ES2198401T3 - Procedimiento para la produccion de plantas resistentes a agentes patogenos. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de plantas resistentes a agentes patogenos.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR PLANTAS DE RESISTENCIA PATOGENA , EN EL CUAL SE INTRODUCE EN LA BASE GENETICA DE LAS PLANTAS, BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR ACTIVO, UN GEN INHIBIDOR DE LA SINTESIS PROTEINICA O UN PRODUCTO DE LA FUSION DEL GEN INHIBIDOR DE LA SINTESIS PROTEINICA O DE LA PROTEINA INHIBIDORA DE LA SINTESIS PROTEINICA CON LIGANDURAS QUE POSIBILITAN EL ADICIONAMIENTO ESPECIFICO EN CELULAS. SE DESCRIBE ADEMAS EL EMPLEO DE LA PROTEINA INHIBIDORA DE LA SINTESIS PROTEINICA OBTENIDA MEDIANTE LA INTRODUCCION DEL GEN INHIBIDOR DE LA SINTESIS PROTEINICA EN SOBREPRODUCTORES BACTERIANOS PARA LA PRODUCCION DE PREPARADOS FARMACEUTICOS.
Description
Procedimiento para la producción de plantas
resistentes a agentes patógenos.
La invención trata de un procedimiento para la
producción de plantas resistentes a agentes patógenos, de plantas y
partes vegetales producidas según el procedimiento, de nuevos
vectores de transferencia de ADN y vectores de expresión de ADN,
así como, finalmente, del uso de una proteína inhibidora de la
síntesis de proteínas para la preparación de preparados
farmacéuticos.
De, por ejemplo, Ann. Rev. Plant. Physiol. 1979,
30:105-130 y Ann. Rev. Plant. Physiol. 1984,
35:34-275, se sabe que las plantas usan los
mecanismos más diversos para protegerse de las infecciones causadas
por agentes patógenos. Estos mecanismos incluyen, por ejemplo,
modificaciones en la estructura de la pared celular, la síntesis de
fitoalexinas de efecto tóxico, la acumulación de las denominadas
proteínas PR (Pathogenesis-related proteins,
proteínas relacionadas con la patogénesis), inhibidores de la
proteasa, así como enzimas con funciones hidrolíticas.
Asimismo se sabe, por ejemplo de Biochem. J.
1983, 216:617-625, que diversas plantas son capaces
de producir proteínas que poseen la capacidad de inhibir los
ribosomas de eucariotas. La característica de tales proteínas
inhibidoras de la síntesis de proteínas es que no influyen en los
ribosomas propios de las plantas, mientras que inactivan los
ribosomas extraños para las plantas. Las proteínas de este tipo se
han conocido especialmente por el nombre de proteínas ``RIP''
(proteínas inhibidoras de ribosomas). De la mayoría de estas
proteínas se conocen únicamente su peso molecular y su modo de
acción.
Las plantas en las que se han encontrado
proteínas RIP incluyen también, entre otras, la cebada. Así, en
Carlsberg Res. Commun. Vol. 51, 1986, pág. 129-141,
se describen la proteína purificada, el peso molecular de la misma,
así como la secuencia de aminoácidos del inhibidor II de las
síntesis de proteínas.
Asimismo se sabe, por ejemplo de Biochimica et
Biophysica Acta 880, 1986, pág. 161-170, que
las proteínas RIP son capaces de inhibir agentes patógenos in
vitro.
Al estudiar concretamente las plantas de cebada,
se identificaron los genes que codifican los inhibidores de la
síntesis de proteínas (PSI). Se descubrió que estos genes de PSI
codifican proteínas PSI que son capaces de bloquear eficazmente la
síntesis de proteínas de fitopatógenos.
Asimismo se descubrió que, por ejemplo, los genes
de PSI aislados de plantas de cebada se pueden fusionar con los
promotores activos más diversos, por ejemplo con el promotor wunl,
que se describe con más detalle en ``The Plant Cell 1'', 1989, pág.
151-158, y que tales fusiones de
promotor-gen se pueden incorporar en el material
genético de las plantas y se pueden producir plantas transgénicas
que muestran una nueva resistencia a agentes patógenos
adquirida.
También se descubrió que la proteína PSI se puede
usar también para la preparación de preparados farmacéuticos que se
pueden usar en el tratamiento de seres humanos y animales que estén
infestados por agentes patógenos fúngicos, bacterianos, víricos u
otros.
Mediante la introducción del gen de PSI en
bacterias superproductoras se puede producir la proteína PSI en
grandes cantidades. La proteína PSI purificada se puede introducir
en la vía sanguínea del ser humano o del animal en forma de
soluciones para infusión. La proteína PSI inhibe el agente patógeno
(como, por ejemplo, los virus del SIDA) sin dañar el organismo. La
especificidad de la proteína PSI por un agente patógeno se puede
aumentar dado el caso acoplando la proteína PSI con anticuerpos
específicos de un agente patógeno.
El uso de la proteína PSI permite también el
tratamiento de células transformadas (cáncer) en humanos o
animales. Así, se puede introducir en la vía sanguínea la proteína
PSI purificada o la proteína PSI acoplada con anticuerpos que
reconocen específicamente células transformadas, para destruir las
células transformadas.
Las soluciones para infusión adecuadas se pueden
preparar en este caso según los procedimientos habituales y
conocidos para la preparación de soluciones acuosas para
infusión.
El objeto de la invención son, en consecuencia,
un procedimiento para la producción de plantas resistentes a
agentes patógenos tal y como se caracteriza en las
reivindicaciones, nuevos vectores de transferencia de ADN y vectores
de expresión de ADN, así como plantas y partes vegetales que se
pueden producir según el procedimiento de acuerdo con la
invención.
El objeto de la invención es asimismo el uso de
la proteína inhibidora de la síntesis de proteínas obtenida por
introducción del gen del inhibidor de la síntesis de proteínas en
bacterias superproductoras para la preparación de preparados
farmacéuticos para la creación de resistencias a agentes patógenos
para combatir la infestación patógena y/o las células
transformadas.
Los fitopatógenos típicos cuya síntesis de
proteínas se puede inhibir mediante la incorporación de un gen de
PSI son, por ejemplo, los hongos Trichoderma reesei y
Fusarium sporotrichioides. (Se remite a la revisión en M.
Klinkowski, E. Mühle, E. Reinmuth y H. Bochow: ``Phytopathologie und
Pflanzenschutz I + II'', Akademie-Verlag, Berlín,
1974).
Se sabe que los hongos fusarium infestan
principalmente especies de cereales y plantas de maíz, mientras que
los hongos del género Trichoderma se encuentran
fundamentalmente sobre granos de maíz.
Se ha observado sorprendentemente que las
propiedades inhibidoras de agentes patógenos de los genes de PSI
aislados, por ejemplo, de plantas de cebada también se pueden
aplicar a plantas de otras especies. Así, por ejemplo, se descubrió
que un gen de PSI aislado de cebada se puede incorporar en el
material genético de plantas de tabaco bajo el control de un
promotor activo, por ejemplo del promotor wunl. Las plantas de
tabaco que como consecuencia de ello producen la proteína PSI
muestran nuevas propiedades de resistencia adquiridas contra, por
ejemplo, el fitopatógeno Rhizoctonia solani.
Rhizoctonia causa la denominada hipocnosis (infestación de
tallo y raíz) en diversas plantas, incluidas las plantas de la
patata y del tabaco. De este modo, las propiedades de resistencia
adquiridas en plantas están correlacionadas directamente con la
expresión de los genes de PSI.
Los genes inhibidores de la síntesis de proteínas
se pueden aislar, por ejemplo, de todas las plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas, además de la cebada, y se pueden
fusionar con los promotores activos más diversos como, por ejemplo,
promotores inducibles por agentes patógenos, promotores
constitutivos, promotores específicos del desarrollo, promotores
específicos de órganos y promotores inducibles.
Como plantas en cuyo material genético se pueden
introducir los nuevos genes del inhibidor de la síntesis de
proteínas bajo el control de un promotor activo pueden mencionarse
a modo de ejemplo:
- -
- todas las plantas monocotiledóneas útiles como, por ejemplo, las plantas de cereales
- -
- todas las plantas dicotiledóneas útiles como, por ejemplo, las solanáceas y cucurbitáceas.
Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la
invención se especialmente adecuado para la producción de plantas
resistentes a agentes patógenos. Sin embargo, con la expresión del
gen del inhibidor de la síntesis de proteínas se puede lograr
también una resistencia a insectos, hongos, bacterias, virus y
viroides en el ser humano y en los animales.
Para la realización del procedimiento de acuerdo
con la invención resulta adecuado, según una configuración
ventajosa, un gen del inhibidor de la síntesis de proteínas que
presenta la secuencia de ADN representada en la Fig. 3A. Sin
embargo, el experto reconocerá que para alcanzar el objetivo
propuesto también se pueden usar secuencias de ADN similares además
de esta secuencia de ADN, por ejemplo una secuencia de ADN según la
Fig. 3B, que en la región 5' se ha completado con un clon de ADNc
correspondiente.
La invención se explicará a continuación con más
detalle a modo de ejemplo mediante el aislamiento de un gen de PSI
de cebada, la fusión de este gen con un promotor activo y la
transferencia del producto de fusión al material genético de
plantas de tabaco.
Las figuras sirven para explicar con más detalle
la invención. En detalle representan:
Fig.
1
Se muestra la separación por electroforesis en
gel de SDS de las fracciones proteicas que se han obtenido en la
purificación de la proteína CHI (carriles 2-5), la
proteína PSI (carriles 7-11) y la proteína BGL
(carriles 13-17) de semillas de cebada. Las
proteínas correspondientes se pueden detectar con la ayuda de
anticuerpos específicos. En este caso significan:
% (NH_{4})_{2}SO_{4}: Proteínas
precipitadas con la sal.
% sup: Proteínas no precipitadas con la sal.
CM: Proteínas que no se han unido a la columna
CM.
fra: Fracción proteica de la columna CM.
pur.: Proteína altamente pura.
MW: Patrón de tamaños de proteínas en
kDalton.
\newpage
Fig.
2
Se cultivaron esporas de Trichoderma
reesei (A) y Fusarium sporotrichioides (B) en un volumen
total de 135 \mul de medio/pocillo de una placa de
microvaloración y se añadieron 0,05 a 1,5 \mug de la proteína
indicada en cada caso. Cada punto es el resultado de 5 mediciones
independientes con unas desviaciones típicas relativas de 3,6% en
(A) y 7,3% en (B). El 100% de crecimiento de los hongos produce una
DO_{540} de 0,40 (A) y 0,41 (B).
Fig.
3
A: El clon de ADNc tiene un tamaño de 1078
nucleótidos. Contiene una región 5' no traducida de 42 pb, un marco
de lectura abierto de 843 pb (el codón de terminación está marcado
con *) y un extremo 3' no traducido de 193 pb. Las posibles señales
de poliadenilación están subrayadas. La secuencia de aminoácidos
que resulta del marco de lectura abierto se indica debajo de la
secuencia correspondiente.
B: Secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de
PSI incompleto. Las posibles señales de poliadenilación están
subrayadas.
Fig.
4
El ADN de embriones de cebada se cortó con
diferentes enzimas de restricción, se separó por electroforesis en
gel, se transfirió a membranas de nilón y se hibridó con ADNc de
PSI radiomarcado. Del número de bandas hibridadas se pueden sacar
conclusiones acerca del número de copias del PSI en el genoma. El
patrón de tamaños se da en kilopares de bases (Kb).
Fig.
5
Se aisló ARN de diferentes órganos de plantas de
cebada, así como a diferentes estadios de desarrollo de las
semillas de cebada. Tras la separación por electroforesis en gel,
el ARN se hibridó con ADNc de PSI radiomarcado mediante el
``procedimiento de transferencia Northern''. El ARN de PSI se puede
detectar específicamente como ARN de 1,3 kb en el endospermo que
contiene almidón durante el desarrollo tardío de la semilla. DPA
representa en este caso días tras la antesis.
Fig.
6
El promotor wunl (``Pwunl''; tamaño
aproximadamente 1.200 pb) se ha fusionado por transcripción con el
gen de PSI (``PSI''; tamaño aproximadamente 1070). Por razones de
estabilidad del ARN se ha fusionado en 3' del gen de PSI un resto
del gen CAT (``x''; tamaño aproximadamente 500 pb), así como una
señal de poliadenilación (``pA''; tamaño aproximadamente 200 pb).
Esta construcción se clonó en el vector binario pPR69.
Fig.
7
Para poder analizar la integración correcta del
ADN de wunl-PSI en el genoma de tabaco se aisló el
ADN de las plantas de tabaco transgénicas wunl-PSI y
se cortó con EcoRI. Tras la separación del ADN por electroforesis
en gel y la transferencia del ADN a membranas de nilón se hibridó
con ADNc de PSI radiactivo. Las plantas marcadas con (+) muestran
una integración correcta del ADN de wunl-PSI. El
tamaño de la banda hibridada es de 1,07 kb y es idéntico al tamaño
del ADN plasmídico de wunl-PSI en pPR69 aplicado
como control (K). Las plantas marcadas con (-) se desecharon a
causa de la presencia de bandas de ADN adicionales o
incorrectas.
Fig.
8
Se separaron por electroforesis en gel 100 \mug
de ARN de hojas de plantas de tabaco infectadas por Rhizoctonia
solani, se transfirieron a membranas de nilón y se hibridaron
con ADNc de PSI radioactivo. En la autorradiografía se puede
observar una banda de ARN de PSI en las plantas de tabaco
transgénicas wunl-PSO (PSI-7;
PSI-18). En las plantas de tabaco no transformadas
(K) no se puede detectar ARN de PSI.
Fig.
9
Cada barra expuesta representa el crecimiento de
una planta de tabaco durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 10 días. A partir de la pendiente de la curva de
crecimiento se calculó el lnx100 de manera que el valor obtenido
representa la tasa de crecimiento. ``inf. SRI'': Tabaco no
transformado que se infectó con Rhizoctonia solani. ``Inf.
RIP'': Tabaco transgénico wunl-PSI que se infectó
con Rhizoctonia solani. ``uninf. SRI'': Tabaco no
transformado que no se infectó.
Fig.
10
Representación de las tasas medias de crecimiento
que se calcularon a partir de los valores individuales mostrados en
la Fig. 9.
Fig.
11
Comportamiento de crecimiento medio de 10 plantas
de tabaco transgénicas wunl-PSI independientes
(``PSI'') y 10 plantas de tabaco no transformadas (``SRI'') tras la
infección con Rhizoctonia solani. En la abscisa se indica la
longitud de los tallos (hasta el punto de vegetación), la ordenada
indica el número de días tras la infección.
Para el cultivo de bacterias se usaron los medios
descritos con más detalle por Maniatis, T. y col. en ``Molecular
cloning: a laboratory manual'', Cold Spring Harbour Laboratory,
Cold Spring Harbour, Nueva York (1982).
Los medios usados derivan de los medios (MS)
indicados por Murashige, T. y col., en ``A rapid method for growth
and bioassays with tobacco tissue cultures''; Physiol. Plant.,
15:473-497 (1962).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
3MS : \+ MS + 3% de sacarosa\cr 3MSC : \+ MS + 3% de sacarosa, 500
\mu g/ml de claforan\cr 3MC15 : \+ MS + 2% de sacarosa, 500
\mu g/ml de claforan, + 100 \mu g/ml de\cr \+ sulfato de
canamicina\cr MSC16: \+ MS + 0,5 \mu g/ml de BAP + 0,1 \mu g/ml
de NAA + 100 \mu g/ml de\cr \+ sulfato de canamicina + 500
\mu g/ml de
claforan\cr}
Para un medio sólido se añadieron además 8 g/l de
bacto-agar.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
BMH 71-18: \+
delta(lac-proAB), thi, supE;\cr \+ F'(laciª,
ZdeltaM15,
proA ^{+} B ^{+} )\cr}
Se remite a: Messing, J. y col. ``Plant Gene
Structure'' en: Kosuge, F., Meredith, C.P., Hollaender, A.
(editores). Genetic engineering of plants. Plenum Press, Nueva
York: 211-227 (1983).
LBA 44D4: (Hoekema y col., Nature
303:179-180 (1983))
pUC8 (Vieira y Messing en ``The puc plasmid, an
M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and
sequencing with synthetic universal primers'' Gene,
19:259-268 (1982)).
pPR69 [un derivado de bin 19, véase ``Bevan, M.
Binary Agrobacterium vectors for plant transformation'', Nucl.
Acids Res. 12:8711-8721 (1984)].
Hordeum vulgare L. cv. Piggy
Nicotiana tabacum SRI
Salvo que se indique otra cosa, todos los
procedimientos convencionales de biología molecular, como, por
ejemplo, el análisis de restricción, el aislamiento de plásmidos,
la minipreparación de ADN plasmídico, la transformación de
bacterias, etc., se realizaron como se describe en Maniatis y col.
(1982).
Se cosecharon semillas de cebada maduras
(Hordeum vulgare L. cv. Piggy) a diferentes tiempos tras la
antesis, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a
-80ºC.
A partir de 10 kg de semillas de cebada maduras
se elabora harina fina (tamaño de partícula: diámetro inferior a
0,5 mm). Tras añadir 100 litros de tampón de extracción (tampón
fosfato 50 mM, pH 6,5; NaCl 100 mM; ácido ascórbico 2,5 mM; EDTA
2,5 mM; betamercapto-EtOH 3 mM) y agitar durante 2
horas a 4ºC el sobrenadante se elimina por filtración. Para ello,
el volumen del sobrenadante se concentra a 6 litros con la ayuda de
una ultracentrífuga (filtros usados: membranas DDS (membranas de
ultrafiltración de polisulfona) que retienen todas las proteínas
inferiores a 20 kDa). El sobrenadante se precipita ahora con
(NH_{4})_{2}SO_{4} al 40-70%. El
sedimento obtenido se disuelve en PMSF 80 mM y se dializa contra
tampón fosfato sódico 2 mM, pH 6,5, al que se añadió PMSF 80 mM.
Ahora la solución de proteínas se carga en CM52 (empresa: Whatman)
mediante una cromatografía de intercambio iónico y se eluye con
fosfato sódico 50 mM que contiene concentraciones crecientes de
NaCl (NaCl 0,05 a 1,0 M en más de 10 pasos de elución).
Se hicieron germinar semillas de cebada durante
12 días, se liofilizaron y se procesaron con tampón de extracción
(véase anteriormente) (1,6 kg de semillas/25 litros de tampón de
extracción). Tras una precipitación con
(NH_{4})_{2}SO_{4} al 40%, el sobrenadante se dializó y
se purificó a través de una columna CM52 y Mono-S.
La proteína BGL aislada se ensayó respecto a la pureza mediante
transferencias Western y secuenciación
N-terminal.
Los anticuerpos se generaron en conejos contra la
proteína PSI-II purificada según procedimientos
convencionales.
Se cultivaron Trichoderma reesei y
Fusarium sporotrichioides (colección ATCC, Rockville) a 25ºC
en agar con dextrosa de patata (empresa Difco). Las esporas de los
cultivos de 8 días de edad se recogieron según el método de
Broekaert, W.F. y col. ``An automated quantitative assay for fungal
growth inhibition.'' FEMS Micobiology Letters (1990), y se
almacenaron a -20ºC en glicerol al 20%. En el marco del ensayo de
crecimiento de hongos se añadieron a una suspensión de esporas
(10.000 esporas/ml) 100 \mul de solución de dextrosa de patatas,
así como 35 \mul de una fracción proteica a ensayar y se incubó a
25ºC. Según describen Broekaert y col., el crecimiento del hongo
está correlacionado de forma lineal con el aumento de la densidad
óptica a 540 nm. Las fracciones proteicas con efecto inhibidor del
crecimiento de los hongos producen, por lo tanto, un aumento de la
densidad óptica menor que las fracciones proteicas sin efecto.
A partir de semillas de cebada maduras
(Hordeum vulgare L cv. Piggy) se aisló ARN poliA^{+} y se
estableció un banco de expresión de ADNc en fagos
lambda-gt-11. Se remite a Leah, R. y
Mundy, J. ``The biofunctional a-mylase/subtilisin
inhibitor of barley: nucleotide sequence and patterns of
seed-specific expression''. Plant Mol. Biol.
12:673-682 (1989). Con la ayuda de anticuerpos PSI
monoespecíficos (véase Mundy, J. y col. ``Differential synthesis
in vitro of barley aleurone ans starchy endosperm proteins''.
Plant Physiol. 81:630-636 (1986)) se identificaron
los clones de ADNc que contenían PSI.
Los fagos
lambda-gt-11 positivos respecto a
PSI se separaron, se subclonaron y se secuenciaron según el
procedimiento de secuenciación del didesoxinucleótido de Sanger y
col., ``DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors''. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74:5463-5467 (1977).
El ADN clonado en E. coli se transfirió a A.
tumefaciens LBA4404 (véase Hoekema y col. ``A binary plant vector
strategy based on separation of virano T-region of
A. tumefaciens'', Nature 303:179-180 (19983)) por
conjugación según el procedimiento descrito por Van Haute y col. en
el trabajo ``Intergenic transfer and exchange recombination of
restriction fragments cloned in pBR322: a novel strategy for
reversed genetics of Ti-plasmids of Agrobacterium
tumefaciens'', EMBO J. 2:411-418 (1983).
La comprobación de la transferencia de ADN a la
agrobacteria se llevó a cabo mediante el aislamiento del ADN de
agrobacterias según el procedimiento descrito por Ebert y col. en
``Identification of an essential upstream element in the nopalin
synthase promoter by stable and transient assays''. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:5745-5749 (1987). La disociación
del ADN por restricción, la transferencia a nitrocelulosa y la
hibridación con la sonda radiactiva correspondiente informaron del
éxito de la transferencia de ADN a la agrobacteria.
Las agrobacterias LBA4404 necesarias para la
infección se cultivaron en medio selectivo de antibióticos (véase
Zambrisky y col. ``Ti-Plasmid vector for the
introduction of DNA into plant cells without alteration of their
normal capacity''. EMBO J. 1:147-152 (1983)), se
sedimentaron por centrifugación y se crecieron en medio YEB sin
antibióticos (YEB = 0,5% de extracto de carne; 0,2% de extracto de
levaduras; 0,5% de peptona; 0,5% de sacarosa; MgSO_{4} 2 mM). Tras
una nueva sedimentación y suspensión en medio 3MS se pudieron usar
las bacterias para la infección.
Para la infección de hojas en rodajas se usaron
hojas estériles de las líneas de tabaco SRI. Se sumergieron trozos
de hoja de aproximadamente 1 cm en la suspensión de agrobacterias
antes descrita y a continuación se transfirieron a medio 3MS. Tras
incubar durante 2 días a 16 horas de luz y 25ºC a 27ºC los trozos
de hoja se transfirieron a medio MSC16. Los brotes aparecidos al
cabo de 4 a 6 semanas se cortaron y se transfirieron a medio MSC15.
Los brotes con formación de raíz se siguieron analizando.
El material vegetal se tritura en mortero con
nitrógeno líquido, se le añaden 10 volúmenes de tampón de
extracción (Tris-HCl 10 mM (pH 8); NaCl 100 mM, EDTA
1 mM, proteinasa K; RNasa pancreática) y se incuba, se extrae con
fenol y el sobrenadante se precipita con EtOH. La digestión de
restricción del ADN aislado, la separación del ADN por
electroforesis en gel con agarosa y la transferencia del ADN a una
membrana de nilón se describen en Maniatis y col. (1982). La
hibridación con muestras de ADN radiomarcadas se llevó a cabo según
un procedimiento descrito por Logemann y col. en el trabajo
``Improved method for the isolation of RNA from plant tissues'',
Anal. Biochem. 163:16-20 (1987).
El aislamiento de ARN total, así como de ARN
poliA^{+}, se llevó a cabo según Leah y Mundy y col. (1989). La
separación por electroforesis en gel con geles de formaldehído, la
transferencia a membranas de nilón, así como la hibridación con
muestras de ADN radiomarcadas se realizó según Maniatis y col.
(1982).
El aislamiento de ARN total de diferentes
órganos, la transferencia a membranas de nilón, así como la
hibridación con muestras de ADN radiomarcadas se llevó a cabo según
Logemann y col. (1987).
\newpage
Se trituró en mortero material de hoja
liofilizado en el tampón de extracción (Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1
mM; NaCl 100 mM; SDS 2%) y la concentración de proteína se ajustó a
1 mg/ml. La separación de la proteína por electroforesis en gel se
llevó a cabo con el sistema Phast-Gel
(Pharmacia), en el que se aplicó 1 \mug de proteína por
muesca. Las proteínas separadas se transfirieron a nitrocelulosa
(transferencia por difusión depositando la nitrocelulosa sobre el
gel de proteínas durante 20 minutos a 70ºC) y se analizaron usando
anticuerpos específicos (análisis mediante la técnica de
transferencia Western según el sistema Proto-Blot de
la empresa Promega).
El hongo Rhizoctonia solani se cultiva en
un medio líquido (agar con dextrosa de patata de la empresa Difco)
a 28ºC y se cosecha al cabo de 5 a 6 días. El medio se retira
mediante un embudo Büchner y un frasco de aspiración conectado. El
micelio del hongo que queda se divide con un bisturí en fragmentos
lo más pequeños posibles. Se pesa la cantidad deseada de micelio de
hongo y se mezcla a conciencia con 5 litros de tierra unificada
estéril. Esta tierra se distribuye en un cuenco y se plantan las
plantas que se van a ensayar. El crecimiento de las plantas se
halla cada 24 horas determinando la longitud del brote (distancia
suelo-punto de vegetación).
El aislamiento de las proteínas CHI y PSI de
semillas de cebada maduras (Hordeum vulgare L. cv. Piggy) se
describe en ``Procedimientos''. Las fracciones proteicas producidas
en el marco de los diversos pasos de purificación se aplicaron en
un gel de acrilamida desnaturalizante y las proteínas CHI o PSI se
visualizaron mediante anticuerpos CHI o PSI marcados con plata
(Fig. 1). Las proteínas CHI o PSI se pueden detectar tras la
precipitación con
\hbox{(NH _{4} ) _{2} } SO_{4}
al 40% y al 70% (carriles 2, 7), tras la separación siguiente
mediante Whatman CM52 (carriles 3, 4, 8) y tras la purificación
siguiente a través de una columna Mono-S (carriles
5, 9, 10, 11). Los carriles 9, 10, 11 de la Fig. 1 muestran que se
han aislado tres isoformas de PSI diferentes (PSI I, II, III) que
se caracterizan por su diferente comportamiento de flujo en la
columna CM52.
La actividad específica de la proteína CHI
purificada se determinó según Molano y col., ``A rapid and
sensitive assay for chitinase using tritiated chitin'', Anal..
Biochem. 88:548-656 (1977) y asciende a 22 mg de
diacetilquitobiosa/minuto/mg de proteína.
La proteína PSI purificada muestra la siguiente
actividad: 3 a 30 ng de PSI son capaces de inhibir 50% de la
traducción de ARN en lisados de reticulocitos.
La proteína BGL se purificó de la planta de
cebada nacida de semilla de 12 días de edad por precipitación con
(NH_{4})_{2}SO_{4}, separación a través de CM52 y una
columna de mono-S (véase ``Procedimientos'') y se
detectó con la ayuda de anticuerpos BGL (Fig. 1 carriles
13-17). La actividad específica de la proteína BGL
purificada asciende a 25 mg de equivalentes de glucosa/minuto/mg de
enzima.
Tal como se describe en ``Procedimientos'', se
cultivan diferentes especies de hongo en 135 \mul de medio para
hongos en placas de microvaloración (96 pocillos/placa) y su
crecimiento se sigue fotométricamente. Mediante la adición de
diferentes proteínas se puede analizar su influencia en el
crecimiento de los hongos.
La Fig. 2A representa el comportamiento de
crecimiento del hongo Trichoderma reesei. El uso de 1,2
\mug de PSI/pocillo inhibe el crecimiento de los hongos en tan
sólo 20%. Por el contrario, el crecimiento es inhibido en más de
95% cuando se combinan entre sí 0,25 \mug de cada una de las
proteínas PSI, CHI y BGL. También se obtiene una inhibición del 95%
mediante la combinación PSI/BGL (1,0 \mug de cada proteína) o
mediante la combinación PSI/CHI (1,5 \mug de cada proteína).
También el crecimiento de Fusarium
sporotrichioides es inhibido en un 95% cuando se combinan 0,25
\mug de cada una de las proteínas PSI, CHI y BGL (Fig. 2B). La
combinación PSI/CHI (1,0 \mug de cada proteína) inhibe el hongo en
la misma medida. Por el contrario, el uso de 1,5 \mug de PSI o
CHI o BGL solas produce inhibiciones significativamente menores. La
combinación PSI/BGL también tiene un ligero efecto.
Los datos hallados en las Fig. 2A y 2B muestran
que el uso de PSI solo presenta un efecto inhibidor relativamente
pequeño frente a los hongos aquí usados. Sin embargo, la
combinación con la quitinasa CHI (Fig. 2A, B) o con la glucanasa BGL
(Fig. 2A) intensifica considerablemente el efecto inhibidor.
Se aisló ARN poliA^{+} de semillas de cebada
maduras de la especie Hordeum vulgare L. cv. Piggy, se
transcribió en ADNc y se clonó en fagos
lambda-gt-11 (véase ``Materiales y
procedimientos''). Se pudo identificar un clon de ADNc de PSI
prácticamente completo usando anticuerpos PSI. La secuenciación del
clon de ADNc de PSI proporcionó los siguientes datos (Fig. 3A):
- El clon de PSI presenta una longitud de 1087
pb.
- El marco de lectura abierto rico en GC codifica
una proteína con un peso molecular de 29.976 Dalton.
- La proteína PSI no contiene ningún péptido
señal.
- La proteína PSI comienza con el aminoácido
metionina y coincide así con el comienzo proteico de la proteína
PSI presente en la naturaleza. Por lo tanto, cabe esperar que la
proteína PSI es una proteína citosólica.
La secuencia de ADN mostrada en la Fig. 3B está
incompleta, pero muestra altas homologías con el clon de ADNc según
la Fig. 3A y es adecuada para lograr el objetivo propuesto si la
secuencia de ADN mostrada se completa en la región 5' con un clon
de ADNc correspondiente.
El uso del clon de ADNc de PSI como sonda
radiactiva permite analizar el genoma de la cebada respecto a la
organización y el número de genes de PSI. Se aisló el ADN de
embriones de cebada, se cortó con diferentes enzimas de restricción
y se hibridó con la muestra de ADNc de PSI. Como se muestra en la
Fig. 4, hibridan principalmente tres fragmentos con PSI; por lo
tanto, se ha de contar con tres genes de PSI por genoma
haploide.
La expresión de ARNm de PSI en diferentes órganos
de plantas de cebada, así como en el marco del desarrollo de las
semillas, se determinó con la ayuda de análisis mediante la técnica
de transferencia Northern (véase ``Materiales y procedimientos'').
Como muestra la Fig. 5, las raíces, tallos y hojas de la cebada,
así como la capa aleurona de las semillas de cebada, no presentan
ARNm de PSI. Por el contrario, se encuentran grandes cantidades de
ARNm de PSI en el endospermo de las semillas con contenido en
almidón, siempre que la semilla se encuentre en un estadio de
desarrollo tardío. En el endospermo joven no existe ARNm de
PSI.
Como se describe en la Fig. 6, el clon de ADNc de
PSI se fusionó por transcripción con el promotor wunl inducible por
wund y el agente patógeno.
El promotor wunl (1022 pb), así como 179 pb de la
región 5' no traducida de wunl, se fusionaron con el clon de ADNc
de PSI aislado del banco de ADNc mediante EcoRI. El gen de PSI
dispone de una señal de poliadenilación propia cuya funcionalidad
en las plantas dicotiledóneas hasta ahora, sin embargo, sólo se
puede suponer. Detrás del gen de PSI se clonaron dos elementos
adicionales para aumentar la estabilidad del ARNm de PSI. 3' del
gen de PSI se fusionó una secuencia parcial del gen CAT
(CAT-cloranfenicolacetiltransferasa) de una
longitud de aproximadamente 500 pb. 3' de la secuencia parcial de
CAT se usó la señal de poliadenilación del gen 35S del virus del
mosaico de la coliflor como señal de terminación, cuya
funcionalidad en las plantas dicotiledóneas es conocida.
El gen quimérico wunl-PSI se
clonó mediante los sitios de corte de HindIII en el vector binario
pPR69, cuyo nombre es ahora ``wunl-PSI en pPR69''.
Wunl-PSI en pPR69 se transformó en plantas de
tabaco mediante el sistema de transformación de Agrobacterium
tumefaciens y se regeneró en plantas de tabaco resistentes a
canamicina.
Las plantas de tabaco transgénicas
wunl-PSI se estudiaron respecto a la integración
correcta de wunl-PSI en el genoma del tabaco con la
ayuda del análisis mediante la técnica de transferencia Southern.
Como muestra la Fig. 7, el tamaño de la banda de ADN que hibrida,
procedente de las plantas de tabaco transgénicas, corresponde al
tamaño del fragmento introducido. Por lo tanto, resulta probable la
integración correcta de wunl-PSI en el genoma del
tabaco.
Se aislaron en cada caso 50 \mug de ARN total
de hojas de tabaco transgénicas wunl-PSI infectadas
por hongos y se analizaron respecto a la presencia de ARNm de PSI
(Fig. 8). En las hojas de tabaco no transformadas (K) no se detectó
ARNm de PSI, independientemente de si las hojas estaban intactas,
dañadas o infectadas por hongos. En las hojas de tabaco de plantas
transgénicas infectadas por hongos se puede reconocer una banda de
ARN que hibrida con PSI. La detección de proteínas PSI en plantas
de tabaco transgénicas se llevó a cabo mediante el procedimiento de
transferencia Western.
\newpage
Se plantaron diferentes plantas transgénicas
wunl-PSI independientes en forma de plantas de un
tamaño de aproximadamente 10 cm en tierra que se había infectado
con Rhizoctonia solani (5 g/5 litros de tierra). El
crecimiento de las plantas se registró para las próximas 2 semanas
aproximadamente midiendo diariamente el tamaño de las plantas
(distancia: punto de vegetación de las
plantas-tierra). Como plantas de control sirvieron
plantas de tabaco no transformadas que
1. se plantaron igualmente en tierra infectada
por Rhizoctonia solani (5 g/5 litros de tierra);
2. se plantaron en tierra sin adición de
Rhizoctonia solani.
La Fig. 9 muestra el comportamiento de
crecimiento de las plantas individuales en las condiciones
correspondientes. La tasa de crecimiento de las plantas de tabaco
no transformadas es muy baja en la tierra que contiene
Rhizoctonia solani. Por el contrario, las plantas de tabaco
transgénicas wunl-PSI muestran una tasa de
crecimiento bastante mayor en un suelo que contiene Rhizoctonia
solani.
La tasa de crecimiento es sólo ligeramente menor
que la tasa de plantas de tabaco no transformadas que se cultivaron
en suelo sin hongos.
La Fig. 10 describe el valor medio estadístico de
los valores individuales mostrados en la Fig. 9.
La Fig. 11 muestra el crecimiento medio de las
plantas de tabaco en las diferentes condiciones. En un periodo de
tiempo de aproximadamente 10 días, las plantas de tabaco no
transformadas crecen aproximadamente 1 cm en suelo que contiene
Rhizoctonia solani. Las plantas de tabaco transgénicas
wunl-PSI crecen aproximadamente 4 cm/10 días en
suelo que contiene Rhizoctonia solani. Las plantas de tabaco
no transformadas que se cultivan en suelo sin Rhizoctonia
solani crecen aproximadamente 6 cm en unos 10 días.
Un ejemplo de un plásmido adecuado para las
bacterias superproductoras de proteínas PSI es el plásmido
pKK233-3 (fabricante: empresa Pharmacia).
Un promotor tac inducible por IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido)
permite, por ejemplo, la producción de la proteína PSI. Los
diferentes sitios de restricción justo detrás del promotor tac
permiten la fusión transcripcional del gen de PSI con el promotor
tac. Un fuerte terminador ribosomal (rrn) provoca la interrupción
definida de la transcripción.
El gen de PSI se clonó en el sitio de corte para
EcoRI de pKK233-3 en la orientación 5'3' a través
del sitio de corte para EcoRI y se transformaron con él bacterias
JM105. Estas bacterias se cultivaron a 37ºC y bajo fuerte agitación
en 100 ml de medio LB (50 \mug/ml de ampicilina) hasta una
DO_{650} = 0,4 y a continuación se añadió IPTG (concentración
final 2,5 mM). Siguió otra incubación durante 4 horas a 37ºC. A
continuación, el cultivo bacteriano de 100 ml se centrifugó durante
15 minutos a 2500 rpm (centrífuga Christ, 4ºC) y el sedimento de
bacterias se suspendió en Tris 50 mM, pH 8,0. La suspensión se
sometió a sonicación con ultrasonidos (varias veces durante 2
minutos con pulsos de 60%) hasta que la viscosidad disminuyó
notablemente.
De forma análoga a la descripción en
``Aislamiento y purificación de la proteína PSI'' expuesta en
``Procedimientos'', la proteína PSI se precipitó ahora con
(NH_{4})_{2}SO_{4} al 40-70% y se
purificó mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo
con CM52.
La proteína purificada y esterilizada por
filtración era adecuada para la preparación de soluciones para
infusión para el uso terapéutico en humanos y animales.
Claims (23)
1. Un ADN que codifica una proteína que comprende
la siguiente secuencia de aminoácidos:
2. El ADN según la reivindicación 1, que
comprende la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto
de:
\newpage
3. El ADN según la reivindicación 1, que
comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:
4. El ADN según la reivindicación 1 ó 2, que está
fusionado con un promotor activo en plantas.
5. El ADN según la reivindicación 4, en el que el
promotor se selecciona entre: promotores inducibles por agentes
patógenos, promotores constitutivos, promotores específicos del
desarrollo, promotores específicos de órganos, promotores
inducibles o el promotor wunl.
6. Un vector de expresión de ADN que comprende el
ADN según una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos según:
8. Uso de la proteína según la reivindicación 7
para la inhibición del crecimiento de fitopatógenos.
9. Uso de la proteína según la reivindicación 7
para obtener propiedades inhibidoras de agentes patógenos en una
planta.
10. Uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que
el agente patógeno es un hongo.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que el
hongo se selecciona entre: Trichoderma reesei,
Rhizoctonia solani o Fusarium sporotrichioides.
12. Procedimiento para la inhibición del
crecimiento de un hongo patógeno para plantas, que comprende
aplicar al hongo una proteína según la reivindicación 7.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que también se aplica al hongo una glucanasa BGL y/o una
quitinasa CHI de semillas de cebada.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, en el que la aplicación en el hongo se lleva a cabo mediante la
expresión en una planta transgénica.
15. Un procedimiento para la producción de
plantas resistentes a agentes patógenos, que comprende la
transformación de una planta con el ADN según la reivindicación 4 o
con una secuencia de ADN similar, derivada de él por sustitución de
nucleótidos, que codifica la proteína según la reivindicación 7.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la planta se ha transformado con el marco de lectura abierto
de la siguiente secuencia de ADN, que se ha completado en la región
5' con un clon de ADNc correspondiente:
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó
16, en el que el agente patógeno es un hongo.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el hongo se selecciona entre: Trichoderma reesei,
Rhizoctonia solani o Fusarium sporotrichioides.
19. Una célula vegetal que puede inhibir el
crecimiento de un agente patógeno fúngico y que se ha transformado
de tal manera que contiene en su genoma el ADN según la
reivindicación 4 o una secuencia de ADN similar, derivada de él por
sustitución de nucleótidos, que codifica la proteína según la
reivindicación 7, exceptuándose naturalmente las células vegetales
presentes en la naturaleza.
\newpage
20. Célula vegetal según la reivindicación 19, en
la que la célula vegetal se ha transformado con un ADN que
comprende el marco de lectura abierto de la siguiente secuencia de
ADN que en la región 5' se ha completado con un clon de ADNc
correspondiente:
21. Célula vegetal según la reivindicación 19 ó
20, que es una célula de una planta monocotiledónea, una planta de
cereales, una planta de maíz, una planta dicotiledónea, una
solanácea o una cucurbitácea.
22. Plantas o partes vegetales que se componen
fundamentalmente de las células vegetales según una de las
reivindicaciones 19 ó 20.
23. Planta según la reivindicación 22 que se
selecciona entre una planta monocotiledónea, una planta de
cereales, una planta de maíz, una planta dicotiledónea, una
solanácea o una cucurbitácea.
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