JP2001037490A - カフェイン合成系関連酵素をコードする遺伝子及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、カフェイン合成系にあるＮ−メチ
ルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの全部もしく
は一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセ
ンスの形で組み込むことにより、（１）工業用、食品用
または医療用酵素として利用できるＮ−メチルトランス
フェラーゼの効率的な生産、（２）カフェイン産生植
物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を
改変することによるカフェイン代謝系の化合物の効率的
生産、及び（３）カフェイン産生植物、植物組織または
植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変することによる
カフェイン代謝系の化合物群の生成比の改変等の課題を
達成する。 【解決手段】 配列番号１に記載のアミノ酸配列または
該アミノ酸配列の変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮ
Ａをセンスまたはアンチセンスの形で組み込んだベクタ
ーで、微生物、植物体または培養細胞を形質転換する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カフェイン合成系
を構成する酵素の一つである７−メチルキサンチンＮ３
メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルト
ランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトラン
スフェラーゼの３つのメチルトランスフェラーゼ活性を
同時に有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフ
ェラーゼ及びその変異体、これらのいずれかをコードす
るヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分
子、これらの分子を用いたベクター、該ベクターによる
形質転換細胞及びこれらの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】カフェインは、チャ（Camellia sinensi
s）などのツバキ科ツバキ属植物やコーヒー（Coffea ar
abica）等のアカネ科コーヒー属植物等に含まれるプリ
ンアルカロイドで、医薬品原料や食品添加物として使用
されている。現在のところ、カフェインは前記植物種を
始めとするカフェイン産生植物からの抽出、または有機
合成によって製造されている。また、チャやコーヒーな
どの嗜好品においては、それらの刺激性を緩和また又は
増強するために、古典的な育種手法等を用いてカフェイ
ンおよびその中間体の含有量の低減または増加が試みら
れている。

【０００３】Phytochemistry, 31, 2575-（1992）に
は、カフェインがキサントシンから３段階のＮ−メチル
化を経て生合成されることが¹⁴Ｃ−トレーサー実験によ
り明らかにされている。この反応経路を以下に示す。

【０００４】

【化１】

【０００５】このメチル化を触媒する酵素活性、すなわ
ちメチルトランスフェラーゼ活性は、１９７５年にチャ
葉の粗抽出液を用いた研究で最初に報告された（Bioche
m.J., 146, 87-（1975））。コーヒーでメチルトランス
フェラーゼの精製が試みられているが（Phytochemistr
y, 37, 1577-（1994））、精製倍率はきわめて低い。チ
ャでは、メチルトランスフェラーゼの部分精製の報告は
あるが（Physiol.Plant., 98, 629-（1996））、酵素タ
ンパク質は単離されていない。

【０００６】以上のように、カフェイン合成系酵素、即
ち、カフェインの生合成の最終反応である７−メチルキ
サンチン〜テオブロミン〜カフェインの２段階のメチル
化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミ
ノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関
しては、これまでのところ全く知られていなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、カフ
ェインの合成に有用なカフェイン合成系を構成する酵素
の一つである７−メチルキサンチンＮ３メチルトランス
フェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラー
ゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼと
しての酵素活性を同時に有するＮ−メチルトランスフェ
ラーゼ、微生物や植物におけるカフェイン生産の増強や
抑制に有用なこのＮ−メチルトランスフェラーゼをコー
ドするＤＮＡまたはＲＮＡ分子、及びそれを用いたベク
ター等を提供することにある。

【０００８】例えば、本発明にかかるＤＮＡ分子の全部
もしくは一部を、微生物または植物細胞に、センスまた
はアンチセンスの形で組み込むことにより、以下の目的
を達成することが可能となる。 （１）工業用、食品用または医療用酵素として利用でき
るＮ−メチルトランスフェラーゼを効率よく生産する。 （２）カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞の
カフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化
合物を効率よく生産する。 （３）カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞の
カフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化
合物群の生成比を改変する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、チャの幼葉から部分精製された７−メチルキサ
ンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ
１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メ
チルトランスフェラーゼの３つの酵素活性を同時に有す
るポリペプチドとしてのＮ−メチルトランスフェラーゼ
のＮ末端アミノ酸配列を解析した。その結果を基に、Ｄ
ＮＡプローブを作成し、このプローブを用いてＲＴ−Ｐ
ＣＲ法および５’ＲＡＣＥ法により目的とするＤＮＡ分
子を単離することに成功した。

【００１０】次に、このＤＮＡ分子をベクターに組み込
んだ後、大腸菌に導入し、当該ＤＮＡ分子に由来するポ
リペプチドを大量に発現させた。発現したポリペプチド
を回収してその酵素学的性質を調べたところ、チャの幼
葉から分離した上記の３種のＮ−メチルトランスフェラ
ーゼ活性を有するポリペプチドと同一の反応、すなわち
パラキサンチンからのカフェインの生成が認められ、当
該ＤＮＡ分子がカフェイン合成系を構成する酵素の一つ
である上記の３つのＮ−メチルトランスフェラーゼ活性
を同時に有するＮ−メチルトランスフェラーゼをコード
する遺伝子を有することを確認した。

【００１１】Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をメ
チル基供与体としてキサントシン類化合物やキサンチン
類化合物にＮ−メチル化を行う植物であれば、本発明に
かかるＮ−メチルトランスフェラーゼあるいはそれと同
一の酵素活性を有するポリペプチド、更にはこれらをコ
ードするＤＮＡが含まれていると推測され、本発明に記
載の方法を用いれば、それらの植物からも、本発明にか
かるＮ−メチルトランスフェラーゼあるいはそれと実質
的に同一の酵素、更にはこれらをコードするＤＮＡ分子
またはＲＮＡ分子を得ることができる。

【００１２】本発明者らは以上の知見に基づいて本発明
を完成するに至った。すなわち、本発明には以下の各態
様が含まれる。

【００１３】本発明にかかるＤＮＡ分子は、以下のヌク
レオチド配列： （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７
−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テ
オブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサ
ンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性
を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼをコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）前記ヌ
クレオチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）が
コードするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範
囲内で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って
得られた変異ヌクレオチド配列のいずれかを有すること
を特徴とする。

【００１４】この変異ヌクレオチド配列（ｂ）として
は、ヌクレオチド配列（ａ）とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし得るものが好ましい。

【００１５】本発明にかかるＲＮＡ分子は、以下のヌク
レオチド配列： （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７
−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テ
オブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサ
ンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性
を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼをコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）前記ヌ
クレオチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）が
コードするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範
囲内で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って
得られた変異ヌクレオチド配列のいずれかを有すること
を特徴とする。

【００１６】この変異ヌクレオチド配列（ｂ）として
は、ヌクレオチド配列（ａ）とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし得るものが好ましい。

【００１７】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼ発現用のベクターは、上記のＤＮＡ分子と、該ＤＮ
Ａ分子によりコードされたＮ−メチルトランスフェラー
ゼを植物細胞中で発現させるための構成と、を有するこ
とを特徴とする。この発現用ベクターを用いて、宿主細
胞を形質転換することで、形質転換細胞を得ることがで
きる。更に、この形質転換細胞を培養して、前記酵素活
性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼを製造するこ
とができる。

【００１８】本発明にかかるＤＮＡ分子の他の態様は、
上記のＤＮＡ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は
一部に相補的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活
性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植
物細胞の該酵素活性を阻害し得ることを特徴とする。

【００１９】本発明にかかるＲＮＡ分子の他の態様は、
上記のＲＮＡ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は
一部に相補的な配列であって、前記酵素活性を有する植
物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵
素活性を阻害し得ることを特徴とする。

【００２０】本発明にかかるベクターの一態様は、上記
のＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子のいずれかを含むことを特
徴とする。このベクターは、例えば、微生物および／ま
たは植物の細胞内で、７−メチルキサンチンＮ３メチル
トランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランス
フェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェ
ラーゼの酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラー
ゼを発現させることができるか、もしくは該Ｎ−メチル
トランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有するもの
として提供することができる。このベクターを用いて、
微生物、植物細胞、植物組織または植物体を形質転換す
ることができ、得られた形質転換体も本発明に含まれ
る。この植物細胞、植物組織または植物体の形質転換体
を用いて植物二次代謝産物を製造させることができる。
また、この植物細胞、植物組織または植物体を用いて植
物二次代謝産物の組成を改変することができる。

【００２１】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼは、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェ
ラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及
びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとして
の酵素活性を有するポリペプチドであって、（ａ）配列
表の配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｂ）配列表
の配列番号：１のアミノ酸配列に、該アミノ酸配列に、
前記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置換、
挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有
することを特徴とする。

【００２２】この変異アミノ酸配列（ｂ）としては、ア
ミノ酸配列（ａ）をコードするＤＮＡと、この変異アミ
ノ酸配列（ｂ）をコードするＤＮＡとがストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし得るものが好ましい。

【００２３】本発明によれば、カフェインの合成、微生
物や植物において生産されるカフェインの組成の改変な
どに有用なカフェイン合成系を構成する酵素の一つであ
る７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラー
ゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパ
ラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵
素活性を同時に有するポリペプチドであるＮ−メチルト
ランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子及びＲＮＡ分
子が提供される。

【００２４】

【発明の実施の形態】本発明にかかるＮ−メチルトラン
スフェラーゼは、７−メチルキサンチンＮ３メチルトラ
ンスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェ
ラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラー
ゼとしての酵素活性を同時に有するポリペプチドであ
る。

【００２５】このＮ−メチルトランスフェラーゼとして
は、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有しているも
の、配列番号：１のアミノ酸配列に、所望とするＮ−メ
チルトランスフェラーゼ活性を損なわない範囲で、アミ
ノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミ
ノ酸配列を有しているものを挙げることができる。すな
わち、所望とする上記のＮ−メチルトランスフェラーゼ
活性を有する配列番号：１のアミノ酸配列及びその変異
配列を有するポリペプチドをＮ−メチルトランスフェラ
ーゼと総称する。

【００２６】上記の変異アミノ酸配列を有するポリペプ
チドとしては、それ自身が実質的にチャ幼葉のＮ−メチ
ルトランスフェラーゼと同等の機能を有し、且つ配列番
号：１のアミノ酸配列と酵素活性にかかわる部位におい
て高い相同性を有しているものを挙げることができる。

【００２７】一般に同等の機能を有する複数の酵素間に
おいて、酵素活性に必須である部位以外のアミノ酸配列
の相同性は非常に低いことがあることは良く知られてい
る（Kawagoe et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93, 12
082-(1996)）。従って、全体としての相同性が低い場合
でも、活性にかかわる部位において高い相同性を有する
ものは本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼと
して分類できる。

【００２８】アミノ酸配列全体として比較した場合にお
ける変異アミノ酸配列としては、配列番号：１のアミノ
酸配列に対して、１５％以上の相同性、好ましくは３０
％以上の相同性、より好ましくは４５％以上の相同性、
更に好ましくは６０％以上の相同性、さらにより好まし
くは７５％以上の相同性、さらにより一層好ましくは９
０％以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相同性
を有し、かつ所望のＮ−メチルトランスフェラーゼ活性
を有するポリペプチドを提供できる変異アミノ酸配列を
挙げることができる。

【００２９】なお、配列番号：１のアミノ酸配列を基準
とした変異を、これらをコードするヌクレオチド配列の
レベルで表現した場合、変異アミノ酸配列をコードする
変異ヌクレオチド配列としては、配列番号：１のアミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、３５％
以上の相同性、好ましくは６０％以上の相同性、より好
ましくは７５％以上の相同性、さらに好ましくは９０％
以上の相同性、更に好ましくは９５％以上の相同性を有
する変異ヌクレオチド配列を挙げることができる。

【００３０】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼをコードするヌクレオチド配列、すなわちＮ−メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子としては、配列番号：１の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を挙げるこ
とができ、その具体例としは、配列番号：２のＤＮＡ配
列、配列番号：３のＲＮＡ配列を挙げることができる。
これらのＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子に対し
て、上記で規定される相同性を有するヌクレオチド配列
も本発明におけるＮ−メチルトランスフェラーゼをコー
ド遺伝子に含まれる。

【００３１】所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ
活性を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異ア
ミノ酸配列をコードする変異ヌクレオチド配列と、配列
番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る
ものが実用上好適に利用し得る。

【００３２】また、変異Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
遺伝子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。そ
の具体例としては、配列番号：２のヌクレオチド配列に
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮ
Ａ分子及び配列番号：３のヌクレオチド配列にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし得るＲＮＡ分子を
挙げることができる。

【００３３】このストリンジェントな条件下でのハイブ
リダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning: Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocol
s inMolecular Biology; Wiley Interscienceに記載の
方法によって行うことができ、市販のシステムとして
は、GeneImageシステム（アマシャム）を挙げることが
できる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼ
ーションを行うことができる。

【００３４】試験すべきＤＡＮまたはＲＮＡ分子を転写
した膜を、製品プロトコールに従って、標識したプロー
ブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッフ
ァー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーショ
ンバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％
デキストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキ
ング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試
薬としては、例えば、１００×Denhardt's solution、
２％（重量／容量）Bovine serum albumin２％（重量
／容量）Ficll^TM400、２％（重量／容量）ポリビニルピ
ロリドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈し
て使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナ
トリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、よ
り好ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜
５×ＳＳＣの濃度で使用する。

【００３５】ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜
８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは
５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュ
ベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗
浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリ
ダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成
は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好まし
くは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好まし
くは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好まし
くは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好まし
くは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。
このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハ
イブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を、プロ
ーブに用いた標識を利用して識別することができる。

【００３６】なお、変異は、自然界において生じたもの
でもよく、ヌクレオチド配列における部位突然変異によ
り人工的に起こしたものでも良い。

【００３７】本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺
伝子を有するＤＮＡ分子は、例えば、Ｎ−メチルトラン
スフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に特異的にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
いたＰＣＲ技術（植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞
工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社(1995)）を
利用して、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラー
ゼを生産する細胞から分離することができる。

【００３８】具体的には、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮ
Ａにリンカーを結合させ、Ｎ−メチルトランスフェラー
ゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡとリンカ
ー間でＰＣＲを行うこと等により、目的ｃＤＮＡの全長
配列を単離することができる。

【００３９】このようなハイブリダイゼーション技術や
ＰＣＲ技術により得られるＮ−メチルトランスフェラー
ゼをコードするＤＮＡ分子は、少なくとも単離に使用し
た部位においては、配列番号：２に記載のＮ−メチルト
ランスフェラーゼ遺伝子と相同性を有する。ここで相同
性とは、それぞれのＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝
子がコードするアミノ酸配列の比較において１５％以上
の相同性、好ましくは３０％以上の相同性、より好まし
くは４５％以上の相同性、更に好ましくは６０％以上の
相同性、さらにより好ましくは７５％以上の相同性、さ
らにより一層好ましくは９０％以上の相同性、最も好ま
しくは９５％以上の相同性を指す。ただし、得られるＮ
−メチルトランスフェラーゼ遺伝子によっては、コード
するアミノ酸の複数の残基が欠失、付加、置換された結
果として、Ｎ−メチルトランスフェラーゼとの相同性が
１５％以下となってもなお、Ｎ−メチルトランスフェラ
ーゼの機能に必須な領域を保持し、実質的にＮ−メチル
トランスフェラーゼと同等の機能を有するタンパク質を
コードしていることも想定される。

【００４０】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼをコードするヌクレオチド配列（遺伝子）を有する
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を単離するために用いる生
物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する生
物であればすべて使用できるが、中でもチャなどのツバ
キ科ツバキ（Camellia）属植物、コーヒーなどのアカネ
科コーヒー（Coffea）属植物、コラノキなどのアオギリ
科コラノキ（Cola）属植物などを例示することができ
る。

【００４１】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を有するＲＮＡ分子は、Ｓｐ６プロモーター
やＴ７プロモーターといったＲＮＡポリメラーゼが認識
するプロモーターの下流に、上記方法で得たＮ−メチル
トランスフェラーゼＤＮＡを所望の向きで、機能し得る
位置に接続して組換え分子を調製し、これをＳｐ６ＲＮ
ＡポリメラーゼやＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡ
ポリメラーゼで翻訳させて得ることができる。また、植
物ウイルスにＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡない
しＲＮＡを導入するか、後で述べるように適当なＤＮＡ
発現カセットにＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡを
所望の向きで機能し得る位置に接続して組換え分子を形
成し、この組換え分子を微生物や植物等の宿主に導入す
ることにより宿主の転写活性を利用して得ることもでき
る。

【００４２】Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有
するＤＮＡ分子の全部または一部と相補性を有するＤＮ
Ａ分子、あるいはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子
を有するＲＮＡ分子の全部または一部と相補性を有する
ＲＮＡ分子であって、カフェインまたはその前駆体を産
生する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけ
るＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能
を有するものは、宿主細胞におけるＮ−メチルトランス
フェラーゼ発現の阻害または抑制用のＤＮＡ分子または
ＲＮＡ分子として用いることができる。

【００４３】ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺
伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎
として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアンチセン
スＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細
胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させる
ためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチ
ルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。
この部分としては、このようなアンチセンスｍＲＮＡの
形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩
基長の長さの部分を挙げることができる。

【００４４】アンチセンスｍＲＮＡ形成用のＤＮＡ分子
としては、例えば、配列番号：２のヌクレオチド配列の
全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子を挙げ
ることができ、アンチセンスＲＮＡ分子としては、配列
番号：３のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性
を有しているＲＮＡ分子を挙げることができる。これら
のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし得る変異配列の全部または一部と相補性を
有しているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子もこのような目
的に用いることができる。

【００４５】なお、これらの阻害用のＤＮＡ分子または
ＲＮＡ分子に対して、高い相同性を有し、所望とする阻
害又は抑制機能を発揮できるものも利用できる。ここで
高い相同性とはそれぞれのヌクレオチド配列の比較にお
いて６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同
性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、最も好まし
くは９５％以上の相同性を指す。

【００４６】これらの阻害用のＤＮＡ分子またはＲＮＡ
分子自体は、必ずしも本発明にかかるＮ−メチルトラン
スフェラーゼをコードするものでなくてもよい。

【００４７】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼ阻害用のヌクレオチド配列の他の態様としては、Ｎ
−メチルトランスフェラーゼ遺伝子と相同性を有する部
分を有するが、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコード
していないヌクレオチド配列で、宿主細胞の有するＮ−
メチルトランスフェラーゼ遺伝子と置換されることで、
宿主のＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を消失させ得
るものを挙げることができる。

【００４８】これらＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝
子またはＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害ま
たは抑制する機能を有するＤＮＡ分子の宿主細胞内での
発現について、宿主細胞として植物細胞を利用した例に
ついて以下に説明する。

【００４９】植物細胞での発現は、（ｉ）宿主細胞内で
のＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を可能とするプロモータ
ー、（ii）プロモーターの下流にセンス方向またはアン
チセンス方向に連結したＮ−メチルトランスフェラーゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片、またはＮ−メチルトランスフ
ェラーゼの発現を阻害する機能を有するＤＮＡ断片、
（iii）必要に応じてこれらＤＮＡ断片の下流に連結さ
れた転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部
位を含むターミネーター配列、などを含む発現カセット
を宿主である植物細胞に導入して、これを形質転換する
方法が利用できる。

【００５０】このような発現カセット、及びこれを含む
ベクターも本発明の対象である。

【００５１】発現カセットは、挿入されているＤＮＡを
恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを
含有し得る。また、この発現カセットは。必要に応じ
て、植物細胞内での複製のための複製オリジンを有する
ことができる。

【００５２】恒常的に発現させるためのプロモーターと
しては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５
Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙
げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモータ
ーとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵
入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散
布等の外因によって発現することが知られているプロモ
ーター等が挙げられる。このようなプロモーターとして
は、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によ
って発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターや
タバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温に
よって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモ
ーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「Ｈ
ＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘
導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気
的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイ
ネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタ
ンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の
化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーター
は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導さ
れる。

【００５３】或いはまた、発現カセットに挿入されてい
るＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、Ｎ
−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを単
離して利用する方法も挙げられる。

【００５４】具体的なプロモーターの単離方法の一例に
は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の全部又は一
部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用
により、ゲノムＤＮＡ断片を選択し、該遺伝子の上流部
ＤＮＡを特定する方法を挙げることができる。

【００５５】発現カセット中の組み換えＤＮＡ分子の植
物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び
形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺
伝子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。
このようなベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ
系、Ｍ1３ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位
で、目的の配列をベクターに導入することができる。得
られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制
限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化
学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操
作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮ
Ａに結合させることができる。各プラスミドＤＮＡの配
列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニ
ングすることができる。

【００５６】植物細胞の中に発現カセットを導入するた
めには、さまざまな手法を用いることができる。これら
の手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）また
は、アグロバクテリウム リゾゲネス（Agrobacterium r
hizogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質
転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション
法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン
法等やその他の可能性が含まれる。

【００５７】プロトプラストへの直接導入では、特別に
必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体の
ような単純なプラスミドを用いることができる。目的の
遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮ
Ａ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉ
プラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、Ｔ
ｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも
右端の配列、大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝
子の隣接領域となるように接続するのが好ましい。

【００５８】アグロバクテリウム属菌を形質転換に用い
る場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラス
ミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター
中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグ
ロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクタ
ーは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーシ
ョンによってアグロバクテリウム属菌の中に移行され
る。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域を
もつため、相同組換えによって、アグロバクテリウム属
菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主
として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領
域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラ
スミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、
Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。

【００５９】一方、バイナリーベクターはアグロバクテ
リウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープ
ラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってア
グロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉ
ｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−Ｄ
ＮＡを植物細胞に移行させることができる。

【００６０】なお、このようにして得られた発現カセッ
トを含む中間ベクターまたはバイナリーベクター、及び
これを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物
も本発明の対象である。

【００６１】形質転換された植物細胞は、再生過程を経
ることにより植物組織または植物体に変換することがで
きる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例
えばイネではFujimuraら（Plant Tissue Culture Let
t., 2, 74-（1995））の方法、トウモロコシでは、Shil
litoら（Bio/Technology, 7, 581-（1989））の方法、
シロイヌナズナではAkamaらの方法（Plant Cell Rep.,
12, 7-（1992））などが挙げられる。

【００６２】本発明において、「植物体」とは植物に分
類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、
葉、茎、根、花、果実、種子等）を指す。

【００６３】これらの方法により作出された植物体また
はその繁殖媒体（例えば種子、塊茎、切穂など）から得
た植物体は、カフェインまたはその前駆体を産生する野
生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフ
ェラーゼの発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変に
よるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト
植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生
成比の変化が起こる。このようにして得られたトランス
ジェニック植物は本発明の対象である。本発明でいう植
物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織ま
たは細胞も含まれる。

【００６４】また、近年植物のポストトランスレーショ
ナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の
外来核酸に対して植物が本来備えている防御機項を利用
して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことが
わかってきた（Cell,95,177-187(1998)、化学と生物、3
7、532-(1999)、蛋白質核酸酵素、44、1396-(1999)）。
これによれば、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が植
物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラント
ＲＮＡを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物
と配列特異的に二本鎖ＲＮＡを形成する。この二本鎖Ｒ
ＮＡはＲＮａｓｅにより分解されることにより、目的の
遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Cell,96, 3
03-(1999)）。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を
抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必
要がない点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物
の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入す
れば、その効果が植物体全体に広がることである。具体
的な発現抑制方法は、目的遺伝子の配列またはそれと高
い相同性を持つ配列の全部または一部を含む二本鎖ＲＮ
Ａや、二本鎖ＤＮＡを持つアグロバクテリウムを植物の
下位葉に感染させる。ここで高い相同性とはそれぞれの
塩基配列の比較において６０％以上の相同性、好ましく
は７５％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の
相同性、最も好ましくは９５％以上の相同性を指す。

【００６５】この方法を施された植物体は、カフェイン
またはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発
現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイ
ン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の
改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が
起こる。このようにして得られた植物は本発明の対象で
ある。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子など
の植物の特定の組織または細胞も含まれる。

【００６６】前記のＳＡＭをメチル基供与体としてカフ
ェインを生成する植物としては、チャなどのツバキ科ツ
バキ（Camellia）属植物、コーヒーなどのアカネ科コー
ヒー（Coffea）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラ
ノキ（Cola）属植物など、カフェイン産生植物を例示す
ることができる。

【００６７】本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼをコードするＤＮＡを導入してＮ−メチルトランス
フェラーゼタンパク質を大量に発現させるための微生物
としては、大腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイル
ス等のウイルスを例示することができる。

【００６８】また、ホスト細胞の代謝を改変して特定化
合物の生産性向上や特定の化合物群の生成比改変を図る
ことを目的に、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡをセンスまたはアンチセンス
の形で組み込んで形質転換植物を得るための植物として
は、カフェインまたはその前駆体を産生する植物であれ
ばすべて使用できる。

【００６９】上記の構成のベクターで形質転換された植
物細胞または植物組織を培養して、あるいは同様に形質
転換された植物体を栽培して、カフェイン合成系にかか
る二次代謝産物の製造やこれらの形質転換体で生産され
る二次代謝産物の組成の改変を行うことがきる。この二
次代謝産物としては、例えば、７−メチルキサンチン、
パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる
群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物を挙げるこ
とができる。

【００７０】形質転換に用いる植物細胞、植物組織また
は植物体の供給原としては、例えば、質転換植物体が、
ツバキ（Camellia）属植物、コーヒー（Coffea）属植
物、がコラノキ（Cola）属植物、モチノキ（Ilex）属植
物、ネエア（Neea）属植物、アオギリ（Firmiana）属植
物、ポーリニア（Paullinia）属植物又はカカオノキ（T
heobroma）属植物を挙げることができる。

【００７１】中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Camell
ia）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Coffe
a）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Col
a）属植物などを好ましいものとして例示することがで
きる。

【００７２】さらに、本発明にかかるＮ−メチルトラン
スフェラーゼは、テオブロミンの他にも７−メチルキサ
ンチンといった構造類似化合物もメチル化することがで
きるので、前記の植物種以外であってもこれらキサンチ
ンの構造類似化合物を含む植物であれば、本発明の方法
を適用することができる。

【００７３】なお、酵素学的な検討の結果、本発明にか
かるＮ−メチルトランスフェラーゼは以下の基本的性質
を有することが明らかになっている。 分子量：４１,０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、６１,００
０（ゲルろ過） 等電点：４．５〜５．０ （クロマトフォーカシング） 至適ｐＨ：８．５ Ｋｍ値：２１μＭ（ＳＡＭ）、２４μＭ（パラキサンチ
ン） 阻害剤：ＳＡＨ（Ｓ−アデノシルホモシステイン） 反応機構：ＳＡＭ＋パラキサンチン→ＳＡＨ＋カフェイ
ン

【００７４】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を更
に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例
に限定されるものではない。

【００７５】実施例１ Ｎ−メチルトランスフェラーゼ精製画分の調製 １９９７年５月に鹿児島県枕崎市で採種した、チャ葉
（Camellia sinensis var. Yabukita）の第１、２、３
葉を液体窒素を用いて凍結し、−８０℃で保存した。こ
の材料１００ｇを、１,０００ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ
−Ｎａ２、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、５％（ｖ
／ｖ） グリセリン、１ｍｇ アプロチニン、０．５％
（ｗ／ｖ） アスコルビン酸ナトリウム、２．５％（ｗ
／ｖ）不溶性ポリビニルポリピロリドンを含む５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）を加えて磨砕
し、３層のガーゼで濾過した後に濾液を遠心分離（１
０,０００ｇ、１５分）して上清を得た。この上清に対
して５０―８０％ 飽和硫安分画を調製した。この分画
をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を用いて脱塩し、２ｍＭ
ＥＤＴＡ−Ｎａ２、２ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、２０％（ｖ／ｖ） グリセリンを含む１０ｍＭ リ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解させた後
に、同じ緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカ
ラム（１５×１６０ｍｍ）に吸着させ、２００ｍｌ ２
ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、２０％（ｖ／ｖ） グリセリンを含む１０―２
００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の直線濃度勾配を用い
て活性画分を溶出した。活性画分を集め、８０％ 飽和
硫安処理により沈殿を回収し、２ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ
２、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含む５０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解した。脱塩処理
を行った後に、同じ緩衝液で平衡化した高速液体クロマ
トグラフィー専用の陰イオン交換カラムＳｈｏｄｅｘ
ＩＥＣ ＱＡ−８２４（８×２５ｍｍ）に吸着させた。
同じ緩衝液でカラムを洗浄後、３６ｍｌの２０―７５０
ｍＭ ＫＣｌ（２ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、２ｍＭ ２
−メルカプトエタノール、２０％（ｖ／ｖ） グリセリ
ンを含む５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
に溶解）の直線濃度勾配で吸着タンパク質を溶出した。
活性画分を集め、脱塩処理を行い、２ｍＭ ＥＤＴＡ−
Ｎａ２、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２０％
（ｖ／ｖ） グリセリンを含む５０ｍＭ トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した後、同じ緩衝液で平衡
化したアフィニティーカラムであるアデノシン−アガロ
ース（１ｍｌ）に吸着させた。０．２Ｍ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、２０％（ｖ／ｖ） グリセリンを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で活性画分を溶出
した。得られた画分を２ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０％（ｖ／ｖ） グリセリ
ンを含む５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００
（１６×６００ｍｍ）を用いてゲル濾過を行い、最終精
製標品を得た。表１にＮ−メチルトランスフェラーゼの
精製過程における比活性の変化をまとめた。

【００７６】

【表１】

【００７７】実施例２ Ｎ−メチルトランスフェラーゼ精製画分のアミノ末端ア
ミノ酸配列の解析 最終精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動後、セミドライブロッティング装置を用いＰＶＤＦメ
ンブレンに転写した。Ｎ−メチルトランスフェラーゼが
転写された部位を切り取り、ＡＢＩプロテインシーケン
サーを用いてＮ末端のアミノ酸配列を分析した。その結
果を配列番号：４に示す。

【００７８】実施例３ Ｎ−メチルトランスフェラーゼのｃＤＮＡクローニング
のためのオリゴヌクレオチド Ｎ末端の７アミノ酸残基に基づく１９残基のオリゴヌク
レオチドＮＭＴ−１とＮｏｔＩ−（ｄＴ）１８プライマ
ー（ファルマシアバイオテック）をプローブとした。配
列番号：５にＮＭＴ−１の配列を示す。

【００７９】実施例４ Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングの
ための１本鎖ｃＤＮＡの合成 （１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの単離 ５ｇの若いチャ葉を液体窒素存在下で乳棒、乳鉢を用い
て破砕した。液体窒素の昇華後、５０ｍｌの３Ｍ Ｌｉ
Ｃｌ、８Ｍ 尿素を加えて、ポリトロンでさらに破砕し
た。４℃で一晩静置した後、１２,０００ｒｐｍで１５
分間、遠心分離を行った。沈殿を０．５％ ＳＤＳ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液 （ｐＨ７．６）に懸濁
し、総量で１０ｍｌ程度にした。１０ｍｌのフェノール
／クロロホルム溶液を加えて混合し、１２,０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離を行った。上清に１／１０倍容
の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）を加え、さ
らに２倍容のエタノールを加えて−８０℃で１時間静置
した。４℃、１２,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離
を行い、上清を除去した沈殿に７０％ エタノールを加
えて懸濁し、再度、遠心分離を行った。上清を除去し、
真空ポンプでドライアップした。沈殿を１．５ｍｌの水
に溶かし、１５０μlの３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ４．８）を加え、さらに１．５ｍｌのフェノール／ク
ロロホルム溶液を加えて転倒混和し、１２,０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離を行った。上清に２倍容のエタ
ノールを加え、−８０℃で２０分間静置した後、４℃で
１２,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い得られ
た沈殿に７０％ エタノールを加えて、再度、遠心分離
を行った。沈殿を１．５ｍｌの水に溶かし、１５０μl
の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）を加え、さ
らに１．５ｍｌのフェノール／クロロホルム溶液を加え
て転倒混和し、１２,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分
離を行った。上清に２倍容のエタノールを加え、−８０
℃で２０分間静置した後、４℃で１２,０００ｒｐｍ、
１０分間の遠心分離を行い得られた沈殿に７０％ エタ
ノールを加えて、再度、遠心分離を行った。真空ポンプ
でドライアップした後、２００μlの水に溶解し、ｔｏ
ｔａｌ ＲＮＡの画分とした。

【００８０】（２） ｍＲＮＡの単離 上述の方法で得たｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２ｍｇ）に６５
℃、５分間の熱処理を行った後、等量の２倍濃度Ａ液
（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．１％ ＳＤＳ、０．５
Ｍ ＮａＣｌ）と混合した。０．１ｇのｏｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｙｐｅ７（ファルマシ
ア）を２ｍｌのＢ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２、０．１％
ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で膨潤させ、その
懸濁液を先端にガラスウールをつめたブルーチップに注
ぎ、２．５ ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで洗浄した後、
５ｍｌのＡ液を流して平衡化した。このカラムにｔｏｔ
ａｌ ＲＮＡをアプライし、３ｍｌのＡ液、４ｍｌのＢ
液を流した後に、ｍＲＮＡを３ｍｌのＣ液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ−Ｎａ２、０．０５％ ＳＤＳ）で溶出した。溶出液
をエタノール沈殿によって濃縮し、ドライアップした後
水に溶解し、−８０℃で保存した。

【００８１】（３） １本鎖ｃＤＮＡの合成 １９０ｎｇのｍＲＮＡを６５℃、１０分間の熱処理を行
った後、ただちに氷上で３分間急冷した。このサンプル
をテンプレートにして、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ファルマシア）
を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ
は−２０℃で保存した。

【００８２】実施例５ ＲＴ−ＰＣＲ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼ遺
伝子のクローニング先に述べた方法で調製した１本鎖ｃ
ＤＮＡをテンプレートにした以下の反応液を調製した。
この反応液をＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃ
ｌｅｒ ＰＴＣ−２００（フナコシ）を用いて、９５℃
／１分間の反応後、９５℃／１分間、４５℃／１分間、
７２℃／２分間を３０サイクル反応させる条件でＰＣＲ
を行い、反応生成物を得た。 テンプレートｃＤＮＡ：３μl １０×ｂｕｆｆｅｒ：５μl ２．５ｍＭ ＮＴＰ：８μl ＮＭＴ−１：１μl（５０ｐｍｏｌ） ＮｏｔＩ−（ｄＴ）１８：１μl（５０ｐｍｏｌ） Ｈ₂Ｏ：３１μl ＥｘＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）：１μl 実施例６ プラスミドベクターへのサブクローニング ０．８％ アガロースゲルを用いてＴＡＥ中で実施例５
で得た反応生成物の電気泳動を行い、得られた目的生成
物のバンドを切り取り、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（フナコ
シ）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮ
ＡをｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライ
ゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメ
ーションした。Ｘ−ｇａｌを用いてカラーセレクション
を行った後に、アンピシリンを含むＬＢ培地で液体培養
を行い、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出、
単離した。インサートの有無はアガロース電気泳動によ
って確認した。こうして、Ｎ−メチルトランスフェラー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミド中に単離し
た。

【００８３】実施例７ 塩基配列の決定 実施例６において単離したプラスミドを用いて下記の反
応液中でプライマーエクステンションを行った。反応条
件は９６℃／１分間反応させた後、９６℃／０．２分
間、５０℃／０．１分間、６０℃／４分間を２５サイク
ル行った。反応液に対してエタノール沈殿を行い、得ら
れたＤＮＡ をＴｅｍｐｌａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｒｅａｇｅｎｔに溶解し、ＡＢＩ−３１０ジェネ
ティックアナライザーを用いて分析した。目的ＤＮＡの
中央部分の配列を決定するためには、ＤＮＡをＳｔｙＩ
で処理して得られたＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９に
サブクローニングしたプラスミドを用いた。配列番号：
６及７にそれらのプライマー配列を示す。

【００８４】プライマーエクステンション反応液の組成 プラスミドＤＮＡ （２０ｎｇ）： ２μl Ｐｒｅｍｉｘ：４μl Ｐｒｉｍｅｒ：１μl Ｈ₂Ｏ：３μl 実施例８ ５’ＲＡＣＥ法によるＮ−メチルトランスフェラーゼｍ
ＲＮＡの５’上流域の単離 ５’上流域の単離には、５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃ
ｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。配列番号：
８〜１７に使用したプライマーの配列を示す。

【００８５】実施例４に記した方法で合成した１ｓｔ
ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡについて、ｈｙｂｒｉｄ ＲＮ
Ａの分解、ライゲーション反応による１本鎖ｃＤＮＡの
環化の後に、配列番号：８〜１２、または配列番号：１
３〜１７のプライマーを用いて、常法に基づいてＰＣＲ
反応を行い、反応生成物を得た。アクリルアミド電気泳
動により反応生成物のバンドを分離し、ゲルからＤＮＡ
を回収し、ｐＴ７ｂｌｕｅベクターにサブクローニング
した。その後、実施例６と７と同様の方法でインサート
されたＤＮＡの塩基配列を決定した。

【００８６】実施例９ Ｎ−メチルトランスフェラーゼの大腸菌での発現 単離したＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現ベ
クターｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み直す
ために以下の操作を行なった。

【００８７】実施例６で得られた単離Ｎ−メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子ＤＮＡが挿入されているｐＴ７ｂｌ
ｕｅベクターをテンプレートとして、配列番号：１８及
び１９に記載のプライマーを用いて以下の条件でＰＣＲ
を行い反応生成物を得た。則ち、反応条件は、９５℃／
１．５分間の後、９５℃／１分間、５２℃／１分間、７
２℃／１分間を３０サイクル行った。

【００８８】これとは別に単離Ｎ−メチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子ＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで処理
して得られた断片をｐＥＴ２３ｄベクターに挿入した。
次に、このｐＥＴ２３ｄベクターのＮｃｏＩサイトに、
上記ＰＣＲ産物をさらに挿入しＮ−メチルトランスフェ
ラーゼ発現プラスミドを構築した。このプラスミドを大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションし
た。得られた大腸菌を３７℃で２時間培養した後に、Ｉ
ＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭになるように加え、３０℃
でさらに３時間培養を行った。培養終了後集菌し、３ｍ
ｌの培養液の菌体に対し０．２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２中で１分間断続的に超音波破
砕を行った。これを１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠
心分離を行い、得られた上清を酵素液とした。

【００８９】ここで得られたＮ−メチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は実施
例７及び８の配列決定から、配列番号：２の配列を有す
るものであり、対応するＲＮＡヌクレオチド配列は配列
番号：３に示される。また、対応するＮ−メチルトラン
スフェラーゼのアミノ酸配列は配列番号：１に示され
る。

【００９０】Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性測定の
ための反応液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ
パラキサンチン、４μＭ［メチル-¹⁴Ｃ］Ｓ−アデノ
シルメチオニン（０．９ｋＢｑ）に酵素液１０μｌを加
えたものとし、反応液の体積は１００μｌとした。２７
℃で１０分間の反応を行い、得られた¹⁴Ｃ−カフェイン
を１ｍｌのクロロホルムを加えて抽出し、クロロホルム
層の放射活性を測定した。対照としては、反応液にパラ
キサンチンの代わりにキサントシンを加えたものまた
は、反応液からパラキサンチンを除いたものを用いた。
活性測定の結果、基質としてパラキサンチンを加えたと
きのみ１．５６ｐｍｏｌのカフェインが生成したことが
判明した。

【００９１】実施例１０ （アンチセンス法によるカフェインの合成の抑制）アン
チセンスＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する
組換えベクターを以下の方法により構築した。

【００９２】実施例９で用いた単離Ｎ−メチルトランス
フェラーゼ遺伝子の全長を鋳型とし、配列番号２０及び
２１に記載の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲに
て増幅し、得られたＤＮＡ断片の末端をＢＫＬキット
（ＴＡＫＡＲＡ社製）で平滑末端化して平滑末端化ＰＣ
Ｒ増幅断片を得た。

【００９３】また、ハイグロマイシン耐性遺伝子を連結
したｐＢＩベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を制限酵
素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断してβ−グルクロニダーゼ
遺伝子を除去し、得られら線状ベクターの末端を平滑末
端とした。

【００９４】この平滑末端化線状ベクターを上記平滑末
端化ＰＣＲ増幅断片とライゲーションキット（ＴＡＫＡ
ＲＡ社製）を用いて結合させ、得られらた反応生成物か
らｐＢＩ中のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に該遺
伝子が逆方向で機能し得る位置に挿入されている所望の
Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するベクター
をシーケンシングにより選択した。このようにして、ア
ンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子が挿入
された所望の組換えベクターを得た。そしてこれを以下
の形質転換に用いた。

【００９５】コーヒーの組織培養によるカフェイン生合
成の従来法については、これまでにもPlanta, 108, 339
(1972), Plant Cell Reports, 2, 109 (1983)などの多
くの報告がある。これらの従来法に従ってコーヒーの茎
頂ないし幼葉からカルスを誘導した。得られたカルスに
パーティクルガン法で上記で構築された組換えベクター
を導入した。あるいは、該カルスのプロトプラストを調
製して、このプロトプラストにエレクトロポレーション
法により組換えベクターを導入した。導入後、マーカー
耐性を示す細胞を選抜した。選択された細胞は明条件下
で培養し、形質転換細胞に対して実施例９に記載の方法
により酵素活性を測定した。その結果、アンチセンスＮ
−メチルトランスフェラーゼＤＡＮを導入した細胞にお
けるカフェインの生産は、アンチセンスＮ−メチルトラ
ンスフェラーゼＤＮＡを導入していない通常細胞と比較
して有意に減少していることが判明した。

【００９６】さらに、形質転換したコーヒー培養細胞を
再分化させ、幼植物体を得た。再分化の方法はZ.Pflanz
enphysiol. Bd., 81, 395 (1977)、Plant Cell, Tissue
andOrgan Culture, 8, 243 (1987)を含む文献に記載の
従来法に従って行った。幼植物体の葉を用いて実施例９
に記載の方法により酵素活性を測定した。その結果、ア
ンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡを導入
した植物体のカフェイン生産は、アンチセンスＮ−メチ
ルトランスフェラーゼＤＮＡを導入していない植物体と
有意に減少していることが判明した。

【００９７】

【発明の効果】本発明によれば、工業用、食品用または
医療用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラ
ーゼを効率よく生産する事が可能になる。

【００９８】本発明によれば、カフェイン産生植物、植
物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変し
てカフェイン代謝系の化合物を効率よく生産する事が可
能になる。

【００９９】本発明によれば、カフェイン産生植物、植
物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変し
てカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変すること
が可能になる。

【０１００】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120>Gene Encoding Caffeine Synthesis System Associated Enzyme and Use t hereof <150>JP 146358/1999 <151>1999-05-26 <160> 20 <210> 1 <211> 356 <212> PRT <213> Camellia sinensis <400> 1 Phe Met Asn Arg Gly Glu Gly Glu Ser Ser Tyr Ala Gln Asn Ser Ser 5 10 15 Phe Thr Gln Gln Val Ala Ser Met Ala Gln Pro Ala Leu Glu Asn Ala 20 25 30 Val Glu Thr Leu Phe Ser Arg Asp Phe His Leu Gln Ala Leu Asn Ala 35 40 45 Ala Asp Leu Gly Cys Ala Ala Gly Pro Asn Thr Phe Ala Val Ile Ser 50 55 60 Thr Ile Lys Arg Met Met Glu Lys Lys Cys Arg Glu Leu Asn Cys Gln 65 70 75 80 Thr Leu Glu Leu Gln Val Tyr Leu Asn Asp Leu Phe Gly Asn Asp Phe 85 90 95 Asn Thr Leu Phe Lys Gly Leu Ser Ser Glu Val Ile Gly Asn Lys Cys 100 105 110 Glu Glu Val Pro Cys Tyr Val Met Gly Val Pro Gly Ser Phe His Gly 115 120 125 Arg Leu Phe Pro Arg Asn Ser Leu His Leu Val His Ser Ser Tyr Ser 130 135 140 Val His Trp Leu Thr Gln Ala Pro Lys Gly Leu Thr Ser Arg Glu Gly 145 150 155 160 Leu Ala Leu Asn Lys Gly Lys Ile Tyr Ile Ser Lys Thr Ser Pro Pro 165 170 175 Val Val Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Gln Phe His Glu Asp Phe Thr Met 180 185 190 Phe Leu Asn Ala Arg Ser Gln Glu Val Val Pro Asn Gly Cys Met Val 195 200 205 Leu Ile Leu Arg Gly Arg Gln Cys Ser Asp Pro Ser Asp Met Gln Ser 210 215 220 Cys Phe Thr Trp Glu Leu Leu Ala Met Ala Ile Ala Glu Leu Val Ser 225 230 235 240 Gln Gly Leu Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Phe Asn Ile Pro Ser 245 250 255 Tyr Phe Ala Ser Leu Glu Glu Val Lys Asp Ile Val Glu Arg Asp Gly 260 265 270 Ser Phe Thr Ile Asp His Ile Glu Gly Phe Asp Leu Asp Ser Val Glu 275 280 285 Met Gln Glu Asn Asp Lys Trp Val Arg Gly Glu Lys Phe Thr Lys Val 290 295 300 Val Arg Ala Phe Thr Glu Pro Ile Ile Ser Asn Gln Phe Gly Pro Glu 305 310 315 320 Ile Met Asp Lys Leu Tyr Asp Lys Phe Thr His Ile Val Val Ser Asp 325 330 335 Leu Glu Ala Lys Leu Pro Lys Thr Thr Ser Ile Ile Leu Val Leu Ser 340 345 350 Lys Ile Asp Gly 355 <210> 2 <211> 1427 <212> DNA <213> Camellia sinensis <400> 2 tgatatcact gctgtggcag ctggcctctt tgctataaaa attacttttc tgacgaggca 60 tggagctagc tactgcgggg aaggtgaacg aagtgttgtt catgaacagg ggggaaggag 120 aaagtagtta tgcacaaaac tcttctttca cgcaacaagt ggcctcaatg gcacagccag 180 cgctagaaaa tgcagttgaa actctcttct ccagagattt ccaccttcaa gctcttaacg 240 cagcggactt gggttgtgca gcgggtccaa acacattcgc agtgatttct acgatcaaga 300 gaatgatgga aaagaaatgc agggaattga attgccaaac actggaactt caggtttact 360 tgaatgatct ttttggaaat gatttcaata ccctcttcaa aggcctgtcg tctgaggtta 420 ttggtaacaa atgtgaggaa gttccgtgtt atgtgatggg agtaccgggg tctttccatg 480 gccggctttt tcctcgtaac agcttacatt tagttcattc ctcttacagt gttcattggc 540 ttactcaggc accaaaagga ctcacaagca gagaaggctt ggcattaaac aaggggaaga 600 tttacatatc aaagacaagc cctcctgttg taagagaagc ctacttatct caatttcatg 660 aagatttcac aatgtttctc aatgctagat cccaagaggt ggttccaaat ggttgtatgg 720 tgttgatact tcgtggtagg caatgttctg atccttcaga catgcagagc tgctttactt 780 gggaactatt agctatggcc attgctgaat tggtttcaca gggattgata gatgaagata 840 aattagacac cttcaatata cccagctatt ttgcatcact tgaggaagtg aaagatatag 900 tggagaggga cggatcattc acaattgatc atatagaggg gtttgatctt gatagcgtag 960 aaatgcagga gaatgataaa tgggttagag gggaaaagtt taccaaggtt gtcagggcct 1020 tcacagagcc tataatttca aaccagtttg gacctgaaat catggacaaa ctatatgaca 1080 aattcactca cattgtagtt tcagatttgg aagcaaagct accgaagacc acaagtatca 1140 tcctagtgct ttccaagatt gatggatagt tttttagtgt tgtgaaataa actgttgtcc 1200 ctatcacata tatgccacta gagggttgtg ccaatgtatt gcacaagaag atttgagagg 1260 ggtcaaatat agaaagcatt ttgctcttgt gtggagagag aatgttttct tgatttaaat 1320 ctgtgatacc caaatcgtaa tgttgggaag aaatgagaag ttgaacatga aattttaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt cctgcggccg cgaattc 1427 <210> 3 <211> 1427 <212> RNA <213> Camellia sinensis <400> 3 ugauaucacu gcuguggcag cuggccucuu ugcuauaaaa auuacuuuuc ugacgaggca 60 uggagcuagc uacugcgggg aaggugaacg aaguguuguu caugaacagg ggggaaggag 120 aaaguaguua ugcacaaaac ucuucuuuca cgcaacaagu ggccucaaug gcacagccag 180 cgcuagaaaa ugcaguugaa acucucuucu ccagagauuu ccaccuucaa gcucuuaacg 240 cagcggacuu ggguugugca gcggguccaa acacauucgc agugauuucu acgaucaaga 300 gaaugaugga aaagaaaugc agggaauuga auugccaaac acuggaacuu cagguuuacu 360 ugaaugaucu uuuuggaaau gauuucaaua cccucuucaa aggccugucg ucugagguua 420 uugguaacaa augugaggaa guuccguguu augugauggg aguaccgggg ucuuuccaug 480 gccggcuuuu uccucguaac agcuuacauu uaguucauuc cucuuacagu guucauuggc 540 uuacucaggc accaaaagga cucacaagca gagaaggcuu ggcauuaaac aaggggaaga 600 uuuacauauc aaagacaagc ccuccuguug uaagagaagc cuacuuaucu caauuucaug 660 aagauuucac aauguuucuc aaugcuagau cccaagaggu gguuccaaau gguuguaugg 720 uguugauacu ucgugguagg caauguucug auccuucaga caugcagagc ugcuuuacuu 780 gggaacuauu agcuauggcc auugcugaau ugguuucaca gggauugaua gaugaagaua 840 aauuagacac cuucaauaua cccagcuauu uugcaucacu ugaggaagug aaagauauag 900 uggagaggga cggaucauuc acaauugauc auauagaggg guuugaucuu gauagcguag 960 aaaugcagga gaaugauaaa uggguuagag gggaaaaguu uaccaagguu gucagggccu 1020 ucacagagcc uauaauuuca aaccaguuug gaccugaaau cauggacaaa cuauaugaca 1080 aauucacuca cauuguaguu ucagauuugg aagcaaagcu accgaagacc acaaguauca 1140 uccuagugcu uuccaagauu gauggauagu uuuuuagugu ugugaaauaa acuguugucc 1200 cuaucacaua uaugccacua gaggguugug ccaauguauu gcacaagaag auuugagagg 1260 ggucaaauau agaaagcauu uugcucuugu guggagagag aauguuuucu ugauuuaaau 1320 cugugauacc caaaucguaa uguugggaag aaaugagaag uugaacauga aauuuuaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaauu ccugcggccg cgaauuc 1427 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Camellia sinensis <400> 4 Phe Met Asn Arg Gly Glu Xaa Glu Ser Ser Tyr Ala Gln Asn Ser Gln 5 10 15 Phe Thr Gln Val 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <400> 5 ttYatgaaYM gIggIgaRg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <400> 6 caaaagggtc agtgctgca 19 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <400> 7 atgaccatga ttacgcc 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <400> 8 gccggtacct ttctggggcc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <400> 9 ccgctgcgtt aagagcttga ag 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <400> 10 gccaaacact ggaacttcag g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <400> 11 ccattgaggc cacttgttgc gtg 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <400> 12 ggcctgtcgt ctgaggttat tg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <400> 13 cagcaatggc catagctaat ag 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <400> 14 ccgctgcgtt aagagcttga ag 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <400> 15 gccaaacact ggaacttcag g 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <400> 16 ccattgaggc cacttgttgc gtg 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <400> 17 ggcctgtcgt ctgaggttat tg 22 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <400> 18 gccatggttt acgcgca 17 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <400> 19 cggccatgga aagaccccgg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <400> 20 tgatatcact gctgtggcag c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <400> 21 aaaatttcat gttcaacttc t 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/10 9/10 Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｂ Ｃ１２Ｐ 17/18 23/00 23/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のヌクレオチド配列： （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７
   −メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テ
   オブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサ
   ンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性
   を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラ
   ーゼをコードするヌクレオチド配列、（ｂ）前記ヌクレ
   オチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）がコー
   ドするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範囲内
   で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って得ら
   れた変異ヌクレオチド配列のいずれかを有することを特
   徴とするＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列（ａ）と前記変異
   ヌクレオチド配列（ｂ）とがストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし得るものである請求項１に記載のＤ
   ＮＡ分子。
3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列（ａ）が、配列表
   の配列番号：２のヌクレオチド配列からなる請求項１ま
   たは２に記載のＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 以下のヌクレオチド配列： （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７
   −メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テ
   オブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサ
   ンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性
   を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラ
   ーゼをコードするヌクレオチド配列、（ｂ）前記ヌクレ
   オチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）がコー
   ドするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範囲内
   で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って得ら
   れた変異ヌクレオチド配列のいずれかを有することを特
   徴とするＲＮＡ分子。
5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列（ａ）と、前記変
   異ヌクレオチド配列（ｂ）がストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし得るものである請求項４に記載のＲ
   ＮＡ分子。
6. 【請求項６】 前記配列（ａ）が、配列表の配列番号：
   ３のヌクレオチド配列からなる請求項４または５に記載
   のＲＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ
   分子と、該ＤＮＡ分子によりコードされた前記Ｎ−メチ
   ルトランスフェラーゼを植物細胞中で発現させるための
   構成と、を有することを特徴とする発現用ベクター。
8. 【請求項８】 宿主細胞を請求項７に記載の発現用ベク
   ターで形質転換して得られたものであることを特徴とす
   る形質転換細胞。
9. 【請求項９】 前記宿主細胞が微生物細胞である請求項
   ８に記載の形質転換細胞。
10. 【請求項１０】 請求項８または９に記載の形質転換細
    胞を培養して、前記酵素活性を有するＮ−メチルトラン
    スフェラーゼの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮ
    Ａ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は一部に相補
    的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活性を有する
    植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該
    酵素活性を阻害し得ることを特徴とするＤＮＡ分子。
12. 【請求項１２】 請求項４〜６のいずれかに記載のＲＮ
    Ａ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は一部に相補
    的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活性を有する
    植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該
    酵素活性を阻害し得ることを特徴とするＲＮＡ分子。
13. 【請求項１３】 請求項１〜６及び１１〜１２のいずれ
    かに記載のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含むベクタ
    ー。
14. 【請求項１４】 微生物および植物の少なくとも一方の
    細胞内で、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフ
    ェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ
    及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼの酵
    素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼを発現さ
    せることができるか、もしくは該Ｎ−メチルトランスフ
    ェラーゼの発現を阻害する機能を有する請求項１３に記
    載のベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１３または１４に記載のベクタ
    ーで形質転換された微生物。
16. 【請求項１６】 請求項１３または１４に記載のベクタ
    ーで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
17. 【請求項１７】 請求項１３または１４に記載のベクタ
    ーが、感染により導入された請求項１６に記載の植物細
    胞、植物組織または植物体。
18. 【請求項１８】 請求項１６または１７に記載の植物細
    胞、植物組織または植物体を用いて植物二次代謝産物を
    製造する方法。
19. 【請求項１９】 請求項１６または１７に記載の植物細
    胞、植物組織または植物体を用いて植物二次代謝産物の
    組成を改変する方法。
20. 【請求項２０】 請求項１６または１７に記載の植物細
    胞または植物組織を培養するか、植物体を栽培して、植
    物二次代謝産物を製造する方法。
21. 【請求項２１】 請求項１６または１７に記載の植物細
    胞または植物組織を培養するか、植物体を栽培して、植
    物二次代謝産物の組成を改変する方法。
22. 【請求項２２】 植物二次代謝産物が、７−メチルキサ
    ンチン、パラキサンチン、テオブロミン及びカフェイン
    からなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物で
    ある請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 【請求項２３】 形質転換植物体が、ツバキ（Camelli
    a）属植物、コーヒー（Coffea）属植物、コラノキ（Col
    a）属植物、モチノキ（Ilex）属植物、ネエア（Neea）
    属植物、アオギリ（Firmiana）属植物、ポーリニア（Pa
    ullinia）属植物又はカカオノキ（Theobroma）属植物体
    である請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
24. 【請求項２４】 ７−メチルキサンチンＮ３メチルトラ
    ンスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェ
    ラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラー
    ゼとしての酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラ
    ーゼであって、（ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸
    配列、または（ｂ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配
    列に、該アミノ酸配列に、前記酵素活性を損なわない範
    囲内でのアミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得ら
    れた変異アミノ酸配列を有することを特徴とするＮ−メ
    チルトランスフェラーゼ。
25. 【請求項２５】 前記アミノ酸配列（ａ）をコードする
    ヌクレオチド配列と、前記変異アミノ酸配列（ｂ）をコ
    ードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズし得るものである請求項２５に記載
    のＮ−メチルトランスフェラーゼ。