逆向き遺伝学について
の新らしい手段」、EMSO J. 2 : 411〜418 (1983)に記
載された方法により、Ａ．トゥメフアシェンス（LBA 44
04) （ホエチマ氏ほか「Ａ−トゥメフアシェンスの vir
−およびＴ−領域の分離によるバイナリー植物ベクター
手段」、Nature 303 : 179〜180 (1983)）に接合して転
移した。
ァン ハウテ氏ほか「pBR322においてクローン化した制
限フラグメントの遺伝子間転移および交換組換え：アク
ロバクテリウム トゥメフアシェンス(Agrobacterium t
umefaciens) のTi−プラスミドの逆向き遺伝学について
の新らしい手段」、EMSO J. 2 : 411〜418 (1983)に記
載された方法により、Ａ．トゥメフアシェンス（LBA 44
04) （ホエチマ氏ほか「Ａ−トゥメフアシェンスの vir
−およびＴ−領域の分離によるバイナリー植物ベクター
手段」、Nature 303 : 179〜180 (1983)）に接合して転
移した。
【００４０】DNA 分析 アクロバクテリウムに対するDNA 転移の検査を、エバー
ト氏ほか「安定および過度検定(transient assays)によ
るノパリン シンテターゼ プロモーターにおける主上
流成分の確認」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 57
45〜5749 (1987) に記載されている方法によるアクロバ
クテリアの分離によって行った。DNA の制限切断はアグ
ロバクテリウムに対する首尾よいDNA 転移についての情
報を与える相当する放射性プローブに関するニトロセル
ロースおよびハイブリッド形成に転移する。
ト氏ほか「安定および過度検定(transient assays)によ
るノパリン シンテターゼ プロモーターにおける主上
流成分の確認」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 57
45〜5749 (1987) に記載されている方法によるアクロバ
クテリアの分離によって行った。DNA の制限切断はアグ
ロバクテリウムに対する首尾よいDNA 転移についての情
報を与える相当する放射性プローブに関するニトロセル
ロースおよびハイブリッド形成に転移する。
【００４１】アグロバクテリアによるタバコ植物の形質
転換 アグロバクテリアの成長：感染に必要なアグロバクテリ
アLBA 4404を選択アンチビオティカ培地で成長し（ザン
ブリスキー氏ほか「正常能力を変えることなく植物細胞
にDNA を導入するTi−プラスミド ベクター」、EMBO
J. 1 : 147〜152 (1983) )、遠心分離により沈降し、
アンチビオティカ(antibiotica) の存在しないYEB 培地
で洗浄した（YEB ＝0.5 ％肉エキス；0.2 ％酵母エキ
ス；0.5 ％ペプトン；0.5 ％サッカロース；２mM MgSO
4 ）。再び沈降し、3MS 培地に吸収させた後、バクテリ
アを感染のために用いることができる。
転換 アグロバクテリアの成長：感染に必要なアグロバクテリ
アLBA 4404を選択アンチビオティカ培地で成長し（ザン
ブリスキー氏ほか「正常能力を変えることなく植物細胞
にDNA を導入するTi−プラスミド ベクター」、EMBO
J. 1 : 147〜152 (1983) )、遠心分離により沈降し、
アンチビオティカ(antibiotica) の存在しないYEB 培地
で洗浄した（YEB ＝0.5 ％肉エキス；0.2 ％酵母エキ
ス；0.5 ％ペプトン；0.5 ％サッカロース；２mM MgSO
4 ）。再び沈降し、3MS 培地に吸収させた後、バクテリ
アを感染のために用いることができる。
【００４２】葉−薄片感染：葉の薄片を感染するため
に、タバコ系統SRI の無菌葉を用いた。約１cmの葉片を
上述するアグロバクテリア懸濁物に浸し、3MS 培地に移
した。２日間、日中16時間、25〜27℃で温置した後、葉
片をMSC16 培地に移した。４〜６週間して生じた苗条を
切り取り、MSC15 培地に置いた。さらに、根形成による
苗条を分析した。
に、タバコ系統SRI の無菌葉を用いた。約１cmの葉片を
上述するアグロバクテリア懸濁物に浸し、3MS 培地に移
した。２日間、日中16時間、25〜27℃で温置した後、葉
片をMSC16 培地に移した。４〜６週間して生じた苗条を
切り取り、MSC15 培地に置いた。さらに、根形成による
苗条を分析した。
【００４３】植物のDNA 分析 植物材料を液体窒素に入れ、10容量の抽出緩衝剤（10 m
M トリス−HCl (pH ８）; 100 mM NaCl；１mM EDTA,
プロテアーゼＫ；膵RNアーゼ）と混合し、温置し、フェ
ノールで抽出し、上澄み液をEtOHで沈殿させた。分離DN
A の制限消化、DNA とアガロースとのゲル−電気泳動分
離、およびDNA のナイロン膜への移動を上述するマニア
ティス氏ほかによる文献 (1982) に記載するように行っ
た。放射性標識DNA 標本についてのハイブリッド形成を
ロゲマン氏ほか「RNA を植物組織から分離する改良方
法」、Anal. Biochem. 163：16〜20 (1987) に記載され
ている方法によって行った。
M トリス−HCl (pH ８）; 100 mM NaCl；１mM EDTA,
プロテアーゼＫ；膵RNアーゼ）と混合し、温置し、フェ
ノールで抽出し、上澄み液をEtOHで沈殿させた。分離DN
A の制限消化、DNA とアガロースとのゲル−電気泳動分
離、およびDNA のナイロン膜への移動を上述するマニア
ティス氏ほかによる文献 (1982) に記載するように行っ
た。放射性標識DNA 標本についてのハイブリッド形成を
ロゲマン氏ほか「RNA を植物組織から分離する改良方
法」、Anal. Biochem. 163：16〜20 (1987) に記載され
ている方法によって行った。
【００４４】植物のRNA 分析 オオムギの植物：全RNA およびポリＡ+ RNA の分離を上
述するレアＲ．およびムンディＪ．氏ほか (1989) の文
献に記載されているように行った。ホルムアルデヒド
ゲルによるゲル−電気泳動分析、ナイロン膜への移動お
よび放射性標識DNA 標本についてのハイブリッド形成を
上述するロゲマン氏ほか (1987) の文献に記載されてい
るように行った。
述するレアＲ．およびムンディＪ．氏ほか (1989) の文
献に記載されているように行った。ホルムアルデヒド
ゲルによるゲル−電気泳動分析、ナイロン膜への移動お
よび放射性標識DNA 標本についてのハイブリッド形成を
上述するロゲマン氏ほか (1987) の文献に記載されてい
るように行った。
【００４５】トランスゲニック植物のタンパク質分析 凍結乾燥した葉材料を抽出緩衝剤（10 mM トリス pH 8.
0 ; １mM EDTA；100mM NaCl；２％SDS ）に入れ、タ
ンパク質濃度を１mg／mlに調整した。タンパク質のゲル
−電気泳動分離を、１μg タンパク質／スロット適用す
る相−ゲル−システム（製薬）によって行った。分離し
たタンパク質をニトロセルロースに移動し（ニトロセル
ロースをタンパク質ゲルに70℃で20分間適用する拡散ブ
ロット）、特異抗体を用いて分析した（プロメガ コン
パニー(Promega Company) のプロットブロット(protobl
ot) システムによるウエスターン ブロット分析）。
0 ; １mM EDTA；100mM NaCl；２％SDS ）に入れ、タ
ンパク質濃度を１mg／mlに調整した。タンパク質のゲル
−電気泳動分離を、１μg タンパク質／スロット適用す
る相−ゲル−システム（製薬）によって行った。分離し
たタンパク質をニトロセルロースに移動し（ニトロセル
ロースをタンパク質ゲルに70℃で20分間適用する拡散ブ
ロット）、特異抗体を用いて分析した（プロメガ コン
パニー(Promega Company) のプロットブロット(protobl
ot) システムによるウエスターン ブロット分析）。
【００４６】リゾクトニア メラニイによるトランスゲ
ニック植物の感染 菌リゾクトニア ソラニイを液体培地（デフコ コンパ
ニーのジャガイモ デキストロース寒天）において28℃
で成長させ、５〜６日目で収穫した。ブフナー漏斗およ
び接続吸引ボトルにより、培地を抽出した。残留する菌
糸(fungus mycel)を外科用メスでできるだけ小さい片に
切った。所望量の菌糸を秤量し、５ｌの無菌の標準土と
十分に混合した。この土を皿に広げ、これに試験すべき
植物を植えた。植物の成長を、根の長さの測定によって
24時間ごとに調べた（土面と植物的成長点の距離）。
ニック植物の感染 菌リゾクトニア ソラニイを液体培地（デフコ コンパ
ニーのジャガイモ デキストロース寒天）において28℃
で成長させ、５〜６日目で収穫した。ブフナー漏斗およ
び接続吸引ボトルにより、培地を抽出した。残留する菌
糸(fungus mycel)を外科用メスでできるだけ小さい片に
切った。所望量の菌糸を秤量し、５ｌの無菌の標準土と
十分に混合した。この土を皿に広げ、これに試験すべき
植物を植えた。植物の成長を、根の長さの測定によって
24時間ごとに調べた（土面と植物的成長点の距離）。
【００４７】結果 オオムギ種子からPSI , CHI およびBGL タンパク質の分
離および精製 CHI およびPSI タンパク質を良く実ったオオムギ種子
（ホルデウム ブルガレＬ．cv. ビギイ）から上述する
「方法」の項目に記載するようにして分離した。種々の
精製段階の範囲内で生成するタンパク質フラクションを
銀−標識CHI またはPSI 抗体により示された変性アクリ
ルアミド ゲルおよびCHI またはPSI タンパク質に適用
した（図１）。CHI またはPSI タンパク質を40％および
70％(NH4)2SO4 沈殿後（列２，７）、ワットマン CM52
による引続く分離後（列３，４，８）、モノ−Ｓ−カラ
ムによる引続く精製後（列５，９，10, 11）に検出する
ことができる。図１に示す列９, 10および11は、３つの
異なるPSI アイソフォーム（PSI I, II, III ）が分離
されたことを示している。これらはCM52カラムにおける
異なる流出状態によって区別することができる。
離および精製 CHI およびPSI タンパク質を良く実ったオオムギ種子
（ホルデウム ブルガレＬ．cv. ビギイ）から上述する
「方法」の項目に記載するようにして分離した。種々の
精製段階の範囲内で生成するタンパク質フラクションを
銀−標識CHI またはPSI 抗体により示された変性アクリ
ルアミド ゲルおよびCHI またはPSI タンパク質に適用
した（図１）。CHI またはPSI タンパク質を40％および
70％(NH4)2SO4 沈殿後（列２，７）、ワットマン CM52
による引続く分離後（列３，４，８）、モノ−Ｓ−カラ
ムによる引続く精製後（列５，９，10, 11）に検出する
ことができる。図１に示す列９, 10および11は、３つの
異なるPSI アイソフォーム（PSI I, II, III ）が分離
されたことを示している。これらはCM52カラムにおける
異なる流出状態によって区別することができる。
【００４８】精製CHI タンパク質の比活性を、モラノ氏
ほか「トリチウム化キチンを用いるキチナーゼについて
の迅速かつ高感度検定法」、Anal. Biochem. 88: 648〜
656(1977)に記載されているようにして調べ、22 mg ジ
アセチル／チトビオース(chitobiose)／分／mgタンパク
質であった。精製PSI タンパク質は次に示す活性を示し
た：３〜30 ng のPSI は網状赤血球溶菌液において50％
のRNA 翻訳を抑制する。BGL タンパク質を12日経過した
オオムギ実生苗から(NH4)2SO4 沈殿、CM52による分離お
よびモノ−Ｓ カラム（上述する「方法」の項目参照）
により精製し、BGL 抗体により検出した（図１、列13〜
17）。精製BGL タンパク質の比活性は25mgグルコース−
同価／分／mg酵素であった。
ほか「トリチウム化キチンを用いるキチナーゼについて
の迅速かつ高感度検定法」、Anal. Biochem. 88: 648〜
656(1977)に記載されているようにして調べ、22 mg ジ
アセチル／チトビオース(chitobiose)／分／mgタンパク
質であった。精製PSI タンパク質は次に示す活性を示し
た：３〜30 ng のPSI は網状赤血球溶菌液において50％
のRNA 翻訳を抑制する。BGL タンパク質を12日経過した
オオムギ実生苗から(NH4)2SO4 沈殿、CM52による分離お
よびモノ−Ｓ カラム（上述する「方法」の項目参照）
により精製し、BGL 抗体により検出した（図１、列13〜
17）。精製BGL タンパク質の比活性は25mgグルコース−
同価／分／mg酵素であった。
【００４９】精製タンパク質による菌類の成長試験：上
述する「方法」の項目に記載しているように、菌類の種
々のゲニイ(geni)を微量滴定プレート（96ウエル／プレ
ート）において各135 μl の菌培地で成長させ、これら
は測光的に(photometrically) 成長した。種々のタンパ
ク質の添加によって、菌類の成長における菌培地の影響
を分析することができる。
述する「方法」の項目に記載しているように、菌類の種
々のゲニイ(geni)を微量滴定プレート（96ウエル／プレ
ート）において各135 μl の菌培地で成長させ、これら
は測光的に(photometrically) 成長した。種々のタンパ
ク質の添加によって、菌類の成長における菌培地の影響
を分析することができる。
【００５０】図２Ａにおいて、菌トリコダーマ リーセ
イの成長状態を示している。1.5 μg ／ウエルのPSI を
使用した場合、菌類成長は20％しか抑制されなかった。
これに対して、タンパク質PSI , CHI およびBGL をそれ
ぞれ0.25μg づつ互いに合わせた場合には、成長を95％
以上抑制されていることがわかる。また、95％抑制率は
PSI／BGL の組合わせにより（いずれの場合において、
1.0 μg タンパク質）または PSI／CHI の組合わせによ
り（いずれの場合において、1.5 μg タンパク質）得ら
れている。
イの成長状態を示している。1.5 μg ／ウエルのPSI を
使用した場合、菌類成長は20％しか抑制されなかった。
これに対して、タンパク質PSI , CHI およびBGL をそれ
ぞれ0.25μg づつ互いに合わせた場合には、成長を95％
以上抑制されていることがわかる。また、95％抑制率は
PSI／BGL の組合わせにより（いずれの場合において、
1.0 μg タンパク質）または PSI／CHI の組合わせによ
り（いずれの場合において、1.5 μg タンパク質）得ら
れている。
【００５１】また、PSI , CHI およびBGL をそれぞれ0.
25μg づつ合わせた場合には、フサリウム スポロトリ
チオイデスの成長は95％抑制されていることがわかる
（図２Ｂ）。
25μg づつ合わせた場合には、フサリウム スポロトリ
チオイデスの成長は95％抑制されていることがわかる
（図２Ｂ）。
【００５２】図２Ａおよび２Ｂにおいて測定したデータ
では、PSI を単独で用いた場合に、ここに用いている菌
に対する抑制効果が比較的に低いことを示している。し
かしながら、キチナーゼCHI との組合わせ（図２Ａ，
Ｂ）またはグルカナーゼBGL との組合わせ（図２Ａ）の
場合には、抑制効果が著しく高められている。
では、PSI を単独で用いた場合に、ここに用いている菌
に対する抑制効果が比較的に低いことを示している。し
かしながら、キチナーゼCHI との組合わせ（図２Ａ，
Ｂ）またはグルカナーゼBGL との組合わせ（図２Ａ）の
場合には、抑制効果が著しく高められている。
【００５３】PSI −cDNAクローンの分離および配列：タ
イプ ホルデウム ブルガレＬ．cv. ビギイのよく実っ
たオオムギ種子から、ポリＡ+ RNA を分離し、cDNAに形
質転換し、λ−gt−11ファージにクローン化した（「材
料および方法」の項目参照）。大部分の完全PSI −cDNA
クローンをPSI −抗体を用いて確認することができた。
イプ ホルデウム ブルガレＬ．cv. ビギイのよく実っ
たオオムギ種子から、ポリＡ+ RNA を分離し、cDNAに形
質転換し、λ−gt−11ファージにクローン化した（「材
料および方法」の項目参照）。大部分の完全PSI −cDNA
クローンをPSI −抗体を用いて確認することができた。
【００５４】PSI −cDNAクローンの配列により次のデー
タを得た（図３，４および５）: −PSI クローンは1087 bp の長さを有していた。 −GCに富んだ読み取枠を29,976ダルトンの分子量を有す
るタンパク質のために暗号化する。 −PSI タンパク質はいかなるシグナルペプチドを含んで
いない。 −PSI タンパク質はアミノ酸メチオニンにより開始し、
このために自然に生ずるPSI タンパク質のタンパク質開
始に適合する。それ故、PSI タンパク質がシトソリック
タンパク質(cytosolic protein) であることが予想さ
れる。
タを得た（図３，４および５）: −PSI クローンは1087 bp の長さを有していた。 −GCに富んだ読み取枠を29,976ダルトンの分子量を有す
るタンパク質のために暗号化する。 −PSI タンパク質はいかなるシグナルペプチドを含んで
いない。 −PSI タンパク質はアミノ酸メチオニンにより開始し、
このために自然に生ずるPSI タンパク質のタンパク質開
始に適合する。それ故、PSI タンパク質がシトソリック
タンパク質(cytosolic protein) であることが予想さ
れる。
【００５５】図５に示すDNA 配列は不完全であるが、し
かし図３および４によるcDNAクローンに実質的に相同で
あることを示しており、５′領域に示すDNA 配列が相当
するcDNAクローンによって完成する場合には、問題セッ
トを解くのに適当である。
かし図３および４によるcDNAクローンに実質的に相同で
あることを示しており、５′領域に示すDNA 配列が相当
するcDNAクローンによって完成する場合には、問題セッ
トを解くのに適当である。
【００５６】オオムギ ゲノムにおけるPSI 遺伝子の検
出：オオムギ ゲノムをPSI 遺伝子の体制および数につ
いて分析するために、放射性プローブとしてPSI −cDNA
クローンを用いた。DNA をオオムギ胚から分離し、種々
の制限酵素で切断し、PSI −cDNA標本についてハイブリ
ッド形成した。図６に示すように、主として３つのフラ
グメントをPSI についてハイブリッド形成し、このため
に一倍体ゲノムについて３つのPSI 遺伝子が予想され
る。
出：オオムギ ゲノムをPSI 遺伝子の体制および数につ
いて分析するために、放射性プローブとしてPSI −cDNA
クローンを用いた。DNA をオオムギ胚から分離し、種々
の制限酵素で切断し、PSI −cDNA標本についてハイブリ
ッド形成した。図６に示すように、主として３つのフラ
グメントをPSI についてハイブリッド形成し、このため
に一倍体ゲノムについて３つのPSI 遺伝子が予想され
る。
【００５７】オオムギ種子におけるPSI −mRNAの検出：
オオムギ種子の種々の器官におけるおよび種子発育の範
囲におけるPSI −mRNAの形質発現ノーザンブロット分析
によって調べた（「材料および方法」の項目参照）。図
７に示すように、PSI −mRNAはオオムギの根、茎および
葉に、またはオオムギ種子のアリューロン層に存在しな
い。これに対して、多量のPSI −mRNAが、種子が遅い発
育段階である以外は、種子からの澱粉含有内乳において
確められた。PSI −mRNAは若い内乳には存在していなか
った。
オオムギ種子の種々の器官におけるおよび種子発育の範
囲におけるPSI −mRNAの形質発現ノーザンブロット分析
によって調べた（「材料および方法」の項目参照）。図
７に示すように、PSI −mRNAはオオムギの根、茎および
葉に、またはオオムギ種子のアリューロン層に存在しな
い。これに対して、多量のPSI −mRNAが、種子が遅い発
育段階である以外は、種子からの澱粉含有内乳において
確められた。PSI −mRNAは若い内乳には存在していなか
った。
【００５８】PSI 遺伝子のwun1プロモーターによる融合
およびタバコ植物への転移：図８に示すように、PSI −
cDNAはwundおよび病原誘導プロモーターwun1と転写的に
融合する。wun1の５′−非翻訳領域のwun1−プロモータ
ー (1022 bp)および179 bpはcDNAバンクからEcoRI を介
して分離したPSI −cDNAクローンと融合する。PSI 遺伝
子はそれ自体ポリアデニル化シグナルを有するが、しか
しその機能性は双子葉植物において推定される程度であ
る。２つの付加要素はPSI 遺伝子の後ろにクローン化し
てPSI −mRNAの安定性を高める。CAT 遺伝子（CAT −ク
ロロ−アンフュニコルアセチル トランスフェラーゼ）
の約500 bp長い配列をPSI 遺伝子の３′で配列した。CA
T 配列の３′において、カリフラワーモザイクウイルス
の35S 遺伝子のポリアデニル化シグナルは終結コドンと
して用い、その機能性は双子葉植物おいて知られてい
る。
およびタバコ植物への転移：図８に示すように、PSI −
cDNAはwundおよび病原誘導プロモーターwun1と転写的に
融合する。wun1の５′−非翻訳領域のwun1−プロモータ
ー (1022 bp)および179 bpはcDNAバンクからEcoRI を介
して分離したPSI −cDNAクローンと融合する。PSI 遺伝
子はそれ自体ポリアデニル化シグナルを有するが、しか
しその機能性は双子葉植物において推定される程度であ
る。２つの付加要素はPSI 遺伝子の後ろにクローン化し
てPSI −mRNAの安定性を高める。CAT 遺伝子（CAT −ク
ロロ−アンフュニコルアセチル トランスフェラーゼ）
の約500 bp長い配列をPSI 遺伝子の３′で配列した。CA
T 配列の３′において、カリフラワーモザイクウイルス
の35S 遺伝子のポリアデニル化シグナルは終結コドンと
して用い、その機能性は双子葉植物おいて知られてい
る。
【００５９】キメラ遺伝子wun1−PSI はHind III切断点
を介してバイナリー ベクター pPR69にクローン化し、
これを「wun1−PSI in pPR69」で示す。wun1−PSI in p
PR69はタバコ植物におけるアグロバクテリウム トゥメ
フアシェンス形質転換系により形質転換し、耐カナマイ
シン タバコ植物を再生した。トランスゲニック植物に
おけるwun1−PSI 遺伝子の検出：サザンブロット分析に
より、wun1−PSI トランスゲニック タバコ植物をwun1
−PSI のタバコ ゲノムへの正しい組込みについて研究
した。図９に示すように、トランスゲニック タバコ植
物からのハイブリッド形成DNA バンドの大きさは導入フ
ラグメントの大きさに相当する。それ故、wun1−PSI の
タバコ ゲノムへの正しい組込みは予想される。
を介してバイナリー ベクター pPR69にクローン化し、
これを「wun1−PSI in pPR69」で示す。wun1−PSI in p
PR69はタバコ植物におけるアグロバクテリウム トゥメ
フアシェンス形質転換系により形質転換し、耐カナマイ
シン タバコ植物を再生した。トランスゲニック植物に
おけるwun1−PSI 遺伝子の検出：サザンブロット分析に
より、wun1−PSI トランスゲニック タバコ植物をwun1
−PSI のタバコ ゲノムへの正しい組込みについて研究
した。図９に示すように、トランスゲニック タバコ植
物からのハイブリッド形成DNA バンドの大きさは導入フ
ラグメントの大きさに相当する。それ故、wun1−PSI の
タバコ ゲノムへの正しい組込みは予想される。
【００６０】トランスゲニック タバコ植物におけるPS
I 遺伝子形質発現の決定：50μg の全RNA を菌感染wun1
−PSI トランスゲニック タバコ葉から分離し、PSI −
mRNAの存在について研究した（図１０）。PSI −mRNAは
非形質転換タバコ植物において検出されず、葉は無傷で
あるかどうかにかかわりなく、害され、または菌に感染
された。菌に感染されたトランスゲニック植物のタバコ
葉において、PSI でハイブリット形成されるRNA バンド
が生ずる。
I 遺伝子形質発現の決定：50μg の全RNA を菌感染wun1
−PSI トランスゲニック タバコ葉から分離し、PSI −
mRNAの存在について研究した（図１０）。PSI −mRNAは
非形質転換タバコ植物において検出されず、葉は無傷で
あるかどうかにかかわりなく、害され、または菌に感染
された。菌に感染されたトランスゲニック植物のタバコ
葉において、PSI でハイブリット形成されるRNA バンド
が生ずる。
【００６１】wun1−PSI −トランスゲニック タバコ植
物のリゾクトニア ソナニイによる感染：種々のwun1−
PSI −トランスゲニック植物をそれぞれ約10cm大きさの
植物としてリゾクトニア ソラニイで感染した土壌に植
えた（５ｇ／５ｌ土壌）。植物の大きさを毎日調べ（植
物の植物的成長点−土壌距離）、植物の成長を次の約２
週間目に記録した。対照植物として、次に示す非形質転
換タバコ植物を用いた： 1. リゾクトニア ソラニイで感染した土壌に植えた非
形質転換タバコ植物（５ｇ／５ｌ土壌）; 2. リゾクトニア ソラニイを加えない土壌に植えた非
形質転換タバコ植物。
物のリゾクトニア ソナニイによる感染：種々のwun1−
PSI −トランスゲニック植物をそれぞれ約10cm大きさの
植物としてリゾクトニア ソラニイで感染した土壌に植
えた（５ｇ／５ｌ土壌）。植物の大きさを毎日調べ（植
物の植物的成長点−土壌距離）、植物の成長を次の約２
週間目に記録した。対照植物として、次に示す非形質転
換タバコ植物を用いた： 1. リゾクトニア ソラニイで感染した土壌に植えた非
形質転換タバコ植物（５ｇ／５ｌ土壌）; 2. リゾクトニア ソラニイを加えない土壌に植えた非
形質転換タバコ植物。
【００６２】図１１は相当する条件下での個々の植物の
成長状態を示している。非形質転換タバコ植物の成長速
度はリゾクトニア ソラニイ含有土壌において極めて低
い。これに対して、wun1−PSI −トランスゲニック タ
バコ植物はリゾクトニア ソラニイ含有土壌において実
質的に高い成長を示している。成長速度は、菌を含まな
い土壌で栽培した非形質転換タバコ植物の速度よりわず
かに低い。
成長状態を示している。非形質転換タバコ植物の成長速
度はリゾクトニア ソラニイ含有土壌において極めて低
い。これに対して、wun1−PSI −トランスゲニック タ
バコ植物はリゾクトニア ソラニイ含有土壌において実
質的に高い成長を示している。成長速度は、菌を含まな
い土壌で栽培した非形質転換タバコ植物の速度よりわず
かに低い。
【００６３】図１２は図１１に示す個々の数値から得た
統計的平均値を示している。
統計的平均値を示している。
【００６４】図１３はタバコ植物の種々の条件における
平均の成長状態を示している。約10日間において、非形
質転換タバコ植物はリゾクトニア ソラニイ含有土壌に
おいて約１cm伸びている。wun1−PSI −トランスゲニッ
ク タバコ植物はリゾクトニア ソラニイ含有土壌にお
いて約10日間に約４cm伸びている。リゾクトニア ソラ
ニイを含まない土壌で栽培した非形質転換タバコ植物は
約10日間で約６cm伸びている。
平均の成長状態を示している。約10日間において、非形
質転換タバコ植物はリゾクトニア ソラニイ含有土壌に
おいて約１cm伸びている。wun1−PSI −トランスゲニッ
ク タバコ植物はリゾクトニア ソラニイ含有土壌にお
いて約10日間に約４cm伸びている。リゾクトニア ソラ
ニイを含まない土壌で栽培した非形質転換タバコ植物は
約10日間で約６cm伸びている。
【００６５】例２ 細菌過剰生産物からPSI タンパク質の分離および精製 PSI タンパク質の細菌過剰生産物についての１例の適当
なプラスミドをプラスミドpKK223-3（製造者：ファマジ
ア(Pharmazia) 。例えば、IPTG（イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシド誘導tac −プロモーターPSI タンパ
ク質を生成する。tac −プロモーターのすぐ後ろの種々
の制限点はPSI 遺伝子とtac −プロモーターとを転写融
合する。強いリボソーム ターミネーター(rrn) は規定
された終結(stoppage)として作用する。
なプラスミドをプラスミドpKK223-3（製造者：ファマジ
ア(Pharmazia) 。例えば、IPTG（イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシド誘導tac −プロモーターPSI タンパ
ク質を生成する。tac −プロモーターのすぐ後ろの種々
の制限点はPSI 遺伝子とtac −プロモーターとを転写融
合する。強いリボソーム ターミネーター(rrn) は規定
された終結(stoppage)として作用する。
【００６６】PSI 遺伝子を５′３′−配向においてEcoR
I 切断点を介してpKK233-3のEcoRI切断点にクローン化
し、JM105 細菌に形質転換した。これらの細菌を100 ml
のLB培地（ 50 mg／mlアンペシリン）において37℃で成
長させ、しかる後にIPTGと混合した（2.5 mM 最終濃
度）。さらに、37℃で４時間にわたって温置した。しか
る後に、100 mlの細菌培養物を2500 rpmで15分間にわた
って遠心分離し（クリスト遠心機、４℃）、細菌ペレッ
トを50 mM トリス pH 8.0 に入れた。懸濁物を、粘度が
明らかに低下するまで、超音波で音波処理した（60％パ
ルスで２分間、数回にわたり）。次いで、「方法」およ
び「PSI タンパク質の分離および精製」の項目に記載し
ているようにして、PSI タンパク質を40〜70％(NH4)2SO
4 で沈殿させ、イオン交換クロマトグラフィー、例えば
CM52 で精製した。精製および無菌−濾過タンパク質は
ヒトおよび動物の治療に用いる注入溶液の調製に適当で
あった。
I 切断点を介してpKK233-3のEcoRI切断点にクローン化
し、JM105 細菌に形質転換した。これらの細菌を100 ml
のLB培地（ 50 mg／mlアンペシリン）において37℃で成
長させ、しかる後にIPTGと混合した（2.5 mM 最終濃
度）。さらに、37℃で４時間にわたって温置した。しか
る後に、100 mlの細菌培養物を2500 rpmで15分間にわた
って遠心分離し（クリスト遠心機、４℃）、細菌ペレッ
トを50 mM トリス pH 8.0 に入れた。懸濁物を、粘度が
明らかに低下するまで、超音波で音波処理した（60％パ
ルスで２分間、数回にわたり）。次いで、「方法」およ
び「PSI タンパク質の分離および精製」の項目に記載し
ているようにして、PSI タンパク質を40〜70％(NH4)2SO
4 で沈殿させ、イオン交換クロマトグラフィー、例えば
CM52 で精製した。精製および無菌−濾過タンパク質は
ヒトおよび動物の治療に用いる注入溶液の調製に適当で
あった。
【図１】オオムギからCHI , BGL およびPSI タンパク質
を精製する電気泳動分離状態を示すグラフである。
を精製する電気泳動分離状態を示すグラフである。
【図２】Ａは精製タンパク質による菌トリコダーマ リ
ーセイの成長試験の結果を示すグラフであり、およびＢ
は精製タンパク質による菌フサリウム スポロトリチオ
イデスの成長試験の結果を示すグラフである。
ーセイの成長試験の結果を示すグラフであり、およびＢ
は精製タンパク質による菌フサリウム スポロトリチオ
イデスの成長試験の結果を示すグラフである。
【図３】PSI −cDNAクローンのヌクレオチド配列を示す
配列図である。
配列図である。
【図４】PSI −cDNAクローンのヌクレオチド配列を示す
図３から連続して続く配列図である。
図３から連続して続く配列図である。
【図５】不完全PS1 −cDNAクローンのヌクレオチド配列
を示す配列図である。
を示す配列図である。
【図６】オオムギ ゲノムにおけるPSI 遺伝子の組織状
態を示す組織図である。
態を示す組織図である。
【図７】オオムギにおけるPSI −RNA の発生特異および
器官特異発現状態を示す状態図である。
器官特異発現状態を示す状態図である。
【図８】pPR69 におけるキメラ遺伝子wun1−PSI の構造
地図である。
地図である。
【図９】wun1−PSI −トランスゲニック タバコ植物の
サザンブロット分析の結果を示すグラフである。
サザンブロット分析の結果を示すグラフである。
【図１０】wun1−PSI −トランスゲニック タバコ植物
のノーザンブロット分析の結果を示すグラフである。
のノーザンブロット分析の結果を示すグラフである。
【図１１】リゾクトニア ソラニイで感染したタバコ植
物の成長速度の状態を示す棒グラフである。
物の成長速度の状態を示す棒グラフである。
【図１２】リゾクトニア ソラニイ感染タバコ植物の平
均成長速度の状態を示す棒グラフである。
均成長速度の状態を示す棒グラフである。
【図１３】リゾクトニア ソラニイ感染タバコ植物の茎
の平均成長状態を示すグラフである。
の平均成長状態を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年９月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】オオムギ ゲノムにおけるPSI 遺伝子の構成を
示す電気泳動後のオートラジオグラフである。
示す電気泳動後のオートラジオグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】オオムギにおけるPSI −RNA の発生に特異的な
さらに器官に特異的な発現状態を示す電気泳動後のオー
トラジオグラフである。
さらに器官に特異的な発現状態を示す電気泳動後のオー
トラジオグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】wun1−PSI −トランスジェニック タバコ植物
のサザンブロット分析の結果を示すゲル電気泳動後のオ
ートラジオグラフである。
のサザンブロット分析の結果を示すゲル電気泳動後のオ
ートラジオグラフである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】wun1−PSI −トランスジェニック タバコ植
物のノーザンブロット分析の結果を示すゲル電気泳動後
のオートラジオグラフである。
物のノーザンブロット分析の結果を示すゲル電気泳動後
のオートラジオグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 ジェフ シェール ドイツ連邦共和国 5000 ケルン 30 カ ルル−フォン−リンネ−ヴェーク 10 (72)発明者 ユルゲン ロゲマン ドイツ連邦共和国 5000 ケルン 30 ド ンファヘンヴェーク ９ (72)発明者 ギド ヤクッ ドイツ連邦共和国 5000 ケルン １ マ テルヌスシュトラーセ 22 (72)発明者 イョハン ムンディ デンマーク国 1760 コペンハーゲン ネ カールスベルグ ヴェイ ６ フィフス フロアー
Claims (8)
- 【請求項１】 タンパク質合成阻害遺伝子、またはタン
パク質合成阻害遺伝子のまたはタンパク質合成阻害タン
パク質の細胞に特異的付着するリガンドによる融合生成
物を、植物の遺伝子型に活性プロモーターの制御下で導
入することを特徴とする耐病原性植物の生産方法。 - 【請求項２】 タンパク質合成阻害遺伝子として、植物
から分離したタンパク質合成阻害遺伝子を用いる請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 タンパク質合成阻害遺伝子として、オオ
ムギ植物から分離し、かつ表１に示すDNA 配列を有する
タンパク質合成阻害遺伝子を用いる請求項３記載の方
法。 【表１】 【表２】 - 【請求項４】 請求項３に記載する表１に示す挿入DNA
配列を有するDNA トランスファー ベクター。 - 【請求項５】 請求項３に記載する表１に示す挿入DNA
配列を有するDNA 発現ベクター。 - 【請求項６】 請求項１，２および３のいずれか一つの
項に記載する方法によって変性した遺伝子型を有する植
物および植物部分。 - 【請求項７】 耐病原性を生ずる薬剤の製造のために、
病原感染の撲滅のためにおよび／または変性細胞の撲滅
のために、タンパク質合成阻害遺伝子を細菌過剰生産物
に導入して得たタンパク質合成阻害タンパク質の使用方
法。 - 【請求項８】 請求項７に記載するタンパク質合成阻害
タンパク質の注入溶液の形態での使用方法。
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