JPH0646874A - 植物細胞における外来遺伝子及びその産物の生産 - Google Patents
植物細胞における外来遺伝子及びその産物の生産Info
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- JPH0646874A JPH0646874A JP5122189A JP12218993A JPH0646874A JP H0646874 A JPH0646874 A JP H0646874A JP 5122189 A JP5122189 A JP 5122189A JP 12218993 A JP12218993 A JP 12218993A JP H0646874 A JPH0646874 A JP H0646874A
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- rna
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ＲＮＡ植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子の
ｃＤＮＡ、及び外被蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの本来の翻
訳開始コドン（５’末端から数えて１番目のＡＴＧ）よ
り下流のＡＴＧ以降を所望の外来遺伝子と置き換えた組
換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ（以下、組換え体
ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡという）を植物ゲノムに
導入することによって、又は、植物ウイルスのＲＮＡ複
製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した植物細
胞に、組換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡから合成
したＲＮＡを接種することによって、植物細胞において
外来遺伝子又はその産物を生産する方法。 【効果】 目的とする外来遺伝子産物が大量に生産され
る。
ｃＤＮＡ、及び外被蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの本来の翻
訳開始コドン（５’末端から数えて１番目のＡＴＧ）よ
り下流のＡＴＧ以降を所望の外来遺伝子と置き換えた組
換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ（以下、組換え体
ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡという）を植物ゲノムに
導入することによって、又は、植物ウイルスのＲＮＡ複
製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した植物細
胞に、組換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡから合成
したＲＮＡを接種することによって、植物細胞において
外来遺伝子又はその産物を生産する方法。 【効果】 目的とする外来遺伝子産物が大量に生産され
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法によ
り、ＲＮＡ植物ウイルス例えばブロムモザイクウイルス
（ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、以下ＢＭＶと
いう）のＲＮＡ複製酵素（ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｓ
ｅ）遺伝子を生産する植物細胞中で外来遺伝子及びその
産物を大量生産することによって、植物細胞中において
農業及び医薬分野に有用な物質を生産する方法、あるい
は有用形質を発現する形質転換植物体を作出することに
関する。また、本発明は、植物形質転換用ベクター、組
換え体ＲＮＡ生産ベクター及び形質転換植物細胞に関す
る。
り、ＲＮＡ植物ウイルス例えばブロムモザイクウイルス
（ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、以下ＢＭＶと
いう）のＲＮＡ複製酵素（ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｓ
ｅ）遺伝子を生産する植物細胞中で外来遺伝子及びその
産物を大量生産することによって、植物細胞中において
農業及び医薬分野に有用な物質を生産する方法、あるい
は有用形質を発現する形質転換植物体を作出することに
関する。また、本発明は、植物形質転換用ベクター、組
換え体ＲＮＡ生産ベクター及び形質転換植物細胞に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】植物細胞に有用ポリペプチドを生産させ
る技術、あるいはそれによって植物に有用形質例えば植
物ウイルス耐性を提供する方法として、Ｔｉプラスミド
形質転換系を用いて外来遺伝子を植物ゲノムに導入し発
現させる方法と植物ウイルスの増殖系を利用した方法が
開発されつつある。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）
の外被蛋白質遺伝子をＴｉプラスミド形質転換系を用い
て植物ゲノムに導入した場合、外被蛋白質の生産量は多
くても総植物蛋白質の０．０１％であることが知られて
いる（Ｂｅａｃｈｙら、（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．２８：４５１−４７４）。こ
の方法では、外来遺伝子産物の生産量は転写量を調節す
るプロモーター活性に依存しており、より強力な転写活
性を賦与するプロモーターの探索が必要になる。一方、
ＴＭＶは宿主植物中に最大２ｇ／生重葉ｋｇのウイルス
粒子を生産するが、ＴＭＶ外被蛋白質の遺伝子部分を目
的物質の外来遺伝子に置き換え宿主植物に接種するとい
う植物ウイルスの増殖系を利用した方法の場合、目的物
質の生産量は約１ｍｇ／生重葉ｋｇであった（Ｔａｋａ
ｍａｔｓｕら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７
−３１１）。ＴＭＶの問題点として、ＴＭＶは一種類の
１本鎖ＲＮＡに３種類の遺伝子がオーバーラップしてコ
ードされているため、外来遺伝子の置き換えによってＴ
ＭＶ複製の制御機構が影響を受けることによると考えら
れている。そのため、ウイルスゲノムが数種の一本鎖Ｒ
ＮＡに分散している植物ウイルスを利用することも検討
されている。
る技術、あるいはそれによって植物に有用形質例えば植
物ウイルス耐性を提供する方法として、Ｔｉプラスミド
形質転換系を用いて外来遺伝子を植物ゲノムに導入し発
現させる方法と植物ウイルスの増殖系を利用した方法が
開発されつつある。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）
の外被蛋白質遺伝子をＴｉプラスミド形質転換系を用い
て植物ゲノムに導入した場合、外被蛋白質の生産量は多
くても総植物蛋白質の０．０１％であることが知られて
いる（Ｂｅａｃｈｙら、（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅ
ｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．２８：４５１−４７４）。こ
の方法では、外来遺伝子産物の生産量は転写量を調節す
るプロモーター活性に依存しており、より強力な転写活
性を賦与するプロモーターの探索が必要になる。一方、
ＴＭＶは宿主植物中に最大２ｇ／生重葉ｋｇのウイルス
粒子を生産するが、ＴＭＶ外被蛋白質の遺伝子部分を目
的物質の外来遺伝子に置き換え宿主植物に接種するとい
う植物ウイルスの増殖系を利用した方法の場合、目的物
質の生産量は約１ｍｇ／生重葉ｋｇであった（Ｔａｋａ
ｍａｔｓｕら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７
−３１１）。ＴＭＶの問題点として、ＴＭＶは一種類の
１本鎖ＲＮＡに３種類の遺伝子がオーバーラップしてコ
ードされているため、外来遺伝子の置き換えによってＴ
ＭＶ複製の制御機構が影響を受けることによると考えら
れている。そのため、ウイルスゲノムが数種の一本鎖Ｒ
ＮＡに分散している植物ウイルスを利用することも検討
されている。
【０００３】その例として、ブロモウイルス群（ｂｒｏ
ｍｏ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）に属しイネ科に属する多
くの植物を宿主とするＢＭＶがあげられる。ＢＭＶのゲ
ノムは３種の（＋）の一本鎖ＲＮＡからなり、分子量の
大きいものから順にＲＮＡ１、２及び３と呼ばれてい
る。さらに、ＢＭＶにはサブゲノムＲＮＡと呼ばれるＲ
ＮＡ４も存在する。これらのＲＮＡは、直径約２６ｎｍ
の球状粒子中にＲＮＡ１及び２はそれぞれ単独で、ＲＮ
Ａ３と４は共に抱含されている（Ｌａｎｅら、（１９７
４）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１９：１５１−２２
０）。ＢＭＶを用いる利点は、感染植物細胞内におけ
る増殖量が多いこと、ゲノムが分割されているという
特徴から、複製酵素のみが複製に必要であり、ＲＮＡ３
の産物である３ａ蛋白質およびＲＮＡ４の産物である外
被蛋白質ともウイルス複製に関与しないことから、外被
蛋白質遺伝子への外来遺伝子の置き換えによってウイル
ス複製の制御機構が影響を受けにくいことである。
ｍｏ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）に属しイネ科に属する多
くの植物を宿主とするＢＭＶがあげられる。ＢＭＶのゲ
ノムは３種の（＋）の一本鎖ＲＮＡからなり、分子量の
大きいものから順にＲＮＡ１、２及び３と呼ばれてい
る。さらに、ＢＭＶにはサブゲノムＲＮＡと呼ばれるＲ
ＮＡ４も存在する。これらのＲＮＡは、直径約２６ｎｍ
の球状粒子中にＲＮＡ１及び２はそれぞれ単独で、ＲＮ
Ａ３と４は共に抱含されている（Ｌａｎｅら、（１９７
４）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１９：１５１−２２
０）。ＢＭＶを用いる利点は、感染植物細胞内におけ
る増殖量が多いこと、ゲノムが分割されているという
特徴から、複製酵素のみが複製に必要であり、ＲＮＡ３
の産物である３ａ蛋白質およびＲＮＡ４の産物である外
被蛋白質ともウイルス複製に関与しないことから、外被
蛋白質遺伝子への外来遺伝子の置き換えによってウイル
ス複製の制御機構が影響を受けにくいことである。
【０００４】ＢＭＶ全ゲノムの塩基配列は解明されてお
り（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９８４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１７２：３６９−３８３）、ＲＮＡ１は全長３
２３４塩基で１ａ蛋白質（分子量１０９キロダルトン
（ＫＤ））をコードし、ＲＮＡ２は全長２８６５塩基で
２ａ蛋白質（分子量９４ＫＤ）をコードしており、１ａ
及び２ａ蛋白質はＲＮＡ複製酵素のサブユニットと考え
られている。（＋）鎖のＢＭＶ ＲＮＡは植物細胞中
で、このＲＮＡ複製酵素によって、（＋）鎖から（−）
鎖が合成され、次に合成された（−）鎖を鋳型として
（＋）鎖が大量に合成されると考えられている。一方、
ＲＮＡ３は全長２１３４塩基で３ａ蛋白質（分子量３４
ＫＤ）及び外被蛋白質（分子量２０ＫＤ）の二つの遺伝
子産物をコードしているが、ＲＮＡ３から直接翻訳され
るのは５’側の３ａ蛋白質だけである。ＲＮＡ４は全長
８７６塩基でＲＮＡ３の外被蛋白質遺伝子部分と同一の
配列を持ち外被蛋白質のｍＲＮＡとなり、ＲＮＡ４は宿
主細胞中でＲＮＡ３から合成される（Ａｈｌｑｕｉｓｔ
ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５３：２３
−３８）。
り（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９８４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１７２：３６９−３８３）、ＲＮＡ１は全長３
２３４塩基で１ａ蛋白質（分子量１０９キロダルトン
（ＫＤ））をコードし、ＲＮＡ２は全長２８６５塩基で
２ａ蛋白質（分子量９４ＫＤ）をコードしており、１ａ
及び２ａ蛋白質はＲＮＡ複製酵素のサブユニットと考え
られている。（＋）鎖のＢＭＶ ＲＮＡは植物細胞中
で、このＲＮＡ複製酵素によって、（＋）鎖から（−）
鎖が合成され、次に合成された（−）鎖を鋳型として
（＋）鎖が大量に合成されると考えられている。一方、
ＲＮＡ３は全長２１３４塩基で３ａ蛋白質（分子量３４
ＫＤ）及び外被蛋白質（分子量２０ＫＤ）の二つの遺伝
子産物をコードしているが、ＲＮＡ３から直接翻訳され
るのは５’側の３ａ蛋白質だけである。ＲＮＡ４は全長
８７６塩基でＲＮＡ３の外被蛋白質遺伝子部分と同一の
配列を持ち外被蛋白質のｍＲＮＡとなり、ＲＮＡ４は宿
主細胞中でＲＮＡ３から合成される（Ａｈｌｑｕｉｓｔ
ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５３：２３
−３８）。
【０００５】その機構は、ＲＮＡ３（＋）鎖から（−）
鎖が合成され、この（−）鎖の内部からＲＮＡ４（＋）
鎖が合成されることによることが明らかになった（Ｍｉ
ｌｌｅｒら、（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６
８−７０）。Ａｈｌｑｕｉｓｔらは、ＲＮＡ３から外被
蛋白質遺伝子の大部分を取り除き、その部分にクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺
伝子を導入した組換えＲＮＡ３をＲＮＡ１及び２ととも
にオオムギプロトプラストに感染させ、高レベルのＣＡ
Ｔが発現することに成功したが、植物体レベルでのＣＡ
Ｔ遺伝子の発現には利用できなかった（Ａｈｌｑｕｉｓ
ｔら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：１２９４
−１２９７）。上述のように、ＢＭＶ、ｃｕｃｕｍｂｅ
ｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（以下ＣＭＶと記す）、ａ
ｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（以下ＡＭＶと
記す）に代表されるウイルスゲノムが４本のＲＮＡ鎖に
分れているウイルスのベクター化の場合、ＢＭＶが最も
良く研究されているが、外被蛋白質遺伝子を外来遺伝子
と置換した組換え体ＲＮＡ３とＲＮＡ１及び２を混合し
て植物プロトプラストに接種し、プロトプラスト内で外
来遺伝子を生産する方法は、プロトプラストへのＲＮＡ
感染効率が低いこと並びに組換えウイルスＲＮＡが全身
感染できないこともあり、個々の細胞における発現量が
少ないという問題点が存在する。それとともに、遺伝的
に形質転換された植物を得ることには利用できない。
鎖が合成され、この（−）鎖の内部からＲＮＡ４（＋）
鎖が合成されることによることが明らかになった（Ｍｉ
ｌｌｅｒら、（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６
８−７０）。Ａｈｌｑｕｉｓｔらは、ＲＮＡ３から外被
蛋白質遺伝子の大部分を取り除き、その部分にクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺
伝子を導入した組換えＲＮＡ３をＲＮＡ１及び２ととも
にオオムギプロトプラストに感染させ、高レベルのＣＡ
Ｔが発現することに成功したが、植物体レベルでのＣＡ
Ｔ遺伝子の発現には利用できなかった（Ａｈｌｑｕｉｓ
ｔら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：１２９４
−１２９７）。上述のように、ＢＭＶ、ｃｕｃｕｍｂｅ
ｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（以下ＣＭＶと記す）、ａ
ｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（以下ＡＭＶと
記す）に代表されるウイルスゲノムが４本のＲＮＡ鎖に
分れているウイルスのベクター化の場合、ＢＭＶが最も
良く研究されているが、外被蛋白質遺伝子を外来遺伝子
と置換した組換え体ＲＮＡ３とＲＮＡ１及び２を混合し
て植物プロトプラストに接種し、プロトプラスト内で外
来遺伝子を生産する方法は、プロトプラストへのＲＮＡ
感染効率が低いこと並びに組換えウイルスＲＮＡが全身
感染できないこともあり、個々の細胞における発現量が
少ないという問題点が存在する。それとともに、遺伝的
に形質転換された植物を得ることには利用できない。
【０００６】さらに、ウイルスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ的に生産することは、コストという点で産業化におけ
る大きな欠点である。それらの問題点を克服するため
に、以下の方法が開発された（Ｍｏｒｉら、（１９９
２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１６９−１７
２）。それは、ＢＭＶを含めたＲＮＡ植物ウイルスのゲ
ノムＲＮＡｃＤＮＡ、並びにウイルスゲノムＲＮＡｃＤ
ＮＡの外被蛋白質遺伝子を外来遺伝子と置換した組換え
体ｃＤＮＡを構築し、植物細胞中でウイルスＲＮＡとし
て発現できるように改造し、それらを例えばＴｉプラス
ミド等の植物細胞形質転換法あるいはエレクトロポレー
ション等のＤＮＡ直接導入法によって植物ゲノムに導入
する等の遺伝子工学技術を用いることにより、ウイルス
ＲＮＡ複製酵素が全ての細胞で生産され外来遺伝子を含
む組換え体ＲＮＡが複製されることによって、外来遺伝
子のｍＲＮＡが大量に発現し、外来遺伝子およびその産
物を大量生産する方法である。この場合、ウイルスＲＮ
Ａが大量に増殖すると植物に対して病徴を引き起こし植
物の生育に悪影響を及ぼすため、外来遺伝子以外のウイ
ルスＲＮＡの増殖は必ずしも必要でないと考えられるこ
とから、ウイルスＲＮＡ複製酵素遺伝子を含むゲノムＲ
ＮＡ、例えばＢＭＶの場合ＲＮＡ１及び２の増殖能を欠
如し翻訳能のみを残し、その結果、１ａ及び２ａ蛋白質
（ＢＭＶ ＲＮＡ複製酵素）のみが翻訳されるように、
ウイルスゲノムを改造する方法も同時に開発されている
（Ｍｏｒｉら、（１９９２）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７３：１６９−１７２）。
ｏ的に生産することは、コストという点で産業化におけ
る大きな欠点である。それらの問題点を克服するため
に、以下の方法が開発された（Ｍｏｒｉら、（１９９
２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１６９−１７
２）。それは、ＢＭＶを含めたＲＮＡ植物ウイルスのゲ
ノムＲＮＡｃＤＮＡ、並びにウイルスゲノムＲＮＡｃＤ
ＮＡの外被蛋白質遺伝子を外来遺伝子と置換した組換え
体ｃＤＮＡを構築し、植物細胞中でウイルスＲＮＡとし
て発現できるように改造し、それらを例えばＴｉプラス
ミド等の植物細胞形質転換法あるいはエレクトロポレー
ション等のＤＮＡ直接導入法によって植物ゲノムに導入
する等の遺伝子工学技術を用いることにより、ウイルス
ＲＮＡ複製酵素が全ての細胞で生産され外来遺伝子を含
む組換え体ＲＮＡが複製されることによって、外来遺伝
子のｍＲＮＡが大量に発現し、外来遺伝子およびその産
物を大量生産する方法である。この場合、ウイルスＲＮ
Ａが大量に増殖すると植物に対して病徴を引き起こし植
物の生育に悪影響を及ぼすため、外来遺伝子以外のウイ
ルスＲＮＡの増殖は必ずしも必要でないと考えられるこ
とから、ウイルスＲＮＡ複製酵素遺伝子を含むゲノムＲ
ＮＡ、例えばＢＭＶの場合ＲＮＡ１及び２の増殖能を欠
如し翻訳能のみを残し、その結果、１ａ及び２ａ蛋白質
（ＢＭＶ ＲＮＡ複製酵素）のみが翻訳されるように、
ウイルスゲノムを改造する方法も同時に開発されている
（Ｍｏｒｉら、（１９９２）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７３：１６９−１７２）。
【０００７】また、ＢＭＶを例に取った場合、融合蛋白
質ではない目的とする蛋白質を産生させるための外来遺
伝子との置き換え部位として、１ａ、２ａ、３ａあるい
は外被蛋白質遺伝子部分が考えられる。ＢＭＶでは系統
によって２０ＫＤの本来の外被蛋白質（ＣＰ１）の他に
１９ＫＤの外被蛋白質（ＣＰ２）も産生されることが知
られており（Ｓａｃｈｅｒ及びＡｈｌｑｕｉｓｔ、（１
９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３：４５４５−４５
５２）、本発明者は、さらに優れた生産方法を提供すべ
くＢＭＶ遺伝子を研究した結果、本発明を完成した。
質ではない目的とする蛋白質を産生させるための外来遺
伝子との置き換え部位として、１ａ、２ａ、３ａあるい
は外被蛋白質遺伝子部分が考えられる。ＢＭＶでは系統
によって２０ＫＤの本来の外被蛋白質（ＣＰ１）の他に
１９ＫＤの外被蛋白質（ＣＰ２）も産生されることが知
られており（Ｓａｃｈｅｒ及びＡｈｌｑｕｉｓｔ、（１
９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３：４５４５−４５
５２）、本発明者は、さらに優れた生産方法を提供すべ
くＢＭＶ遺伝子を研究した結果、本発明を完成した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】植物ウイルスのＲＮＡ
複製酵素遺伝子のｃＤＮＡ、および外被蛋白質遺伝子と
外来遺伝子を置き換えた組換えウイルスゲノムＲＮＡｃ
ＤＮＡとをそれぞれ別個に植物ゲノムに導入し、又は、
植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物
ゲノムに導入した植物細胞に組換え体ウイルスゲノムＲ
ＮＡｃＤＮＡから合成したＲＮＡを接種し、植物細胞に
おいて外来遺伝子を発現させる方法を用いて、外来遺伝
子及びその産物を大量に、しかも、効率的に生産する方
法が待ち望まれている。
複製酵素遺伝子のｃＤＮＡ、および外被蛋白質遺伝子と
外来遺伝子を置き換えた組換えウイルスゲノムＲＮＡｃ
ＤＮＡとをそれぞれ別個に植物ゲノムに導入し、又は、
植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物
ゲノムに導入した植物細胞に組換え体ウイルスゲノムＲ
ＮＡｃＤＮＡから合成したＲＮＡを接種し、植物細胞に
おいて外来遺伝子を発現させる方法を用いて、外来遺伝
子及びその産物を大量に、しかも、効率的に生産する方
法が待ち望まれている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＲＮＡ植物ウ
イルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子を植物ゲノムに導入し、
植物細胞中で生産されたウイルスＲＮＡ複製酵素によっ
て所望の外来遺伝子のｍＲＮＡを大量に合成し、その遺
伝子産物であるポリペプチドを大量に生産する方法、あ
るいは植物の形質に影響を及ぼすポリペプチド若しくは
アンチセンスＲＮＡを植物細胞において大量生産させ有
用形質を有する植物体を作出する方法を提供し、より詳
しくは、ＲＮＡ植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子の
ｃＤＮＡ、及び外被蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの本来の翻
訳開始コドン（５’末端から数えて１番目のＡＴＧ）よ
り下流のＡＴＧ以降を所望の外来遺伝子と置き換えた組
換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ（以下組換え体ウ
イルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡという）を植物ゲノムに導
入することによって、又は、植物ウイルスのＲＮＡ複製
酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した植物細胞
に、組換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡから合成し
たＲＮＡを接種することによって、植物細胞において外
来遺伝子又はその産物を生産する方法を提供する。
イルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子を植物ゲノムに導入し、
植物細胞中で生産されたウイルスＲＮＡ複製酵素によっ
て所望の外来遺伝子のｍＲＮＡを大量に合成し、その遺
伝子産物であるポリペプチドを大量に生産する方法、あ
るいは植物の形質に影響を及ぼすポリペプチド若しくは
アンチセンスＲＮＡを植物細胞において大量生産させ有
用形質を有する植物体を作出する方法を提供し、より詳
しくは、ＲＮＡ植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子の
ｃＤＮＡ、及び外被蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの本来の翻
訳開始コドン（５’末端から数えて１番目のＡＴＧ）よ
り下流のＡＴＧ以降を所望の外来遺伝子と置き換えた組
換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ（以下組換え体ウ
イルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡという）を植物ゲノムに導
入することによって、又は、植物ウイルスのＲＮＡ複製
酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した植物細胞
に、組換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡから合成し
たＲＮＡを接種することによって、植物細胞において外
来遺伝子又はその産物を生産する方法を提供する。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明者
は、植物ウイルスゲノム中の考え得るほとんど全ての部
位に外来遺伝子を導入し、外来遺伝子産物の産生量を比
較した。その結果、驚くべきことに、外被蛋白質遺伝子
のｃＤＮＡの本来の翻訳開始コドン（５’末端から数え
て１番目のＡＴＧ）より下流のＡＴＧ以降を所望の外来
遺伝子と置き換えた場合、外来遺伝子産物の予想外の高
効率生産が行われることが明らかとなった。本発明はそ
の知見に基づくものである。
は、植物ウイルスゲノム中の考え得るほとんど全ての部
位に外来遺伝子を導入し、外来遺伝子産物の産生量を比
較した。その結果、驚くべきことに、外被蛋白質遺伝子
のｃＤＮＡの本来の翻訳開始コドン（５’末端から数え
て１番目のＡＴＧ）より下流のＡＴＧ以降を所望の外来
遺伝子と置き換えた場合、外来遺伝子産物の予想外の高
効率生産が行われることが明らかとなった。本発明はそ
の知見に基づくものである。
【００１１】（１）ＲＮＡ植物ウイルス 本発明において、利用されるＲＮＡ植物ウイルスは、好
ましくはウイルスゲノムが数本の（＋）鎖ＲＮＡから構
成されるものである。更に好ましくは、ＢＭＶ、ＣＭ
Ｖ、ＡＭＶである。これらのウイルスのＲＮＡ複製酵素
遺伝子を含むゲノムＲＮＡｃＤＮＡは植物ゲノムに導入
される。外来遺伝子を組み込んだ外被蛋白質遺伝子を含
むゲノムＲＮＡｃＤＮＡは、植物ゲノムに導入される
か、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡとし
て接種される。ＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶの場合、ゲノム
は４種類のＲＮＡに分れており（図１）、本発明におい
て最も扱いやすいウイルスである。これら以外のウイル
スでも、ＲＮＡ複製酵素遺伝子と外被蛋白質遺伝子を、
それぞれを単独で発現できる状態で植物ゲノムに組み込
むことができれば、本発明が適用できる。
ましくはウイルスゲノムが数本の（＋）鎖ＲＮＡから構
成されるものである。更に好ましくは、ＢＭＶ、ＣＭ
Ｖ、ＡＭＶである。これらのウイルスのＲＮＡ複製酵素
遺伝子を含むゲノムＲＮＡｃＤＮＡは植物ゲノムに導入
される。外来遺伝子を組み込んだ外被蛋白質遺伝子を含
むゲノムＲＮＡｃＤＮＡは、植物ゲノムに導入される
か、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡとし
て接種される。ＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶの場合、ゲノム
は４種類のＲＮＡに分れており（図１）、本発明におい
て最も扱いやすいウイルスである。これら以外のウイル
スでも、ＲＮＡ複製酵素遺伝子と外被蛋白質遺伝子を、
それぞれを単独で発現できる状態で植物ゲノムに組み込
むことができれば、本発明が適用できる。
【００１２】ＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶを例にとれば、本
発明において、植物ゲノムに導入されるべく改造される
部分は、ＲＮＡ１、２及び３であり、改造されたＲＮＡ
３のうち所望の外来遺伝子によって置き換えられるのは
３’末端側の外被蛋白質遺伝子部分である。ウイルスゲ
ノムが導入される植物としては、タバコ、ダイズ、キュ
ウリ、ジャガイモ、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロ
コシなどがあげられるが、これらに限られるわけではな
い。
発明において、植物ゲノムに導入されるべく改造される
部分は、ＲＮＡ１、２及び３であり、改造されたＲＮＡ
３のうち所望の外来遺伝子によって置き換えられるのは
３’末端側の外被蛋白質遺伝子部分である。ウイルスゲ
ノムが導入される植物としては、タバコ、ダイズ、キュ
ウリ、ジャガイモ、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロ
コシなどがあげられるが、これらに限られるわけではな
い。
【００１３】上記した植物ウイルスは、それぞれの宿主
となる植物が異なる。例えば、ＢＭＶはイネ科に属する
多くの植物を宿主とするが、タバコ植物へのウイルス粒
子又はウイルスＲＮＡの接種では、ＢＭＶは植物体中で
増殖しないために、タバコはＢＭＶの宿主と考えられて
いない。しかし、ＢＭＶ粒子又はＲＮＡをタバコプロト
プラストに接種すると、細胞中でウイルスＲＮＡが複製
され外被蛋白質の生産がおこることが報告されている
（Ｍａｅｋａｗａら、（１９８５）Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏ
ｐａｔｈ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ ５１：２２７−２３
０）。このことは、ウイルス遺伝子を植物細胞中で発現
できれば、従来のウイルスと宿主の関係に捕らわれる必
要はないことを示唆している。従って、本発明によって
ウイルス遺伝子を植物ゲノムに導入する場合にも、従来
のウイルスと宿主の概念に捕らわれずに本発明を適用す
る植物を選ぶことができる。又、植物細胞とはプロトプ
ラストを含む概念である。
となる植物が異なる。例えば、ＢＭＶはイネ科に属する
多くの植物を宿主とするが、タバコ植物へのウイルス粒
子又はウイルスＲＮＡの接種では、ＢＭＶは植物体中で
増殖しないために、タバコはＢＭＶの宿主と考えられて
いない。しかし、ＢＭＶ粒子又はＲＮＡをタバコプロト
プラストに接種すると、細胞中でウイルスＲＮＡが複製
され外被蛋白質の生産がおこることが報告されている
（Ｍａｅｋａｗａら、（１９８５）Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏ
ｐａｔｈ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ ５１：２２７−２３
０）。このことは、ウイルス遺伝子を植物細胞中で発現
できれば、従来のウイルスと宿主の関係に捕らわれる必
要はないことを示唆している。従って、本発明によって
ウイルス遺伝子を植物ゲノムに導入する場合にも、従来
のウイルスと宿主の概念に捕らわれずに本発明を適用す
る植物を選ぶことができる。又、植物細胞とはプロトプ
ラストを含む概念である。
【００１４】（２）植物形質転換用ベクターの構築 ウイルスＲＮＡは、ＲＮＡ抽出法として公知の方法たと
えばグアニジン法、熱フェノール法、ラウリル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）フェノール法等を用いウイルス粒子か
ら抽出する。ＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶの場合、ゲノムが
数種類のＲＮＡからなるため、アガロースゲル電気泳動
でＲＮＡ１、２及び３として分画精製する。それぞれの
ＲＮＡの相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の構築は、常法の遺
伝子操作技術を利用して行なうことができる（Ａｈｌｑ
ｕｉｓｔら、（１９８４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７
２：３６９−３８３；Ｍｏｒｉら、（１９９１）Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２４３−２４６）。
えばグアニジン法、熱フェノール法、ラウリル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）フェノール法等を用いウイルス粒子か
ら抽出する。ＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶの場合、ゲノムが
数種類のＲＮＡからなるため、アガロースゲル電気泳動
でＲＮＡ１、２及び３として分画精製する。それぞれの
ＲＮＡの相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の構築は、常法の遺
伝子操作技術を利用して行なうことができる（Ａｈｌｑ
ｕｉｓｔら、（１９８４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７
２：３６９−３８３；Ｍｏｒｉら、（１９９１）Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２４３−２４６）。
【００１５】本発明において、ＲＮＡ複製酵素遺伝子を
含むゲノムＲＮＡ、例えばＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶの場
合、ＲＮＡ１及び２は、ｉ）植物で機能するプロモータ
ー、ｉｉ）ＲＮＡ１又は２のｃＤＮＡ、ｉｉｉ）植物で
機能するターミネーターからなるＤＮＡ分子として、そ
れぞれ植物ゲノムに導入される。そのようなＤＮＡ分子
が導入された形質転換体植物細胞では、ＲＮＡ１及び２
が転写され、１ａ及び２ａ蛋白質が生産される。ＲＮＡ
３のｃＤＮＡの外被蛋白質遺伝子領域は所望の外来遺伝
子と組換えられ組換え体ＲＮＡ３ｃＤＮＡが構築された
後、ｉ）植物で機能するプロモーター、ｉｉ）組換え体
ＲＮＡ３ｃＤＮＡ、ｉｉｉ）植物で機能するターミネー
ターからなるＤＮＡ分子として、上述の１ａ及び２ａ蛋
白質が生産される植物のゲノムに導入される。あるい
は、転写ベクターによってｉｎ ｖｉｔｒｏ的に生産さ
れた組換え体ＲＮＡ３として、上述の１ａ及び２ａ蛋白
質が生産されている植物細胞に接種される。
含むゲノムＲＮＡ、例えばＢＭＶ、ＣＭＶ、ＡＭＶの場
合、ＲＮＡ１及び２は、ｉ）植物で機能するプロモータ
ー、ｉｉ）ＲＮＡ１又は２のｃＤＮＡ、ｉｉｉ）植物で
機能するターミネーターからなるＤＮＡ分子として、そ
れぞれ植物ゲノムに導入される。そのようなＤＮＡ分子
が導入された形質転換体植物細胞では、ＲＮＡ１及び２
が転写され、１ａ及び２ａ蛋白質が生産される。ＲＮＡ
３のｃＤＮＡの外被蛋白質遺伝子領域は所望の外来遺伝
子と組換えられ組換え体ＲＮＡ３ｃＤＮＡが構築された
後、ｉ）植物で機能するプロモーター、ｉｉ）組換え体
ＲＮＡ３ｃＤＮＡ、ｉｉｉ）植物で機能するターミネー
ターからなるＤＮＡ分子として、上述の１ａ及び２ａ蛋
白質が生産される植物のゲノムに導入される。あるい
は、転写ベクターによってｉｎ ｖｉｔｒｏ的に生産さ
れた組換え体ＲＮＡ３として、上述の１ａ及び２ａ蛋白
質が生産されている植物細胞に接種される。
【００１６】ｉ）植物で機能するプロモーター、ｉｉ）
植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子ｃＤＮＡ、例えば
ＲＮＡ１、２又は組換え体ウイルスゲノムＲＮＡのｃＤ
ＮＡ、例えばＲＮＡ３のｃＤＮＡ、ｉｉｉ）植物で機能
するターミネーターからなるＤＮＡ分子を植物ゲノムに
導入するために使用される形質転換用ベクターとして
は、例えば図２に示した第一型（ｐＢＩＣＢＲベクタ
ー）及び第二型（ｐＢＩＣＢＭＲベクター）の２種類の
ベクターがある（Ｍｏｒｉら、（１９９２）Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１６９−１７２）。２種類のベ
クターとも完全な１ａあるいは２ａ翻訳領域を保持する
とともに、第一型ベクターは、ウイルスＲＮＡの５’末
端及び３’末端の完全な非翻訳領域のｃＤＮＡを保持す
る。それに対して、第二型ベクターは、完全な５’末端
非翻訳領域のｃＤＮＡを持つが、３’末端非翻訳領域に
相当するヌクレチオド部分のｃＤＮＡに欠失を持つ。ウ
イルスＲＮＡの５’末端非翻訳領域は、翻訳能及び
（−）鎖から（＋）鎖の合成に必須であり、３’末端非
翻訳領域は、（＋）鎖から（−）鎖の合成に必須であ
る。そのため、３’末端非翻訳領域の欠失は、（＋）鎖
から（−）鎖の合成の欠失につながりウイルスＲＮＡの
増殖能を失わせることになるが、翻訳能に影響を及ぼさ
ない。
植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子ｃＤＮＡ、例えば
ＲＮＡ１、２又は組換え体ウイルスゲノムＲＮＡのｃＤ
ＮＡ、例えばＲＮＡ３のｃＤＮＡ、ｉｉｉ）植物で機能
するターミネーターからなるＤＮＡ分子を植物ゲノムに
導入するために使用される形質転換用ベクターとして
は、例えば図２に示した第一型（ｐＢＩＣＢＲベクタ
ー）及び第二型（ｐＢＩＣＢＭＲベクター）の２種類の
ベクターがある（Ｍｏｒｉら、（１９９２）Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１６９−１７２）。２種類のベ
クターとも完全な１ａあるいは２ａ翻訳領域を保持する
とともに、第一型ベクターは、ウイルスＲＮＡの５’末
端及び３’末端の完全な非翻訳領域のｃＤＮＡを保持す
る。それに対して、第二型ベクターは、完全な５’末端
非翻訳領域のｃＤＮＡを持つが、３’末端非翻訳領域に
相当するヌクレチオド部分のｃＤＮＡに欠失を持つ。ウ
イルスＲＮＡの５’末端非翻訳領域は、翻訳能及び
（−）鎖から（＋）鎖の合成に必須であり、３’末端非
翻訳領域は、（＋）鎖から（−）鎖の合成に必須であ
る。そのため、３’末端非翻訳領域の欠失は、（＋）鎖
から（−）鎖の合成の欠失につながりウイルスＲＮＡの
増殖能を失わせることになるが、翻訳能に影響を及ぼさ
ない。
【００１７】第一型ベクターを用いて植物ゲノム内にウ
イルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入した場合、導入細
胞では生産された転写物は野生型ウイルスＲＮＡと同じ
ように増殖し、また翻訳も行なわれる。一方、第二型ベ
クターを用いて植物ゲノム内にウイルスＲＮＡの３’末
端欠失ｃＤＮＡを導入した場合、導入細胞では生産され
た転写物は増殖しないが翻訳は行なわれ翻訳産物のみが
生産される。ウイルスＲＮＡが大量に増殖すると植物に
対して病徴を引き起こし植物の生育に悪影響を及ぼすと
考えられることから、このような問題点を解決するため
には第二型ベクターを使用すれば良い。
イルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入した場合、導入細
胞では生産された転写物は野生型ウイルスＲＮＡと同じ
ように増殖し、また翻訳も行なわれる。一方、第二型ベ
クターを用いて植物ゲノム内にウイルスＲＮＡの３’末
端欠失ｃＤＮＡを導入した場合、導入細胞では生産され
た転写物は増殖しないが翻訳は行なわれ翻訳産物のみが
生産される。ウイルスＲＮＡが大量に増殖すると植物に
対して病徴を引き起こし植物の生育に悪影響を及ぼすと
考えられることから、このような問題点を解決するため
には第二型ベクターを使用すれば良い。
【００１８】植物で機能的なプロモーター及びターミネ
ターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕ
ｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、以下Ｃ
ａＭＶ）３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶターミネータ
ー等で代表される植物細胞中で機能的なターミネター等
がある。５’末端に余分な７塩基の塩基配列を持つ変異
ＢＭＶ ＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（Ｊａｎｄ
ａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５９
−２６２）が明らかになっているため、植物細胞に導入
したウイルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核内転写物に翻
訳能力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転写開始点をウ
イルスＲＮＡの５’末端と正確に一致させる必要があ
る。ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを用いた場合、Ｍｏ
ｒｉらの方法（Ｍｏｒｉら、（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．７２：２４３ー２４６）により転写開始点
のすぐ下流にウイルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入す
る（図３）。
ターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕ
ｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、以下Ｃ
ａＭＶ）３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶターミネータ
ー等で代表される植物細胞中で機能的なターミネター等
がある。５’末端に余分な７塩基の塩基配列を持つ変異
ＢＭＶ ＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（Ｊａｎｄ
ａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５９
−２６２）が明らかになっているため、植物細胞に導入
したウイルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核内転写物に翻
訳能力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転写開始点をウ
イルスＲＮＡの５’末端と正確に一致させる必要があ
る。ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを用いた場合、Ｍｏ
ｒｉらの方法（Ｍｏｒｉら、（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．７２：２４３ー２４６）により転写開始点
のすぐ下流にウイルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入す
る（図３）。
【００１９】所望の外来遺伝子によって置き換え可能な
部分は、１ａ蛋白質、２ａ蛋白質、３ａ蛋白質および外
被蛋白質遺伝子の１番目の翻訳開始コドン、あるいは外
被蛋白質遺伝子の１番目以降にある翻訳開始コドン、例
えば２番目、３番目など、からの部分である。所望の外
来遺伝子をこれらの部位に導入するためには、置き換え
られる遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および外来遺
伝子の翻訳開始コドンにＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎ
ｋｅｌら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ １５４：３６７−３８２）によってＮｓ
ｉＩ切断部位を導入しておき、ＮｓｉＩで切断後Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで一本鎖部分を取り除き平滑末端化し
た後結合することによって、翻訳の読み枠を変えること
なく（インフレームに）外来遺伝子の置き換えが行える
（図４）。
部分は、１ａ蛋白質、２ａ蛋白質、３ａ蛋白質および外
被蛋白質遺伝子の１番目の翻訳開始コドン、あるいは外
被蛋白質遺伝子の１番目以降にある翻訳開始コドン、例
えば２番目、３番目など、からの部分である。所望の外
来遺伝子をこれらの部位に導入するためには、置き換え
られる遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および外来遺
伝子の翻訳開始コドンにＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎ
ｋｅｌら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ １５４：３６７−３８２）によってＮｓ
ｉＩ切断部位を導入しておき、ＮｓｉＩで切断後Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで一本鎖部分を取り除き平滑末端化し
た後結合することによって、翻訳の読み枠を変えること
なく（インフレームに）外来遺伝子の置き換えが行える
（図４）。
【００２０】（３）植物形質転換用ベクターによる形質
転換体の作製 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた植
物形質転換法しては、リーフディスク法（Ｈｏｒｓｃｈ
ら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−
１２３１）が最も一般的に利用される。Ｔｉプラスミド
にはｖｉｒ領域があり、この領域の働きによって、Ｔｉ
プラスミド中のＴ−ＤＮＡ領域をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓの宿主細胞ゲノム中に導入できる（Ｎｅｓｔｅｒ
ら、（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．３５：３８７−４１３）。Ｔｉプラスミドを
用いた遺伝子導入法としては、現在バイナリーベクター
法が広く用いられている。これは、ＴｉプラスミドをＴ
−ＤＮＡの欠失しｖｉｒ領域を持つＴｉプラスミドとＴ
−ＤＮＡを含むバイナリーベクターに分割して用いるも
のである。バイナリーベクターとはＡ．ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓでも大腸菌でも増殖できるベクターである。プ
ロモーター、ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、ターミネータ
ーで構成されるＤＮＡは、バイナリーベクター中のＴ−
ＤＮＡ領域に組み込まれ、形質転換用ベクターが構築さ
れる。
転換体の作製 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた植
物形質転換法しては、リーフディスク法（Ｈｏｒｓｃｈ
ら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−
１２３１）が最も一般的に利用される。Ｔｉプラスミド
にはｖｉｒ領域があり、この領域の働きによって、Ｔｉ
プラスミド中のＴ−ＤＮＡ領域をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓの宿主細胞ゲノム中に導入できる（Ｎｅｓｔｅｒ
ら、（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．３５：３８７−４１３）。Ｔｉプラスミドを
用いた遺伝子導入法としては、現在バイナリーベクター
法が広く用いられている。これは、ＴｉプラスミドをＴ
−ＤＮＡの欠失しｖｉｒ領域を持つＴｉプラスミドとＴ
−ＤＮＡを含むバイナリーベクターに分割して用いるも
のである。バイナリーベクターとはＡ．ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓでも大腸菌でも増殖できるベクターである。プ
ロモーター、ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、ターミネータ
ーで構成されるＤＮＡは、バイナリーベクター中のＴ−
ＤＮＡ領域に組み込まれ、形質転換用ベクターが構築さ
れる。
【００２１】このような形質転換用ベクターをＴ−ＤＮ
Ａの欠失しｖｉｒ領域を持つＴｉプラスミドを保持する
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中に導入し、該Ａ．ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを宿主植物に接種すれば、ｖｉｒ
領域の働きによって、該組み合わせの構成からなるＤＮ
Ａを含むＴ−ＤＮＡ領域を宿主ゲノム中に導入しうる。
その他の公知の遺伝子導入法、すなわちプロトプラスト
へのエレクトロポーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）法、リポゾーム融合、マイクロインジェク
ション、植物組織へのパーティクルガン（ｐａｒｔｉｃ
ｌｅ ｇｕｎ）あるいはそれらに準じた方法等によって
も、上記構成からなるＤＮＡを植物細胞に導入できる。
Ａの欠失しｖｉｒ領域を持つＴｉプラスミドを保持する
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中に導入し、該Ａ．ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを宿主植物に接種すれば、ｖｉｒ
領域の働きによって、該組み合わせの構成からなるＤＮ
Ａを含むＴ−ＤＮＡ領域を宿主ゲノム中に導入しうる。
その他の公知の遺伝子導入法、すなわちプロトプラスト
へのエレクトロポーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）法、リポゾーム融合、マイクロインジェク
ション、植物組織へのパーティクルガン（ｐａｒｔｉｃ
ｌｅ ｇｕｎ）あるいはそれらに準じた方法等によって
も、上記構成からなるＤＮＡを植物細胞に導入できる。
【００２２】形質転換体の選抜には、カナマイシン、ハ
イグロマイシン、ホスホノトリシン等の薬剤を用いるこ
とが出来る。形質転換体は、適宜の培地で培養してカル
ス形成、カルス増殖、さらに必要に応じて不定胚分化ま
たは器官分化を行ない、ついで植物ホルモンを添加した
植物体再分化用培地で植物体に再生させることができ
る。双子葉植物に本発明を使用する場合には、対象の植
物は、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバーな
ど）、セリ科（ニンジン、セロリなど）、アブラナ科
（キャベツ、ダイコン、ナタネなど）、ナス科（ジャガ
イモ、タバコ、トマトなど）がある。単子葉植物に使用
する場合には、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた手
法は利用できないが、プロトプラストへのエレクトロポ
ーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法、
リポゾーム融合、マイクロインジェクション、植物組織
へのパーティクルガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）を
用い導入可能であり、対象の植物は、イネ科（イネ、コ
ムギ、オオムギ、トウモロコシなど）がある。
イグロマイシン、ホスホノトリシン等の薬剤を用いるこ
とが出来る。形質転換体は、適宜の培地で培養してカル
ス形成、カルス増殖、さらに必要に応じて不定胚分化ま
たは器官分化を行ない、ついで植物ホルモンを添加した
植物体再分化用培地で植物体に再生させることができ
る。双子葉植物に本発明を使用する場合には、対象の植
物は、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバーな
ど）、セリ科（ニンジン、セロリなど）、アブラナ科
（キャベツ、ダイコン、ナタネなど）、ナス科（ジャガ
イモ、タバコ、トマトなど）がある。単子葉植物に使用
する場合には、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた手
法は利用できないが、プロトプラストへのエレクトロポ
ーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法、
リポゾーム融合、マイクロインジェクション、植物組織
へのパーティクルガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）を
用い導入可能であり、対象の植物は、イネ科（イネ、コ
ムギ、オオムギ、トウモロコシなど）がある。
【００２３】第一型あるいは第二型ベクターを用いてＲ
ＮＡ１及び２のｃＤＮＡがゲノムに導入された形質転換
細胞を得る方法としては、ＲＮＡ１ｃＤＮＡが導入さ
れた形質転換植物体とＲＮＡ２ｃＤＮＡが導入された形
質転換植物体との間で交雑を行ない、１ａ及び２ａ蛋白
質を発現している植物体を選抜する。あるいは、別々
の選抜用薬剤耐性マーカーを備え付けたＲＮＡ１ｃＤＮ
Ａを組み込んだベクターとＲＮＡ２ｃＤＮＡを組み込ん
だベクターとによって同一植物体を形質転換するか、
エレクトロポレーション法を用いて同一細胞にｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行なう等の方法によって
作出できる。１ａ及び２ａ蛋白質の発現は、植物体から
得たプロトプラストにＲＮＡ３を接種しウエスタンブロ
ッティングによる外被蛋白質の存在により確認される。
さらに、ＲＮＡ１及び２の両ｃＤＮＡを植物ゲノム中に
ホモに持つ純系植物体を得るためには、１ａ及び２ａ蛋
白質を発現する形質転換植物体のやく培養（ａｎｔｈｅ
ｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行ない、花粉由来の半数体植物
の染色体を倍加することによって純系二倍体を得た後、
上記した方法によって１ａ及び２ａ蛋白質を発現する形
質転換植物体を選抜すれば良い。
ＮＡ１及び２のｃＤＮＡがゲノムに導入された形質転換
細胞を得る方法としては、ＲＮＡ１ｃＤＮＡが導入さ
れた形質転換植物体とＲＮＡ２ｃＤＮＡが導入された形
質転換植物体との間で交雑を行ない、１ａ及び２ａ蛋白
質を発現している植物体を選抜する。あるいは、別々
の選抜用薬剤耐性マーカーを備え付けたＲＮＡ１ｃＤＮ
Ａを組み込んだベクターとＲＮＡ２ｃＤＮＡを組み込ん
だベクターとによって同一植物体を形質転換するか、
エレクトロポレーション法を用いて同一細胞にｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行なう等の方法によって
作出できる。１ａ及び２ａ蛋白質の発現は、植物体から
得たプロトプラストにＲＮＡ３を接種しウエスタンブロ
ッティングによる外被蛋白質の存在により確認される。
さらに、ＲＮＡ１及び２の両ｃＤＮＡを植物ゲノム中に
ホモに持つ純系植物体を得るためには、１ａ及び２ａ蛋
白質を発現する形質転換植物体のやく培養（ａｎｔｈｅ
ｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行ない、花粉由来の半数体植物
の染色体を倍加することによって純系二倍体を得た後、
上記した方法によって１ａ及び２ａ蛋白質を発現する形
質転換植物体を選抜すれば良い。
【００２４】（４）組換え体ウイルスゲノムＲＮＡ転写
ベクターの構築 本発明において、所望の生産すべきポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ的に転写産物を生産す
るための転写ベクターに組換えられた後、該組換え転写
ベクターにより、ＲＮＡとして生産しても良い。ウイル
スＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ的に合成するには、ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリメラー
ゼ等が市販されている。好ましくは、プロモーター領域
の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかになってお
り並びに高転写活性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
（Ｄｕｎｎら、（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌ．１
６６：４７７−５３５）を用いることができる。ウイル
スＲＮＡの５’末端の核酸の構造は、ウイルスＲＮＡの
複製や翻訳等において非常に重要な機能を持っており、
５’末端に余分な塩基配列が付加されるとウイルスＲＮ
Ａの生物活性は激減することが報告されている（Ｊａｎ
ｄａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５
９−２６２）。そのため、野生型と同一の５’末端の塩
基配列を持つウイルスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合
成するには、ｃＤＮＡの５’末端から正確に転写が開始
することが好ましい。ＢＭＶを例にとれば、ＢＭＶＲＮ
Ａ３の転写ベクターｐＢＴＦ３が構築されている（Ｍｏ
ｒｉら、（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：
２４３ー２４６）（図５）。
ベクターの構築 本発明において、所望の生産すべきポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ的に転写産物を生産す
るための転写ベクターに組換えられた後、該組換え転写
ベクターにより、ＲＮＡとして生産しても良い。ウイル
スＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ的に合成するには、ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリメラー
ゼ等が市販されている。好ましくは、プロモーター領域
の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかになってお
り並びに高転写活性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
（Ｄｕｎｎら、（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌ．１
６６：４７７−５３５）を用いることができる。ウイル
スＲＮＡの５’末端の核酸の構造は、ウイルスＲＮＡの
複製や翻訳等において非常に重要な機能を持っており、
５’末端に余分な塩基配列が付加されるとウイルスＲＮ
Ａの生物活性は激減することが報告されている（Ｊａｎ
ｄａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５
９−２６２）。そのため、野生型と同一の５’末端の塩
基配列を持つウイルスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合
成するには、ｃＤＮＡの５’末端から正確に転写が開始
することが好ましい。ＢＭＶを例にとれば、ＢＭＶＲＮ
Ａ３の転写ベクターｐＢＴＦ３が構築されている（Ｍｏ
ｒｉら、（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：
２４３ー２４６）（図５）。
【００２５】組換え体ＢＭＶＲＮＡ３転写ベクターを構
築するための材料としてはｐＢＴＦ３ベクターが利用さ
れる。ｐＢＴＦ３ベクターは、Ｔ７プロモーターとＢＭ
ＶＲＮＡ３ｃＤＮＡ及び大腸菌のベクターであるｐＵＣ
ベクターの遺伝子とを含むベクターである。上記ベクタ
ーの外被蛋白質遺伝子部分内にある翻訳開始コドンにＫ
ｕｎｋｅｌらの方法によってＮｓｉＩ切断部位を付与し
ておき、外被蛋白質遺伝子部分内にあるＳｔｕＩ制限酵
素切断部位にリンカー等を接合させることによってＳａ
ｃＩ制限酵素切断部位に置き換え、ＮｓｉＩ／ＳａｃＩ
断片を取り除き、外来遺伝子を含むＮｓｉＩ／ＳａｃＩ
断片を組み込むことによって、読み枠を変えずに外来遺
伝子を導入することができる。転写産物の生産にあたっ
ては、組換えｐＢＴＦ３ベクターをＥｃｏＲＩで切断す
ることによってリニアーなＤＮＡの形状にして鋳型とし
て用い、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、キャップア
ナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを
含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写システムによって組換え体Ｒ
ＮＡ３を大量生産する。
築するための材料としてはｐＢＴＦ３ベクターが利用さ
れる。ｐＢＴＦ３ベクターは、Ｔ７プロモーターとＢＭ
ＶＲＮＡ３ｃＤＮＡ及び大腸菌のベクターであるｐＵＣ
ベクターの遺伝子とを含むベクターである。上記ベクタ
ーの外被蛋白質遺伝子部分内にある翻訳開始コドンにＫ
ｕｎｋｅｌらの方法によってＮｓｉＩ切断部位を付与し
ておき、外被蛋白質遺伝子部分内にあるＳｔｕＩ制限酵
素切断部位にリンカー等を接合させることによってＳａ
ｃＩ制限酵素切断部位に置き換え、ＮｓｉＩ／ＳａｃＩ
断片を取り除き、外来遺伝子を含むＮｓｉＩ／ＳａｃＩ
断片を組み込むことによって、読み枠を変えずに外来遺
伝子を導入することができる。転写産物の生産にあたっ
ては、組換えｐＢＴＦ３ベクターをＥｃｏＲＩで切断す
ることによってリニアーなＤＮＡの形状にして鋳型とし
て用い、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、キャップア
ナログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを
含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写システムによって組換え体Ｒ
ＮＡ３を大量生産する。
【００２６】（５）ＲＮＡ複製酵素を生産する形質転換
体プロトプラストにおける外来遺伝子の発現 ＲＮＡ複製酵素遺伝子、例えばＲＮＡ１及び２の両ｃＤ
ＮＡを導入した形質転換細胞中では生物活性を持つＲＮ
Ａ複製酵素、例えば１ａ及び２ａ蛋白質が全ての細胞で
発現される（Ｍｏｒｉら、（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７３：１６９−１７２）。つまり、このよう
な形質転換細胞中では、ウイルスゲノムを植物の転写及
び翻訳機構によって発現させることができる。又、まず
ＲＮＡ複製酵素遺伝子、例えばＲＮＡ１及び２の両ｃＤ
ＮＡを導入した形質転換植物ゲノムに、形質転換用ベク
ターを用いて組換え体ウイルスゲノムＲＮＡ、例えば組
換え体ＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入し、植物の転写機構に
よって組換え体ＲＮＡ３を転写させ、植物細胞中に生産
されているＲＮＡ複製酵素、例えば１ａ及び２ａ蛋白質
によって組換え体ウイルスゲノムＲＮＡ、例えば組換え
体ＲＮＡ３が複製されるとともにサブゲノムである組換
え体ＲＮＡ４も大量に合成され、導入された外来遺伝子
及び産物が大量生産されることになる。若しくは、ＲＮ
Ａ１及び２の両ｃＤＮＡを導入した形質転換植物細胞に
組換え体ＲＮＡ３を接種すれば、組換え体ＲＮＡ３の複
製及びサブゲノムである組換え体ＲＮＡ４も大量に合成
される。
体プロトプラストにおける外来遺伝子の発現 ＲＮＡ複製酵素遺伝子、例えばＲＮＡ１及び２の両ｃＤ
ＮＡを導入した形質転換細胞中では生物活性を持つＲＮ
Ａ複製酵素、例えば１ａ及び２ａ蛋白質が全ての細胞で
発現される（Ｍｏｒｉら、（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７３：１６９−１７２）。つまり、このよう
な形質転換細胞中では、ウイルスゲノムを植物の転写及
び翻訳機構によって発現させることができる。又、まず
ＲＮＡ複製酵素遺伝子、例えばＲＮＡ１及び２の両ｃＤ
ＮＡを導入した形質転換植物ゲノムに、形質転換用ベク
ターを用いて組換え体ウイルスゲノムＲＮＡ、例えば組
換え体ＲＮＡ３のｃＤＮＡを導入し、植物の転写機構に
よって組換え体ＲＮＡ３を転写させ、植物細胞中に生産
されているＲＮＡ複製酵素、例えば１ａ及び２ａ蛋白質
によって組換え体ウイルスゲノムＲＮＡ、例えば組換え
体ＲＮＡ３が複製されるとともにサブゲノムである組換
え体ＲＮＡ４も大量に合成され、導入された外来遺伝子
及び産物が大量生産されることになる。若しくは、ＲＮ
Ａ１及び２の両ｃＤＮＡを導入した形質転換植物細胞に
組換え体ＲＮＡ３を接種すれば、組換え体ＲＮＡ３の複
製及びサブゲノムである組換え体ＲＮＡ４も大量に合成
される。
【００２７】形質転換植物ゲノム中の組換え体ウイルス
ゲノムＲＮＡｃＤＮＡ、例えばＲＮＡ３のｃＤＮＡの確
認はサザンブロティングによって、組換え体ＲＮＡ３の
複製及び組換え体ＲＮＡ４の合成の確認はノーザンブロ
ティングによって、外来遺伝子産物の生産は、例えばヒ
ト由来γ−インターフェロン（以後ＩＦＮという）遺伝
子を導入した場合、抗ＩＦＮ抗体によるウエスタンブロ
ッティングによって確認することができる。外来遺伝子
として、β−グルクロニダーゼ（以後ＧＵＳという）を
用いる場合には、一般的に用いられる蛍光分光法（Ｇｕ
ｓ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｅ
ｒ’ｓ ｍａｎｕａｌ）によって確認できる。
ゲノムＲＮＡｃＤＮＡ、例えばＲＮＡ３のｃＤＮＡの確
認はサザンブロティングによって、組換え体ＲＮＡ３の
複製及び組換え体ＲＮＡ４の合成の確認はノーザンブロ
ティングによって、外来遺伝子産物の生産は、例えばヒ
ト由来γ−インターフェロン（以後ＩＦＮという）遺伝
子を導入した場合、抗ＩＦＮ抗体によるウエスタンブロ
ッティングによって確認することができる。外来遺伝子
として、β−グルクロニダーゼ（以後ＧＵＳという）を
用いる場合には、一般的に用いられる蛍光分光法（Ｇｕ
ｓ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｅ
ｒ’ｓ ｍａｎｕａｌ）によって確認できる。
【００２８】ＲＮＡ１ｃＤＮＡ、ＲＮＡ２ｃＤＮＡ、組
換え体ＲＮＡ３ｃＤＮＡをゲノムに導入した形質転換植
物細胞中で、例えば外来遺伝子をβーグルグロニダーゼ
とした場合、βーグルグロニダーゼが生産されることが
既に確認されている（米国特許出願第０７／６６３１６
４号）。そのため、外来遺伝子置換部位を決定するため
の遺伝子発現効率の比較は、ＲＮＡ１ｃＤＮＡ、ＲＮＡ
２ｃＤＮＡ及び外来遺伝子を置換した組換え体ＲＮＡｃ
ＤＮＡの３者を植物ゲノムに導入した植物体を用いて検
討するよりも、ｉ）ＲＮＡ１ｃＤＮＡ及びＲＮＡ２ｃＤ
ＮＡをゲノムに導入した組換え体植物のプロトプラスト
に合成した組換え体ＲＮＡを接種するか、若しくはｉ
ｉ）合成したＲＮＡ１、ＲＮＡ２及び組換え体ＲＮＡを
植物プロトプラストに同時接種することによって、簡
便、正確かつ再現性高く行うことができる。なぜなら
ば、組換え体ＲＮＡｃＤＮＡを植物ゲノムに導入する場
合、ゲノム中における導入部位、導入数によって、細胞
中で転写される組換え体ＲＮＡの量に差異が認められる
からである。接種の方法としては、ポリカチオン法、ポ
リエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法
等の公知の方法が用いられる。
換え体ＲＮＡ３ｃＤＮＡをゲノムに導入した形質転換植
物細胞中で、例えば外来遺伝子をβーグルグロニダーゼ
とした場合、βーグルグロニダーゼが生産されることが
既に確認されている（米国特許出願第０７／６６３１６
４号）。そのため、外来遺伝子置換部位を決定するため
の遺伝子発現効率の比較は、ＲＮＡ１ｃＤＮＡ、ＲＮＡ
２ｃＤＮＡ及び外来遺伝子を置換した組換え体ＲＮＡｃ
ＤＮＡの３者を植物ゲノムに導入した植物体を用いて検
討するよりも、ｉ）ＲＮＡ１ｃＤＮＡ及びＲＮＡ２ｃＤ
ＮＡをゲノムに導入した組換え体植物のプロトプラスト
に合成した組換え体ＲＮＡを接種するか、若しくはｉ
ｉ）合成したＲＮＡ１、ＲＮＡ２及び組換え体ＲＮＡを
植物プロトプラストに同時接種することによって、簡
便、正確かつ再現性高く行うことができる。なぜなら
ば、組換え体ＲＮＡｃＤＮＡを植物ゲノムに導入する場
合、ゲノム中における導入部位、導入数によって、細胞
中で転写される組換え体ＲＮＡの量に差異が認められる
からである。接種の方法としては、ポリカチオン法、ポ
リエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法
等の公知の方法が用いられる。
【００２９】ＢＭＶは１ａ、２ａ、３ａ及び外被蛋白質
を生産する。また、系統によって２０ＫＤの本来の外皮
蛋白質（ＣＰ１）の他１９ＫＤの外皮蛋白質（ＣＰ２）
も生産することが知られている。（Ｓａｃｈｅｒ ａｎ
ｄ Ａｈｌｑｕｉｓｔ、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６３：４５４５−４５５２）。本発明者は、ＢＭＶ,Ａ
ＴＣＣ６６系統を用いて１ａ蛋白質、２ａ蛋白質、３ａ
蛋白質および外被蛋白質遺伝子の１番目の翻訳開始コド
ンからの部分、あるいは外被蛋白質遺伝子の１番目以降
の翻訳開始コドンからの部分を、外来遺伝子、例えばＩ
ＦＮ若しくはＧＵＳと置き換え、外来遺伝子置換部位と
外来遺伝子産物生産量の関係を検討した結果、驚くべき
ことにＣＰ２を外来遺伝子と置き換えたときに飛躍的に
外来遺伝子の生産量が高まることを見い出した。この理
由として、本発明者は理論に拘束されるものではない
が、上記の外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡの５’末端非翻訳
領域から、外被蛋白質構造遺伝子中の２番目の翻訳開始
コドンまでのヌクレオチド部分の配列が重要であると考
る。
を生産する。また、系統によって２０ＫＤの本来の外皮
蛋白質（ＣＰ１）の他１９ＫＤの外皮蛋白質（ＣＰ２）
も生産することが知られている。（Ｓａｃｈｅｒ ａｎ
ｄ Ａｈｌｑｕｉｓｔ、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６３：４５４５−４５５２）。本発明者は、ＢＭＶ,Ａ
ＴＣＣ６６系統を用いて１ａ蛋白質、２ａ蛋白質、３ａ
蛋白質および外被蛋白質遺伝子の１番目の翻訳開始コド
ンからの部分、あるいは外被蛋白質遺伝子の１番目以降
の翻訳開始コドンからの部分を、外来遺伝子、例えばＩ
ＦＮ若しくはＧＵＳと置き換え、外来遺伝子置換部位と
外来遺伝子産物生産量の関係を検討した結果、驚くべき
ことにＣＰ２を外来遺伝子と置き換えたときに飛躍的に
外来遺伝子の生産量が高まることを見い出した。この理
由として、本発明者は理論に拘束されるものではない
が、上記の外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡの５’末端非翻訳
領域から、外被蛋白質構造遺伝子中の２番目の翻訳開始
コドンまでのヌクレオチド部分の配列が重要であると考
る。
【００３０】この配列は、５’ＧＴＡＴＴＴＡＡＴＧＴ
ＣＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＧＡＴＧ（配
列番号：１）であることが判明した。すなわち、ＢＭＶ
ＡＴＣＣ６６外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡの５’末端非
翻訳領域に相当するヌクレオチド部分から１番目の翻訳
開始コドン周辺のヌクレオチド配列が翻訳に不適切であ
り、かつ、２番目の翻訳開始コドン付近のヌクレオチド
配列が翻訳に適した構造であり、２番目の翻訳開始コド
ンから翻訳が行なわれることが、ＡＴＣＣ６６のＣＰ２
からの翻訳能を高めている可能性がある。また、本発明
はＡＴＣＣ６６のＣＰ２を外来遺伝子と置き換えること
によって、外被蛋白質との融合蛋白質ではない目的とす
る外来遺伝子産物が大量に生産されるという優れた効果
を有する画期的な発明である。
ＣＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＧＡＴＧ（配
列番号：１）であることが判明した。すなわち、ＢＭＶ
ＡＴＣＣ６６外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡの５’末端非
翻訳領域に相当するヌクレオチド部分から１番目の翻訳
開始コドン周辺のヌクレオチド配列が翻訳に不適切であ
り、かつ、２番目の翻訳開始コドン付近のヌクレオチド
配列が翻訳に適した構造であり、２番目の翻訳開始コド
ンから翻訳が行なわれることが、ＡＴＣＣ６６のＣＰ２
からの翻訳能を高めている可能性がある。また、本発明
はＡＴＣＣ６６のＣＰ２を外来遺伝子と置き換えること
によって、外被蛋白質との融合蛋白質ではない目的とす
る外来遺伝子産物が大量に生産されるという優れた効果
を有する画期的な発明である。
【００３１】このことから、本発明によれば、他の植物
ＲＮＡウイルスであっても、外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡ
の５’末端非翻訳領域に相当するヌクレオチド部分に、
Ｋｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５
４：３６７−３８２）による部位特異的突然変異等によ
って欠失若しくは置換などの遺伝子操作を行ない、１番
目の翻訳開始コドン周辺のヌクレオチド配列を翻訳に不
適切にし、かつ、２番目の翻訳開始コドン周辺のヌクレ
オチド配列を翻訳に適した構造にし、２番目の翻訳開始
コドンから翻訳が行なわれるように改変するような遺伝
子操作を行うことによって、飛躍的に目的とする遺伝子
産物の生産を高めることができることができる。また、
人為的に本来の翻訳開始点より下流にＡＴＧ部位を作出
し、人為的に作出したＡＴＧ部位から翻訳を開始させる
ことも可能である。
ＲＮＡウイルスであっても、外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡ
の５’末端非翻訳領域に相当するヌクレオチド部分に、
Ｋｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５
４：３６７−３８２）による部位特異的突然変異等によ
って欠失若しくは置換などの遺伝子操作を行ない、１番
目の翻訳開始コドン周辺のヌクレオチド配列を翻訳に不
適切にし、かつ、２番目の翻訳開始コドン周辺のヌクレ
オチド配列を翻訳に適した構造にし、２番目の翻訳開始
コドンから翻訳が行なわれるように改変するような遺伝
子操作を行うことによって、飛躍的に目的とする遺伝子
産物の生産を高めることができることができる。また、
人為的に本来の翻訳開始点より下流にＡＴＧ部位を作出
し、人為的に作出したＡＴＧ部位から翻訳を開始させる
ことも可能である。
【００３２】組換え体ＲＮＡは、ウイルスが植物体全身
に転移するときに必要な外被蛋白質（Ａｌｌｉｓｏｎ
ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：１８２０−１８２４）遺伝子部分を
取り除いているため、接種法では植物体全体で外来遺伝
子を発現させることは不可能である。本発明では、ＲＮ
Ａ複製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した組
換え植物に、組換え体ＲＮＡｃＤＮＡをさらに導入し組
換え植物体で外来遺伝子を発現させる方法もとっている
ため、植物体全体で外来遺伝子を発現させることが可能
になる。
に転移するときに必要な外被蛋白質（Ａｌｌｉｓｏｎ
ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：１８２０−１８２４）遺伝子部分を
取り除いているため、接種法では植物体全体で外来遺伝
子を発現させることは不可能である。本発明では、ＲＮ
Ａ複製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した組
換え植物に、組換え体ＲＮＡｃＤＮＡをさらに導入し組
換え植物体で外来遺伝子を発現させる方法もとっている
ため、植物体全体で外来遺伝子を発現させることが可能
になる。
【００３３】本発明の方法は、ＲＮＡ植物ウイルスのゲ
ノムにコードされたウイルスＲＮＡ複製酵素を植物ゲノ
ムに導入し、植物の転写翻訳機構によってＲＮＡ複製酵
素を生産させ、植物細胞中において所望の遺伝子のｍＲ
ＮＡを大量に合成し、さらに翻訳能を高め、遺伝子産物
の効率的な生産を可能とするので、産業上の利用価値は
極めて大きいものである。本発明の方法では、外来遺伝
子はウイルスゲノムＲＮＡの外被蛋白質遺伝子と置き換
えられてから植物形質転換用ベクターに組み込まれ植物
ゲノムに導入され、植物細胞中で組換え体ＲＮＡとして
転写させるか、又は、組換え体転写ベクターに組み込ま
れｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成された組換え体ＲＮＡとし
て植物に接種されるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ的にすべて
のウイルスゲノムＲＮＡを合成して植物に接種するより
も、極めて効率的な利用法になる。また、ＢＭＶ ＡＴ
ＣＣ６６のように、５’末端非翻訳領域から外被蛋白質
遺伝子内の２番目の翻訳開始コドンまでのヌクレオチド
配列をＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、（１９
８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１５４：３６７−３８２）による部位特異的突然変異等
によって欠失若しくは置換などの改変を行い、外来遺伝
子と置き換えられる部分を外被蛋白質遺伝子の２番目の
翻訳開始コドン以降にすると、外被蛋白質との融合蛋白
質ではなく目的とする外来遺伝子産物が飛躍的に生産さ
れることから、さらなる産業上の利用価値が高まってい
る。
ノムにコードされたウイルスＲＮＡ複製酵素を植物ゲノ
ムに導入し、植物の転写翻訳機構によってＲＮＡ複製酵
素を生産させ、植物細胞中において所望の遺伝子のｍＲ
ＮＡを大量に合成し、さらに翻訳能を高め、遺伝子産物
の効率的な生産を可能とするので、産業上の利用価値は
極めて大きいものである。本発明の方法では、外来遺伝
子はウイルスゲノムＲＮＡの外被蛋白質遺伝子と置き換
えられてから植物形質転換用ベクターに組み込まれ植物
ゲノムに導入され、植物細胞中で組換え体ＲＮＡとして
転写させるか、又は、組換え体転写ベクターに組み込ま
れｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成された組換え体ＲＮＡとし
て植物に接種されるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ的にすべて
のウイルスゲノムＲＮＡを合成して植物に接種するより
も、極めて効率的な利用法になる。また、ＢＭＶ ＡＴ
ＣＣ６６のように、５’末端非翻訳領域から外被蛋白質
遺伝子内の２番目の翻訳開始コドンまでのヌクレオチド
配列をＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、（１９
８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１５４：３６７−３８２）による部位特異的突然変異等
によって欠失若しくは置換などの改変を行い、外来遺伝
子と置き換えられる部分を外被蛋白質遺伝子の２番目の
翻訳開始コドン以降にすると、外被蛋白質との融合蛋白
質ではなく目的とする外来遺伝子産物が飛躍的に生産さ
れることから、さらなる産業上の利用価値が高まってい
る。
【００３４】組換え体ウイルスゲノムＲＮＡ、例えば組
換え体ＲＮＡ３に導入される遺伝子としては、種々のも
のが考えられる。たとえば、農業上有用な蛋白質、機能
性蛋白質、医薬となる蛋白質例えばインターフェロン
等、の遺伝子が導入可能である。この場合、細菌を用い
た方法では活性のある蛋白質が得られないもの、例えば
糖鎖構造の付与が蛋白質の活性に重要なものが導入可能
である。さらには、動物細胞あるいは細菌では細胞が死
滅してしまう毒性のある蛋白質がもし植物細胞にたいし
て毒性がなければ、本方法は極めて有効な手段となりう
る。又、作物育種に利用する場合には、従来の植物ゲノ
ムに数コピーの外来遺伝子を組み込む方法より、外来遺
伝子のｍＲＮＡ生産量が多いため、より高い形質の発現
が獲得できる。例えば、外来遺伝子がウイルスの外被蛋
白質遺伝子であればウイルス抵抗性植物の育種につなが
り、ササゲトリプシンインヒビター遺伝子であればスペ
クトラムの広い害虫抵抗性植物の育種につながる。さら
に、内在性ＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡを組込
み、植物細胞中でアンチセンスＲＮＡを大量に合成すれ
ば、内在性ＲＮＡの翻訳を抑制することができ、植物遺
伝子の発現を調節することが可能である。
換え体ＲＮＡ３に導入される遺伝子としては、種々のも
のが考えられる。たとえば、農業上有用な蛋白質、機能
性蛋白質、医薬となる蛋白質例えばインターフェロン
等、の遺伝子が導入可能である。この場合、細菌を用い
た方法では活性のある蛋白質が得られないもの、例えば
糖鎖構造の付与が蛋白質の活性に重要なものが導入可能
である。さらには、動物細胞あるいは細菌では細胞が死
滅してしまう毒性のある蛋白質がもし植物細胞にたいし
て毒性がなければ、本方法は極めて有効な手段となりう
る。又、作物育種に利用する場合には、従来の植物ゲノ
ムに数コピーの外来遺伝子を組み込む方法より、外来遺
伝子のｍＲＮＡ生産量が多いため、より高い形質の発現
が獲得できる。例えば、外来遺伝子がウイルスの外被蛋
白質遺伝子であればウイルス抵抗性植物の育種につなが
り、ササゲトリプシンインヒビター遺伝子であればスペ
クトラムの広い害虫抵抗性植物の育種につながる。さら
に、内在性ＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡを組込
み、植物細胞中でアンチセンスＲＮＡを大量に合成すれ
ば、内在性ＲＮＡの翻訳を抑制することができ、植物遺
伝子の発現を調節することが可能である。
【００３５】
【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが本発明はこれらに限定されるべきものでは
ない。 実施例１．ＢＭＶＲＮＡ転写ベクター及び植物形質転換
用ベクターの構築 Ａ．ＢＭＶ ＲＮＡ１、２及び３のｃＤＮＡの作製 ＢＭＶはＡＴＣＣ６６系統を用いた。ウイルス増殖には
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌａｇａｒｅ Ｌ．品
種：五畝四石）を用い、公知の分画遠心分離法（Ｏｋｕ
ｎｏら、（１９７８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．３８：４
０９−４１８））によってウイルス粒子を純化し、純化
ＢＭＶを用いてベントナイト及びＳＤＳ存在下でフェノ
ール抽出を３ー４回繰り返し、エチルエーテル処理、エ
タノール沈澱を行ないＲＮＡを得た。
に説明するが本発明はこれらに限定されるべきものでは
ない。 実施例１．ＢＭＶＲＮＡ転写ベクター及び植物形質転換
用ベクターの構築 Ａ．ＢＭＶ ＲＮＡ１、２及び３のｃＤＮＡの作製 ＢＭＶはＡＴＣＣ６６系統を用いた。ウイルス増殖には
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌａｇａｒｅ Ｌ．品
種：五畝四石）を用い、公知の分画遠心分離法（Ｏｋｕ
ｎｏら、（１９７８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．３８：４
０９−４１８））によってウイルス粒子を純化し、純化
ＢＭＶを用いてベントナイト及びＳＤＳ存在下でフェノ
ール抽出を３ー４回繰り返し、エチルエーテル処理、エ
タノール沈澱を行ないＲＮＡを得た。
【００３６】得られたＲＮＡの溶液を、標準的な低融点
アガロース電気泳動を用いた分離法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により、Ｒ
ＮＡ１、２及び３をそれぞれ得た。得られた各ＲＮＡか
ら、公知の方法（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９８４）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７２：３６９−３８３）によ
ってＲＮＡ１、２および３の完全長ｃＤＮＡを調製しｐ
ＵＣベクターにクローニングしたものがそれぞれｐＢＢ
１、２及び３である。ｐＢＢ１、２及び３は、完全長ｃ
ＤＮＡのＢＭＶ ＲＮＡ５’末端に相当する部位にＳｎ
ａＢＩ部位を持ち３’末端のすぐ下流にＥｃｏＲＩ部位
を持っている。
アガロース電気泳動を用いた分離法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により、Ｒ
ＮＡ１、２及び３をそれぞれ得た。得られた各ＲＮＡか
ら、公知の方法（Ａｈｌｑｕｉｓｔら、（１９８４）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７２：３６９−３８３）によ
ってＲＮＡ１、２および３の完全長ｃＤＮＡを調製しｐ
ＵＣベクターにクローニングしたものがそれぞれｐＢＢ
１、２及び３である。ｐＢＢ１、２及び３は、完全長ｃ
ＤＮＡのＢＭＶ ＲＮＡ５’末端に相当する部位にＳｎ
ａＢＩ部位を持ち３’末端のすぐ下流にＥｃｏＲＩ部位
を持っている。
【００３７】Ｂ．ＢＭＶ ＲＮＡ転写ベクターの構築と
感染性ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成 Ｂ−１ ＢＭＶ ＲＮＡ転写ベクター（ｐＢＴＦ１、２
及び３）の構築 ＢＭＶ ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成するには、
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが不可欠である。ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリメラー
ゼ等が市販されているが、本実験では、プロモーター領
域の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかになって
おり並びに高転写活性を有することから、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ（Ｄｕｎｎら、（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６：４７７−５３５）を用いたｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ ＢＭＶ ＲＮＡ合成系を確立した。ウイルスＲ
ＮＡの５’末端の核酸の構造は、ウイルスＲＮＡの複製
や翻訳等において非常に重要な機能を持っており、５’
末端に余分な塩基配列が付加されるとウイルスＲＮＡの
生物活性は激減することが報告されている（Ｊａｎｄａ
ら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５９−
２６２）。そのため、野生型と同一の５’末端の塩基配
列を持つウイルスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成す
るには、ｃＤＮＡの５’末端から正確に転写が開始され
ねばならない。従って、転写開始点を平滑末端化し、Ｂ
ＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入するために、Ｔ７
プロモーターの転写開始点に制限酵素認識部位を導入す
ることを試みた。
感染性ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成 Ｂ−１ ＢＭＶ ＲＮＡ転写ベクター（ｐＢＴＦ１、２
及び３）の構築 ＢＭＶ ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成するには、
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが不可欠である。ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＲＮＡポリメラー
ゼ等が市販されているが、本実験では、プロモーター領
域の塩基配列並びに転写開始点が正確に明らかになって
おり並びに高転写活性を有することから、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ（Ｄｕｎｎら、（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６：４７７−５３５）を用いたｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ ＢＭＶ ＲＮＡ合成系を確立した。ウイルスＲ
ＮＡの５’末端の核酸の構造は、ウイルスＲＮＡの複製
や翻訳等において非常に重要な機能を持っており、５’
末端に余分な塩基配列が付加されるとウイルスＲＮＡの
生物活性は激減することが報告されている（Ｊａｎｄａ
ら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５９−
２６２）。そのため、野生型と同一の５’末端の塩基配
列を持つウイルスＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成す
るには、ｃＤＮＡの５’末端から正確に転写が開始され
ねばならない。従って、転写開始点を平滑末端化し、Ｂ
ＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入するために、Ｔ７
プロモーターの転写開始点に制限酵素認識部位を導入す
ることを試みた。
【００３８】Ｂ−１−１ Ｔ７プロモーターの合成 ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社モデル３８１Ａ）を用いて、２種の３１塩基からな
るオリゴヌクレチオド５’ｐｄ（ＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴ
ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡ）（配列
番号：２）及び５’ｐｄ（ＡＧＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＴ）（配列番号：
３）を合成した。合成終了後、常法に従って高速液体ク
ロマトグラフィーによって精製し、回収したオリゴヌク
レチオド溶液に１／２００容量の２Ｎ ＨＣｌを加え中
和した後、ＮＥＮＳＯＲＢ２０（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）
に添加して脱塩を行なった。
ｓ社モデル３８１Ａ）を用いて、２種の３１塩基からな
るオリゴヌクレチオド５’ｐｄ（ＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴ
ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡ）（配列
番号：２）及び５’ｐｄ（ＡＧＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＴ）（配列番号：
３）を合成した。合成終了後、常法に従って高速液体ク
ロマトグラフィーによって精製し、回収したオリゴヌク
レチオド溶液に１／２００容量の２Ｎ ＨＣｌを加え中
和した後、ＮＥＮＳＯＲＢ２０（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）
に添加して脱塩を行なった。
【００３９】まず、２ｍｌのメタノール（高速液体クロ
マトグラフィー用、ナカライテスク社製）、２ｍｌのＡ
液（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔ
ｈｙｌａｍｉｎｅ（ＴＥＡ）、１ｍＭ Ｎａ2−ＥＤＴ
Ａ）、ｐＨ７．７）によってカラムの平衡化を行なっ
た。次にサンプルに１．４μｇ／ｍｌの割り合いでＴＥ
Ａを加えたものをカラムに添加し吸着させた。６ー９ｍ
ｌのＡ液及び３ｍｌのイオン交換水でカラムを洗浄した
後、４００μｌの５０％エタノール（特級、ナカライテ
スク社製）により、オリゴヌクレチオドを溶出した。溶
出したオリゴヌクレチオド溶液をエバポレーターによっ
て減圧乾固後イオン交換水に溶解し、１μｇ／ｍｌのオ
リゴヌクレチオド溶液を調製した。これらの合成オリゴ
ヌクレチオドの５’及び３’末端をリン酸化した。すな
わち、１μｌのオリゴヌクレチオド（１μｇ／ｍｌ）、
２０μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、２０μｌの１０Ｘキナー
ゼ溶液（５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１
００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ジチオスレイトール
（ＤＴＴ））、４μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（４ｕｎｉｔ／μｌ、宝酒造社製）及び１５５μｌのイ
オン交換水を含む反応液を３７℃、１時間反応させ、オ
リゴヌクレチオドのリン酸化を行なった。反応後、６５
℃、１０分間の熱処理によって酵素の不活化を行なっ
た。
マトグラフィー用、ナカライテスク社製）、２ｍｌのＡ
液（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｅｔ
ｈｙｌａｍｉｎｅ（ＴＥＡ）、１ｍＭ Ｎａ2−ＥＤＴ
Ａ）、ｐＨ７．７）によってカラムの平衡化を行なっ
た。次にサンプルに１．４μｇ／ｍｌの割り合いでＴＥ
Ａを加えたものをカラムに添加し吸着させた。６ー９ｍ
ｌのＡ液及び３ｍｌのイオン交換水でカラムを洗浄した
後、４００μｌの５０％エタノール（特級、ナカライテ
スク社製）により、オリゴヌクレチオドを溶出した。溶
出したオリゴヌクレチオド溶液をエバポレーターによっ
て減圧乾固後イオン交換水に溶解し、１μｇ／ｍｌのオ
リゴヌクレチオド溶液を調製した。これらの合成オリゴ
ヌクレチオドの５’及び３’末端をリン酸化した。すな
わち、１μｌのオリゴヌクレチオド（１μｇ／ｍｌ）、
２０μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、２０μｌの１０Ｘキナー
ゼ溶液（５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１
００ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ジチオスレイトール
（ＤＴＴ））、４μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（４ｕｎｉｔ／μｌ、宝酒造社製）及び１５５μｌのイ
オン交換水を含む反応液を３７℃、１時間反応させ、オ
リゴヌクレチオドのリン酸化を行なった。反応後、６５
℃、１０分間の熱処理によって酵素の不活化を行なっ
た。
【００４０】反応液にフェノール処理２回、フェノール
／クロロホルム処理１回、クロロホルム処理１回及びエ
チルエーテル処理３回を行ない、その後減圧下に３０ー
４０分間置き、反応液中に混在するエチルエーテルを完
全に除去した。この反応液をＮＥＮＳＯＲＢ２０カラム
に添加し、上述と同様の方法によってリン酸化オリゴヌ
クレチオドの精製を行なった後、減圧乾固し５０ｎｇ／
ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、以後の操作に供試し
た。これらの合成オリゴヌクレチオドをアニーリングし
てＴ７プロモーターを合成した。このプロモーター配列
はＴ７プロモーターのコンセンサス配列の他に５’末端
にＨｉｎｄＩＩＩ部位、３’末端にＸｂａＩ部位を突出
して持ち、さらに、転写開始点から（＋４）の位置にＮ
ｓｉＩ部位を持つ。
／クロロホルム処理１回、クロロホルム処理１回及びエ
チルエーテル処理３回を行ない、その後減圧下に３０ー
４０分間置き、反応液中に混在するエチルエーテルを完
全に除去した。この反応液をＮＥＮＳＯＲＢ２０カラム
に添加し、上述と同様の方法によってリン酸化オリゴヌ
クレチオドの精製を行なった後、減圧乾固し５０ｎｇ／
ｍｌとなるように蒸留水に溶解し、以後の操作に供試し
た。これらの合成オリゴヌクレチオドをアニーリングし
てＴ７プロモーターを合成した。このプロモーター配列
はＴ７プロモーターのコンセンサス配列の他に５’末端
にＨｉｎｄＩＩＩ部位、３’末端にＸｂａＩ部位を突出
して持ち、さらに、転写開始点から（＋４）の位置にＮ
ｓｉＩ部位を持つ。
【００４１】Ｂ−１−２ 転写ベクターｐＵＣＴへの
ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの導入（図５） 合成Ｔ７プロモーターをｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／
ＸｂａＩ部位に導入し転写ベクターｐＵＣＴを構築し
た。ｐＵＣＴにＮｓｉＩおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理を行ない、Ｔ７プロモーターの（＋１）位までの塩
基を除去し（−１）位の塩基対で平滑末端を形成させる
ことができる。ｐＢＢ１、ｐＢＢ２、ｐＢＢ３それぞれ
のＢＭＶ ＲＮＡ全長ｃＤＮＡを含むＳｎａＢＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ断片と，ＮｓｉＩ及びＴ４ポリメラーゼ処理後Ｅ
ｃｏＲＩ処理を行なったｐＵＣＴの大断片とライゲーシ
ョンし、ＢＭＶ ＲＮＡ１、２および３の転写ベクター
ｐＢＴＦ１、２及び３をそれぞれ構築した。
ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの導入（図５） 合成Ｔ７プロモーターをｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／
ＸｂａＩ部位に導入し転写ベクターｐＵＣＴを構築し
た。ｐＵＣＴにＮｓｉＩおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理を行ない、Ｔ７プロモーターの（＋１）位までの塩
基を除去し（−１）位の塩基対で平滑末端を形成させる
ことができる。ｐＢＢ１、ｐＢＢ２、ｐＢＢ３それぞれ
のＢＭＶ ＲＮＡ全長ｃＤＮＡを含むＳｎａＢＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ断片と，ＮｓｉＩ及びＴ４ポリメラーゼ処理後Ｅ
ｃｏＲＩ処理を行なったｐＵＣＴの大断片とライゲーシ
ョンし、ＢＭＶ ＲＮＡ１、２および３の転写ベクター
ｐＢＴＦ１、２及び３をそれぞれ構築した。
【００４２】Ｂ−２ 感染性ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ合成（図５） Ｔ７プロモーターの転写写開始点のすぐ下流にＲＮＡ
１、２及び３のそれぞれの完全長ｃＤＮＡが導入され、
さらに、完全長ｃＤＮＡのすぐ下流にＥｃｏＲＩ部位が
存在する転写ベクターｐＢＴＦ１、２及び３のそれぞれ
のＤＮＡを塩化セシウム遠心分離法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって精製
した。それぞれの精製ＤＮＡ３μｇをＥｃｏＲＩで切断
後、フェノール／クロロホルム処理を行ない、２０μｇ
のｔＲＮＡをキャリアとして用いエタノール沈澱した。
ｏ合成（図５） Ｔ７プロモーターの転写写開始点のすぐ下流にＲＮＡ
１、２及び３のそれぞれの完全長ｃＤＮＡが導入され、
さらに、完全長ｃＤＮＡのすぐ下流にＥｃｏＲＩ部位が
存在する転写ベクターｐＢＴＦ１、２及び３のそれぞれ
のＤＮＡを塩化セシウム遠心分離法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄ、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって精製
した。それぞれの精製ＤＮＡ３μｇをＥｃｏＲＩで切断
後、フェノール／クロロホルム処理を行ない、２０μｇ
のｔＲＮＡをキャリアとして用いエタノール沈澱した。
【００４３】得られた沈澱に１６．８μｌの蒸留水、１
０μｌの５Ｘ転写緩衝液（２００ｍＭ,トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｓ
ｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）、５μｌの
１００ｍＭ,ＤＴＴ、１．８μｌのＤＮａｓｅ／ＲＮａ
ｓｅフリー牛血清アルブミン（２．８ｍｇ／ｍｌ）、
２．５μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、
２．５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、２．５μｌの１０ｍＭ
ＵＴＰ、２．５μｌの１０ｍＭ ＣＴＰ、０．４μｌ
の１０ｍＭ ＧＴＰおよび５μｌの５ｍＭキャップアナ
ログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）を加え、軽く混ぜた後、１μｌ
のＴ７ポリメラーゼを加え、３７℃で反応させた。１時
間後、さらに２μｌの１０ｍＭ ＧＴＰおよび１μｌの
Ｔ７ポリメラーゼを加え、３７℃、１時間反応させた。
その後、１．３μｌのＤＮａｓｅ（１ｕｎｉｔ／ｍｌ）
を加え、３７℃、１時間反応させ、鋳型ＤＮＡを分解し
た。この反応液をフェノール／クロロホルム及びクロロ
ホルムでそれぞれ１回ずつ処理し、２０μｇのｔＲＮＡ
をキャリアとしてエタノール沈澱した後、１０μｌの蒸
留水に懸濁した。
０μｌの５Ｘ転写緩衝液（２００ｍＭ,トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｓ
ｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）、５μｌの
１００ｍＭ,ＤＴＴ、１．８μｌのＤＮａｓｅ／ＲＮａ
ｓｅフリー牛血清アルブミン（２．８ｍｇ／ｍｌ）、
２．５μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、
２．５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、２．５μｌの１０ｍＭ
ＵＴＰ、２．５μｌの１０ｍＭ ＣＴＰ、０．４μｌ
の１０ｍＭ ＧＴＰおよび５μｌの５ｍＭキャップアナ
ログ（ｍ７ＧｐｐｐＧ）を加え、軽く混ぜた後、１μｌ
のＴ７ポリメラーゼを加え、３７℃で反応させた。１時
間後、さらに２μｌの１０ｍＭ ＧＴＰおよび１μｌの
Ｔ７ポリメラーゼを加え、３７℃、１時間反応させた。
その後、１．３μｌのＤＮａｓｅ（１ｕｎｉｔ／ｍｌ）
を加え、３７℃、１時間反応させ、鋳型ＤＮＡを分解し
た。この反応液をフェノール／クロロホルム及びクロロ
ホルムでそれぞれ１回ずつ処理し、２０μｇのｔＲＮＡ
をキャリアとしてエタノール沈澱した後、１０μｌの蒸
留水に懸濁した。
【００４４】上述の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏ合成したＢ
ＭＶ ＲＮＡ１、２および３ｃＤＮＡのそれぞれの転写
物を混合し、それに等量の２Ｘ接種緩衝液（１００ｍ
Ｍ,トリス−リン酸（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（Ｗ／Ｖ）ベントナイ
ト）を加え接種液とした。全身感染宿主であるオオムギ
葉の上に軽くカーボランダム（６００メッシュ）を振り
かけ、５ー１０μｌの接種液滴を塗沫接種した。接種
後、すぐに葉上のカーボランダムを水道水で洗い流し
た。約２週間、２５℃のグロースチャンバー（８，００
０ＬＵＸ）で育成したところ、全身感染病徴を発現した
ため、転写ベクターｐＢＴＦ１、２及び３の転写物は感
染性のあることが確認された。
ＭＶ ＲＮＡ１、２および３ｃＤＮＡのそれぞれの転写
物を混合し、それに等量の２Ｘ接種緩衝液（１００ｍ
Ｍ,トリス−リン酸（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（Ｗ／Ｖ）ベントナイ
ト）を加え接種液とした。全身感染宿主であるオオムギ
葉の上に軽くカーボランダム（６００メッシュ）を振り
かけ、５ー１０μｌの接種液滴を塗沫接種した。接種
後、すぐに葉上のカーボランダムを水道水で洗い流し
た。約２週間、２５℃のグロースチャンバー（８，００
０ＬＵＸ）で育成したところ、全身感染病徴を発現した
ため、転写ベクターｐＢＴＦ１、２及び３の転写物は感
染性のあることが確認された。
【００４５】Ｃ．植物形質転換用ベクターの構築 Ｃ−１ ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの転写開始点へ
の制限酵素認識部位の導入 植物細胞内に存在するＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーター及びターミネーターの間
にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入することを試
みた。プロモーターとしては、転写量が多く、転写開始
点及びプロモーター領域の塩基配列が明らかにされてい
ることを考慮して、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを用
いた。また、５’末端に余分な７塩基の塩基配列を持つ
変異ＢＭＶＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（Ｊａｎ
ｄａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５
９−２６２）が明らかになっているため、植物細胞に導
入したＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核内転写物に
増殖能力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転写開始点を
ＢＭＶ ＲＮＡの５’末端と正確に一致させる必要があ
る。そこで、転写開始点のすぐ下流にＢＭＶ ＲＮＡの
完全長ｃＤＮＡを導入するために、ＣａＭＶの３５Ｓプ
ロモーターの転写開始点に部位特異的突然変異導入法に
よって制限酵素の認識部位を導入した。
の制限酵素認識部位の導入 植物細胞内に存在するＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されるプロモーター及びターミネーターの間
にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入することを試
みた。プロモーターとしては、転写量が多く、転写開始
点及びプロモーター領域の塩基配列が明らかにされてい
ることを考慮して、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを用
いた。また、５’末端に余分な７塩基の塩基配列を持つ
変異ＢＭＶＲＮＡ株は感染能力を持たないこと（Ｊａｎ
ｄａら、（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：２５
９−２６２）が明らかになっているため、植物細胞に導
入したＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの核内転写物に
増殖能力を持たせるためには、ｃＤＮＡの転写開始点を
ＢＭＶ ＲＮＡの５’末端と正確に一致させる必要があ
る。そこで、転写開始点のすぐ下流にＢＭＶ ＲＮＡの
完全長ｃＤＮＡを導入するために、ＣａＭＶの３５Ｓプ
ロモーターの転写開始点に部位特異的突然変異導入法に
よって制限酵素の認識部位を導入した。
【００４６】Ｃ−２ 部位特異的突然変異導入法（図
３） 京都大学農学部植物病理学研究室保存のＣａＭＶ ＣＭ
１８４１株の３５Ｓプロモーター領域（７０１６−７４
３４）をｐＵＣ１８由来のポリリンカー配列及びＣａＭ
Ｖ ＣＭ１８４１株の３５Ｓターミネーター領域（７４
３６−７６０６）の直前に持つｐＣＡＭ３５を用いた。
３５Ｓプロモーター領域の一本鎖ＤＮＡを調製するため
に、ｐＣＡＭ３５のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ
１１８のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＣＡＭ
３５ＥＰを構築した。ｐＣＡＭ３５ＥＰで大腸菌ＭＶ１
１８４株を形質転換し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７
を利用して一本鎖ＤＮＡを調製した。
３） 京都大学農学部植物病理学研究室保存のＣａＭＶ ＣＭ
１８４１株の３５Ｓプロモーター領域（７０１６−７４
３４）をｐＵＣ１８由来のポリリンカー配列及びＣａＭ
Ｖ ＣＭ１８４１株の３５Ｓターミネーター領域（７４
３６−７６０６）の直前に持つｐＣＡＭ３５を用いた。
３５Ｓプロモーター領域の一本鎖ＤＮＡを調製するため
に、ｐＣＡＭ３５のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ
１１８のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＣＡＭ
３５ＥＰを構築した。ｐＣＡＭ３５ＥＰで大腸菌ＭＶ１
１８４株を形質転換し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７
を利用して一本鎖ＤＮＡを調製した。
【００４７】転写開始点にＳｔｕＩ部位を導入するため
に、調製した一本鎖ＤＮＡの転写開始点に３個所のミス
マッチを除いては相補的な２５塩基のオリゴヌクレチオ
ド５’ｐｄ（ＧＴＡＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡ
ＡＴＧＡＡＣ）（配列番号：４）をＢ−１−１に述べた
方法で合成及び調製した。１μｌの一本鎖ＤＮＡ（２０
μｇ／μｌ）、１μｌの合成オリゴヌクレチオド（２μ
ｇ／μｌ）、２０μｌの１０Ｘアニーリング緩衝液（２
００ｍＭ,トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ）、１７８μｌの蒸留水を１．５ｍｌ用エッペンチュ
ーブに入れ、６２℃、１５分間処理を行なった後、７分
間室温で徐冷し、一本鎖ＤＮＡに合成オリゴヌクレチオ
ドをアニールさせた。徐冷後、４０μｌのＫｌｅｎｏｗ
緩衝液（１００ｍＭ,トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），
５０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＤＴＴ）、２０μｌ
のｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰそれぞれ２ｍＭ）、１０μｌのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ（４ｕｎｉｔ／ｍｌ）及び１３０μｌの蒸
留水を加え、２２℃、５時間の酵素反応を行ない、合成
オリゴヌクレチオドをプライマーとして相補的なＤＮＡ
鎖を合成した。
に、調製した一本鎖ＤＮＡの転写開始点に３個所のミス
マッチを除いては相補的な２５塩基のオリゴヌクレチオ
ド５’ｐｄ（ＧＴＡＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡ
ＡＴＧＡＡＣ）（配列番号：４）をＢ−１−１に述べた
方法で合成及び調製した。１μｌの一本鎖ＤＮＡ（２０
μｇ／μｌ）、１μｌの合成オリゴヌクレチオド（２μ
ｇ／μｌ）、２０μｌの１０Ｘアニーリング緩衝液（２
００ｍＭ,トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ）、１７８μｌの蒸留水を１．５ｍｌ用エッペンチュ
ーブに入れ、６２℃、１５分間処理を行なった後、７分
間室温で徐冷し、一本鎖ＤＮＡに合成オリゴヌクレチオ
ドをアニールさせた。徐冷後、４０μｌのＫｌｅｎｏｗ
緩衝液（１００ｍＭ,トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），
５０ｍＭ ＭｇＣｌ2，５０ｍＭ ＤＴＴ）、２０μｌ
のｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰそれぞれ２ｍＭ）、１０μｌのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ（４ｕｎｉｔ／ｍｌ）及び１３０μｌの蒸
留水を加え、２２℃、５時間の酵素反応を行ない、合成
オリゴヌクレチオドをプライマーとして相補的なＤＮＡ
鎖を合成した。
【００４８】反応後、フェノール処理及びフェノール／
クロロホルム処理、エチルエーテル処理後、エタノール
沈澱を行ない、二本鎖ＤＮＡの沈澱を得た。この二本鎖
ＤＮＡをＰｖｕＩＩにより切断した後、フェノール／ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱を行ない、得られた沈
澱に１．５μｌのローディング緩衝液（０．８９Ｍ ト
リス−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（Ｗ／
Ｖ））ブロムフェノールブルー、０．２％（Ｗ／Ｖ）キ
シレンシアノール）及び４３２μｌのホルムアルデヒド
を混合し、９５℃、５分間の熱処理後、氷中で急冷し
た。
クロロホルム処理、エチルエーテル処理後、エタノール
沈澱を行ない、二本鎖ＤＮＡの沈澱を得た。この二本鎖
ＤＮＡをＰｖｕＩＩにより切断した後、フェノール／ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱を行ない、得られた沈
澱に１．５μｌのローディング緩衝液（０．８９Ｍ ト
リス−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（Ｗ／
Ｖ））ブロムフェノールブルー、０．２％（Ｗ／Ｖ）キ
シレンシアノール）及び４３２μｌのホルムアルデヒド
を混合し、９５℃、５分間の熱処理後、氷中で急冷し
た。
【００４９】このサンプルを３．５％ポリアクリルアミ
ド７Ｍ尿素ゲル（１５ｃｍＸ１５ｃｍ、厚さ２ｍｍ、ス
ロット幅１ｃｍ）にロードし、２００Ｖ、２時間電気泳
動し、プライマーによって合成された一本鎖ＤＮＡを分
離した。エチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）でゲ
ルを染色した後、約３０ｍｌのイオン交換水で３回洗浄
し、余分なエチジウムブロミドと尿素の除去を行なっ
た。ＵＶ照射下で目的とするバンドを切出し、１ｍｌの
シリンジ（テルモ）を通してゲルを細片化した。細片化
したゲルを７ｍｌの溶出緩衝液（５００ｍＭ 酢酸アン
モニウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％ＳＤＳ）に入れ、３７℃で一夜放置した。
５０００Ｘｇ、３０分間遠心分離した後、上澄にフェノ
ール処理２回、フェノール／クロロホルム処理１回、ク
ロロホルム処理１回およびエチルエーテル処理３回を行
なった。この液を２−ブタノールで４倍に濃縮した後、
２倍量のエタノール及び１０μｌのｔＲＮＡ（２ｍｇ／
ｍｌ）を加え、エタノール沈澱によって一本鎖ＤＮＡの
沈澱を得、３０μｌの蒸留水に溶解した。
ド７Ｍ尿素ゲル（１５ｃｍＸ１５ｃｍ、厚さ２ｍｍ、ス
ロット幅１ｃｍ）にロードし、２００Ｖ、２時間電気泳
動し、プライマーによって合成された一本鎖ＤＮＡを分
離した。エチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）でゲ
ルを染色した後、約３０ｍｌのイオン交換水で３回洗浄
し、余分なエチジウムブロミドと尿素の除去を行なっ
た。ＵＶ照射下で目的とするバンドを切出し、１ｍｌの
シリンジ（テルモ）を通してゲルを細片化した。細片化
したゲルを７ｍｌの溶出緩衝液（５００ｍＭ 酢酸アン
モニウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％ＳＤＳ）に入れ、３７℃で一夜放置した。
５０００Ｘｇ、３０分間遠心分離した後、上澄にフェノ
ール処理２回、フェノール／クロロホルム処理１回、ク
ロロホルム処理１回およびエチルエーテル処理３回を行
なった。この液を２−ブタノールで４倍に濃縮した後、
２倍量のエタノール及び１０μｌのｔＲＮＡ（２ｍｇ／
ｍｌ）を加え、エタノール沈澱によって一本鎖ＤＮＡの
沈澱を得、３０μｌの蒸留水に溶解した。
【００５０】５μｌの回収した一本鎖ＤＮＡ（０．２μ
ｇ／μｌ）、１．５μｌのＭ１３リバースプライマー
（５０ｎｇ／μｌ、Ｍ１３プライマーＲＶ、宝酒造
社）、１μｌのアニーリング緩衝液（１００ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５００ｍＭ ＮａＣｌ）、１．５μｌのＴＥ緩衝液（１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）及び１μｌのＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（４ｕ
ｎｉｔ／μｌ）を混合して二本鎖ＤＮＡ断片を合成し、
転写開始点にＳｔｕＩ部位を導入した。合成した３５Ｓ
プロモーター領域の断片をＥｃｏＲＩで切断したものを
ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位に導入し、改変
した３５Ｓプロモーター領域を含むｐＣａＰ３５を構築
した。ｐＣａＰ３５をＳｔｕＩで切断することによって
転写開始点を平滑末端にすることができ、ＢＭＶ ＲＮ
Ａの完全長ｃＤＮＡを転写開始点のすぐ下流に導入する
ことができる。
ｇ／μｌ）、１．５μｌのＭ１３リバースプライマー
（５０ｎｇ／μｌ、Ｍ１３プライマーＲＶ、宝酒造
社）、１μｌのアニーリング緩衝液（１００ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５００ｍＭ ＮａＣｌ）、１．５μｌのＴＥ緩衝液（１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）及び１μｌのＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（４ｕ
ｎｉｔ／μｌ）を混合して二本鎖ＤＮＡ断片を合成し、
転写開始点にＳｔｕＩ部位を導入した。合成した３５Ｓ
プロモーター領域の断片をＥｃｏＲＩで切断したものを
ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位に導入し、改変
した３５Ｓプロモーター領域を含むｐＣａＰ３５を構築
した。ｐＣａＰ３５をＳｔｕＩで切断することによって
転写開始点を平滑末端にすることができ、ＢＭＶ ＲＮ
Ａの完全長ｃＤＮＡを転写開始点のすぐ下流に導入する
ことができる。
【００５１】Ｃ−３ 植物形質転換用ベクター（ｐＢ
ＩＣＢＲシリーズ）の構築（図６） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入
し、導入細胞で合成された転写産物が野生型ウイルスＲ
ＮＡと同様な翻訳及び増殖能を持つ形質転換植物作出の
ためのベクターを構築した。植物形質転換用のアグロバ
クテリウム・バイナリーベクターｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖ
ａｎら、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１２：８７１１−８７２１）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位にＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、ｐＵＣ１８
由来のポリリンカー部位およびＣａＭＶターミネーター
を導入したプラスミドがｐＢＩＣ３５である。ｐＢＩＣ
３５をＥｃｏＲＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理
によって平滑末端化し、ＳａｌＩリンカーを付加し、そ
の後ＳａｌＩで切断しセルフライゲーションを行ない、
３５Ｓプロモーターを欠失したｐＢＩＣＴ（−Ｅ）を構
築した。次に、ＳｍａＩで切断したｐＢＩＣＴ（−Ｅ）
をさらにＥｃｏＲＩリンカーを付加した後にセルフライ
ゲーションを行ない、ＳｍａＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に
改変したｐＢＩＣＴＥを構築した。
ＩＣＢＲシリーズ）の構築（図６） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入
し、導入細胞で合成された転写産物が野生型ウイルスＲ
ＮＡと同様な翻訳及び増殖能を持つ形質転換植物作出の
ためのベクターを構築した。植物形質転換用のアグロバ
クテリウム・バイナリーベクターｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖ
ａｎら、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１２：８７１１−８７２１）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位にＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、ｐＵＣ１８
由来のポリリンカー部位およびＣａＭＶターミネーター
を導入したプラスミドがｐＢＩＣ３５である。ｐＢＩＣ
３５をＥｃｏＲＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理
によって平滑末端化し、ＳａｌＩリンカーを付加し、そ
の後ＳａｌＩで切断しセルフライゲーションを行ない、
３５Ｓプロモーターを欠失したｐＢＩＣＴ（−Ｅ）を構
築した。次に、ＳｍａＩで切断したｐＢＩＣＴ（−Ｅ）
をさらにＥｃｏＲＩリンカーを付加した後にセルフライ
ゲーションを行ない、ＳｍａＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に
改変したｐＢＩＣＴＥを構築した。
【００５２】一方、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの転
写開始点に部位特異的突然変異導入法によってＳｔｕＩ
部位を導入した改変型３５Ｓプロモーターを含むｐＣａ
ｐ３５をＥｃｏＲＩ切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理によって両端を平滑末端化し、その両端にＳａｌＩリ
ンカーを付加し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩによって切
断することによって、改変３５Ｓプロモーターを含むＤ
ＮＡ断片を得た。この断片をｐＢＩＣＴＥのＳａｌＩ／
ＢａｍＨＩ部位に導入しｐＢＩＣＰ３５を構築した。次
に、ＢＭＶ ＲＮＡ１、２および３の完全長ｃＤＮＡ断
片を含むｐＢＢ１、ｐＢＢ２及びｐＢＢ３のＳｎａＢＩ
／ＥｃｏＲＩ断片をそれぞれｐＢＩＣＰ３５のＳｔｕＩ
／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベクターｐ
ＢＩＣＢＲ１、２及び３をそれぞれ構築した（図６）。
写開始点に部位特異的突然変異導入法によってＳｔｕＩ
部位を導入した改変型３５Ｓプロモーターを含むｐＣａ
ｐ３５をＥｃｏＲＩ切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理によって両端を平滑末端化し、その両端にＳａｌＩリ
ンカーを付加し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩによって切
断することによって、改変３５Ｓプロモーターを含むＤ
ＮＡ断片を得た。この断片をｐＢＩＣＴＥのＳａｌＩ／
ＢａｍＨＩ部位に導入しｐＢＩＣＰ３５を構築した。次
に、ＢＭＶ ＲＮＡ１、２および３の完全長ｃＤＮＡ断
片を含むｐＢＢ１、ｐＢＢ２及びｐＢＢ３のＳｎａＢＩ
／ＥｃｏＲＩ断片をそれぞれｐＢＩＣＰ３５のＳｔｕＩ
／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベクターｐ
ＢＩＣＢＲ１、２及び３をそれぞれ構築した（図６）。
【００５３】Ｃ−４ 植物形質転換用ベクター（ｐＢ
ＩＣＢＭＲシリーズ）の構築（第７図そのないし図９） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの３’末端欠失ｃＤＮＡ
を導入し、導入細胞で合成された転写産物が翻訳能は持
つが野生型ウイルスＲＮＡのような増殖能は持たない形
質転換体作出のためのベクターを構築した。ＢＭＶ Ｒ
ＮＡ１の完全長ｃＤＮＡを含むｐＢＢ１をＸｈｏＩ切断
後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行ない、両端を平滑末
端化した後ＥｃｏＲＩリンカーを付加し、さらにＥｃｏ
ＲＩ切断した後セルフライゲーションを行なった。その
結果、ＲＮＡ１ ｃＤＮＡの３’末端非翻訳領域のＸｈ
ｏＩから下流の約２００塩基の欠失を持つｐＢＢ１（−
３）を得た。ｐＢＢ１（−３）のＲＮＡ１ ｃＤＮＡを
含むＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＩＣＰ３５のＳ
ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベク
ターｐＢＩＣＢＭＲ１を構築した（第７図）。
ＩＣＢＭＲシリーズ）の構築（第７図そのないし図９） 植物ゲノム内にＢＭＶ ＲＮＡの３’末端欠失ｃＤＮＡ
を導入し、導入細胞で合成された転写産物が翻訳能は持
つが野生型ウイルスＲＮＡのような増殖能は持たない形
質転換体作出のためのベクターを構築した。ＢＭＶ Ｒ
ＮＡ１の完全長ｃＤＮＡを含むｐＢＢ１をＸｈｏＩ切断
後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行ない、両端を平滑末
端化した後ＥｃｏＲＩリンカーを付加し、さらにＥｃｏ
ＲＩ切断した後セルフライゲーションを行なった。その
結果、ＲＮＡ１ ｃＤＮＡの３’末端非翻訳領域のＸｈ
ｏＩから下流の約２００塩基の欠失を持つｐＢＢ１（−
３）を得た。ｐＢＢ１（−３）のＲＮＡ１ ｃＤＮＡを
含むＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＩＣＰ３５のＳ
ｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入し、植物形質転換用ベク
ターｐＢＩＣＢＭＲ１を構築した（第７図）。
【００５４】ＢＭＶ ＲＮＡ２の完全長ｃＤＮＡを含む
ｐＢＢ２をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断後、ｃＤ
ＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に導入し、ＲＮＡ２の３’末端の非翻訳領域を欠失した
ｃＤＮＡを含むｐＢＢ２（−Ｈ）を得た。ｐＢＢ２（−
Ｈ）をＨｉｎｄＩＩＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理を行ない、両端を平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ
ーを付加し、さらにＥｃｏＲＩ切断した後セルフライゲ
ーションを行なった。その結果、ＲＮＡ２の３’末端の
非翻訳領域のＨｉｎｄＩＩＩから下流約２００塩基の欠
失を持つｐＢＢ２（−３）を得た。ｐＢＢ２（−３）の
ＲＮＡ２ ｃＤＮＡを含むＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片
をｐＢＩＣＰ３５のＳｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入
し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ２を構築し
た（図８）。
ｐＢＢ２をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断後、ｃＤ
ＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に導入し、ＲＮＡ２の３’末端の非翻訳領域を欠失した
ｃＤＮＡを含むｐＢＢ２（−Ｈ）を得た。ｐＢＢ２（−
Ｈ）をＨｉｎｄＩＩＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理を行ない、両端を平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ
ーを付加し、さらにＥｃｏＲＩ切断した後セルフライゲ
ーションを行なった。その結果、ＲＮＡ２の３’末端の
非翻訳領域のＨｉｎｄＩＩＩから下流約２００塩基の欠
失を持つｐＢＢ２（−３）を得た。ｐＢＢ２（−３）の
ＲＮＡ２ ｃＤＮＡを含むＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片
をｐＢＩＣＰ３５のＳｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入
し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ２を構築し
た（図８）。
【００５５】ＢＭＶ ＲＮＡ３の完全長ｃＤＮＡを含む
ｐＢＢ３をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断後、ｃＤ
ＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に導入し、ＲＮＡ３の３’末端の非翻訳領域を欠失した
ｃＤＮＡを含むｐＢＢ３（−Ｈ）を得た。ｐＢＢ３（−
Ｈ）をＨｉｎｄＩＩＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理を行ない、両端を平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ
ーを付加し、さらにＥｃｏＲＩ切断した後セルフライゲ
ーションを行なった。その結果、ＲＮＡ３の３’末端の
非翻訳領域のＨｉｎｄＩＩＩから下流約２００塩基の欠
失を持つｐＢＢ３（−３）を得た。ｐＢＢ３（−３）の
ＲＮＡ３ ｃＤＮＡを含むＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片
をｐＢＩＣＰ３５のＳｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入
し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ３を構築し
た（図９）。
ｐＢＢ３をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断後、ｃＤ
ＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に導入し、ＲＮＡ３の３’末端の非翻訳領域を欠失した
ｃＤＮＡを含むｐＢＢ３（−Ｈ）を得た。ｐＢＢ３（−
Ｈ）をＨｉｎｄＩＩＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理を行ない、両端を平滑末端化した後ＥｃｏＲＩリンカ
ーを付加し、さらにＥｃｏＲＩ切断した後セルフライゲ
ーションを行なった。その結果、ＲＮＡ３の３’末端の
非翻訳領域のＨｉｎｄＩＩＩから下流約２００塩基の欠
失を持つｐＢＢ３（−３）を得た。ｐＢＢ３（−３）の
ＲＮＡ３ ｃＤＮＡを含むＳｎａＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片
をｐＢＩＣＰ３５のＳｔｕＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入
し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ３を構築し
た（図９）。
【００５６】実施例２．形質転換植物細胞内における導
入されたＢＭＶ各ゲノムの発現 Ａ．Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの植物形質転換用ベ
クターの導入 １枚のＮＢ寒天培地（０．８％ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂ
ｒｏｔｈ、１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ）上に大腸
菌ＤＨ５α株（ｐＢＩＣＢＲもしくはｐＢＩＣＢＭＲベ
クターを保持する）、大腸菌ＨＢ１０１株（ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３を保持する）及びＡ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４株（Ｔ−ＤＮＡ領域を欠
失したＴｉプラスミドを保持する）をそれぞれ接種し、
３０℃、２日間培養した。培養後、殺菌した白金耳で３
種の細菌を混合し、さらに３０℃、２日間培養した。５
０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＡＢ寒天培地
（表１）上に混合培養した細菌を画線し、３０℃、２日
間培養し、シングルコロニーを得た。このコロニーが形
質転換用ベクターを保持するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓＬＢＡ４４０４株である。
入されたＢＭＶ各ゲノムの発現 Ａ．Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの植物形質転換用ベ
クターの導入 １枚のＮＢ寒天培地（０．８％ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂ
ｒｏｔｈ、１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ）上に大腸
菌ＤＨ５α株（ｐＢＩＣＢＲもしくはｐＢＩＣＢＭＲベ
クターを保持する）、大腸菌ＨＢ１０１株（ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３を保持する）及びＡ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４株（Ｔ−ＤＮＡ領域を欠
失したＴｉプラスミドを保持する）をそれぞれ接種し、
３０℃、２日間培養した。培養後、殺菌した白金耳で３
種の細菌を混合し、さらに３０℃、２日間培養した。５
０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＡＢ寒天培地
（表１）上に混合培養した細菌を画線し、３０℃、２日
間培養し、シングルコロニーを得た。このコロニーが形
質転換用ベクターを保持するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓＬＢＡ４４０４株である。
【００５７】Ｂ．タバコへのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓの接種及び形質転換体の選抜 接種用タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ Ｈａｂａｎａ ＳＲ１）としては、
殺菌処理した種子由来の無菌植物を供試した。１．５ｍ
ｌ用エッペンチューブに約１００μｌのタバコ種子を入
れ、１ｍｌの７０％エタノールでタバコ種子を洗浄し
た。次に、１．５ｍｌの２０％アンチホルミンを加え４
分間おきに１秒間の攪はんを行ないながら、室温に２０
分間放置し、種子殺菌を行なった。殺菌後、殺菌水で３
ー４回種子を洗浄し、ＬＳ１培地（表２）を入れたプラ
スチックシャーレ（西部社、径９０ｍｍ、深さ２０ｍ
ｍ）に播種し、２６℃、８，０００ｌｕｘで育成した。
約１ｃｍに生長した幼植物をＬＳ８培地（表２）の入っ
たバイオポット（日本医化器械株式会社）に移植し、体
長約１０ｃｍに生長したものをＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ接種に用いた。形質転換用ベクターを保持するＡ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ン含有ＡＢ液体培地で３０℃、２日間振とう培養（１２
０回転／分）した。
ｓの接種及び形質転換体の選抜 接種用タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ Ｈａｂａｎａ ＳＲ１）としては、
殺菌処理した種子由来の無菌植物を供試した。１．５ｍ
ｌ用エッペンチューブに約１００μｌのタバコ種子を入
れ、１ｍｌの７０％エタノールでタバコ種子を洗浄し
た。次に、１．５ｍｌの２０％アンチホルミンを加え４
分間おきに１秒間の攪はんを行ないながら、室温に２０
分間放置し、種子殺菌を行なった。殺菌後、殺菌水で３
ー４回種子を洗浄し、ＬＳ１培地（表２）を入れたプラ
スチックシャーレ（西部社、径９０ｍｍ、深さ２０ｍ
ｍ）に播種し、２６℃、８，０００ｌｕｘで育成した。
約１ｃｍに生長した幼植物をＬＳ８培地（表２）の入っ
たバイオポット（日本医化器械株式会社）に移植し、体
長約１０ｃｍに生長したものをＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ接種に用いた。形質転換用ベクターを保持するＡ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ン含有ＡＢ液体培地で３０℃、２日間振とう培養（１２
０回転／分）した。
【００５８】これ以後の操作はすべて無菌的に行なっ
た。無菌培養したタバコの葉を１ｃｍＸ１ｃｍに切り抜
き、上述のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養液に１分間
浸漬した。あらかじめ殺菌しておいたペータータオルの
上にこの葉片を置き、過剰の細菌液を除き、ＬＳ１培地
（表２）上に葉片の裏面を上にして置いた。２６℃、４
８時間から７２時間培養後、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓを完全に除去するために、５００μｇ／ｍｌのカルベ
ニシリンを含有するＬＳ１液体培地に移し、２６℃、７
００ｌｕｘで２日間培養した。培養後あらかじめ殺菌し
ておいたペータータオルの上にこの葉片を置き、ＭＳ１
液体培地を除き、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び
１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＳ４培
地（表２）に移し、２６℃、 ８，０００ｌｕｘで約２
ー３週間培養した。
た。無菌培養したタバコの葉を１ｃｍＸ１ｃｍに切り抜
き、上述のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養液に１分間
浸漬した。あらかじめ殺菌しておいたペータータオルの
上にこの葉片を置き、過剰の細菌液を除き、ＬＳ１培地
（表２）上に葉片の裏面を上にして置いた。２６℃、４
８時間から７２時間培養後、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓを完全に除去するために、５００μｇ／ｍｌのカルベ
ニシリンを含有するＬＳ１液体培地に移し、２６℃、７
００ｌｕｘで２日間培養した。培養後あらかじめ殺菌し
ておいたペータータオルの上にこの葉片を置き、ＭＳ１
液体培地を除き、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び
１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＳ４培
地（表２）に移し、２６℃、 ８，０００ｌｕｘで約２
ー３週間培養した。
【００５９】発芽した５ー１０ｍｍのシュートを殺菌し
たメスでカルスから切り取り、１００μｇ／ｍｌのカナ
マイシン及び１５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン含有Ｍ
ＳＲ培地（５２５μｇ／ｍｌのナフタレン酢酸と１００
μｇ／ｍｌの６−ベンジルアデニンを含み、寒天の代わ
りにＧｅｌａｎｇｕｍを用いたＬＳプレート培地）に移
した。２週間後、全身約５ｃｍに育成した幼植物を直径
１２ｃｍの植木鉢に鉢上げし、透明なプラスチックボッ
クスで植物を覆い、数日間馴化させた後、グロースチャ
ンバー内で育成した。
たメスでカルスから切り取り、１００μｇ／ｍｌのカナ
マイシン及び１５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン含有Ｍ
ＳＲ培地（５２５μｇ／ｍｌのナフタレン酢酸と１００
μｇ／ｍｌの６−ベンジルアデニンを含み、寒天の代わ
りにＧｅｌａｎｇｕｍを用いたＬＳプレート培地）に移
した。２週間後、全身約５ｃｍに育成した幼植物を直径
１２ｃｍの植木鉢に鉢上げし、透明なプラスチックボッ
クスで植物を覆い、数日間馴化させた後、グロースチャ
ンバー内で育成した。
【００６０】形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＲ１、ｐＢ
ＩＣＢＲ２およびｐＢＩＣＢＲ３によるカナマイシン耐
性形質転換タバコをそれぞれＢＲ１、ＢＲ２及びＢＲ
３、また、形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ１、ｐＢ
ＩＣＢＭＲ２及びｐＢＩＣＢＭＲ３によるカナマイシン
耐性形質転換タバコをそれぞれＢＭＲ１、ＢＭＲ２及び
ＢＭＲ３と名付けた。
ＩＣＢＲ２およびｐＢＩＣＢＲ３によるカナマイシン耐
性形質転換タバコをそれぞれＢＲ１、ＢＲ２及びＢＲ
３、また、形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＭＲ１、ｐＢ
ＩＣＢＭＲ２及びｐＢＩＣＢＭＲ３によるカナマイシン
耐性形質転換タバコをそれぞれＢＭＲ１、ＢＭＲ２及び
ＢＭＲ３と名付けた。
【００６１】Ｃ．タバコに導入したＢＭＶ各遺伝子産物
の発現分析 カナマイシン耐性を示した形質転換植物の中で導入され
たＢＭＶの各遺伝子が発現しているかどうかを調べる方
法として、導入された１ａ遺伝子の発現の分析は、形質
転換タバコから調製したプロトプラストにＲＮＡ２およ
び３の混合物を接種することによって、また、２ａ遺伝
子の発現の分析はＲＮＡ１および３の混合物を接種する
ことによって行なった。ＲＮＡ１、２及び３は、実施例
１Ｂの項で述べた方法によってｐＢＴＦ１、２及び３か
らｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成した。 ＄ ウイルスＲＮＡ複製酵素である１ａ及び２ａ蛋白質が発
現している細胞中では、接種したＲＮＡ３から外被蛋白
質のｍＲＮＡであるＲＮＡ４が転写され、細胞内にＢＭ
Ｖの外被蛋白質が蓄積するものと考えられる。外被蛋白
質はＲＮＡ３から直接翻訳されることはなく、ＢＭＶの
ＲＮＡ複製酵素によって（−）鎖ＲＮＡ３から転写され
たＲＮＡ４をとおして翻訳されると考えられており（Ｍ
ｉｌｌｅｒら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６
８−７０）、外被蛋白質の発現を検出することによっ
て、間接的にＲＮＡ複製酵素あるいは同酵素のサブユニ
ットである１ａ及び２ａ蛋白質の発現の検出を行なうこ
とができる。そこで、抗ＢＭＶ抗体を用いたウエスタン
ブロット法によって外被蛋白質の発現の分析を行なっ
た。
の発現分析 カナマイシン耐性を示した形質転換植物の中で導入され
たＢＭＶの各遺伝子が発現しているかどうかを調べる方
法として、導入された１ａ遺伝子の発現の分析は、形質
転換タバコから調製したプロトプラストにＲＮＡ２およ
び３の混合物を接種することによって、また、２ａ遺伝
子の発現の分析はＲＮＡ１および３の混合物を接種する
ことによって行なった。ＲＮＡ１、２及び３は、実施例
１Ｂの項で述べた方法によってｐＢＴＦ１、２及び３か
らｉｎ ｖｉｔｒｏ的に合成した。 ＄ ウイルスＲＮＡ複製酵素である１ａ及び２ａ蛋白質が発
現している細胞中では、接種したＲＮＡ３から外被蛋白
質のｍＲＮＡであるＲＮＡ４が転写され、細胞内にＢＭ
Ｖの外被蛋白質が蓄積するものと考えられる。外被蛋白
質はＲＮＡ３から直接翻訳されることはなく、ＢＭＶの
ＲＮＡ複製酵素によって（−）鎖ＲＮＡ３から転写され
たＲＮＡ４をとおして翻訳されると考えられており（Ｍ
ｉｌｌｅｒら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６
８−７０）、外被蛋白質の発現を検出することによっ
て、間接的にＲＮＡ複製酵素あるいは同酵素のサブユニ
ットである１ａ及び２ａ蛋白質の発現の検出を行なうこ
とができる。そこで、抗ＢＭＶ抗体を用いたウエスタン
ブロット法によって外被蛋白質の発現の分析を行なっ
た。
【００６２】Ｃ−１ プロトプラストの調製 プロトプラストの調製には、葉長１５ー２０ｃｍのタバ
コ第４ー５葉を用いた。切り取ったタバコ葉の裏表皮を
剥離し、１００ｍｌコルベンに入れた１％セルラーゼオ
ノズカＲ−１０（近畿ヤクルト）、０．０５％マセロザ
イム（近畿ヤクルト）を含む０．５Ｍマンニトール液
（ＫＯＨでｐＨ５．６ー５．８に調製したもの）に浸
し、１５分毎にコルベンを軽く振り混ぜ、２６℃で２時
間処理した。得られたプロトプラスト懸濁液に含まれる
未分解組織を、４ー６層のガーゼで濾別し、５０ｍｌ用
ガラス遠沈管に移し、１００Ｘｇ、２分間の遠心分離に
よってプロトプラストを集め、さらに、０．５Ｍのマン
ニトール液による遠心洗浄を２回繰り返した。
コ第４ー５葉を用いた。切り取ったタバコ葉の裏表皮を
剥離し、１００ｍｌコルベンに入れた１％セルラーゼオ
ノズカＲ−１０（近畿ヤクルト）、０．０５％マセロザ
イム（近畿ヤクルト）を含む０．５Ｍマンニトール液
（ＫＯＨでｐＨ５．６ー５．８に調製したもの）に浸
し、１５分毎にコルベンを軽く振り混ぜ、２６℃で２時
間処理した。得られたプロトプラスト懸濁液に含まれる
未分解組織を、４ー６層のガーゼで濾別し、５０ｍｌ用
ガラス遠沈管に移し、１００Ｘｇ、２分間の遠心分離に
よってプロトプラストを集め、さらに、０．５Ｍのマン
ニトール液による遠心洗浄を２回繰り返した。
【００６３】Ｃ−２ タバコプロトプラストへのＢＭＶ
ＲＮＡの接種 ０．５Ｍマンニトールに懸濁したプロトプラストを４ー
６本の１０ｍｌ容ポリプロピレン製培養チューブ（日水
製薬＃０６４８０）に移し、１００Ｘｇ、２分間の遠心
分離でプロトプラストを集め、上清を除去した。プロト
プラストに２−１０μｇのＢＭＶ ＲＮＡと１０μｇの
ｔＲＮＡを含むＴ液（０．５Ｍマンニトール、４０ｍＭ
ＣａＣｌ2）を０．７ｍｌ加えよく混和した後、直ち
にＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００、０．５Ｍマン
ニトール、４０ｍＭ ＣａＣｌ2）を０．７ｍｌ加え、
上下逆さまにしてゆるやかに混ぜ、氷上で３０分間低速
振とうした。
ＲＮＡの接種 ０．５Ｍマンニトールに懸濁したプロトプラストを４ー
６本の１０ｍｌ容ポリプロピレン製培養チューブ（日水
製薬＃０６４８０）に移し、１００Ｘｇ、２分間の遠心
分離でプロトプラストを集め、上清を除去した。プロト
プラストに２−１０μｇのＢＭＶ ＲＮＡと１０μｇの
ｔＲＮＡを含むＴ液（０．５Ｍマンニトール、４０ｍＭ
ＣａＣｌ2）を０．７ｍｌ加えよく混和した後、直ち
にＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００、０．５Ｍマン
ニトール、４０ｍＭ ＣａＣｌ2）を０．７ｍｌ加え、
上下逆さまにしてゆるやかに混ぜ、氷上で３０分間低速
振とうした。
【００６４】その後、約８ｍｌのＴ液を加え上下逆さま
にしてゆるやかに混ぜ、氷上に３０分間静置した。１０
０Ｘｇ、２分間の遠心分離でプロトプラストを集めた
後、ＰＥＧや未吸着のＲＮＡを除去するためＨｉｇｈ−
ｐＨ, Ｈｉｇｈ−Ｃａ2+緩衝液（０．７Ｍマンニトー
ル、５０ｍＭ,ＣａＣｌ2、５０ｍＭグリシン、ｐＨ８．
５）による遠心洗浄を３回繰り返した。プロトプラスト
を３ｍｌの０．７ｉ培地（０．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、
１ｍＭ ＫＮＯ３、１ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０
ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2Ｏ、０．１μＭ ＫＩ、０．
０１μＭ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．７Ｍマンニト
ール、 ２５００ｕｎｉｔ／ｍｌマイコスタチン、２０
０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、ｐＨ６．５）に懸
濁し、２６℃、４８時間培養した。
にしてゆるやかに混ぜ、氷上に３０分間静置した。１０
０Ｘｇ、２分間の遠心分離でプロトプラストを集めた
後、ＰＥＧや未吸着のＲＮＡを除去するためＨｉｇｈ−
ｐＨ, Ｈｉｇｈ−Ｃａ2+緩衝液（０．７Ｍマンニトー
ル、５０ｍＭ,ＣａＣｌ2、５０ｍＭグリシン、ｐＨ８．
５）による遠心洗浄を３回繰り返した。プロトプラスト
を３ｍｌの０．７ｉ培地（０．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、
１ｍＭ ＫＮＯ３、１ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０
ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2Ｏ、０．１μＭ ＫＩ、０．
０１μＭ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．７Ｍマンニト
ール、 ２５００ｕｎｉｔ／ｍｌマイコスタチン、２０
０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、ｐＨ６．５）に懸
濁し、２６℃、４８時間培養した。
【００６５】Ｃ−３ 抗体の調製とウエスタンブロッ
ト分析 抗ＢＭＶ血清を硫酸アンモニウム法によって精製し、γ
−グロブリン画分を得た。タバコプロトプラストからア
セトンパウダーを調製し、これに上述の精製抗ＢＭＶ抗
体と反応させ、非特異的に植物成分と結合する抗体を除
去した。ＢＭＶＲ ＮＡを接種したプロトプラストから
抽出した蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動した後、分離された蛋白質をＴｏｗｂｉｎらの方法
（Ｔｏｗｂｉｎら、（１９７９）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０−４３５４）
によって電気的にメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−
Ｐ、ミリポア社製）に転写した。転写後、一次抗体に精
製抗ＢＭＶ抗体を１／４００に希釈したもの、二次抗体
にアルカリホスファターゼでラベルした抗ウサギＩｇＧ
−ヤギＩｇＧを用い、ＮＢＴ−ＢＣＩＰを基質とした発
色反応によってＢＭＶ外被蛋白質の検出を行なった。
ト分析 抗ＢＭＶ血清を硫酸アンモニウム法によって精製し、γ
−グロブリン画分を得た。タバコプロトプラストからア
セトンパウダーを調製し、これに上述の精製抗ＢＭＶ抗
体と反応させ、非特異的に植物成分と結合する抗体を除
去した。ＢＭＶＲ ＮＡを接種したプロトプラストから
抽出した蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動した後、分離された蛋白質をＴｏｗｂｉｎらの方法
（Ｔｏｗｂｉｎら、（１９７９）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０−４３５４）
によって電気的にメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−
Ｐ、ミリポア社製）に転写した。転写後、一次抗体に精
製抗ＢＭＶ抗体を１／４００に希釈したもの、二次抗体
にアルカリホスファターゼでラベルした抗ウサギＩｇＧ
−ヤギＩｇＧを用い、ＮＢＴ−ＢＣＩＰを基質とした発
色反応によってＢＭＶ外被蛋白質の検出を行なった。
【００６６】Ｃ−４ ＢＲ１および２植物細胞におけ
る導入した遺伝子産物の分析 ＢＲ１植物から調製したプロトプラストに試験管内で合
成したＲＮＡ２＋３、また、ポジティブコントロールと
してＲＮＡ１＋２＋３を接種した。接種４８時間後に、
形質転換植物内で合成された外被蛋白質の相対的評価を
ウエスタンブロット分析により行なった。ポジティブコ
ントロールにおける外被蛋白質遺伝子の発現量の平均値
を１００％とした場合、次のように検出された。
る導入した遺伝子産物の分析 ＢＲ１植物から調製したプロトプラストに試験管内で合
成したＲＮＡ２＋３、また、ポジティブコントロールと
してＲＮＡ１＋２＋３を接種した。接種４８時間後に、
形質転換植物内で合成された外被蛋白質の相対的評価を
ウエスタンブロット分析により行なった。ポジティブコ
ントロールにおける外被蛋白質遺伝子の発現量の平均値
を１００％とした場合、次のように検出された。
【００６７】 ──────────────────────────────────── 外被蛋白質発現の平均値 ──────────────────────────────────── ＢＲ１植物 ＲＮＡ１＋２＋３接種区 １００ ＢＲ１植物 Ｍｏｃｋ（偽）接種区 ０ ＢＲ１植物 ＲＮＡ１＋３接種区 ０ ＢＲ１植物 ＲＮＡ２＋３接種区 １１０ ────────────────────────────────────
【００６８】ＲＮＡ２＋３接種区でＲＮＡ１＋２＋３接
種区と同程度の外被蛋白質が検出された。ＲＮＡ１を接
種せずにＲＮＡ２とＲＮＡ３のみを接種した場合にも、
ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外被蛋白質
がプロトプラスト内で合成されたことから、ＢＲ１植物
ではすべての細胞で完全な１ａ蛋白質が発現されている
と考えられた。ＢＲ２植物から調製したプロトプラスト
にＲＮＡ１＋３を接種した場合にも、外被蛋白質が次の
ように検出された。
種区と同程度の外被蛋白質が検出された。ＲＮＡ１を接
種せずにＲＮＡ２とＲＮＡ３のみを接種した場合にも、
ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と同程度の外被蛋白質
がプロトプラスト内で合成されたことから、ＢＲ１植物
ではすべての細胞で完全な１ａ蛋白質が発現されている
と考えられた。ＢＲ２植物から調製したプロトプラスト
にＲＮＡ１＋３を接種した場合にも、外被蛋白質が次の
ように検出された。
【００６９】 ──────────────────────────────────── 外被蛋白質発現の平均値 ──────────────────────────────────── ＢＲ２植物 ＲＮＡ１＋２＋３接種区 １００ ＢＲ２植物 Ｍｏｃｋ接種区 ０ ＢＲ２植物 ＲＮＡ２＋３接種区 ０ ＢＲ２植物 ＲＮＡ１＋３接種区 ９８ ────────────────────────────────────
【００７０】ＲＮＡ２を接種せずにＲＮＡ１＋３のみを
接種した場合にも、ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と
同程度の外被蛋白質がプロトプラスト内で合成されたこ
とから、ＢＲ２植物ではすべての細胞で完全な２ａ蛋白
質が発現されていると考えられた。
接種した場合にも、ＲＮＡ１＋２＋３を接種した場合と
同程度の外被蛋白質がプロトプラスト内で合成されたこ
とから、ＢＲ２植物ではすべての細胞で完全な２ａ蛋白
質が発現されていると考えられた。
【００７１】Ｃ−５ ＢＭＲ１及び２植物細胞における
導入した遺伝子産物の分析 ＢＭＲ１及び２から調製したプロトプラストにｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで合成したＲＮＡを接種した。接種４８時間後
にプロトプラスト内の外被蛋白質をウエスタンブロット
法で検出した。
導入した遺伝子産物の分析 ＢＭＲ１及び２から調製したプロトプラストにｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで合成したＲＮＡを接種した。接種４８時間後
にプロトプラスト内の外被蛋白質をウエスタンブロット
法で検出した。
【００７２】 ──────────────────────────────────── 外被蛋白質発現の平均値 ──────────────────────────────────── ＢＭＲ１植物 ＲＮＡ１＋２＋３接種区 １００ ＢＭＲ１植物 Ｍｏｃｋ接種区 ０ ＢＭＲ１植物 ＲＮＡ２＋３接種区 １０５ ＢＭＲ１植物 ＲＮＡ１＋３接種区 ０ ＢＭＲ２植物 ＲＮＡ１＋２＋３接種区 １００ ＢＭＲ２植物 Ｍｏｃｋ接種区 ０ ＢＭＲ２植物 ＲＮＡ２＋３接種区 ０ ＢＭＲ２植物 ＲＮＡ１＋３接種区 ９０ ────────────────────────────────────
【００７３】その結果、３’末端の非翻訳領域にのみ欠
失をもつｐＢＩＣＢＭＲベクターを用いてＲＮＡ１のｃ
ＤＮＡを導入したＢＭＲ１から調製したプロトプラスト
にＲＮＡ２＋３を接種した場合にも、ＲＮＡ１＋２＋３
を接種した場合と同程度の外被蛋白質が検出され、ま
た、ＢＭＲ２にＲＮＡ１＋３を接種した場合にも外被蛋
白質が検出された。ＢＭＲ１もしくはＢＭＲ２では、植
物ゲノム中に導入されたＲＮＡ１もしくはＲＮＡ２のｃ
ＤＮＡの転写物は複製能力を持たないため、ウイルスの
複製に必要な全ての１ａ蛋白質もしくは２ａ蛋白質を植
物ゲノムからの転写および翻訳に依存されることができ
たことを示している。また、ウイルスの各遺伝子をウイ
ルスの複雑な制御機構から独立させ、植物の転写、翻訳
機構に依存することができたことが明らかになった。
失をもつｐＢＩＣＢＭＲベクターを用いてＲＮＡ１のｃ
ＤＮＡを導入したＢＭＲ１から調製したプロトプラスト
にＲＮＡ２＋３を接種した場合にも、ＲＮＡ１＋２＋３
を接種した場合と同程度の外被蛋白質が検出され、ま
た、ＢＭＲ２にＲＮＡ１＋３を接種した場合にも外被蛋
白質が検出された。ＢＭＲ１もしくはＢＭＲ２では、植
物ゲノム中に導入されたＲＮＡ１もしくはＲＮＡ２のｃ
ＤＮＡの転写物は複製能力を持たないため、ウイルスの
複製に必要な全ての１ａ蛋白質もしくは２ａ蛋白質を植
物ゲノムからの転写および翻訳に依存されることができ
たことを示している。また、ウイルスの各遺伝子をウイ
ルスの複雑な制御機構から独立させ、植物の転写、翻訳
機構に依存することができたことが明らかになった。
【００７４】Ｃ−６ ＢＭＶ ＲＮＡ複製酵素を産生
するタバコ植物の作出 ＢＲ１植物とＢＲ２植物、ＢＭＲ１植物とＢＭＲ２植
物、それぞれの交雑を行なった。交雑法は、開花中の花
粉親ＢＲ１植物のやくをピンセットで取り、除雄した母
本Ｒ２植物の雌しべに受粉させ、その約４週間後に種子
を収穫した。ＢＭＲ１植物とＢＭＲ２植物の交雑も同様
の方法で行なった。採取した種子をカナマイシン含有
（５０μｇ／ｍｌ）ＬＳ１培地上で発芽させ、カナマイ
シン耐性のタバコを選抜した。ＲＮＡ１及びＲＮＡ２の
両ｃＤＮＡをゲノムに導入された植物体は１ａ及び２ａ
蛋白質を生産するため、そのプロトプラストへのＲＮＡ
３接種によって外被蛋白質を生産できる。そこで、〔実
施例２〕Ｃ−４及び５と同様の方法によって、カナマイ
シン耐性タバコ植物中から外被蛋白質を生産したタバコ
植物体を選抜した。上述した方法によって得た、ＢＲ１
植物とＢＲ２植物のＦ１植物をＢＲ（１＋２）植物、Ｂ
ＭＲ１植物とＢＭＲ２植物のＦ１植物をＢＭＲ（１＋
２）植物と名付けた。これらはＲＮＡ１及びＲＮＡ２の
両ｃＤＮＡをゲノムに導入された植物体であり、１ａ及
び２ａ蛋白質を生産している。
するタバコ植物の作出 ＢＲ１植物とＢＲ２植物、ＢＭＲ１植物とＢＭＲ２植
物、それぞれの交雑を行なった。交雑法は、開花中の花
粉親ＢＲ１植物のやくをピンセットで取り、除雄した母
本Ｒ２植物の雌しべに受粉させ、その約４週間後に種子
を収穫した。ＢＭＲ１植物とＢＭＲ２植物の交雑も同様
の方法で行なった。採取した種子をカナマイシン含有
（５０μｇ／ｍｌ）ＬＳ１培地上で発芽させ、カナマイ
シン耐性のタバコを選抜した。ＲＮＡ１及びＲＮＡ２の
両ｃＤＮＡをゲノムに導入された植物体は１ａ及び２ａ
蛋白質を生産するため、そのプロトプラストへのＲＮＡ
３接種によって外被蛋白質を生産できる。そこで、〔実
施例２〕Ｃ−４及び５と同様の方法によって、カナマイ
シン耐性タバコ植物中から外被蛋白質を生産したタバコ
植物体を選抜した。上述した方法によって得た、ＢＲ１
植物とＢＲ２植物のＦ１植物をＢＲ（１＋２）植物、Ｂ
ＭＲ１植物とＢＭＲ２植物のＦ１植物をＢＭＲ（１＋
２）植物と名付けた。これらはＲＮＡ１及びＲＮＡ２の
両ｃＤＮＡをゲノムに導入された植物体であり、１ａ及
び２ａ蛋白質を生産している。
【００７５】次に、ＢＲ（１＋２）植物及びＢＭＲ（１
＋２）植物の純系二倍体を得るために、Ｉｍａｍｕｒａ
らの方法（Ｉｍａｍｕｒａら、（１９８２） Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：７１３−７１
６）により、やく培養（ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ）を行ない、得られた半数体幼植物の第２葉が出た時
に、幼芽の先端に０．２％コルヒチン水溶液を処理し
た。倍加植物とみられる植物体を選び、〔実施例２〕Ｃ
−４及び５と同様な方法によって外被蛋白質を生産する
個体を選抜し、純系二倍体とした。ＢＲ（１＋２）植物
及びＢＭＲ（１＋２）植物から得た純系二倍体をそれぞ
れＢＲＰ（１＋２）植物及びＢＭＲＰ（１＋２）植物と
名付けた。
＋２）植物の純系二倍体を得るために、Ｉｍａｍｕｒａ
らの方法（Ｉｍａｍｕｒａら、（１９８２） Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：７１３−７１
６）により、やく培養（ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ）を行ない、得られた半数体幼植物の第２葉が出た時
に、幼芽の先端に０．２％コルヒチン水溶液を処理し
た。倍加植物とみられる植物体を選び、〔実施例２〕Ｃ
−４及び５と同様な方法によって外被蛋白質を生産する
個体を選抜し、純系二倍体とした。ＢＲ（１＋２）植物
及びＢＭＲ（１＋２）植物から得た純系二倍体をそれぞ
れＢＲＰ（１＋２）植物及びＢＭＲＰ（１＋２）植物と
名付けた。
【００７６】実施例３．ＩＦＮの産生 ＲＮＡ植物ウイルスとしてＢＭＶ ＡＴＣＣ６６系統
を、所望の外来遺伝子として、ヒト由来γ−インターフ
ェロン（ＩＦＮ）遺伝子を用いた。ＩＦＮ遺伝子の特徴
として、動物由来の遺伝子である、翻訳後に糖鎖が付加
され、さらに、Ｎ端及びＣ端がプロセシング（切断）さ
れるといったことが挙げられる。ＩＦＮ遺伝子は約５０
０ｂｐで、約１７０アミノ酸の蛋白質をコードし、この
遺伝子を動物細胞中で発現させると、糖鎖付加及び両端
のプロセシングによって３種の成分が検出される（Ｇｒ
ａｙら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９５：５０３−
５０５）。
を、所望の外来遺伝子として、ヒト由来γ−インターフ
ェロン（ＩＦＮ）遺伝子を用いた。ＩＦＮ遺伝子の特徴
として、動物由来の遺伝子である、翻訳後に糖鎖が付加
され、さらに、Ｎ端及びＣ端がプロセシング（切断）さ
れるといったことが挙げられる。ＩＦＮ遺伝子は約５０
０ｂｐで、約１７０アミノ酸の蛋白質をコードし、この
遺伝子を動物細胞中で発現させると、糖鎖付加及び両端
のプロセシングによって３種の成分が検出される（Ｇｒ
ａｙら、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９５：５０３−
５０５）。
【００７７】Ａ．ＢＭＶーＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベク
ターの構築（図１０−図１５） ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベクターの構築には、
ＢＭＶ ＲＮＡ１、２及び３の完全長ｃＤＮＡがＴ７プ
ロモーターの下流に挿入されたプラスミドｐＢＴＦ１、
２及び３（図５）をそれぞれ用いた。１ａ、２ａ及び２
種の外被蛋白質遺伝子（ＣＰ１及び２）をそれぞれコー
ドするウイルス遺伝子をＩＦＮ遺伝子と置換するため
に、ＢＭＶｃＤＮＡ及びＩＦＮ遺伝子の開始コドンの位
置にＮｓｉＩ部位をＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅ
ｌら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ １５４：３６７−３８２）によって導入した
（図４）。
ターの構築（図１０−図１５） ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベクターの構築には、
ＢＭＶ ＲＮＡ１、２及び３の完全長ｃＤＮＡがＴ７プ
ロモーターの下流に挿入されたプラスミドｐＢＴＦ１、
２及び３（図５）をそれぞれ用いた。１ａ、２ａ及び２
種の外被蛋白質遺伝子（ＣＰ１及び２）をそれぞれコー
ドするウイルス遺伝子をＩＦＮ遺伝子と置換するため
に、ＢＭＶｃＤＮＡ及びＩＦＮ遺伝子の開始コドンの位
置にＮｓｉＩ部位をＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅ
ｌら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ １５４：３６７−３８２）によって導入した
（図４）。
【００７８】該方法による部位特異的突然変異を行うた
めに以下のオリゴヌクレオチドを〔実施例１〕Ｂ−１−
１の方法に従って合成した。ｐＢＴＦ１における１ａ蛋
白質遺伝子には５’ｐｄ（ＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣ
ＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＧ
Ｃ）（配列番号：５）、ｐＢＴＦ２における２ａ蛋白質
遺伝子には５’ｐｄ（ＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＴＴＣ
ＧＡＡＡＡＣＣ）（配列番号：６）、ｐＢＴＦ３におけ
る３ａ蛋白質遺伝子には５’ｐｄ（ＧＴＴＣＣＣＧＡＴ
ＧＣＡＴＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴ）（配列番号：７）、ｐ
ＢＴＦ３におけるＣＰ１遺伝子には５’ｐｄ（ＧＴＡＴ
ＴＴＡＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣ）（配列番
号：８）、ｐＢＴＦ３におけるＣＰ２遺伝子には５’ｐ
ｄ（ＴＧＧＴＡＡＧＡＴＧＣＡＣＧＣＧＣＧＣＡＧＣ）
（配列番号：９）、ｐＭＫＣ（第一製薬から譲渡され
た）におけるＩＦＮ遺伝子には５’ｐｄ（ＴＣＴＣＴＣ
ＧＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＡＴＡＣ）（配
列番号：１０）を各々用いた。
めに以下のオリゴヌクレオチドを〔実施例１〕Ｂ−１−
１の方法に従って合成した。ｐＢＴＦ１における１ａ蛋
白質遺伝子には５’ｐｄ（ＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣ
ＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＧ
Ｃ）（配列番号：５）、ｐＢＴＦ２における２ａ蛋白質
遺伝子には５’ｐｄ（ＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＴＴＣ
ＧＡＡＡＡＣＣ）（配列番号：６）、ｐＢＴＦ３におけ
る３ａ蛋白質遺伝子には５’ｐｄ（ＧＴＴＣＣＣＧＡＴ
ＧＣＡＴＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴ）（配列番号：７）、ｐ
ＢＴＦ３におけるＣＰ１遺伝子には５’ｐｄ（ＧＴＡＴ
ＴＴＡＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣ）（配列番
号：８）、ｐＢＴＦ３におけるＣＰ２遺伝子には５’ｐ
ｄ（ＴＧＧＴＡＡＧＡＴＧＣＡＣＧＣＧＣＧＣＡＧＣ）
（配列番号：９）、ｐＭＫＣ（第一製薬から譲渡され
た）におけるＩＦＮ遺伝子には５’ｐｄ（ＴＣＴＣＴＣ
ＧＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＡＴＡＣ）（配
列番号：１０）を各々用いた。
【００７９】これらを用い、ｐＢＴＦ１ａ、ｐＢＴＦ２
ａ、ｐＢＴＦ３ａ、ｐＢＴＦｐＣＰ１、ｐＢＴＦｐＣＰ
２およびｐＵＣｐＩＦＮ（Ｎｓｉ）をそれぞれ構築し
た。さらに、ｐＵＣｐＩＦＮ（Ｎｓｉ）の終始コドンの
すぐ下流にオリゴヌクレオチド５’ｐｄ（ＣＣＣＡＧＴ
ＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣ）（配列番号：
１１）を用いてＳａｃＩ部位を導入し、ｐＵＣＩＦＮ
（Ｎｓｉ）を構築した。
ａ、ｐＢＴＦ３ａ、ｐＢＴＦｐＣＰ１、ｐＢＴＦｐＣＰ
２およびｐＵＣｐＩＦＮ（Ｎｓｉ）をそれぞれ構築し
た。さらに、ｐＵＣｐＩＦＮ（Ｎｓｉ）の終始コドンの
すぐ下流にオリゴヌクレオチド５’ｐｄ（ＣＣＣＡＧＴ
ＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣ）（配列番号：
１１）を用いてＳａｃＩ部位を導入し、ｐＵＣＩＦＮ
（Ｎｓｉ）を構築した。
【００８０】ｐＢＴＦ３ａをＣｌａＩ及びＳｔｕＩで切
断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって平滑末端化を
行い、ＳａｃＩリンカーを付加し、さらに、ＳａｃＩ切
断後セルフライゲーションを行った。この結果得られた
プラスミドｐＢＴＦ３ａ１は、サブゲノムＲＮＡプロモ
ーターを消失し、ＣｌａＩ部位がＳａｃＩ部位に置換さ
れている。ｐＢＴＦ３ａをＳａｃＩ及びＳｔｕＩで切断
後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によっては平滑末端化を
行い、セルフライゲーションした。この結果得られたプ
ラスミドｐＢＴＦ３ａ２はＮｓｉＩ部位を消失してい
る。ｐＢＴＦ３ａ２をＣｌａＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼによって平滑末端化し、ＳａｃＩリンカーを付
加した。さらに、ＳａｃＩ切断後、セルフライゲーショ
ンした。この結果得られたプラスミドｐＢＴＦ３ａ３で
はＣｌａＩ部位がＳａｃＩ部位に置換されている。
断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって平滑末端化を
行い、ＳａｃＩリンカーを付加し、さらに、ＳａｃＩ切
断後セルフライゲーションを行った。この結果得られた
プラスミドｐＢＴＦ３ａ１は、サブゲノムＲＮＡプロモ
ーターを消失し、ＣｌａＩ部位がＳａｃＩ部位に置換さ
れている。ｐＢＴＦ３ａをＳａｃＩ及びＳｔｕＩで切断
後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によっては平滑末端化を
行い、セルフライゲーションした。この結果得られたプ
ラスミドｐＢＴＦ３ａ２はＮｓｉＩ部位を消失してい
る。ｐＢＴＦ３ａ２をＣｌａＩで切断後Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼによって平滑末端化し、ＳａｃＩリンカーを付
加した。さらに、ＳａｃＩ切断後、セルフライゲーショ
ンした。この結果得られたプラスミドｐＢＴＦ３ａ３で
はＣｌａＩ部位がＳａｃＩ部位に置換されている。
【００８１】ｐＢＴＦｐＣＰ１およびｐＢＴＦｐＣＰ２
をＳｔｕＩで切断後、ＳａｃＩリンカーを付加した。さ
らに、ＳａｃＩ切断後セルフライゲーションした。この
結果得られたプラスミドｐＢＴＦＣＰ１及びｐＢＴＦＣ
Ｐ２ではＳｔｕＩ部位がＳａｃＩ部位に置換されてい
る。ｐＢＴＦ２ａ、ｐＢＴＦ３ａ１、ｐＢＴＦ３ａ３、
ｐＢＴＦＣＰ１及びｐＢＴＦＣＰ２をＮｓｉＩ及びＳａ
ｃＩで切断することによって得られた大断片（プラスミ
ドを含む断片）と、ｐＵＣＩＦＮ（Ｎｓｉ）をＮｓｉＩ
及びＳａｃＩで切断することによって得られたＩＦＮ遺
伝子断片をライゲーションし、ｐＢＴＦ２ａｐＩＦＮ、
ｐＢＴＦ３ａ１ｐＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ３ｐＩＦＮ、ｐ
ＢＴＦＣＰ１ｐＩＦＮ及びｐＢＴＦＣＰ２ｐＩＦＮを構
築した。
をＳｔｕＩで切断後、ＳａｃＩリンカーを付加した。さ
らに、ＳａｃＩ切断後セルフライゲーションした。この
結果得られたプラスミドｐＢＴＦＣＰ１及びｐＢＴＦＣ
Ｐ２ではＳｔｕＩ部位がＳａｃＩ部位に置換されてい
る。ｐＢＴＦ２ａ、ｐＢＴＦ３ａ１、ｐＢＴＦ３ａ３、
ｐＢＴＦＣＰ１及びｐＢＴＦＣＰ２をＮｓｉＩ及びＳａ
ｃＩで切断することによって得られた大断片（プラスミ
ドを含む断片）と、ｐＵＣＩＦＮ（Ｎｓｉ）をＮｓｉＩ
及びＳａｃＩで切断することによって得られたＩＦＮ遺
伝子断片をライゲーションし、ｐＢＴＦ２ａｐＩＦＮ、
ｐＢＴＦ３ａ１ｐＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ３ｐＩＦＮ、ｐ
ＢＴＦＣＰ１ｐＩＦＮ及びｐＢＴＦＣＰ２ｐＩＦＮを構
築した。
【００８２】ｐＢＴＦ１ａをＮｒｕＩ（平滑末端切断）
及びＮｓｉＩで切断した。得られた大断片と、ｐＵＣＩ
ＦＮ（Ｎｓｉ）をＳａｃＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ処理によって平滑末端化後ＮｓｉＩ切断によって得ら
れたＩＦＮ遺伝子断片をライゲーションし、ｐＢＴＦ１
ａｐＩＦＮを構築した。ｐＢＴＦ１ａｐＩＦＮ、ｐＢＴ
Ｆ２ａｐＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ１ｐＩＦＮ、ｐＢＴＦ３
ａ３ｐＩＦＮ、ｐＢＴＦＣＰ１ｐＩＦＮ及びｐＢＴＦＣ
Ｐ２ｐＩＦＮをＮｓｉＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理によって平滑末端化し、セルフライゲーションする
ことによって、ｐＢＴＦ１ａＩＦＮ、ｐＢＴＦ２ａＩＦ
Ｎ、ｐＢＴＦ３ａ１ＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ３ＩＦＮ、ｐ
ＢＴＦＣＰ１ＩＦＮ及びｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮを構築し
た。ｐＢＴＦ３ａ３ＩＦＮをＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ
で切断することによって得られた大断片と、ｐＢＴＦ３
をＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断することによって得
られた小断片をライゲーションし、ｐＢＴＦ３ａ４ＩＦ
Ｎを構築した。ｐＢＴＦ３ａ４をＢｓｓＨＩ切断後、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって平滑末端化し、セル
フライゲーションを行った。その結果得られたプラスミ
ドｐＢＴＦ３ａ５ＩＦＮではＢＭＶの外被蛋白質遺伝子
にフレームシフトが導入されている。
及びＮｓｉＩで切断した。得られた大断片と、ｐＵＣＩ
ＦＮ（Ｎｓｉ）をＳａｃＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ処理によって平滑末端化後ＮｓｉＩ切断によって得ら
れたＩＦＮ遺伝子断片をライゲーションし、ｐＢＴＦ１
ａｐＩＦＮを構築した。ｐＢＴＦ１ａｐＩＦＮ、ｐＢＴ
Ｆ２ａｐＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ１ｐＩＦＮ、ｐＢＴＦ３
ａ３ｐＩＦＮ、ｐＢＴＦＣＰ１ｐＩＦＮ及びｐＢＴＦＣ
Ｐ２ｐＩＦＮをＮｓｉＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理によって平滑末端化し、セルフライゲーションする
ことによって、ｐＢＴＦ１ａＩＦＮ、ｐＢＴＦ２ａＩＦ
Ｎ、ｐＢＴＦ３ａ１ＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ３ＩＦＮ、ｐ
ＢＴＦＣＰ１ＩＦＮ及びｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮを構築し
た。ｐＢＴＦ３ａ３ＩＦＮをＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ
で切断することによって得られた大断片と、ｐＢＴＦ３
をＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断することによって得
られた小断片をライゲーションし、ｐＢＴＦ３ａ４ＩＦ
Ｎを構築した。ｐＢＴＦ３ａ４をＢｓｓＨＩ切断後、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって平滑末端化し、セル
フライゲーションを行った。その結果得られたプラスミ
ドｐＢＴＦ３ａ５ＩＦＮではＢＭＶの外被蛋白質遺伝子
にフレームシフトが導入されている。
【００８３】Ｂ．感染性ＢＭＶＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒ
ｏ合成及びタバコプロトプラストへの接種 ＢＭＶＲＮＡ１、２、及び３のそれぞれ完全長ｃＤＮＡ
転写用のプラスミドｐＢＴＦ１、２及び３、あるいはＢ
ＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写用プラスミドｐＢＴＦ１
ａＩＦＮ、ｐＢＴＦ２ａＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ１ＩＦ
Ｎ、ｐＢＴＦ３ａ４ＩＮＦ、ｐＢＴＦ３ａ５ＩＮＦ、ｐ
ＢＴＦＣＰ１ＩＦＮ及びｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮから、
〔実施例１〕Ｂ−２の方法に従って、感染性ＢＭＶＲＮ
ＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ合成を行った。その結果、ＢＭＶ
ＲＮＡ１、２、３及び７種のＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮ
Ａが得られた。得られたＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡを
それぞれ、Ｆ１ａＩＦＮ、Ｆ２ａＩＦＮ、Ｆ３ａ１ＩＦ
Ｎ、ＦＮＦ３ａ３ＩＦＮ、Ｆ３ａ４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５Ｉ
ＦＮ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ２ＩＦＮ（第図１６）
と名付けた。
ｏ合成及びタバコプロトプラストへの接種 ＢＭＶＲＮＡ１、２、及び３のそれぞれ完全長ｃＤＮＡ
転写用のプラスミドｐＢＴＦ１、２及び３、あるいはＢ
ＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写用プラスミドｐＢＴＦ１
ａＩＦＮ、ｐＢＴＦ２ａＩＦＮ、ｐＢＴＦ３ａ１ＩＦ
Ｎ、ｐＢＴＦ３ａ４ＩＮＦ、ｐＢＴＦ３ａ５ＩＮＦ、ｐ
ＢＴＦＣＰ１ＩＦＮ及びｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮから、
〔実施例１〕Ｂ−２の方法に従って、感染性ＢＭＶＲＮ
ＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ合成を行った。その結果、ＢＭＶ
ＲＮＡ１、２、３及び７種のＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮ
Ａが得られた。得られたＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡを
それぞれ、Ｆ１ａＩＦＮ、Ｆ２ａＩＦＮ、Ｆ３ａ１ＩＦ
Ｎ、ＦＮＦ３ａ３ＩＦＮ、Ｆ３ａ４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５Ｉ
ＦＮ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ２ＩＦＮ（第図１６）
と名付けた。
【００８４】各ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及び対照の
野性型ＢＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合し
て、〔実施例２〕Ｃの方法に従って、タバコプロトプラ
ストに接種した。
野性型ＢＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合し
て、〔実施例２〕Ｃの方法に従って、タバコプロトプラ
ストに接種した。
【００８５】Ｃ．ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡの複製 各ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及び対照の野性型ＢＭＶ
ＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合してタバコプロ
トプラストに接種した。接種４８時間後に、タバコプロ
トプラストから全ＲＮＡを調製し、全ＢＭＶＲＮＡに共
通の３’末端配列部分をプローブとしてノーザンブロッ
ティングを行い、各実験区におけるキメラＲＮＡの複製
及びサブゲノムＲＮＡの合成の相対的評価をノーザンブ
ロッティングにより行なった。ポジティブコントロール
である野性株ＢＭＶＲＮＡ３におけるキメラＲＮＡの複
製及びサブゲノムＲＮＡの合成を１００％とした場合、
次のように検出された。
ＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合してタバコプロ
トプラストに接種した。接種４８時間後に、タバコプロ
トプラストから全ＲＮＡを調製し、全ＢＭＶＲＮＡに共
通の３’末端配列部分をプローブとしてノーザンブロッ
ティングを行い、各実験区におけるキメラＲＮＡの複製
及びサブゲノムＲＮＡの合成の相対的評価をノーザンブ
ロッティングにより行なった。ポジティブコントロール
である野性株ＢＭＶＲＮＡ３におけるキメラＲＮＡの複
製及びサブゲノムＲＮＡの合成を１００％とした場合、
次のように検出された。
【００８６】 ──────────────────────────────────── キメラＲＮＡの複製 サブゲノムＲＮＡの合成 ──────────────────────────────────── Ｆ１ａＩＦＮ １ − Ｆ２ａＩＦＮ １ − Ｆ３ａ１ＩＦＮ １ − Ｆ３ａ４ＩＦＮ ６０ ６０ Ｆ３ａ５ＩＦＮ ８０ ８０ ＦＣＰ１ＩＦＮ ４０ ２０ ＦＣＰ２ＩＦＮ ４０ ２０ ＲＮＡ３ １００ １００ ────────────────────────────────────
【００８７】その結果、Ｆ３ａ４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５ＩＦ
Ｎ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ２ＩＦＮのみが複製し、
かつ、サブゲノムＲＮＡも合成された。ＦＣＰ１ＩＦＮ
あるいはＦＣＰ２ＩＦＮから合成されたサブゲノムＲＮ
Ａは、野性株のＲＮＡ３から合成されたＲＮＡ４の２０
％に相当した。一方、Ｆ３ａ４ＩＦＮあるいはＦ３ａ５
ＩＦＮから転写されたＲＮＡの量は、野性株のＲＮＡ３
から転写されたＲＮＡ４の量と大きな差異はなかった。
また、プロトプラスト中における全ＲＮＡ量を定量し、
ＦＣＰ２ＩＦＮから合成されたサブゲノムＲＮＡの量と
比較したところ、ＦＣＰ２ＩＦＮから合成されたＲＮＡ
の量は全ＲＮＡ中のおよそ１％であった。
Ｎ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ２ＩＦＮのみが複製し、
かつ、サブゲノムＲＮＡも合成された。ＦＣＰ１ＩＦＮ
あるいはＦＣＰ２ＩＦＮから合成されたサブゲノムＲＮ
Ａは、野性株のＲＮＡ３から合成されたＲＮＡ４の２０
％に相当した。一方、Ｆ３ａ４ＩＦＮあるいはＦ３ａ５
ＩＦＮから転写されたＲＮＡの量は、野性株のＲＮＡ３
から転写されたＲＮＡ４の量と大きな差異はなかった。
また、プロトプラスト中における全ＲＮＡ量を定量し、
ＦＣＰ２ＩＦＮから合成されたサブゲノムＲＮＡの量と
比較したところ、ＦＣＰ２ＩＦＮから合成されたＲＮＡ
の量は全ＲＮＡ中のおよそ１％であった。
【００８８】Ｄ．ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡを接種し
たプロトプラストにおけるＩＦＮ産生量分析 上述の各ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及び対照の野性型
ＢＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合してタバ
コプロトプラストに接種した。接種４８時間後に、タバ
コプロトプラストから全蛋白質を抽出し、各実験区にお
けるＩＦＮ産生量を抗ＩＦＮ抗体を用いたウエスタンブ
ロティング分析により測定した。最も高いＩＦＮ産生量
を示したＦＣＰ２ＩＦＮを用いた実験区におけるＩＦＮ
産生量の平均値を１００％とした場合、次のように検出
された。
たプロトプラストにおけるＩＦＮ産生量分析 上述の各ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及び対照の野性型
ＢＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合してタバ
コプロトプラストに接種した。接種４８時間後に、タバ
コプロトプラストから全蛋白質を抽出し、各実験区にお
けるＩＦＮ産生量を抗ＩＦＮ抗体を用いたウエスタンブ
ロティング分析により測定した。最も高いＩＦＮ産生量
を示したＦＣＰ２ＩＦＮを用いた実験区におけるＩＦＮ
産生量の平均値を１００％とした場合、次のように検出
された。
【００８９】 ──────────────────────────────────── ＩＦＮ産生量 ──────────────────────────────────── Ｆ１ａＩＦＮ ０ Ｆ２ａＩＦＮ ０ Ｆ３ａ１ＩＦＮ ０ Ｆ３ａ４ＩＦＮ １５ Ｆ３ａ５ＩＦＮ １５ ＦＣＰ１ＩＦＮ １５ ＦＣＰ２ＩＦＮ １００ ────────────────────────────────────
【００９０】その結果、Ｆ３ａ４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５ＩＦ
Ｎ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ２ＩＦＮを用いた実験区
でのみ、糖鎖付加及び両端のプロセシングによるものと
思われるＩＦＮの３成分が産生された。これらのうち
で、ＦＣＰ２ＩＦＮを用いた区で最も高レベルのＩＦＮ
の産生が認められ、この実験区におけるＩＦＮ産生量を
１００として他の実験区におけるＩＦＮ産生の相対量を
算出した。Ｆ３ａ４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５ＩＦＮ及びＦＣＰ
１ＩＦＮを用いた区では、ＦＣＰ２ＩＦＮのおよそ１５
％のＩＦＮが産生された。
Ｎ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ２ＩＦＮを用いた実験区
でのみ、糖鎖付加及び両端のプロセシングによるものと
思われるＩＦＮの３成分が産生された。これらのうち
で、ＦＣＰ２ＩＦＮを用いた区で最も高レベルのＩＦＮ
の産生が認められ、この実験区におけるＩＦＮ産生量を
１００として他の実験区におけるＩＦＮ産生の相対量を
算出した。Ｆ３ａ４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５ＩＦＮ及びＦＣＰ
１ＩＦＮを用いた区では、ＦＣＰ２ＩＦＮのおよそ１５
％のＩＦＮが産生された。
【００９１】一方、ＦＣＰ１ＩＦＮを用いた区では抗Ｉ
ＦＮ抗体を用いた蛍光免疫染色法によっておよそ１０％
のプロトプラストでＩＦＮが産生されていることが明ら
かとなった。市販のＩＦＮ（ＪＣＲ社）を用いた対照区
との比較からＩＦＮの絶対量を測定したところＦＣＰ２
ＩＦＮが感染した細胞あたり、およそ５０ｐｇであり、
これは細胞内の全蛋白質のおよそ５％に相当した。すな
わち、ＩＦＮの産生量は外被蛋白質に匹敵するレベルで
あった。以上の結果から、ＣＰ遺伝子の２番目の翻訳開
始コドン以降をＩＦＮ遺伝子と置換した場合、１番目の
翻訳開始コドン以降を置換するという通常の方法を用い
た場合に比べて６倍以上の蛋白質産生能があるというこ
とが分かった。
ＦＮ抗体を用いた蛍光免疫染色法によっておよそ１０％
のプロトプラストでＩＦＮが産生されていることが明ら
かとなった。市販のＩＦＮ（ＪＣＲ社）を用いた対照区
との比較からＩＦＮの絶対量を測定したところＦＣＰ２
ＩＦＮが感染した細胞あたり、およそ５０ｐｇであり、
これは細胞内の全蛋白質のおよそ５％に相当した。すな
わち、ＩＦＮの産生量は外被蛋白質に匹敵するレベルで
あった。以上の結果から、ＣＰ遺伝子の２番目の翻訳開
始コドン以降をＩＦＮ遺伝子と置換した場合、１番目の
翻訳開始コドン以降を置換するという通常の方法を用い
た場合に比べて６倍以上の蛋白質産生能があるというこ
とが分かった。
【００９２】Ｅ．ＣＰ２遺伝子をＩＦＮ遺伝子と置換し
たＢＭＶーＩＦＮキメラＲＮＡ４及び野性型ＲＮＡ４転
写ベクターの構築及びｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写
（図１７） 上述のように、ＩＦＮのｉｎ ｖｉｖｏにおける翻訳産
物は翻訳後の修飾によって３種類認められるため、ＦＣ
Ｐ２ＩＦＮにおいて、１番目の翻訳開始コドンあるいは
２番目すなわちＩＦＮの翻訳開始コドンのいずれから翻
訳が開始されているかが明らかではなかった。そこで、
翻訳後の修飾の影響を排除するために、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏタンパク質翻訳系を用いることを試みた。また、ＢＭ
Ｖ ＲＮＡ３には外被蛋白質翻訳能はなく、外被蛋白質
は感染細胞内でＲＮＡ３から合成されたＲＮＡ４から翻
訳される。したがって、ＲＮＡ４中のＣＰ２遺伝子をＩ
ＦＮ遺伝子と置換し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質翻訳系に
おいてＩＦＮ翻訳能を持つＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ
４を調製することを試みた。
たＢＭＶーＩＦＮキメラＲＮＡ４及び野性型ＲＮＡ４転
写ベクターの構築及びｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写
（図１７） 上述のように、ＩＦＮのｉｎ ｖｉｖｏにおける翻訳産
物は翻訳後の修飾によって３種類認められるため、ＦＣ
Ｐ２ＩＦＮにおいて、１番目の翻訳開始コドンあるいは
２番目すなわちＩＦＮの翻訳開始コドンのいずれから翻
訳が開始されているかが明らかではなかった。そこで、
翻訳後の修飾の影響を排除するために、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏタンパク質翻訳系を用いることを試みた。また、ＢＭ
Ｖ ＲＮＡ３には外被蛋白質翻訳能はなく、外被蛋白質
は感染細胞内でＲＮＡ３から合成されたＲＮＡ４から翻
訳される。したがって、ＲＮＡ４中のＣＰ２遺伝子をＩ
ＦＮ遺伝子と置換し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質翻訳系に
おいてＩＦＮ翻訳能を持つＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ
４を調製することを試みた。
【００９３】プラスミドｐＢＢ３はＢＭＶ完全長ｃＤＮ
Ａ３を持ち、そのｃＤＮＡはＳｎａＢＩ−ＥｃｏＲＩ断
片としてプラスミドから切り出される。プラスミドｐＵ
ＣＴ７はＴ７プロモーター配列及びＮｓｉＩ部位を保持
している。オリゴヌクレオチド５’ｐｄ（ＧＴＡＴＴＴ
ＡＡＴＧ）（配列番号：１２）及び５’ｐｄ（ＴＣＧＡ
ＣＡＴＴＡＡＡＴＡＣ）（配列番号：１３）をアニーリ
ング後、得られた断片をｐＢＢ３のＳｎａＢＩーＥｃｏ
ＲＩ部位に導入し、ｐＢＢ４を構築した。
Ａ３を持ち、そのｃＤＮＡはＳｎａＢＩ−ＥｃｏＲＩ断
片としてプラスミドから切り出される。プラスミドｐＵ
ＣＴ７はＴ７プロモーター配列及びＮｓｉＩ部位を保持
している。オリゴヌクレオチド５’ｐｄ（ＧＴＡＴＴＴ
ＡＡＴＧ）（配列番号：１２）及び５’ｐｄ（ＴＣＧＡ
ＣＡＴＴＡＡＡＴＡＣ）（配列番号：１３）をアニーリ
ング後、得られた断片をｐＢＢ３のＳｎａＢＩーＥｃｏ
ＲＩ部位に導入し、ｐＢＢ４を構築した。
【００９４】ｐＢＢ４はＢＭＶｃＤＮＡ４の５’末端と
一致する部位にＳｎａＢＩ切断部位を持つ。ｐＵＣＴ７
をＮｓｉＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって
平滑末端化し、ＥｃｏＲＩ切断を行った。さらに、得ら
れたＤＮＡをｐＢＢ４のＳｎａＢＩーＥｃｏＲＩ断片
（ＢＭＶｃＤＮＡ４インサート）とライゲーションし、
ｐＢＴＦ４を構築した。ｐＢＴＦ４をＳａｌＩ及びＥｃ
ｏＲＩで切断して得られた大断片を、ｐＢＴＦＣＰ２Ｉ
ＦＮをＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断して得られた小断
片とライゲーションし、ｐＢＴＦｓＣＰ２ＩＦＮを構築
した。これらのプラスミドから、〔実施例１〕Ｂ−２の
方法に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写し、野性
型ＢＭＶＲＮＡ４及びＣＰ２をＩＦＮ遺伝子と置換した
ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ４であるＦｓＣＰ２ＩＦＮ
を得た。
一致する部位にＳｎａＢＩ切断部位を持つ。ｐＵＣＴ７
をＮｓｉＩ切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって
平滑末端化し、ＥｃｏＲＩ切断を行った。さらに、得ら
れたＤＮＡをｐＢＢ４のＳｎａＢＩーＥｃｏＲＩ断片
（ＢＭＶｃＤＮＡ４インサート）とライゲーションし、
ｐＢＴＦ４を構築した。ｐＢＴＦ４をＳａｌＩ及びＥｃ
ｏＲＩで切断して得られた大断片を、ｐＢＴＦＣＰ２Ｉ
ＦＮをＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで切断して得られた小断
片とライゲーションし、ｐＢＴＦｓＣＰ２ＩＦＮを構築
した。これらのプラスミドから、〔実施例１〕Ｂ−２の
方法に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写し、野性
型ＢＭＶＲＮＡ４及びＣＰ２をＩＦＮ遺伝子と置換した
ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ４であるＦｓＣＰ２ＩＦＮ
を得た。
【００９５】Ｆ．ＣＰ２をＩＦＮ遺伝子と置換したＢＭ
Ｖ−ＩＦＮキメラＲＮＡ４からｉｎｖｉｔｒｏで翻訳さ
れた蛋白質の解析 野性型ＢＭＶＲＮＡ４及びＦｓＣＰ２ＩＦＮを小麦胚芽
抽出物ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質翻訳系（アマシャム社）
に加え、ｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質を翻訳し、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後、フルオログラフィー
によって翻訳産物を比較、分析した。その結果、２番目
のＡＴＧから翻訳されたＩＦＮの量は、１番目のＡＴＧ
から翻訳されたＩＦＮの量のおよそ５０倍であることが
分かった。一方、野性型ＲＮＡ４からはほぼ同量のＣＰ
１及びＣＰ２が翻訳された。以上の結果から、ＣＰ２を
外来遺伝子と置換した場合、２番目の翻訳開始コドン即
ち外来遺伝子の翻訳開始コドンから蛋白質の翻訳が始ま
り、外被蛋白質との融合ではなく、真の外来遺伝子産物
が高効率で翻訳されることが分かった。
Ｖ−ＩＦＮキメラＲＮＡ４からｉｎｖｉｔｒｏで翻訳さ
れた蛋白質の解析 野性型ＢＭＶＲＮＡ４及びＦｓＣＰ２ＩＦＮを小麦胚芽
抽出物ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質翻訳系（アマシャム社）
に加え、ｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質を翻訳し、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後、フルオログラフィー
によって翻訳産物を比較、分析した。その結果、２番目
のＡＴＧから翻訳されたＩＦＮの量は、１番目のＡＴＧ
から翻訳されたＩＦＮの量のおよそ５０倍であることが
分かった。一方、野性型ＲＮＡ４からはほぼ同量のＣＰ
１及びＣＰ２が翻訳された。以上の結果から、ＣＰ２を
外来遺伝子と置換した場合、２番目の翻訳開始コドン即
ち外来遺伝子の翻訳開始コドンから蛋白質の翻訳が始ま
り、外被蛋白質との融合ではなく、真の外来遺伝子産物
が高効率で翻訳されることが分かった。
【００９６】Ｇ．ＢＭＶＲＮＡ複製酵素発現植物細胞中
におけるＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡの複製 〔実施例２〕Ｃ−６で作出したＢＭＲＰ（１＋２）植
物、即ち、３’末端非翻訳領域を欠失したＢＭＶＲＮＡ
１及び２が細胞内で転写されるため、ＢＭＶＲＮＡ複製
酵素である１ａ及び２ａ蛋白質は細胞内で産生されてい
るが、ＢＭＶＲＮＡ１及び２は複製されない植物、から
プロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト
に、各ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及び対照の野性型Ｂ
ＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合して接種し
た後、全ＲＮＡを調製し、全ＢＭＶＲＮＡに共通の３’
末端配列部分をプローブとしてノーザンブロッティング
を行い、各実験区におけるキメラＲＮＡの複製及びサブ
ゲノムＲＮＡの合成を野性株ＢＭＶＲＮＡ３と比較し
た。
におけるＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡの複製 〔実施例２〕Ｃ−６で作出したＢＭＲＰ（１＋２）植
物、即ち、３’末端非翻訳領域を欠失したＢＭＶＲＮＡ
１及び２が細胞内で転写されるため、ＢＭＶＲＮＡ複製
酵素である１ａ及び２ａ蛋白質は細胞内で産生されてい
るが、ＢＭＶＲＮＡ１及び２は複製されない植物、から
プロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト
に、各ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及び対照の野性型Ｂ
ＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１、２と混合して接種し
た後、全ＲＮＡを調製し、全ＢＭＶＲＮＡに共通の３’
末端配列部分をプローブとしてノーザンブロッティング
を行い、各実験区におけるキメラＲＮＡの複製及びサブ
ゲノムＲＮＡの合成を野性株ＢＭＶＲＮＡ３と比較し
た。
【００９７】 ──────────────────────────────────── キメラＲＮＡの複製 サブゲノムＲＮＡの合成 ──────────────────────────────────── Ｆ１ａＩＦＮ １ − Ｆ２ａＩＦＮ １ − Ｆ３ａ１ＩＦＮ １ − Ｆ３ａ４ＩＦＮ ２０ ８０ Ｆ３ａ５ＩＦＮ １０ ４０ ＦＣＰ１ＩＦＮ ５０ ２０ ＦＣＰ２ＩＦＮ ５０ ２０ ＲＮＡ３ １００ １００ ────────────────────────────────────
【００９８】その結果、Ｆ１ａＩＦＮ、Ｆ２ａＩＦＮ及
びＦ３ａ１ＩＦＮはほとんど複製しなかったが、Ｆ３ａ
４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５ＩＦＮ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ
２ＩＦＮは野性株ＲＮＡ３を用いた場合には劣るもの比
較的高い効率で複製し、その結果は、〔実施例３〕Ｃと
ほぼ同様であった。。したがって、〔実施例３〕Ａ−Ｆ
までで得られた結果全ては、形質転換植物を用いた場合
でも有効であることが分かった。
びＦ３ａ１ＩＦＮはほとんど複製しなかったが、Ｆ３ａ
４ＩＦＮ、Ｆ３ａ５ＩＦＮ、ＦＣＰ１ＩＦＮ及びＦＣＰ
２ＩＦＮは野性株ＲＮＡ３を用いた場合には劣るもの比
較的高い効率で複製し、その結果は、〔実施例３〕Ｃと
ほぼ同様であった。。したがって、〔実施例３〕Ａ−Ｆ
までで得られた結果全ては、形質転換植物を用いた場合
でも有効であることが分かった。
【００９９】実施例４ ＧＵＳの産生 ＲＮＡ植物ウイルスとしてＢＭＶ ＡＴＣＣ６６系統
を、所望の外来遺伝子として、β−グルクロニダーゼ遺
伝子（ＧＵＳ）を用いた。ＧＵＳ遺伝子は、酵素活性測
定の容易さ及び感度の高さからレポーター遺伝子として
頻繁に用いられるものである。また、遺伝子の大きさ
は、ＢＭＶの外被蛋白質遺伝子のおよそ３倍である。
を、所望の外来遺伝子として、β−グルクロニダーゼ遺
伝子（ＧＵＳ）を用いた。ＧＵＳ遺伝子は、酵素活性測
定の容易さ及び感度の高さからレポーター遺伝子として
頻繁に用いられるものである。また、遺伝子の大きさ
は、ＢＭＶの外被蛋白質遺伝子のおよそ３倍である。
【０１００】Ａ．ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡ転写ベク
ターの構築、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写及びタバコ
プロトプラストへの接種 ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベクターの構築の場合
と同様の方法によって、１ａ、２ａ、３ａ、ＣＰ１及び
ＣＰ２遺伝子をＧＵＳ遺伝子と置換した。プラスミドｐ
ＢＩ１０１（クロンテックラボラトリー社）中のＧＵＳ
遺伝子における開始及び終始コドンに、ＮｓｉＩ及びＳ
ａｃＩ部位をそれぞれオリゴヌクレオチド５’ｐｄ（Ｇ
ＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＴＴＡＣＧＴＡ）
（配列番号：１４）及び５’ｐｄ（ＡＡＴＧＡＡＴＣＡ
ＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧ）（配列番号：１５）
を用いて導入し、ｐＵＣＧＵＳ（Ｎｓｉ）を構築した。
ターの構築、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写及びタバコ
プロトプラストへの接種 ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベクターの構築の場合
と同様の方法によって、１ａ、２ａ、３ａ、ＣＰ１及び
ＣＰ２遺伝子をＧＵＳ遺伝子と置換した。プラスミドｐ
ＢＩ１０１（クロンテックラボラトリー社）中のＧＵＳ
遺伝子における開始及び終始コドンに、ＮｓｉＩ及びＳ
ａｃＩ部位をそれぞれオリゴヌクレオチド５’ｐｄ（Ｇ
ＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＴＴＡＣＧＴＡ）
（配列番号：１４）及び５’ｐｄ（ＡＡＴＧＡＡＴＣＡ
ＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧ）（配列番号：１５）
を用いて導入し、ｐＵＣＧＵＳ（Ｎｓｉ）を構築した。
【０１０１】転写ベクターｐＢＴＦ１ａＧＵＳ、ｐＢＴ
Ｆ２ａＧＵＳ、ｐＢＴＦ３ａ１ＧＵＳ、ｐＢＴＦ３ａ４
ＧＵＳ、ｐＢＴＦ３ａ５ＧＵＳ、ｐＢＴＦＣＰ１ＩＦＮ
及びｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮを、ｐＵＣＩＦＮ（Ｎｓｉ）
の代わりにｐＵＣＧＵＳ（Ｎｓｉ）を用いて、〔実施例
３〕Ａで述べたＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベクタ
ーの構築の場合と同様な方法によって構築した。
Ｆ２ａＧＵＳ、ｐＢＴＦ３ａ１ＧＵＳ、ｐＢＴＦ３ａ４
ＧＵＳ、ｐＢＴＦ３ａ５ＧＵＳ、ｐＢＴＦＣＰ１ＩＦＮ
及びｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮを、ｐＵＣＩＦＮ（Ｎｓｉ）
の代わりにｐＵＣＧＵＳ（Ｎｓｉ）を用いて、〔実施例
３〕Ａで述べたＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ転写ベクタ
ーの構築の場合と同様な方法によって構築した。
【０１０２】得られたプラスミドから、〔実施例１〕Ｂ
−２の方法に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写
し、得られた７種のＲＮＡをそれぞれＦ１ａＧＵＳ、Ｆ
２ａＧＵＳ、Ｆ３ａ１ＧＵＳ、Ｆ３ａ４ＧＵＳ、Ｆ３ａ
５ＧＵＳ、ＦＣＰ１ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳと名付け
た（図１６）。各ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡ及び対照
の野性型ＢＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１＋２と混合
し、〔実施例２〕Ｃの方法に従ってタバコプロトプラス
トに接種した。
−２の方法に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写
し、得られた７種のＲＮＡをそれぞれＦ１ａＧＵＳ、Ｆ
２ａＧＵＳ、Ｆ３ａ１ＧＵＳ、Ｆ３ａ４ＧＵＳ、Ｆ３ａ
５ＧＵＳ、ＦＣＰ１ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳと名付け
た（図１６）。各ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡ及び対照
の野性型ＢＭＶＲＮＡ３をそれぞれＲＮＡ１＋２と混合
し、〔実施例２〕Ｃの方法に従ってタバコプロトプラス
トに接種した。
【０１０３】Ｂ．ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡの複製 各ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡをそれぞれＲＮＡ１、２
と混合して接種したタバコプロトプラストから全ＲＮＡ
を調製し、全ＢＭＶＲＮＡに共通の３’末端配列部分を
プローブとしてノーザンブロッティングを行い、各実験
区におけるキメラＲＮＡの複製及びサブゲノムＲＮＡの
合成を比較した。しかし、これらキメラＲＮＡの複製は
野性型ＢＭＶＲＮＡの複製に比べて、非常に低レベルで
あり、野性型ＲＮＡとの比較は不可能であった。 そこ
で、ＧＵＳ遺伝子に特異的なプローブを用いてノーザン
ブロッティングを行った。最も高いキメラＲＮＡの複製
およびサブゲノムＲＮＡの合成を示したＦＣＰ２ＧＵＳ
を用いた実験区における該ＲＮＡの平均値をそれぞれ１
００％とした場合、以下のように検出された。 ──────────────────────────────────── キメラＲＮＡの複製 サブゲノムＲＮＡの合成 ──────────────────────────────────── Ｆ１ａＧＵＳ ０ − Ｆ２ａＧＵＳ ０ − Ｆ３ａ１ＧＵＳ ０ − Ｆ３ａ４ＧＵＳ １００ − Ｆ３ａ５ＧＵＳ ５０ − ＦＣＰ１ＧＵＳ １００ １００ ＦＣＰ２ＧＵＳ １００ １００ ────────────────────────────────────
と混合して接種したタバコプロトプラストから全ＲＮＡ
を調製し、全ＢＭＶＲＮＡに共通の３’末端配列部分を
プローブとしてノーザンブロッティングを行い、各実験
区におけるキメラＲＮＡの複製及びサブゲノムＲＮＡの
合成を比較した。しかし、これらキメラＲＮＡの複製は
野性型ＢＭＶＲＮＡの複製に比べて、非常に低レベルで
あり、野性型ＲＮＡとの比較は不可能であった。 そこ
で、ＧＵＳ遺伝子に特異的なプローブを用いてノーザン
ブロッティングを行った。最も高いキメラＲＮＡの複製
およびサブゲノムＲＮＡの合成を示したＦＣＰ２ＧＵＳ
を用いた実験区における該ＲＮＡの平均値をそれぞれ１
００％とした場合、以下のように検出された。 ──────────────────────────────────── キメラＲＮＡの複製 サブゲノムＲＮＡの合成 ──────────────────────────────────── Ｆ１ａＧＵＳ ０ − Ｆ２ａＧＵＳ ０ − Ｆ３ａ１ＧＵＳ ０ − Ｆ３ａ４ＧＵＳ １００ − Ｆ３ａ５ＧＵＳ ５０ − ＦＣＰ１ＧＵＳ １００ １００ ＦＣＰ２ＧＵＳ １００ １００ ────────────────────────────────────
【０１０４】その結果、Ｆ３ａ４ＧＵＳ、Ｆ３ａ５ＧＵ
Ｓ、ＦＣＰ１ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳのみが複製し、
かつ、ＦＣＰ１ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳではサブゲノ
ムＲＮＡも検出された。
Ｓ、ＦＣＰ１ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳのみが複製し、
かつ、ＦＣＰ１ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳではサブゲノ
ムＲＮＡも検出された。
【０１０５】Ｃ．ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡを接種し
たプロトプラストにおけるＧＵＳ産生量及びＧＵＳ活性
の分析 上述の各ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡをそれぞれＲＮＡ
１、２と混合してタバコプロトプラストに接種した。接
種４８時間後に、タバコプロトプラストから全蛋白質を
抽出し、抗ＧＵＳ抗体を用いたウエスタンブロティング
によって、各実験区におけるＧＵＳ産生量を比較した。
また、以下の方法を用いて、ＧＵＳ活性を測定した。ま
ず、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ
ら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０
７）に従って、プロトプラスト抽出物を調製した。ＧＵ
Ｓ活性レベルは、基質である４ーメチルウンベリフェリ
ルグルクロニドの４ーメチルウンベリフェロンへの酵素
的変換を、長波長紫外線によって標品のＧＵＳの活性と
比較して行った。最も高いＧＵＳ産生量及びＧＵＳ活性
を示したＦＣＰ２ＩＦＮを用いた実験区におけるＧＵＳ
産生量及びＧＵＳ活性の平均値を１００％とした場合、
以下のように検出された。
たプロトプラストにおけるＧＵＳ産生量及びＧＵＳ活性
の分析 上述の各ＢＭＶ−ＧＵＳキメラＲＮＡをそれぞれＲＮＡ
１、２と混合してタバコプロトプラストに接種した。接
種４８時間後に、タバコプロトプラストから全蛋白質を
抽出し、抗ＧＵＳ抗体を用いたウエスタンブロティング
によって、各実験区におけるＧＵＳ産生量を比較した。
また、以下の方法を用いて、ＧＵＳ活性を測定した。ま
ず、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ
ら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０
７）に従って、プロトプラスト抽出物を調製した。ＧＵ
Ｓ活性レベルは、基質である４ーメチルウンベリフェリ
ルグルクロニドの４ーメチルウンベリフェロンへの酵素
的変換を、長波長紫外線によって標品のＧＵＳの活性と
比較して行った。最も高いＧＵＳ産生量及びＧＵＳ活性
を示したＦＣＰ２ＩＦＮを用いた実験区におけるＧＵＳ
産生量及びＧＵＳ活性の平均値を１００％とした場合、
以下のように検出された。
【０１０６】 ──────────────────────────────────── ＧＵＳ産生量 ＧＵＳ活性 ──────────────────────────────────── Ｆ１ａＧＵＳ ０ ３ Ｆ２ａＧＵＳ ０ ３ Ｆ３ａ１ＧＵＳ ０ ３ Ｆ３ａ４ＧＵＳ ２０ ３０ Ｆ３ａ５ＧＵＳ １０ １５ ＦＣＰ１ＧＵＳ ０ ３ ＦＣＰ２ＧＵＳ １００ １００ ────────────────────────────────────
【０１０７】ウエスタンブロティングの結果、Ｆ３ａ４
ＧＵＳ、Ｆ３ａ５ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳを用いた実
験区でのみ、ＧＵＳが産生され、これらのうちで、ＦＣ
Ｐ２ＧＵＳを用いた区で最も高レベルのＧＵＳの産生が
認められた。しかし、ＦＣＰ１ＧＵＳを用いた区では、
ウエスタンブロティングによっては、ＧＵＳは認められ
なかった。そこで、各実験区におけるＧＵＳ活性を測定
した結果、ＦＣＰ２ＧＵＳを用いた区ではＦＣＰ１ＧＵ
Ｓを用いた区に比較して、同レベルのサブゲノムＲＮＡ
合成量であるにもかかわらず（〔実施例４〕Ｂ）、およ
そ３０倍のＧＵＳが産生されていることが明らかとなっ
た。
ＧＵＳ、Ｆ３ａ５ＧＵＳ及びＦＣＰ２ＧＵＳを用いた実
験区でのみ、ＧＵＳが産生され、これらのうちで、ＦＣ
Ｐ２ＧＵＳを用いた区で最も高レベルのＧＵＳの産生が
認められた。しかし、ＦＣＰ１ＧＵＳを用いた区では、
ウエスタンブロティングによっては、ＧＵＳは認められ
なかった。そこで、各実験区におけるＧＵＳ活性を測定
した結果、ＦＣＰ２ＧＵＳを用いた区ではＦＣＰ１ＧＵ
Ｓを用いた区に比較して、同レベルのサブゲノムＲＮＡ
合成量であるにもかかわらず（〔実施例４〕Ｂ）、およ
そ３０倍のＧＵＳが産生されていることが明らかとなっ
た。
【０１０８】以上の結果から、ＧＵＳのような分子量の
比較的大きな蛋白質を産生する場合には、ＩＦＮの場合
以上に、ＣＰ１遺伝子ではなくＣＰ２遺伝子との置換に
よる蛋白質産生能の向上が認められた。
比較的大きな蛋白質を産生する場合には、ＩＦＮの場合
以上に、ＣＰ１遺伝子ではなくＣＰ２遺伝子との置換に
よる蛋白質産生能の向上が認められた。
【０１０９】実施例５ ＢＭＶの全ゲノムＲＮＡを発現
する植物の作出 Ａ．ＢＭＶＲＮＡ３を発現する植物の作出 ［実施例２］Ａ．の方法に従ってｐＢＩＣＢＲ３（図
６）をＡ．ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓに導入し、［実施例
２］Ｂ．の方法に従って、タバコへのＡ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ（ｐＢＩＣＢＲ３）の接種及び形質転換体の
選抜を行った。植物ゲノム中に組み込まれたＲＮＡ３の
発現の確認は、［実施例２］Ｃで述べた形質転換植物か
ら得られたプロトプラストへのＲＮＡ１＋２の接種及び
抗ＢＭＶ抗体を用いたウエスタンブロット法によって行
った。 ウエスタンブロット法によってＲＮＡ３の発現
を確認した植物においては、植物ゲノムから転写された
ＲＮＡ３からＢＭＶＲＮＡ複製酵素によってサブゲノム
ＲＮＡ４が合成され、このサブゲノムＲＮＡ４から外皮
タンパク質が翻訳されている。ＲＮＡ３の発現を確認し
た植物から［実施例２］Ｃ−６のやく培養法によってＲ
ＮＡ３を発現する純系二倍体を選抜し、ＢＲＰ３植物と
名付けた。
する植物の作出 Ａ．ＢＭＶＲＮＡ３を発現する植物の作出 ［実施例２］Ａ．の方法に従ってｐＢＩＣＢＲ３（図
６）をＡ．ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓに導入し、［実施例
２］Ｂ．の方法に従って、タバコへのＡ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ（ｐＢＩＣＢＲ３）の接種及び形質転換体の
選抜を行った。植物ゲノム中に組み込まれたＲＮＡ３の
発現の確認は、［実施例２］Ｃで述べた形質転換植物か
ら得られたプロトプラストへのＲＮＡ１＋２の接種及び
抗ＢＭＶ抗体を用いたウエスタンブロット法によって行
った。 ウエスタンブロット法によってＲＮＡ３の発現
を確認した植物においては、植物ゲノムから転写された
ＲＮＡ３からＢＭＶＲＮＡ複製酵素によってサブゲノム
ＲＮＡ４が合成され、このサブゲノムＲＮＡ４から外皮
タンパク質が翻訳されている。ＲＮＡ３の発現を確認し
た植物から［実施例２］Ｃ−６のやく培養法によってＲ
ＮＡ３を発現する純系二倍体を選抜し、ＢＲＰ３植物と
名付けた。
【０１１０】Ｂ．ＢＭＶＲＮＡ複製酵素を発現するタバ
コ植物のゲノムへのＢＭＶＲＮＡ３ｃＤＮＡの導入 ［実施例２］Ｃ−６で作出したＢＲＰ（１＋２）植物及
びＢＭＲＰ（１＋２）植物のゲノムへＢＭＶＲＮＡ３ｃ
ＤＮＡを導入するため、ＢＲＰ（１＋２）植物とＢＲＰ
３植物、ＢＭＲＰ（１＋２）植物とＢＲＰ３植物のそれ
ぞれの交雑を行った。得られたＦ１植物をそれぞれＢＲ
Ｐ（１＋２＋３）植物、ＢＭＲＰ（１＋２＋３）植物と
名付けた。両植物を育成し、［実施例２］Ｃ−３の抗Ｂ
ＭＶ抗体を用いたウエスタンブロット法によって外皮蛋
白質遺伝子の発現量を比較した。ＢＲＰ（１＋２＋３）
植物における外皮蛋白質の発現量の平均値を１００％と
した場合、次のように検出された。
コ植物のゲノムへのＢＭＶＲＮＡ３ｃＤＮＡの導入 ［実施例２］Ｃ−６で作出したＢＲＰ（１＋２）植物及
びＢＭＲＰ（１＋２）植物のゲノムへＢＭＶＲＮＡ３ｃ
ＤＮＡを導入するため、ＢＲＰ（１＋２）植物とＢＲＰ
３植物、ＢＭＲＰ（１＋２）植物とＢＲＰ３植物のそれ
ぞれの交雑を行った。得られたＦ１植物をそれぞれＢＲ
Ｐ（１＋２＋３）植物、ＢＭＲＰ（１＋２＋３）植物と
名付けた。両植物を育成し、［実施例２］Ｃ−３の抗Ｂ
ＭＶ抗体を用いたウエスタンブロット法によって外皮蛋
白質遺伝子の発現量を比較した。ＢＲＰ（１＋２＋３）
植物における外皮蛋白質の発現量の平均値を１００％と
した場合、次のように検出された。
【０１１１】 ──────────────────────────────────── 外皮蛋白質の平均値 ──────────────────────────────────── ＢＲＰ（１＋２）植物 ０ ＢＲＰ（１＋２＋３）植物 １００ ＢＭＲＰ（１＋２）植物 ０ ＢＭＲＰ（１＋２＋３）植物 １３０ ────────────────────────────────────
【０１１２】したがって、ＢＲＰ（１＋２＋３）植物及
びＢＭＲＰ（１＋２＋３）植物においては、外部からＢ
ＭＶＲＮＡを導入する必要がなく、植物ゲノムから転写
されたウイルスＲＮＡによってＲＮＡ複製酵素の生産、
複製酵素によるサブゲノムＲＮＡの合成、外皮蛋白質の
生産というウイルスの増殖サイクルが進行することがわ
かった。
びＢＭＲＰ（１＋２＋３）植物においては、外部からＢ
ＭＶＲＮＡを導入する必要がなく、植物ゲノムから転写
されたウイルスＲＮＡによってＲＮＡ複製酵素の生産、
複製酵素によるサブゲノムＲＮＡの合成、外皮蛋白質の
生産というウイルスの増殖サイクルが進行することがわ
かった。
【０１１３】実施例６ ＢＭＶＲＮＡ複製酵素を発現す
るタバコ植物のゲノムに導入されたＩＦＮ遺伝子の発現 Ａ．ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３ｃＤＮＡを導入した
植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＩＦＮの構築（図１
８） ＣＰ２遺伝子をＩＦＮ遺伝子と置換したＢＭＶ−ＩＦＮ
キメラＲＮＡ３ｃＤＮＡを植物ゲノムに導入するための
ベクターｐＢＩＣＩＦＮを構築した。ｐＢＴＦＣＰ２Ｉ
ＦＮ（図１５）からＩＦＮ遺伝子を含有するＸｂａＩ／
ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、形質転換ベクターｐＢＩＣ
ＢＲ３（図６）のＲＮＡ３ｃＤＮＡにおけるＸｂａＩ部
位とＥｃｏＲＩ部位の間を除去した部分に挿入し、ｐＢ
ＩＣＩＦＮを構築した。
るタバコ植物のゲノムに導入されたＩＦＮ遺伝子の発現 Ａ．ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３ｃＤＮＡを導入した
植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＩＦＮの構築（図１
８） ＣＰ２遺伝子をＩＦＮ遺伝子と置換したＢＭＶ−ＩＦＮ
キメラＲＮＡ３ｃＤＮＡを植物ゲノムに導入するための
ベクターｐＢＩＣＩＦＮを構築した。ｐＢＴＦＣＰ２Ｉ
ＦＮ（図１５）からＩＦＮ遺伝子を含有するＸｂａＩ／
ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、形質転換ベクターｐＢＩＣ
ＢＲ３（図６）のＲＮＡ３ｃＤＮＡにおけるＸｂａＩ部
位とＥｃｏＲＩ部位の間を除去した部分に挿入し、ｐＢ
ＩＣＩＦＮを構築した。
【０１１４】Ｂ．ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３を発現
する植物の作出 ［実施例２］Ａ．の方法に従ってｐＢＩＣＩＦＮをＡ．
ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓに導入し、［実施例２］Ｂ．の方
法に従って、タバコへのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの
接種及び形質転換体の選抜を行った。植物ゲノム中に組
み込まれたＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３の発現の確認
は、［実施例２］Ｃ．で述べた形質転換植物から得られ
たプロトプラストへのＲＮＡ１＋２の接種及び抗ＩＦＮ
抗体を用いたウエスタンブロット法によって行った。
ウエスタンブロット法によってキメラＲＮＡ３の発現を
確認した植物においては、植物ゲノムから転写されたキ
メラＲＮＡ３からＢＭＶＲＮＡ複製酵素によってキメラ
サブゲノムＲＮＡ４が合成され、このキメラサブゲノム
ＲＮＡ４からＩＦＮが翻訳されている。ウエスタンブロ
ット法によってＢＭＶ−ＩＦＮきめらＲＮＡ３の発現を
確認した植物から［実施例２］Ｃ−６のやく培養法によ
ってＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３を発現する純系二倍
体を選抜し、ＢＲＰ３ＩＦＮ植物と名付けた。
する植物の作出 ［実施例２］Ａ．の方法に従ってｐＢＩＣＩＦＮをＡ．
ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓに導入し、［実施例２］Ｂ．の方
法に従って、タバコへのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの
接種及び形質転換体の選抜を行った。植物ゲノム中に組
み込まれたＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３の発現の確認
は、［実施例２］Ｃ．で述べた形質転換植物から得られ
たプロトプラストへのＲＮＡ１＋２の接種及び抗ＩＦＮ
抗体を用いたウエスタンブロット法によって行った。
ウエスタンブロット法によってキメラＲＮＡ３の発現を
確認した植物においては、植物ゲノムから転写されたキ
メラＲＮＡ３からＢＭＶＲＮＡ複製酵素によってキメラ
サブゲノムＲＮＡ４が合成され、このキメラサブゲノム
ＲＮＡ４からＩＦＮが翻訳されている。ウエスタンブロ
ット法によってＢＭＶ−ＩＦＮきめらＲＮＡ３の発現を
確認した植物から［実施例２］Ｃ−６のやく培養法によ
ってＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３を発現する純系二倍
体を選抜し、ＢＲＰ３ＩＦＮ植物と名付けた。
【０１１５】Ｃ．ＢＭＶＲＮＡ複製酵素を発現するタバ
コ植物のゲノムへのＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３ｃＤ
ＮＡの導入 ［実施例２］Ｃ−６で作出したＢＲＰ（１＋２）植物及
びＢＭＲＰ（１＋２）植物のゲノムへＢＭＶ−ＩＦＮキ
メラＲＮＡ３ｃＤＮＡを導入するため、ＢＲＰ（１＋
２）植物とＢＲＰ３ＩＦＮ植物、ＢＭＲＰ（１＋２）植
物とＢＲＰ３ＩＦＮ植物のそれぞれの交雑を行った。得
られたＦ１植物をそれぞれＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）
植物、ＢＭＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物と名付けた。
両植物を育成し、 ［実施例２］Ｃ−３の抗ＩＦＮ抗体を
用いたウエスタンブロット法によってＩＦＮの発現量を
比較した。ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物におけるＩ
ＦＮの発現量の平均値を１００％とした場合、次のよう
に検出された。
コ植物のゲノムへのＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３ｃＤ
ＮＡの導入 ［実施例２］Ｃ−６で作出したＢＲＰ（１＋２）植物及
びＢＭＲＰ（１＋２）植物のゲノムへＢＭＶ−ＩＦＮキ
メラＲＮＡ３ｃＤＮＡを導入するため、ＢＲＰ（１＋
２）植物とＢＲＰ３ＩＦＮ植物、ＢＭＲＰ（１＋２）植
物とＢＲＰ３ＩＦＮ植物のそれぞれの交雑を行った。得
られたＦ１植物をそれぞれＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）
植物、ＢＭＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物と名付けた。
両植物を育成し、 ［実施例２］Ｃ−３の抗ＩＦＮ抗体を
用いたウエスタンブロット法によってＩＦＮの発現量を
比較した。ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物におけるＩ
ＦＮの発現量の平均値を１００％とした場合、次のよう
に検出された。
【０１１６】 ──────────────────────────────────── ＩＦＮの平均値 ──────────────────────────────────── ＢＲＰ（１＋２）植物 ０ ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物 １００ ＢＭＲＰ（１＋２）植物 ０ ＢＭＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物 １３０ ────────────────────────────────────
【０１１７】ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物及びＢＭ
ＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物のＩＦＮの発現がキメラ
ＲＮＡ３からサブゲノムとして合成されるキメラＲＮＡ
４から翻訳されたものであることを確認するために、Ｂ
ＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物及びＢＭＲＰ（１＋２＋
３ＩＦＮ）植物を用いてノーザンブロット分析を行っ
た。それぞれのタバコ葉から純化した全ＲＮＡ（２０マ
イクロｇ）をアガロース電気泳動によって分離し、ナイ
ロン膜に転写し、ＩＦＮ遺伝子を含有するｐＵＣＩＦＮ
（ＮｓｉＩ）のＮｓｉＩ／ＳａｃＩ断片をプローブとし
て調べた。その結果、キメラＲＮＡ３とキメラＲＮＡ４
に相当するバンドが反応した。ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦ
Ｎ）植物におけるキメラＲＮＡ３の複製量及びキメラＲ
ＮＡ４の合成量を１００％とした場合、次のように検出
された。
ＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物のＩＦＮの発現がキメラ
ＲＮＡ３からサブゲノムとして合成されるキメラＲＮＡ
４から翻訳されたものであることを確認するために、Ｂ
ＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物及びＢＭＲＰ（１＋２＋
３ＩＦＮ）植物を用いてノーザンブロット分析を行っ
た。それぞれのタバコ葉から純化した全ＲＮＡ（２０マ
イクロｇ）をアガロース電気泳動によって分離し、ナイ
ロン膜に転写し、ＩＦＮ遺伝子を含有するｐＵＣＩＦＮ
（ＮｓｉＩ）のＮｓｉＩ／ＳａｃＩ断片をプローブとし
て調べた。その結果、キメラＲＮＡ３とキメラＲＮＡ４
に相当するバンドが反応した。ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦ
Ｎ）植物におけるキメラＲＮＡ３の複製量及びキメラＲ
ＮＡ４の合成量を１００％とした場合、次のように検出
された。
【０１１８】 ──────────────────────────────────── キメラＲＮＡ３ キメラＲＮＡ４ の複製 の合成 ──────────────────────────────────── ＢＲＰ（１＋２）植物 ０ ０ ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物 １００ １００ ＢＭＲＰ（１＋２）植物 ０ ０ ＢＭＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物 １２０ １３０ ────────────────────────────────────
【０１１９】したがって、ＢＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）
植物及びＢＭＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物において
は、外部からＢＭＶＲＮＡ及び外来遺伝子を含むキメラ
ＢＭＶＲＮＡを導入する必要がなく、植物ゲノムから転
写されたウイルスＲＮＡによってＲＮＡ複製酵素の生
産、複製酵素によるキメラＲＮＡ４の合成及び外来遺伝
子の発現が行われることがわかった。
植物及びＢＭＲＰ（１＋２＋３ＩＦＮ）植物において
は、外部からＢＭＶＲＮＡ及び外来遺伝子を含むキメラ
ＢＭＶＲＮＡを導入する必要がなく、植物ゲノムから転
写されたウイルスＲＮＡによってＲＮＡ複製酵素の生
産、複製酵素によるキメラＲＮＡ４の合成及び外来遺伝
子の発現が行われることがわかった。
【０１２０】 ＡＢ培地（表１） ──────────────────────────────────── 溶液１ Ｋ2ＨＰＯ4 １２ｇ ＮａＨ2ＰＯ4 ４ｇ 溶液２ ＮＨ4Ｃｌ ４ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ ＫＣｌ ０．６ｇ ＣａＣｌ2 ０．６ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ 溶液３ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ ────────────────────────────────────
【０１２１】 ＬＳ培地 （表２） ＬＳ培地の作製法（２００ｍｌ当たり） ──────────────────────────────────── ストック１ Ｋ2ＨＰＯ4 １２ｇ ＮａＨ2ＰＯ4 ４ｇ ストック２ ＮＨ4Ｃｌ ４ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ ＫＣｌ ０．６ｇ ストック３ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2Ｏ ８．８ｇ ストック４ Ｎａ2−ＥＤＴＡ ０．６６６ｇ ストック５ Ｈ2ＢＯ3 ０．１２４ｇ ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．１７２ｇ ＺｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．４４６ｇ ＫＩ ０．０１７ｇ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．００５ｇ ストック５’ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０５ｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．００５ｇ ストック６ チアミン−塩酸 ０．００８ｇ Ｍｙｏ−イノシトール ２．０ｇ ストック７ ナフタレン酢酸（ＮＡＡ） ０．０４２ｇ ストック８ ６−ベンジルアデニナ（ＢＡＰ） ０．００４ｇ ストック９ ６−ベンジルアデニナ（ＢＡＰ） ０．１ｇ ストック１０ Ｍｙｏ−イノシトール ２．０ｇ グリシン ０．０４ｇ プリドキシン−塩酸 ０．０１ｇ ニコチニックアシッド ０．０１ｇ チアミン−塩酸 ０．０２ｇ ────────────────────────────────────
【０１２２】ＢＡＰはまず０．１Ｎ ＨＣｌ ３０ｍｌ
に溶解（湯煎）し、その後水を加えて、２００ｍｌとす
る。 ＬＳ培地の作製法（１リットル） １． ２ｍｌのストック５’を２００ｍｌの新しいスト
ック５に加え、以後これを使用する。 ２． ストック１，２，３，４，５，６を各１０ｍｌず
つ入れる。 ３． 下表にしたがってホルモンストックを加える。 ４． シュクローズ ３０ｇを加え、イオン交換水で１
ｍｌとする。 ５． ＮａＯＨ或いは、ＫＯＨでｐＨを５．８〜６．２
に調整する。 ６． ０．８〜１％の寒天を加え、培養用ポットでオー
トクレーブする。 ７． ５０〜６０℃にした後、ポットを軽く振り混ぜ、
室温に放置し、固化させる。
に溶解（湯煎）し、その後水を加えて、２００ｍｌとす
る。 ＬＳ培地の作製法（１リットル） １． ２ｍｌのストック５’を２００ｍｌの新しいスト
ック５に加え、以後これを使用する。 ２． ストック１，２，３，４，５，６を各１０ｍｌず
つ入れる。 ３． 下表にしたがってホルモンストックを加える。 ４． シュクローズ ３０ｇを加え、イオン交換水で１
ｍｌとする。 ５． ＮａＯＨ或いは、ＫＯＨでｐＨを５．８〜６．２
に調整する。 ６． ０．８〜１％の寒天を加え、培養用ポットでオー
トクレーブする。 ７． ５０〜６０℃にした後、ポットを軽く振り混ぜ、
室温に放置し、固化させる。
【０１２３】抗生物質を添加する場合は、５０〜６０℃
にした後、フィルター滅菌した抗生物質を添加する。
にした後、フィルター滅菌した抗生物質を添加する。
【０１２４】 ホルモン濃度（タバコの場合） （１ｍｌ当り） ──────────────────────────────────── ストック７ ストック８ ストック９ ────────────────────────── カルス用（ＬＳ１） １０ｍｌ １０ｍｌ − 発芽用 （ＬＳ４） ０．５ｍｌ − １０ｍｌ 発振用 （ＬＳ７） ２．５ｍｌ ５ｍｌ − 幼植物用（ＬＳ８） − − − ────────────────────────────────────
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ 配列 GTATTTAATG TCGACTTCAG GAACTGGTAA GATG 配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 CTAGATGCAT ATAGTGAGTC GTATTAATTT A 配列番号：３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 AGCTTAAATT AATACGACTC ACTATATGCA T 配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GTAGGCCTCT CCAAATGAAA TGAAC 配列番号：５ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GTTTTTCACC AACAAAATGC ATAGTTCTAT CGATTTGC 配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 CACCAAGATG CATTCGAAAA CC 配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GTTCCCGATG CATAACATAG TTT 配列番号：８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GTATTTAATG CATACTTCAG GAAC 配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TGGTAAGATG CACGCGCGCA GC 配列番号：１０ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TCTCTCGGAA TGCATGCATG AAATATAC 配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 CCCAGTAATG GAGCTCCTGC CTGC 配列番号：１２ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GTATTTAATG 配列番号：１３ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TCGACATTAA ATAC 配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GTGGTCAGTC ATGCATGTTA CGTA 配列番号：１５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 AATGAATCAA GAGCTCTCCT GGCG
【図１】 ＢＭＶの遺伝子発現様式を示す。
【図２】 ＢＭＶ各遺伝子のタバコ形質転換用ベクタ
ー。
ー。
【図３】 部位特異的突然変異導入法によるＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターの転写開始点への制限酵素部位（Ｓｔ
ｕ１）の導入。
５Ｓプロモーターの転写開始点への制限酵素部位（Ｓｔ
ｕ１）の導入。
【図４】 ＢＭＶ遺伝子を外来遺伝子と置換するための
方法を示す。
方法を示す。
【図５】 ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの転写ベク
ター（ｐＵＣＴ）への導入と、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼを用いたインビトロＢＭＶ ＲＮＡ合成。
ター（ｐＵＣＴ）への導入と、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼを用いたインビトロＢＭＶ ＲＮＡ合成。
【図６】 ＢＭＶ ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを導入した
形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＲ１−３の構築。
形質転換用ベクターｐＢＩＣＢＲ１−３の構築。
【図７】 ＢＭＶ ＲＮＡの３’末端の非翻訳領域に相
当するヌクレオチド部分に欠失を持つＢＭＶ ＲＮＡの
ｃＤＮＡを導入した植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢ
ＭＲ１の構築。
当するヌクレオチド部分に欠失を持つＢＭＶ ＲＮＡの
ｃＤＮＡを導入した植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢ
ＭＲ１の構築。
【図８】 ＢＭＶ ＲＮＡの３’末端の非翻訳領域に相
当するヌクレオチド部分に欠失を持つＢＭＶ ＲＮＡの
ｃＤＮＡを導入した植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢ
ＭＲ２の構築。
当するヌクレオチド部分に欠失を持つＢＭＶ ＲＮＡの
ｃＤＮＡを導入した植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢ
ＭＲ２の構築。
【図９】 ＢＭＶ ＲＮＡの３’末端の非翻訳領域に相
当するヌクレオチド部分に欠失を持つＢＭＶ ＲＮＡの
ｃＤＮＡを導入した植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢ
ＭＲ３の構築。
当するヌクレオチド部分に欠失を持つＢＭＶ ＲＮＡの
ｃＤＮＡを導入した植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＢ
ＭＲ３の構築。
【図１０】 ｐＢＴＦ１ａＩＦＮの構築を示す。
【図１１】 ｐＢＴＦ２ａＩＦＮの構築を示す。
【図１２】 ｐＢＴＦ３ａＩＦＮの構築を示す。
【図１３】 ｐＢＴＦ３ａ４ＩＦＮ及びｐＢＴＦ３ａ５
ＩＦＮの構築を示す。
ＩＦＮの構築を示す。
【図１４】 ｐＢＴＦＣＰ１ＩＦＮの構築を示す。
【図１５】 ｐＢＴＦＣＰ２ＩＦＮの構築を示す。
【図１６】 ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ及びＢＭＶ−
ＧＵＳキメラＲＮＡの模式図を示す。
ＧＵＳキメラＲＮＡの模式図を示す。
【図１７】 ｐＢＴＦｓＣＰ２ＩＦＮの構築を示す。
【図１８】 ＢＭＶ−ＩＦＮキメラＲＮＡ３を導入した
植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＩＦＮの構築。
植物形質転換用ベクターｐＢＩＣＩＦＮの構築。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/11 15/83 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (34)
- 【請求項１】ＲＮＡ植物ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝
子のｃＤＮＡ、及び外被蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの本来
の翻訳開始コドン（５’末端から数えて１番目のＡＴ
Ｇ）より下流のＡＴＧ以降を所望の外来遺伝子と置き換
えた組換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ（以下組換
え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡという）を植物ゲノ
ムに導入することによって、又は、植物ウイルスのＲＮ
Ａ複製酵素遺伝子のｃＤＮＡを植物ゲノムに導入した植
物細胞に、組換え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡから
合成したＲＮＡを接種することによって、植物細胞にお
いて外来遺伝子又はその産物を生産する方法。 - 【請求項２】上記の外被蛋白質遺伝子のｃＤＮＡの２番
目のＡＴＧ以降を所望の外来遺伝子と置き換えることを
特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】上記のＲＮＡ複製酵素遺伝子ｃＤＮＡ及び
外被蛋白質遺伝子を含むウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ
が、完全長若しくはウイルスＲＮＡの３’末端非翻訳領
域に相当するヌクレオチド部分に欠失を持つｃＤＮＡで
ある請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】上記のＲＮＡ複製酵素遺伝子と外被蛋白質
遺伝子が異なる一本鎖（＋）ＲＮＡに存在する請求項１
又は２記載の方法。 - 【請求項５】上記のウイルスがｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉ
ｃ ｖｉｒｕｓ（ＢＭＶ）、ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａ
ｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、ａｌｆａｌｆａｍｏｓａ
ｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）からなる群から選ばれる請
求項４記載の方法。 - 【請求項６】上記のウイルスがｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉ
ｃ ｖｉｒｕｓである請求項５記載の方法。 - 【請求項７】上記の外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡの５’末
端非翻訳領域に相当するヌクレオチド部分に、欠失若し
くは置換などの遺伝子操作を行なうことによって、１番
目の翻訳開始コドン周辺のヌクレオチド配列を翻訳に不
適切にし、かつ、２番目のＡＴＧ周辺のヌクレオチド配
列を翻訳に適した構造にし、２番目のＡＴＧから翻訳が
行なわれるように改変した組換え体ウイルスゲノムＲＮ
ＡｃＤＮＡを用いる請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項８】該２番目のＡＴＧが人為的に作出されたも
のである請求項７記載の方法。 - 【請求項９】上記の外被蛋白質遺伝子ｃＤＮＡの５’末
端非翻訳領域から、外被蛋白質構造遺伝子中の２番目の
ＡＴＧまでのヌクレオチド部分の配列が、５’ＧＴＡＴ
ＴＴＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡ
ＡＧＡＴＧ（配列番号：１）である請求項７記載の方
法。 - 【請求項１０】上記のＲＮＡ複製酵素遺伝子ｃＤＮＡ及
び外被蛋白質遺伝子を含むウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮ
Ａが、完全長若しくはウイルスＲＮＡの３’末端非翻訳
領域に相当するヌクレオチド部分に欠失を持つｃＤＮＡ
である請求項７ないし９記載いずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】上記のＲＮＡ複製酵素遺伝子と外被蛋白
質遺伝子が異なる一本鎖（＋）ＲＮＡに存在する請求項
７ないし９いずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】上記のウイルスがｂｒｏｍｅ ｍｏｓａ
ｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＢＭＶ）、ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓ
ａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、ａｌｆａｌｆａｍｏｓ
ａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）からなる群から選ばれる
請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】上記のウイルスがｂｒｏｍｅ ｍｏｓａ
ｉｃ ｖｉｒｕｓである請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】植物細胞で機能するプロモーター、植物
ウイルスのＲＮＡ複製酵素遺伝子ｃＤＮＡ、植物で機能
するターミネーターを含有するＤＮＡ分子。 - 【請求項１５】上記ｃＤＮＡが完全長若しくはウイルス
ＲＮＡの３’末端非翻訳領域に相当するヌクレオチド部
分に欠失を持つｃＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡ
分子。 - 【請求項１６】請求項１記載の方法に使用するための、
請求項１４又は１５記載のＤＮＡ分子を持つ形質転換用
ベクター。 - 【請求項１７】植物細胞で機能するプロモーター、組換
え体ウイルスゲノムＲＮＡｃＤＮＡ、植物で機能するタ
ーミネーターを含有するＤＮＡ分子。 - 【請求項１８】上記ｃＤＮＡが完全長若しくはウイルス
ＲＮＡの３’末端非翻訳領域に相当するヌクレオチド部
分に欠失を持つｃＤＮＡである請求項１７記載のＤＮＡ
分子。 - 【請求項１９】請求項１記載の方法に使用するための、
請求項１７又は１８記載のＤＮＡ分子を持つ形質転換用
ベクター。 - 【請求項２０】インビトロ的に機能的なプロモーターと
ウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡからなるベクターであ
って、組換え体ウイルスゲノムＲＮＡを生産する転写ベ
クター。 - 【請求項２１】請求項１５記載のＤＮＡ分子を植物ゲノ
ム中に含有する形質転換植物細胞。 - 【請求項２２】請求項２１記載の細胞を再分化させて得
た植物体。 - 【請求項２３】請求項２２記載のＤＮＡ分子を植物ゲノ
ム中に含有する形質転換植物細胞。 - 【請求項２４】請求項２３記載の細胞を再分化させて得
た植物体。 - 【請求項２５】請求項１５記載のＤＮＡ分子及び請求項
１８記載のＤＮＡ分子を植物ゲノム中に含有する形質転
換植物細胞。 - 【請求項２６】請求項２５記載の細胞を再分化させて得
た植物体。 - 【請求項２７】上記の植物が、マメ科、セリ科、アブラ
ナ科、ウリ科、ナス科及びイネ科から選んだ科に属する
請求項２２記載の植物。 - 【請求項２８】上記の植物が、マメ科、セリ科、アブラ
ナ科、ウリ科、ナス科及びイネ科から選んだ科に属する
請求項２４記載の植物。 - 【請求項２９】上記のウイルスがｂｒｏｍｅ ｍｏｓａ
ｉｃ ｖｉｒｕｓである請求項１７記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項３０】請求項２９記載のＤＮＡ分子を植物ゲノ
ム中に含有する形質転換植物細胞。 - 【請求項３１】請求項３０記載の細胞を再分化させて得
た植物体。 - 【請求項３２】上記の植物が、マメ科、セリ科、アブラ
ナ科、ウリ科、ナス科及びイネ科から選んだ科に属する
請求項３１記載の植物。 - 【請求項３３】上記の植物がタバコ植物である請求項３
１記載の植物。 - 【請求項３４】上記の所望の外来遺伝子がインターフェ
ロンである請求項７ないし９いずれか１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05122189A JP3098353B2 (ja) | 1992-04-28 | 1993-04-27 | 植物細胞における外来遺伝子及びその産物の生産 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-152593 | 1992-04-28 | ||
| JP15259392 | 1992-04-28 | ||
| JP05122189A JP3098353B2 (ja) | 1992-04-28 | 1993-04-27 | 植物細胞における外来遺伝子及びその産物の生産 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646874A true JPH0646874A (ja) | 1994-02-22 |
| JP3098353B2 JP3098353B2 (ja) | 2000-10-16 |
Family
ID=26459370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05122189A Expired - Fee Related JP3098353B2 (ja) | 1992-04-28 | 1993-04-27 | 植物細胞における外来遺伝子及びその産物の生産 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP3098353B2 (ja) |
-
1993
- 1993-04-27 JP JP05122189A patent/JP3098353B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3098353B2 (ja) | 2000-10-16 |
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