ES2215572T3 - Clonacion de una n-metil transferasa implicada en la biosintesis de la cafeina. - Google Patents
Clonacion de una n-metil transferasa implicada en la biosintesis de la cafeina.Info
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Abstract
Una molécula de ADN que comprende cualquiera de las siguientes secuencias de nucleótidos: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la N-metil transferasa, que es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias y que tiene actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; o (b) una secuencia modificada de nucleótidos obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nucleótidos en dicha secuencia nucleotídica dentro de un intervalo en el que un polipéptido codificado por dicha secuencia nucleotídica tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.
Description
Clonación de una N-metil
transferasa implicada en la biosíntesis de la cafeína.
La presente invención trata de una
N-metil transferasa, una de las enzimas que
constituyen un sistema de síntesis de cafeína, que es un polipéptido
que tiene simultáneamente tres actividades de tres metil
transferasas, 7-metil xantina N3 metil transferasa,
teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa,
y variantes de la N-metil transferasa; moléculas de
ADN o moléculas de ARN que tienen secuencias nucleotídicas que
codifican la N-metil transferasa o variantes de la
misma; vectores que usan estas moléculas y células transformadas con
los vectores y sus usos.
La cafeína es un alcaloide púrico contenido en
plantas de la familia Theaceae Camellia, tales como
Camellia sinensis o plantas de Rubiaceae Coffea como
Coffea arabica o similares. En la actualidad, la cafeína se
produce por extracción de las plantas productoras de cafeína,
incluidas las anteriores especies de plantas, o por síntesis
orgánica. Además, en plantas como las de té o café, para atenuar o
inducir su estímulo, se intenta una reducción o aumento del
contenido de cafeína y sus productos intermedios usando técnicas de
alimentación clásicas o similares.
En Phytochemistry,
31-2575-(1992), se describe mediante experimentos
usando marcador ^{14}C que la cafeína se biosintetiza a partir de
xantosina con tres etapas de N-metilación. Esta vía
de reacción se muestra a continuación
La primera vez que se informó acerca de las
actividades enzimáticas que catalizan esta metilación, es decir, las
actividades metil transferasa, fue en un estudio que usó extracción
COARSE de hojas de té en 1975 (Biochem. J. 164, 87-(1975)). Aunque
se han hecho intentos para purificar la metil transferasa a partir
de café (Phytochemistry, 37, 1577-(1994), la concentración de la
purificación es muy baja.
Este artículo presenta datos acerca de la
purificación y la secuencia N terminal de
S-adenosil-L-metionina:
teobromina 1N-metiltransferasa (STM), la enzima
responsable de la metilación del teobromina que lleva a la formación
de la cafeína en el café. La STM se purificó a partir de endospermas
en desarrollo de frutos inmaduros mediante
DEAE-celulosa, interacción hidrófoba y cromatografía
de afinidad, usando como ligando
S-adenosil-L-homocisteína.
Mediante filtración en gel y SDS-PAGE se mostró que
la enzima tenía una Mt aparente de aproximadamente 54.000 y de
aproximadamente 60.000, respectivamente. Mediante cromatoenfoque
líquida se obtuvo un pI de 5,1 y de 4,8 mediante isoelectroenfoque
en electroforesis de gel de poliacrilamida. Usando teobromina como
sustrato, el valor de Km para la
S-adenosil-metionina fue 10 \muM,
sufriendo inhibición competitiva por la
S-adenosil-L-homocisteína
(Ki= 4,6 \muM). La STN es una enzima bifuncional, ya que también
es 7-metilxantina metilada, el precursor inmediato
del teobromina en la ruta de la biosíntesis de la cafeína. La
actividad específica de la STM con 7-metilxantina
fue de aproximadamente 55% de la determinada con teobromina. Los
valores de Km obtenidos para el teobromina y la
7-metilxantina fueron 0,196 y 0,946 mM,
respectivamente. Asimismo, se purificó STM a partir de hojas usando
los mismos procedimientos usados para los endospermas, junto con una
cromatografía adicional en una columna de Mono Q; se usó teobromina
como sustrato. Por último, se obtuvo la secuencia
N-terminal para los primeros 20 aminoácidos para la
STM purificada a partir de endospermas. No se encontraron semejanzas
con otras secuencias de metiltransferasa u otras proteínas
conocidas.
En el caso del té, se informó de la purificación
parcial de la metil transferasa (Physiol. Plan., 98, 629-(1996), sin
embargo no se aisló ninguna proteína enzimática.
Como se ha descrito anteriormente, la secuencia
de aminoácidos de la enzima en un sistema de síntesis de cafeína es
una N-metil transferasa que cataliza una reacción de
metilación de dos etapas a partir de 7-metil xantina
mediante teobromina a cafeína, que es una reacción final de la
biosíntesis de cafeína, ni la secuencia de aminoácidos ni el ADN que
codifica la secuencia de aminoácidos se conoce en la técnica
anterior.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar N-metil transferasa, una de las
enzimas que constituyen un sistema de síntesis de cafeína útil para
la síntesis de cafeína, que tiene simultáneamente las actividades
enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa,
teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa,
una molécula de ADN o de ARN que codifica la N-metil
transferasa útil para la estimulación o supresión de la producción
de cafeína en microorganismos o plantas y vectores similares usando
las mismas.
Por ejemplo, toda o parte de la molécula de ADN
según la presente invención se incorpora a microorganismos o células
vegetales en la forma de sentido o antisentido, por tanto haciendo
posible los siguientes objetos:
- (1)
- Producir de forma eficaz N-metil transferasa que pueda usarse como una enzima para uso industrial, alimentario o médico;
- (2)
- Producir de forma eficaz compuestos relacionados con el metabolismo de la cafeína modificando la biosíntesis de la cafeína y el metabolismo de plantas productoras de cafeína, tejidos vegetales o células vegetales y
- (3)
- Modificar la biosíntesis de cafeína y el metabolismo de plantas productoras de cafeína, tejidos vegetales, modificando por tanto la tasa de producción de los compuestos relacionados con el metabolismo de la cafeína.
Los presentes inventores llevaron a cabo un
análisis de la secuencia de aminoácidos N terminal de una
N-metil transferasa, como un polipéptido que tiene
simultáneamente las actividades de tres enzimas,
7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1
metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, que se ha
purificado de cotiledones de té, como resultado del estudio más
serio del inventor. En función del resultado se preparó una sonda
de ADN y usando esta sonda se aisló con éxito una molécula de ADN
diana mediante técnicas de PCR-RT y técnicas 5'
RACE.
Después, se integró la molécula de ADN en un
vector y se insertó en Escherichia coli para expresar una
gran cantidad de un polipéptido derivado de una molécula de ADN.
Cuando se recuperó el polipéptido expresado y se investigaron sus
propiedades enzimológicas, se observó la misma reacción que la del
polipéptido que tiene las actividades de las tres
N-metil transferasas descritas anteriormente
aisladas de los cotiledones de té, es decir, la producción de
cafeína a partir de paraxantina. Por tanto, se verificó que la
molécula de ADN tiene un gen que codifica una
N-metil transferasa, una de las enzimas que
constituyen un sistema de síntesis de cafeína, simultáneamente con
las actividades de las tres N-metil transferasas
descritas anteriormente.
En las plantas en las que la
N-metilación se lleva a cabo para una xantosina o un
compuesto análogo, o una xantina o un compuesto análogo, usando
S-adenosil metionina (SAM) como donante de un grupo
metilo, polipéptidos con la actividad de la N-metil
transferasa según la presente invención o la misma actividad
enzimática como se estima que contienen la transferasa y los ADN que
codifican estos péptidos. Usando el procedimiento según la
invención, a partir de estas plantas se pueden obtener la
N-metil transferasa o sustancialmente la misma
enzima como la transferasa y las moléculas de ADN o ARN que
codifican estas transferasas.
Los presentes inventores lograron la presente
invención en función de los hallazgos anteriores. Es decir, la
presente invención incluye los aspectos siguientes.
La primera molécula de ADN según la presente
invención se caracteriza por comprender cualquiera de las siguientes
secuencias de nucleótidos:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica una
N-metil transferasa, como un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº1 de la lista de secuencias
y que tiene actividades enzimáticas de 7 metil xantina N3 metil
transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil
transferasa; y
(b) una secuencia de nucleótidos modificada
obtenida mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos
en la secuencia nucleotídica (a) descrita anteriormente dentro un
intervalo donde un polipéptido codificado por la secuencia de
nucleótidos (a) pueda mantener la actividad enzimática.
Es preferible que la secuencia nucleotídica
modificada (b) pueda hibridar con la secuencia nucleotídica (a) en
condiciones estrictas.
Las primeras moléculas de ARN según la presente
invención se caracterizan por comprender cualquiera de las
secuencias de nucleótidos siguientes:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica la
N-metil transferasa, un polipéptido con una
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias
y que tiene las actividades enzimáticas de 7-metil
xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y para
xantina N3 metil transferasa; y
(b) una secuencia de nucleótidos modificada
obtenida mediante sustitución, deleción o inserción de nucleótidos
en la secuencia nucleotídica (a) descrita anteriormente dentro un
intervalo donde un polipéptido codificado por la secuencia
nucleotídica (a) pueda mantener las actividades enzimáticas.
Es preferible que la secuencia nucleotídica
modificada (b) pueda hibridar con la secuencia nucleotídica (a) en
condiciones estrictas.
Un vector para la expresión de la
N-metil transferasa según la presente invención se
caracteriza por comprender la molécula de ADN descrita anteriormente
y una constitución para expresar la N-metil
transferasa codificada por la primera molécula de ADN, en células
vegetales. Las células huésped pueden transformarse usando el vector
de expresión para obtener células transformadas. Además, las
células transformadas se cultivan, haciendo posible, por tanto,
producir N-metil transferasa con las actividades
enzimáticas anteriores.
Otro aspecto de una molécula de ADN según la
presente invención es la segunda molécula de ADN que tiene una
secuencia complementaria de toda o parte de la secuencia de
nucleótidos de la primera molécula de ADN descrita anteriormente,
caracterizada porque la segunda molécula de ADN es capaz de inhibir
las actividades enzimáticas de las células vegetales cuando se
introduce en las células vegetales con las actividades enzimáticas y
se expresa en las células vegetales.
Otro aspecto de una molécula de ARN según la
presente invención es la segunda molécula de ARN que tiene una
secuencia complementaria de toda o parte de la secuencia de
nucleótidos de la primera molécula de ARN descrita anteriormente,
caracterizada porque la segunda molécula de ARN es capaz de inhibir
la expresión de las actividades N-metil transferasa
de las células vegetales cuando se introduce en las células
vegetales con las actividades N-metil transferasa y
se lleva a cabo su expresión.
Un aspecto de un vector según la presente
invención se caracteriza por comprender cualquiera de las anteriores
moléculas de ADN y moléculas de ARN. Este vector puede
proporcionarse de manera que tenga una función para hacer posible la
expresión de la N-metil transferasa en un
microorganismo o una planta, teniendo dicha transferasa las tres
actividades de 7-metil xantina N3 metil transferasa,
teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa,
como se ha descrito anteriormente.
Usando el vector pueden transformarse
microorganismos, células vegetales, tejidos vegetales o cuerpos de
planta y los transformantes obtenidos se incluyen en la presente
invención. En plantas se puede producir un metabolito secundario
usando las células vegetales, los tejidos vegetales o los cuerpos de
planta transformados. Además, la composición del metabolito
secundario en las plantas transformadas puede modificarse usando
células vegetales, tejidos vegetales o cuerpos de planta.
La N-metil transferasa según la
presente invención es un polipéptido con las actividades enzimáticas
de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina
N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa,
caracterizado por tener:
- (a)
- una secuencia amino de SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias; o
- (b)
- una secuencia de aminoácidos modificada obtenida por sustitución, inserción o deleción de aminoácidos por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias dentro del intervalo en el que las actividades enzimáticas descritas anteriormente no se pierden sino que se mantienen.
Respecto a esta secuencia de aminoácidos
modificada (b), es preferible que el ADN que codifica la secuencia
aminoacídica (a) y el ADN que codifica esta secuencia aminoacídica
modificada (b) puedan hibridar en condiciones estrictas.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una molécula de ADN y una molécula de ARN que codifican
la N-metil transferasa, que es:
- i)
- una de las enzimas que constituyen un sistema de síntesis de cafeína.
- ii)
- Útil para la síntesis de cafeína y la modificación de la composición de la cafeína Un polipéptido que tiene simultáneamente las producida en microorganismos o plantas; y
- iii)
- tres actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.
La N-metil transferasa según la
presente invención es un polipéptido que tiene simultáneamente las
actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil
transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil
transferasa.
Respecto a la N-metil transferasa
puede mencionarse que teniendo una secuencia de aminoácidos indicada
por la SEC ID Nº 1 y que teniendo una secuencia de aminoácidos
modificada obtenida llevando a cabo sustitución, inserción o
deleción dentro de un intervalo donde la actividad
N-metil transferasa deseada no está dañada en la
secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1. Es decir, los polipéptidos
con una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 que tiene la
actividad N-metil transferasa deseada como se ha
descrito anteriormente y aquellos con una secuencia modificada se
denominan N-metil transferasa.
El polipéptido anterior que tiene él mismo la
secuencia de aminoácidos modificada tiene funciones
considerablemente idénticas a la N-metil transferasa
de los cotiledones de té y tiene una elevada homología con una
secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº1 en un sitio asociado con las
actividades enzimáticas.
En general, entre una pluralidad de enzimas con
funciones idénticas, es bien conocido que la homología de la
secuencia de aminoácidos en otro lugar distinto al sitio
indispensable para las actividades enzimáticas es muy baja (Kawagoe
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12082-(1996)). Por tanto,
incluso en el caso en el que toda la homología sea baja, la
transferasa que tiene una homología elevada en un sitio asociado con
las actividades puede clasificarse como N-metil
transferasa.
Al comparar toda la secuencia de aminoácidos,
puede ponerse como ejemplo una secuencia de aminoácidos modificada
que puede proporcionar un polipéptido con la N-metil
transferasa deseada y una homología de 15% o más, preferiblemente
una homología de 30% o más, más preferiblemente una homología de 45%
o más y todavía más preferiblemente una homología de 75% o más, la
homología más preferible es de 95% o más frente a la secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 1.
En el caso en el que la modificación frente a la
secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1 como la base se define a nivel
de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos modificada, puede proporcionarse una secuencia
nucleotídica modificada con una homología de 40% o más,
preferiblemente una homología de 60% o más, más preferiblemente una
homología de 75% o más, incluso más preferiblemente una homología de
90% o mas, todavía más preferiblemente una homología de 95% o más
frente a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 1.
Una secuencia de nucleótidos que codifica la
N-metil transferasa según la presente invención, es
decir, un gen de N-metil transferasa puede contener
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 1. Un ejemplo específico de la misma puede
incluir una secuencia de ADN de SEC ID Nº 2 y una secuencia de ARN
de SEC ID Nº 3. Una secuencia de nucleótidos con homología RULED
ABOVE frente al gen de N-metil transferasa como
base también está incluido en el gen que codifica la
N-metil transferasa según la presente invención.
Como una secuencia de aminoácidos que mantiene
las actividades N-metil transferasas deseadas, sus
ejemplos preferibles incluyen las codificadas por una secuencia de
nucleótidos modificada, que puede hibridar en condiciones estrictas
con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de SEC ID Nº 1 como la base.
Además, como el gen modificado de
N-metil transferasa, en la práctica puede usarse
preferiblemente aquel capaz de hibridar con la secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1
en condiciones estrictas. Un ejemplo específico del mismo puede
incluir moléculas de ADN capaces de hibridar en condiciones
estrictas para una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 2; y
moléculas de ARN capaces de hibridar en condiciones estrictas para
una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 3.
La hibridación en estas condiciones estrictas
puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento
descrito en Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Current Protocols in Molecular Biology; Wiley Interscience. Como un
sistema disponible comercialmente, puede ponerse como ejemplo un
sistema de GeneImage (Amersham). Específicamente, la hibridación se
puede llevar a cabo mediante la operación siguiente.
Una membrana, a la que se han transferido las
moléculas de ADN o de ARN que se van a probar, se trata para la
hibridación usando una sonda marcada en un tampón de hibridación
especificado por el protocolo de acuerdo con los protocolos del
producto. La composición del tampón de hibridación consiste en 0,1%
en peso de SDS, 5% en peso de sulfato de dextrano; 1/20 de volumen
de un reactivo bloqueante incluido en el kit y de 2 a 7 x SSC. Un
reactivo bloqueante se usa preparando 100 x solución de Denhardt, 2%
(peso/volumen) de seroalbúmina bovina, 2% (peso/volumen)de
Ficill^{TM} 400, 2% (peso/volumen) polivinil pirrolidona a una
concentración del quíntuple, y diluirlos a 1/20. Respecto a 20 x
SSS, es una solución de cloruro sódico 3M y ácido cítrico 0,3M.
Preferiblemente, SSC se usa a una concentración de 3 a 6 x SSC y más
preferiblemente se usa a una concentración de 4 a 5 x SSC.
La temperatura de hibridación varía de 40ºC a
80ºC, más preferiblemente de 50ºC a 70ºC y más preferiblemente de
55ºC a 65ºC. Se lleva a cabo incubación durante varias horas o una
noche, seguido por lavados usando un tampón de lavado.
Preferiblemente, la temperatura de lavado es igual a la temperatura
ambiente y más preferiblemente es una temperatura durante la
hibridación. La composición del tampón de lavado es una solución de
6 x SSC + 0,1% en peso de SDS, más preferiblemente una solución 4 x
SSC + 0,1% en peso de SDS, todavía más preferiblemente una solución
2 x SSC + 0,1% en peso de SDS, todavía más preferiblemente una
solución 1 x SSC + 0,1% en peso de SDS y lo más preferible es una
solución 0,1 x SSC + 0,1% en peso de SDS. Se lava una membrana con
dicho tampón de lavado, por lo cual las moléculas de ADN o las
moléculas de ARN en las que la sonda se híbrida pueden identificarse
usando un marcaje empleado para la sonda.
La modificación se puede producir en la
naturaleza o puede generarse de forma artificial mediante mutación
de sitio en la secuencia de nucleótidos.
Las moléculas de ADN con genes de
N-metil transferasa de acuerdo con la presente
invención pueden separarse de células productoras de
N-metil transferasa según la presente invención
usando técnicas de PCR como se describe en "Plant PCR test
protocols" (otro volumen de ingeniería celular, ingeniería de
células vegetales serie 2) Shujynsha (1995), donde se emplea como
cebador, por ejemplo, un oligonucleótido que híbrida específicamente
con moléculas de ADN que codifican N-metil
transferasa.
Específicamente, una molécula de unión se une al
ADNc sintetizado a partir del ARNm y se lleva a cabo una PCR entre
la molécula de unión y el ADN que codifica una secuencia de
aminoácidos que constituye la N-metil transferasa,
en el que puede aislarse la secuencia de longitud total del ADNc
diana.
Las moléculas de ADN que codifican la
N-metil transferasa obtenidas mediante tal técnica
de hibridación o técnica de PCR tienen homología con el gen de la
N-metil transferasa de la SED ID Nº 2 al menos en un
sitio usado para el aislamiento. La homología usada en la presente
invención denota homología de 15% o más, preferiblemente homología
de 30% o más, más preferiblemente homología de 45% o más, todavía
más preferiblemente homología de 60% o más, todavía más
preferiblemente homología de 75% o más, incluso más preferiblemente
homología de 90% o más y la más preferible, homología de 95% o más,
en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por los
respectivos genes de N-metil transferasa. Sin
embargo, incluso si la homología con la N-metil
transferasa llega a 15% o menos como resultado de una deleción,
adición y sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos
para ser codificados, se estima que algunos de los genes de
N-metil transferasas obtenidos mantienen una región
indispensable para las funciones de N-metil
transferasa y sustancialmente codifican proteínas que tienen sus
funciones similares a la N-metil transferasa.
Pueden usarse todos los organismos usados para
aislar moléculas de ADN o moléculas de ARN que tengan secuencias de
nucleótidos (genes) que codifican N-metil
transferasa de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando
produzcan cafeína o su precursor. Pueden incluir plantas de
Theaceae Camellia, tales como el té. Plantas de Rubiaceae
Coffea como la planta del café. Plantas de Sterculiacecae
Cola, como la planta de Cola o similares.
Puede obtenerse una molécula de ARN que incluya
un gen de N-metil transferasa de acuerdo con la
presente invención conectando un ADN que codifique la
N-metil transferasa, que puede preparase mediante el
procedimiento descrito anteriormente, en la dirección deseada en la
localización operable en la dirección 3' de un promotor como el
promotor Sp6 o el promotor T7, reconocidos por la ARN polimerasa,
para preparar una molécula e recombinante y traduciendo la molécula
recombinante mediante la ARN SP6 polimerasa o al T7 polimerasa y
obtener la molécula de ARN deseada. La molécula de ARN también puede
obtenerse introduciendo un ADN o un AR>N que codifica la
N-metil transferasa en un virus vegetal o insertando
un ADN o un ARN que codifica la N-metil transferasa
en un vector que lleva un cassette de expresión adecuado, como se
describe más adelante, de manera que el ADN o el ARN esté conectado
al cassette de expresión en la dirección deseada en la localización
operable para preparar una molécula recombinante e introduciendo la
molécula recombinante en un microorganismo o planta huésped para que
el ARN que codifica la N-metil transferasa pueda
formarse en el huésped usando la actividad de transcripción del
huésped.
Las moléculas de ADN que tienen complementariedad
con todas o parte de las moléculas de ADN que tienen los genes de la
N-metil transferasa o moléculas de ARN que tienen
genes de N-metil transferasa pueden usarse como
moléculas de ADN o de ARN para la inhibición o la supresión de la
expresión de la N-metil transferasa en células
vegetales, siempre y cuando estas moléculas tengan una función en la
inhibición de la expresión de la N-metil transferasa
peculiar para las células vegetales del huésped cuando estas
moléculas se expresas en las células vegetales del huésped.
Según la presente invención, la parte del gen de
N-metil transferasa como la base para la molécula
de ADN o ARN complementaria denota un sitio que puede usarse para
proporcionar una secuencia complementaria como una base para formas
ARNm para la inhibición (es decir, ARN antisentido) en las células
huésped. Este ARNm para inhibición se forma en las células huésped,
el ARN se une con el ARNm para expresión de la
N-metil transferasa en las células huésped, y la
expresión de N-metil transferasa en las células
huésped se inhibe. Este sitio es necesario para formar dicho ARNm
antisentido, que tiene, por ejemplo, al menos 14 bases de
longitud.
Las moléculas de ADN para formar el ARNm
antisentido pueden incluir, por ejemplo, moléculas de ADN
complementarias a toda o parte de la secuencia de nucleótidos SEC ID
Nº 2, y las moléculas de ARN antisentido incluyen moléculas de ARN
complementarias a toda o parte de la secuencia de nucleótidos SEC ID
nº 3. Para dicho propósito también se pueden usar moléculas de ADN
o moléculas de ARN complementarias a toda o parte de la secuencia
modificada capaz de hibridar con estas secuencias nucleotídicas de
SEC ID Nº 2 y 3 en condiciones estrictas.
También pueden usarse las moléculas de ADN que
tengan una homología elevada con estas moléculas de ADN o moléculas
de ARN inhibidoras y con las funciones inhibidoras o restrictivas
deseadas. En la presente, una homología elevada denota homología de
60% o más, preferiblemente homología de 75% o más, más
preferiblemente homología de 90% o más y, lo más preferible,
homología de 95% o más en la comparación de las secuencias de
nucleótidos respectivas.
Puede que estas mismas moléculas inhibidoras de
ADN o moléculas inhibidoras de ARN no siempre codifiquen la
N-metil transferasa según la presente
invención.
Otro aspecto de la secuencia de nucleótidos para
inhibir la N metil transferasa según la presente invención está
dirigido a una secuencia de nucleótidos con uno o más sitios de
homología con el gen de la N-metil transferasa, pero
que no codifican la N-metil transferasa. La
N-metil transferasa peculiar para las células
huésped puede inhibirse sustituyendo esta secuencia de nucleótidos
con el gen de la N-metil transferasa de las células
huésped que se va a delecionar.
Respecto de la expresión del gen de
N-metil transferasa o de la expresión de las
moléculas de ADN que tienen funciones inhibidoras o restrictivas de
la expresión del gen de N-metil transferasa o de la
N-metil transferasa en las células huésped, más
adelante se describirá un ejemplo usando células vegetales como
células huésped.
Para la expresión en células vegetales puede
usarse un procedimiento para introducir en las células vegetales
huésped un cassette de expresión y transformar las células huésped,
incluyendo el cassette de expresión: (i) un promotor que permita la
transcripción de ADN en ARNm en la célula huésped; (ii) un fragmento
de ADN que contiene un gen de N-metil transferasa
unido al lado 3' del promotor en dirección sentido o antisentido o
un fragmento de ADN con las funciones para inhibir la expresión de
la N-metil transferasa; y (iii) una secuencia de
terminación que contienen un sitio de poliadenilación requerido para
la estabilización de los productos transcritos unida al lado 3' de
estos fragmentos de ADN, como es necesario.
Dicho cassette de expresión y un vector que
contiene este cassette son el objeto de la presente invención.
El cassette de expresión puede contener un
promotor que exprese de forma constitutiva o inductiva el ADN
insertado. Además, este cassette de expresión puede tener un origen
de replicación en las células vegetales, como se requiere.
Los promotores para la expresión constitutiva
incluyen, por ejemplo, un promotor 35S para el virus del mosaico de
la coliflor, un promotor de la actina del arroz y similares. Además,
promotores para la expresión inductiva incluyen, por ejemplo,
promotores de los que se sabe que se expresan a causa de factores
externos tales como infecciones o invasiones por hongos, bacterias o
virus, temperaturas bajas, temperaturas elevadas, condiciones de
sequedad y anaerobias, pulverización de compuestos específicos o
similares. Tales promotores incluyen un promotor de genes de la
quitinasa de arroz expresado, por ejemplo por infecciones o invasión
de hongos, bacterias o virus; un promotor de genes de proteína PR;
un promotor de genes de "lip19" de arroz inducido por las
temperaturas bajas; un promotor de genes de "HSP162" de
Capsella bursa-pastoris inducido por las
temperaturas elevadas; un promotor de genes "rab" de arroz
inducido por sequía; un promotor del gen de la alcohol
deshidrogenasa de maíz inducido por condiciones anaerobias o
similares. Además, el promotor de los genes de la quitinasa de arroz
y el promotor de los genes de la proteína PR del tabaco se inducen
por compuestos específicos tales como ácido salicílico o similares,
y el promotor del gen "rab" del arroz está inducido por la
pulverización de ácido abscísico de hormona vegetal.
Por otro lado, como promotor para expresar ADN
insertado en el cassette de expresión se puede usar un promotor
derivado de cualquiera de los genes de N-metil
transferasa.
Un ejemplo específico de aislamiento de un
promotor puede incluir un procedimiento para seleccionar fragmentos
de ADN genómico y especificar el ADN en la sección superior del gen
usando la técnica de hibridación en la que todos o parte de los
genes de la N-metil transferasa se usan como
sonda.
Para preparar la introducción en plantas de
moléculas de ADN recombinante en el cassette de expresión puede
usarse un número de vectores de clonación que contienen una señal de
replicación en E. coli y uno o varios genes marcadores para
la selección de las células de E. coli transformadas.
Ejemplos de tales vectores incluyen pBR322, sistema pUC, sistema
M13mp o similares. Se puede introducir una secuencia diana en un
punto de corte de enzimas de restricción adecuado. Para aclarar las
características del ADN plasmídico obtenido generalmente se usan
análisis del punto de corte de la enzima de restricción,
electroforesis en gel y otros procedimientos bioquímicos,
biológico-moleculares. Después de completar cada
operación, se corta el ADN plasmídico y se puede unir con otro ADN.
La secuencia de cada plásmido se puede clonar en el mismo plásmido o
en otro plásmido.
Para introducir el cassette de expresión en
células vegetales se puede usar una variedad de técnicas. Estas
técnicas incluyen la transformación de células vegetales con
ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes como factores de transformación;
inducción directa en los protoplastos (procedimiento de inyección,
procedimiento de electroporación o similares), procedimiento de
disparo de partículas o similar y cualquier otra posibilidad.
Para la introducción directa en los protoplastos
no se requiere ningún vector en particular. Por ejemplo, puede
usarse un plásmido simple como un derivado del pUC. Algunos
procedimientos para introducir los genes diana en las células
vegetales pueden requerir otra secuencia de ADN. Por ejemplo,
cuando se usa el plásmido Ti o Ri para transformar las células
vegetales, es preferible conectar al menos la secuencia del extremo
derecho de la región del ADN-T para los plásmidos Ti
y Ri, principalmente las secuencias de ambos extremos para que sean
regiones adyacentes de los genes que se van a introducir.
Cuando se usa Agrobacteriu para la
transformación, se requiere introducir un cassette de expresión para
su clonación en un plásmido específico, es decir, en un vector
intermedio o en un vector binario. El vector intermedio no se
replica en Agrobacterium. El vector intermedio se desplaza al
interior de Agrobacterium con un plásmido auxiliar o mediante
electroporación. el vector intermedio tiene una región homóloga a la
secuencia de ADN-T y, por tanto, se incorpora en el
plásmido Ti o Ri de Agrobacterium mediante recombinación
homóloga. Como huésped es necesario usar Agrobacterium para
incluir la región vir y el ADN-T puede moverse a las
células vegetales por medio de las funciones de la región.
Por otro lado, el vector binario puede replicarse
y mantenerse en Agrobacterium. Por tanto, cuando el vector
binario se incorpora en Agrobacterium por medio del plásmido
auxiliar o técnicas de electroporación, el ADN-T del
vector binario puede moverse a las células vegetales mediante las
funciones de la región Vir del huésped.
El vector intermedio o el vector binario que
incluye el cassette de expresión obtenido y microorganismos como
Escherichia coli o Agrobacteriu que incluyen estos
vectores son el objeto de la presente invención.
Las células vegetales transformadas pueden
convertirse en un tejido vegetal o un cuerpo vegetal experimentando
un proceso de reproducción. Los métodos de reproducción dependen de
los tipos de células vegetales e incluyen el procedimiento de
Fujimora y col. para el arroz (Plan Tissue Culture Lett., 2.
74-(1995)): el procedimiento de Shillito y col. para el maíz
(Bio/Technology, 7, 581-(1989)); y el procedimiento de Akama y col.,
para Capsella bursa-pastoris (Plant Cell Rep., 12,
7-(1992)) o similares.
Según la presente invención, el término "cuerpo
vegetal" se refiere a todo el organismo individual clasificado en
planta o partes orgánicas de la misma tales como hojas, tallos,
raíces, flores, frutos, semilla y similares.
En cuanto al cuerpo vegetal producido por estos
procedimientos o el cuerpo vegetal obtenido de su catalizador de
reproducción (por ejemplo, semillas, tallos, esquejes o similares),
una cantidad de expresión de N-metil transferasa
según la presente invención varía en comparación con un de cuerpo
vegetal de tipo salvaje productor de cafeína o de su precursor; se
produce un cambio en la cantidad de generación de compuestos del
sistema del metabolismo de la cafeína debido a la modificación del
metabolismo de la planta huésped o un cambio en la tasa de
producción del grupo de compuestos del sistema del metabolismo de la
cafeína por una modificación del metabolismo de la planta huésped.
La planta transgénica obtenida de esta manera es el objeto de la
presente invención. Las plantas según la presente invención incluyen
tejidos o células específicos de plantas tales como hojas, flores,
frutos, semilla o similares.
Además, recientemente, a partir de estudios sobre
el silencio génico postraduccional de plantas, se ha encontrado que
la expresión de genes diana puede restringirse usando los mecanismos
de protección intrínsecos de la planta para ácidos nucleicos
exóticos tales como virus (Cell, 95, 177-187 (1998),
Chemistry and Biology, 37, 532-(1999) y enzimas proteicas de ácidos
nucleicos, 44, 1396- (1999)). Según este estudio, en el caso en el
que virus ADN o virus de ARN o similares invaden la planta, las
plantas transcriben ARN aberrante a partir de estos moldes y se
forma ARN bicatenario de forma secuencial específicamente con el
producto transcrito de la secuencia intrínseca que las plantas
poseen. Esta ARN bicatenario se fragmenta por la acción de la RNasa,
por tanto haciendo posible restringir la expresión de genes diana
(Cell, 96, 303-(1999)). Una de las características esenciales de
este procedimiento es que una secuencia cuya expresión se va a
restringir, no siempre necesita ser transformada en la planta diana.
Además, otras características de este procedimiento son que, si se
introduce un ácido nucleico diana en parte de la planta (hoja de
orden inferior o similares) por infección o similar, su efecto se
extiende a la totalidad del cuerpo de la planta. Un procedimiento
específico de la restricción de la expresión consiste en producir la
infección con la hoja de orden menor de la planta del ARN
bicatenario que incluye todo o parte de la secuencia del gen diana o
la secuencia que tiene una homología elevada o Agrobacteriu
con el ADN bicatenario. En la presente, una homología elevada denota
homología de 60% o más, preferiblemente homología de 75% o más, más
preferiblemente homología de 90% o más y lo más preferiblemente, una
homología de 95% o más en comparación con las secuencias de bases
respectivas.
En el cuerpo de la planta sometido a este
procedimiento, una cantidad de expresión de la proteína
N-metil transferasa según la presente invención
cambia en comparación con un cuerpo vegetal de tipo salvaje que
produce cafeína o su precursor. Además, se produce un cambio en la
cantidad de la expresión de los compuestos del metabolismo de la
cafeína debido a la modificación del metabolismo de la planta
huésped o un cambio en la tasa de producción del grupo de compuestos
del sistema del metabolismo de la cafeína debido a la modificación
del metabolismo de la planta huésped. La planta obtenida de esta
manera es el objeto de la presente invención. Las plantas usadas en
esta invención incluyen tejidos o células específicas de plantas,
tales como hojas, flores, frutos, semilla o similares.
Las plantas productoras de cafeína siendo el SAM
un donante de grupos metilo pueden incluir plantas productoras de
cafeína entre las que se incluyen plantas de Theacea Camellia
como la planta del té; plantas de Rubiaceae coffea tales como
la planta del café; plantas de Sterculiaceae Cola tales como
la planta de Cola.
Los microorganismos para introducir ADN que
codifica la N-metil transferasa, expresando por
tanto una gran cantidad de las proteínas N-metil
transferasa según la presente invención, pueden incluir bacterias
tales como E. coli, Bacillus subtilis o similares; y
virus tales como Baculoviridae.
Además, cualquier planta productora de cafeína o
su precursor puede usarse como planta en la cual un ADN que codifica
la N-metil transferasa según la presente invención,
en la forma de sentido o antisentido, para obtener plantas
transformadas para los propósitos de mejorar la productividad para
un compuesto específico y cambiar una proporción de producción de un
grupo de compuestos específico modificando el metabolismo en las
células huésped.
La producción de metabolitos secundarios
relacionados con el sistema de síntesis de cafeína y la composición
de los metabolitos secundarios producidos por estos transformantes
pueden modificarse cultivando las células vegetales o los tejidos
vegetales transformados con el vector de la constitución descrita
anteriormente o cultivando plantas transformadas del mismo modo.
Como metabolitos secundarios pueden mencionarse, por ejemplo, al
menos un compuesto seleccionado del grupo compuesto por
7-metil xantina, paraxantina, teobromina y
cafeína.
Como fuentes de suministro de células vegetales,
tejidos vegetales o cuerpos de plantas usados para transformación
pueden mencionarse, por ejemplo, una planta de Camellia, una planta
de Coffea, una planta de Cola, una planta de Ilex, una planta de
Neea, una planta de Firmiana, una planta de Paulinia o una planta de
Therbroma como cuerpos de plantas para transformación.
Estas plantas pueden incluir plantas de
Theaceae Camellia tales como la planta el té; plantas de
Rubiaceca coffea tales como la planta del café; plantas de
Sterculiaceae Cola tales como la planta de Cola, o
similares.
Además, en la N-metil transferasa
según la presente invención, pueden metilarse compuestos
estructuralmente análogos tales como 7-metil xantina
así como teobromina. por tanto, incluso si no son los tipos de
plantas anteriores, el procedimiento según la presente invención se
puede aplicar a plantas que contienen compuestos de xantina
estructuralmente análogos de la misma.
Como resultado del estudio enzimático, está claro
que la N-metil transferasa según la presente
invención tiene las siguientes propiedades básicas.
- Peso molecular: 41.000 (SDS-PAGE), 61.000 (filtración en gel)
- Punto isoeléctrico: 4,5 a 5,0 (cromatoenfoque)
- pH óptimo: 8,5
- Valor Km: 21 \muM (SAM) o 24 \muM (paraxantina)
- Inhibidor: SAH (S-adenosil homocisteína)
- Mecanismo de la reacción: SAM + Paraxantina \rightarrow cafeína SAH
En lo sucesivo, la presente invención describirá
con más detalle por medio de Ejemplos y Ejemplos Comparativos. El
alcance de la presente invención no se limita a estos Ejemplos.
Primeras, segundas y terceras hojas de té
(Camellia sinensis var. Yabukita) recogidas en Makurazaki
City, Kagoshima Prefecture en mayo de 1997 se congelaron usando
nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC. Este material de 100 g
se molió añadiendo 5 mM EDTA-Na2 de 1.000 ml; 2,5
mM 2-mercaptoetanol; 5% (v/v) de glicerina; 1 mg de
aprotinina; 0,5% (p/v) de ascorbato sódico y 50 mM de una solución
de tampón de fosfato sódico (pH 7,3) que contiene 2,5% (p/v) de
polivinil pirrolidona insoluble, y se filtró a través de un filtro
de tres capas. A continuación se centrifugó el líquido filtrado
(10.000 g, 15 minutos) y se obtuvo un sobrenadante. Después, a
partir del sobrenadante se preparó una fracción de sulfato amónico
saturado al 50-80%. Esta fracción se desionizó
usando Sefadex G -25; se disolvió en una solución 10 mM de tampón
fosfato sódico (pH 7,2) que contiene 2 mM de
EDTA-Na2; 2-mercaptoetanol 2mM; 20%
(v/v) de glicerina y, después, se adsorbió a una columna de
hidroxiapatita (15 x 160 mm) equilibrada con la misma solución de
tampón; y se eluyó una fracción activa usando un gradiente de
concentración lineal de 10-200 mM de 200 ml de la
solución de tampón fosfato sódico que contienen
EDTA-Na2 2 mM; 2-mercaptoetanol 2mM;
20% (v/v) de glicerina. Se recogió la fracción activa y el
precipitado se volvió a recoger mediante sulfato amónico insaturado
al 80% y la fracción se disolvió en Tris 50
mM-solución de tampón de ácido clorhídrico (pH 8,4)
que contiene EDTA-Na2 2 mM;
2-mercaptoetanol 2mM; KCl 20 mM; 20% (v/v) de
glicerina. Tras llevar a cabo la desionización, la fracción se
adsorbió a una columna de intercambio iónico catódica Shodex IEC
QA-824 (8 x 25 mm) para el uso exclusivo en una
cromatografía líquida de alto rendimiento equilibrada por la misma
solución tampón. Después de lavar la columna con la misma solución
tampón, la proteína adsorbida se eluyó mediante un gradiente de
concentración lineal de 30 ml de KCl de 20-750 mM
(disuelta en la solución tampón de ácido
clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene
EDTA-Na2 2 mM; 2-mercaptoetanol 2
mM; y 20% (v/v) de glicerina. Se recogió la fracción activa, se
desionizó y se adsorbió en adenosina-agarosa (1 ml)
que es una columna de afinidad equilibrada por la misma solución
tampón tras haberse disuelto en una solución tampón ácido
clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene
EDTA-Na2 2 mM; 2-mercaptoetanol 2mM
y 20% (v/v) de glicerina. La fracción activa se eluyó mediante una
solución de tampón de ácido clorhídrico-Tris 50 mM
(pH 8,5) que contiene NaCl 0,2M; EDTA-Na2 2mM;
2-mercaptoetanol 2mM y 20% (v/v) de glicerina. La
fracción obtenida se sometió a filtración en gel usando H1Load
Superdex 200 (16 x 600 mm) equilibrada por la solución tampón de
ácido clorhídrico-Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene
2-mercaptoetanol 2 mM; KCl 150 mM; 20% (v/v) de
glicerina y se obtuvo una muestra finalmente refinada. La tabla 1
resume un cambio en la actividad del procedimiento de refinado de la
N-metil transferasa.
La muestra finalmente purificada se transfirió a
una membrana de PVDF usando un aparato de Transferencia Semiseca
tras electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se
cortó un sitio al cual se transfirió la N-metil
transferasa y se analizó una secuencia de aminoácidos de un extremo
N-terminal usando un secuenciador proteico ABI. El
resultado se muestra en la SEC ID Nº4.
Como sonda se empleó un oligonucleótido
NMT-1 de 19 residuos y un cebador Not I-(dT) 18
(Pharmacia Biotech) basado en 7 residuos aminoacídicos del extremo
N-terminal del oligonucleótido para la clonación del
ADNc de la N-metil transferasa. La secuencia de
NMT-1 se muestra en la SEC ID Nº5.
Se molieron hojas jóvenes de té de 5 g en
presencia de nitrógeno líquido usando una vara (ROD) o un mortero.
Tras la sublimación del nitrógeno líquido se añadieron 50 ml de LiCl
3M y urea 8M y se molieron más con politron. Después, las hojas
molidas se colocaron estáticamente una noche a 4ºC y se
centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 minutos. El precipitado se
suspendió en 0,5% de SDS, una solución tampón
clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,6) hasta una cantidad
total de aproximadamente 10 ml. El precipitado suspendido se mezcló
añadiendo 10 ml de una solución de cloroformo de fenol y se
centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos. Al sobrenadante se
añadió 1/10 volumen de una solución de acetato sódico 3M (pH 4,8) y
después 2 volúmenes de etanol, la mezcla se colocó estáticamente a
-80ºC durante una hora. La centrifugación se llevó a cabo a 4ºC y
12.000 rpm durante 10 minutos, al precipitado separado del
sobrenadante se añadió un 70% de etanol para formar una suspensión y
se volvió a centrifugar. Se eliminó el sobrenadante y el residuo se
secó mediante una bomba de vacío. El precipitado obtenido de esta
manera se disolvió en 1,5 ml de agua, se añadieron 150 \mul de
solución de acetato sódico 3M (pH 4,8) y posteriormente se añadieron
1,5 ml de solución de fenol/cloroformo para vertirse y mezclarse.
Después, se llevó a cabo la centrifugación a 12.000 rpm durante 10
minutos. Al sobrenadante se añadieron 2 volúmenes de etanol y se
colocó estáticamente a -80ºC durante 20 minutos. Después se llevó a
cabo la centrifugación a 4ºC y 12.000 rpm durante 10 minutos. Al
precipitado obtenido de esta manera se añadió etanol al 70% y se
volvió a centrifugar. El precipitado se secó mediante la bomba de
vacío, se disolvió en 200 \mul de agua y, por tanto, se obtuvo una
fracción de ARN total.
El ARN total (2 mg) obtenido mediante el
procedimiento descrito anteriormente se sometió a tratamiento
térmico a 65ºC durante 5 minutos y después se mezcló con la solución
A del mismo volumen que dos veces la concentración (solución tampón
ácido clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,5);
EDTA-Na2 1mM; 0,1% de SDS; NaCl 0,5M).
Se sumergieron 0,1 g de
oligo(dT)-Celulosa tipo 7 (Pharmacia) en 2 ml
de solución B (solución tampón ácido
clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,5);
EDTA-Na2 1mM; 0,1% SDS; NaCl 0,1 M) y la suspensión
se vertió en una punta azul rellena con lana cristalina en su
extremo y se lavó con 2,5 ml de NaOH 0,1 N. Después, se vertieron 5
ml de la solución A y se equilibró. A esta columna se aplicó el ARN
total y se vertieron 3 ml de solución A y 4 ml de solución B. A
continuación se eluyó el ARNm mediante 3 ml de solución C (solución
tampón clorhídrico-Tris 10 mM (pH 7,5),
EDTA-Na2 1 mM y 0,05% de SDS). La solución eludida
se condensó mediante precipitación en etanol y se secó. Después, la
solución se disolvió en agua y se conservó a -80ºC.
Durante 3 minutos se enfriaron de forma aguda 190
de ARNm inmediatamente después del tratamiento térmico a 65ºC
durante 10 minutos. Esta muestra se usó como molde y se sintetizó un
ADNc monocatenario usando el First-Strand cDNA
Synthesis Kit (Pharmacia). El ADNc sintetizado se conservó a
-20ºC.
Se preparó la siguiente solución de reacción que
contenía el ADNC monocatenario preparado mediante el procedimiento
descrito anteriormente y se usó como molde. Esta solución de
reacción se hizo reaccionar a 95ºC durante 1 minuto usando un
ciclador térmico Peltier PTC-200 (Funakoshi),la PCR
se llevó acabo en condiciones en las que un ciclo incluía las etapas
de 95ºC/1 minuto, 45ºC/1 minuto y 72ºC/2 minutos, respectivamente y
se realizaron 30 ciclos, y se obtuvo el producto de la reacción.
- ADNc molde: 3 \mul
- Tampón 10 x: 5 \mul
- NTP 2,5 mM: 8 \mul
- NMT-1: 1 \mul (50 pmol)
- NotI- (dT) 18: 1 \mul (50 pmol)
- H2O: 31 \mul
- ExTaq (TAKARA): 1 \mul
La electroforesis del producto de reacción
obtenido en el Ejemplo 5 se llevó a cabo en TAE usando gel de
agarosa al 0,8%, una banda del producto diana obtenido se cortó y el
ADN se recogió de un gel usando GENE CLEAN (Funakoshi). El ADN
recogido de transformó en Escherichia coli DH5\alpha tras
la unión con el vector pT7blue (Novagen). Después de llevar a cabo
la selección de color usando X-gal, el cultivo
líquido se realizó en el medio de cultivo LB con ampicilina y se
extrajo y aisló un plásmido usando la técnica
álcali-SDS. La presencia o ausencia del inserto de
verificó mediante electroforesis en agarosa. Por tanto, un fragmento
de ADN que incluía el gen de la N-metil transferasa
se aisló en el plásmido.
La extensión del cebador se llevó a cabo en la
siguiente solución de reacción usando plásmido aislado. Las
condiciones de reacción son las siguientes. Tras la reacción a
96ºC/1 minuto, la PCR en la que un ciclo incluía las etapas de
96ºC/0,2 minutos, 50ºC/0,1 minuto y 60ºC/4 minutos, respectivamente
y se realizaron 25 ciclos. Se llevó a cabo precipitación en etanol
para la solución de la reacción y el ADN obtenido se disolvió en
reactivo de supresión de molde y se analizó usando el analizador
genético ABI-310. Para determinar una secuencia en
el centro del ADN diana se usó un plásmido en el que el fragmento de
ADN obtenido tratando el ADN con Styl se subclonó en pUC19. Estas
secuencias cebadoras se muestran en las SEC ID Nº 6 y 7.
Composición de la solución de la reacción de
extensión del cebador
- ADN plasmídico (20 ng): 2 \mul
- Premix: 4 \mul
- Cebador: 1 \mul
- H2O: 3 \mul
Para el aislamiento de la región 5' se usó el
equipo Full RACE Core (Takara). Se muestran las secuencias de los
cebadores usados para las SEC ID Nº 8 a 17.
Con la primera hebra de ADNc sintetizada por el
procedimiento descrito en el Ejemplo 4, tras la descomposición del
ARN cíclico y el ciclado del ADNc monocatenario con una reacción de
ligación, se llevó a cabo la reacción de PCR en función de la
técnica normal usando los cebadores de las SEC ID Nº 8 a 12 o SEC ID
Nº 13 a 17, y se obtuvo el producto de la reacción. Una banda del
producto de la reacción se separó mediante electroforesis en
acrilamida y se recogió ADN de un gel, y se subclonó en el vector
pT7blue. Después, se determinó la secuencia de bases del ADN
insertado mediante la técnica similar a las de los Ejemplos 6 y
7.
La siguiente operación se llevó a cabo para
volver a incorporar el gen aislado de N-metil
transferasa en el vector de expresión pET23d (Novagen).
La PCR se llevó a cabo en las siguientes
condiciones usando el vector pT7blue, en el que se obtuvieron el ADN
del gen aislado de la N-metil transferasa obtenido
en el Ejemplo 6 como un molde y los cebadores de las SEC ID Nº 18 y
19, respectivamente, y el producto de la reacción.
Tras la reacción a 95ºC/1,5 minutos, se llevó a
cabo la PCR en la que un ciclo incluía las etapas de 95ºC/1 minuto,
52ºC/1 minuto y 72ºC/1 minutos, respectivamente y se repitieron 30
ciclos.
Por otro lado, un fragmento obtenido tratando el
fragmento de ADN del gen de la N-metil transferasa
aislado con NcoI y EcoRI se insertó en el vector pET23d. A
continuación, el producto de la PCR citado anteriormente se insertó
en el sitio Ncol de este vector pET23d para formar un plásmido de
expresión de N-metil transferasa. Este plásmido se
transformó en Escherichia coli BL21 (DE3). Después de
cultivar la Escherichia coli obtenida a 37ºC durante 2 horas,
se añadió IPTG hasta llegar a una concentración final de 0,3 mM y se
llevó a cabo un cultivo adicional de 3 horas a 30ºC. Después de
completar el cultivo, se recogieron las células y las células de la
solución de cultivo de 3 ml se sometieron a tratamiento con
ultrasonidos durante 1 minuto con intervalos en 0,2 ml de Tris 10
mM-solución tampón de ácido clorhídrico (pH 7,5),
NaCl 0,1M, EDTA-Na2 1mM. Después se centrifugó a
14.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante obtenido se usó como
una solución enzimática.
En cuanto a la secuenciación de los Ejemplos 7 y
8, la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN que incluye el
gen de N-metil transferasa obtenido en este ejemplo
tiene la secuencia de SEC ID Nº 2 y la correspondiente tiene la
secuencia de SEC ID Nº 3. secuencia de nucleótidos del ARN. La
correspondiente secuencia de aminoácidos de la
N-metil transferasa se muestra como la SEC ID
Nº1.
La solución de la reacción para la determinación
de N-metil transferasa se preparó de la siguiente
manera. A Tris 100 mM-solución tampón de ácido
clorhídrico (pH 8,5), MgCl2 0,2 mM, paraxantina 0,2 mM,
[metil-14C]S-adenosilmetionina
4 \muM (0,9 kBq) se añadieron 10 \mul de la solución enzimática
y el volumen de la solución de reacción fue 100 \mul. La reacción
se llevó a cabo a 27ºC durante 10 minutos, la
cafeína-^{14}C se extrajo añadiendo 1 ml de
cloroformo a la misma y se midió la radioactividad de una capa de
cloroformo. Como control a la solución de reacción se añadió
xantosina en vez de para xantina o se retiró paraxantina. Como
resultado de la medición de la actividad, se encontró que se
produjeron 1,56 pmol de cafeína sólo cuando se añadía paraxantina
como sustrato.
La reacción enzimática anterior se repitió, a
excepción de que a la solución de reacción se añadió
7-metil xantina o teobromina en vez de paraxantina.
Como resultado de la medición de la actividad enzimática, la
producción de teobromina se observó en la solución de reacción a la
cual se añadió 7-metil xantina en vez de
paraxantina, mientras que la producción de cafeína se observó en la
solución de reacción a la cual se añadió teobromina en vez de
paraxantina. Respecto de estos resultados, se reveló que la enzima
aislada en el procedimiento anterior tenía tres actividades
N-metil transferasa diferentes usando otros dos
sustratos además de paraxantina, respectivamente.
Mediante el siguiente procedimiento de creó un
vector recombinante que llevaba un gen antisentido de
N-metil transferasa:
Mediante PCR se amplificaron fragmentos de ADN
usando como molde la longitud total del gen de la
N-metil transferasa aislado como se usó en el
Ejemplo 9 y los cebadores con las secuencias de nucleótidos de SEC
ID Nº 20 y 21, respectivamente. Los extremos de los fragmentos de
ADN amplificados de esta manera se convirtieron en extremos romos
con el kit BKL (TAKARA) para obtener los fragmentos amplificados por
PCR de extremos romos.
De forma independiente, el vector pBI (Clontech),
al que se había unido un gen de resistencia a la higromicina, se
cortó con XbaI y SacI para eliminar el gen de la
\beta-glucuronidasa, y los extremos del vector
linear obtenidos de esta manera se convirtieron en extremos
romos.
El vector lineal de extremos romos se ligó con
los fragmentos de extremos romos amplificados por PCR para obtener
vectores recombinantes con el kit Ligation (TAKARA) y después el
vector que llevaba el gen de la N-metil transferasa
deseado que se había insertado en dirección inversa a la
localización del operador en el lado 3' del promotor CaMV35S en el
vector pBI se seleccionó de los productos de reacción mediante
secuenciación. Por tanto, se obtuvo el vector recombinante deseado,
que tenía insertado el gen antisentido de la N-metil
transferasa, y se usó la siguiente transformación:
Se han publicado muchos artículos respecto de los
procedimientos convencionales de síntesis biológica de cafeína
usando cultivos tisulares de café, tales como Plants, 108, 339
(1972), Plant Cell Reports, 2, 109 (1983). Se indujo la formación de
un callo de café a partir de un ápice de brote de café o de una hoja
joven según los procedimientos convencionales. El vector
recombinante se introdujo en el callo obtenido de esta manera
mediante el procedimiento de disparo de partículas. Por otro lado,
se prepararon protoplastos del callo mediante procedimientos
convencionales y el vector recombinante se introdujo en los
protoplastos por electroporación. Después de la introducción, se
seleccionaron las células con la resistencia marcador. Las células
seleccionadas de esta manera se cultivaron en condiciones de luz y
la actividad enzimática de las células transformadas se midió según
el procedimiento descrito en el Ejemplo 9. Como resultado, se
descubrió que la producción de cafeína por las células transformadas
en las se había introducido el gen antisentido de la
N-metil transferasa se había reducido
significativamente en comparación con la de las células normales en
las que no se había introducido el gen antisentido de la
N-metil transferasa.
Se llevó a cabo la rediferenciación de las
células de café transformadas para obtener una planta joven de café,
por la cual la rediferenciación se llevó a cabo mediante
procedimientos convencionales descritos en los artículos, incluidos
Z. Pflanzenphysiolo. Bd., 81, 395 (1977) y Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 8, 243 (1987). Se midió la actividad de cada una de
las enzimas en las hojas de la planta joven de café. Como resultado,
se descubrió que la producción de cafeína de la planta joven de
café, en la que se había introducido la N-metil
transferasa antisentido, estaba significativamente reducida en
comparación con la de la planta joven de café en la que no se había
introducido el gen antisentido de la N-metil
transferasa.
Las secuencias definidas por los números de SEC
ID son las siguientes:
\vskip0.333000\baselineskip
<110> MITSUI CHEMICALS, INC.
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Enzima asociada al sistema de
síntesis de cafeína codificada en un gen y su uso
\vskip0.333000\baselineskip
<150> JP 146358/1999
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
1999-05-26
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 356
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Camellia sinensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1427
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Camellia sinensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1427
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Camellia sinensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Camellia sinensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Met Asn Arg Gly Glu Xaa Glu Ser Ser Tyr
Ala Gln Asn Ser Gln}
\sac{Phe Thr Gln Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttYatgaaYM gIggIgaRg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaaagggtc agtgctgca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
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<211> 17
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaccatga ttacgcc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccggtacct ttctggggcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgcgtt aagagcttga ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgccaaacact ggaacttcag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattgaggc cacttgttgc gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcctgtcgt ctgaggttat tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
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<211> 22
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcaatggc catagctaat ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<400> 14
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgcgtt aagagcttga ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattgaggc cacttgttgc gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcctgtcgt ctgaggttat tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccatggttt acgcgca
\hfill17
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggccatgga aagaccccgg
\hfill20
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatatcact gctgtggcag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatttcat gttcaacttc t
\hfill21
Claims (20)
1. Una molécula de ADN que comprende cualquiera
de las siguientes secuencias de nucleótidos:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la N-metil transferasa, que es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias y que tiene actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; o
- (b)
- una secuencia modificada de nucleótidos obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nucleótidos en dicha secuencia nucleotídica dentro de un intervalo en el que un polipéptido codificado por dicha secuencia nucleotídica tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.
2. La molécula de ADN según la reivindicación 1,
en la que dicha secuencia de nucleótidos (a) y dicha secuencia de
nucleótidos modificada (b) puede hibridar en condiciones
estrictas.
3. La molécula de ADN según la reivindicación 1 ó
2, en la que dicha secuencia de nucleótidos (a) bien:
- i)
- consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2 de la lista de secuencias, o
- ii)
- consiste en una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar en condiciones estrictas con una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2 de la lista de secuencias, o
- iii)
- consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% o al menos 90% o al menos 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2.
4. Una molécula de ARN que comprende cualquiera
de las siguientes secuencias de nucleótidos:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica N-metil transferasa, que es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias y que tiene actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; y
- (b)
- una secuencia de nucleótidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nucleótidos en dicha secuencia nucleotídica (a) dentro de un intervalo donde un polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos tiene las actividades enzimáticas 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa.
5. Una molécula de ARN según la reivindicación 4,
en la que dicha secuencia de nucleótidos (a) y dicha secuencia de
nucleótidos (b) puede hibridar en condiciones estrictas.
6. La molécula de ARN según la reivindicación 4 ó
5, en la que dicha secuencia (a) bien:
- i)
- consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 de la lista de secuencias; o
- ii)
- consiste en una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar en condiciones estrictas con una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 de la lista de secuencias; o
- iii)
- consiste en una secuencia de nucleótidos que tienen al menos 75% o al menos 90% o al menos 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3.
7. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una
constitución para expresar dicha N-metil transferasa
codificada por la molécula de ADN en células vegetales.
8. Una célula transformada obtenida transformando
una célula huésped, tal como un microorganismo, con el vector de
expresión según la reivindicación 7.
9. Un procedimiento para producir
N-metil transferasa que comprende: cultivar las
células transformadas de la reivindicación 8, presentando de ese
modo las actividades enzimáticas.
10. Una molécula de ADN que comprende una
secuencia de nucleótidos complementaria a toda o parte de:
- i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº1 y con las actividades enzimáticas 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; o
- ii)
- una secuencia de nucleótidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de un nucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, en la que el polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos modificada tiene las actividades enzimáticas 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, opcionalmente en el que dicha secuencia de nucleótidos y dicha secuencia de nucleótidos modificada puede hibridar en condiciones estrictas; o
- iii)
- que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2,
y en la que las actividades enzimáticas de
7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1
metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa de las células
vegetales pueden inhibirse en células vegetales con dichas
actividades enzimáticas cuando dicha molécula de ADN se introduce y
expresa en dichas células
vegetales.
11. Una molécula de ARN que comprende una
secuencia de nucleótidos complementaria a toda o parte de la
secuencia de nucleótidos de:
- (i)
- un nucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 y que tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa; o
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, deleción o inserción de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, en el que el polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos modificada tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa, opcionalmente en la que dicha secuencia de nucleótidos y dicha secuencia de nucleótidos modificada puede hibridar en condiciones estrictas; o
en la que las actividades enzimáticas de
7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1
metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa de células
vegetales puede inhibirse cuando dicha molécula de ARN se introduce
y expresa en dichas células
vegetales.
12. Un vector que comprende una molécula de ADN o
una molécula de ARN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
10 y 11, y el vector es capaz de expresar N-metil
transferasa con las actividades enzimáticas de
7-metil xantina N3 metil transferasa, teobromina N1
metil transferasa y paraxantina N3 metil transferasa en células de
al menos uno de los microorganismos o plantas o tiene una función de
inhibición de la expresión de la N-metil
transferasa.
13. Un microorganismo en el que el microorganismo
se transforma con el vector según la reivindicación 12.
14. Una célula vegetal, tejido vegetal o cuerpo
de planta, en la que la célula vegetal, el tejido vegetal o el
cuerpo de planta se transforma con el vector según la reivindicación
12, que, por ejemplo, se introduce mediante infección.
15. Un procedimiento para producir un metabolito
vegetal secundario o un procedimiento para modificar una composición
de un metabolito vegetal secundario que comprende: usar la célula
vegetal, el tejido vegetal o el cuerpo de planta según la
reivindicación 14.
16. Un procedimiento para producir un metabolito
vegetal secundario que comprende: cultivar la célula vegetal o el
tejido vegetal según la reivindicación 14, y producir el crecimiento
del cuerpo de la planta.
17. Un procedimiento para modificar una
composición del metabolito vegetal secundario que comprende:
cultivar la célula vegetal o el tejido vegetal, o producir el
crecimiento del cuerpo de la planta según la reivindicación 14.
18. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que (a) el metabolito vegetal
secundario es al menos uno o más compuestos seleccionados del grupo
compuesto por 7-metil xantina, paraxantina,
teobromina y cafeína; o (b) en el que un cuerpo de planta
transformado es una planta de Camellia, un planta de Coffea, una
planta de Cola, una planta de Ilex, una planta de Neea, una planta
de Firmiana, una planta de Paullinia o un cuerpo de planta de
Therbroma.
19. Una N-metil transferasa que
tiene las actividades enzimáticas de 7-metil xantina
N3 metil transferasa, teobromina N1 metil transferasa y paraxantina
N3 metil transferasa, comprendiendo dicha N-metil
transferasa:
- (a)
- una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias; o
- (b)
- una secuencia de aminoácidos modificada obtenida llevando a cabo sustitución, inserción o deleción de aminoácidos en la secuencia aminoacídica de la SEC ID Nº 1 de la lista de secuencias, dentro de un intervalo en el que dichas actividades enzimáticas no se alteran.
20. La N-metil transferasa según
la reivindicación 19, en la que dicha secuencia de nucleótidos que
codifica dicha secuencia de aminoácidos (a) y dicha secuencia de
nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos modificada
(b) puede hibridar en condiciones estrictas.
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