DE60223034T2

DE60223034T2 - Regulation des peroxisomalen fettsäuretransports in pflanzen

Info

Publication number: DE60223034T2
Application number: DE60223034T
Authority: DE
Inventors: Alison Faculty of Biol. Sciences BAKER; Stephen Faculty of Biol. Sciences SLOCOMBE; Ian York GRAHAM
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2008-08-21
Anticipated expiration: 2022-07-20
Also published as: EP1412506A2; AU2002317372A1; WO2003008597A3; EP1412506B1; US20040244078A1; DE60223034D1; WO2003008597A2; US7626079B2; ATE376064T1; CA2486593A1; AU2002317372B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäure, deren Verwendungen und ein Verfahren zur genetischen Manipulation des peroxisomalen Fettsäure-Transports und/oder -Metabolismus, Mittel dazu und Produkte dafür, insbesondere zur Verwendung bei der Regulierung des Pflanzenwachstums und beim Steuern des Spektrums von Fettsäuren, die von der Pflanze gebraucht werden können.
Hintergrund der Erfindung
Fettsäuren sind Haupt-Kohlenstoff und -Energiespeicher in den Samen vieler landwirtschaftlich wichtiger Spezies. Für die Pflanze sind sie essentielle Reserven, die eine Keimung und ein Anlegen des Setzlings unterstützen, bis die Pflanze ihre eigenen Bausteine und ihre eigene Energie durch Photosynthese herstellen kann. In jüngerer Zeit publizierte Daten zeigen, dass ein Blockieren der Mobilisierung dieser Fettsäuren ein Anlegen verhindert oder stark beeinträchtigt (Hayashi et al., 1998; Germain et al., 2001). Klarerweise sind eine effiziente Keimung und Anlage von Setzlingen von großer Wichtigkeit für Landwirte. Darüber hinaus machen in Samen abgeschiedene Fettsäuren diese zu wichtigen Nahrungsmitteln für Menschen und Tiere. Es gibt ein großes Interesse daran, die Konzentrationen und die Zusammensetzung von Fettsäuren in Samen zu modifizieren und so ihre Nahrungsqualität und ihre vorteilhaften Eigenschaften für die Gesundheit zu verbessern. Weiter gibt es erhebliches Interesse daran, Kulturpflanzen einem Engineering zu unterwerfen und so neue Fettsäuren mit vorteilhaften Eigenschaften für die Industrie herzustellen. Diese können als Ausgangsmaterialien für die chemische und mit der Pflege der Gesundheit verbundene Industrie verwendet werden, und zwar mit dem Ziel einer Verringerung des Sich-Verlassen-Müssens auf petrochemische Ausgangsmaterialien. Es ist daher erwünscht, diese Moleküle in einer stärker ökologisch freundlichen und nachhaltigen Weise zu produzieren und nicht der Ernährung dienende Kulturpflanzen für die europäische Landwirtschaft zu entwickeln.
Pflanzen, die mit dem Ziel einem Engineering unterworfen werden, veränderte Fettsäuren zu produzieren, produzieren selten ökonomische überlebensfähige Konzentrationen in Samen. Die Gründe hierfür sind wahrscheinlich komplex, jedoch kann ein Faktor deren Umsatz sein, d. h. eine gewisse Teilmenge wird abgebaut, wenn sie hergestellt werden. Weiter kann dann, wenn hohe Konzentrationen erreicht werden, dies das Vermögen dieser Pflanzen zum Keimen und Anlegen beeinträchtigten, wenn diese veränderten Fettsäuren nicht effizient genutzt werden können. Klarerweise ist dies schädlich für eine Kommerzialisierung dieser Pflanzen.
Fettsäuren in Samen werden in Öl-Körpern in Form von Triacylglycerolen (3 Fettsäure-Moleküle sind an ein Glycerin-Grundgerüst gebunden) gespeichert, die während der Samen-Entwicklung abgelegt werden. Während des Keimens werden freie Fettsäuren durch Einwirkung von Lipasen freigesetzt, und die Fettsäuren treten in den β-Oxidations-Weg ein, der in einer spezialisierten Organelle, dem Glyoxysom, beheimatet ist. Die Fettsäuren werden dann unter Produktion von Energie und Bausteinen für die Zelle metabolisiert. Eine Steuerung biochemischer Wege befindet sich häufig nahe dem Beginn des Weges, und in einigen Fällen wurde gezeigt, dass Transport-Schritte hohe Fluss-Steuerungs-Koeffizienten anwenden. Dies bedeutet, dass ein Transportieren eines Moleküls, beispielsweise von Kompartment A zu Kompartment B häufig ein wichtiger Schritt in der Bestimmung der Gesamt-Geschwindigkeit des Weges ist.
Es gibt einige Anzeichen dafür, aus Human-Studien vorzuschlagen, dass Proteine der ATP-Bindungskassetten-Familie (in Bezug genommen als ABCs) in einen Fettsäure-Transport involviert sind. ABCs sind integrale Membran-Proteine, die eine große Vielzahl von Molekülen durch Membranen hindurch transportieren. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass X-gebundene Adrenoleukodystrophy (X-ALD) mit einer besonderen Gen-Mutation verbunden ist (Moser et al., 1993). Die klinischen Symptome der Krankheit führen zu zunehmenden neurologischen Beeinträchtigungen, progressiv verlaufender mentaler und physischer Behinderung und gegebenenfalls zum Tod in Altersstufen der späten Kindheit oder des frühen Teenager-Alters. Biochemisch können diese Patienten sehr langkettige Fettsäuren nicht abbauen. Das bei der X-ALD mutierte Gen ist ein ABC-Transporter, der nahe verwandt, jedoch nicht identisch einem weiteren Säuger-Peroxisomal-ABC-Transporter ist, nämlich PMP70. Es ist nun bekannt, dass es 4 dieser peroxisomalen ABC-Gene beim Menschen gibt (PMP70, PMP70R, ALD und ALDR). Darüber hinaus wurden in der Hefe S. cerevisiae zwei homologe Gene identifiziert (PXA1 und PXA2, auch bekannt als PAT1 und PAT2), und es wurde gezeigt, dass diese Transporter von Fettsäure-Acyl CoAs sind (Hettema et al., 1996). PXA2 ist auch bekannt als das COMATOSE-Gen (CTS-Gen) (Russell et al., 2000; Footitt et al., 2002).
Glyoxisome sind cytoplasmische Organellen, die auf Pflanzen beschränkt sind. Glyoxisome sind eine spezialisierte Form von Peroxisomen, jedoch enthalten sie auch Enzyme des Glyoxylat-Zyklus. Sie sind im Endosperm oder in Cotyledonen ölreicher Samen reichlich vorhanden. Es ist nicht bekannt, wie Fettsäuren in Glyoxisome transportiert werden.
Es ist daher wünschenswert, ein Transport-Protein oder ein Regulator-Protein zu identifizieren, das mit der Geschwindigkeit des Eintritts von Fettsäuren in den Abbauweg in Verbindung steht. Ein Identifizieren und Charakterisieren der Proteine, die Fettsäuren in Glyoxisome transportieren, würde ein attraktives Ziel für die Biotechnologie darstellen, und zwar im Hinblick auf ein Unterdrücken oder Fördern des Wachstums oder auf ein Ändern des Spektrums von Fettsäuren, die durch die Pflanze verwendet werden können.
Feststellungen der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer isolierten Nukleinsäure, die eine Nukleotid-Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das als peroxisomaler Fettsäure-Transporter in Pflanzen fungiert, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus

i) einer Nukleinsäure-Sequenz, wie sie in Seq. ID-Nr. 1 abgebildet ist;
ii) einer Nukleinsäure-Sequenz, die von der Sequenz abgeleitet ist, die in Seq ID-Nr. 1 abgebildet ist, und zwar entsprechend der Degeneration des genetischen Codes;

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung werden der Einfachheit halber als das CTS-Gen bezeichnet.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche, die folgen, wird das Wort „umfassen" oder Variationen davon wie beispielsweise „umfasst" oder „umfassend" so verstanden, dass es den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen impliziert, jedoch nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen, soweit nicht der Kontext irgendetwas anderes erfordert. Dementsprechend betrifft ein Aspekt der Erfindung isolierte Nukleinsäure-Moleküle (z. B. cDNSs), die eine Nukleotid-Sequenz umfassen, die für ein Fettsäure-Transporter-Protein oder biologisch aktive Teile davon kodiert, sowie Nukleinsäure-Fragmente, die geeignet sind als Primer, oder Hybridisierungs-Sonden für den Nachweis oder eine Amplifikation einer für einen Fettsäure-Transporter kodierenden Nukleinsäure (z. B. DNS oder mRNS).
Die Anmeldung offenbart, dass das isolierte Nukleinsäure-Molekül eine der in Seq. ID-Nr. 1 angegebenen Nukleinsäure-Sequenzen oder den kodierenden Bereich oder ein Komplement davon einer dieser Nukleinsäure-Sequenzen umfasst. Die Anmeldung offenbart, dass das isolierte Nukleinsäure-Molekül gemäß der Erfindung eine Nukleinsäure-Sequenz umfassen könnte, die hybridisiert mit oder um wenigstens etwa 50%, vorzugsweise wenigstens etwa 60%, noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 70%, 80% oder 90% und sogar noch mehr bevorzugt um wenigstens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog ist mit einer Nukleotid-Sequenz wie der Sequenz Seq. ID-Nr. 1, oder ein Teil davon. Die Anmeldung offenbart, dass das isolierte Nukleinsäure-Molekül für eine der Aminosäure-Sequenzen kodiert, die in der Sequenz Seq. ID-Nr. 2 angegeben sind. Das bevorzugte Fettsäure-Transporter-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt vorzugsweise auch wenigstens eine der Fettsäure-Transporter-Aktivitäten, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind. Diese können einschließen einen Transport von Fettsäuren und/oder Acyl CoAs von verschiedenen Kettenlängen, Grad der Unsättigung und Substitution und ihre Analoge und Derivate und/oder andere amphipathische Moleküle wie beispielsweise 2,4-Dichlorphenoxybuttersäure und Indolbuttersäure und ihre Analoge und Derivate.
In einer anderen Ausführungsform hat das isolierte Nukleinsäure-Molekül eine Länge von wenigstens 15 Nukleotiden und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäure-Molekül, das eine Nukleotid-Sequenz aus Seq. ID-Nr. 1 umfasst. Vorzugsweise entspricht das isolierte Nukleinsäure-Molekül einem natürlich vorkommenden Nukleinsäure-Molekül. Noch mehr bevorzugt kodiert die isolierte Nukleinsäure für einen natürlich vorkommenden Arabidopsis-Thaliana-Fettsäure-Transporter oder einen biologisch aktiven Teil davon.
Es ist auch bevorzugt, dass die bevorzugten Formen von Fettsäure-Transportern auch eine oder mehrere der Fettsäure-Transporter-Aktivitäten aufweisen, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind.
Nukleinsäure-Moleküle, die natürlichen Varianten und nicht-Arabidopsis-Thaliana-Homologen, Derivaten oder Analogen der Arabidopsis-Thaliana-Fettsäure-Transporter cDNS gemäß der Erfindung entsprechen, können isoliert werden auf der Basis ihrer Homologie zu Arabidopsis-Thaliana-Fettsäure-Transporter-Nukleinsäure, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart ist, und zwar unter Verwendung der Arabidopsis-Thaliana-cDNS oder eines Abschnitts davon als Hybridisierungs-Sonde gemäß Standard-Hybridisierungs-Techniken unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen. Dementsprechend ist in einer anderen Ausführungsform ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül gemäß der Erfindung wenigstens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäure-Molekül, das eine Nukleotid-Sequenz gemäß Seq. ID-Nr. 1 umfasst. In anderen Ausführungsformen hat die Nukleinsäure wenigstens eine Länge von 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden.
Derartige stringente Bedingungen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt und können gefunden werden in der Druckschrift „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6". Ein bevorzugtes, nicht be schränkendes Beispiel stringenter Hybridisierungs-Bedingungen ist Hybridisierung in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Wie einem in diesem technischen Gebiet versierten Fachmann bekannt ist, unterscheiden sich derartige Hydridisierungs-Bedingungen in Abhängigkeit vom Typ der Nukleinsäure und von der Frage, ob beispielsweise organische Lösungsmittel zugegen sind, im Hinblick auf die Temperatur und die Konzentration des Puffers. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter „Standard-Hybridisierungs-Bedingungen" in Abhängigkeit vom Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH = 7,2). In dem Fall, dass ein organisches Lösungsmittel in dem vorgenannten Puffer zugegen ist, beispielsweise 50% Formamid, liegt die Temperatur unter Standard-Bedingungen bei etwa 42°C. Vorzugsweise sind Hybridisierungs-Bedingungen für DNS:DNS-Hybride beispielsweise 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C bis 45°C. Vorzugsweise sind Hybridisierungs-Bedingungen für DNS:RNS-Hybride beispielsweise 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C bis 55°C. Die vorgenannten Hybridisierungs-Temperaturen werden abgeschätzt beispielsweise für eine Nukleinsäure von etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge mit einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Der in diesem Fachgebiet versierte Arbeiter weiß, wie die notwendigen Hybridisierungs-Bedingungen abgeschätzt werden, beispielsweise gemäß den Fachbüchern, wie beispielsweise demjenigen, das oben genannt wurde, oder aus den folgenden Fachbüchern: „Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989"; „Hames and Higgins (Hrsg.) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Pratical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford"; „Brown (Hrsg.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford". Dies trifft ebenfalls zu auf stringente oder niedrig-stringente Hybridisierungs-Bedingungen. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül gemäß der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz aus Seq. ID-Nr. 1 hybridisiert wurde, einem natürlich auftretenden Nukleinsäure-Molekül. Der Begriff „ein natürlich auftretendes Nukleinsäure-Molekül", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein RNS- oder DNS-Molekül, das eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die in der Natur vorkommt (z. B. für ein natürliches Protein kodiert). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure für einen natürlichen Arabidopsis-Thaliana-Fettsäure-Transporter.
Zusätzlich zu natürlich auftretenden Varianten der Fettsäure-Transporter-Sequenz, die in der Population existieren können, wird der fachkundige Fachmann weiter erkennen, dass Änderungen durch Mutation in eine Nukleotid-Sequenz aus Seq. ID-Nr. 1 eingeführt werden können, und dass dies zu Änderungen der Aminosäure-Sequenz des kodierten Fettsäure-Transporters führt, ohne das funktionelle Vermögen des Fettsäure-Transporters zu verändern. Beispielsweise können in einer Sequenz aus Seq. ID-Nr. 1 Nukleotid-Substitutionen, die zu Aminosäure-Substitutionen an „nicht-essentiellen" Aminosäure-Resten führen, gemacht werden: ein „nicht-essentieller" Aminosäure-Rest ist ein Rest, der bei der Wild-Typ-Sequenz eines der Fettsäure-Transporter (Seq. ID-Nr. 2) geändert werden kann, ohne die Aktivität des Fettsäure-Transporters zu verändern, während ein „essentieller" Aminosäure-Rest für eine Fettsäure-Transporter-Aktivität erforderlich ist. Andere Aminosäure-Reste (z. B. diejenigen, die in der Domäne mit Fettsäure-Transporter-Aktivität nicht erhalten werden oder nur halbwegs erhalten werden) können jedoch für die Aktivität nicht essentiell sein und können daher wahrscheinlich einer Änderung ohne Änderung der Fettsäure-Transporter-Aktivität zugänglich sein.
Die Anmeldung offenbart, dass das isolierte Nukleinsäure-Molekül für ein Protein oder einen Abschnitt davon kodiert, worin das Protein oder der Abschnitt davon eine Aminosäure-Sequenz einschließt, die ausreichend homolog zu einer Aminosäure-Sequenz der Sequenz Seq. ID-Nr. 2 ist, so dass das Protein oder ein Abschnitt davon eine Fettsäure-Transporter-Aktivität aufrechterhält. Vorzugsweise hält das Protein oder ein Abschnitt davon, der durch das Nukleinsäure-Molekül kodiert wird, das Vermögen aufrecht, am Metabolismus von Verbindungen teilzunehmen, die nötig für das Aufbauen von Fettsäuren, speziell PUFAs, oder zellulären Membranen von Pflanzen oder beim Transport von Molekülen durch diese Membranen sind. Die Anmeldung offenbart, dass das Protein, das durch das Nukleinsäure-Molekül kodiert wird, zu wenigstens etwa 50%, vor zugsweise zu wenigstens etwa 60% und noch mehr bevorzugt zu wenigstens etwa 70%, 80% oder 90% und am meisten bevorzugt zu wenigstens etwa 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr homolog (= Identität) mit einer Aminosäure-Sequenz der Sequenz Seq. ID-Nr. 2 ist.
Weiter sind DNSs, die für Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren oder die sich in der Codon-Sequenz von Seq. ID-Nr. 1 aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden, ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Die Degeneriertheit des genetischen Codes, die es erlaubt, dass verschiedene Nukleinsäure-Sequenzen für dasselbe Protein oder Peptid kodieren, ist in der Literatur wohlbekannt; siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,757,006 (Toole et al., in Spalte 2, Tabelle 1).
Sequenz-Identität: die Ähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäure-Sequenzen oder zwei Aminosäure-Sequenzen wird ausgedrückt als Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen, auch in Bezug genommen als „Sequenz-Identität". Eine Sequenz-Identität wird häufig gemessen als Prozentsatz der Identität (oder der Ähnlichkeit oder Homologie); je höher der Prozentwert ist, desto mehr ähnlich sind die beiden Sequenzen. Homologe oder Orthologe des Proteins und die entsprechende cDNS oder Gen-Sequenz besitzen ein relativ hohen Grad der Sequenz-Identität, wenn sie unter Verwendung von Standard-Methoden abgestimmt werden. Diese Homologie ist noch signifikanter, wenn orthologe Proteine oder cDNSs von Spezies abgeleitet werden, die näher verwandt sind (z. B. Human- und Schimpansen-Sequenzen), verglichen mit Spezies, die entfernter verwandt sind (menschliche und C. elegans-Sequenzen).
Verfahrensweisen zum Abstimmen von Sequenzen zum Vergleich sind in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Verschiedene Programme und Abstimmungs-Algorithmen sind beschrieben in: „Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)"; „Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)"; „Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444 (1988)"; „Higgins & Sharp, Gene, 73: 237–244 (1988)"; „Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151–153 (1989)"; „Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16, 10881–10890 (1988)"; "Huang et al., Computer Appls. In the Biosciences 8, 155–165 (1992)"; und "Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24, 307–331 (1994)". Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)) präsentieren eine detaillierte Übersicht zu Sequenz-Abstimmungs-Verfahren und Homologie-Berechnungen.
Das NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)) ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, einschließlich National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) und in dem Internet, und zwar zur Verwendung in Verbindung der Sequenzanalyse blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx. Beispielsweise wird für Vergleiche von Aminosäure-Sequenzen einer Länge von mehr als etwa 30 Aminosäuren die Blast 2-Sequenzen-Funktion verwendet, und zwar unter Verwendung der Fehler BLOSUM62-Matrix, die auf Fehler-Parameter eingestellt ist (Leerstellen-Existenz-Belastung 11, pro Rest Leerstellen-Belastung 1). Wenn kurze Peptide abgestimmt werden (weniger als etwa 30 Aminosäuren), kann die Abstimmung beispielsweise durchgeführt werden unter Anwendung der Blast 2-Sequenzen-Funktion unter Verwendung der PAM30-Matrix, die auf Fehler-Parameter gesetzt ist (Handycap für offene Leerstellen: 9; Handycap für Extension-Leerstellen: 1).
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Gen-Konstrukt, das eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die die Sequenz Seq. ID-Nr. 1 aufweist, wie sie oben definiert wurde, worin die Nukleinsäure funktionell an eines oder mehrere Regulator-Signale geknüpft ist.
Demgemäß ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein neues Gen-Konstrukt, das eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die von einer Pflanze abgeleitet ist, die für ein Polypeptid kodiert, das als Fettsäure-Transporter fungiert, oder die Gen-Sequenz von Seq. ID-Nr. 1, ihre Homologe, Derivate oder Analoge, wie sie oben definiert wurden, die funktionell an ein oder mehrere Regulator-Signale geknüpft wurden, um vorteilhafterweise eine Gen-Expression zu erhöhen. Beispiele dieser Regulator-Sequenzen sind Sequenzen, an die sich Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulator-Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den tatsächlichen Struktur-Genen noch vor handen sein und – wo geeignet – genetisch modifiziert worden sein, so dass die natürliche Regulation abgeschaltet wurde und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Gen-Konstrukt kann jedoch eine einfachere Struktur haben, das bedeutet: keine zusätzlichen Regulator-Signale wurden vor der Sequenz Seq. ID-Nr. 1 oder ihren Homologen eingebaut, und der natürliche Promoter mit seiner Regulierung wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulator-Sequenz so mutiert, dass eine Regulierung nicht mehr stattfindet und eine Gen-Expression verstärkt ist. Das Gen-Konstrukt kann darüber hinaus vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte Verstärker-Sequenzen umfassen, die funktionell an den Promoter gebunden sind und eine erhöhte Expression der Nukleinsäure-Sequenz möglich machen. Es ist auch möglich, am 3'-Ende der DNS-Sequenzen zusätzliche vorteilhafte Sequenzen einzubauen, wie beispielsweise weitere Regulator-Elemente oder Terminatoren. Die Fettsäure-Transporter-Gene können in einer oder mehreren Kopien in dem Gen-Konstrukt zugegen sein. Es ist vorteilhafter, dass weitere Gene in dem Gen-Konstrukt zum Einsetzen von weiteren Genen in Organismen zugegen sind.
Vorteilhafte Regulator-Sequenzen für den neuen Prozess sind vorhanden, beispielsweise in Promotoren wie beispielsweise dem cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR- oder I-PL-Promoter und sie werden vorteilhafterweise verwendet in Gram-negativen Bakterien. Weitere vorteilhafte Regulator-Sequenzen sind zugegen, beispielsweise in den Gram-positiven Promoter amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilz-Promotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzen-Promotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980), 285–294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder in dem Ubiquitin- oder Phaseolin-Promoter. Auch vorteilhaft in diesem Zusammenhang sind induzierbare Promotoren wie beispielsweise die Promotoren, die beschrieben sind in der Druckschrift EP-A 0 388 186 (induzierbar durch Benzylsulfonamid) in Plant J. 2, 1992: 397–404 (Gatz et al., induzierbar durch Tetracyclin), in der Druckschrift EP-A 0 335 528 (induzierbar durch Abscisinsäure) oder in der Druckschrift WO 93/21334 (induzierbar durch Ethanol oder Cyclohexenol). Weitere nützliche Pflanzen-Promotoren sind der cytosolische FBPase-Promoter oder der ST-LSI-Promoter der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, (1989): 2445), der Phosphorybosyl-phyrophosphat-amidotransferase-Promoter von Glycin max (Gen-Bank-Zugangs-Nr. U87999) oder der Noden-spezifische Promoter, der beschrieben ist in der Druckschrift EP-A 0 249 676 . Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, die die Expression in Geweben erlauben, die in die Fettsäure-Biosynthese involviert sind. Am meisten besonders vorteilhaft sind Samen-spezifische Promotoren wie beispielsweise der usp-, der LEB4-, der Phaseolin- oder der Napin-Promoter. Zusätzliche besonders vorteilhafte Promotoren sind Samen-spezifische Promotoren, die für Monokotyledonen oder Dikotyledonen verwendet werden können und beschrieben sind in der Druckschrift US 5,608,152 (Napin-Promoter von Rapssamen), in der Druckschrift WO 98/45461 (Phaseolin-Promoter von Arabidopsis), in der Druckschrift US 5,504,200 (Phaseolin-Promoter von Phaseolus vulgaris), in der Druckschrift WO 91/13980 (Bce4-Promoter von Brassica), in der Druckschrift Baeumlein et al., Plant J. 2, 2 (1992): 233–239 (LEB4-Promoter von Leguminosen) wobei die Promotoren nützlich sind in Dikotyledonen. Beispielsweise sind die folgenden Promotoren nützlich in Monokotyledonen: lpt-2- oder lpt-1-Promoter von Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ), Hordein-Promoter von Gerste und andere nützliche Promotoren, die beschrieben sind in der Druckschrift WO 99/16890 .
Prinzipiell ist es möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulator-Sequenzen, wie denjenigen, die oben erwähnt wurden, für den neuen Prozess zu verwenden. Es ist auch möglich und vorteilhaft, zusätzlich synthetische Promotoren zu verwenden.
Das Gen-Konstrukt kann – wie oben beschrieben – auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingesetzt werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in Wirts-Organismen Gene einzusetzen und zu exprimieren, wie beispielsweise Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, die durch ihre enzymatische Aktivität in die Regulierung eingreifen, oder auch eines oder mehrere oder alle Gene eines biosynthetischen Weges. Diese Gene können vom Ursprung her heterolog oder homolog sein. Die eingesetzten Gene können ihren eigenen Promoter aufweisen oder anderweitig unter Kontrolle des Promoters der Sequenz Seq. ID-Nr. 1 oder ihrer Homologen stehen.
Das Gen-Konstrukt umfasst vorteilhafterweise zur Expression der anderen vorhandenen Gene zusätzliche Regulator-Sequenzen am 3'- und/oder 5'-Terminus zur Verstärkung der Expression, die gewählt werden zur optimalen Expression in Abhängigkeit von dem gewählten Wirts-Organismus und dem Gen oder den Genen.
Diese Regulator-Sequenzen machen der Intension nach eine spezifische Expression der Gene und eine Protein-Expression möglich, wie oben erwähnt wurde. Dies kann in Abhängigkeit von dem Wirts-Organismus beispielsweise bedeuten, dass das Gen nur nach einer Induktion exprimiert oder über-exprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder über-exprimiert wird.
Die Regulator-Sequenzen oder Faktoren können darüber hinaus vorzugsweise eine vorteilhafte Wirkung auf die Expression der induzierten Gene haben und diese damit erhöhen. Es ist auf diese Weise möglich, dass die Regulator-Elemente vorteilhaft auf Transkriptions-Niveau verstärkt werden, indem man starke Transkriptions-Signale wie beispielsweise Promotoren und/oder Verstärker verwendet. Jedoch ist es darüber hinaus auch möglich, eine Translation zu verstärken, beispielsweise durch Verbessern der Stabilität der mRNS.
Zusätzlich umfasst das Gen-Konstrukt gemäß der Erfindung vorzugsweise ein zusätzliches Gen von verschiedenen biochemischen Wegen, beispielsweise Gene für die Synthese von Vitaminen, Carotinoiden, Zuckern wie beispielsweise Monosacchariden, Oligosacchariden oder Polysacchariden oder Fettsäure-Biosynthese-Gene. Noch mehr bevorzugt umfasst das Gen-Konstrukt Fettsäure-Biosynthese-Gene wie beispielsweise Desaturasen, Hydroxylasen, Acyl-ACP-Thioesterasen, Elongasen, Acetylenasen, Synthetasen oder Reduktasen wie beispielsweise n19-, n17-, n15-, n12-, n9-, n8-, n6-, n5-, n4-Desaturasen, Hydroxylasen, Elongasen, n12-Acetylenase, Acyl-ACP-Thioesterasen, β-Ketoacyl-ACP-Synthasen oder β-Ketoacyl-ACP-Reduktasen.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Vektor, der die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Gen-Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Dieser Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Vektoren, vorzugsweise Expressions-Vektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die für einen Fettsäure-Transporter (oder einen Abschnitt davon) kodiert. Der Begriff „Vektor", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäure-Molekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure zu transportieren, an die er gebunden wurde. Ein Typ Vektor ist ein „Plasmid", was sich bezieht auf einen kreisförmigen, doppelsträngigen DNS-Loop, in den zusätzliche DNS-Segmente eingebunden werden können. Ein anderer Typ Vektor ist ein viraler Vektor, in dem zusätzliche DNS-Segmente in das virale Genom eingebunden werden können. Bestimmte Vektoren sind für eine autonome Replikation in einer Wirtszelle befähigt, in die sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Replikations-Ursprung (origin of replication) haben, und episomale Säuger-Vektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säuger-Vektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle bei Einführen in die Wirtszelle integriert und werden dadurch zusammen mit dem Wirts-Genom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren befähigt, die Expression von Genen zu dirigieren, mit denen sie operativ verbunden werden. Solche Vektoren werden in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen als „Expressions-Vektoren" in Bezug genommen. Allgemein liegen Expressions-Vektoren von Nützlichkeit in rekombinanten DNS-Techniken oft in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können die Begriffe „Plasmid" und „Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am meisten verbreitet verwendete Form eines Vektors ist. Jedoch ist es beabsichtigt, dass die Erfindung solche anderen Formen von Expressions-Vektoren einschließt, beispielsweise virale Vektoren (z. B. Replikations-unbrauchbare Retroviren, Adenoviren oder Adeno-assoziierte Viren), die äquivalenten Funktionen dienen.
Die rekombinanten Expressions-Vektoren gemäß der Erfindung umfassen wenigstens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung oder wenigstens ein Gen-Konstrukt gemäß der Erfindung in einer Form, die für eine Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressions-Vektoren eine oder mehrere Regulator-Sequenzen einschließen, die gewählt sind auf der Basis der Wirtszellen, die für eine Expression verwendet werden sollen, die operativ an die Nukleinsäure-Sequenz gebunden ist, die exprimiert werden soll. Innerhalb eines rekombinanten Expressions-Vektors ist es beabsichtigt, dass der Begriff „operativ verbunden" bedeutet, dass die Nukleotid-Sequenz von Interesse an die regulatorische(n) Sequenz(en) in einer Weise gebunden ist, die eine Expression der Nukleotid-Sequenz erlaubt und die so miteinander verbunden sind, dass beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion erfüllen, die der verwendeten Sequenz zukommt (z. B. in einem in-vitro-Transkriptions-/-Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in eine Wirtszelle eingeführt wird). Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „Regulator-Sequenz" Promotoren, Verstärker und andere Expressions-Steuerelemente einschließt (z. B. Polyadenylierungssignale). Solche Regulator-Sequenzen sind beispielsweise beschrieben in der Druckschrift „Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)"; oder „Gruber and Grosby, in; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsg.: Glick and Thompson, Kapitel 7, Seiten 89–108" einschließlich der darin angegebenen Literaturzitate. Regulator-Sequenzen schließen solche Sequenzen ein, die eine konstitutive Expression einer Nukleotid-Sequenz in vielen Arten von Wirtszellen dirigieren, und solche, die eine Expression der Nukleotid-Sequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen dirigieren. Von Fachleuten mit Sachverstand in diesem technischen Bereich wird erkannt, dass das Design des Expressions-Vektors von solchen Faktoren wie der Wahl der Wirtszelle, die transformiert werden soll, dem Grad der Expression des gewünschten Proteins usw. abhängen kann. Die Expressions-Vektoren gemäß der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden und produzieren dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusions-Proteinen oder -Peptiden, die durch Nukleinsäuren kodiert werden, wie sie in der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben sind (z. B. Fettsäure-Transporter, mutante Formen von Fettsäure-Transportern, Fusions-Proteine usw.).
Die rekombinanten Expressions-Vektoren gemäß der Erfindung können für eine Expression von Fettsäure-Transportern in prokarontischen oder eukaryontischen Zellen zugeschnitten sein, vorzugsweise in eukaryontischen Zellen. Beispielsweise können Fettsäure-Transporter-Gene exprimiert werden in Bakterienzellen wie beispielsweise C. glutamicum, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressions-Vektoren), Hefe- und anderen Pilz-Zellen (siehe M. A. Romanus et al. (1992), Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423–488; C. A. M. J. J. van den Hondel et al. (1991), Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure (Hrsg.), Seiten 396–428; Academic Press, San Diego und C. A. M. J. J. van den Hondel und P. J. Punt (1991), Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al. (Hrsg.), Seiten 1–28; Cambridge University Press, Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1, 3: 239–251), Ciliaten der Typen Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, speziell der Genus Stylonychia lemnae mit Vektoren im Anschluss an ein Transformations-Verfahren, wie es beschrieben ist in der Druckschrift WO 98/01,572 und multizelluläre Pflanzenzellen (siehe R. Schmidt und L. Willmitzer (1988), High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis-Thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep.: 583–586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C. Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, Seiten 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer in: Transgenic Plants, Ausgabe 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 (und die darin zitierten Druckschriften) oder Säugerzellen. Geeignete Wirtszellen werden weiter diskutiert in der Druckschrift „Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)". Alternativ dazu kann der rekombinante Expressions-Vektor in vitro transkribiert und translatiert werden, beispielsweise unter Verwendung von T7-Promoter-Regulator-Sequenzen und T7-Polymerase.
Eine Expression von Proteinen in Prokaryonten wird am häufigsten durchgeführt mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression entweder von Fusions- oder nicht-Fusions-Proteinen dirigieren. Fusions-Vektoren addieren eine Zahl von Aminosäuren zu einem darin kodierten Protein, üblicherweise an dem Amino-Terminus des rekombinanten Proteins, jedoch auch an den C-Terminus, oder werden in geeignete Bereiche in den Proteinen eingebunden. Solche Fusions-Vektoren dienen typiscsherweise drei Zwecken: 1) einer Erhöhung der Expression von rekombinantem Protein; 2) einer Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) zur Unterstützung bei der Reinigung des rekombinanten Proteins, indem sie als Ligand in einer Affinitäts-Reinigung wirken. Oft wird in Fusions-Expressions-Vektoren eine proteolytische Spaltungsstelle an der Verbindung der Fusions-Einheit und des rekombinanten Proteins eingeführt, um eine Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Fusions-Einheit am Anschluss an die Reinigung des Fusions-Proteins zu erlauben. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungs-Sequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
Typische Fusions-Expressions-Vektoren schließen ein: pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; D. B. Smith und K. S. Johnson (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A mit dem rekombinanten Ziel-Protein verbinden. In einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz des Fettsäure-Transporters in einen pGEX-Expressions-Vektor geklont und so ein Vektor geschaffen, der für ein Fusions-Protein kodiert, das – vom N-Terminus zum C-Terminus, GST-Thrombin – Spaltungsstelle – X – Protein umfasst. Das Fusions-Protein kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Glutathion-Agarose-Harzes gereinigt werden. Rekombinanter Fettsäure-Transporter, der nicht mehr an GST gebunden ist, kann gewonnen werden durch Spaltung des Fusions-Proteins mit Thrombin.
Beispiele geeigneter induzierbarer nicht-Fusions-E. coli Expressions-Vektoren schließen ein: pTrc (Amann et al. (1988), Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990), 60–89). Eine Ziel-Gen-Expression vom pTrc-Vektor vertraut auf eine Wirts-RNS-Polymerase-Transkription von einem Hybrid-trp-lac-Fusions-Promoter. Eine Ziel-Gen-Expression vom pET 11d-Vektor vertraut auf eine Transkription von einem T7 gn10-lac-Fusions-Promoter vermittelt durch eine co-exprimierte virile RNS-Polymerase (T7 gn1). Diese virile Polymerase wird geliefert von Wirtsstämmen der Bezeichnung BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem Residenten 1-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptions-Steuerung des lacUV5-Promoter beherbergt.
Andere Vektoren, die nützlich in Prokaryonten-Organismen sind, sind einem Fachmann mit technischem Sachverstand in diesem Bereich bekannt. Solche Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, Vektoren der pBR-Reihe wie beispielsweise pBR322, Vektoren der pUC-Reihe wie beispielsweise pUC 18 oder pUC 19, Vektoren der M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, lgt11 oder pBdCl; in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361 in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214 in Corynebakterium pSA77 oder pAJ667.
Eine Strategie zur Maximierung einer Expression von rekombinantem Protein ist, das Protein in Wirtsbakterien mit einem gestörten Vermögen zum proteolytischen Spalten des rekombinanten Proteins zu exprimieren (S. Gottesman, Gene Expression Technologe: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990), 119–128). Eine andere Strategie ist, die Nukleinsäure-Sequenz der Nukleinsäure, die in einen Expressions-Vektor eingesetzt werden soll, zu verändern, so dass die einzelnen Kodons für jede Aminosäure diejenigen sind, die bevorzugt in dem Bakterium verwendet werden, das für eine Expression gewählt wurde, wie beispielsweise C. glutamicum (Wada et al. (1992), Nucleic Aids Res. 20: 2111–2118). Eine derartige Veränderung von Nukleinsäure-Sequenzen gemäß der Erfindung kann durchgeführt werden mittels Standard-DNS-Synthese-Verfahren.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Fettsäure-Transporter-Expressions-Vektor ein Hefe-Expressions-Vektor. Beispiele von Vektoren für eine Expression in der Hefe S. cerivisae schließen ein: pYepSec1 (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54: 113–123), und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahrensweisen für den Aufbau von Vektoren, die geeignet für eine Verwendung in anderen Pilzen sind, wie beispielsweise filamenten Pilzen, schließen diejenigen ein, die detailliert genannt sind in der Druckschrift „C. A. M. J. J. van den Hondel & P. J. Punt (1991), Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al. (Hrsg.), Seiten 1 bis 28, Cambridge University Press; Cambridge" oder in: „More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure (Hrsg.), Seiten 396–428, Academic Press, San Diego]. Weitere nützliche Hefe-Vektoren sind beispielsweise 2mM, pAG-1, Yep6, Yep13 oder pEMBLYe23.
Alternativ dazu kann der Fettsäure-Transporter gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert werden in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressions-Vektoren. Baculovirus-Vektoren, die für eine Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen erhältlich sind (z. B. Sf9-Zellen), schließen die Vektoren der pAc-Reihe (Smith et al. (1983), Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die Vektoren der pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989), Virology 170: 31–39) ein.
Die oben genannten Vektoren sind nur ein kleiner Überblick möglicher nützlicher Vektoren. Zusätzliche Plasmide sind versierten Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt und sind beschrieben beispielsweise in der Druckschrift „Cloning Vectors (Hrsg.: P. H. Pouwels et al., Elsevier Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
In einer weiteren Ausführungsform kann der Fettsäure-Transporter gemäß der Erfindung exprimiert werden durch unizellulare Pflanzenzellen (wie beispielsweise Algen) (siehe beispielsweise Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 und darin zitierte Druckschriften) und Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. die Spermatophyten, wie beispielsweise Feldpflanzen). Beispiele von Pflanzen-Expressions-Vektoren schließen diejenigen ein, die detailliert beschrieben sind in der Druckschrift „D. Becker, E. Kemper, J. Schell und R. Masterson (1992), New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197" und "M. W. Bevan (1984), Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721"; "Vectors for Gene Transfer in Higher Plants in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, Seiten 15–38".
Eine Pflanzenexpressions-Kassette enthält vorzugsweise Regulator-Sequenzen, die in der Lage sind, eine Gen-Expression in Pflanzenzellen anzutreiben, und die funktionell verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, wie beispielsweise eine Beendigung der Transkription wie beispielsweise Polyadenylierungs-Signale. Bevorzugte Polyadenylierungs-Signale sind diejenigen, die von Agrobakterium tumefaciens t-DNS stammen, wie beispielsweise das Gen 3, das bekannt ist als Octopin-Synthase des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, jedoch sind auch alle anderen Terminatoren, die funktionell in Pflanzen aktiv sind, geeignet.
Da Pflanzen-Gen-Expression sehr oft nicht auf transkriptionelle Ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressions-Kassette vorzugsweise andere funktionell verknüpfte Sequenzen wie Translations-Verstärker wie beispielsweise die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz des Tabak-Mosaik-Virus enthält, die das Protein/RNS-Verhältnis erhöht (Gallie et al. 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711).
Eine Pflanzen-Gen-Expression muss funktionell verknüpft sein mit einem passenden Promoter, der eine Gen-Expression in einer rechtzeitigen, für die Zelle oder das Gewebe spezifischen Weise herbeiführt. Bevorzugt sind Promotoren, die eine konstitutive Expression herbeiführen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195–2202, wie diejenigen, die abgeleitet sind von Pflanzen-Viren wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980), 285– 294), 19S CAMV (siehe auch US-A 5,352,605 und WO 84/02,913 ) oder Pflanzen-Promoteren wie diejenigen von der kleinen Rubisco-Untereinheit, die beschrieben ist in der Druckschrift US-A 4,962,028 . Weitere vATPase-Promotoren wie beispielsweise ein 1.153 Basenpaare großes Fragment von β-vulgaris (Plant Mol Biol. 1999, 39: 463–475) können verwendet werden, um eine ASE-Gen-Expression allein oder in Kombination mit anderen PUFA-Biosynthese-Genen voranzutreiben.
Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung bei der funktionellen Bindung in Pflanzen-Gen-Expressions-Kassetten sind zielgerichtete bzw. auf ein Ziel ausgerichtete Sequenzen, die nötig sind, um das Gen-Produkt in sein zugehöriges Zell-Kompartment zu dirigieren (für einen Überblick: siehe „Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285–423" und darin angegebene Literatur-Referenzen), wie beispielsweise Vacuole, Nucleus, alle Typen von Plastiden, Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, der extrazelluläre Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisome und andere Kompartiments von Pflanzenzellen.
Eine Pflanzen-Gen-Expression kann auch erleichtert werden über einen chemisch induzierbaren Promoter (hinsichtlich eines Überblicks: siehe „Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108"). Chemisch induzierbare Promotoren sind besonders geeignet, wenn es erwünscht ist, dass eine Gen-Expression in einer zeitspezifischen Weise stattfindet. Beispiele für solche Promotoren sind ein durch Salicylsäure induzierbarer Promoter ( WO 97/19443 ), ein durch Tetracyclin induzierbarer Promoter (Gatz et al., 1992, Plant J. 2, 397–404) und ein durch Ethanol induzierbarer Promoter ( WO J93/21334) .
Auch sind solche Promotoren geeignete Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stress-Bedingungen antworten, wie beispielsweise der durch Pathogene induzierbare PRP1-Gen-Promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361–366), der durch Hitze induzierbare hsp80-Promoter der Tomate ( US 5,187,267 ), der durch Kalte induzierbare α-Amylase-Promoter der Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der durch Verwundung induzierbare pinII-Promoter ( EP-A 0 375 091 ).
Speziell die Promotoren sind bevorzugt, die eine Gen-Expression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen eine Lipid- und Öl-Biosynthese in Samenzellen stattfindet, wie beispielsweise Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napin-Gen-Promoter von Rapssamen ( US 5,608,152 ), der USP-Promoter von Vicia faba (Baeumlein et al., Mol. Gen. Genet. 1991, 225 (3): 459–467) der Oleosin-Promoter von Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promoter von Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promoter von Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin B4-Promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233–239) sowie die Promotoren, die eine Samen-spezifische Expression in Monocotyledonen-Pflanzen herbeiführen, wie beispielsweise Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw.. Zu nennende geeignete Promotoren sind die lpt2- oder der lpt1-Gen-Promoter von Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder diejenigen Promotoren, die beschrieben sind in der Druckschrift WO 99/16890 (Promoter vom Gerste-Hordein-Gen, vom Reis-Glutelin-Gen, vom Reis-Oryzin-Gen, vom Reis-Prolamin-Gen, vom Weizen-Gliadin-Gen, vom Weizen-Glutelin-Gen, vom Mais-Zein-Gen, vom Hafer-Glutelin-Gen, vom Sorghum-Kasirin-Gen, vom Roggen-Secalin-Gen).
Auch speziell geeignete sind Promotoren, die eine Plastid-spezifische Gen-Expression herbeiführen, da Plastide das Kompartiment sind, in dem Vorstufen und einige Endprodukte der Lipid-Biosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren wie beispielsweise der virale RNS-Polymerase-Promoter sind beschrieben in der Druckschrift WO 95/16783 und WO 97/06250 , sowie der clpP-Promoter von Arabidopsis, der beschrieben wurde in der Druckschrift WO 99/46394 .
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen in die ein rekombinanter Expressions-Vektor gemäß der Erfindung eingeführt wurde. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden in der vorliegenden Beschreibung austauschbar verwendet. Es wird verstanden, dass sich solche Begriffe nicht nur auf die speziell angesprochene Zelle beziehen, sondern auch auf die Nachkommen oder potentielle Nachkommen einer solchen Zelle. Da in nachfolgenden Generationen bestimmte Modifikationen auftreten können, und zwar entweder aufgrund von Mutation oder von Umwelt- Einflüssen, mögen solche Nachkommen in der Praxis nicht mit der Elternzelle identisch sein, sind jedoch noch in den Umfang des Begriffs, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, eingeschlossen.
Eine Vektor-DNS kann in prokaryontische oder eukaryontische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektions-Techniken eingeführt werden. Die Begriffe „Transformation" und „Transfektion", „Konjugation" und „Transduktion" wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet werden, sollen sich der Absicht nach auf eine Vielzahl von in diesen technischen Bereich anerkannten Verfahren zum Einführen einer Fremd-Nukleinsäure (z. B. einer DNS) in eine Wirtszelle beziehen und schließen Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Co-Prezipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelte Übertragung oder Elektroporation ein. Geeignete Verfahrensweisen zum Transformieren oder Transfektieren von Wirtszellen, die Pflanzenzellen einschließen, können gefunden werden in der Druckschrift „Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989" und andere Labor-Handbücher wie beispielsweise „Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols; Hrsg.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingeführt (z. B. über einen über Agrobacterium vermittelten Gen-Transfer, eine biolistische Transformation, Polyethylenglycol oder andere anwendbare Verfahrensweisen), und Zellen, in denen sich das eingeführte ASE-Gen homolog mit dem endogenen Fettsäure-Transporter-Gen rekombiniert hat, werden selektiert, wobei man in diesem technischen Bereich bekannte Verfahrensweisen verwendet. Im Fall von Pflanzenzellen ist das AHAS-Gen, das beschrieben wurde in der Druckschrift „Ott et al., J. Mol. Biol. 1996, 263: 359–360" speziell geeignet für eine Marker-Gen-Expression und Beständigkeit gegenüber Herbiziden des Imidazolinon- oder Sulfonylharnstoff-Typs.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Organismen wie beispielsweise Mikroorganismen hergestellt werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingeführten Gens erlauben. Beispielsweise das Einschließen eines Fettsäure-Transporter-Gens in einen Vektor und Setzen des Gens unter Steuerung des lac-Operons erlaubt eine Expression des Fettsäure-Transporter-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Solche Regulator-Systeme sind in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Der Begriff „rekombinante Organismen" bedeutet einen Organismus, der eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß der Erfindung umfasst, ein Gen-Konstrukt oder einen Vektor in der Zelle oder innerhalb des Genoms an einer Stelle, die nicht die „natürliche" Stelle ist, oder an einer „natürlichen" Stelle, jedoch in einer Weise modifiziert, die nicht die natürliche Weise ist; dies bedeutet, dass die Kodierungs-Sequenz modifiziert ist und/oder die Regulator-Sequenz modifiziert ist. Der Begriff „modifiziert" bedeutet, dass ein einzelnes Nukleotid oder ein oder mehrere Kodons geändert werden, im Vergleich zu der natürlichen Sequenz.
Eine Wirtszelle gemäß der Erfindung, wie beispielsweise eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle in Kultur kann verwendet werden zum Produzieren (d. h. zum Exprimieren) eines Fettsäure-Transporters. Ein alternatives Verfahren kann zusätzlich in Pflanzen angewendet werden durch die direkte Übertragung einer DNS in sich entwickelnde Blumen über Elektroporation oder einen Gen-Transfer mittels des Mediums Agrobakterium. Dementsprechend stellt die Erfindung weiter Verfahrensweisen zum Produzieren von Fettsäure-Transportern unter Verwendung der Wirtszellen gemäß der Erfindung bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle gemäß der Erfindung (in die ein rekombinanter Expressions-Vektor, der für einen Fettsäure-Transporter kodiert, eingeführt wurde oder in deren Genom ein Gen, das für einen Fettsäure-Transporter des Wild-Typs oder einen geänderten Fettsäure-Transporter kodiert, eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, bis der Fettsäure-Transporter produziert wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter ein Isolieren der Fettsäure-Transporter aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Wirts-Organismen, die prinzipiell geeignet sind, die Nukleinsäure gemäß der Erfindung, das neue Gen-Konstrukt oder den Vektor gemäß der Erfindung zu umfassen, sind alle prokaryontische oder eurkaryontische Organismen. Die mit Vorteil genutzten Wirts-Organismen sind Organismen wie beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, Tierzellen oder Pflanzenzellen. Weitere vorteilhafte Organismen sind Pilze, Hefen oder Pflanzen, vorzugsweise Pilze oder Pflanzen, sehr speziell bevorzugt Pflanzen wie beispielsweise Ölsamen-Pflanzen, die hohe Mengen an Lipid-Verbindungen enthalten, wie beispielsweise Rapssamen, Schlüsselblume, Raps, Erdnuss, Leinsamen, Sojabohne, Öldistel, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen wie beispielsweise Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Manihot (Yucca-Stärke), Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen wie beispielsweise Kartoffel, Tabak, Auberginen und Tomate, Pflanzen der Spezies Vitia, Erbsen, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Pflanzen der Spezies Salix, Bäume (Palmölbaum, Kokosnussbaum) und mehrjährige Gräser und Futterpflanzen. Besonders bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölsamenpflanzen wie beispielsweise Sojabohne, Erdnuss, Rapssamen, Raps, Sonnenblume, Öldistel, Bäume (Palmölbaum, Kokosnussbaum).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Nukleinsäure-Molekül, umfassend Seq. ID-Nr. 1, das für einen peroxisomalen ABC-Transporter (ATP-binding cassette transporter) kodiert.
Auch bereitgestellt wird eine Nukleinsäure, die für ein ABC-Kassetten-Transporter-Protein kodiert, speziell ein solches, das in einen Fettsäure-Transport durch peroxisomale Membranen involviert ist, wobei die Nukleinsäure gewählt ist aus einer Gruppe, die besteht aus

a) einer DNS, die eine Nukleotid-Sequenz aufweist, wie sie in der vorliegenden Beschreibung in Seq. ID-Nr. 1 angegeben ist, die für ein Protein kodiert, das die in der vorliegenden Beschreibung unter Seq. ID-Nr. 2 angegebene Aminosäure-Sequenz aufweist;
b) einer Nukleinsäure, die sich mit einer DNS gemäß dem vorstehenden Abschnitt a) hybridisiert (z. B. unter stringenten Bedingungen); und
c) einer Nukleinsäure, die sich von der DNS gemäß dem vorstehenden Abschnitt a) oder b) unterscheidet, und zwar aufgrund der Generationsfähigkeit des genetischen Codes, und die für ein Protein kodiert, das auch durch eine DNS der vorstehenden Abschnitte a) oder b) kodiert wird.

DNSs gemäß der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die für Proteine kodieren, die homolog den in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Proteinen sind und die im Wesentlichen dieselben biologischen Eigenschaften haben wie die in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Proteine, und schließen insbesondere die DNS ein, die in der vorliegenden Beschreibung unter Seq. ID-Nr. 1 offenbart wurde und für das Protein kodiert, das in der vorliegenden Beschreibung unter Seq. ID-Nr. 2 angegeben ist. Diese Definition soll den Intentionen gemäß natürliche allelische Kombinationen einschließen, wie sie offenbart sind. Damit können isolierte DNS oder geklonte Gene gemäß der vorliegenden Erfindung solche mit einem Ursprung jeder beliebigen Pflanzen-Spezies sein. Damit sind DNSs, die zu einer DNS hybridisieren, die in der vorliegenden Beschreibung unter Seq. ID-Nr. 1 offenbart ist (oder Fragmente oder Derivate davon, die als Hybridisierungs-Sonden dienen, wie unten diskutiert wird) und die eine Expression eines Proteins kodieren, das mit dem Fettsäure- oder Acyl CoA-Transport in Peroxisome assoziiert ist (z. B. ein Protein gemäß Seq. ID-Nr. 2) in die vorliegende Erfindung eingeschlossen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt die Verwendung der Nukleinsäure gemäß der Erfindung und/oder eines Proteins oder Polypeptids, das dadurch kodiert wird, in irgendeinem oder mehreren der folgenden Prozesse: Regulation des Fettsäure-Transports durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom-Membranen, Regulierung des Wachstums, Regulierung der Samen-Entwicklung und Modulieren der Fettsäure-Verwendung durch die Pflanze.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zum Regulieren eines oder mehrerer der folgenden Prozesse: Regulieren des Fettsäure-Transports durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom-Membranen; Regulierung des Wachstums, Regulieren der Samen-Entwicklung und Modulieren der Fettsäure-Verwendung durch die Pflanze, umfassend ein Genetic-Engineering einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzengewebes oder eines Samens unter Verstärken oder Reduzieren/Verhindern einer Expression der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung.
Solche Verfahrensweisen sind in diesem technischen Bereich wohlbekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: eine Reduktion der Expression der Nukleinsäure und des durch diese durch Antisense-Expression eines Teils der gesamten Sequenz entsprechend der Seq. ID-Nr. 1 kodierten Proteins; Expression eines Teils oder der gesamten Seq. ID-Nr. 1 als doppelsträngige Interferenz-RNS (RNSi); oder Co-Supression des endogenen Gens, bewirkt durch Einführen zusätzlicher Kopien eines Teils oder der gesamten Seq. ID-Nr. 1. Eine Expression im Gegensatz dazu kann erhöht sein oder räumlich oder zeitlich verändert sein durch die Einführung von Konstrukten, die an verschiedene Regulator-Sequenzen gebunden sind, wie sie oben beschrieben wurden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zum Modifizieren einer Pflanzenzelle zur Erhöhung oder Senkung des Transports eines Teils oder aller Fettsäuren durch Zellmembranen und/oder zur Erhöhung oder Verhinderung ihres Abbaus.
Vorzugsweise könnte die Modifikation die Form eines Mutierens, Unterdrückens oder Streichens des CTS-Gens annehmen. Das CTS-Gen könnte auch modifiziert werden, um seine Expressions-Niveaus in speziellen Geweben oder zu spezifischen Zeiten zu verändern. Beispielsweise – und nicht mit dem Ziel einer Beschränkung – könnte die CTS-Expression inhibiert werden beim Entwickeln von Samen, jedoch nicht beim Keimen von Samen. Alternativ dazu kann die Pflanzenzelle so modifiziert werden, dass sie eine erhöhte Zahl von Kopien der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, verglichen mit dem Wild-Typ.
Eine Mutation der Sequenz kann erfolgen durch vorgegebene Änderungen oder statistische Änderungen, gefolgt von einer Selektion unter Einführen von Variationen von Seq. ID-Nr. 1 und Seq. ID-Nr. 2 bei geänderter Substrat-Spezifität oder Transport-Rate oder Regulation oder durch die Expression von Mutanten mit dominant negativer Aktivität.
Die Erfindung schließt daher transgene Pflanzen ein, die ein Nukleinsäure-Molekül gemäß der Erfindung umfassen, sowie transgene Pflanzen, die für eine Erhöhung oder Absenkung der Expression eines aktiven peroxisomalen ABC-Transporters angepasst sind. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zum Regulieren irgendeines oder mehrerer der folgenden Prozesse: Fettsäure-Transport durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom-Membranen; Samen-Entwicklung und Fettsäure-Verwendung durch eine Pflanze, welches ein Genetic-Engineering einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzengewebes oder eines Pflanzensamens unter Verstärkung oder Reduzierung/Verhinderung der Expression der oben definierten Nukleinsäure umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zum Modifizieren einer Pflanzenzelle unter Erhöhung oder Absenkung des Transports einiger oder aller Fettsäuren durch Zellmembranen und/oder unter Erhöhen oder Verhindern ihres Abbaus in speziellen Geweben oder zu speziellen Zeiten, welches ein Genetic-Engineering der Pflanzenzelle unter Verstärken oder Reduzieren/Verhindern einer Expression der oben im Detail definierten Nukleinsäure umfasst.
Es wird erhofft, eine Pflanzenzelle und/oder ein Pflanzengewebe und/oder eine Pflanze und/oder einen Pflanzensamen bereitzustellen, die/das/der keine durch Transkription aktivierte/aktivierbare Form des Nukleinsäure-Moleküls gemäß der Erfindung umfasst.
Es wird erhofft, eine Pflanzenzelle und/oder ein Pflanzengewebe und/oder eine Pflanze und/oder einen Pflanzensamen bereitzustellen, die/das/der eine erhöhte oder abgesenkte Transkription der Nukleinsäure gemäß der Erfindung im Vergleich zu dem Wild-Typ umfasst.
Die Anmeldung offenbart eine Pflanze, die aus einer Pflanzenzelle und/oder Pflanzengewebe und/oder einer Pflanze und/oder einem Pflanzensamen erzeugt wurde, die/das/der eine erhöhte oder abgesenkte Transkription der Nukleinsäure gemäß der Erfindung im Vergleich mit dem Wild-Typ umfasst.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Primer, der irgendeine der Seq. ID-Nrn. 3 bis 10 umfasst, d. h. in der Lage ist, die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder Homologe davon zu erkennen, wobei der Primer spezifisch für eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung ist.
Die folgenden T-DNS-Knockout-Linien, die Insertionen des CTS-Gens enthalten, wurden von der Wisconsin-Knockout-Population alpha gescreent:

cts-2: Position der Insertion in der genomischen DNS ist 16.674 bei Accession AL161596 (Arabidopsis-Thaliana DNS-Chromosom 4, enthaltend Fragment Nr. 92, Version AL161596.2). Dies entspricht Exon 3 des Gens oder Position 846 in der Seq. ID-Nr. 1 (cDNS) sowie in Kodon Thr115 in Seq. ID-Nr. 2 (die abgeleitete Aminosäure-Sequenz). Die in dem anfänglichen PCR-Screen verwendeten Primer sind vorzugsweise H1A6T7 DSR1 (Seq. ID-Nr. 8) und JL 202 (Seq. ID-Nr. 11).
F27: Position der Insertion in der genomischen DNS ist 15.873 in Accession AL161596. Dies ist in dem Intron-1, das in der 5'-UTR angeordnet ist. Die in dem anfänglichen PCR-Screen verwendeten Primer sind vorzugsweise H1A6T7 DSF1 (Seq. ID-Nr. 4) und JL 202 (Seq. ID-Nr. 11).
F12: Position der Insertion in der genomischen DNS ist 17.318 in Accession AL161596. Dies ist in dem Intron-4. Die in dem anfänglichen PCR-Screen verwendeten Primer sind vorzugsweise H1A6T7 DSF1 (Seq. ID-Nr. 4) und JL 202 (Seq. ID-Nr. 11).

Vorzugsweise schließen die Primer gemäß der vorliegenden Erfindung ein:
Primer H1A6T7 DSF1: Vorwärts-Primer, 5' an Position 15.667 von Accession AL161596, (Seq. ID-Nr. 4); Primer H1A6T7 DSF2: 5' an Position 15.640 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 5); Primer H1A6T7 DSF3: 5' an Position 15.320 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 6); Primer H1A6T7 DSF: 5' an Position 15.542 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 3); Primer H1A6T7 DSR1, Rückwärts-Primer: 5' an Position 20.611 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 8); Primer H1A6T7 DSR2: 5' an Position 17.819 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 9); Primer H1A6T7 DSR3: 5' an Position 21.191 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 10): Primer H1A6T7 DSR: 5' an Position 19.978 von Accession AL161596 (Seq. ID-Nr. 7) und/oder Primer JL 202: Left-Border-Primer für PCR außerhalb der Konstrukte Wisconsin-Knockout-Population-alpha (Seq. ID-Nr. 11).
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt eine Verwendung eines Primers, der irgendeine der Seq. ID-Nrn. 3 bis 10 umfasst, d. h. in der Lage ist, die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder Homologe davon zu erkennen, bei der Identifizierung einer Nukleinsäure-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 veranschaulicht eine Abstimmung von peroxisomalen ABC-Transporter. Die Peptid-Sequenzen von Human-ALD und -PMP70 wurden abgestimmt mit Arabidopsis CTS und Hefe-Pxa1 CTS. Obwohl die Arabidopsis-ABC ein Doppel-Transporter ist, der aus 2 Sätzen von Transmembran-Domänen besteht, die mehrere Transmembran-Helices und 2 ATPase-Domäns umfassen (Format: TM-Domän – ATPase – TM-Domän – ATPase), sind seine nächsten Homologen außerhalb des Pflanzenreichs Halb-Transporter (Format: TM-Domän – ATPase). Für diese Abstimmung wurde die Peptid-Sequenz der Arabidopsis-ABC willkürlich in zwei Hälften aufgeteilt, nämlich CTSa und CTSb. Konservierte Domänen, die vorher in der Literatur beschrieben wurden, sind markiert. Loop 1 ist konserviert nur bei peroxisomalen ABC-Transportern. Das EAA-artige Motiv, Walker A und B und die C-Sequenz sind alle konserviert bei prokaryontischen und eukaryontischen ABC-Transporter.
2 veranschaulicht eine Analyse der CTS-Transkript-Werte während der Keimung im Licht. Samen wurden unter Verwendung von Milton^® oberflächen-sterilisiert und im Dunkeln bei 4°C für 4 d getränkt, bevor man sie ausplattierte und 22°C inkubierte. Die Datenpunkte sind solche für Tage nach dem Tränken (days post imbibition; dpi).
3 zeigt die Expression und Reinigung der zweiten ATPase-Domän von CTS.
4 veranschaulicht den Ort von Fraktionen CTS zu Membran. Eine Arabidopsis-Zell-Suspensions-Kultur, die von Blättern abgeleitet worden war, wurde homogenisiert und bei niedriger Geschwindigkeit (1.000 g) zentrifugiert, um Kerne zu entfernen, gefolgt von einem Zentrifugieren bei 20.000 g zum Sedimentieren von Membran-Fraktionen. Diese wurden dann resuspendiert und auf einen Sucrose-Schritt-Gradienten aufgegeben. Fraktionen von äquivalenter Protein-Beladung wurden mittels SDS-PAGE abgetrennt, gefolgt von einem Immuno-Blotting mit Anti-Seren gegen CTS. Spur 1: SDS-Extraktion des ursprünglichen Homogenats; Spur 2: Post-nuklearer Überstand; Spur 3: Resuspendiertes Membran-Pellet; Spur 4: Membran, gewonnen bei 0,5 M/1,6 M Sucrose-Grenzfläche; und Spur 5: 1,6 M/2,2 M Sucrose-Grenzfläche. Die Konzentration an CTS in den Membran-Fraktionen ist übereinstimmend damit, dass CTS ein Membran-Protein ist.
5 gibt den Ort der T-DNS-Insertionen in drei CTS-Knockouts wieder, also cts-2F27 und F12. Die Exons sind gezeigt als dunkel schraffierte Boxen. Nicht-kodierende transkripierte Regionen sind durch helles Schraffieren angegeben.
6 veranschaulicht die Isolation von einzelnen CTS-Knockout-Pflanzen. 100 einzelne Pflanzen wurden mittels PCR auf das Exon-2-Knockout (cts-2) von einem Pool gescreent, der Samen von mit 9 T-DNS getaggten Linien enthielt, die vorher durch PCR identifiziert worden waren. Eine PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines für T-DNS spezifischen Primers (JL-202) und eines Gen-spezifischen Primers DSR1 (A) oder DSR3 (B). Eine positive Pflanze (Spur 5) wurde aus dieser Probe von 15 Individu en identifiziert. (C) Eine HindIII-Restriktions-Behandlung von genomischer CTS von wt (Spur 1) und der positiven Pflanze (Spur 2) wurde mit einer CTS-Sonde behandelt. Banden von 2,5 kb und 6,5 kb entsprechen den vorhergesagten Größen für wt-CTS. Die Bande mit 8,7 kb entspricht einer vorausgesagten Größe, die konsistent mit einer T-DNS-Insertion in das Exon 2 ist. Zusammen legen diese Daten nahe, dass die positive Pflanze ein Heterozygot ist, der eine Kopie des wt-CTS-Gens und ein Mutanten-Gen, das eine T-DNS-Insertion aufwies, hatte. (D) PCR, identifiziert das Vorhandensein von Knockout-Pflanzen in einem Pool von keimenden Sämlingen von mit 9-T-DNS-getaggten Linien für Knockout-F27 (Spuren 1 bis 3) und Knockout-F12 (Spuren 4 bis 6) unter Verwendung eines für T-DNS-spezifischen Primers und einer Reihe von Gen-spezifischen Primern.
7 veranschaulicht eine CTS-Lokalisation in Peroxisomen. Ein Sucrose-Dichte-Gradient zeigt die Lokalisation von peroxisomalen Markern Catalase (geschlossene Kreise) und 3-Ketoacyl-Thioloase (KAT), ER-Marker-Calreticulin (CAL), Mitochondiraler Marker Adenin-Nucleotid-Translocator (ANT) und Chlorophyll (offene Kreise). CTS-Antigen folgt der Verteilung von Catalase und Thiolase.
8 veranschaulicht die Profile von Triacylglycerin-abgeleiteten Fettsäuren und Acyl CoA-Konzentrationen im Wild-Typ und in einer cts-2-Mutante: a = Vergleich von TAG-abgeleiteten Fettsäuren in den Wild-Typen und in der cts-2-Mutante in Samen und Setzlingen 0, 2 und 5 Tage nach dem Säen. b = Profil von TAG-abgeleiteten Fettsäuren in getränkten Wild-Typ-Samen und Mutanten-Samen nach der Kettenlänge; c = wie b, jedoch Profil von 5 Tage alten Setzlingen; d = Vergleich von Acyl-CoA-Konzentrationen in Wild-Typen und cts-2-Mutanten-Setzlingen 0, 2 und 5 Tage nach dem Säen; e = Profil von Acyl CoAs in getränkten Samen des Wild-Typs und Mutanten-Samen nach der Kettenlänge; und f = wie e, jedoch Profil von 5 Tage alten Setzlingen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die peroxisomalen ABC-Transporter-Proteine von Hefe und von Menschen wurden verwendet zum Suchen der öffentlich zugänglichen Sequenz-Datenbanken von Arabidopsis-Thaliana unter Verwendung des BLAST-Algorithmus. Eine Sequenz wurde identifiziert (T5J17.20; AT4G39850 vom Chromosom IV), die eine signifikante Sequenz-Homologie zu allen Sonden-Sequenzen hatte und die einem EST (H1A6T7) von einer 3-Tages-Setzling-Hypocotyl-Bibliothek entsprach. Dieser Klon wurde erhalten von dem Arabidopsis Biological Resource Centre der Ohio State University (USA), und zwar vollständig sequenziert und bezeichnet mit CTS (Seq. ID-Nr. 1).
Eine bioinformatische Analyse der Sequenz machte klar, dass diese für ein Protein mit 1.337 Aminosäuren mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 149.576 kodiert (Seq. ID-Nr. 2). Funktionale ABC-Transporter haben 4 Domänen, zwei Sätze mit 5 oder 6 Transmembran-Spannen und zwei ATPase-Domänen, die auf getrennten Polypeptid-Ketten vorliegen oder in verschiedenen Kombinationen verbunden sein können. CTS ist von dem Typ, in dem alle Domänen verbunden sind, während ScPxa2p vom Halb-Transporter-Typ ist, der eine Transmembran-Domän und eine ATPase-Domän enthält. CTS enthält alle konservierten Reste, die typisch für einen ABC-Transporter sind. Die beiden Halb-Transporter-Domänen von CTS sind zu 34% identisch miteinander. Die höchsten Übereinstimmungen bei der BLASTp-Suche (P < 7,1e-67) sind die Säuger PMP70- und Adrenoleukodystrophy-Proteine, ebenfalls Halb-Transporter, die in den Fettsäure-Transport in Peroxisome involviert sind. Saccharomyes cerevisiae Pxa2p ist die sechst-häufig ähnliche Sequenz (P = 1,5e-44). Eine Abstimmung der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen von CTS mit PMP70, ALDP, ScPxa1p und ScPxa2p ist in 2 gezeigt. Die ATP-Bindungsstelle, bezeichnet als Walker-A- und -B-Motive sind in allen ATPasen hochgradig konserviert. Die C-Sequenz, sonst bekannt als das ABC-Motiv, ist diagnostisch für die ABC-Transporter-Superfamilie, wie auch die EAA-Sequenz. Die Sequenz NSEEIAFY ist diagnostisch für die peroxisomalen ABC-Transporter beim Menschen und bei der Hefe, und die nahe verwandte Sequenz H (S/A) SIAF (Y/F) tritt in den beiden Hälften von CTS auf. Der Loop1-Bereich und die Sequenz PQRPVMTLGTLRDQ ist diagnostisch für tierische peroxisomale ABC-Transporter. Die nahezu identische Sequenz PQRPV(M/T)(A/C)LGTLRDQ tritt in beiden Hälften von CTS auf. Daher enthalten CTS Sequenzen, die es der peroxisomalen Unterklasse von ABC-Transportern zuordnen.
Um zu bestimmen, ob das Expressions-Muster von CTS konsistent mit dessen Involvierung in eine Fettsäure-Aufnahme in Peroxisomen war, wurde ein Northern Blot-Test durchgeführt (2). Die Fettsäure-Oxidation ist ein andauernder Vorgang in Pflanzenzellen aufgrund des Umsatzes von Membran-Lipiden durch β-Oxidation. Jedoch würden höhere Werte der Expression während und unmittelbar nach einer Keimung erwartet, wie es für die β-Oxidations-Enzyme Thiolase (Germain et al., 2001) und Acyl CoA-Oxidase beobachtet wird (Hooks et al., 1999). Konsistent damit weist die CTS-Sonde ein Transkript von 4,9 kb nach, das über die ersten 12 Tage nach einem Tränken exprimiert wird, jedoch bei höchster Expression am Tag 1.
Um einen experimentellen Nachweis für die peroxisomale Lokalisierung von CTS zu liefern, wurden Antik-Körper für die zweite ATPase-Domän gezüchtet. Ein den Aminosäuren 1.112–1.337 entsprechendes Fragment wurde in pEP28b geklont (Novagen) und so ein mit his-getaggtes rekombinantes Gen produziert. Das rekombinante Protein, das in Inklusions-Körpern vorliegt, wurde durch NTA-Agarose-Chromatographie gereinigt (3). Affinitäts-gereinigte Antiseren wiesen ein Protein einer Größe von ca. 140 kDa in Membran-Fraktionen von Arabidopsis-Setzlingen und Gewebe-Kulturzellen nach (4). Weitere Experimente zeigten die Lokalisation dieses Proteins speziell in Peroxisomen/Glyoxisomen (7).
Bisher wird die Funktion des CTS-Proteins abgeleitet von einer Sequenz-Homologie mit bekannten peroxisomalen Fettsäure-ABC-Transportern. Zum Erhalt funktioneller Informationen für CTS wurden Knockout-Mutationen in Arabidopsis durch genetische Rückwärts-Schritte gesucht. Primer wurden entworfen und an die Arabidopsis-Knockout-Stelle an der University of Wisconsin (USA) gesandt, um deren Population an T-DNS-getaggten Mutanten einem Screening zu unterwerfen. Drei Allele von CTS wurden nachgewiesen (5). Der Ort der T-DNS-Insertionen wurde bestimmt durch Sequenzieren der PCR-Produkte. T-DNS-Insertionen gibt es im Exon-2 und in den Introns 1 (in der 5'-UTR) und 4 von CTS. Die Insertionen in Exon 2 von CTS wurden als Null-Allele vorausgesagt, während diejenigen in den Introns Phenotypen ergeben können oder nicht ergeben können, abhängig davon, dass sie korrekt von dem Transkript ausgesplict werden. Einzelne heterozygote Pflanzen wurden für jede T-DNS-Insertion erhalten (6). Heterozygote cts-2-Pflanzen ließ man sich selbst befruchten, und homozygote Nachkommen wurden selektiert. Homozygote Samen und Setzlinge wurden einem Profilieren auf Triacylglycerin und Acyl CoA unterworfen (8). Diese Ergebnisse liefern eine starke Stütze für die vorgeschlagene biochemische Funktion von CTS als Fett-Acyl-CoA-Transporter.
Verfahrensweisen
Das cts-2-Mutanten-Allel wurde erhalten durch PCR-basiertes Screening der Wisconsin-alpha-Gen-Knockout-Linien für Insertionen in das CTS-Gen (Krysan et al., 1999). Die Sequenz der CTS-RNS wurde erhalten unter Verwendung des cDNS-Klons H1A6T7 (ABRC, OHIO State University). Die Gesamt-RNS wurde extrahiert, durch denaturierende Agarosegel-Elektrophorese getrennt und in eine Hybridisierungs-Membran übertragen. Die Membran wurde mit 32P-markiertem Klon H1A6T7 hybridisiert, wie beschrieben wurde durch „Hooks et al., (1999)" und wurde durch Photoabbilden nachgewiesen.
Ein polyklonaler Antikörper wurde gegen ein C-terminales Fragment von CTS (Aminosäuren 1.112–1.337) gezüchtet und in dem E. coli-Stramm BL21 (DE3) pLysS (Firma Novagen) unter Verwendung eines Konstrukts pET28b (Firma Novagen) exprimiert, das ein NheI-BamHI-Fragment des cDNS-Klons H1A6T7 enthielt (EMBL, Zugang AJ311341). Der Antikörper wurde unter Verwendung des rekombinanten Fragments Affinitäts-gereinigt (Tugal et al., 1999).
Acyl CoAs und Gesamt-Lipide wurden von fünf Replikat-Gewebeproben (3–10 mg) extrahiert und entsprechend Larson und Graham (2001) analysiert. Ein Aliquot des Gesamt-Lipid-Extrakts wurde für eine Triacyl-Glycerol-Bestimmung (TAG) verwendet. Eine Bond-Flut-SPE-Säule (Firma Varian, Surrey, UK) mit 1 ml und 100 mg Bett-Volumen wurde hergestellt durch Elution mit 2 × 1 ml Methanol, 3 × 1 ml Hexan und danach wurden 100 μl Probe in Hexan aufgegeben. Die TAGs wurden mit 1,5 ml einer Mischung aus Chloroform und Hexan (2:3, v/v) eluiert, im Vakuum getrocknet, zu Fettsäuremethylestern transmethyliert und wie früher beschrieben analysiert (Larson und Graham, 2001). Die Spezifität für eine TAG-Trennung wurde optimiert, so dass das Dipalmitin-Diacylglycerol (Firma Sigma) von dem SPE-Eluat ausgeschlossen wurde.
Um weitere Informationen über die spezielle Natur des Blocks beim Lipid-Abbau und damit die Funktion des CTS-Proteins zu liefern, wurden die Konzentrationen an Triacylglycerol (TAG) und Acyl CoAs in der cts-2-Mutante und dem korrespondierenden WS-Wild-Typ gemessen. Alle Zell-Linien wurden in Gegenwart von 1% Sucrose ausgekeimt, und die Tests der cts-2-Mutanten wurden abgebrochen, um eine Keimung zu ermöglichen, um sicherzustellen, dass die Setzlinge in ähnlichen morphologischen Stufen der Entwicklung waren. Die aufsummierten Änderungen des Fettsäure-Gehalts von extrahierten TAG zeigen ähnliche Konzentrationen von TAG abgeleiteten Fettsäuren in getränkten Samen des Wild-Typs und der Mutante am Tag 0 (8a). Höhere offensichtliche TAG-Konzentrationen pro Samen bzw. Setzling in den Mutanten geben eine größere Samen-Größe wieder, und diese sind nicht ersichtlich, wenn die Daten ausgedrückt werden auf Basis des Frischgewichts. Die TAG-Fettsäure-Konzentrationen gingen nur leicht nach zwei Tagen Keimung selbst in Setzlingen des Wild-Typs zurück, vermutlich aufgrund der Gegenwart von Sucrose als alternative Energiequelle. Jedoch waren am Tag 5 die Konzentrationen an TAG-abgeleiteten Fettsäuren um 95,8% der Konzentration des Wild-Typs zurückgegangen, jedoch nur um 32,3% bei der Mutante. Alle TAG-abgeleiteten Fettsäure-Kettenlängen wurden nach 5 Tagen Keimen mobilisiert beim Wild-Typ, jedoch hielt die cts-2-Mutante hohe Konzentrationen derselben TAGs aufrecht (8b, c).
Die Werte an Gesamt Acyl CoAs stiegen in beiden Linien über den Zeitraum von 0 bis 5 Tagen an (8d), jedoch ist dies viel dramatischer in der Mutante. Am Tag 5 kann ein Teil des Anstiegs sowohl in Setzlingen des Wild-Typs als auch in Setzlingen der Mutante eine neue Lipid-Synthese widerspiegeln (z. B. für eine Membran-Biogenese). Jedoch ist die am meisten deutliche Beobachtung die Beibehaltung von 20:1-CoAs (und in einem geringen Ausmaß von 20:0- und 22:1-CoAs) in Setzlingen der cts-2-Mutante (8e, f). Da C20-Fettsäuren nur sehr untergeordnete Komponenten von nicht Speicher-Lipidenin Arabidopsis sind, zeigen diese Daten, dass es eine starke Blockierung des Kohlenstoff-Flusses von gespeicherten Triacylglycerinen während der Keimung in der Mutante gibt.
Eine Analyse der TAG-abgeleiteten Fettsäuren und Acyl CoAs zeigt, dass trotz der Tatsache, dass etwas Lipid in den cts-2-Mutanten mobilisiert wird, ein Katabolismus vor einer β-Oxidation inhibiert wird, was zu einem erhöhten Acyl CoA-Pool führt. Dies ist besonders ausgeprägt für C₂₀- und C₂₂-Acyl CoAs, die überwiegend von TAG abgeleitet sind. Diese Daten legen stark nahe, dass der Primär-Defekt in den cts-2-Mutanten im Transport von Fettacyl CoAs in Peroxisome liegt. 18:2- und 18:3-CoAs sammelt sich nicht in einem ähnlichen Ausmaß an, was ihre Verwendung in der Synthese strukturelle Lipide durch ER-vermittelte Wege widerspiegelt. Im Gegensatz dazu sind C20:1 eine Komponente von strukturellen Lipiden und können sich ansammeln, da es keinen synthetischen Entsorgungs-Weg gibt. Es ist möglich, dass die Ansammlung von 20:1-CoA oder die Abreicherung an freiem Enzym A zur Inhibierung einer Lipolyse und daher zur Freisetzung weiterer Fettsäuren von Speicher-TAG führt. Die Ansammlung von Acyl CoAs steht dafür, dass diese die Substrate des CTS-Proteins sind und legt nahe, dass – anders als bei X-ALD-Patienten – CTS-Mutanten ihre VLCFA-Synthetase-Aktivität beibehalten. Die erhebliche Ansammlung von Acyl CoAs mit langen und sehr langen Ketten in der cts-2-Mutante ist konsistent mit der Aktivierung dieser Fettsäuren durch Acyl CoA-Synthetasen auf der cytoplasmatischen Seite der Peroxisomal-Membran, wie in Reports belegt wurde für S. cerevisiae (Hettema et al., 1996), Säuger (Mannaerts et al., 1982) und Pflanzen (Olsen und Lusk, 1994). Das Ergebnis, dass alle Fettsäure-Kettenlängen im Wild-Typ mobilisiert werden und in der Mutante erhalten bleiben, legt nahe, dass der Transporter eine breite Substrat-Spezifität in Bezug auf die Acyl-Kettenlänge aufweist. Acyl CoAs sind amphipathische Moleküle, wie es auch die Substrate für viele ABC-Transporter sind.
Ölsamen können einem Engineering unterworfen werden und produzieren dann wirtschaftlich wertvolle, ungewöhnliche Fettsäuren. Jedoch das genaue Schicksal der ungewöhnlichen Fettsäure, sobald sie einmal hergestellt wurde, ist nicht bekannt. Was bekannt ist, ist, dass nicht genügend der wertvollen Fettsäure im Samenöl endet. Ein Faktor, der die Ausbeute an neuem Öl zu limitieren scheint, ist, dass die Fettsäuren, aus denen es besteht, abgebaut werden, bevor sie in das Öl eingebaut werden (Eccleston und Ohlrogge, 1998). CTS, die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, ist ein ausgezeichneter Kandidat zum Involvieren am Beginn dieses Prozesses. Wie durch die Daten in 8 angezeigt wird, reduziert oder beseitigt ein Mutieren der Funktion von CTS den Eintritt einiger oder aller Fettsäuren in das Glyoxisom/Peroxisom und verhindert so deren Abbau. Es lässt sich voraussagen, dass dies ihre Ansammlung im Samen oder anderen Pflanzen-Geweben ermöglichen würde. Jedoch ist es nötig, dass die Pflanze noch in der Lage ist, endogene Fettsäuren zum Keimen und Wachsen zu gebrauchen. Ein Blockieren der β-Oxidation durch die Mutation von Thiolase führt zu einer Keimung, jedoch ist das anschließende Wachstum abhängig von exogen zugeführter Sucrose (Germain et al., 2001). Es sollte möglich sein, die Expressions-Grade von CTS in spezifischen Geweben oder zu spezifischen Zeiten zu verändern, beispielsweise seine Aktivität beim Entwickeln von Samen zu inhibieren, jedoch nicht beim Keimen der Samen. Alternativ könnte man dann, wenn man die Substrat-Spezifität bestimmen und dann verändern kann, in der Lage sein, eine Ansammlung der gewünschten neuen Öle zu ermöglichen, nicht jedoch eine Keimung und ein Austreiben der Setzlinge unter Verwendung endogener Fettsäuren zu verhindern. Ein zusätzliches Problem ist, dass dann, wenn hohe Konzentrationen an neuen Ölen erreicht werden, Ölsamen diese Fremdöle nicht als effiziente Quelle von "Brennstoff" für junge Setzlinge zum Wachsen nutzen können, was zu einem nicht-lebensfähigen Samen führt. Beispielsweise könnte ein Exprimieren einer Form von CTS, die die neuen Öle in dem sich entwickelnden Samen nicht transportieren kann, jedoch auf eine Form umschalten kann, die die neuen Öle als Substrat während der Keimung nutzen kann, dieses Problem überwinden. Diese Proteine mit geänderter Substrat-Spezifität könnten auftreten als Ergebnis einer gezielten oder zuverlässigen Mutation des Gens mit anschließender passender Selektion oder einer Verwendung des Arabidopsis-Proteins zum Isolieren von Homologen, die unterschiedliche Substrat-Spezifität gegenüber der Spezies haben können, die natürlicherweise hohe Konzentration der gewünschten neuen Öle ansammelt. Daher hat das Protein der vorliegenden Erfindung das Potential zur Erhöhung der Ansammlung neuer Öle in Samen auf wirtschaftlich brauchbare Werte.
Mutanten der β-Oxidation zeigen Resistenz gegenüber 2,4-Dichlorphenoxybuttersäure (2,4-DB, Hayashi et al., 1998) und Indol-3-Buttersäure (IBA; Zollmann et al., 2000), und die β-Oxidation wird in den cts-2-Mutanten klar verschlechtert, da höchstwahrscheinlich als Folge eines Defekts im Transport von Fettacyl CoAs in das Peroxisom zum Metabolismus. CTS zeigt auf denselben Ort auf dem Chromosom IV wie die ped3-Mutante (Hayashi et al., 1998). IBA und 2,4 DB sind amphipathische Moleküle, und CTS ist ein guter Kandidat zur Vermittlung ihrer Aufnahme in Peroxisome. Wenn eine dominant-negative oder RNSi-Version von CTS unter Steuerung eines regulierten Promoters exprimiert werden könnte, könnte diese als selektierbarer Marker für eine Pflanzen-Transformation verwendet werden. Die Expression der dominant-negativen Form des Proteins würde höchstwahrscheinlich Resistenz gegen IBA oder 2,4 DB verleihen. Resistenz führt zu einem „long root"-Phenotyp und würde es ermöglichen, dass Pflanzen, die diesen Marker exprimieren, auf einem Medium selektiert werden können, das IBA oder 2,4 DB, Sucrose und das induzierende Molekül für den regulierten Promoter enthält. Der Vorteil ist, dass der selektierbare Marker pflanzlichen Ursprungs ist und – anders als beispielsweise Resistenz gegen ein Herbizid – eine Selektion nur in Gegenwart der drei getrennten Moleküle gestattet, was in der Natur nicht stattfinden wird. Dies liefert keine Antibiotika-Resistenz, so dass keine Gefahr einer Verbreitung von Resistenz in die Umgebung vorhanden ist. Die Verwendung eines regulierten Promoters führt zur Expression der Selektion nur unter definierten Bedingungen.
Druckschriften

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Germain, V., Rylott, E. Larson, T. R., Sherson, S. M., Bechtold, N. Carde, J-P., Bryce J. H. Graham, I. A. und Smith, S. M. (2001) Plant 128, 1–12.
Hayashi M, Toriyama, K, Kondo, M. ad Nishimura, M. (1998) Plant Cell 10, 183–195.
Hettema, E. H., van Roermund, CWT, Distel, B. van den Berg, M. Vilela, C., Rodrigues-Pousada C, Wanders, RJA und Tabak, HF (1996) EMBO J. 15, 3813–3822.
Hooks, MA., Kellas, F. und Graham, LA. (1999) Plant J. 20, 1–3.
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Mosser, J. Douar, A. M., Sarde, C-C)., Kioschis, P. Feil, R. Moser, H., Poustka, A-M., Mandel, J-M and Augbourg, P (1993). Nature 361, 726–730.
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Zollman B. K., Yoder, A. und Bartel, B. (2000) Genetics 156, 1323–1337

Seq. ID-Nr. 1 Nukleotid-Sequenz von CTS
Seq. ID-Nr. 2: abgeleitete Aminosäure-Sequenz der CTS-cDNS voller Länge
Graue Unterlegung sind konservierte EAA-Motive; weiße Schrift auf Schwarz ist die ATP-Bindungstelle (Walker-A-Motiv); fettgedrückt: ABC-Familien Signatur PCR-Primer, die spezifisch für die CTS-Nukleotid-Sequenz sind.
Vorwärts-Primer:
Rückwärts-Primer:
Primer JL 202: Left Border-Primer für PCR, aus Konstrukten der Wisconsin-Knockout-Population alpha.
Sequenzliste

Claims

Verwendung einer isolierten Nukleinsäure, die eine Nukleotid-Sequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das als peroxisomaler Fettsäure-Transporter in Pflanzen fungiert, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus: (i) einer Nukleinsäure-Sequenz, wie sie in Seq.-ID Nr. 1 abgebildet ist; (ii) einer Nukleinsäure-Sequenz, die von der in Seq.-ID Nr. 1 abgebildeten Sequenz entsprechend der Degeneration des genetischen Codes abgeleitet ist; in einem oder mehreren der folgenden Prozesse: Regulierung des Fettsäure- oder Acyl-CoA-Transports durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom- und/oder Zell-Membranen; Regulierung des Wachstums, Regulierung der Samen-Entwicklung; und Modulierung der Fettsäure-Nutzung durch eine Pflanze.
Verwendung eines isolierten Nukleinsäure-Moleküls nach Anspruch 1, das für ein Polypeptid kodiert, das als peroxisomaler Transporter von AcylCoAs wechselnder Kettenlängen, wechselnden Grads der Unsättigung und Substitution und ihrer Analoge und Derivate fungiert.
Verwendung eines Gen-Konstrukts, umfassend eine isolierte Nukleinsäure nach einem der beiden Ansprüche 1 oder 2, worin die isolierte Nukleinsäure funktionell mit einem oder mehreren Regulator-Signalen verbunden ist.
Verwendung eines Gen-Konstrukts nach Anspruch 3, worin das Regulator-Signal eine Sequenz umfasst, die für einen Promoter kodiert.
Verwendung eines Gen-Konstrukts nach einem der beiden Ansprüche 3 oder 4, weiter umfassend ein zusätzliches Gen, das mit Metabolismus, Katabolismus oder Synthese eines endogenen oder exogenen Produktes verbunden ist.
Verwendung eines Vektors, umfassend die isolierte Nukleinsäure nach einem der beiden Ansprüche 1 oder 2 oder ein Gen-Konstrukt nach einem der Ansprüche 3 bis 5 beim Regulieren des Fettsäure- oder AcylCoA-Transports durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom- und/oder Zell-Membranen, beim Regulieren des Wachstums, beim Regulieren der Samen-Entwicklung; und beim Modulieren der Fettsäure-Verwendung durch eine Pflanze.
Verwendung einer Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 6 transfektiert ist, bei der Regulierung des Fettsäure- oder AcylCoA-Transports durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom- und/oder Zell-Membranen; beim Regulieren des Wachstums; beim Regulieren der Samen-Entwicklung; und beim Modulieren der Fettsäure-Verwendung durch eine Pflanze.
Verfahren zum Regulieren eines oder mehrerer der folgenden Prozesse: Fettsäure-Transport durch Peroxisom- und/oder Glyoxisom-Membranen; Samen-Entwicklung; und Fettsäure-Verwendung durch eine Pflanze, umfassend ein Genetic Engineering einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzen-Gewebes oder eines Pflanzensamens unter Erhöhen und Verringern/Verhindern einer Expression der Nukleinsäure, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
Verfahren zum Modifizieren einer Pflanzenzelle zum Erhöhen oder Erniedrigen des Transports einer oder aller Fettsäuren durch Zell-Membranen und/oder zur Erhöhung oder Verhinderung ihres Zusammenbruchs in speziellen Geweben oder zu speziellen Zeiten, umfassend ein Genetic Engineering der Pflanzenzelle zur Erhöhung oder Verringerung/Verhinderung der Expression der Nukleinsäure, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
Primer, umfassend eine der Seq.-ID Nrn. 3 bis 10, der in der Lage ist, die Nukleinsäure zu erkennen, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
Verwendung eines Primers, der eine der Seq.-ID Nrn. 3 bis 10 umfasst, der in der Lage ist, die Nukleinsäure zu erkennen, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.