ES2281932T3 - Procedimiento de produccion de acidos grasos ramificados por medio de plantas geneticamente modificadas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción de ácidos grasos ramificados, caracterizado porque dichos ácidos grasos ramificados se producen a partir de al menos una célula vegetal o a partir de semillas o a partir de una planta, comprendiendo el genoma de dicha célula vegetal o dichas semillas o dicha planta un ácido nucleico recombinante que codifica para una metil transferasa, una ciclopropano ácido graso sintasa, un metilmalonil-CoA o una malonil-CoA descarboxilasa.
Description
Procedimiento de producción de ácidos grasos
ramificados por medio de plantas genéticamente modificadas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de producción de ácidos grasos de cadena alifática no
lineal. El procedimiento de la invención se refiere más
particularmente al uso de plantas modificadas genéticamente. Los
ácidos grasos así producidos, en forma libre o no, eventualmente
modificados por medio químico o enzimático, pueden utilizarse en la
fabricación de diferentes productos industriales, especialmente de
lubricantes de tipo aceite hidráulico o aceite de motor.
Los ácidos grasos son ácidos de cadena alifática
larga generalmente comprendida entre 6 y 25 átomos de carbono. La
cadena alifática puede ser lineal o no lineal (también denominada
ramificada). Los ácidos grasos producidos de manera natural están
presentes o bien en forma libre, o bien en forma esterificada,
especialmente en forma de diglicéridos o triglicéridos. Los ácidos
grasos se utilizan generalmente en diferentes tipos de industrias,
especialmente para la preparación de bases lubricantes de origen
natural o en detergentes, adyuvantes, o incluso en la constitución
de biocarburantes. Para todas estas aplicaciones, resulta
particularmente ventajoso poder utilizar ácidos grasos de origen
natural, especialmente derivados de materia vegetal. Por tanto, se
han descrito diferentes procedimientos de producción y de
extracción de ácidos grasos a partir de plantas (especialmente de
semilla de plantas) en la técnica anterior (véase especialmente
Harrington et al, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1985, Vol.
24, página 314; el documento FR 2 722 798). Además, la solicitud WO
94/13814 se refiere a células de plantas genéticamente modificadas
por una enzima implicada en la transferencia de los ácidos grasos
libres sobre el colesterol. Sin embargo, aunque esta solicitud
permite modificar la composición de los triglicéridos, no permite
de ninguna manera alterar la estructura de la cadena alifática de
los ácidos grasos. Schmid K. (Plant Lipid Metabolism (1995,108)
menciona la síntesis de ácidos grasos cíclicos
(di-hidroesterculato) en células de tabaco
modificadas genéticamente. No obstante, este documento no describe
la producción de ácidos grasos ramificados, ni los medios
correspondientes, ni las aplicaciones industriales.
Uno de los principales inconvenientes de los
procedimientos anteriores que utilizan plantas, reside precisamente
en la poca diversidad de los ácidos grasos que pueden obtenerse. Por
tanto, las plantas producen de manera natural esencialmente ácidos
grasos de cadena alifática lineal del tipo de C6 a C24. Ahora bien,
los estudios realizados por la empresa solicitante han demostrado
que para obtener una buena base lubricante, era particularmente
ventajoso utilizar ácidos grasos de cadena alifática no lineal (o
ramificada). Por tanto, el solicitante ha demostrado que el empleo
de ácidos grasos (libres o no) de cadena alifática ramificada,
permite obtener productos de tipo lubricante que presentan una
buena estabilidad térmica, una buena resistencia a la oxidación, una
buena viscosidad, una buena biodegradabilidad así como puntos de
fusión (o puntos de fluidez) bajos.
Por tanto, existe una necesidad auténtica de
disponer de procedimientos que permitan producir eficazmente ácidos
grasos ramificados. La presente invención proporciona precisamente
una solución ventajosa a estas necesidades describiendo
procedimientos basados en la modificación genética de plantas.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un procedimiento de producción de ácidos grasos
ramificados por medio de plantas genéticamente modificadas.
Otro aspecto de la invención se refiere a
plantas genéticamente modificadas que pueden producir ácidos grasos
ramificados y a un procedimiento de preparación de tales plantas.
Otro aspecto de la invención se refiere igualmente a células de
plantas que contienen un ácido nucleico recombinante que codifica
para un producto que induce o estimula la síntesis en dicha célula
de ácidos grasos ramificados.
La presente invención se refiere igualmente al
ácido nucleico recombinante tal como se definió anteriormente y a
cualquier vector que lo contenga.
La presente invención se refiere por tanto a un
procedimiento de producción de ácidos grasos ramificados a partir
de plantas genéticamente modificadas, a plantas y células de plantas
genéticamente modificadas que producen ácidos grasos ramificados,
así como a ácidos nucleicos recombinantes y vectores que los
contienen, utilizables para este fin.
En el sentido de la invención, por ácido graso
ramificado se entiende cualquier ácido graso que tiene una cadena
alifática ramificada auténtica. Tal como se entiende a partir del
texto de la presente solicitud, el término "ramificado" se
refiere en el sentido de la invención a ácidos grasos que tienen una
o varias sustituciones, sobre una o varias posiciones distintas de
la cadena alifática. Por tanto, simplemente la presencia de un
ciclo en la cadena alifática no es suficiente para calificar a un
ácido graso de ramificado según la invención. Se trata
preferiblemente de un ácido graso que tiene una cadena alifática de
C6 a C24, incluso más preferiblemente de C12 a C24. Ejemplos de
tales ácidos, esencialmente en forma saturada y todavía no
ramificada, son especialmente el ácido cáprico (C10), láurico
(C12), mirístico (C14), palmítico (C16), esteárico (C18),
eicosanoico (C20), docosanoico (C22), tetracosanoico (C24) y
mezclas de los mismos. La cadena alifática de los ácidos grasos
ramificados de la invención puede estar ramificada en una o varias
posiciones por grupos diferentes. Ventajosamente, la cadena
alifática comprende de una a cuatro ramificaciones localizadas en la
parte central de la cadena alifática y/o en su parte terminal
opuesta a la función ácida. Más preferiblemente, la o las
ramificación/ramificaciones está(n) localizada(s) en uno o
varios carbonos comprendidos entre las posiciones 8 y 15 de la
cadena alifática. Además, el grupo ramificado puede ser cualquier
grupo alquilo, preferiblemente un alquilo de C1 a C5, incluso más
preferiblemente un metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,
terc-butilo. Un grupo ramificado particularmente
preferido es un grupo metilo. Ácidos grasos ramificados particulares
en el sentido de la invención son, por ejemplo, el ácido
9-metiloctadecanoico; el ácido
-10metiloctadecanoico; el ácido
9,12-dimetiloctadecanoico; el ácido
10,12-dimetiloctadecanoico; el ácido
9,13-dimetiloctadecanoico; el ácido
10,13-dimetiloctadecanoico; el ácido
9,12-dimetiloleico; el ácido
10,12-dimetiloleico; el ácido
9,13-dimetiloleico; el ácido
10,13-dimetiloleico o incluso el ácido
2,4,6,8-tetrametildecanoico.
Además, los ácidos grasos ramificados según la
invención pueden ser ácidos grasos ramificados en forma libre o en
forma de derivados. Puede tratarse especialmente de ésteres de ácido
graso ramificado, tales como monoésteres, diésteres o triésteres
del glicerol (triglicérido). En el caso de di- o triglicéridos,
además no es necesario que la totalidad de los ácidos grasos
presentes en la molécula estén ramificados. Por tanto, un
triglicérido puede comprender 1, 2 ó 3 ácidos grasos ramificados.
No obstante, es preferible que la proporción de ácidos grasos
ramificados en los ésteres u otros derivados sea elevada.
Un primer objeto de la invención se refiere más
particularmente a un procedimiento de producción de ácidos grasos
ramificados, caracterizado porque dichos ácidos grasos ramificados
se producen a partir de al menos una célula vegetal o de un
material vegetal o de una planta que comprende al menos una célula
vegetal, comprendiendo dicha célula vegetal en su genoma un ácido
nucleico recombinante que codifica para un producto que induce o
estimula la síntesis de ácido(s) graso(s)
ramificado(s).
En el sentido de la invención, se denomina
"ácido nucleico recombinante" a cualquier ácido ribonucleico o
desoxirribonucleico construido mediante técnicas de ingeniería
genética. Puede tratarse particularmente de un ADN complementario,
de un ADN genómico o de un ARN mensajero. Un ácido nucleico de este
tipo puede ser además de diversos orígenes, especialmente
bacteriano, viral, vegetal, de mamíferos, sintético o semisintético.
Un ácido nucleico recombinante puede prepararse utilizando técnicas
conocidas por el experto en la técnica, y especialmente mediante
cribado de bancos de ácidos nucleicos con sondas apropiadas,
mediante síntesis química (utilizando sintetizadores de ácidos
nucleicos), mediante digestiones/ligaciones enzimáticas, etc., o
cualquier combinación de estos métodos.
La presente invención puede ponerse en práctica
con diferentes tipos de plantas, preferiblemente plantas cultivables
en campos. Se trata ventajosamente de una planta oleaginosa, tal
como por ejemplo la colza, el girasol, el cacahuete, la soja, el
lino (oleaginoso) o incluso el maíz. Igualmente puede tratarse de
una planta de tipo tabaco.
Las células de plantas según la invención pueden
ser cualquier célula de plantas tales como se definieron
anteriormente en el presente documento. Puede tratarse más
preferiblemente de una célula de planta cultivable, y que puede
regenerar una planta. El término "material vegetal" designa
cualquier parte de una planta tal como se definió anteriormente en
el presente documento, que comprende al menos una célula. Puede
tratarse de cualquier tejido de dicha planta, tal como
especialmente semillas.
Por tanto, la célula o planta según la invención
está genéticamente modificada, de manera que comprende en su genoma
en forma libre o integrada, un ácido nucleico recombinante que
codifica para un producto que induce o estimula la síntesis de
ácido graso ramificado. Las plantas y células de plantas de la
invención comprenden por tanto ácidos grasos de los que una
fracción está constituida por ácidos grasos ramificados. Según las
aplicaciones previstas, puede resultar ventajoso que esta fracción
represente una proporción sustancial de los ácidos grasos totales.
Ventajosamente, el ácido nucleico recombinante está presente en la
célula en forma integrada al genoma de dicha célula, de manera que
es más estable de manera segregacional.
Se denomina un producto como que induce la
síntesis de ácido graso ramificado cuando permite a la célula de
planta que lo contiene realizar una síntesis que no habría podido
realizar en su ausencia. Se habla de un producto que estimula la
síntesis de ácido graso ramificado, cuando se trata de un producto
que permite a la célula de planta que lo contiene favorecer una vía
de síntesis preexistente en dicha célula pero nada o poco explotada
por la misma, por ejemplo, por motivos de estequiometría o de
especificidad de sustrato. El ácido nucleico recombinante utilizado
en la presente invención puede codificar más particularmente, para
un producto que puede inducir una ramificación de los ácidos grasos
producidos por la célula tras la síntesis o para un producto que
permite realizar una ramificación concomitante a dicha síntesis.
Además, estos dos enfoques pueden combinarse.
Los ácidos grasos se sintetizan por las células
de plantas en el cloroplasto. Esta síntesis comprende varios ciclos
repetitivos en el transcurso de los cuales se añaden unidades
carbonadas sucesivamente entre sí para generar la cadena alifática
grasa. Tras su síntesis, estos ácidos grasos lineales se exportan
hacia el citoplasma en el que experimentan diferentes
modificaciones tras la síntesis (o tras la elongación) y
especialmente desaturación por enzimas denominadas desaturasas.
En un primer modo de realización, el ácido
nucleico recombinante codifica para un producto que permite inducir
o estimular la ramificación tras la síntesis de los ácidos grasos
producidos por dicha célula de planta. Más particularmente, según
este primer modo de realización de la invención, el ácido nucleico
recombinante codifica para una enzima, por ejemplo, una metil
transferasa o una ciclopropano ácido graso sintasa, que permite la
transferencia de uno o varios grupos alquilo sobre el o los
doble(s) enlace(s) de los ácidos grasos
insaturados.
Los grupos alquilo transferidos pueden ser, tal
como se indicó anteriormente en el presente documento, cualquier
grupo alquilo que comprende de 1 a 5 átomos de carbono
preferiblemente. Se trata ventajosamente de grupos alquilo que
comprenden de 1 a 3 átomos de carbono y especialmente del grupo
metilo, etilo, propilo o isopropilo.
Ventajosamente, el ácido nucleico recombinante
codifica para una enzima heteróloga, es decir, una enzima procedente
de un organismo distinto a una célula de planta. Más
particularmente, la enzima utilizada procede ventajosamente de un
microorganismo procariota o eucariota tal como, por ejemplo, una
bacteria o una levadura.
Pueden mencionarse, a título ilustrativo de los
ácidos nucleicos recombinantes según la invención, un ácido
nucleico recombinante que codifica para la ciclopropano ácido graso
sintasa, denominada CFAS. El ácido nucleico puede igualmente
codificar para metil transferasa tal como, por ejemplo,
SAM-metil transferasa, es decir, enzimas que pueden
catalizar la transferencia de un grupo metilo desde la SAM
(S-adenosil-metionina) hacia un
ácido graso insaturado o más generalmente hacia un doble enlace de
una cadena alifática. Un ácido nucleico recombinante particular en
el sentido de la invención codifica, por ejemplo, para la
ciclopropano ácido graso sintasa tal como se describe por Wang
et al (Biochemistry 31(1992) 11020) o para cualquier
enzima análoga a ésta última. En el sentido de la presente
invención, se entiende por el término "análogo" cualquier
enzima que tiene una o varias modificaciones estructurales con
respecto a la enzima descrita anteriormente en el presente
documento y que conserva una actividad de transferencia de grupo
alquilo sobre los dobles enlaces de la cadena alifática. Estas
modificaciones estructurales pueden ser mutaciones, deleciones,
substituciones o adiciones de uno o varios aminoácidos. El término
"análogo" comprende igualmente las secuencias homólogas
obtenidas a partir de otros organismos. Otro "análogo" es una
enzima producida por un ácido nucleico que se hibrida con toda o
parte de la secuencia de la transferasa o la sintasa y que conserva
una actividad de igual naturaleza. La hibridación se realiza
ventajosamente en condiciones de rigurosidad normal, o más
preferiblemente fuerte. Condiciones de hibridación rigurosa son por
ejemplo: hibridación a 42ºC, formamida al 50%, 5 X SSC, 1 X
Denhardt; lavado a 65ºC en 0,1 X SSC, SDS al 0,1%. Condiciones de
hibridación no rigurosas son por ejemplo: hibridación a 37ºC,
formamida al 40%, 5 X SSC, 1 X Denhardt; lavado a 50ºC en 1 X SSC,
SDS al 0,1%. Las condiciones rigurosas están particularmente
adaptadas cuando el ácido nucleico de prueba está presente en poca
cantidad y/o en forma poco purificada. Las condiciones no rigurosas
están más adaptadas cuando el ácido nucleico de prueba está
presente en cantidades más importantes y se encuentra en forma
significativamente representada en la muestra. Otras condiciones de
hibridación se conocen bien por el experto en la técnica (véase
especialmente Maniatis et al). Otro ejemplo particular de
ácidos nucleicos recombinantes según la invención es un ácido
nucleico recombinante que codifica para la
metil-transferasa responsable de la síntesis del
ácido
9-metil-10-hexadecenoico
en Corynebacterium spp. (Niepel et al., J. Bact. 180
(1998) 4650) o en una variedad de algas (Carballeira et al.,
Lipids 32 (1997) 1271).
Además, este modo de realización que consiste en
transferir un grupo alquilo sobre una cadena alifática recurre a
grupos alquilo o donadores de alquilo presentes en dicha célula. Con
respecto a esto, para la transferencia de un grupo metilo, las
reservas de la célula están principalmente constituidas por el grupo
SAM. Además, con el objetivo de mejorar aún la eficacia de esta
reacción, y por tanto el rendimiento en ácidos grasos ramificados,
un modo de realización particular consiste en introducir en la
célula de planta, además del ácido nucleico que codifica para el
producto definido anteriormente en el presente documento, un segundo
ácido nucleico que codifica para una enzima implicada en la
síntesis del dador de alquilo. Preferiblemente, se trata un ácido
nucleico que codifica para una enzima de síntesis de SAM. Aún más
preferiblemente, se trata de un ácido nucleico que codifica para la
SAM sintetasa o un análogo de la misma. Este ácido nucleico puede
introducirse por medio de un segundo ácido nucleico recombinante,
de manera simultánea al primero o de manera secuencial. Según otro
modo de puesta en práctica, los ácidos nucleicos que codifican para
las dos enzimas están en el mismo ácido nucleico recombinante.
Según un segundo modo de realización de la
presente invención, el ácido nucleico recombinante contenido en la
célula de planta codifica para un producto que permite inducir o
estimular la incorporación en la cadena alifática de ácido graso en
curso de elongación, de grupos que generan una o varias
ramificaciones. Según este segundo enfoque, no se trata ya de
realizar una modificación tras la síntesis en los ácidos grasos
producidos, sino de realizar una ramificación de manera
concomitante a dicha síntesis.
Este modo de realización se obtiene
preferiblemente forzando la célula de planta a utilizar, como
sustrato para la síntesis de la cadena alifática, un grupo
acil-CoA que comprende un número de átomos de
carbono superior a 3, preferiblemente entre 4 y 8 en lugar de
malonil-CoA. Ventajosamente, el sustrato utilizado
es un grupo acil-CoA no lineal. Aún más
preferiblemente, se trata de un grupo acil-CoA no
lineal que permite la incorporación en la cadena alifática en curso
de elongación de un grupo con un número impar de átomos de carbono.
Esta estrategia permite por ejemplo obtener ácidos grasos
ramificados denominados de múltiples ramas, tales como, por ejemplo,
el ácido 2,4,6,8-tetrametildecanoico. Un ejemplo
particular de sustrato de tipo acil-CoA es por
ejemplo el metilmalonil-CoA. El
metilmalonil-CoA es un grupo no lineal, que
comprende 4 átomos de carbono, de los cuales tres sirven para la
elongación. En este caso, con el objetivo de forzar a la planta a
utilizar este sustrato para la síntesis de la cadena alifática,
resulta particularmente ventajoso introducir en la célula de la
planta un ácido nucleico recombinante que codifica para una
malonil-CoA descarboxilasa (E.C. Nº 4.1.1.9). El
modo de acción de esta enzima, así como de manera más general la
vía de síntesis de los ácidos grasos ramificados por las células
modificadas según esta estrategia, se representa en la figure 1. Se
entiende que en la presente invención puede utilizarse cualquier
otra enzima análoga a la mencionada anteriormente en el presente
documento que pueda forzar a la planta a utilizar un
acil-CoA que comprende más de 3 átomos de carbono,
preferiblemente de 4 a 8, como sustrato en la síntesis de las
cadenas alifáticas de los ácidos grasos. A título de ejemplo
particular de tales enzimas, puede mencionarse especialmente la
malonil-CoA descarboxilasa cuya secuencia
nucleotídica se ha descrito en la bibliografía (véanse los
ejemplos), así como cualquier análogo de la misma.
Este segundo modo de realización puede obtenerse
igualmente modificando la especificidad de las enzimas implicadas
en la síntesis de la cadena alifática grasa, especialmente
modificando la especificidad de la enzima que impide la
transferencia de malonil-CoA sobre el
malonil-ACP, y en particular la especificidad de
toda o parte de la ácido graso sintasa, de la
acetil-CoA carboxilasa o de la
acetil-CoA transacilasa. Con respecto a esto, la
ácido graso sintasa está constituida por un complejo multienzimático
y la modificación de su especificidad puede obtenerse mediante
modificación de una, varias, o incluso todas las subunidades.
Además, tal como se indicó anteriormente en el
presente documento, estos dos modos de realización pueden combinarse
para generar células de plantas que pueden sintetizar ácidos grasos
de cadena alifática ramificada tanto en la etapa de la elongación
como tras la elongación.
Para la puesta en práctica de la presente
invención, el ácido nucleico recombinante comprende ventajosamente
regiones reguladoras, de tipo promotor, funcionales en las células
de plantas y que permiten controlar la expresión de los ácidos
nucleicos definidos anteriormente en el presente documento. Entre
las regiones reguladoras de la transcripción utilizables en las
plantas y en la puesta en práctica de la presente invención, pueden
mencionarse, por ejemplo, las regiones asociadas al virus del
mosaico de la coliflor (35S, 19S) o las regiones promotoras de
genes estructurales tales como los genes de la nopalina sintasa
(nos) o la octopina sintasa (ocp) o la manopina, la agropina o la
proteína portadora de acilo (ACP). La estructura y la clonación de
estas regiones diferentes se han descrito en la bibliografía. De
manera más general, cualquier promotor que permita una expresión
constitutiva, espacial o temporal de un ácido nucleico en una célula
de planta puede utilizarse para la puesta en práctica de la
presente invención. Con respecto a esto, es especialmente posible
utilizar promotores que permiten una expresión localizada en
ciertos tejidos o partes de la planta (semilla, polen, etc.), o
promotores cuya actividad depende del estado de desarrollo de la
planta (elongación, floración, etc.). Como promotor que tiene una
expresión mayoritaria en las semillas puede mencionarse, por
ejemplo, el promotor de la ACP, de la napina o los promotores
descritos por Krebbers et al. (Plant Physiol. 87 (1988) 859).
El empleo de tales promotores puede evitar cualquier posible efecto
secundario inducido por una producción masiva y generalizada de
ácidos grasos ramificados en la planta, e igualmente facilitar la
recuperación de los ácidos grasos así producidos, concentrándolos
en ciertas regiones de la planta.
Además, resulta igualmente ventajoso introducir
en los ácidos nucleicos recombinantes según la invención,
secuencias terminadoras localizadas en 3' que pueden derivarse o
bien directamente del gen utilizado o bien proceder de regiones de
otros genes, tales como especialmente los de la nopalina sintasa
(nos) o incluso de la octopina sintasa (ocp) de la manopina, de la
agropina o de la ACP.
Por tanto, el ácido nucleico recombinante que
comprende ventajosamente una región reguladora de la transcripción,
un gen o una región que codifica para un principio activo tal como
se definió anteriormente en el presente documento, y regiones
terminadoras en 3', se introduce ventajosamente en un vector
plasmídico de clonación o de expresión.
Con respecto a esto, otro objeto de la invención
se refiere más particularmente a un ácido nucleico recombinante que
comprende:
- un ácido nucleico que codifica para un
producto tal como se definió anteriormente en el presente
documento,
- un promotor que controla la expresión de dicho
ácido nucleico, y que puede provocar una expresión de este ácido
nucleico localizada en ciertos tejidos vegetales o ciertas partes
vegetales, y,
- una región en 3' de terminación de la
transcripción.
Más particularmente, el promotor comprendido en
las construcciones genéticas de la invención es un promotor que
puede provocar una expresión del ácido nucleico localizada en la
semilla de la planta. El término "expresión localizada"
significa que la expresión es especialmente más importante en el
tejido afectado que en los otros tejidos vegetales. Sin embargo, se
entiende que no se requiere una especificidad absoluta de la
expresión, ya que se observa una expresión significativa en los
tejidos investigados. El carácter localizado de la expresión según
la invención es doblemente ventajoso ya que facilita por una parte
la recuperación de los ácidos grasos ramificados y porque limita
los riesgos de toxicidad (especialmente sobre el buen crecimiento y
la reproducción) de los productos expresados en las plantas
modificadas.
Los ácidos nucleicos recombinantes de la
invención pueden comprender además señales de direccionamiento, que
permiten mejorar el direccionamiento de las proteínas sintetizadas
hacia los compartimientos celulares en los que ejercen su
actividad. Cuando el producto sintetizado es un producto implicado
en la transferencia de grupos alquilo sobre cadenas grasas tras la
elongación, la proteína ejerce su actividad en el citoplasma y por
tanto no necesita señales de direccionamiento particulares. Cuando
el producto interviene sobre la propia síntesis de las cadenas
grasas, ejerce su actividad en el seno de los cloroplastos y puede
ser ventajoso utilizar una señal que permite el direccionamiento de
este producto hacia el cloroplasto. Tales señales se conocen en la
técnica anterior.
Otro objeto de la invención se refiere a un
ácido nucleico recombinante que comprende:
- un ácido nucleico que codifica para una
metil-transferasa que puede catalizar la
transferencia de un grupo metilo hacia la cadena alifática de un
ácido graso insaturado,
- un promotor funcional en las células vegetales
que controla la expresión de dicho ácido nucleico, y,
- una región en 3' de terminación de la
transcripción.
En otro modo de realización particular, la
invención tiene por objeto un ácido nucleico recombinante que
comprende:
- un ácido nucleico que codifica para una
malonil-CoA descarboxilasa,
- un promotor funcional en las células vegetales
que controla la expresión de dicho ácido nucleico, y,
- una región en 3' de terminación de la
transcripción.
Otro objeto de la presente invención se refiere
igualmente a un vector que comprende un ácido nucleico recombinante
tal como se definió anteriormente en el presente documento. Un
vector de este tipo puede derivarse especialmente del vector Ti.
Los vectores de la invención pueden utilizarse para producir
cantidades importantes de ácidos nucleicos recombinantes en las
células, o para producir las enzimas correspondientes, o para
transformar células vegetales.
La presente invención se refiere igualmente a
cualquier célula de planta que comprende un ácido nucleico
recombinante o un vector tal como se definieron anteriormente en el
presente documento.
Los ácidos nucleicos recombinantes o vectores de
la invención pueden introducirse en las plantas mediante cualquier
técnica conocida por el experto en la técnica, y especialmente
mediante técnicas químicas, físicas o biológicas. Las técnicas
químicas implican, por ejemplo, el empleo de agentes transfectantes
que facilitan la penetración celular. Las técnicas físicas son, por
ejemplo, la electroporación, el bombardeo, las "pistolas
génicas" ("gene guns"), etc. Una técnica biológica bien
conocida y particularmente eficaz consiste en utilizar
infiltraciones a vacío o co-cultivos, vectores
virales o, preferiblemente, Agrobacterium tumefaciens, que
permiten introducir material genético en las células de plantas por
medio del plásmido Ti. Estas técnicas se conocen bien por el
experto en la técnica. Tras la transformación, se seleccionan las
células de plantas que realmente contienen el ácido nucleico según
la invención. Estas células pueden mantenerse entonces en cultivo,
eventualmente multiplicarse en cultivo, y utilizarse directamente
para la producción de ácidos grasos ramificados (cultivos
discontinuos ("batch"), semi-continuos ("fed
batch"), etc.). Estas células pueden almacenarse igualmente con
vistas a un uso posterior. Estas células pueden utilizarse
igualmente para regenerar plantas transgénicas, según las técnicas
clásicas de la biología vegetal.
Otro objeto de la invención se refiere por tanto
a un procedimiento de preparación de una planta transgénica que
puede producir ácidos grasos ramificados, que comprende la
introducción de un ácido nucleico recombinante tal como se definió
anteriormente en el presente documento en una célula o parte de
planta y la regeneración, a partir de estas células o partes de
plantas, de una planta transgénica. Ventajosamente, la introducción
se realiza utilizando agrobacterias. En un modo particular, la
introducción se realiza sobre células de plantas o discos foliares.
La regeneración se realiza mediante cualquier técnica conocida por
el experto en la técnica.
Otro objeto de la invención se refiere a una
planta transgénica cuyas células contienen un ácido nucleico
recombinante tal como se definió anteriormente y que codifica para
las enzimas que permiten inducir o estimular la ramificación tras
la síntesis de los ácidos grasos producidos por dicha célula de
planta, o secuencias que permiten inducir o estimular la
incorporación, en la cadena alifática de ácido graso en curso de
elongación, de grupos ramificados.
Las plantas transgénicas de la invención
contienen el ácido nucleico recombinante integrado de manera estable
en su genoma, tanto en el de las células germinales como el de las
células somáticas.
La invención se refiere igualmente a cualquier
material vegetal procedente de una planta de este tipo, y
especialmente las semillas.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de producción de ácidos grasos ramificados mediante
cultivo de una célula tal como se definió anteriormente en el
presente documento y recuperación de los ácidos grasos
producidos.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de producción de ácidos grasos ramificados mediante
cultivo celular de una célula de planta que comprende:
- el cultivo de estas células en un medio
apropiado para su crecimiento,
- la extracción y la purificación de los ácidos
grasos ramificados a partir de la biomasa celular, y especialmente
a partir de estas células o del sobrenadante de dicho cultivo.
\newpage
La invención se refiere además a un
procedimiento de preparación de ácidos grasos ramificados mediante
extracción a partir de una planta transgénica cuyas células
contienen un ácido nucleico recombinante tal como se definió
anteriormente en el presente documento, según el cual dichos ácidos
grasos se recuperan a partir de cualquier parte de dicha planta, y
especialmente de las semillas de dicha planta.
La invención se refiere a un procedimiento de
preparación de ácidos grasos ramificados a partir de una planta
transgénica cuyas células contienen un ácido nucleico recombinante
que comprende:
- el cultivo en campos de dichas plantas
transgénicas;
- la recuperación de las semillas de dichas
plantas;
- la extracción de los ácidos grasos a partir de
estas semillas.
El procedimiento de la invención está
particularmente adaptado a la producción de ácidos grasos metilados
no cíclicos, especialmente de ácidos grasos en C16 o C18 que tienen
uno o varios grupos metilo. A título de ejemplos preferidos, pueden
mencionarse los ácidos
metil-9-octadecanoico,
metil-10-octadecanoico,
metil-9-hexadecanoico y
metil-10-hexadecanoico.
En los procedimientos de producción de ácidos
grasos ramificados tal como se definieron anteriormente en el
presente documento, puede realizarse una etapa facultativa de
tratamiento de los ácidos grasos, con el fin de mejorar aún más las
propiedades fisicoquímicas de estos compuestos. Por tanto, los
procedimientos de la invención comprenden especialmente:
- una etapa de extracción de los ácidos grasos
ramificados a partir de las células, semillas o plantas, y,
- una etapa de tratamiento de los ácidos grasos
para mejorar sus propiedades fisicoquímicas.
La extracción puede realizarse mediante métodos
clásicos conocidos por el experto en la técnica mencionados
anteriormente en el presente documento.
Más preferiblemente, la etapa de tratamiento es
una etapa de hidrogenación, realizada en condiciones habituales o
fuertes, que conduce a la formación de ácidos grasos ramificados
saturados. Más específicamente, la hidrogenación puede realizarse
en las condiciones descritas por Christie W. W. (Topics in Lipid
Chemistry, 1970, Vol. 1, FD Gunstone, ed. Londres: Logus Press),
incorporada al presente documento como referencia, dado el caso en
presencia de un catalizador de paladio.
La invención se refiere más generalmente al uso
de una planta transgénica regenerada a partir de una célula tal
como se definió anteriormente en el presente documento, para la
producción de ácidos grasos ramificados.
La invención se refiere igualmente al uso de una
planta o parte de una planta transgénica en la que al menos algunas
de las células comprenden un ácido nucleico recombinante tal como se
definió anteriormente en el presente documento, para la producción
de ácidos grasos ramificados.
Los inventores han demostrado especialmente que
los ésteres de ácidos grasos ramificados tal como se definen en la
invención tenían una buena resistencia a la oxidación y puntos de
fluidez bajos, y tenían por tanto propiedades ventajosas para su
uso como lubricantes.
Los ésteres de ácidos grasos ramificados tal
como se definieron anteriormente en el presente documento pueden
utilizarse como lubricantes, especialmente para la preparación de
composiciones de aceite, en particular de aceite de motor y de
aceite hidráulico, especialmente en la sustitución de bases no
convencionales o sintéticas (tales como ésteres, polialfaolefinas,
etc.).
Una composición lubricante puede comprender
ácidos grasos ramificados tal como se describieron anteriormente en
el presente documento, y uno o varios aditivos, tales como
especialmente agentes antidesgaste, modificadores de la presión,
tensioactivos, etc.
La presente solicitud se describirá más en
detalle con ayuda de los ejemplos siguientes, que deben considerarse
como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: esquema de la síntesis de los ácidos
grasos en el cloroplasto de las células de planta.
Figura 2: representación de un ácido nucleico
recombinante que comprende un gen que codifica para una transferasa
bajo el control del promotor CaMV 35S (figura 2A) o nos (figura
2B).
\newpage
Figura 3: representación de un ácido nucleico
recombinante que comprende un gen que codifica para la SAM
sintasa.
Figura 4: mapa de restricción del gen cfa.
Figura 5: representación de un casete de
regulación de un gen que puede estimular la producción de ácidos
grasos ramificados.
Figura 6: esquema de construcción del casete de
regulación del gen cfa.
Figura 7: construcción del vector pTDEcfa.
Figura 8: transformación de los discos foliares
y regeneración de las plantas. A: co-cultivo de
agrobacterias-discos foliares; B: 2ª semana de
cultivo; C: 5ª semana de cultivo; D: arraigo de brotes; E: plántula
a partir de esquejes in vitro.
Figura 9: representación de un ácido nucleico
recombinante que comprende un gen que codifica para la
malonil-CoA descarboxilasa.
Este ejemplo ilustra la construcción de plantas
genéticamente modificadas que pueden producir ácidos grasos
ramificados mediante alquilación tras la elongación, más
particularmente mediante metilación tras la elongación.
Particularmente, este ejemplo describe la inserción mediante
ingeniería genética en el genoma de la planta de un gen o de un
conjunto de genes que codifican para:
\bullet por una parte, una o varias
transferasas, por ejemplo, metilasas o metiltransferasas (del tipo
ciclopropano ácido graso sintasa, es decir CFA sintasa, por
ejemplo) que pueden catalizar la adición de grupos metilo (u otros
alquilos: etilo, propilo, isopropilo...) sobre los dobles enlaces de
ácidos grasos insaturados; y,
\bullet por otra parte, de uno o varios genes
que permiten aumentar el conjunto de grupos dadores de metilo
(S-adenosil-metionina, es decir,
SAM), especialmente del gen que codifica para la
S-adenosil-metionina sintetasa (SAM
sintetasa).
La construcción de estas plantas transgénicas
según la invención se realiza según las etapas siguientes.
Etapa
1
Las plantas modelo de tabaco de tipo SR1 (Horsch
et al., 1985 Science, 22, 1229-1231) o BY2
(Nagata et al., 1992 Int. Rev. Of Cytol., 132,
1-30) se utilizan, en primer lugar, para realizar
los experimentos. De hecho, estos dos especies modelo pueden
transformarse fácilmente mediante Agrobacterium tumefaciens
(Van Lijsebettens et al., 1986, J. Mol. Biol.,
188,129-145; Shaul et al. 1986; Shaul et
al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,
4868-4872) y permiten la regeneración de plantas
nuevas. Por supuesto todas las plantas oleaginosas tales como
colza, girasol, cacahuete, soja, maíz, etc. pueden utilizarse de la
misma manera.
Etapa
2
La transformación genética consiste en la
introducción de un ácido nucleico recombinante que comprende un
casete de expresión que comprende el gen a transferir, el promotor
de expresión de este gen que podrá permitir una expresión
constitutiva, espacial o temporal, y una región en 3' de terminación
de la transcripción. A continuación se describen los diferentes
elementos genéticos utilizados y la construcción de los ácidos
nucleicos recombinantes correspondientes (figuras 2 y 3).
En este ejemplo se utilizan ácidos nucleicos que
codifican para metilasas o metiltransferasa que proceden de
organismos procariotas o eucariotas y cuyas secuencias codificantes
son análogas a la secuencia codificante de la ciclopropano ácido
graso sintasa descrita por Wang et al. (1992 Biochemistry,
31, 11020-11028). Más particularmente, se aísla un
ácido nucleico que codifica para la ciclopropano ácido graso sintasa
y se verifica su secuencia.
Además, para mejorar la eficacia del
procedimiento, en un modo de realización particular, puede
utilizarse un segundo ácido nucleico, que codifica para la SAM
sintetasa cuya secuencia nucleotídica está descrita por Peleman
et al. (1989 Plant Cell, 1, 81-93).
Para la construcción de los ácidos nucleicos
recombinantes, pueden utilizarse diferentes tipos de promotores, y
en particular cualquier promotor funcional en las plantas y que
permite el control de la expresión de los genes.
Con respecto a esto, pueden citarse los
promotores que permiten una expresión localizada en las semillas (o
algunos tejidos de las semillas) de plantas, tales como
especialmente el promotor del gen que codifica para la prolamina
(Zhou et al, Transgenic Res. 2 (1993) 141), el promotor del
gen que codifica para la lectina de guisantes (Pater et al.,
Plant J. 6 (1994) 133), el promotor del gen que codifica para las
LEA ("Late Embryogenesis Abundant protein") (Goupil et
al., Plant. Mol. Biol. 18 (1992) 1049), el promotor del gen que
codifica para la familia de las proteínas napina (NAP) (Boutilier
et al., Plant. Mol. Biol. 26 (1994) 1711), el promotor del
gen que codifica para la gluterina del arroz (Zhao et al.,
Plant. Mol. Biol. 25 (1994) 429), el promotor del gen que codifica
para la oleosina (Keddie et al., Plant. Mol. Biol. 19 (1992)
443), el promotor del gen que codifica para la familia S de las
proteínas de almacenaje (promotor 2S del gen napA, promotor 11S o
12S del gen de la globulina), el promotor del gen que codifica para
la beta-faseolina, la legumina, la conglutina
gamma, la concanavalina A, la desaturasa Bn10 (Plant. Physiol. 104,
1167), la alfa/béta gliandina de trigo, la catalasa CatA del arroz,
la alfa-kafirina de sorgo o además la Adh1 del maíz
(Kyozuka et al., PlantCell 6 (1994) 799) o la proteína SBP65
del guisante (Dehaye et al., Plant Mol. Biol. 65 (1997)
605).
En este ejemplo, los promotores utilizados son
el promotor 35S del virus de mosaico de la coliflor y el promotor
del gen de la nopalina sintasa (nos): La estructura de estos
promotores se ha descrito por ejemplo por Benfey y Chua (1990,
Science, 250 959-966).
En este ejemplo, les regiones de terminación de
la transcripción utilizadas proceden o bien directamente del gen
utilizado (figura 3), o bien de los genes de la nopalina sintasa
(nos) y de la octopina sintasa (ocs).
Para construir los ácidos nucleicos
recombinantes que permiten introducir los elementos mencionados
anteriormente en el presente documento en las células de plantas,
estos elementos genéticos se aíslan y se subclonan previamente en
vectores de clonación de tipo pBR322 y pUC, que llevan marcadores
que permiten la selección de los transformantes que proporcionan
una resistencia a agentes citotóxicos tales como antibióticos,
toxinas, etc. Los casetes de expresión se introducen a continuación
en vectores binarios que comprenden las secuencias necesarias para
la transformación de las plantas, en particular, el vector
ADN-T. Este vector se utiliza para la transformación
de las plantas y la estructura de los vectores que contienen las
secuencias específicas de reconocimiento (RB y LB) se ha descrito
ampliamente en la bibliografía (Libro de Hoekema, the binary Plant
Vector Systems, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985.
Molecular genetics of the Bacteria-Plant
Interaction, Puhler A. Ed., Springer-Verlag, NY,
1983. Plant Genetic Transformation and Gene expression: A Laboratory
Manual Draper J., Scott R., Armitage P., y Walden R. Eds, Blackwell
Scientific Publications, Oxford, 1988. Kahl G. y Weising K., (1993)
Genetic engineering of plant cells. En Biotechnology: Genetics
Fundamentals and genetic Engineering. Rehm H.J., Reed G., Pühler A.
y Stadler P. Eds, VCH Publishers Inc., Nueva York (USA) Vol 2, pp
547-659).
La estructura de los ácidos nucleicos
recombinantes preparados de este modo se representa en las figuras 2
y 3.
En otro ejemplo particular, el vector binario
pTDEcfa se construyó tal como sigue.
Tras la lectura de los trabajos de Wang (Wang
et al., 1992) se ha notado una ambigüedad relativa al tamaño
del fragmento ClaI presente en el plásmido pAYW19. Además, Wang
et al. (1992) presenta, en la estrategia de secuenciación,
el fragmento ClaI con un sitio único de restricción para la enzima
HindII en sentido 5' del sitio ClaI. Sin embargo, según la
secuencia publicada este sitio aparece en sentido 3' del sitio ClaI.
Por tanto en una primera etapa se ha realizado la verificación de
la integridad y la caracterización de la estructura completa del
gen cfa. A tal efecto, se ha realizado un mapa de restricción del
gen cfa presente en el plásmido pAYW19 con diferentes enzimas de
restricción. El análisis de los tamaños de los fragmentos obtenidos
tras la restricción, electroforesis en gel de agarosa y coloración
de los fragmentos con bromuro de etidio ha permitido trazar el mapa
físico de este gen, presentado en la figura 4. Estos resultados se
han confirmado por la secuenciación del fragmento en sentido 3' del
sitio HindII. La secuencia completa y corregida del gen cfa se ha
informatizado e introducido en un programa (DNAstrider) que permite
estudiar los sitios de restricción.
Este ejemplo describe la construcción del vector
binario pTDEcfa que lleva un casete de expresión del gen cfa
corregido, bordado con las regiones LB y RB del plásmido Ti. Este
vector binario permite la transferencia, mediante A.
tumefaciens, de dicho casete en el genoma de las células
vegetales.
Se construye el plásmido pBSgus mediante
clonación del fragmento EcoRI-HindIII que procede
del vector binario pTDE4 en el vector pBS (pBluescript, BRL) que
sólo contiene muy poco del sitio de restricción. El fragmento
EcoRI-HindII contiene el promotor p35S y el
terminador 3'nos. Así el vector constituido, pBSgus, contiene los
sitios únicos de restricción para las enzimas Ncol y Nrul. Estas dos
enzimas permiten aislar el gen gus conservando la integridad de las
secuencias reguladoras (p35S y 3'nos).
El principio de esta etapa reside en la
sustitución del gen gus del plásmido pBSgus por un sitio de
clonación que comprende sitios únicos. Este casete se ha creado
mediante PCR, a partir del pBSgus, y contiene el promotor p35S y el
terminador 3'nos. Se han seleccionado los cebadores necesarios para
la PCR de manera que se crea la estructura presentada en la figura
5. La elección de los dos sitios únicos de restricción está
condicionada por la necesidad que estén ausentes del p35S, del
3'nos, del vector de clonación en el que la estructura va a
integrarse y del gen cfa que va a integrarse entre las 2 secuencias
reguladoras. Tras el análisis de las diferentes secuencias, se han
identificado dos sitios posibles: Nhel y Nrul. Se ha realizado la
construcción del casete tal como sigue (figura 6):
- Clonación del casete de regulación en el pGEMT
para obtener el vector pGEM (35S-3'nos)
- Creación mediante PCR de los sitios Nhel en
sentido 5' del gen cfa y Nrul en sentido 3'
- Clonación del producto de PCR en el vector
pGEMT para obtener el vector pGEMcfa
- Secuenciación de los vectores pGEM
(35S-3'nos) y pGEMcfa.
- Clonación del fragmento
NheI-NruI que procede del vector pGEMcfa en el
vector pGEM (35S-3'nos) en el que se ha eliminado
el fragmento Nhel-Nrul. El vector obtenido mediante
esta clonación se denomina pGEM
(35S-cfa-3'nos).
- A partir del vector pGEM
(35S-cfa-3'nos) se puede aislar un
fragmento único EcoRI-HindII que comprende la
secuencia (35S-cfa-3'nos).
Tras la optimización de las condiciones de PCR
para la creación del casete de regulación (figura 6), ésta se ha
clonado en el vector pGEM-T. Por lo tanto tras el
análisis mediante restricción con diferentes enzimas el vector pGEM
(35S-3'nos) está disponible en dos clones.
Del mismo modo, se ha obtenido el vector pGEMcfa
y se han retenido dos clones.
La secuencia deseada de los vectores pGEM
(35S-3'nos) y pGEMcfa se ha informatizado y luego
introducido en el programa DNAstrider. Se han enviado dos clones
para cada vector a la sociedad Génome express para
secuenciación.
Los resultados de la secuenciación se han
obtenido para los dos clones (2 y 3) que contienen teóricamente el
vector pGEMcfa. Tras el alineamiento con la secuencia teórica, la
secuencia del vector contenido en el clon 2 presenta varias
mutaciones y por lo tanto este clon no podrá utilizarse para la
continuación del trabajo. La secuencia del vector contenido en el
clon 3 contiene una mutación, sin embargo esta mutación es una
mutación denominada "muda" porque no tendrá efecto sobre la
secuencia de la proteína CFA.
Los resultados relativos al clon 3 que contiene
el vector pGEM (35S-3'nos) no son muy alentadores
porque el vector contenido en este clon presenta varias mutaciones.
Sin embargo estas mutaciones están relativamente alejadas de las
secuencias indispensables para el buen funcionamiento del promotor
p35S y del terminador 3'nos. Además, no se ha podido secuenciar el
clon 4. Por lo tanto se ha realizado una nueva selección entre los
clones contenidos en el vector pGEM (35S-3'nos) y
se ha seleccionado el clon 10 para una análisis de su secuencia.
Así, se ha realizado la secuenciación del vector
pGEM (35S-3'nos) contenido en el clon 10. Se ha
utilizado el método de secuenciación mediante PCR con 3 cebadores
(T7, SP6 y un cebador cercano de la secuencia poli CCC). Se ha
comparado la secuencia obtenida con la secuencia teórica. Los 2
errores puestos en evidencia justo antes el sitio HinDIII parecen
errores en la secuencia teórica y no de secuenciación, puesto que se
encuentran de nuevo en las secuencias de los vectores pGEM
(35S-3'nos) contenidos en los clones 3 y 4
anteriormente secuenciados.
Partiendo de la base de los resultados de
secuencia, el fragmento Nhel-Nrul, que procede del
vector pGEMcfa contenido en el clon 3, se ha clonado en el vector
pGEM (35S-3'nos) contenido en el clon 10 al nivel de
los sitios Nhel y Nrul. Se ha designado el vector obtenido pGEM
(35s-cfa-3'nos). Entre los clones
obtenidos, se ha realizado una selección mediante el uso de varias
enzimas de restricción. Se conservó el clon 13 para la continuación
de la clonación.
El vector binario es un vector que comprende las
secuencias LB y RB del plásmido Ti, necesarias para la transferencia
de genes en las células vegetales mediante Agrobacterium
tumefaciens. El vector binario pTDEcfa se ha construido tal
como sigue (figura 7):
- Clonación del fragmento
HindIII-EcoRI que procede del vector pGEM
(35S-cfa-3'nos) 13 en el vector
binario ptde4 en el que se ha eliminado el fragmento
HindIII-EcoRI. El vector obtenido se denomina
pTDEcfa. Entre los clones obtenidos, se ha realizado una selección
mediante el uso de varias enzimas de restricción. Se conservó el
clon 8 para realizar la triparental.
- El clon que contiene el vector pTDEcfa (clon
8) se ha utilizado para preparar una cantidad de ADN que se ha
probado en un experimento de inmunotransferencia tipo Southern. En
este experimento, la sonda que revela mediante hibridación
ADN-ADN la presencia del gen cfa se ha
realizado a partir del vector inicial pAYW19. Mediante este
experimento, se ha podido comprobar mediante el uso de varias
enzimas de restricción que el gen cfa está bien integrado en
el vector binario entre las 2 secuencias reguladoras: promotor y
terminador.
El vector binario se ha transferido a
continuación en la bacteria A. tumefaciens, en las
condiciones habituales.
Etapa
3
En un primer momento, protoplastos, células
vegetales, tejidos o plantas de tabaco se transforman genéticamente
mediante los ácidos nucleicos recombinantes descritos anteriormente
en el presente documento, mediante el uso de métodos de
transferencia indirecta con la ayuda de un vector tal como las
agrobacterias (por ejemplo Agrobacterium tumefaciens:
C58C1Rif: pGV2260; Deblaere et al., 1985) o mediante el uso
de los métodos de transformación directa (electroporación,
bombardeo de partículas, infiltración a vacío, etc., (Kahl y
Weising, 1993).
En el caso del uso de transferencia de gen
indirecto, las agrobacterias contienen un plásmido que posee las
regiones vir (plásmido Ti desarmado) necesarias para la
transferencia del ADN-T en las células
vegetales.
En una primera etapa facultativa, se transforman
las células mediante un ácido nucleico recombinante (figura 3) que
codifica para la SAM sintetasa. Luego se seleccionan los
transformantes que poseen un potencial elevado de metilación.
Estas líneas, o células aún no transformadas, se
transforman genéticamente a continuación con la perspectiva de
incluir en su genoma un ácido nucleico recombinante que contiene el
gen que codifica para la CFA sintasa descrita anteriormente en el
presente documento.
El protocolo utilizado para realizar estas
transformaciones se ha descrito por Van Lijsebettens et al.
(1986 J. Mol. Biol., 188, 129-145) o catalogado en
la bibliografía (Plant Genetic Transformation and Gene Expression:
A Laboratory Manual. Draper J., Scott R., Amritage P., y Walden R.
Eds, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Kahl G. Y
Weiding K. (1993) Genetic engineering of plant cells. En
Biotechnology: Genetics Fundamentals and genetic Engineering. Rehm
H.J., Reed G., Pühler A. y Stadler P. Eds, VCH Publishers Inc.,
Nueva York (USA) Vol. 2, págs. 547-659).
En un ejemplo particular, se han utilizado las
células no diferenciadas de tabaco variedad BY2 para la
transformación genética. Estas células se cultivan in vitro
en medio nutritivo líquido. Cada 10 días, se toman 10 ml de células
para inocular 100 ml del medio en un erlenmeyer de 500 ml. El
erlenmeyer se coloca sobre un agitador orbital a la velocidad de
140 rpm, en la oscuridad y a 24ºC. Se ha realizado la transformación
en células de 3 días de edad. Se toman 2 ml de células y se
inoculan con 100 \mul de un cultivo de agrobacterias
transformantes de 24 h de edad. La densidad óptica a \lambda=600
nm del cultivo de agrobacterias utilizadas se ajusta a 1,5
unidades. El co-cultivo de agrobacterias/células
vegetales se realiza en pequeñas placas de petri durante 2 días a
24ºC y en la oscuridad. Tras el co-cultivo, las
células vegetales se aclaran abundantemente con medio nutritivo
para eliminar el máximo de agrobacterias. A continuación, las
células vegetales se ponen en cultivo en un medio sólido
(gelificado). Este medio comprende cefotaxima que permite eliminar
el resto de las agrobacterias. Contiene igualmente kanamicina que
permite seleccionar las células vegetales que han incluido en su
genoma el fragmento LB-RB del vector binario y que
expresan el gen que proporciona resistencia a la kanamicina.
Después de 2 a 3 semanas de cultivo se han
desarrollado las células vegetales resistentes a la kanamicina. En
esta fase se puede tomar una cantidad de biomasa suficiente para
ponerla en cultivo en medio líquido para acelerar la producción de
biomasa, conservando la presión de selección
(kanamicina-cefotaxima). Tras varios ciclos de
cultivo y para una parte de la biomasa, se ha eliminado la presión
de selección en el medio de cultivo para poder comparar los
perfiles lipídicos de esta suspensión con aquellos obtenidos a
partir de células de control cultivadas en las mismas condiciones,
sin presión de selección.
\newpage
Mediante este método, se ha conseguido por lo
tanto obtener una suspensión celular resistente a la kanamicina. La
presencia del gen que codifica para la CFA en el material genético
de esta suspensión se ha confirmado igualmente. Por eso, se han
realizado extracciones de ADN (Dellaporta et al. Plant Mol.
Biol. Rep. 1 (1983) 19) y se ha llevado a cabo una prueba PCR que
utiliza cebadores específicos del gen cfa. El resultado
positivo de la PCR muestra la presencia de una banda de tamaño
previsto que corresponde al gen cfa.
En otro ejemplo particular, se han preparado
discos foliares de 0,5 cm de diámetro a partir de tabaco variedad
SR1 cultivado in vitro y transformado. En resumen, se han
cultivado los discos 24 en un medio sólido (gelificado) de
desdiferenciación celular. A continuación se han inoculado mediante
inmersión en un cultivo de agrobacterias transformantes de 24 h de
edad y cuya densidad óptica a \lambda=600 nm se ha ajustado a 1
unidad.
Etapa
4
Las células vegetales transformadas por los
vectores que contienen los constructos descritas anteriormente en
el presente documento se regeneran a continuación a partir de
células aisladas, de callos o de discos foliares mediante el uso de
las técnicas habituales de cultivos de plantas (Plant Cell Culture:
A pratical Approach. Dixon R.A. ed., IRL Press, Oxford, Washington
DC., 1985). Las células y plantas transformadas se ponen en cultivo
según los procedimientos habituales y descritos en la bibliografía.
La selección de las células y plantas transformadas se efectúa en
el momento de su cultivo, sobre medio selectivo que contiene un
antibiótico o toxina específicos del casete introducido.
En un ejemplo particular, los discos foliares
descritos anteriormente en el presente documento se han enjugado
sobre un papel secante estéril y luego puesto en
co-cultivo 2 días a 24ºC y en la oscuridad sobre el
mismo medio sólido de desdiferenciación celular. Tras el
co-cultivo, se han aclarado los discos ½ hora en el
medio de inducción de los brotes, que contiene cefotaxima y
kanamicina. Finalmente, la inducción de los brotes se ha realizado
sobre este mismo medio sólido. Cada semana los discos se toman, se
aclaran y se ponen de nuevo en cultivo sobre el mismo medio
preparado recientemente.
Después de 4 a 5 semanas, los brotes que se
desarrollan, se toman y se ponen en cultivo sobre un medio de
enraizamiento que contiene cefotaxima y kanamicina.
Las diferentes etapas de esta transformación se
ilustran en la figura 8.
Se ha obtenido una cincuentena de brotes
mediante este método, de los cuales una veintena se ha enraizado en
medio selectivo. Estas plántulas se multiplican mediante esquejes
para producir bastante biomasa como para efectuar las
verificaciones PCR que ponen en evidencia la presencia del gen
cfa y para extraer los lípidos totales.
Etapa
5
A continuación se analizan los transformantes
producidos de este modo a varios niveles:
a) - Análisis directo que confirma la presencia
del gen en la célula vegetal o la planta, realizada o bien mediante
inmunotransferencia tipo Southern o análisis PCR que necesitan
extracciones de ADN genómico. (Protocolo descrito en el Sambrook
y/o el Current Protocol).
Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T. en
Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Irwin N., Ford N., Nolan C.
y Ferguson M. eds, Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989.
Current protocols in Molecular Biology. Ausubel
F.M. Brent R. Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. y
Struhl K. eds, Current Protocols Inc Wiley, Massachusetts..., Vol.
1: Molecular Biology- Techniques. 1994 y Vol. 2: Molecular Biology-
Laboratory. 1994.
b) - Análisis del producto génico, es decir,
ARNm mediante inmunotransferencia tipo Northern y que confirma la
transcripción del gen (Protocolo descrito en el Sambrook y/o el
Current Protocol mencionados anteriormente en el presente
documento).
c) - Análisis de la proteína sintetizada, la
enzima (que confirma la traducción del gen en proteína) y que
permite asegurarse de la funcionalidad de ésta (dosificación
enzimática inmunotransferencia, inmunotransferencia tipo
Western).
La dosificación de la SAM sintetasa y de la
reserva SAM en las células se realiza más particularmente según el
protocolo descrito por Mathur y Sachar (1981 FEBS Lett., 287,
113-117).
La dosificación de la CFA sintasa en las células
y plantas de tabaco se realiza según el protocolo descrito por
Taylor y Cronan (1979 Biochemistry, 18,
3292-3300).
d) - El análisis y la identificación de los
triglicéridos sintetizados se realizan mediante el uso de técnicas
cromatográficas de tipo HPLC, CG-EM o mediante RMN
tras extracción utilizando los protocolos descritos en la
bibliografía.
Estos experimentos permiten comprobar que los
ácidos nucleicos recombinantes son funcionales, que pueden
introducirse en las células de plantas, que dichas células pueden
regenerarse, y que estas células producen efectivamente ácidos
grasos ramificados. A continuación estos ácidos pueden recuperarse
directamente en las semillas de las plantas correspondientes,
mediante las técnicas de extracción conocidas.
En un ejemplo particular, se han extraído los
lípidos de las plantas obtenidas anteriormente (semillas, hojas o
suspensiones celulares) mediante el uso de la técnica descrita por
Browse et al. (Anal. Biochem. 152 (1986) 141). Los lípidos
obtenidos se han transesterificado mediante el método de Fisher y
Cherry (Lipids 18 (1983) 589). Este método utiliza el hidróxido de
tetrametil ammonio al 20% en metanol. Es no destructivo, eficaz y
se presta perfectamente a la metanolisis de los aceites
inhabituales. Los esteres metílicos de ácidos grasos obtenidos de
este modo se han analizado a continuación mediante cromatografía en
fase gaseosa.
En primer lugar se han realizado los análisis de
lípidos sobre extractos de suspensiones celulares BY2 transformadas
y no transformadas de 7 días de edad y cultivadas en las mismas
condiciones (medio de selección sin presión, agitación 140 rpm,
24ºC, oscuridad). Estos análisis han permitido validar el método de
extracción de los lípidos totales sobre las suspensiones
celulares.
A continuación, la comparación de los extractos
de lípidos obtenidos a partir de suspensiones celulares de BY2 y a
partir de hojas de tabaco SR1 transformadas y no transformadas en
diferentes condiciones (con o sin presión de selección, con o sin
luz, de 7 o 14 días de edad), pone en evidencia, en el material
vegetal transformado, la presencia de compuestos que tienen la
estructura de ácidos grasos ramificados según la invención.
La análisis mediante espectrometría de masas de
las muestras obtenidas confirma que los ácidos grasos obtenidos
comprenden efectivamente ácidos grasos ramificados en el sentido de
la invención, es decir que poseen al menos una sustitución de
naturaleza no-cíclica. Estos resultados muestran
especialmente la presencia de los ácidos 9- (y/o 10-)
metiloctadecanoico y/o 9-(y/o 10-)metilhexadecanoico.
Etapa
6
En una etapa facultativa, los ácidos grasos
ramificados producidos por los materiales vegetales de la invención
se tratan de manera que mejoren sus propiedades fisicoquímicas,
especialmente sus propiedades lubricantes.
En un ejemplo particular, este tratamiento
comprende la hidrogenación de los ácidos grasos, con miras a
aumentar la proporción de ácidos grasos ramificados y obtener así
composiciones que tienen una resistencia a la oxidación aumentada y
puntos de flujo bajos. Esta hidrogenación se realiza en las
condiciones conocidas por el experto en la técnica.
Este ejemplo ilustra la construcción de plantas
genéticamente modificadas que pueden producir ácidos grasos
ramificados multiramificados. En particular, este ejemplo describe
la inserción mediante ingeniería genética en el genoma de la planta
de un gen o de un conjunto de genes que conduce la planta a utilizar
un acil-CoA no lineal que tiene un número de átomos
de carbono superior a 3 (el metilmalonil CoA por ejemplo) en lugar
del malonil CoA para obtener ácidos grasos ramificados denominados
multiramificados tales como el ácido 2, 4, 6,
8-tetrametildecanoico. Dado que la síntesis de los
ácidos grasos se produce en los cloroplastos, el ácido nucleico
recombinante insertado comprende ventajosamente un gen que codifica
para una malonil-CoA descarboxilasa (E.C. Nº
4.1.1.9) de modo que esta enzima es activa al nivel cloroplástico o
a otro nivel de la célula. Esto se obtiene o bien mediante
introducción del ácido recombinante en los cloroplastos, o bien
mediante inserción de un péptido de transito que permite el
direccionamiento de la proteína en este compartimiento.
La construcción de estas plantas transgénicas
según la invención se efectúa según las etapas siguientes (figura
9).
Etapa
1
El material vegetal utilizado es idéntico al
descrito en el ejemplo A.
\newpage
Etapa
2
La transformación genética consiste en la
introducción de una casete de expresión que comprende el gen a
transferir, el promotor de expresión de este gen que podrá permitir
una expresión constitutiva, espacial o temporal y una secuencia
nucleotídica adicional que codifica para un péptido de transito que
permite el direccionamiento de la proteína en un compartimento
celular en el que será activa.
Uso del gen que codifica para la
malonil-CoA descarboxilasa cuya secuencia
nucleotídica se describe por Kolattukudy et al. (1987) o
cualquier otra secuencia nucleotídica análoga que procede de otros
organismos o microorganismos procariotas o eucariotas.
Kolattukudy P.E. Rogers L.M., Poulose A.J., Jang
S.H., Kim Y.S., Cheesbrough T.M. y Liggitt D.H.(1987) Developmental
pattern of the expression of malonyl-CoA
decarboxylase gène and the production of unique lipids in the goose
uropygial glands. Arch. Biochem. Biophys., 256,
446-454.
Fernandese N.D. y Kolattukudy P.E. (1996)
Cloning, sequencing and characterization of a fatty acid
synthase-encoding gene from Mycobacterium
tuberculosis var. bovis BCG. Gene, 170,
95-99.
En algunos casos, componentes de la síntesis de
ácidos grasos se encuentran en los cloroplastos u otros orgánulos.
En este caso, la enzima sintetizada: malonil-CoA
descarboxilasa, debe transportarse a los cloroplastos para ser
activa. Deberá añadirse a los constructos génicos una secuencia de
ADN que codifica para un péptido de transito operacional y
reconocido por la planta receptora. Estos péptidos de transito son
en general secuencias líderes que deberán combinadarse con la
secuencia nucleotídica del gen asociado a un promotor específico.
Estas secuencias "señal" pueden representarse por cualquier
otra secuencia nucleotídica derivada de un gen que se expresa en el
citoplasma antes de llegar a su compartimento de reacción apropiado.
El ADN de estos péptidos de tránsito pueden proceder de otras
plantas. Puede ser, por ejemplo, el péptido de transito de la
pequeña subunidad de la RUBISCO de soja o las secuencias que
codifican para los 6 o 12 aminoácidos terminales de la pequeña
subunidad madura de la RUBISCO de guisante y mencionados en la
patente de Calgene WO 94/29467 (Esquema de tipo 4).
En este ejemplo, los promotores utilizados son
el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y el promotor
del gen de la nopalina sintasa (nos). La estructura de estos
promotores se ha descrito por ejemplo por Benfey y Chua (1990,
Science, 250 959-966).
En este ejemplo, les regiones de terminación de
la transcripción utilizadas proceden de los genes de la nopalina
sintasa (nos) y de la octopina sintasa (ocs)(figura 9).
Para construir los ácidos nucleicos
recombinantes que permiten introducir los elementos mencionados
anteriormente en el presente documento en las células de plantas,
estos elementos genéticos se aíslan y se subclonan previamente en
vectores de clonación de tipo pBR322 y pUC, que llevan marcadores
que permiten la selección de los transformantes que proporcionan
una resistencia a agentes citotóxicos tales como antibióticos,
toxinas, etc. a continuación se introducen los casetes de expresión
en vectores binarios que contienen las secuencias necesarias para la
transformación de las plantas, en particular, el vector
ADN-T. Este vector se utiliza para la transformación
de las plantas y se ha descrito ampliamente en la bibliografía la
estructura de los vectores que contienen las secuencias específicas
de reconocimiento (RB y LB) (Libro de Hoekema, the binary Plant
Vector Systems, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985.
Molecular genetics of the Bacteria-Plant
Interaction, Puhler A. Ed., Springer-Verlag, NY,
1983. Plant Genetic Transformation and Gene expression: A Laboratory
Manual Draper J., Scott R., Armitage P., y Walden R. Eds, Blackwell
Scientific Publications, Oxford, 1988. Kahl G. y Weising K., (1993)
Genetic engineering of plant cells. En Biotechnology: Genetics
Fundamentals and genetic Engineering. Rehm H.J., Reed G., Pühler A.
y Stadler P. Eds, VCH Publishers Inc., Nueva York (USA) Vol 2, págs.
547-659).
La estructura de los ácidos nucleicos
recombinantes preparados de este modo se representa en la figura
9.
Etapa
3
En primer lugar, se transforman genéticamente
protoplastos, células vegetales, tejidos o plantas de tabaco
mediante los ácidos nucleicos recombinantes descritos anteriormente
en el presente documento, mediante el uso de métodos de
transferencia indirecta con la ayuda de un vector tal como las
agrobacterias (por ejemplo Agrobacterium tumefaciens:
C58C1Rif: pGV2260; Deblaere et al., 1985) o mediante el uso
de los métodos de transformación directa (electroporación,
bombardeo de partículas, infiltración a vacío, etc., (Kahl y
Weising, 1993).
En el caso del uso de transferencia de gen
indirecta, las agrobacterias contienen un plásmido que posee las
regiones vir (plásmido Ti desarmado) necesarias para la
transferencia del ADN-T en las células
vegetales.
Las células se transforman genéticamente para
incluir en su genoma un ácido nucleico recombinante (figura 9) que
contiene el gen que codifica para la malonil-CoA
descarboxilasa descrita anteriormente en el presente documento.
El protocolo utilizado para realizar estas
transformaciones se ha descrito por Van Lijsebettens et al.
(1986 J. Mol. Biol., 188, 129-145) o catalogado en
la bibliografía (Plant Genetic Transformation and Gene Expression:
A Laboratory Manual. Draper J., Scott R., Amritage P., y Walden R.
Eds, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Kahl G. Y
Weiding K. (1993) Genetic engineering of plant cells. En
Biotechnology: Genetics Fundamentals and genetic Engineering. Rehm
H.J., Reed G., Pühler A. y Stadler P. Eds, VCH Publishers Inc.,
Nueva York (USA) Vol. 2, pp 547-659).
Etapa
4
Las células vegetales transformadas por les
vectores que contienen los constructos descritos anteriormente en
el presente documento se regeneran a continuación a partir de
células aisladas, de callos o de discos foliares mediante el uso de
las técnicas habituales de cultivos de plantas (Plant Cell Culture:
A pratical Approach. Dixon R.A. ed., IRL Press, Oxford, Washington
DC., 1985). Las células y plantas transformadas se ponen en cultivo
según los procedimientos habituales y descritos en la bibliografía.
La selección de las células y plantas transformadas se efectúa en
el momento de su cultivo, sobre medio selectivo que contiene un
antibiótico o toxina específicos del casete introducido.
Etapa
5
Los transformantes producidos de este modo se
analizan a continuación a varios niveles:
a) - Análisis directo que confirma la presencia
del gen en la célula vegetal o la planta, realizada o bien mediante
inmunotransferencia tipo Southern o bien mediante análisis PCR que
necesitan extracciones de ADN genómico según un Protocolo descrito
en:
- Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T. en
Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Irwin N., Ford N., Nolan C.
y Ferguson M. eds, Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989 o,
- Current protocols in Molecular Biology.
Ausubel F. M. Brent R. Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G.,
Smith J.A. y Struhl K. eds, Current Protocols Inc Wiley,
Massachusetts..., Vol. 1: Molecular Biology - Techniques. 1994 y
Vol. 2: Molecular Biology - Laboratory. 1994.
b) - Análisis del producto génico, es decir,
ARNm mediante inmunotransferencia tipo Northern y que confirma la
transcripción del gen (Protocolo descrito en el Sambrook y/o el
Current Protocol mencionados anteriormente en el presente
documento).
c) - Análisis de la proteína sintetizada, la
enzima (que confirma la traducción del gen en proteína) y que
permite asegurarse de la funcionalidad de ésta (dosificación
enzimática inmunotransferencia, inmunotransferencia tipo
Western).
d) Dosificación de la
Malonil-CoA descarboxilasa según el protocolo
descrito por Kolattuduky et al. (1987): Developmental
pattern of the expression of Malonyl-CoA
decarboxylase gene and the production of unique lipids in the goose
uropygial glands. Arch. Biochem. Biophys., 256,
446-454.
e) - El análisis y la identificación de los
triglicéridos sintetizados se realizan mediante el uso de técnicas
cromatográficas de tipo HPLC, CG-EM o mediante RMN
tras extracción utilizando los protocolos descritos en la
bibliografía.
Estos experimentos permiten comprobar que los
ácidos nucleicos recombinantes son funcionales, que se pueden
introducir en las células de plantas, que dichas células se pueden
regenerar, y que estas células producen efectivamente ácidos grasos
ramificados. A continuación estos ácidos pueden recuperarse
directamente en las semillas de las plantas correspondientes,
mediante las técnicas de extracción conocidas.
Claims (16)
1. Procedimiento de producción de
ácidos grasos ramificados, caracterizado porque dichos ácidos
grasos ramificados se producen a partir de al menos una célula
vegetal o a partir de semillas o a partir de una planta,
comprendiendo el genoma de dicha célula vegetal o dichas semillas o
dicha planta un ácido nucleico recombinante que codifica para una
metil transferasa, una ciclopropano ácido graso sintasa, un
metilmalonil-CoA o una malonil-CoA
descar-
boxilasa.
boxilasa.
2. Procedimiento según la
reivindicación 1, caracterizado porque además comprende una
etapa de extracción de los ácidos grasos ramificados.
3. Procedimiento según la
reivindicación 2, caracterizado porque comprende además una
etapa de tratamiento de los ácidos grasos ramificados
extraídos.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho ácido
nucleico recombinante codifica para un producto que permite inducir
o estimular la ramificación tras la síntesis de los ácidos grasos
producidos por dicha célula.
5. Procedimiento según la
reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico
recombinante codifica para una enzima que permite la transferencia
de uno o más grupos alquilo sobre el/los doble(s)
enlace(s) de los ácidos grasos insaturados.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la célula
vegetal comprende además un ácido nucleico recombinante que
codifica para la SAM sintetasa.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ácido
nucleico recombinante codifica para una enzima que permite forzar a
dicha célula de planta a utilizar un sustrato que comprende un
número de átomos de carbono superior a 3 para la síntesis de la
cadena alifática.
8. Procedimiento según la
reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico
recombinante codifica para una enzima que puede forzar a la planta
a utilizar un acil-CoA no lineal.
9. Célula de planta que comprende un
ácido nucleico recombinante que comprende
- -
- una secuencia de ADN que codifica para un péptido de transito operacional y reconocido por la planta receptora y que permite el direccionamiento de la proteína en los cloroplastos;
- -
- un ácido nucleico que codifica para una malonil-CoA descarboxilasa que permite forzar a una célula de planta a utilizar un sustrato que comprende un número de átomos de carbono superior a 3 como sustrato para la síntesis de la cadena alifática;
- -
- un promotor funcional en las células vegetales que controla la expresión de dicho ácido nucleico, y
- -
- una región en 3' de terminación de la transcripción,
o un vector que comprende un ácido
nucleico recombinante de este
tipo.
10. Célula de planta según la
reivindicación 9, caracterizada porque se trata de una célula
de planta oleaginosa, seleccionada preferiblemente entre la colza,
el girasol, el cacahuete, la soja, el lino y el maíz.
11. Planta transgénica caracterizada
porque contiene al menos una célula según la reivindicación 9 ó
10.
12. Procedimiento de producción de ácidos
grasos ramificados mediante cultivo celular de una célula de planta
según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, y que
comprende:
- -
- el cultivo de estas células en un medio apropiado para su crecimiento,
- -
- la extracción y la purificación de los ácidos grasos ramificados a partir de estas células o del sobrenadante de dicho cultivo.
13. Procedimiento de preparación de ácidos
grasos ramificados a partir de una planta transgénica cuyas células
contienen un ácido nucleico recombinante que comprende
- -
- una secuencia de ADN que codifica para un péptido de transito operacional y reconocido por la planta receptora y que permite el direccionamiento de la proteína en los cloroplastos;
\newpage
- -
- un ácido nucleico que codifica para una malonil-CoA descarboxilasa que permite forzar a una célula de planta a utilizar un sustrato que comprende un número de átomos de carbono superior a 3 como sustrato para la síntesis de la cadena alifática;
- -
- un promotor funcional en las células vegetales que controla la expresión de dicho ácido nucleico, y
- -
- una región en 3' de terminación de la transcripción.
- -
- el cultivo en campos de dichas plantas transgénicas,
- -
- la recuperación de las semillas de dichas plantas,
- -
- la extracción de los ácidos grasos a partir de estas semillas.
14. Uso de una planta transgénica según la
reivindicación 11, regenerada a partir de una célula según
cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, para la producción de
ácidos grasos ramificados.
15. Uso de una planta o parte de una planta
transgénica en la que al menos algunas de las células comprenden un
ácido nucleico recombinante que comprende
- -
- una secuencia de ADN que codifica para un péptido de transito operacional y reconocido por la planta receptora y que permite el direccionamiento de la proteína en los cloroplastos;
- -
- un ácido nucleico que codifica para una malonil-CoA descarboxilasa que permite forzar a una célula de planta a utilizar un sustrato que comprende un número de átomos de carbono superior a 3 como sustrato para la síntesis de la cadena alifática;
- -
- un promotor funcional en las células vegetales que controla la expresión de dicho ácido nucleico, y
- -
- una región en 3' de terminación de la transcripción,
para la producción de ácidos grasos
ramificados.
16. Procedimiento de preparación de una
planta transgénica que puede producir ácidos grasos ramificados,
que comprende la introducción de un ácido nucleico recombinante que
comprende
- -
- una secuencia de ADN que codifica para un péptido de transito operacional y reconocido por la planta receptora y que permite el direccionamiento de la proteína en los cloroplastos;
- -
- un ácido nucleico que codifica para una malonil-CoA descarboxilasa que permite forzar a una célula de planta a utilizar un sustrato que comprende un número de átomos de carbono superior a 3 como sustrato para la síntesis de la cadena alifática;
- -
- un promotor funcional en las células vegetales que controla la expresión de dicho ácido nucleico, y
- -
- una región en 3' de terminación de la transcripción, en una célula o parte de planta y la regeneración, a partir de estas células o partes de plantas, de una planta transgénica.
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