DE69837047T2 - Verfahren zur herstellung verzweigtkettiger fettsäuren mittels genetisch modifizierter pflanzen - Google Patents

Verfahren zur herstellung verzweigtkettiger fettsäuren mittels genetisch modifizierter pflanzen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäuren mit aliphatischer, nicht linearer Kette. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung genetisch modifizierter Pflanzen. Die so hergestellten Fettsäuren, in freier Form oder nicht, gegebenenfalls auf chemischem oder enzymatischem Weg modifiziert, können bei der Herstellung unterschiedlicher Industrieerzeugnisse, insbesondere Schmiermitteln der Art Hydrauliköl oder Motoröl, verwendet werden.
  • Die Fettsäuren sind Fettsäuen mit langer aliphatischer Kette mit üblicherweise 6 bis 25 Kohlenstoffatomen. Die aliphatische Kette kann linear oder nicht linear (ebenfalls als verzweigt bezeichnet) sein. Die natürlich hergestellten Fettsäuren liegen entweder in freier Form oder verestert, insbesondere in Form von Diglyceriden oder Triglyceriden, vor. Die Fettsäuren werden üblicherweise in unterschiedlichen industriellen Bereichen verwendet, insbesondere für die Herstellung von Schmierstoffbasen natürlichen Ursprungs oder in Reinigungsmitteln, Adjuvantien und auch bei der Bildung von Biokraftstoffen. Bei all diesen Anwendungen ist es besonders vorteilhaft, Fettsäuren natürlicher Herkunft, insbesondere pflanzlicher Herkunft, verwenden zu können. Folglich wurden verschiedene Verfahren zur Herstellung und Extraktion von Fettsäuren aus Pflanzen (insbesondere Samen von Pflanzen) im Stand der Technik beschrieben (siehe insbesondere Harrington et al, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1985, Bd 24. Seite 314; FR 2 722 798). Weiterhin betrifft die Anmeldung WO 94/13814 Pflanzenzellen, die durch ein bei der Übertragung von freien Fettsäuren auf Cholesterol eingebrachtes Enzym genetisch modifiziert wurden. Obwohl durch diese Anmeldung das Modifizieren der Zusammensetzung von Triglyceriden ermöglicht wird, wird jedoch auf keine Weise ermöglicht, die Struktur der aliphatischen Kette der Fettsäuren zu verändern. In Schmid K. (Plant Lipid Metabolism (1995, 108) wird die Synthese cyclischer Fettsäuren (Dihydrosterculat) in genetisch modifizierten Tabakzellen beschrieben. Jedoch wird in diesem Schriftstück nicht die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren beschrieben, weder die entsprechenden Mittel noch die industriellen Anwendungen.
  • Einer der Hauptnachteile der Verfahren im Stand der Technik unter Verwendung von Pflanzen liegt genau in der geringen Diversität der Fettsäuren, die erhalten werden können. Des Weiteren stellen die Pflanzen auf natürliche Weise im Wesentlichen Fettsäuren mit linearer aliphatischer Kette der Art C6 bis C24 her. Nun haben die von der Anmelderin durchgeführten Studien gezeigt, dass es besonders vorteilhaft ist, Fettsäuren mit nicht linearer (oder verzweigter) Kette zu verwenden, um eine gute Schmierstoffbasis zu erhalten. Des Weiteren hat die Anmelderin aufgezeigt, dass die Verwendung von Fettsäuren (frei oder nicht) mit verzweigter aliphatischer Kette ermöglichte, Produkte der Art Schmierstoff zu erhalten, die eine gute Wärmestabilität, eine gute Resistenz gegenüber Oxidation, eine gute Viskosität, eine gute biologische Abbaubarkeit sowie niedrige Schmelzpunkte (oder Pourpoints) aufweisen.
  • Es besteht somit ein Erfordernis nach Verfahren, die es ermöglichen, wirksam verzweigtkettige Fettsäuren herzustellen. Die vorliegende Erfindung sieht eine vorteilhafte Lösung hierfür vor, indem Verfahren beschrieben werden, die auf der genetischen Modifizierung von Pflanzen bestehen.
  • Folglich betrifft ein erster Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren mittels genetisch modifizierter Pflanzen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft genetisch modifizierte Pflanzen, die geeignet sind, verzweigtkettige Fettsäuren herzustellen, sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft weiterhin Pflanzenzellen, die eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein Produkt kodiert, das die Synthese in der Zelle von derartigen verzweigtkettigen Fettsäuren bewirkt oder stimuliert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine rekombinate Nukleinsäure wie oben beschrieben sowie jeden Vektor, der diese enthält.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von verzweigtkettigen Fettsäuren aus genetisch modifizierten Pflanzen, genetisch modifizierten Pflanzen und Pflanzenzellen, die verzweigtkettige Fettsäuren herstellen, sowie rekombinante Nukleinsäuren und diese enthaltende Vektoren, die zu diesem Zweck verwendet werden können.
  • Im Sinn der Erfindung wird unter verzweigtkettiger Fettsäure jede Fettsäure verstanden, die eine echte verzweigte aliphatische Kette aufweist. Wie aus dem Text der vorliegenden Anmeldung hervorgeht, werden im Sinn der Erfindung mit dem Begriff "verzweigt(kettig)" Fettsäuren bezeichnet, die eine oder mehrere Substitutionen an einer oder mehreren verschiedenen Positionen der aliphatischen Kette aufweisen. Weiterhin ist das Vorhandensein eines einzigen Cyclus in der aliphatischen Kette nicht ausreichend, um eine Fettsäure als verzweigtkettig gemäß der Erfindung zu bezeichnen. Es handelt sich vorzugsweise um eine Fettsäure, welche eine aliphatische Kette mit C6 bis C24, noch bevorzugter C12 bis C24, aufweist. Beispiele derartiger Fettsäuren, im Wesentlichen in gesättigter Form und noch nicht verzweigt, sind insbesondere Caprinsäure (C10), Laurinsäure (C12), Myristinsäure (C14), Palmitinsäure (C16), Stearinsäure (C18), Arachinsäure (C20), Behensäure (C22), Tetracosansäure (C24) sowie Mischungen daraus. Die aliphatische Kette der verzweigtkettigen Fettsäuren gemäß der Erfindung kann an einer oder mehreren Positionen durch unterschiedliche Gruppen verzweigt sein. Vorteilhafterweise weist die aliphatische Kette eine bis vier Verzweigungen auf, die im mittleren Teil der aliphatischen Kette und/oder an ihrem Ende gegenüber der Säurefunktion lokalisiert sind. Noch bevorzugter ist/sind die Verzweigung(en) auf einem oder mehreren Kohlenstoffen zwischen den Positionen 8 und 15 der aliphatischen Kette lokalisiert. Des Weiteren kann die verzweigte Grruppe jede Alkylgruppe, vorzugsweise ein Alkyl mit C1 bis C5, sein, noch bevorzugter ein Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Terbutyl. Eine besonders bevorzugte verzweigende Gruppe ist eine Methylgruppe. Besondere verzweigtkettige Fettsäuren im Sinn der Erfindung sind beispielsweise 9-Methyloctadecansäure, 10-Methyloctadecansäure, 9,12-Dimethyloctadecansäure, 10,12-Dimethyloctadecansäure, 9,13-Dimethyloctadecansäure, 10,13-Dimethyloctadecansäure, 9,12-Dimethyloleinsäure, 10,12-Dimethyloleinsäure, 9,13-Dimethyloleinsäure, 10,13-Dimethyloleinsäure oder auch 2,4,6,8-Tetramethyldecansäure.
  • Des Weiteren können die verzweigtkettigen Fettsäuren gemäß der Erfindung verzweigtkettige Fettsäuren in freier Form oder in Form von Derivaten sein. Es kann sich insbesondere um verzweigtkettige Fettsäureester handeln, wie beispielsweise Monoester, Diester und Triester von Glycerin (Triglycerid). Im Fall von Di- oder Triglyceriden ist es des Weiteren nicht erforderlich, dass alle in dem Molekül vorhandenen Fettsäuren verzweigtkettig sind. Folglich kann ein Triglycerid 1, 2 oder 3 verzweigtkettige Fettsäuren aufweisen. Es wird jedoch bevorzugt, dass der Anteil an verzweigtkettigen Fettsäuren in den Estern oder anderen Derivaten erhöht ist.
  • Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die verzweigtkettigen Fettsäuren aus wenigstens einer pflanzlichen Zelle oder pflanzlichem Material oder einer Pflanze mit wenigstens einer pflanzlichen Zelle hergestellt werden, wobei die pflanzliche Zelle in ihrem Genom eine rekombinante Nukleinsäure aufweist, die für ein Produkt kodiert, das die Synthese einer verzweigtkettigen Fettsäure oder verzweigtkettiger Fettsäuren bewirkt oder stimuliert.
  • Im Sinn der Erfindung werden mit "rekombinanter Nukleinsäure" alle Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren bezeichnet, die durch Gentechniken hergestellt werden. Es handelt sich insbesondere um eine komplementäre DNA, eine genomische DNA oder eine Messenger-RNA. Eine derartige Nukleinsäure kann des Weiteren von unterschiedlicher Her kunft sein, insbesondere bakteriell, viral, pflanzlich, von Säugetieren, synthetisch oder semisynthetisch. Eine rekombinante Nukleinsäure kann hergestellt werden, indem dem Durchschnittsfachmann bekannte Techniken verwendet werden, und insbesondere durch Sieben von Nukleinsäurebänken mit geeigneten Sonden, durch chemische Synthese (indem Nukleinsäure-Synthesizer verwendet werden), durch enzymatische Verdauung/Ligation etc. oder jedwede Kombination dieser Methoden.
  • Die vorliegende Erfindung kann mit unterschiedlichen Pflanzenarten durchgeführt werden, vorzugsweise mit auf Feldern kultivierbaren Pflanzen. Es handelt sich vorteilhafterweise um eine Ölpflanze, wie zum Beispiel Raps, Sonnenblume, Erdnuss, Soja, Flachs (ölhaltig) oder auch Mais. Es kann sich ebenfalls um eine Tabakpflanze handeln.
  • Die Pflanzenzellen gemäß der Erfindung können jede Zelle der oben genannten Pflanzen sein. Es kann sich noch bevorzugter um eine kultivierbare Pflanzenzelle handeln, die geeignet ist, eine Pflanze wiederherzustellen.
  • Mit dem Begriff "pflanzliches Material" wird jeder Teil einer Pflanze wie oben beschrieben bezeichnet, der wenigstens eine Zelle aufweist. Es kann sich um jedes Gewebe der Pflanze handeln, insbesondere um Samen.
  • Die Zelle oder Pflanze gemäß der Erfindung wird somit genetisch so modifiziert, dass sie in ihrem Genom, in freier Form oder integriert, eine rekombinante Nukleinsäure aufweist, die für ein Produkt kodiert, das die Synthese einer verzweigtkettigen Fettsäure bewirkt oder stimuliert. Die Pflanzen und Pflanzenzellen gemäß der Erfindung umfassen somit Fettsäuren, von denen eine Fraktion aus verzweigtkettigen Fettsäuren gebildet ist. Je nach den geplanten Anwendungen kann es vorteilhaft sein, dass die Fraktion einen wesentlichen Anteil aller Fettsäuren darstellt. Vorteilhafterweise ist die rekombinante Nukleinsäure in der Zelle in in dem Genom der Zelle integrierter Form vorhanden, damit sie im getrennten Zustand stabiler ist.
  • Ein Produkt wird als die Synthese verzweigtkettiger Fettsäuren bewirkend bezeichnet, wenn es der Pflanzenzelle, die dieses enthält, ermöglicht, eine Synthese durchzuführen, die sie bei dessen Fehlen nicht durchführen könnte. Von einem die Synthese verzweigtkettiger Fettsäuren stimulierenden Produkt wird gesprochen, wenn es sich um ein Produkt handelt, das es der dieses enthaltenden Pflanzenzelle ermöglicht, einen vorab bestehenden Syntheseweg in der Zelle zu nutzen, der zuvor nicht oder nur wenig genutzt wurde, beispielsweise aus Gründen der Stöchiometrie oder der Spezifizität des Substrats. Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete rekombinante Nukleinsäure kann insbesondere für ein Produkt kodieren, das geeignet ist, eine Verzweigung der Fettsäuren zu bewirken, die nach der Synthese von der Zelle hergestellt wurden, oder für ein Produkt, welches ermöglicht, gleichzeitig zu der Synthese eine Verzweigung durchzuführen. Diese beiden Annäherungen sind des Weiteren kombinierbar.
  • Die Fettsäuren werden von den Pflanzenzellen in Chloroplast synthetisiert. Die Synthese weist mehrere sich wiederholende Zyklen auf, in deren Lauf die Kohlenstoffeinheiten der Reihe nach zueinander hinzugefügt werden, um die aliphatische Fettkette zu erzeugen. Nach ihrer Synthese werden die linearen Fettsäuren zu dem Cytoplasma exportiert, wo sie verschiedenen post-Synthese- oder (post-Elongation-) Modifikationen und insbesondere einer Entsättigung durch als Desaturasen bezeichnete Enzyme unterzogen werden.
  • In einer ersten Ausführungsform kodiert die rekombinante Nukleinsäure für ein Produkt, welches es ermöglicht, die post-Synthese-Verzweigung von Fettsäuren zu bewirken oder zu stimulieren, die von der Pflanzenzelle erzeugt wurden. Insbesondere kodiert gemäß dieser ersten Ausführungsform der Erfindung die rekombinante Nukleinsäure für ein Enzym, zum Beispiel eine Methyltransferase oder eine Cyclopropanfettsäure-Synthese, welche den Transfer einer oder mehrerer Alkylgruppen auf die Doppelbindung(en) von ungesättigten Fettsäuren ermöglicht.
  • Die transferierten Alkylgruppen können, wie zuvor angegeben, jede Alkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sein. Es handelt sich vorteilhafterweise um Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und insbesondere um eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylgruppe.
  • Vorteilhafterweise kodiert die rekombinante Nukleinsäure für ein heterologes Enzym, d. h. ein Enzym, das von einem Organismus stammt, der keine Pflanzenzelle ist. Insbesondere stammt das verwendete Enzym vorteilhafterweise von einem prokaryotischen oder eukaryotischem Mikroorganismus, wie zum Beispiel einer Bakterie oder einer Hefe.
  • Als Beispiele für rekombinante Nukleinsäuren gemäß der Erfindung kann eine rekombinante Nukleinsäure genannt werden, die für eine Cyclopropanfettsäure-Synthase, auch CFAS bezeichnet, kodiert. Die Nukleinsäure kann gleichermaßen für Methyltransferasen, wie beispielsweise SAM-Methyltransferase kodieren, d.h. für Enzyme, die geeignet sind, als Katalysator für den Transfer einer Methylgruppe aus SAM (S-Adenosyl-methionin) zu einer ungesättigten Fettsäure oder allgemeiner zu einer Doppelbindung einer aliphatischen Kette zu dienen. Eine im Sinn der Erfindung besondere rekombinante Nukleinsäure kodiert zum Beispiel für die Cyclopropanfettsäure-Synthase, wie von Wang et al. (Biochemistry 31 (1992) 11020) beschrieben, oder für jedes Enzym, das zu dem letztgenannten analog ist. Im Sinn der Erfin dung wird unter dem Begriff "analog" jedes Enzym verstanden, das eine oder mehrere strukturelle Modifikationen bezogen auf das zuvor beschriebene Enzym aufweist und eine Aktivität für den Transfer von Alkylgruppen auf die Doppelbindungen der aliphatischen Kette bewahrt. Diese strukturellen Modifikationen können Mutationen, Deletionen, Substitutionen oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäuren sein. Der Begriff "analog" umfasst gleichermaßen homologe Sequenzen, die aus anderen Organismen erhalten werden. Ein anderes "analoges" Enzym ist ein Enzym, das durch eine hybridisierende Nukleinsäure mit der ganzen oder einem Teil der Sequenz der Transferase oder der Synthase gebildet wurde und eine Aktivität der gleichen Art bewahrt. Die Hybridisierung wird vorteilhafterweise unter normalen oder noch bevorzugter strengen Bedingungen der Stringenz durchgeführt. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind zum Beispiel: Hybridisierung bei 42°C, 50% Formamid, 5 × SSC, 1 × Denhardt; Waschen bei 65°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Nicht-stringente Hybridisierungsbedingungen sind zum Beispiel: Hybridisierung bei 37°C, 40% Formamid, 5 × SSC, 1 × Denhardt; Waschen bei 50°C in 1 × SSC, 0,1% SDS. Die stringenten Bedingungen werden insbesondere angewendet, wenn die Test-Nukleinsäure in geringer Menge vorhanden ist und/oder in wenig gereinigter Form vorliegt. Die nicht-stringenten Bedingungen werden eher angewendet, wenn die Test-Nukleinsäure in größeren Mengen vorhanden ist und in signifikanter Form in der Probe vorliegt. Andere Hybridisierungsbedingungen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt (siehe insbesondere Maniatis et al.). Ein weiteres bestimmtes Beispiel für rekombinante Nukleinsäuren gemäß der Erfindung ist eine rekombinante Nukleinsäure, die für die Methyltransferase kodiert, die für die Synthese von 9-Methyl-10-hexadecensäure bei Corynebacterium spp. (Niepel et al., J. Bact. 180 (1998) 4650) oder in einer Algenvarietät (Carballeira et al., Lipids 32 (1997) 1271) verantwortlich ist.
  • Des Weiteren spricht die Ausführungsform, die im Transfer einer Alkylgruppe auf eine aliphatische Kette besteht, auf Alkylgruppen oder Alkyldonatoren an, die in der Zelle vorhanden sind. Zu diesem Zweck werden für den Transfer einer Methylgruppe die Reserven der Zelle im Wesentlichen durch die SAM-Gruppe gebildet. Mit dem Ziel, die Wirksamkeit der Reaktion und somit die Ausbeute an verzweigtkettigen Fettsäuren weiter zu verbessern, besteht eine bestimmte Ausführungsform darin, zusätzlich zu der Nukleinsäure, die für das oben beschriebene Produkt kodiert, eine zweite Nukleinsäure in die Pflanzenzelle einzubringen, die für ein Enzym kodiert, das an der Synthese des Alkyldonators beteiligt ist. Vorzugsweise handelt es sich um eine Nukleinsäure, die für ein SAM-Syntheseenzym kodiert. Noch bevorzugter handelt es sich um eine Nukleinsäure, die für die SAM-Synthetase oder ein Analogon kodiert. Diese Nukleinsäure kann als Zwischenprodukt einer zweiten rekombinanten Nuklein säure eingebracht werden, entweder gleichzeitig mit der ersten oder nacheinander. Gemäß einer anderen Durchführungsform werden die Nukleinsäuren, die für die beiden Enzyme kodieren, von derselben rekombinanten Nukleinsäure getragen.
  • Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die in der Pflanzenzelle enthaltene rekombinante Nukleinsäure für ein Produkt, welches es ermöglicht, das Einbringen der Fettsäure in die aliphatische Kette während der Elongation zu bewirken oder zu stimulieren, wobei die Gruppen eine oder mehrere Verzweigungen erzeugen. Gemäß dieser zweiten Vorgehensweise handelt es sich also nicht darum, eine post-Synthese-Modifizierung an den hergestellten Fettsäuren durchzuführen, sondern eine Verzweigung gleichzeitig mit der Synthese durchzuführen.
  • Diese Ausführungsform wird vorzugsweise erhalten, indem die Pflanzenzelle dazu gebracht wird, als Substrat für die Synthese der aliphatischen Kette eine Acyl-CoA-Gruppe zu verwenden, welche eine Anzahl Kohlenstoffatome größer 3, vorzugsweise zwischen 4 und 8, statt des Malonyl-CoAs aufweist. Vorteilhafterweise ist das verwendete Substrat eine nichtlineare Acyl-CoA-Gruppierung. Noch bevorzugter handelt es sich um eine nichtlineare Acyl-CoA-Gruppe, welche im Laufe der Elongation das Einbringen einer Gruppe mit einer ungeraden Anzahl Kohlenstoffatomen in die aliphatische Kette ermöglicht. Durch diese Strategie wird beispielsweise ermöglicht, verzweigtkettige Fettsäuren zu erhalten, die multiverzweigt genannt werden, wie zum Beispiel 2,4,6,8-Tetramethyldecansäure. Ein bestimmtes Beispiel für ein Substrat der Art Acyl-CoA ist zum Beispiel Methylmalonyl-CoA. Das Methylmalonyl-CoA ist eine nichtlineare Gruppe mit 4 Kohlenstoffatomen, von denen drei als Elongation dienen. In diesem Fall ist es zu dem Ziel, die Pflanze dazu zu bringen, dieses Substrat für die Synthese der aliphatischen Kette zu verwenden, besonders vorteilhaft, in die Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure einzubringen, die für eine Malonyl-CoA-Decarboxylase (E.C. Nr. 4.1.1.9) kodiert. Die Wirkungsweise dieses Enzyms sowie allgemeiner der Weg der Synthese verzweigtkettiger Fettsäuren durch gemäß dieser Strategie modifizierte Zellen ist in 1 dargestellt. Selbstverständlich kann für die vorliegende Erfindung jedes andere Enzym, das zu dem oben beschriebenen analog ist und geeignet ist, die Pflanze dazu zu bringen, ein Acyl-CoA mit mehr als 3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 bis 8, als Substrat bei der Synthese aliphatischer Ketten von Fettsäuren zu verwenden, verwendet werden. Als bestimmte Beispiele derartiger Enzyme können insbesondere Malonyl-CoA-Decarboxylase genannt werden, deren Nukleotidsequenz in der Literatur (siehe Beispiele) beschrieben wurde, sowie alle dazu analogen Enzyme.
  • Die zweite Ausführungsform kann gleichermaßen erhalten werden, indem die Spezifizität der in die Synthese der aliphatischen Fettkette eingebrachten Enzyme modifiziert wird, insbesondere, indem die Spezifizität des Enzyms modifiziert wird, das den Transfer des Malonyl-CoA auf das Malonyl-ACP unterbindet, und insbesondere die Spezifizität der gesamten oder eines Teils der Fettsäuresynthase, der Acetyl-CoA-Carboxylase oder der Acetyl-CoA-Transacylase. Zu diesem Zweck ist die Fettsäuresynthase aus einem multienzymatischen Komplex gebildet, und die Modifizierung seiner Spezifizität kann durch Modifizierung einer, mehrerer, sogar aller Untereinheiten erhalten werden.
  • Des Weiteren können, wie oben angegeben, die beiden Ausführungsformen kombiniert werden, um Pflanzenzellen zu erzeugen, die geeignet sind, Fettsäuren mit verzweigter aliphatischer Kette zugleich im Stadium der Elongation und post-Elongation zu synthetisieren.
  • Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung weist die rekombinante Nukleinsäure vorteilhafterweise regulierende Regionen der Art Promotor auf, die in Pflanzenzellen funktionell sind und ermöglichen, die Expression der oben beschriebenen Nukleinsäuren zu steuern. Unter den die Transkription regulierenden Regionen, die in den Pflanzen und bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können zum Beispiel die Regionen genannt werden, die dem Mosaikvirus von Blumenkohl (355, 19S) zugeordnet sind, oder die Promotorregionen struktrureller Gene, wie beispielsweise die Gene der Nopalinsynthase (nos) oder Octipinsynthase (ocp) oder Mannopin, Agropin oder Acylträgerprotein (ACP = acyl carrier protein). Die Struktur und das Klonen der unterschiedlichen Bereiche wurden in der Literatur beschrieben. Auf allgemeinere Weise kann jeder Promotor, der eine konstitutive, räumliche oder zeitliche Expression einer Nukleinsäure in eine Pflanzenzelle ermöglicht, für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zu diesem Zweck ist es insbesondere möglich, Promotoren zu verwenden, die eine Expression ermöglichen, die in bestimmten Geweben oder Teilen der Pflanze (Samen, Pollen, etc.) lokalisiert ist, oder Promotoren, deren Aktivität von dem Entwicklungsstadium der Pflanze (Elongation, Blütezeit etc.) abhängt. Als Promotor mit einer Hauptexpression in den Samen kann beispielsweise der Promotor von ACP, Napin oder die von Krebbers et al. (Plant Physiol. 87 (1988) 859) beschriebenen genannt werden. Die Verwendung derartiger Promotoren kann jede mögliche Nebenwirkung verhindern, die durch eine massive und ausgebreitete Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren in der Pflanze bewirkt wird, und gleichermaßen die Wiedergewinnung der so hergestellten Fettsäuren erleichtern, indem diese in bestimmten Bereichen der Pflanze konzentriert werden.
  • Des Weiteren ist es gleichermaßen vorteilhaft, in die rekombinanten Nukleinsäuren gemäß der Erfindung 3'-Sequenzen zur Terminierung einzubringen, die entweder direkt von dem verwendeten Gen stammen oder aus den Regionen anderer Gene stammen können, wie insbesondere jene von Nopalinsynthase (nos) oder auch Octopinsynthase (ocp) von Mannopin, Agropin oder ACP.
  • Die rekombinante Nukleinsäure, die also vorteilhafterweise eine die Transkription regulierende Region, ein Gen oder eine Region, die für ein aktives Produkt wie zuvor beschrieben kodiert, und eine 3'-Region zur Terminierung aufweist, wird vorteilhafterweise in einen Plasmidvektor zum Klonen oder zur Expression eingebracht.
  • Zu diesem Zweck betrifft ein anderer Gegenstand der Erfindung insbesondere eine rekombinante Nukleinsäure, welche aufweist:
    • – eine Nukleinsäure, die für ein Produkt wie zuvor beschrieben kodiert,
    • – einen Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert und geeignet ist, eine Expression dieser Nukleinsäure zu bewirken, die in bestimmten Pflanzengeweben oder bestimmten Pflanzenteilen lokalisiert ist, und
    • – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription.
  • Insbesondere ist der in den Genkonstruktionen gemäß der Erfindung enthaltene Promotor ein Promotor, der geeignet ist, eine Expression einer Nukleinsäure zu bewirken, die in dem Samen der Pflanze lokalisiert ist. Die Angabe " lokalisierte Expression" besagt, dass die Expression in dem betroffenen Gewebe wesentlich bedeutender ist als in den anderen Pflanzengeweben. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass eine absolute Spezifizität der Expression nicht erforderlich ist, sofern eine bedeutende Expression in den untersuchten Geweben beobachtet wird. Der lokalisierte Charakter der Expression gemäß der Erfindung ist von doppeltem Vorteil, da er einerseits das Wiedergewinnen der verzweigtkettigen Fettsäuren erleichtert und andererseits die Risiken der Toxizität (insbesondere durch das gute Wachstum und die Reproduktion) der Produkte, die auf den modifizierten Pflanzen exprimiert sind, einschränkt.
  • Die rekombinanten Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können des Weiteren Signale zur Adressierung aufweisen, welche die Verbesserung der Adressierung der synthetisierten Proteine zu den Zellabteilungen ermöglichen, wo sie ihre Wirksamkeit entfalten. Wenn das synthetisierte Produkt ein Produkt ist, das an dem Transfer der Alkylgruppen auf die Fettketten post-Elongation beteiligt ist, entfaltet das Protein seine Wirksamkeit in dem Cytoplasma und erfordert somit keine bestimmten Signale zur Adressierung. Wenn das Produkt auch in die Syn these der Fettketten eingeift, entfaltet es seine Aktivität im Innern der Chloroplasten und es kann vorteilhaft sein, ein Signal zu verwenden, das die Adressierung des Produkts in dem Chloroplast ermöglicht. Derartige Signale sind im Stand der Technik bekannt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine rekombinante Nukleinsäure, welche aufweist:
    • – eine Nukleinsäure, die für eine Methyl-Transferase kodiert, die geeignet ist, als Katalysator für den Transfer einer Methylgruppe zu der aliphatischen Kette einer ungesättigten Fettsäure zu dienen,
    • – einen Promotor, die in den Pflanzenzellen funktionell ist, zur Steuerung der Expression der Nukleinsäure und,
    • – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription.
  • In einer weiteren bestimmten Ausführungsform hat die Erfindung eine rekombinante Nukleinsäure zum Gegenstand, welche aufweist:
    • – eine Nukleinsäure, die für eine Malonyl-CoA Decarboxylase kodiert,
    • – einen Promotor, der in den Pflanzenzellen funktionell ist, zur Steuerung der Expression der Nukleinsäure und,
    • – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft gleichermaßen einen Vektor, welcher eine rekombinante Nukleinsäure wie zuvor beschrieben aufweist. Ein derartiger Vektor kann insbesondere ein Derivat des Ti-Vektors sein. Die Vektoren gemäß der Erfindung können verwendet werden, um bedeutende Mengen an rekombinanten Nukleinsäuren in den Zellen herzustellen oder um die entsprechenden Enzyme herzustellen oder um die Pflanzenzellen zu transformieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen alle Pflanzenzellen, welche eine rekombinante Nukleinsäure oder einen Vektor wie zuvor beschrieben aufweisen.
  • Die rekombinanten Nukleinsäuren oder Vektoren gemäß der Erfindung können auf jede dem Durchschnittsfachmann bekannte Technik in die Pflanzen eingebracht werden, und insbesondere durch chemische, physikalische oder biologische Techniken. Die chemischen Techniken umfassen zum Beispiel die Verwendung von Transfektanten, welche das Durchdringen der Zelle erleichtern. Physikalische Techniken sind zum Beispiel Elektroporation, Beschuss, "Gene-Guns" etc. Eine wohlbekannte und besonders wirksame biologische Technik besteht darin, Infiltrationen unter Vakuum oder Cokultur, virale Vektoren oder bevorzugt Agrobacterium tumefaciens, zu verwenden, was ermöglicht, genetisches Material in die Pflanzenzellen mit Hilfe von Plasmid Ti einzubringen. Diese Techniken sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Nach der Transformation werden die Pflanzenzellen, die wirksam die Nukleinsäure gemäß der Erfindung enthalten, ausgewählt. Diese Zellen können dann in Kultur gehalten werden, gegebenenfalls in Kultur vermehrt werden und direkt für die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren (Batch-Kulturen, Fed-Batch, etc.) verwendet werden. Die Zellen können ebenfalls im Hinblick auf spätere Verwendung gelagert werden. Die Zellen können gleichermaßen verwendet werden, um transgene Pflanzen gemäß in der Pflanzenbiologie herkömmlichen Techniken wiederherzustellen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die in der Lage ist, verzweigtkettige Fettsäuren herzustellen, welches das Einbringen einer rekombinanten Nukleinsäure wie oben beschrieben in eine Zelle oder einen Teil der Pflanze und das Wiederherstellen einer transgenen Pflanze aus diesen Zellen oder Teilen von Pflanzen aufweist. Vorteilhafterweise wird das Einbringen unter Verwendung eines Agrobacteriums durchgeführt. In einer bestimmten Ausführungsform wird das Einbringen in Pflanzenzellen oder Blattscheiben durchgeführt. Die Wiederherstellung wird auf jede dem Durchschnittsfachmann bekannte Weise bewirkt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, deren Zellen eine rekombinante Nukleinsäure wie oben beschrieben enthalten und für Enzyme kodieren, die es ermöglichen, die Verzweigung nach Synthese der von der Pflanzenzelle hergestellten Fettsäure zu bewirken oder zu stimulieren, oder Sequenzen, welche es ermöglichen, das Einbringen verzweigter Gruppen während der Elongation in die aliphatische Kette von Fettsäuren zu bewirken oder zu stimulieren.
  • Die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung enthalten die rekombinante Nukleinsäure, die auf stabile Weise in ihr Genom integriert ist, sowohl in die Keimzellen als auch in die somatischen Zellen.
  • Die Erfindung betrifft gleichermaßen jedes pflanzliche Material, das aus einer derartigen Pflanze hervorgeht, und insbesondere die Samen.
  • Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren durch Kultur einer Zelle wie oben beschrieben und zum Wiedergewinnen der hergestellten Fettsäuren.
  • Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren durch Zellkultur einer Pflanzenzelle, welches aufweist:
    • – die Kultur der Zellen in einem Medium, das für ihr Wachstum geeignet ist,
    • – die Extraktion und Reinigung verzweigtkettiger Fettsäuren aus der Zell-Biomasse und insbesondere aus den Zellen oder dem Überstand der Kultur.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren durch Extraktion aus einer transgenen Pflanze, deren Zellen eine rekombinante Nukleinsäure wie oben beschrieben enthalten, gemäß welchem die Fettsäuren aus jedem Teil der Pflanze wiedergewonnen werden, und insbesondere den Samen der Pflanze.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren aus einer transgenen Pflanze, deren Zellen eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, welches aufweist:
    • – die Kultur der transgenen Pflanzen auf einem Feld;
    • – das Wiedergewinnen von Samen der Pflanzen;
    • – die Extraktion von Fettsäuren aus den Samen.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung ist insbesondere für die Herstellung methylierter nicht cyclischer Fettsäuren, insbesondere von Fettsäuren mit C16 oder C18, die eine oder mehrere Methylgruppen tragen, geeignet. Als bevorzugte Beispiele können die Methyl-9-octadecansäure, Methyl-10-octadecansäure, Methyl-9-hexadecansäure und Methyl-10-hexadecansäure genannt werden.
  • Bei den Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren wie oben beschrieben kann ein nicht-obligatorischer Schritt zur Behandlung der Fettsäuren durchgeführt werden, um weiter die physiko-chemischen Eigenschaften der Verbindungen zu verbessern. Folglich weisen die Verfahren gemäß der Erfindung insbesondere auf:
    • – einen Schritt der Extraktion verzweigtkettiger Fettsäuren aus Zellen, Samen oder Pflanzen und
    • – einen Schritt der Behandlung der Fettsäuren, um ihre physiko-chemischen Eigenschaften zu verbessern.
  • Die Extraktion kann durch die weiter oben genannten, herkömmlichen, dem Durchschnittsfachmann bekannten Methoden durchgeführt werden.
  • Noch bevorzugter ist der Schritt der Behandlung ein Schritt der Hydrierung, durchgeführt unter Standard- oder strengen Bedingungen, was zu der Bildung gesättigter verzweigtkettiger Fettsäuren führt. Genauer kann die Hydrierung unter Bedingungen durchgeführt werden, die von Christie W. W. (Topics in Lipid Chemistry, 1970, Bd. 1, FD Gunstone, Hrsg., London: Logus Press) beschrieben werden, hier durch Bezugnahme eingeschlossen, gegebenenfalls in Gegenwart eines Katalysators aus Palladium.
  • Die Erfindung betrifft allgemeiner die Verwendung einer transgenen Pflanze, die aus einer Zelle wie oben beschrieben wiederhergestellt wurde, für die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren.
  • Die Erfindung betrifft gleichermaßen die Verwendung einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, von der/dem wenigstens bestimmte der Zellen eine rekombinante Nukleinsäure wie zuvor beschrieben aufweisen, für die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren.
  • Die Erfinder haben insbesondere aufgezeigt, dass die Ester verzweigtkettiger Fettsäuren wie in der Erfindung beschrieben eine gute Resistenz gegen Oxidation und niedrige Pourpoints aufweisen und somit für eine Verwendung als Schmiermittel vorteilhafte Eigenschaften besitzen.
  • Die Ester von verzweigtkettigen Fettsäuren wie zuvor beschrieben können als Schmiermittel verwendet werden, insbesondere für die Herstellung von Olzusammensetzungen, besonders Motoröl und Hydrauliköl, insbesondere, indem die nicht-herkömmlichen oder synthetischen Basen (wie beispielsweise die Ester, Polyalphaolefine etc.) ersetzt werden.
  • Eine Schmiermittelzusammensetzung kann verzweigtkettige Fettsäuren wie oben beschrieben und ein oder mehrere Additive, wie insbesondere Anti-Verschleißmittel, Druckmodifikatoren, Tenside etc. aufweisen.
  • Die vorliegende Anmeldung wird detaillierter mittels der folgenden Beispiele beschrieben, die als darstellend und nicht beschränkend betrachtet werden müssen.
  • ZEICHNUNGSFIGUREN
  • 1: Darstellung der Synthese von Fettsäuren in dem Chloroplast von Pflanzenzellen
  • 2: Darstellung einer rekombinanten Nukleinsäure mit einem Gen, das für eine Transferase unter Steuerung des Promotors CaMV 35S (2A) oder nos (2B) kodiert.
  • 3: Darstellung einer rekombinanten Nukleinsäure mit einem Gen, das für die SAM-Synthase kodiert.
  • 4: Restriktionskarte des Gens cfa
  • 5: Darstellung einer Kassette zur Regulierung eines Gens, das in der Lage ist, die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren zu stimulieren.
  • 6: Schema der Konstruktion der Kassette zur Regulierung des Gens cfa.
  • 7: Konstruktion des Vektors pTDEcfa.
  • 8: Transformation der Blattscheiben und Wiederherstellung der Pflanzen. A: Cokultur Agrobakterien-Blattscheiben; B: zweite Woche der Kultur; C: fünfte Woche der Kultur; D: Anwachsen der Sprosse; E: in vitro vermehrter Keimling.
  • 9: Darstellung einer rekombinanten Nukleinsäure mit einem Gen, das für Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert.
  • BEISPIEL A: KONSTRUKTION EINER GENETISCH MODIFIZIERTEN PFLANZENZELLE, DIE GEEIGNET IST, DURCH ALKYLIERUNG POST-ELONGATION VERZWEIGTKETTIGE FETTSÄUREN ZU ERZEUGEN
  • In diesem Beispiel wird die Konstruktion genetisch modifizierter Pflanzen dargestellt, die geeignet sind, durch Alkylierung post-Elongation, genauer durch Methylierung post-Elongation, verzweigtkettige Fettsäuren herzustellen. Insbesondere wird mit diesem Beispiel das Einsetzen durch Gentechnik in das Genom der Pflanze eines Gens oder einer Einheit von Genen beschrieben, die kodieren für:
    • – einerseits eine oder mehrere Transferasen, zum Beispiel Methylasen oder Methyltransferasen (zum Beispiel der Art Cyclopropanfettsäuresynthase, d.h. CFA-Synthase), die geeignet sind, als Katalysator für die Addition von Methylgruppen (oder anderen Alkylen: Ethyl, Propyl, Isopropyl ...) an die Doppelbindungen ungesättigter Fettsäuren zu wirken; und
    • – andererseits ein oder mehrere Gene, die es ermöglichen, den Pool an Donatorgruppen von Methyl (S-Adenosylmethionin, d.h. SAM) zu erhöhen, insbesondere für das Gen, das für S-Adenosylmethionin-Synthetase (SAM-Synthetase) kodiert.
  • Die Konstruktion der transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung wird gemäß den folgenden Schritten durchgeführt.
  • SCHRITT 1: VERWENDETES PFLANZLICHES MATERIAL
  • Pflanzenmodelle von Tabak der Art SR1 (Horsch et al., 1985 Science, 22, 1229-1231) oder BY2 (Nagata et al., 1992 Int. Rev. Of Cytol., 132, 1-30) werden zu einem ersten Zeitpunkt verwendet, um die Versuche durchzuführen. Die beiden Modellgattungen sind nämlich leicht durch Agrobacterium tumefaciens (Van Lijsebettens et al., 1986, J. Mol. Biol., 188, 129-145; Shaul et al. 1986; Shaul et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4868-4872) transformierbar und ermöglichen die Wiederherstellung neuer Pflanzen. Alle Ölpflanzen wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Erdnuss, Soja, Mais etc. können selbstverständlich auf gleiche Weise verwendet werden.
  • SCHRITT 2: GENKONSTRUKTIONEN
  • Die genetische Transformation besteht darin, eine rekombinante Nukleinsäure einzubringen, welche eine Expressionskassette aufweist, die das zu transferierende Gen, den Expressionspromotor dieses Gens, der eine konstitutive, räumliche oder zeitliche Expression ermöglichen kann, sowie eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription aufweist. Nachstehend sind unterschiedliche verwendete genetische Elemente beschrieben sowie die Konstruktion der entsprechenden rekombinanten Nukleinsäuren (2 und 3).
  • 2.1. Auswählen und Isolieren der Nukleinsäuren, die für die Enzyme kodieren.
  • In diesem Beispiel werden Nukleinsäuren verwendet, die für die Methylasen oder die Methyltransferase aus einem prokaryoten oder enkaryoten Organismus kodieren, deren kodierende Sequenzen analog zu der Sequenz sind, die für die Cyclopropanfettsäure-Synthase kodiert, beschrieben von Wang et al. (1992 Biochemistry, 31, 11020-11028). Genauer wird eine Nukleinsäure, die für Cyclopropanfettsäure-Synthase kodiert, isoliert und ihre Sequenz überprüft.
  • Des Weiteren kann, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu verbessern, in einer bestimmten Ausführungsform eine zweite Nukleinsäure verwendet werden, die für die SAM-Synthetase kodiert, deren Nukleotidsequenz von Peleman et al. (1989 Plant Cell, 1, 81-93) beschrieben wird.
  • 2.2. Auswahl der Promotorregionen
  • Für die Konstruktion rekombinanter Nukleinsäuren können verschiedene Arten von Promotoren verwendet werden, und insbesondere jeder Promotor, der in den Pflanzen funktionell ist und die Steuerung der Expression der Gene ermöglicht.
  • Zu diesem Zweck können die Promotoren genannt werden, die eine in den Samen (oder bestimmten Samengeweben) der Pflanze lokalisierte Expression ermöglichen, wie insbesondere der Promotor des Gens, das für Prolamin kodiert (Zhou et al., Transgenic Res. 2 (1993) 141), der Promotor des Gens, das für Lectin von Erbsen kodiert (Pater et al., Plant J. 6 (1994) 133), der Promotor des Gens, das für LEA kodiert ("Late Embryogenesis Abundant protein") (Goupil et al., Plant. Mol. Biol. 18 (1992) 1049), der Promotor des Gens, das für die Familie der Napin-Proteine (NAP) kodiert (Boutilier et al., Plant. Mol. Biol. 26 (1994) 1711), der Promotor des Gens, das für Gluterin von Reis kodiert (Zhao et al., Plant. Mol. Biol. 25 (1994) 429), der Promotor des Gens, das für Oleosin kodiert (Keddie et al., Plant. Mol. Biol. 19 (1992) 443), der Promotor des Gens, das für die Familie S der Lagerproteine kodiert (Promotor 2S des Gens napA, Promotor 11S oder 12S des Gens von Globulin), der Promotor des Gens, das für Beta-Phaseolin, Legumin, Gamma-Conglutin, Concanavalin A, Desaturase Bn10 (Plant. Physiol. 104, 1167), Alpha/Beta-Gliadin von Weizen, Katalase CatA von Reis, Alpha-Kafirin von Sorgtium oder auch Adh1 von Mais (Kyozuka et al., Plant Cell 6 (1994) 799) oder das Protein SBP65 von Erbsen (Dehaye et al., Plant Mol. Biol. 65 (1997) 605) kodiert.
  • Die in diesem Beispiel verwendeten Promotoren sind der Promotor 35S des Mosaikvirus von Blumenkohl und der Promotor des Gens von Nopalinsynthase (nos). Die Struktur dieser Promotoren wurde zum Beispiel von Benfey und Chua (1990, Science, 250 959-966) beschrieben.
  • 2.3. Auswahl der die Transkription terminierenden Regionen.
  • In diesem Beispiel stammen die verwendeten, die Transkription terminierenden Regionen entweder direkt von dem verwendeten Gen (3) oder von den Genen der Nopalinsynthase (nos) und der Octopinsynthase (ocs).
  • 2.4. Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuren (Vektoren).
  • Um rekombinante Nukleinsäuren zu konstruieren, die es ermöglichen, die oben beschriebenen Elemente in Pflanzenzellen einzubringen, werden die genetischen Elemente zuallererst isoliert und in Vektoren zum Klonen der Art pBR322 und pUC unterkloniert, die Marker tragen, welche die Auswahl der Transformanten ermöglichen, die eine Widerstandsfähigkeit gegen cytotoxische Mittel wie beispielsweise Antibiotika, Toxine etc. verleihen. Die Expressionskassetten werden dann in binäre Vektoren eingebracht, welche die Sequenzen enthalten, die für die Transformation der Pflanze erforderlich sind, insbesondere den Vektor T-DNA. Dieser Vektor wird für die Transformation von Pflanzen verwendet, und die Struktur der Vektoren, welche die zur Wiedererkennung spezifischen Sequenzen (RB und LB) enthalten, wurde reichlich in der Literatur beschrieben (Buch von Hoekema, the binary Plant Vector Systems, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985. Molocular genetics of the Bacteria-Plant In teraction, Puhler A., Hrsg., Springer-Verlag, NY, 1983. Plant Genetic Transformation and Gene expression: A Laboratory Manual Draper J., Scott R., Armitage P. und Walden R., Hrsg., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988. Kahl G. und Weising K., (1993) Genetic engineering of plant cells. In Biotechnology: Genetics Fundamentals and genetic Engineering. Rehm H.J., Reed G., Pühler A. und Stadler P., Hrsg., VCH Publishers Inc., New York (USA) Bd 2, S. 547-659).
  • Die Struktur der so hergestellten rekombinanten Nukleinsäuren ist in den 2 und 3 dargestellt.
  • In einem anderen bestimmten Beispiel wurde der Binärvektor pTDEcfa wie folgt konstruiert.
  • a) Klonen und Charakterisierung des Gens cfa, das für Cyclopropanfettsäure-Synthase kodiert.
  • Beim Lesen der Arbeiten von Wang (Wang et al., 1992) wurde eine Zweideutigkeit festgestellt bezüglich der Größe des Fragments ClaI, das in dem Plasmid pAYW19 vorhanden ist. Weiterhin stellt Wang et al. (1992) in der Strategie zur Sequenzierung das Fragment ClaI mit einer einzigen Stelle der Restriktion für das Enzym HindII aufwärts der Stelle ClaI dar. Jedoch ist gemäß der veröffentlichten Sequenz diese Stelle abwärts der Stelle ClaI. In einem ersten Schritt galt es somit, die Integrität zu überprüfen und die gesamte Struktur des Gens cfa zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde eine Restriktionskarte des Gens cfa, vorhanden in dem Plasmid pAYW19, mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen durchgeführt. Die Analyse der Größe der nach Restriktion erhaltenen Fragmente, Elektrophorese in Agarosegel und Färbung der Fragmente mit Ethidiumbromid hat ermöglicht, die physikalische Karte dieses Gens zu errichten, welche in 4 dargestellt ist. Die Ergebnisse wurden durch die Sequenzierung des Fragments abwärts der Stelle HindII bestätigt. Die vollständige und korrigierte Sequenz des Gens cfa wurde computerisiert und in ein Programm (DNA strider) eingebracht, welches das Studium der Restriktionsstellen ermöglicht.
  • b) Konstruktion des Binärvektors pTDEcfa
  • In diesem Beispiel wird die Konstruktion des Binärvektors pTDEcfa beschrieben, der eine Expressionskassette des korrigierten Gens cfa trägt, eingefasst von den Regionen LB und RB des Plasmids Ti. Dieser Binärvektor ermöglicht durch A. tumefaciens den Transfer der Kassette in das Genom von pflanzlichen Zellen.
  • i) Konstruktion des Plasmids pBSgus
  • Das Plasmid pBSgus wurde gebildet durch Klonen des Fragments EcoRI-HindIII, hervorgegangen aus dem Binärvektor pTDE4, in den Vektor pBS (pBluescript, BRL), der nur sehr wenige Restriktionsstellen enthält. Das Fragment EcoRI-HindII enthält den Promotor p35S und den Terminator 3'nos. Der gebildete Vektor, pBSgus, enthält somit die einzigen Restriktionsstellen für die Enzyme NcoI und NruI. Diese beiden Enzyme ermöglichen, das Gen gus zu isolieren, wobei die Integrität der Regulatorsequenzen (p35S und 3'nos) bewahrt bleibt.
  • ii) Erstellen der Expressionskassette des korrigierten Gens cfa
  • Die Grundlagen dieses Schritts beruhen auf dem Ersetzen des Gens gus des Plasmids pBSgus durch eine Klonstelle, welche einzige Stellen aufweist. Diese Kassette wurde durch PCR aus pBSgus erzeugt und enthält den Promotor p35S und den Terminator 3'nos. Die für die PCR erforderlichen Primer wurden derart gewählt, dass sie die in 5 dargestellte Struktur erzeugen. Die Wahl der beiden einzigen Restriktionsstellen wird bedingt durch die Notwendigkeit, dass sie ohne p35S, 3'nos, den Vektor zum Klonen, in den die Struktur integriert wird, und das Gen cfa, das zwischen die beiden Regulatorsequenzen integriert wird, sind. Nach Analyse der unterschiedlichen Sequenzen wurden zwei mögliche Stellen identifiziert: NheI und NruI. Die Konstruktion der Kassette wurde wie folgt durchgeführt (6):
    • – Klonen der Regulationskassette in pGEM-T, um den Vektor pGEM(355-3'nos) zu erhalten
    • – Herstellen durch PCR von Stellen NheI aufwärts des Gens cfa und NruI abwärts des Gens cfa
    • – Klonen des PCR-Produkts in den Vektor pGEM-T, um den Vektor pGEMcfa zu erhalten
    • – Sequenzierung der Vektoren pGEM(35S-3'nos) und pGEMcfa.
    • – Klonen des Fragments NheI-NruI, das von dem Vektor pGEMcfa stammt, in den Vektor pGEM(355-3'nos), indem das Fragment NheI-NruI entfernt wurde. Der Vektor, der durch das Klonen erhalten wurde, wird pGEM(35S-cfa-3'nos) genannt.
    • – Ausgehend von dem Vektor pGEM(35S-cfa-3'nos) ist es möglich, ein einziges Fragment EcoRI-HindII zu isolieren, welches die Sequenz pGEM(35S-cfa-3'nos) enthält.
  • Nach Optimierung der PCR-Bedingungen für die Erzeugung der Regulationskassette (6) wurde diese in den Vektor pGEM-T geklont. Ebenfalls nach Analyse durch Restriktion mit unterschiedlichen Enzymen ist der Vektor pGEM(35S-3'nos) in zwei Klonen verfügbar.
  • Auf gleiche Weise wurde der Vektor pGEMcfa erhalten, und zwei Klone wurden wiedergewonnen.
  • Die gewünschte Sequenz der Vektoren pGEM(35S-3'nos) und pGEMcfa wurde computerisiert und dann in das Programm DNAstrider eingebracht. Zwei Klone für jeden Vektor wurden an die Firma Génome express gesendet, um sequenziert zu werden.
  • Die Ergebnisse der Sequenzierung wurden für die beiden Klone (2 und 3) erhalten, die theoretisch den Vektor pGEMcfa enthalten. Nach Ausrichtung mit der theoretischen Sequenz weist die Sequenz des Vektors, die in dem Klon 2 enthalten ist, mehrere Mutationen auf, und somit konnte dieser Klon in der Folge nicht verwendet werden. Die Sequenz des Vektors, der in dem Klon 3 enthalten ist, enthält eine Mutation, jedoch ist diese Mutation eine Mutation, die "still" genannt wird, da sie keine Auswirkung auf die Sequenz des Proteins CFA hat.
  • Die Ergebnisse bezüglich des Klons 3, der den Vektor pGEM(355-3'nos) enthält, sind nicht sehr ermutigend, da der in diesem Klon enthaltene Vektor mehrere Mutationen aufweist. Jedoch sind die Mutationen relativ weit entfernt von Sequenzen, die für eine gute Funktion des Promotors p35S und des Terminators 3'nos unverzichtbar sind. Weiterhin konnte der Klon 4 nicht sequenziert werden. Eine neue Auswahl wurde folglich unter den Klonen durchgeführt, die den Vektor pGEM(355-3'nos) enthalten, und der Klon 10 wurde für eine Analyse seiner Sequenz ausgewählt.
  • Folglich wurde die Sequenzierung des Vektors pGEM(355-3'nos), der in dem Klon 10 enthalten ist, durchgeführt. Bei der Methode zur Sequenzierung durch PCR wurden drei Primer (T7, SP6 und ein Primer nahe der Sequenz poly CCC) verwendet. Die erhaltene Sequenz wurde mit der theoretischen Sequenz verglichen. Die beiden Fehler, die direkt vor der Stelle HindIII aufgedeckt wurden, schienen Fehler in der theoretischen Sequenz und nicht der Sequenzierung zu sein, da sie in den Sequenzen der Vektoren pGEM(355-3'nos), die in den zuvor sequenzierten Klonen 3 und 4 enthalten sind, wiedergefunden wurden.
  • Auf Grundlage der Ergebnisse der Sequenz wurde das Fragment NheI-NruI, hervorgegangen aus dem Vektor pGEMcfa, enthalten in dem Klon 3, in den Vektor pGEM(35S-3'nos) geklont, der in dem Klon 10 auf Höhe der Stellen NheI und NruI enthalten ist. Der erhaltene Vektor wurde pGEM(35s-cfa-3'nos) genannt. Unter den erhaltenen Klonen wurde eine Auswahl durchgeführt, indem mehrere Restriktionsenzyme verwendet wurden. Der Klon 13 wurde für das Klonen verwendet.
  • iii) Konstruktion des Binärvektors
  • Der Binärvektor ist ein Vektor, welcher die Sequenzen LB und RB des Plasmids Ti aufweist, die für den Transfer der Gene in die Pflanzenzellen mittels Agrobacterium tumefaciens erforderlich sind. Der Binärvektor pTDEcfa wurde wie folgt konstruiert (7):
    • – Klonen des Fragments HindIII-EcoRI, hervorgegangen aus dem Vektor pGEM(355-cfa-3'nos)13, in den Binärvektor ptde4, an dem das Fragment HindIII-EcoRI entfernt wurde. Der erhaltene Vektor wird pTDEcfa genannt. Unter den erhaltenen Klonen wurde eine Auswahl durchgeführt, indem mehrere Restriktionsenzyme verwendet wurden. Der Klon 8 wurde zurückbehalten, um die triparentale Konjugation zu bewirken.
    • – Der Klon, der den Vektor pTDEcfa (Klon 8) enthält, wurde verwendet, um eine Menge DNA herzustellen, die in einem Southern-Blot-Versuch getestet wurde. Bei diesem Versuch wurde die Sonde, die durch Hybridisierung DNA-DNA das Vorhandensein des Gens cfa aufdeckt, ausgehend von dem Anfangsvektor pAYW19 realisiert. Durch diesen Versuch konnte unter Verwendung unterschiedlicher Restriktionsenzyme überprüft werden, dass das Gen cfa in den Binärvektor gut integriert wurde zwischen den 2 Regulatorsequenzen: Promotor und Terminator.
  • Der Binärvektor wird dann in das Bacterium A. tumefaciens unter Standardbedingungen transferiert.
  • SCHRITT 3: TRANSFORMATION DER PFLANZE
  • Zu einem ersten Zeitpunkt wurden Protoplasten, Pflanzenzellen, Gewebe von Tabak oder Tabakpflanzen genetisch durch die oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuren transformiert unter Verwendung indirekter Transfermethoden mittels eines Vektors wie beispielsweise Agrobakterien (zum Beispiel Agrobacterium tumefaciens: C58C1Rif pGV2260; Deblaere et al., 1985), oder indem die direkten Transformationsmethoden verwendet werden (Elektroporation, Beschuss mit Partikeln, Infiltration unter Vakuum etc. (Kahl und Weising, 1993)).
  • In dem Fall der Verwendung des indirekten Gentransfers enthalten die Agrobakterien ein Plasmid, welches die Regionen vir (inaktiviertes Plasmid Ti) aufweist, die für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzellen erforderlich sind.
  • In einem ersten nicht-obligatorischen Schritt werden die Zellen durch eine rekombinante Nukleinsäure transformiert (3), die für die SAM-Synthetase kodiert. Die Transformanten, die ein stark methylisierendes Potential aufweisen, werden dann ausgewählt.
  • Diese Linien oder noch nicht transformierte Zellen, werden dann genetisch transformiert, um in ihr Genom eine rekombinante Nukleinsäure einzusetzen, die das Gen enthält, das für die zuvor beschriebene CFA-Synthetase kodiert.
  • Das zur Durchführung dieser Transformationen verwendete Protokoll wurde beschrieben von Van Lijsebettens et al. (1986 J. Mol. Biol., 188, 129-145) oder in der Literatur verzeichnet (Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual. Draper J., Scott R., Amritage P., und Walden R., Hrsg., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Kahl G. und Weiding K. (1993) Genetic engineering of plant cells. In Biotechnology: Genetics Fundamentals and genetic Engineering. Rehm H.J., Reed G., Pühler A. und Stadler P., Hrsg., VCH Publishers Inc., New York (USA) Bd 2, S. 547-659).
  • In einem bestimmten Beispiel wurden die undifferenzierten Zellen von Tabak der Varietät BY2 für die genetische Transformation verwendet. Die Zellen werden in einem flüssigen Nährmedium in vitro gehalten. Alle 10 Tage werden 10 ml Zellen entnommen, um 100 ml Medium in einen Erlenmeyerkolben von 500 ml zu impfen. Der Erlenmeyer wird in einem Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 140 U/min bei völliger Dunkelheit und 24°C angeordnet. Die Transformation wurde an Zellen durchgeführt, die 3 Tage alt sind. 2 ml Zellen werden entnommen und mit 100 μl einer Kultur transformierender Agrobakterien, Alter 24h, geimpft. Die optische Dichte von λ = 600 nm der verwendeten Agrobakterienkultur wird auf 1,5 Einheiten angepasst. Die Cokultur Agrobakterien/Pflanzenzellen wird in kleinen Petrischalen für 2 Tage bei 24°C und völliger Dunkelheit durchgeführt. Nach der Cokultur werden die Pflanzenzellen reichlich mit dem Nährmedium gespült, um die meisten Agrobakterien zu entfernen. Die Pflanzenzellen werden dann auf einem festen (gelifizierten) Medium kultiviert. Das Medium enthält Cefotaxim, wodurch ermöglicht wird, die Reste von Agrobakterien zu entfernen. Es enthält gleichermaßen Kanamycin, wodurch ermöglicht wird, die Pflanzenzellen auszuwählen, in deren Genom das Fragment LB-RB des Binärvektors eingesetzt ist und die das Gen exprimieren, was die Resistenz gegen Kanamycin verleiht.
  • Nach 2 bis 3 Wochen der Kultur haben sich die Pflanzenzellen entwickelt, die gegenüber Kanamycin resistent sind. In diesem Stadium kann eine Menge Biomasse entnommen werden, die ausreichend ist, in einem flüssigen Medium kultiviert zu werden, um die Herstellung von Biomasse zu beschleunigen, wobei der Selektionsdruck (Kanamycin-Cefotaxim) bewahrt bleibt. Nach mehreren Kulturcyclen wurde für einen Teil der Biomasse der Selektionsdruck in dem Kulturmedium entfernt, um die Flüssigkeitsprofile dieser Suspension mit jenen von unter gleichen Bedingungen ohne Selektionsdruck kultivierten Kontrollzellen zu vergleichen.
  • Auf diese Weise konnte eine Zellsuspension erhalten werden, die gegenüber Kanamycin resistent ist. Das Vorhandensein des Gens, das für CFA kodiert, konnte gleichermaßen in dem genetischen Material dieser Suspension bestätigt werden. Dazu wurden Extraktionen von DNA (Dellaporta et al. Plant Mol. Biol. Rep. 1 (1983) 19) durchgeführt und einem PCR-Test unter Verwendung von für das Gen cfa spezifischen Primern unterzogen. Das positive Ergebnis der PCR zeigt das Vorhandensein eines Streifens von erwarteter Größe, die dem Gen cfa entspricht.
  • In einem anderen bestimmten Beispiel wurden Blattscheiben mit einem Durchmesser von 0,5 cm aus Tabak der Varietät SR1 hergestellt, in vitro kultiviert und transformiert. Kurz gesagt wurden die Scheiben 24h auf einem festen (gelifizierten) Medium zur Zell-Entdifferenzierung kultiviert. Sie wurden dann durch Eintauchen in eine Kultur transformierender Agrobakterien, Alter 24h, deren optische Dichte λ = 600 nm auf eine Einheit angepasst wurde, geimpft.
  • SCHRITT 4: KULTUR UND AUSWAHL DER TRANSFORMIERTEN PFLANZEN.
  • Die durch die Vektoren, die die zuvor beschriebenen Konstrukte enthalten, transformierten Pflanzenzellen wurden dann aus den isolierten Zellen, von Kallussen oder Blattscheiben wiederhergestellt, indem für die Kultur von Pflanzen herkömmliche Techniken verwendet wurden (Plant Cell Culture: A practical Approach. Dixon R.A. Hrsg., IRL Press, Oxford, Washington DC., 1985). Die transformierten Zellen und Pflanzen werden entsprechend herkömmlichen und in der Literatur beschriebenen Verfahren kultiviert. Die Selektion transformierter Zellen und Pflanzen wird bei ihrer Kultur durchgeführt, auf einem selektiven Medium, welches ein Antibiotikum oder Toxin enthält, das für die eingebrachte Kassette spezifisch ist.
  • In einem bestimmten Beispiel wurden die zuvor beschriebenen Blattscheiben auf sterilem Löschpapier abgeschöpft, dann für 2 Tage bei 24°C und völliger Dunkelheit auf dem gleichen festen Medium zur Zell-Entdifferenzierung cokultiviert. Nach Cokultivierung wurden die Scheiben eine 1/2 Stunde in dem Medium zur Induktion der Sprosse gespült, welches Cefotaxim und Kanamycin enthält. Schließlich wurde die Induktion der Sprosse auf dem gleichen festen Medium durchgeführt. Jede Woche wurden die Scheiben entnommen, gespült und erneut auf dem gleichen Medium, das augenblicklich hergestellt wurde, kultiviert.
  • Nach 4 bis 5 Wochen wurden die Sprossen, die sich entwickeln, entnommen und auf einem Medium zum Anwachsen kultiviert, welches Cefotaxim und Kanamycin enthält.
  • Die verschiedenen Schritte dieser Transformation sind in 8 dargestellt.
  • Ungefähr fünfzig Sprosse konnten auf diese Weise erhalten werden, von denen ungefähr zwanzig auf selektivem Medium angewachsen wurden. Die Keimlinge wurden durch Stecklingsfamilien vermehrt, um ausreichend Biomasse herzustellen, um die PCR-Überprüfungen durchzuführen, welche das Vorhandensein des Gens cfa beweisen, und um alle Lipide zu extrahieren.
  • SCHRITT 5: ANALYSE DER TRANSFORMANTEN
  • Die so hergestellten Transformanten wurden dann auf mehreren Ebenen analysiert:
    • a) – Direkanalyse, welche das Vorhandensein des Gens in der Pflanzenzelle oder der Pflanze bestätigt, entweder ausgeführt durch Southern-Blot oder PCR-Analysen, welche die Extraktion von genomischer DNA erfordern. (Protokoll beschrieben im Sambrook und/oder dem Current Protocol). Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T. in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Irwin N., Ford N., Nolan C. und Ferguson M., Hrsg., Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989. Current protocols in Molecular Biology. Ausubel F. M. Brent R. Kingston R.R., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. und Struhl K., Hrsg., Current Protocols Inc Wiley, Massachusetts..., Bd 1: Molecular Biology – Techniques. 1994 und Bd 2: Molecular Biology – Laboratory. 1994.
    • b) – Analyse des Produkts des Gens, d.h. mRNA, durch Northern-Blot und Bestätigung der Transkription des Gens (Protokoll beschrieben im Sambrook und/oder dem Current Protocol wie oben angeführt).
    • c) – Analyse des synthetisierten Proteins, des Enzyms (zur Bestätigung der Übersetzung des Gens in ein Protein) und Ermöglichung der Überprüfung der Funktionalität desselben (enzymatische Dosierung Immuno-Blot, Western-Blot).
  • Die Dosierung der SAM-Synthetase und des SAM-Pools in den Zellen wird genauer unter Berücksichtigung des von Mathur und Sachar (1981 FEBS Lett., 287, 113-117) beschriebenen Protokolls durchgeführt.
  • Die Dosierung der CFA-Synthetase in den Zellen und Tabakpflanzen wird entsprechend dem von Taylor und Cronan (1979 Biochemistry, 18, 3292-3300) beschriebenen Protokoll durchgeführt.
    • d) – Die Analyse und Identifizierung synthetisierter Triglyceride wird durchgeführt unter Verwendung von Chromatographietechniken der Art HPLC, GC-MS oder durch NMR nach Extraktion unter Verwendung der in der Literatur verwendeten Protokolle.
  • Die Versuche ermöglichen, zu überprüfen, dass die rekombinanten Nukleinsäuren funktionell sind, dass sie in die Pflanzenzellen eingebracht werden können, dass die Zellen wiederhergestellt werden können und dass die Zellen wirksam verzweigtkettige Fettsäuren herstellen. In der Folge können die Säuren direkt in den entsprechenden Pflanzensamen auf bekannte Extraktionstechniken wiedergewonnen werden.
  • In einem bestimmten Beispiel wurden die Lipide aus den zuvor erhaltenen Pflanzen extrahiert (Samen, Blätter oder Zellsuspensionen), indem die von Browse et al. (Anal. Biochem. 152 (1986) 141) beschriebene Technik verwendet wurde. Die erhaltenen Lipide wurden durch das Verfahren von Fisher und Cherry (Lipids 18 (1983) 589) umgeestert. Bei dieser Methode wird Tetramethylammoniumhydroxyd zu 20% in Methanol verwendet. Sie ist nicht-destruktiv, wirksam und perfekt für die Methanolyse der ungewöhnlichen Öle geeignet. Die Methylester der so erhaltenen Fettsäuren wurden dann durch Gasphasenchromatographie analysiert.
  • Die Lipidanalysen wurden zu einem ersten Zeitpunkt auf Extrakten von Zellsuspensionen BY2, transformiert und nicht transformiert, Alter 7 Tage, durchgeführt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert (Medium ohne Selektionsdruck, Schütteln bei 140 U/min, 24°C, völlige Dunkelheit). Diese Analyse ermöglicht, das Extraktionsverfahren aller Lipide auf den Zellsuspensionen zu validisieren.
  • In der Folge hat der Vergleich der Lipidextrakte, die aus den Zellsuspensionen BY2 und aus den Tabakblättern SR1, transformiert und nicht transformiert, unter unterschiedlichen Bedingungen (mit oder ohne Selektionsdruck, mit oder ohne Licht, Alter 7 oder 14 Tage) in dem transformierten Pflanzenmaterial das Vorhandensein von Verbindungen bewiesen, die die Struktur verzweigtkettiger Fettsäuren gemäß der Erfindung aufweisen.
  • Die Analyse durch Massenspektrometrie der erhaltenen Proben bestätigt, dass die erhaltenen Fettsäuren wohl die verzweigtkettigen Fettsäuren im Sinn der Erfindung aufweisen, d.h. wenigstens eine Substitution nicht-cyclischer Art besitzen. Die Ergebnisse zeigen insbesondere das Vorhandensein von Methyl-9- (und/oder 10) octadecansäure und/oder Methyl-9- (und/oder 10) hexadecansäure.
  • SCHRITT 6: BEHANDLUNG DER VERZWEIGTKETTIGEN FETTSÄUREN
  • In einem nicht obligatorischen Schritt werden die verzweigtkettigen Fettsäuren, die von dem Pflanzenmaterial gemäß der Erfindung erzeugt wurden, behandelt, um ihre physikochemischen Eigenschaften, insbesondere ihre Schmiereigenschaften, zu verbessern.
  • In einem bestimmten Beispiel weist diese Behandlung die Hydrierung der Fettsäuren auf, um den Anteil verzweigtkettiger Fettsäuren zu erhöhen und somit Zusammensetzungen mit einer gesteigerten Resistenz gegen Oxidation und niedrigen Pourpoints zu erhalten. Die Hydrierung wird unter dem Durchschnittsfachmann bekannten Bedingungen durchgeführt.
  • BEISPIEL B: KONSTRUKTION EINER GENETISCH MODIFIZIERTEN PFLANZENZELLE, DIE IN DER LAGE IST, VERZWEIGTKETTIGE FETTSÄUREN (MULTIVERZWEIGT) IM LAUFE DER ELONGATION HERZUSTELLEN
  • In diesem Beispiel wird die Konstruktion genetisch modifizierter Pflanzen dargestellt, die geeignet sind, multiverzweigte verzweigtkettige Fettsäuren herzustellen. Insbesondere wird in diesem Beispiel das Einsetzen durch Gentechnik in das Genom der Pflanze eines Gen oder einer Gesamtheit von Genen beschrieben, die die Pflanze dazu bringen, ein nicht lineares Acyl-CoA mit einer Anzahl Kohlenstoffatomen von mehr als 3 (beispielsweise Methylmalonyl-CoA) an Stelle von Malonyl-CoA zu verwenden, um verzweigtkettige Fettsäuren zu erhalten, die multiverzweigt genannt werden, wie beispielsweise 2,4,6,8-Tetramethyldecansäure. Die Synthese der Fettsäuren findet in den Chloroplasten statt, die eingesetzte rekombinante Nukleinsäure weist vorteilhafterweise ein Gen auf, das für eine Malonyl-CoA-Decarboxylase (E.C. Nr 4.1.1.9) kodiert, derart, dass das Enzym entweder auf Chloroplastebene aktiv ist oder auch auf einer anderen Ebene der Zelle. Diese wird entweder durch Einbringen der rekombinanten Säure in die Chloroplasten oder durch Einsetzen eines Transferpeptids, welches die Adressierung des Proteins in diesem Bereich ermöglicht, erreicht.
  • Die Konstruktion der transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung wird gemäß den folgenden Schritten durchgeführt (9).
  • SCHRITT 1: VERWENDETES PFLANZENMATERIAL
  • Das verwendete Pflanzenmaterial ist zu dem in Beispiel A beschriebenen identisch.
  • SCHRITT 2: GENKONSTRUKTIONEN
  • Die genetische Transformation besteht darin, eine Expressionskassette einzubringen, welche das zu transferierende Gen, den Expressionspromotor für dieses Gen, der eine konstitutive, räumliche oder zeitliche Expression ermöglichen kann, und eine zusätzliche Nukleotidse quenz aufweist, die für ein Transferpeptid kodiert, das die Adressierung des Proteins in einem Zellbereich ermöglicht, wo es aktiv sein kann.
  • 2.1. Auswahl und Isolierung von Nukleinsäuren, die für die Enzyme kodieren.
  • Verwendung des Gens, das für die Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert, deren Nukleotidsequenz von Kolattukudy et al. (1987) beschrieben wurde, oder allen anderen analogen Nukleotidsequenzen, die von anderen prokaryoten oder eukaryoten Organismen oder Mikroorganismen stammen.
    • Kolattukudy P.E. Rogers L.M., Poulose A.J., Jang S.H., Kim Y.S., Cheesbrough T.M. und Liggitt D.H. (1987) Developmental pattern of the expression of malonyl-CoA decarboxylase gene and the production of unique lipids in the goose uropygial glands. Arch. Biochem. Biophys., 256, 446-454.
    • Fernandese N.D. und Kolattukudy P.E. (1996) Cloning, sequencing and characterization of a fatty acid synthase-encoding gene from Mycobacterium tuberculosis var. bovis BCG. Gene, 170, 95-99.
  • In bestimmten Fällen sind die Bestandteile der Synthese von Fettsäuren in den Chloroplasten oder anderen Organellen lokalisiert. In diesem Fall muss das synthetisierte Enzym Malonyl-CoA-Decarboxylase in die Chloroplasten transportiert werden, um aktiv zu sein. Unseren Genkonstruktionen muss eine DNA-Sequenz hinzugefügt werden, die für ein operationelles Transferpeptid kodiert und von der Empfängerpflanze wiedererkannt wird. Diese Transferpeptide sind im Allgemeinen Leadersequenzen, die mit der Nukleotidsequenz des Gens verbunden mit einem spezifischen Promotor kombiniert werden müssen. Diese "Signal"-Sequenzen können durch beliebige andere Nukleotidsequenzen dargestellt werden, die von jener eines Gens stammen, das in das Cytoplasma exprimiert, bevor es seinen geeigneten Reaktionsbereich erreicht. Die DNA dieser Transferpeptide kann von anderen Pflanzen stammen. Dies kann zum Beispiel das Transferpeptid der kleinen Untereinheit von RUBISCO von Soja sein oder die Sequenzen, die für 6- oder 12-terminale Aminosäuren der kleinen reifen Untereinheit von RUBISCO von Erbsen, genannt in dem Patent von Calgene WO 94/29467 (Schema Typ 4), sein.
  • 2.2. Selektion der Promotorregionen
  • In diesem Beispiel sind die verwendeten Promotoren der Promotor 35S des Mosaikvirus von Blumenkohl und der Promotor des Gens der Nopalin-Synthase (nos). Die Struktur dieser Promotoren wurde zum Beispiel von Benfey und Chua (1990, Science, 250 959-966) beschrieben.
  • 2.3. Selektion der die Transkription terminierenden Regionen
  • In diesem Beispiel stammen die verwendeten Regionen, die die Transkription terminieren, von Genen der Nopalin-Synthase (nos) und Octopin-Synthase (ocs) (9).
  • 2.4. Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuren (Vektoren).
  • Um rekombinante Nukleinsäuren zu konstruieren, die es ermöglichen, die oben beschriebenen Elemente in Pflanzenzellen einzubringen, werden die genetischen Elemente zuallererst isoliert und in Vektoren zum Klonen der Art pBR322 und pUC unterkloniert, welche Marker tragen, welche die Auswahl der Transformanten ermöglichen, die eine Widerstandsfähigkeit gegen cytotoxische Mittel wie beispielsweise Antibiotika, Toxine etc. verleihen. Die Expressionskassetten werden dann in binäre Vektoren eingebracht, die die Sequenzen enthalten, die für die Transformation der Pflanze erforderlich sind, insbesondere den Vektor T-DNA. Dieser Vektor wird für die Transformation von Pflanzen verwendet, und die Struktur der Vektoren, die die zur Wiedererkennung spezifischen Sequenzen (RB und LB) enthalten, wurde reichlich in der Literatur beschrieben (Buch von Hoekema, the binary Plant Vector Systems, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985. Molocular genetics of the Bacteria-Plant Interaction, Puhler A., Hrsg., Springer-Verlag, NY, 1983. Plant Genetic Transformation and Gene expression: A Laboratory Manual Draper J., Scott R., Armitage P., und Walden R., Hrsg., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988. Kahl G. und Weising K., (1993) Genetic engineering of plant cells. In Biotechnology: Genetics Fundamentals and genetic Engineering. Rehm H.J., Reed G., Pühler A. und Stadler P., Hrsg VCH Publishers Inc., New York (USA) Bd 2, S. 547-659).
  • Die Struktur der so hergestellten rekombinanten Nukleinsäuren ist in 9 dargestellt.
  • SCHRITT 3: TRANSFORMATION DER PFLANZE
  • Zu einem ersten Zeitpunkt wurden Protoplasten, Pflanzenzellen, Gewebe von Tabak oder Tabakpflanzen genetisch durch die oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuren transformiert unter Verwendung indirekter Transfermethoden mittels eines Vektors wie beispielsweise Agrobakterien (zum Beispiel Agrobacterium tumefaciens: C58C1Rif pGV2260; Deblaere et al., 1985), oder indem die direkten Transformationsmethoden verwendet werden (Elektroporation, Beschuss mit Partikeln, Infiltration unter Vakuum etc. (Kahl und Weising, 1993)).
  • In dem Fall der Verwendung des indirekten Gentransfers enthalten die Agrobakterien ein Plasmid, welches die Regionen vir (inaktiviertes Plasmid Ti) aufweist, die für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzellen erforderlich sind.
  • Die Zellen werden genetisch transformiert, um in ihr Genom eine rekombinante Nukleinsäure einzusetzen (9), die das Gen enthält, das für Malonyl-CoA-Decarboxylase, zuvor beschrieben, kodiert.
  • Das zur Durchführung dieser Transformationen verwendete Protokoll wurde beschrieben von Van Lijsebettens et al. (1986 J. Mol. Biol., 188, 129-145) oder in der Literatur verzeichnet (Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual. Draper J., Scott R., Amritage P., und Walden R., Hrsg., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Kahl G. und Weiding K. (1993) Genetic engineering of plant cells. In Biotechnology: Genetics Fundamentals and genetic Engineering. Rehm H.J., Reed G., Pühler A. und Stadler P., Hrsg., VCH Publishers Inc., New York (USA) Bd 2, S. 547-659).
  • SCHRITT 4: KULTUR UND AUSWAHL DER TRANSFORMIERTEN PFLANZEN.
  • Die durch die Vektoren, die die zuvor beschriebenen Konstruktionen enthalten, transformierten Pflanzenzellen wurden dann aus den isolierten Zellen, von Kallus oder Blattscheiben wiederhergestellt, indem für die Kultur von Pflanzen herkömmliche Techniken verwendet wurden (Plant Cell Culture: A practical Approach. Dixon R.A., Hrsg., IRL Press, Oxford, Washington DC., 1985). Die transformierten Zellen und Pflanzen werden entsprechend herkömmlichen und in der Literatur beschriebenen Verfahren kultiviert. Die Selektion transformierter Zellen und Pflanzen wird bei ihrer Kultur durchgeführt, auf einem selektiven Medium, welches ein Antibiotikum oder Toxin enthält, das für die eingebrachte Kassette spezifisch ist.
  • SCHRITT 5: ANALYSE DER TRANSFORMENTEN
  • Die so hergestellten Transformanten wurden dann auf mehreren Ebenen analysiert:
    • a) – Direkanalyse, welche das Vorhandensein des Gens in der Pflanzenzelle oder der Pflanze bestätigt, entweder ausgeführt durch Southern-Blot oder PCR-Analysen, welche die Extraktion von genomischer DNA erfordern gemäß einem Protokoll, das beschrieben wird in: – Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T. in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Irwin N., Ford N., Nolan C. und Ferguson M. Hrsg., Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989, oder – Current protocols in Molecular Biology. Ausubel F. M. Brent R. Kingston R.R., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. und Struhl K. Hrsg., Current Protocols Inc Wiley, Massachusetts..., Bd 1: Molecular Biology – Techniques. 1994 und Bd 2: Molecular Biology – Laboratory. 1994.
    • b) – Analyse des Produkts des Gens, d.h. mRNA, durch Northern-Blot und Bestätigung der Transkription des Gens (Protokoll beschrieben im Sambrook und/oder dem Current Protocol wie oben angeführt).
    • c) – Analyse des synthetisierten Proteins, des Enzyms (welches die Übersetzung des Gens in ein Protein bestätigt) und Ermöglichung der Überprüfung der Funktionalität derselben (enzymatische Dosierung Immuno-Blot, Western-Blot).
    • d) – Die Dosierung der Malonyl-CoA-Decarboxylase gemäß dem Protokoll, das von Kolattuduky et al. (1987): Development pattern of the expression of Malonyl-CoA decarboxylase gene and the production of unique lipids in the goose uropygial glands. Arch. Biochem. Biophys., 256, 446-454.
    • e) – Die Analyse und Identifizierung synthetisierter Triglyceride wird durchgeführt unter Verwendung von Chromatographietechniken der Art HPLC, GC-MS oder durch NMR nach Extraktion unter Verwendung der in der Literatur verwendeten Protokolle.
  • Durch die Versuche wird ermöglicht zu überprüfen, dass die rekombinanten Nukleinsäuren funktionell sind, dass sie in die Pflanzenzellen eingebracht werden können, dass die Zellen wiederhergestellt werden können und dass die Zellen wirksam verzweigtkettige Fettsäuren herstellen. In der Folge können die Säuren direkt in den entsprechenden Pflanzensamen mittels bekannter Extraktionstechniken wiedergewonnen werden.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die verzweigtkettigen Fettsäuren aus wenigstens einer pflanzlichen Zelle oder Samen oder einer Pflanze hergestellt werden, wobei die pflanzliche Zelle oder die Samen oder die Pflanze in ihrem Genom eine rekombinante Nukleinsäure aufweisen, die für eine Methyltransferase, eine Cyclopropanfettsäuresynthase, ein Methylmalonyl-CoA oder eine Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es des Weiteren einen Schritt der Extraktion der verzweigtkettigen Fettsäuren aufweist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es des Weiteren einen Schritt der Behandlung der extrahierten verzweigtkettigen Fettsäuren aufweist.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure für ein Produkt kodiert, das es ermöglicht, die Verzweigung nach Synthese der mittels der Zelle hergestellten Fettsäuren auszulösen oder zu stimulieren.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure für ein Enzym kodiert, das den Transfer einer oder mehrerer Alkylgruppen auf die Doppelbindung(en) der ungesättigten Fettsäuren ermöglicht.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die pflanzliche Zelle des Weiteren eine rekombinante Nukleinsäure aufweist, die für die SAM-Synthetase kodiert.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure für ein Enzym kodiert, das es ermöglicht, die Pflanzenzelle dazu zu zwingen, für die Synthese der aliphatischen Kette ein Substrat zu verwenden, das eine Anzahl Kohlenstoffatome von größer 3 aufweist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäure für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, die Pflanze eine nicht lineare Acyl-CoA verwenden zu lassen.
  9. Pflanzenzelle mit einer rekombinanten Nukleinsäure, welche aufweist: – eine DNA-Sequenz, die für ein Transferpeptid kodiert, das operationell ist und von der Empfängerpflanze wiedererkannt wird und das die Adressierung des Proteins in den Chloroplasten ermöglicht; – eine Nukleinsäure, welche für eine Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert, die es ermöglicht, die Pflanzenzelle für die Synthese der aliphatischen Kette ein Substrat verwenden zu lassen, das eine Anzahl Kohlenstoffatome von größer 3 aufweist; – einen in den pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert, und – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription. oder einen Vektor, der eine derartige rekombinante Nukleinsäure aufweist.
  10. Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Ölpflanzenzelle handelt, die vorzugsweise aus Raps, Sonnenblume, Erdnuss, Soja, Leinen und Mais gewählt ist.
  11. Transgene Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine Zelle gemäß Anspruch 9 oder 10 enthält.
  12. Verfahren zu Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren durch Zellkultur einer Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, welches aufweist: – die Kultur von derartigen Zellen in einem Medium, das für ihr Wachstum geeignet ist; – die Extraktion und das Reinigen der verzweigtkettigen Fettsäuren aus den Zellen oder dem Überstand der Kultur.
  13. Verfahren zu Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren aus einer transgenen Pflanze, deren Zellen eine rekombinante Nukleinsäure aufweisen, welche aufweist: – eine DNA-Sequenz, die für ein Transferpeptid kodiert, das operationell ist und von der Empfängerpflanze wiedererkannt wird und das die Adressierung des Proteins in den Chloroplasten ermöglicht; – eine Nukleinsäure, welche für eine Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert, die es ermöglicht, die Pflanzenzelle für die Synthese der aliphatischen Kette ein Substrat verwenden zu lassen, das eine Anzahl Kohlenstoffatome von größer 3 aufweist; – einen in den pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert, – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription, – die Kultur der transgenen Pflanzen auf einem Feld, – das Wiedergewinnen von Samen der Pflanzen, – die Extraktion von Fettsäuren aus den Samen.
  14. Verwendung einer transgenen Pflanze gemäß Anspruch 11, die aus einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 wiederhergestellt wurde, für die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren.
  15. Verwendung einer transgenen Pflanze oder eines Teils einer transgenen Pflanze, wovon bestimmte Zellen wenigstens eine rekombinante Nukleinsäure aufweisen, die aufweist: – eine DNA-Sequenz, die für ein Transferpeptid kodiert, das operationell ist und von der Empfängerpflanze wiedererkannt wird und das die Adressierung des Proteins in den Chloroplasten ermöglicht; – eine Nukleinsäure, welche für eine Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert, die es ermöglicht, die Pflanzenzelle für die Synthese der aliphatischen Kette ein Substrat verwenden zu lassen, das eine Anzahl Kohlenstoffatome von größer 3 aufweist; – einen in den pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert, und – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkription, für die Herstellung verzweigtkettiger Fettsäuren.
  16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die in der Lage ist, verzweigtkettige Fettsäuren herzustellen, welches das Einbringen einer rekombinanten Nukleinsäure aufweist, die umfasst: – eine DNA-Sequenz, die für ein Transferpeptid kodiert, das operationell ist und von der Empfängerpflanze wiedererkannt wird und das die Adressierung des Proteins in den Chloroplasten ermöglicht; – eine Nukleinsäure, welche für eine Malonyl-CoA-Decarboxylase kodiert, die es ermöglicht, die Pflanzenzelle für die Synthese der aliphatischen Kette ein Substrat verwenden zu lassen, das eine Anzahl Kohlenstoffatome von größer 3 aufweist; – einen in den pflanzlichen Zellen funktionellen Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert, und – eine 3'-Region zur Terminierung der Transkriptase, in einer Zelle oder einem Teil einer Pflanze sowie das Wiederherstellen einer transgenen Pflanze aus den Zellen oder Teilen der Pflanze.
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