JP2003274973A - キサントシンメチル化酵素およびその用途 - Google Patents
キサントシンメチル化酵素およびその用途Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 カフェイン合成系にあるＮ−メチルトランス
フェラーゼをコードするＤＮＡの全部もしくは一部を微
生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で
組み込むことにより、（１）工業用、食品用または医療
用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラーゼ
の効率的な生産、（２）カフェイン産生植物、植物組織
または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変すること
によるカフェイン代謝系の化合物の効率的生産、及び
（３）カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞の
カフェイン生合成代謝を改変することによるカフェイン
代謝系の化合物群の生成比の改変等の課題を達成する。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列または該アミノ酸配
列の変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡをセンスま
たはアンチセンスの形で組み込んだベクターで、微生
物、植物体または培養細胞を形質転換する。
フェラーゼをコードするＤＮＡの全部もしくは一部を微
生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で
組み込むことにより、（１）工業用、食品用または医療
用酵素として利用できるＮ−メチルトランスフェラーゼ
の効率的な生産、（２）カフェイン産生植物、植物組織
または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変すること
によるカフェイン代謝系の化合物の効率的生産、及び
（３）カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞の
カフェイン生合成代謝を改変することによるカフェイン
代謝系の化合物群の生成比の改変等の課題を達成する。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列または該アミノ酸配
列の変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡをセンスま
たはアンチセンスの形で組み込んだベクターで、微生
物、植物体または培養細胞を形質転換する。
Description
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、コーヒーノキにおけ
る、キサントシンから７−メチルキサントシン、７−メ
チルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合
成される一連の反応において、キサントシンから７−メ
チルキサントシンを生成する活性を有するキサントシン
メチル化酵素及びその変異体、これらのいずれかをコー
ドする塩基配列を有するDNA分子又はRNA分子、これらの
分子を用いたベクター、該ベクターによる形質転換生物
及びこれらの用途に関する。
る、キサントシンから７−メチルキサントシン、７−メ
チルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合
成される一連の反応において、キサントシンから７−メ
チルキサントシンを生成する活性を有するキサントシン
メチル化酵素及びその変異体、これらのいずれかをコー
ドする塩基配列を有するDNA分子又はRNA分子、これらの
分子を用いたベクター、該ベクターによる形質転換生物
及びこれらの用途に関する。
【０００２】
【発明の背景】コーヒーノキ(Coffea)、チャノキ(Camel
lia sinensis)、コラ(Cola acuminata)、マテ(Ilex par
aguariensis)は１，３，７−トリメチルキサンチン(カ
フェイン)を、カカオ(Theobroma cacao)、コラは３，７
−ジメチルキサンチン(テオブロミン)を生合成する植物
である。これらの植物種の葉や果実は嗜好品として飲料
や食品に加工され、人々に摂取されている。また、これ
らの植物種から抽出されたカフェイン及びテオブロミン
は、中枢神経興奮作用などの様々な薬理作用を有するた
め医薬品として利用されている。
lia sinensis)、コラ(Cola acuminata)、マテ(Ilex par
aguariensis)は１，３，７−トリメチルキサンチン(カ
フェイン)を、カカオ(Theobroma cacao)、コラは３，７
−ジメチルキサンチン(テオブロミン)を生合成する植物
である。これらの植物種の葉や果実は嗜好品として飲料
や食品に加工され、人々に摂取されている。また、これ
らの植物種から抽出されたカフェイン及びテオブロミン
は、中枢神経興奮作用などの様々な薬理作用を有するた
め医薬品として利用されている。
【０００３】カフェインやテオブロミンは世界中で莫大
な需要があるが、これらを生合成する植物種の多くは特
定の地域でのみ栽培される。そこで、遺伝子組換え技術
を利用して微生物や栽培の簡単な植物種にそれらを生合
成させる技術の開発が望まれている。
な需要があるが、これらを生合成する植物種の多くは特
定の地域でのみ栽培される。そこで、遺伝子組換え技術
を利用して微生物や栽培の簡単な植物種にそれらを生合
成させる技術の開発が望まれている。
【０００４】他方、カフェインの過剰な摂取は不眠、不
整脈、震顫などの副作用を引き起こすため、遺伝子組換
え技術を利用してカフェイン生合成機能を抑制した植物
種を育種し、カフェイン含量の低い飲料や食品を製造す
る技術が望まれている。これらの技術を開発するために
は、カフェイン及びテオブロミンの生合成に関与する遺
伝子あるいはそのｃDNAを単離することが必要である。
整脈、震顫などの副作用を引き起こすため、遺伝子組換
え技術を利用してカフェイン生合成機能を抑制した植物
種を育種し、カフェイン含量の低い飲料や食品を製造す
る技術が望まれている。これらの技術を開発するために
は、カフェイン及びテオブロミンの生合成に関与する遺
伝子あるいはそのｃDNAを単離することが必要である。
【０００５】
【従来の技術】コーヒーノキ及びチャノキでは、アデニ
ンヌクレオチド及びグアニンヌクレオチドの異化代謝中
間産物であるキサントシンを出発材料とし、７−メチル
キサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを
経てカフェインが生合成される(後述の文献(1)、図１参
照)。
ンヌクレオチド及びグアニンヌクレオチドの異化代謝中
間産物であるキサントシンを出発材料とし、７−メチル
キサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを
経てカフェインが生合成される(後述の文献(1)、図１参
照)。
【０００６】コーヒーノキから７−メチルキサンチンメ
チル化酵素（テオブロミン合成酵素）をコードするCaMX
MT cDNA(後述の文献(2))、はすでに単離されている。
チル化酵素（テオブロミン合成酵素）をコードするCaMX
MT cDNA(後述の文献(2))、はすでに単離されている。
【０００７】また、特開2001-37490号公報には、カフェ
インの生合成の最終反応である７−メチルキサンチン→
テオブロミン→カフェインの２段階のメチル化反応を触
媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及
びそのアミノ酸配列をコードするDNAが記載されてい
る。
インの生合成の最終反応である７−メチルキサンチン→
テオブロミン→カフェインの２段階のメチル化反応を触
媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及
びそのアミノ酸配列をコードするDNAが記載されてい
る。
【０００８】特表2001-519649号公報には、そのcDNA
は、カフェイン生合成経路におけるキサントシンから７
−メチルキサントシンへの反応を触媒する酵素、キサン
トシンメチル化酵素の発現をコードすると記述されてい
る。しかし、同公報には、実際に、該cDNA配列を用いて
組換えタンパク質を生産し、キサントシンから７−メチ
ルキサントシンを生成することは確認されていない。し
たがって、現在、キサントシンメチル化酵素をコードす
る遺伝子及びそのｃDNAは、まだ単離されていない。
は、カフェイン生合成経路におけるキサントシンから７
−メチルキサントシンへの反応を触媒する酵素、キサン
トシンメチル化酵素の発現をコードすると記述されてい
る。しかし、同公報には、実際に、該cDNA配列を用いて
組換えタンパク質を生産し、キサントシンから７−メチ
ルキサントシンを生成することは確認されていない。し
たがって、現在、キサントシンメチル化酵素をコードす
る遺伝子及びそのｃDNAは、まだ単離されていない。
【０００９】
【発明の課題】本発明は、コーヒーノキにおける、キサ
ントシンから７−メチルキサントシン、７−メチルキサ
ンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される
一連の反応において、キサントシンから７−メチルキサ
ントシンを生成する活性を有するキサントシンメチル化
酵素、微生物や植物におけるメチルキサンチン類（本明
細書において、７−メチルキサントシン、７−メチルキ
サンチン、テオブロミン、パラキサンチン、カフェイン
を「メチルキサンチン類」と呼ぶ）の生産制御に有用な
キサントシンメチル化酵素をコードする DNA 又は RNA
分子、及びそれを用いたベクター等を提供することを目
的とする。例えば、本発明による DNA 分子の全部もし
くは一部を、微生物又は植物に、センス又はアンチセン
スの形で組み込むことにより、以下の目的を達成するこ
とが可能になる。(1) 工業用、食品用、医療用として利
用できるキサントシンメチル化酵素の精製物及び祖抽出
物を効率よく生産し、これらを用いて酵素反応によって
７−メチルキサントシン及び７−メチルキサンチンを製
造する。(2) メチルキサンチン類を生合成しない微生
物、植物体、植物組織、植物細胞にキサントシンメチル
化酵素活性を付加して、７−メチルキサントシン及び７
−メチルキサンチンを効率よく生産する。(3) メチルキ
サンチン類を生合成する植物体、植物組織、植物細胞の
メチルキサンチン類生合成代謝を改変して、メチルキサ
ンチン類を効率よく生産する。(4) メチルキサンチン類
を生合成する植物体、植物組織、植物細胞のメチルキサ
ンチン類生合成代謝を改変して、メチルキサンチン類の
生産を抑制又は停止させる。
ントシンから７−メチルキサントシン、７−メチルキサ
ンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される
一連の反応において、キサントシンから７−メチルキサ
ントシンを生成する活性を有するキサントシンメチル化
酵素、微生物や植物におけるメチルキサンチン類（本明
細書において、７−メチルキサントシン、７−メチルキ
サンチン、テオブロミン、パラキサンチン、カフェイン
を「メチルキサンチン類」と呼ぶ）の生産制御に有用な
キサントシンメチル化酵素をコードする DNA 又は RNA
分子、及びそれを用いたベクター等を提供することを目
的とする。例えば、本発明による DNA 分子の全部もし
くは一部を、微生物又は植物に、センス又はアンチセン
スの形で組み込むことにより、以下の目的を達成するこ
とが可能になる。(1) 工業用、食品用、医療用として利
用できるキサントシンメチル化酵素の精製物及び祖抽出
物を効率よく生産し、これらを用いて酵素反応によって
７−メチルキサントシン及び７−メチルキサンチンを製
造する。(2) メチルキサンチン類を生合成しない微生
物、植物体、植物組織、植物細胞にキサントシンメチル
化酵素活性を付加して、７−メチルキサントシン及び７
−メチルキサンチンを効率よく生産する。(3) メチルキ
サンチン類を生合成する植物体、植物組織、植物細胞の
メチルキサンチン類生合成代謝を改変して、メチルキサ
ンチン類を効率よく生産する。(4) メチルキサンチン類
を生合成する植物体、植物組織、植物細胞のメチルキサ
ンチン類生合成代謝を改変して、メチルキサンチン類の
生産を抑制又は停止させる。
【００１０】
【課題の解決手段】本発明者らは、上記課題を解決すべ
く研究を重ねた結果、配列表の配列番号：２に示すDNA
断片をPCR法により増幅し、次に、このDNA分子を発現ベ
クターに組み込んだ後、大腸菌に導入し、当該DNA分子
に由来するポリペプチドを大量に発現させ、発現したポ
リペプチドを回収してその酵素学的性質を調べたとこ
ろ、これが、キサントシンのメチル化による７−メチル
キサントシンの生成反応を触媒することを認めた。すな
わち、当該DNA分子がカフェイン合成系を構成する酵素
の一つであるキサントシンメチル化酵素をコードするこ
とが確認された。また、この方法で得られたキサントシ
ンメチル化酵素の粗抽出物は、大腸菌内在性のヌクレオ
シド脱リボース活性を含んでおり、７−メチルキサント
シンの脱リボース反応を触媒し、７−メチルキサンチン
が生成することを認めた。
く研究を重ねた結果、配列表の配列番号：２に示すDNA
断片をPCR法により増幅し、次に、このDNA分子を発現ベ
クターに組み込んだ後、大腸菌に導入し、当該DNA分子
に由来するポリペプチドを大量に発現させ、発現したポ
リペプチドを回収してその酵素学的性質を調べたとこ
ろ、これが、キサントシンのメチル化による７−メチル
キサントシンの生成反応を触媒することを認めた。すな
わち、当該DNA分子がカフェイン合成系を構成する酵素
の一つであるキサントシンメチル化酵素をコードするこ
とが確認された。また、この方法で得られたキサントシ
ンメチル化酵素の粗抽出物は、大腸菌内在性のヌクレオ
シド脱リボース活性を含んでおり、７−メチルキサント
シンの脱リボース反応を触媒し、７−メチルキサンチン
が生成することを認めた。
【００１１】上記発現ベクターに上記DNAを組み込む方
法には、既知のいずれの方法も適用し得る。例えば適当
な制限酵素を選択し、これで該DNAを処理して切断し、
次いで同様に処理した発現ベクターと混合し、リガーゼ
によって再結合する方法が用いられる。この様にして得
られた該DNAと発現ベクターの結合物を、形質転換法に
よって微生物の菌体、好ましくは大腸菌に導入し、遺伝
形質として安定するまで増殖すると、目的の遺伝形質と
ベクターDNAの形質を併せもつ形質転換株が得られる。
形質転換株の培養、形質転換株から組換えタンパク質の
粗抽出、粗抽出物の精製は、いずれも常法に従って行っ
てよい。
法には、既知のいずれの方法も適用し得る。例えば適当
な制限酵素を選択し、これで該DNAを処理して切断し、
次いで同様に処理した発現ベクターと混合し、リガーゼ
によって再結合する方法が用いられる。この様にして得
られた該DNAと発現ベクターの結合物を、形質転換法に
よって微生物の菌体、好ましくは大腸菌に導入し、遺伝
形質として安定するまで増殖すると、目的の遺伝形質と
ベクターDNAの形質を併せもつ形質転換株が得られる。
形質転換株の培養、形質転換株から組換えタンパク質の
粗抽出、粗抽出物の精製は、いずれも常法に従って行っ
てよい。
【００１２】Ｓ−アデノシルメチオニン（SAM）をメチ
ル基供与体としてメチルキサンチン類を生合成する植物
であれば、本発明によるキサントシンメチル化酵素ある
いはそれと同一の酵素活性を有するポリペプチド、更に
はこれらをコードするDNAが含まれていると推測され、
本発明に記載の方法を用いれば、それらの植物からも、
本発明によるキサントシンメチル化酵素あるいはそれと
実質的に同一の酵素、更にはこれらをコードするDNA分
子又はRNA分子を得ることができる。
ル基供与体としてメチルキサンチン類を生合成する植物
であれば、本発明によるキサントシンメチル化酵素ある
いはそれと同一の酵素活性を有するポリペプチド、更に
はこれらをコードするDNAが含まれていると推測され、
本発明に記載の方法を用いれば、それらの植物からも、
本発明によるキサントシンメチル化酵素あるいはそれと
実質的に同一の酵素、更にはこれらをコードするDNA分
子又はRNA分子を得ることができる。
【００１３】本発明は以上の様な知見に基づいて完成さ
れたものである。以下、本発明を説明する。
れたものである。以下、本発明を説明する。
【００１４】本発明によるDNA分子は、下記の塩基配列
(a)(b)のいずれかを有するDNA分子である。
(a)(b)のいずれかを有するDNA分子である。
【００１５】(a)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸
配列を有し、プリン環の７位でのキサントシンのメチル
化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドであるキサ
ントシンメチル化酵素をコードする塩基配列、(b)上記
塩基配列(a)に、該塩基配列(a)がコードするポリペプチ
ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、
欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。
配列を有し、プリン環の７位でのキサントシンのメチル
化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドであるキサ
ントシンメチル化酵素をコードする塩基配列、(b)上記
塩基配列(a)に、該塩基配列(a)がコードするポリペプチ
ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、
欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。
【００１６】変異塩基配列(b)としては、上記塩基配列
(a)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものが好ましい。
(a)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものが好ましい。
【００１７】本発明によるDNA分子の具体例は、配列番
号：２の塩基配列からなる。
号：２の塩基配列からなる。
【００１８】本発明によるRNA分子は、下記の塩基配列
(a)(b)のいずれかを有するRNA分子である。
(a)(b)のいずれかを有するRNA分子である。
【００１９】(a)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸
配列を有し、プリン環の７位でのキサントシンのメチル
化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドであるキサ
ントシンメチル化酵素をコードする塩基配列、(b)上記
塩基配列(a)に、該塩基配列(a)がコードするポリペプチ
ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、
欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。
配列を有し、プリン環の７位でのキサントシンのメチル
化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドであるキサ
ントシンメチル化酵素をコードする塩基配列、(b)上記
塩基配列(a)に、該塩基配列(a)がコードするポリペプチ
ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、
欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。
【００２０】変異塩基配列(b)としては、上記塩基配列
(a)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものが好ましい。
(a)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものが好ましい。
【００２１】本発明によるRNA分子の具体例は、配列番
号：３の塩基配列からなる。
号：３の塩基配列からなる。
【００２２】本発明によるDNA分子の他の態様は、上記
のDNA分子の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な
塩基配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導
入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻
害し得る。
のDNA分子の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な
塩基配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導
入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻
害し得る。
【００２３】本発明によるRNA分子の他の態様は、上記
のRNA分子の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な
塩基配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導
入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻
害し得る。
のRNA分子の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な
塩基配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導
入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻
害し得る。
【００２４】本発明によるベクターの一態様は、上記の
DNA分子及びRNA分子のいずれかを含む。このベクター
は、例えば、微生物及び／又は植物の細胞内で、プリン
環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素活
性を有するキサントシンメチル化酵素を発現させること
ができるか、もしくは該キサントシンメチル化酵素の発
現を阻害する機能を有するものとして提供することがで
きる。このベクターを用いて、微生物、植物細胞、植物
組織又は植物体を形質転換することができ、得られた形
質転換体も本発明に含まれる。
DNA分子及びRNA分子のいずれかを含む。このベクター
は、例えば、微生物及び／又は植物の細胞内で、プリン
環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素活
性を有するキサントシンメチル化酵素を発現させること
ができるか、もしくは該キサントシンメチル化酵素の発
現を阻害する機能を有するものとして提供することがで
きる。このベクターを用いて、微生物、植物細胞、植物
組織又は植物体を形質転換することができ、得られた形
質転換体も本発明に含まれる。
【００２５】この微生物、植物体、植物組織又は植物細
胞を用いて、キサントシンメチル化酵素の粗抽出物を製
造し、又は更にその精製品を製造することができる。
胞を用いて、キサントシンメチル化酵素の粗抽出物を製
造し、又は更にその精製品を製造することができる。
【００２６】また、この微生物、植物体、植物組織又は
植物細胞を用いて７−メチルキサントシン又は７−メチ
ルキサンチンを製造することができる。
植物細胞を用いて７−メチルキサントシン又は７−メチ
ルキサンチンを製造することができる。
【００２７】また、この微生物、植物体、植物組織又は
植物細胞を用いてメチルキサンチン類の組成を改変する
ことができる。
植物細胞を用いてメチルキサンチン類の組成を改変する
ことができる。
【００２８】本明細書において、メチルキサンチン類と
は、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、
パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる
群から選ばれる少なくとも１つの化合物を言う。
は、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、
パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる
群から選ばれる少なくとも１つの化合物を言う。
【００２９】メチルキサンチン類の組成の改変に用いる
植物細胞、植物組織又は植物体の供給源としては、コー
ヒーノキ（Coffea）属植物、ツバキ（Camellia）属植
物、コラノキ（Cola）属植物、モチノキ（Ilex）属植
物、ネエア（Neea）属植物、アオギリ（Firmiana）属植
物、ポーリニア（Paullinia ）属植物又はカカオノキ
（Theobroma ）属植物を挙げることができる。
植物細胞、植物組織又は植物体の供給源としては、コー
ヒーノキ（Coffea）属植物、ツバキ（Camellia）属植
物、コラノキ（Cola）属植物、モチノキ（Ilex）属植
物、ネエア（Neea）属植物、アオギリ（Firmiana）属植
物、ポーリニア（Paullinia ）属植物又はカカオノキ
（Theobroma ）属植物を挙げることができる。
【００３０】本発明によるキサントシンメチル化酵素
は、下記のアミノ酸配列(a)(b)のいずれかを有するタン
パク質からなり、かつ、プリン環の７位でのキサントシ
ンのメチル化を触媒する酵素活性を有する。
は、下記のアミノ酸配列(a)(b)のいずれかを有するタン
パク質からなり、かつ、プリン環の７位でのキサントシ
ンのメチル化を触媒する酵素活性を有する。
【００３１】(a)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸
配列、(b)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列
に、上記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置
換、挿入又は欠失を行って得られた変異アミノ酸配列。
配列、(b)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列
に、上記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置
換、挿入又は欠失を行って得られた変異アミノ酸配列。
【００３２】この変異アミノ酸配列(b)としては、上記
アミノ酸配列(a)をコードする塩基配列及び上記変異ア
ミノ酸配列(b)をコードする塩基配列がストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし得るものが好ましい。
アミノ酸配列(a)をコードする塩基配列及び上記変異ア
ミノ酸配列(b)をコードする塩基配列がストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし得るものが好ましい。
【００３３】本発明は、上記キサントシンメチル化酵
素、もしくは上記方法で得られたキサントシンメチル化
酵素の精製品と、キサントシンと、Ｓ−アデノシルメチ
オニンとを含む混合液をインキュベーションして、７−
メチルキサントシンを生成させる、７−メチルキサント
シンの製造法を含む。
素、もしくは上記方法で得られたキサントシンメチル化
酵素の精製品と、キサントシンと、Ｓ−アデノシルメチ
オニンとを含む混合液をインキュベーションして、７−
メチルキサントシンを生成させる、７−メチルキサント
シンの製造法を含む。
【００３４】本発明は、また、上記方法で得られたキサ
ントシンメチル化酵素の粗抽出物と、キサントシンと、
Ｓ−アデノシルメチオニンとを含む混合液をインキュベ
ーションして、７−メチルキサンチンを生成させる、７
−メチルキサンチンの製造法をも含む。
ントシンメチル化酵素の粗抽出物と、キサントシンと、
Ｓ−アデノシルメチオニンとを含む混合液をインキュベ
ーションして、７−メチルキサンチンを生成させる、７
−メチルキサンチンの製造法をも含む。
【００３５】この様に、本発明により、メチルキサンチ
ン類の合成、微生物や植物において生産されるメチルキ
サンチン類の組成の改変などに有用な、メチルキサンチ
ン類合成系を構成する酵素の一つであるキサントシンメ
チル化酵素をコードするDNA分子及びRNA分子が提供され
る。
ン類の合成、微生物や植物において生産されるメチルキ
サンチン類の組成の改変などに有用な、メチルキサンチ
ン類合成系を構成する酵素の一つであるキサントシンメ
チル化酵素をコードするDNA分子及びRNA分子が提供され
る。
【００３６】
【発明の実施の形態】本発明のキサントシンメチル化酵
素は、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有している
もの、又は、配列番号：１のアミノ酸配列に、目的とす
るキサントシンメチル化酵素活性を損なわない範囲で、
アミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異ア
ミノ酸配列を有しているものである。本明細書では、上
記キサントシンメチル化酵素活性を有する配列番号：１
のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチド
をキサントシンメチル化酵素と総称する。
素は、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有している
もの、又は、配列番号：１のアミノ酸配列に、目的とす
るキサントシンメチル化酵素活性を損なわない範囲で、
アミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異ア
ミノ酸配列を有しているものである。本明細書では、上
記キサントシンメチル化酵素活性を有する配列番号：１
のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチド
をキサントシンメチル化酵素と総称する。
【００３７】上記の変異アミノ酸配列を有するポリペプ
チドは、好ましくは、それ自身が実質的にコーヒーノキ
由来のキサントシンメチル化酵素と同等の機能を有し、
且つ配列番号：１のアミノ酸配列と酵素活性に関する部
位において高い相同性を有しているものである。
チドは、好ましくは、それ自身が実質的にコーヒーノキ
由来のキサントシンメチル化酵素と同等の機能を有し、
且つ配列番号：１のアミノ酸配列と酵素活性に関する部
位において高い相同性を有しているものである。
【００３８】一般に同等の機能を有する複数の酵素間に
おいて、酵素活性に必須である部位以外のアミノ酸配列
の相同性は非常に低いことがある（Kawagoe et al., Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 93, 12082-(1996)参照）。従っ
て、全体としての相同性が低い場合でも、活性に関する
部位において高い相同性を有するものは本発明によるキ
サントシンメチル化酵素として分類できる。
おいて、酵素活性に必須である部位以外のアミノ酸配列
の相同性は非常に低いことがある（Kawagoe et al., Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 93, 12082-(1996)参照）。従っ
て、全体としての相同性が低い場合でも、活性に関する
部位において高い相同性を有するものは本発明によるキ
サントシンメチル化酵素として分類できる。
【００３９】アミノ酸配列全体として比較した場合にお
ける変異アミノ酸配列は、この、配列番号：１のアミノ
酸配列に対して、１５％以上の相同性、好ましくは３０
％以上の相同性、より好ましくは４５％以上の相同性、
更に好ましくは６０％以上の相同性、更により好ましく
は７５％以上の相同性、更により一層好ましくは９０％
以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相同性を有
し、かつ目的のキサントシンメチル化酵素活性を有する
ポリペプチドを提供できる変異アミノ酸配列である。
ける変異アミノ酸配列は、この、配列番号：１のアミノ
酸配列に対して、１５％以上の相同性、好ましくは３０
％以上の相同性、より好ましくは４５％以上の相同性、
更に好ましくは６０％以上の相同性、更により好ましく
は７５％以上の相同性、更により一層好ましくは９０％
以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相同性を有
し、かつ目的のキサントシンメチル化酵素活性を有する
ポリペプチドを提供できる変異アミノ酸配列である。
【００４０】なお、配列番号：１のアミノ酸配列を基準
とした変異を、これらをコードする塩基配列のレベルで
表現した場合、変異アミノ酸配列をコードする変異塩基
配列は、配列番号：１のアミノ酸配列をコードする塩基
配列に対して、３５％以上の相同性、好ましくは６０％
以上の相同性、より好ましくは７５％以上の相同性、更
に好ましくは９０％以上の相同性、更に好ましくは９５
％以上の相同性を有する変異塩基配列である。
とした変異を、これらをコードする塩基配列のレベルで
表現した場合、変異アミノ酸配列をコードする変異塩基
配列は、配列番号：１のアミノ酸配列をコードする塩基
配列に対して、３５％以上の相同性、好ましくは６０％
以上の相同性、より好ましくは７５％以上の相同性、更
に好ましくは９０％以上の相同性、更に好ましくは９５
％以上の相同性を有する変異塩基配列である。
【００４１】本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードする塩基配列、すなわちキサントシンメチル化酵
素遺伝子としては、配列番号：１のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を挙げることができ、その具体例として
は、配列番号：２のDNA配列、配列番号：３のRNA配列を
挙げることができる。これらのキサントシンメチル化酵
素遺伝子に対して、上記で規定される相同性を有する塩
基配列も本発明におけるキサントシンメチル化酵素をコ
ード遺伝子に含まれる。
コードする塩基配列、すなわちキサントシンメチル化酵
素遺伝子としては、配列番号：１のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を挙げることができ、その具体例として
は、配列番号：２のDNA配列、配列番号：３のRNA配列を
挙げることができる。これらのキサントシンメチル化酵
素遺伝子に対して、上記で規定される相同性を有する塩
基配列も本発明におけるキサントシンメチル化酵素をコ
ード遺伝子に含まれる。
【００４２】目的とするキサントシンメチル化酵素活性
を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異アミノ
酸配列をコードする変異塩基配列と、配列番号：１のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列とがストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利
用し得る。
を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異アミノ
酸配列をコードする変異塩基配列と、配列番号：１のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列とがストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利
用し得る。
【００４３】また、変異キサントシンメチル化酵素遺伝
子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコードする
塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例とし
ては、配列番号：２の塩基配列にストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし得るDNA分子及び配列番号：３
の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし得るRNA分子を挙げることができる。
子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコードする
塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例とし
ては、配列番号：２の塩基配列にストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし得るDNA分子及び配列番号：３
の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし得るRNA分子を挙げることができる。
【００４４】このストリンジェントな条件下でのハイブ
リダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning: Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocol
s inMolecular Biology; Wiley Interscience に記載の
方法によって行うことができ、市販のシステムとして
は、Gene Image システム（アマシャム）を挙げること
ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイ
ゼーションを行うことができる。
リダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning: Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocol
s inMolecular Biology; Wiley Interscience に記載の
方法によって行うことができ、市販のシステムとして
は、Gene Image システム（アマシャム）を挙げること
ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイ
ゼーションを行うことができる。
【００４５】試験すべきDNA分子又はRNA分子を転写した
膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブと
プロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー
中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバ
ッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキ
ストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング
試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬と
しては、例えば、１００×Denhardt's solution 、２％
（重量／容量）Bovine serum albumin２％（重量／容
量）FicllTM400、２％（重量／容量）ポリビニルピロリ
ドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈して使
用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好
ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５×
ＳＳＣの濃度で使用する。
膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブと
プロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー
中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバ
ッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキ
ストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング
試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬と
しては、例えば、１００×Denhardt's solution 、２％
（重量／容量）Bovine serum albumin２％（重量／容
量）FicllTM400、２％（重量／容量）ポリビニルピロリ
ドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈して使
用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好
ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５×
ＳＳＣの濃度で使用する。
【００４６】ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜
８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは
５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュ
ベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗
浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリ
ダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成
は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好まし
くは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好まし
くは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好まし
くは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好まし
くは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。
この様な洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイ
ブリダイズしたDNA分子又はRNA分子を、プローブに用い
た標識を利用して識別することができる。
８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは
５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュ
ベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗
浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリ
ダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成
は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好まし
くは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好まし
くは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好まし
くは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好まし
くは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。
この様な洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイ
ブリダイズしたDNA分子又はRNA分子を、プローブに用い
た標識を利用して識別することができる。
【００４７】なお、変異は、自然界において生じたもの
でもよく、塩基配列における部位突然変異により人工的
に起こしたものでも良い。
でもよく、塩基配列における部位突然変異により人工的
に起こしたものでも良い。
【００４８】本発明のキサントシンメチル化酵素遺伝子
を有するDNA分子は、例えば、キサントシンメチル化酵
素をコードするDNA分子に特異的にハイブリダイズする
オリゴ塩基をプライマーとして用いたPCR技術（植物のP
CR実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリ
ーズ２）秀潤社(1995)）を利用して、本発明によるキサ
ントシンメチル化酵素を生産する細胞から分離すること
ができる。
を有するDNA分子は、例えば、キサントシンメチル化酵
素をコードするDNA分子に特異的にハイブリダイズする
オリゴ塩基をプライマーとして用いたPCR技術（植物のP
CR実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリ
ーズ２）秀潤社(1995)）を利用して、本発明によるキサ
ントシンメチル化酵素を生産する細胞から分離すること
ができる。
【００４９】具体的には、mRNAから合成したｃDNAにリ
ンカーを結合させ、キサントシンメチル化酵素を構成す
るアミノ酸配列をコードするDNAとリンカー間でPCRを行
うこと等により、目的ｃDNAの全長配列を単離すること
ができる。
ンカーを結合させ、キサントシンメチル化酵素を構成す
るアミノ酸配列をコードするDNAとリンカー間でPCRを行
うこと等により、目的ｃDNAの全長配列を単離すること
ができる。
【００５０】この様なハイブリダイゼーション技術やPC
R技術により得られるキサントシンメチル化酵素をコー
ドするDNA分子は、少なくとも単離に使用した部位にお
いては、配列番号：２に記載のキサントシンメチル化酵
素遺伝子と相同性を有する。ここで相同性とは、それぞ
れのキサントシンメチル化酵素遺伝子がコードするアミ
ノ酸配列の比較において１５％以上の相同性、好ましく
は３０％以上の相同性、より好ましくは４５％以上の相
同性、更に好ましくは６０％以上の相同性、更により好
ましくは７５％以上の相同性、更により一層好ましくは
９０％以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相同
性を指す。ただし、得られるキサントシンメチル化酵素
遺伝子によっては、コードするアミノ酸の複数の残基が
欠失、付加、置換された結果として、キサントシンメチ
ル化酵素との相同性が１５％以下となってもなお、キサ
ントシンメチル化酵素の機能に必須な領域を保持し、実
質的にキサントシンメチル化酵素と同等の機能を有する
タンパク質をコードしていることも想定される。
R技術により得られるキサントシンメチル化酵素をコー
ドするDNA分子は、少なくとも単離に使用した部位にお
いては、配列番号：２に記載のキサントシンメチル化酵
素遺伝子と相同性を有する。ここで相同性とは、それぞ
れのキサントシンメチル化酵素遺伝子がコードするアミ
ノ酸配列の比較において１５％以上の相同性、好ましく
は３０％以上の相同性、より好ましくは４５％以上の相
同性、更に好ましくは６０％以上の相同性、更により好
ましくは７５％以上の相同性、更により一層好ましくは
９０％以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相同
性を指す。ただし、得られるキサントシンメチル化酵素
遺伝子によっては、コードするアミノ酸の複数の残基が
欠失、付加、置換された結果として、キサントシンメチ
ル化酵素との相同性が１５％以下となってもなお、キサ
ントシンメチル化酵素の機能に必須な領域を保持し、実
質的にキサントシンメチル化酵素と同等の機能を有する
タンパク質をコードしていることも想定される。
【００５１】本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードする塩基配列（遺伝子）を有するDNA分子又はRNA
分子を単離するために用いる生物は、メチルキサンチン
類を生成する生物であればいずれも使用できるが、中で
もコーヒーノキなどのアカネ科コーヒーノキ (Coffea)
属植物、チャノキなどのツバキ科ツバキ (Camellia)属
植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Cola）属植
物などが好ましい。
コードする塩基配列（遺伝子）を有するDNA分子又はRNA
分子を単離するために用いる生物は、メチルキサンチン
類を生成する生物であればいずれも使用できるが、中で
もコーヒーノキなどのアカネ科コーヒーノキ (Coffea)
属植物、チャノキなどのツバキ科ツバキ (Camellia)属
植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Cola）属植
物などが好ましい。
【００５２】本発明によるキサントシンメチル化酵素遺
伝子を有するRNA分子は、Ｓｐ６プロモーターやＴ７プ
ロモーターといったRNAポリメラーゼが認識するプロモ
ーターの下流に、上記方法で得たキサントシンメチル化
酵素DNAを所望の向きで、機能し得る位置に接続して組
換え分子を調製し、これをＳｐ６RNAポリメラーゼやＴ
７RNAポリメラーゼなどのRNA ポリメラーゼで転写させ
て得ることができる。また、植物ウイルスにキサントシ
ンメチル化酵素DNAないしRNAを導入するか、後で述べる
様に適当なDNA発現カセットにキサントシンメチル化酵
素遺伝子を有するDNAを所望の向きで機能し得る位置に
接続して組換え分子を形成し、この組換え分子を微生物
や植物等の宿主に導入することにより宿主の転写活性を
利用して得ることもできる。
伝子を有するRNA分子は、Ｓｐ６プロモーターやＴ７プ
ロモーターといったRNAポリメラーゼが認識するプロモ
ーターの下流に、上記方法で得たキサントシンメチル化
酵素DNAを所望の向きで、機能し得る位置に接続して組
換え分子を調製し、これをＳｐ６RNAポリメラーゼやＴ
７RNAポリメラーゼなどのRNA ポリメラーゼで転写させ
て得ることができる。また、植物ウイルスにキサントシ
ンメチル化酵素DNAないしRNAを導入するか、後で述べる
様に適当なDNA発現カセットにキサントシンメチル化酵
素遺伝子を有するDNAを所望の向きで機能し得る位置に
接続して組換え分子を形成し、この組換え分子を微生物
や植物等の宿主に導入することにより宿主の転写活性を
利用して得ることもできる。
【００５３】キサントシンメチル化酵素遺伝子を有する
DNA分子の全部又は一部と相補性を有するDNA分子、ある
いはキサントシンメチル化酵素遺伝子を有するRNA分子
の全部又は一部と相補性を有するRNA 分子であって、メ
チルキサンチン類を生成する宿主細胞中において発現し
た際に宿主細胞におけるキサントシンメチル化酵素の発
現を阻害する機能を有するものは、宿主細胞におけるキ
サントシンメチル化酵素発現の阻害又は抑制用のDNA分
子又はRNA分子として用いることができる。
DNA分子の全部又は一部と相補性を有するDNA分子、ある
いはキサントシンメチル化酵素遺伝子を有するRNA分子
の全部又は一部と相補性を有するRNA 分子であって、メ
チルキサンチン類を生成する宿主細胞中において発現し
た際に宿主細胞におけるキサントシンメチル化酵素の発
現を阻害する機能を有するものは、宿主細胞におけるキ
サントシンメチル化酵素発現の阻害又は抑制用のDNA分
子又はRNA分子として用いることができる。
【００５４】ここで、キサントシンメチル化酵素遺伝子
の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎とし
て得られる阻害用のmRNA、すなわちアンチセンスRNAが
宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞における
キサントシンメチル化酵素を発現させるためのmRNAと結
合して、宿主細胞におけるキサントシンメチル化酵素の
発現が阻害される部分である。この部分としては、この
様なアンチセンスmRNAの形成に必要となる部分であり、
例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げること
ができる。
の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎とし
て得られる阻害用のmRNA、すなわちアンチセンスRNAが
宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞における
キサントシンメチル化酵素を発現させるためのmRNAと結
合して、宿主細胞におけるキサントシンメチル化酵素の
発現が阻害される部分である。この部分としては、この
様なアンチセンスmRNAの形成に必要となる部分であり、
例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げること
ができる。
【００５５】アンチセンスmRNA形成用のDNA分子として
は、例えば、配列番号：２の塩基配列の全部又は一部と
相補性を有しているDNA分子を挙げることができ、アン
チセンスRNA分子としては、配列番号：３の塩基配列の
全部又は一部と相補性を有しているRNA分子を挙げるこ
とができる。これらの塩基配列とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部又は一部と
相補性を有しているDNA分子又はRNA分子もこの様な目的
に用いることができる。
は、例えば、配列番号：２の塩基配列の全部又は一部と
相補性を有しているDNA分子を挙げることができ、アン
チセンスRNA分子としては、配列番号：３の塩基配列の
全部又は一部と相補性を有しているRNA分子を挙げるこ
とができる。これらの塩基配列とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部又は一部と
相補性を有しているDNA分子又はRNA分子もこの様な目的
に用いることができる。
【００５６】なお、これらの阻害用のDNA分子又はRNA分
子に対して、高い相同性を有し、目的とする阻害又は抑
制機能を発揮できるものも利用できる。ここで高い相同
性とはそれぞれの塩基配列の比較において６０％以上の
相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましく
は９０％以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相
同性を指す。
子に対して、高い相同性を有し、目的とする阻害又は抑
制機能を発揮できるものも利用できる。ここで高い相同
性とはそれぞれの塩基配列の比較において６０％以上の
相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましく
は９０％以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相
同性を指す。
【００５７】これらの阻害用のDNA分子又はRNA分子自体
は、必ずしも本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードするものでなくてもよい。
は、必ずしも本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードするものでなくてもよい。
【００５８】本発明によるキサントシンメチル化酵素阻
害用の塩基配列の他の態様としては、キサントシンメチ
ル化酵素遺伝子と相同性を有する部分を有するが、キサ
ントシンメチル化酵素をコードしていない塩基配列で、
宿主細胞の有するキサントシンメチル化酵素遺伝子と置
換されることで、宿主のキサントシンメチル化酵素活性
を消失させ得るものを挙げることができる。
害用の塩基配列の他の態様としては、キサントシンメチ
ル化酵素遺伝子と相同性を有する部分を有するが、キサ
ントシンメチル化酵素をコードしていない塩基配列で、
宿主細胞の有するキサントシンメチル化酵素遺伝子と置
換されることで、宿主のキサントシンメチル化酵素活性
を消失させ得るものを挙げることができる。
【００５９】これらキサントシンメチル化酵素遺伝子又
はキサントシンメチル化酵素の発現を阻害又は抑制する
機能を有するDNA分子の宿主細胞内での発現について、
宿主細胞として植物細胞を利用した例について以下に説
明する。
はキサントシンメチル化酵素の発現を阻害又は抑制する
機能を有するDNA分子の宿主細胞内での発現について、
宿主細胞として植物細胞を利用した例について以下に説
明する。
【００６０】植物細胞での発現は、（ｉ）宿主細胞内で
のDNAからmRNAへの転写を可能とするプロモーター、（i
i）プロモーターの下流にセンス方向又はアンチセンス
方向に連結したキサントシンメチル化酵素遺伝子を含む
DNA断片、又はキサントシンメチル化酵素の発現を阻害
する機能を有するDNA断片、（iii）必要に応じてこれら
DNA断片の下流に連結された転写産物の安定化に必要な
ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、
などを含む発現カセットを宿主である植物細胞に導入し
て、これを形質転換する方法が利用できる。
のDNAからmRNAへの転写を可能とするプロモーター、（i
i）プロモーターの下流にセンス方向又はアンチセンス
方向に連結したキサントシンメチル化酵素遺伝子を含む
DNA断片、又はキサントシンメチル化酵素の発現を阻害
する機能を有するDNA断片、（iii）必要に応じてこれら
DNA断片の下流に連結された転写産物の安定化に必要な
ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、
などを含む発現カセットを宿主である植物細胞に導入し
て、これを形質転換する方法が利用できる。
【００６１】この様な発現カセット、及びこれを含むベ
クターも本発明の対象である。
クターも本発明の対象である。
【００６２】発現カセットは、挿入されているDNAを恒
常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有
し得る。また、この発現カセットは。必要に応じて、植
物細胞内での複製のための複製オリジンを有することが
できる。
常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有
し得る。また、この発現カセットは。必要に応じて、植
物細胞内での複製のための複製オリジンを有することが
できる。
【００６３】恒常的に発現させるためのプロモーターと
しては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５
Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙
げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモータ
ーとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵
入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散
布等の外因によって発現することが知られているプロモ
ーター等が挙げられる。この様なプロモーターとして
は、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によ
って発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターや
タバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温に
よって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモ
ーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「Ｈ
ＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘
導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気
的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイ
ネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタ
ンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の
化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーター
は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導さ
れる。
しては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５
Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙
げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモータ
ーとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵
入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散
布等の外因によって発現することが知られているプロモ
ーター等が挙げられる。この様なプロモーターとして
は、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によ
って発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターや
タバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温に
よって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモ
ーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「Ｈ
ＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘
導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気
的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイ
ネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタ
ンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の
化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーター
は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導さ
れる。
【００６４】或いはまた、発現カセットに挿入されてい
るDNAを発現させるためのプロモーターとしては、キサ
ントシンメチル化酵素遺伝子のプロモーターを単離して
利用する方法も挙げられる。
るDNAを発現させるためのプロモーターとしては、キサ
ントシンメチル化酵素遺伝子のプロモーターを単離して
利用する方法も挙げられる。
【００６５】具体的なプロモーターの単離方法の一例に
は、キサントシンメチル化酵素遺伝子の少なくとも一部
をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用に
より、ゲノムDNA断片を選択し、該遺伝子の上流部DNAを
特定する方法を挙げることができる。
は、キサントシンメチル化酵素遺伝子の少なくとも一部
をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用に
より、ゲノムDNA断片を選択し、該遺伝子の上流部DNAを
特定する方法を挙げることができる。
【００６６】発現カセット中の組み換えDNA分子の植物
への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形
質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝
子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。こ
の様なベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ
13ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の
配列をベクターに導入することができる。得られたプラ
スミドDNAの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部
位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生
物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた
後、プラスミドDNAを切断して、別のDNAに結合させるこ
とができる。各プラスミドDNAの配列を、同じプラスミ
ド又は別のプラスミド中にクローニングすることができ
る。
への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形
質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝
子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。こ
の様なベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ
13ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の
配列をベクターに導入することができる。得られたプラ
スミドDNAの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部
位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生
物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた
後、プラスミドDNAを切断して、別のDNAに結合させるこ
とができる。各プラスミドDNAの配列を、同じプラスミ
ド又は別のプラスミド中にクローニングすることができ
る。
【００６７】植物細胞の中に発現カセットを導入するた
めには、さまざまな手法を用いることができる。これら
の手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）又
は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium
rhizogenes）を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転
換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション
法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン
法等やその他の可能性が含まれる。
めには、さまざまな手法を用いることができる。これら
の手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）又
は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium
rhizogenes）を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転
換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション
法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン
法等やその他の可能性が含まれる。
【００６８】プロトプラストへの直接導入では、特別に
必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体の
様な単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺
伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のDNA配
列が必要になることもある。例えばＴｉ又はＲｉプラス
ミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、Ｔｉ及び
ＲｉプラスミドのT-DNA領域の少なくとも右端の配列、
大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域
となる様に接続するのが好ましい。
必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体の
様な単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺
伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のDNA配
列が必要になることもある。例えばＴｉ又はＲｉプラス
ミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、Ｔｉ及び
ＲｉプラスミドのT-DNA領域の少なくとも右端の配列、
大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域
となる様に接続するのが好ましい。
【００６９】アグロバクテリウム属菌を形質転換に用い
る場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラス
ミド、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクター中
にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロ
バクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクター
は、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーショ
ンによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。
中間ベクターは、T-DNAの配列と相同な領域をもつた
め、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴ
ｉ又はＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使
われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含ま
れている必要がある。通常Ｔｉ又はＲｉプラスミドにｖ
ｉｒ領域が含まれており、その働きにより、T-DNAを植
物細胞に移行させることができる。
る場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラス
ミド、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクター中
にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロ
バクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクター
は、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーショ
ンによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。
中間ベクターは、T-DNAの配列と相同な領域をもつた
め、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴ
ｉ又はＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使
われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含ま
れている必要がある。通常Ｔｉ又はＲｉプラスミドにｖ
ｉｒ領域が含まれており、その働きにより、T-DNAを植
物細胞に移行させることができる。
【００７０】一方、バイナリーベクターはアグロバクテ
リウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープ
ラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってア
グロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉ
ｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のT-DNA
を植物細胞に移行させることができる。
リウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープ
ラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってア
グロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉ
ｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のT-DNA
を植物細胞に移行させることができる。
【００７１】この様にして得られた発現カセットを含む
中間ベクター又はバイナリーベクター、及びこれを含む
大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の
対象である。
中間ベクター又はバイナリーベクター、及びこれを含む
大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の
対象である。
【００７２】形質転換された植物細胞は、再生過程を経
ることにより植物組織又は植物体に変換することができ
る。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例え
ばコーヒーノキではHatanakaら（Plant Cell Rep., 19,
106- （1999））の方法、イネではFujimuraら（Plant
Tissue Culture Lett., 2, 74- （1995））の方法、ト
ウモロコシでは、Shillitoら（Bio/Technology, 7, 581
- （1989））の方法、シロイヌナズナではAkama らの方
法（Plant Cell Rep., 12, 7- （1992））などがある。
ることにより植物組織又は植物体に変換することができ
る。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例え
ばコーヒーノキではHatanakaら（Plant Cell Rep., 19,
106- （1999））の方法、イネではFujimuraら（Plant
Tissue Culture Lett., 2, 74- （1995））の方法、ト
ウモロコシでは、Shillitoら（Bio/Technology, 7, 581
- （1989））の方法、シロイヌナズナではAkama らの方
法（Plant Cell Rep., 12, 7- （1992））などがある。
【００７３】本発明において、「植物体」とは植物に分
類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、
葉、茎、根、花、果実、種子等）を指す。
類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、
葉、茎、根、花、果実、種子等）を指す。
【００７４】これらの方法により作出された植物体又は
その繁殖媒体（例えば種子、塊茎、切穂など）から得た
植物体は、メチルキサンチン類を生成する野生型の植物
体と比較して本発明のキサントシンメチル化酵素の発現
量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサ
ンチン類の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変に
よるメチルキサンチン類の生成比の変化が起こる。この
様にして得られた形質転換植物は本発明の対象である。
本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物
の特定の組織又は細胞も含まれる。
その繁殖媒体（例えば種子、塊茎、切穂など）から得た
植物体は、メチルキサンチン類を生成する野生型の植物
体と比較して本発明のキサントシンメチル化酵素の発現
量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサ
ンチン類の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変に
よるメチルキサンチン類の生成比の変化が起こる。この
様にして得られた形質転換植物は本発明の対象である。
本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物
の特定の組織又は細胞も含まれる。
【００７５】また、近年植物のポストトランスレーショ
ナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の
外来核酸に対して植物が本来備えている防御機能を利用
して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことが
わかってきた（Cell,95,177-187(1998) 、化学と生物、
37、532-(1999)、蛋白質核酸酵素、44、1396-(199
9)）。これによれば、DNAウイルスやRNAウイルス等が植
物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラント
RNAを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と
配列特異的に二本鎖RNAを形成する。この二本鎖RNAはＲ
Ｎａｓｅにより分解されることにより、目的の遺伝子の
発現を抑制することが可能となる（Cell,96,303-(1999)
）。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制した
い配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない
点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部
（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、
その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発
現抑制方法は、目的遺伝子の配列又はそれと高い相同性
を持つ配列の全部又は一部を含む二本鎖RNAや、二本鎖D
NAを持つアグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させ
る。ここで高い相同性とはそれぞれの塩基配列の比較に
おいて６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相
同性、更に好ましくは９０％以上の相同性、最も好まし
くは９５％以上の相同性を指す。
ナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の
外来核酸に対して植物が本来備えている防御機能を利用
して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことが
わかってきた（Cell,95,177-187(1998) 、化学と生物、
37、532-(1999)、蛋白質核酸酵素、44、1396-(199
9)）。これによれば、DNAウイルスやRNAウイルス等が植
物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラント
RNAを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と
配列特異的に二本鎖RNAを形成する。この二本鎖RNAはＲ
Ｎａｓｅにより分解されることにより、目的の遺伝子の
発現を抑制することが可能となる（Cell,96,303-(1999)
）。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制した
い配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない
点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部
（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、
その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発
現抑制方法は、目的遺伝子の配列又はそれと高い相同性
を持つ配列の全部又は一部を含む二本鎖RNAや、二本鎖D
NAを持つアグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させ
る。ここで高い相同性とはそれぞれの塩基配列の比較に
おいて６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相
同性、更に好ましくは９０％以上の相同性、最も好まし
くは９５％以上の相同性を指す。
【００７６】この方法を施された植物体は、メチルキサ
ンチン類を生成する野生型の植物体と比較して本発明の
キサントシンメチル化酵素タンパク質の発現量が変化
し、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサンチン類
の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるメチ
ルキサンチン類の生成比の変化が起こる。この様にして
得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物
には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織又は
細胞も含まれる。
ンチン類を生成する野生型の植物体と比較して本発明の
キサントシンメチル化酵素タンパク質の発現量が変化
し、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサンチン類
の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるメチ
ルキサンチン類の生成比の変化が起こる。この様にして
得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物
には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織又は
細胞も含まれる。
【００７７】上記のメチルキサンチン類を生成する植物
としては、コーヒーノキなどのアカネ科コーヒーノキ
(Coffea) 属植物、チャノキなどのツバキ科ツバキ (Cam
ellia) 属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ (C
ola) 属植物などを例示することができる。
としては、コーヒーノキなどのアカネ科コーヒーノキ
(Coffea) 属植物、チャノキなどのツバキ科ツバキ (Cam
ellia) 属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ (C
ola) 属植物などを例示することができる。
【００７８】本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードするDNAを導入してキサントシンメチル化酵素タ
ンパク質を大量に発現させるための微生物としては、大
腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイルス等のウイル
スを例示することができる。
コードするDNAを導入してキサントシンメチル化酵素タ
ンパク質を大量に発現させるための微生物としては、大
腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイルス等のウイル
スを例示することができる。
【００７９】本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードするDNAを導入してキサントシンメチル化酵素タ
ンパク質を発現させ、７−メチルキサントシン又は７−
メチルキサンチンを生成させるための微生物としては大
腸菌や枯草菌等の細菌及び酵母や麹菌等の真菌を例示す
ることができる。
コードするDNAを導入してキサントシンメチル化酵素タ
ンパク質を発現させ、７−メチルキサントシン又は７−
メチルキサンチンを生成させるための微生物としては大
腸菌や枯草菌等の細菌及び酵母や麹菌等の真菌を例示す
ることができる。
【００８０】上記の７−メチルキサントシン又は７−メ
チルキサンチンを生成させるための植物体、植物組織又
は植物細胞はいかなる植物種のものであってもよいが、
栽培又は培養が容易なものが望ましい。
チルキサンチンを生成させるための植物体、植物組織又
は植物細胞はいかなる植物種のものであってもよいが、
栽培又は培養が容易なものが望ましい。
【００８１】本発明によるキサントシンメチル化酵素を
コードするDNAを導入してキサントシンメチル化酵素タ
ンパク質を発現させ、メチルキサンチン類の生成量を増
加させるため又はメチルキサンチン類の生成比を変化さ
せるための植物体、植物組織又は植物細胞は、メチルキ
サンチン類を生成する植物であればどれでも使用でき
る。
コードするDNAを導入してキサントシンメチル化酵素タ
ンパク質を発現させ、メチルキサンチン類の生成量を増
加させるため又はメチルキサンチン類の生成比を変化さ
せるための植物体、植物組織又は植物細胞は、メチルキ
サンチン類を生成する植物であればどれでも使用でき
る。
【００８２】上記の植物体、植物組織又は植物細胞の供
給源としては、例えば、コーヒーノキ(Coffea)属植物、
ツバキ(Camellia)属植物、コラノキ(Cola)属植物、モチ
ノキ(Ilex)属植物、ネエア(Neea)属植物、アオギリ(Fir
miana)属植物、ポーリニア(Paullinia)属植物又はカカ
オノキ(Theobroma)属植物を挙げることができる。
給源としては、例えば、コーヒーノキ(Coffea)属植物、
ツバキ(Camellia)属植物、コラノキ(Cola)属植物、モチ
ノキ(Ilex)属植物、ネエア(Neea)属植物、アオギリ(Fir
miana)属植物、ポーリニア(Paullinia)属植物又はカカ
オノキ(Theobroma)属植物を挙げることができる。
【００８３】
【実施例】本発明を下記の実施例により具体的に説明す
る。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるもので
はない。
る。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるもので
はない。
【００８４】(1) 発現ベクターの構築
完全長のコード配列を含む、コーヒーノキ由来のCaMTL3
cDNA(配列番号：２)をPyrobest DNA Polymerase（宝酒
造）を用いてPCR法によって増幅した。プライマーに
は、CaMTL3 cDNA(配列番号：２)の配列をもとに作成し
たCaCS-SmaI(5'-AATTCCCGGGATGGAGCTCCAAGAAGTCC-3')及
びCaCS-NotI(5'-GCGGCCGCTTACACGTCTGACTTCTC-3')を用
いた。鋳型にはコーヒーノキ由来のcDNAライブラリーか
ら単離されたファージミドクローン35(後述の文献(2))
を用いた。増幅したCaMTL3 cDNA断片をベクターpBluesc
ript II KS-(Stratagene社製)のEco RVサイトへ挿入
し、塩基配列決定を行うことによって塩基置換や欠失が
無いことを確認した。ベクターpBluescript II KS-に挿
入されたCaMTL3 cDNA断片を制限酵素Sma I及び制限酵素
NotIで切断し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GS
T)発現ベクターであるpGEX-4T-2(Amersham Bioscience
s)のSma I/Not Iサイトへ挿入した。以上の操作によっ
て、GSTとCaMTL3の融合タンパク質(GST-MTL3)を大腸菌
において発現させるための組換えベクターpGEX-MTL3を
構築した。これを図３に示す。
cDNA(配列番号：２)をPyrobest DNA Polymerase（宝酒
造）を用いてPCR法によって増幅した。プライマーに
は、CaMTL3 cDNA(配列番号：２)の配列をもとに作成し
たCaCS-SmaI(5'-AATTCCCGGGATGGAGCTCCAAGAAGTCC-3')及
びCaCS-NotI(5'-GCGGCCGCTTACACGTCTGACTTCTC-3')を用
いた。鋳型にはコーヒーノキ由来のcDNAライブラリーか
ら単離されたファージミドクローン35(後述の文献(2))
を用いた。増幅したCaMTL3 cDNA断片をベクターpBluesc
ript II KS-(Stratagene社製)のEco RVサイトへ挿入
し、塩基配列決定を行うことによって塩基置換や欠失が
無いことを確認した。ベクターpBluescript II KS-に挿
入されたCaMTL3 cDNA断片を制限酵素Sma I及び制限酵素
NotIで切断し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GS
T)発現ベクターであるpGEX-4T-2(Amersham Bioscience
s)のSma I/Not Iサイトへ挿入した。以上の操作によっ
て、GSTとCaMTL3の融合タンパク質(GST-MTL3)を大腸菌
において発現させるための組換えベクターpGEX-MTL3を
構築した。これを図３に示す。
【００８５】(2) 組換えタンパク質の生産
組換えベクターpGEX-MTL3及び、対照としてのグルタチ
オンS-トランスフェラーゼ(GST)発現ベクターpGEX-4T-2
をそれぞれ大腸菌BL21株に導入し、これを形質転換し
た。いずれの形質転換株も100mLの2xYT液体培地(100mg/
Lのアンピシリンを含む)において、培養液の吸光度(A
６００)が約0.8になるまで37℃で振盪培養を行った。こ
れらの培養液に終濃度が1mMになる様にイソプロピル-β
-D-チオガラクトシド(IPTG)を添加し、更に20℃で6時間
の振盪培養を行った。以上の操作によって、大腸菌にお
いて組換えタンパク質(GST-MTL3)及び組換えタンパク質
(GST)の生産を行った。
オンS-トランスフェラーゼ(GST)発現ベクターpGEX-4T-2
をそれぞれ大腸菌BL21株に導入し、これを形質転換し
た。いずれの形質転換株も100mLの2xYT液体培地(100mg/
Lのアンピシリンを含む)において、培養液の吸光度(A
６００)が約0.8になるまで37℃で振盪培養を行った。こ
れらの培養液に終濃度が1mMになる様にイソプロピル-β
-D-チオガラクトシド(IPTG)を添加し、更に20℃で6時間
の振盪培養を行った。以上の操作によって、大腸菌にお
いて組換えタンパク質(GST-MTL3)及び組換えタンパク質
(GST)の生産を行った。
【００８６】(3) 組換えタンパク質の粗抽出と精製
組換えタンパク質を生産した大腸菌を遠心分離によって
回収し、10mLの破砕洗浄液(50mM Tris-HCl[pH8.0]、1mM
EDTA、5mMジチオスレイトール)に懸濁した。以降の操
作は氷上あるいは4℃で行った。得られた懸濁液を超音
波破砕処理した後、終濃度が1%になる様にTriton X-100
を加えて30分間インキュベーションした。得られた破砕
液を遠心分離によって上清と沈殿に分離し、この上清を
組換えタンパク質の粗抽出試料とした。粗抽出試料に10
0μLのグルタチオンセファロース4B樹脂(Amersham Bios
ciences)を加え、1時間穏やかに攪拌した。組換えタン
パク質が結合したグルタチオンセファロース4B樹脂を遠
心分離によって回収し、1mLの破砕洗浄液で3回洗浄した
後、同樹脂に100μLの溶出液(50mM Tris-HCl[pH8.5]、1
mM EDTA、5mMジチオスレイトール、10mMグルタチオン)
を加えてこの混合物を20分間穏やかに攪拌した。混合物
から溶出液を遠心分離によって回収し、これを組換えタ
ンパク質の精製試料とした。
回収し、10mLの破砕洗浄液(50mM Tris-HCl[pH8.0]、1mM
EDTA、5mMジチオスレイトール)に懸濁した。以降の操
作は氷上あるいは4℃で行った。得られた懸濁液を超音
波破砕処理した後、終濃度が1%になる様にTriton X-100
を加えて30分間インキュベーションした。得られた破砕
液を遠心分離によって上清と沈殿に分離し、この上清を
組換えタンパク質の粗抽出試料とした。粗抽出試料に10
0μLのグルタチオンセファロース4B樹脂(Amersham Bios
ciences)を加え、1時間穏やかに攪拌した。組換えタン
パク質が結合したグルタチオンセファロース4B樹脂を遠
心分離によって回収し、1mLの破砕洗浄液で3回洗浄した
後、同樹脂に100μLの溶出液(50mM Tris-HCl[pH8.5]、1
mM EDTA、5mMジチオスレイトール、10mMグルタチオン)
を加えてこの混合物を20分間穏やかに攪拌した。混合物
から溶出液を遠心分離によって回収し、これを組換えタ
ンパク質の精製試料とした。
【００８７】(4) 薄層クロマトグラフィー(TLC)による
酵素反応生成物の検出 100mM Tris-HCl[pH8.0]、200μM MgCl２、200μMキサン
トシン（メチル基受容体[XR]）、16.8μM S-アデノシル
-L-[メチル-１４C]メチオニン[SAM][2.2GBq/mmol;Amers
ham Biosciences]（メチル基供与体）、及び1μgの組換
えタンパク質精製試料からなる混合液100μLを27℃で終
夜インキュベーションした。得られた酵素反応液をフィ
ルターカップ(ULTRAFREE-MC 10,000NMWL;Millipore)に
よって濾過した。2μLの酵素反応液を2μLのメタノール
と混合して混合液をTLCプレート(Silicagel 60 F254; M
erck)に点着した。
酵素反応生成物の検出 100mM Tris-HCl[pH8.0]、200μM MgCl２、200μMキサン
トシン（メチル基受容体[XR]）、16.8μM S-アデノシル
-L-[メチル-１４C]メチオニン[SAM][2.2GBq/mmol;Amers
ham Biosciences]（メチル基供与体）、及び1μgの組換
えタンパク質精製試料からなる混合液100μLを27℃で終
夜インキュベーションした。得られた酵素反応液をフィ
ルターカップ(ULTRAFREE-MC 10,000NMWL;Millipore)に
よって濾過した。2μLの酵素反応液を2μLのメタノール
と混合して混合液をTLCプレート(Silicagel 60 F254; M
erck)に点着した。
【００８８】また、1μgの組換えタンパク質精製試料の
代わりに5μgの組換えタンパク質粗抽出試料を用いた点
を除いて、上記と同様に混合液を同一TLCプレートに点
着した。
代わりに5μgの組換えタンパク質粗抽出試料を用いた点
を除いて、上記と同様に混合液を同一TLCプレートに点
着した。
【００８９】以上の操作は、対照として組換えタンパク
質（GST)についても同様に行った。
質（GST)についても同様に行った。
【００９０】酵素反応液の代わりには、７−メチルキサ
ントシン[7mXR]標品(1mM水溶液)及び７−メチルキサン
チン[7mX]標品(1mM水溶液)を用いた点を除いて、上記と
同様に混合液を同一TLCプレートに点着した。
ントシン[7mXR]標品(1mM水溶液)及び７−メチルキサン
チン[7mX]標品(1mM水溶液)を用いた点を除いて、上記と
同様に混合液を同一TLCプレートに点着した。
【００９１】その後、展開溶媒として水/酢酸/n-ブタノ
ール(2:1:4,v/v/v)を用いて1.5時間展開を行った。酵素
反応液を展開した部分に増感剤(En３ Hance;Dupont NE
N)を噴霧し、X線フィルム(BioMax MS;Kodak)を用いてオ
ートラジオグラフィー(−８０℃で３日間の露光)を行
い、レーベル化されたメチル基(メチル-１４C)が付加さ
れた酵素反応生成物のスポットを検出した。標品を展開
した部分に紫外光を照射して標品のスポットを検出し
た。TLCによる解析の結果を図４に示す。
ール(2:1:4,v/v/v)を用いて1.5時間展開を行った。酵素
反応液を展開した部分に増感剤(En３ Hance;Dupont NE
N)を噴霧し、X線フィルム(BioMax MS;Kodak)を用いてオ
ートラジオグラフィー(−８０℃で３日間の露光)を行
い、レーベル化されたメチル基(メチル-１４C)が付加さ
れた酵素反応生成物のスポットを検出した。標品を展開
した部分に紫外光を照射して標品のスポットを検出し
た。TLCによる解析の結果を図４に示す。
【００９２】図４から分かる様に、組換えタンパク質GS
T-MTL3の精製試料は、メチル基受容体であるキサントシ
ン[XR]の存在下で、メチル基供与体である[SAM]を消費
し、７−メチルキサントシン[7mXR]を生成した。すなわ
ち、この試料は、キサントシン[XR]のメチル化による７
−メチルキサントシン[7mXR]の生成反応を触媒すること
が分かった。
T-MTL3の精製試料は、メチル基受容体であるキサントシ
ン[XR]の存在下で、メチル基供与体である[SAM]を消費
し、７−メチルキサントシン[7mXR]を生成した。すなわ
ち、この試料は、キサントシン[XR]のメチル化による７
−メチルキサントシン[7mXR]の生成反応を触媒すること
が分かった。
【００９３】また、組換えタンパク質(GST-MTL3)の粗抽
出試料は、キサントシン[XR]の存在下でメチル基供与体
[SAM]を消費し、更に、生じた７−メチルキサントシン
[7mXR]の脱リボース体である７−メチルキサンチン[7m
X]を生成した。すなわち、この試料は、キサントシン[X
R]のメチル化による７−メチルキサントシン[7mXR]の生
成、及び[7mXR]からその脱リボース体である７−メチル
キサンチン[7mX]の生成の２反応を触媒することが分か
った。
出試料は、キサントシン[XR]の存在下でメチル基供与体
[SAM]を消費し、更に、生じた７−メチルキサントシン
[7mXR]の脱リボース体である７−メチルキサンチン[7m
X]を生成した。すなわち、この試料は、キサントシン[X
R]のメチル化による７−メチルキサントシン[7mXR]の生
成、及び[7mXR]からその脱リボース体である７−メチル
キサンチン[7mX]の生成の２反応を触媒することが分か
った。
【００９４】一方、対照として用いた組換えタンパク質
(GST)は、精製試料及び粗抽出試料ともにこの様な酵素
活性を示さなかった。
(GST)は、精製試料及び粗抽出試料ともにこの様な酵素
活性を示さなかった。
【００９５】
【発明の効果】本発明によれば、下記の様な効果が発揮
される。
される。
【００９６】(1) 工業用、食品用、医療用として利用で
きるキサントシンメチル化酵素の精製物及び祖抽出物を
効率よく生産し、これらを用いて酵素反応によって７−
メチルキサントシン及び７−メチルキサンチンを製造す
ることが可能になる。
きるキサントシンメチル化酵素の精製物及び祖抽出物を
効率よく生産し、これらを用いて酵素反応によって７−
メチルキサントシン及び７−メチルキサンチンを製造す
ることが可能になる。
【００９７】(2) メチルキサンチン類を生合成しない微
生物、植物、植物組織、植物細胞にキサントシンメチル
化酵素活性を付加して、７−メチルキサントシン及び７
−メチルキサンチンを効率よく生産することが可能にな
る。
生物、植物、植物組織、植物細胞にキサントシンメチル
化酵素活性を付加して、７−メチルキサントシン及び７
−メチルキサンチンを効率よく生産することが可能にな
る。
【００９８】(3) メチルキサンチン類を生合成する植
物、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代
謝を改変して、メチルキサンチン類を効率よく生産する
ことが可能になる。
物、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代
謝を改変して、メチルキサンチン類を効率よく生産する
ことが可能になる。
【００９９】(4) メチルキサンチン類を生合成する植
物、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代
謝を改変して、メチルキサンチン類の生産を抑制又は停
止させることが可能になる。
物、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代
謝を改変して、メチルキサンチン類の生産を抑制又は停
止させることが可能になる。
【図１】 図１はコーヒーノキ及びチャノキにおける主
要なカフェイン生合成経路を示すフローシートである。
右側に各化合物の名称を併記し、左側に各反応を触媒す
る酵素の名称を併記する。SAMはＳ−アデノシル−Ｌ−
メチオニン、SAHはＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイ
ンを意味する。
要なカフェイン生合成経路を示すフローシートである。
右側に各化合物の名称を併記し、左側に各反応を触媒す
る酵素の名称を併記する。SAMはＳ−アデノシル−Ｌ−
メチオニン、SAHはＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイ
ンを意味する。
【図２】 図２はpGEX-MTL３ベクターを模式的に示す図
である。tacプロモーター（Ｐtac）によって制御される
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子(GST)の下
流にCaMTL3 cDNAを連結してpGEX-MTL3を構築した。アン
ピシリン耐性遺伝子（Ampｒ）、ラックリプレッサー遺
伝子（laclｑ）、pBR322複製起点（pBR322ori）、制限
酵素認識部位（Smal及びNotl）を図中に示す。
である。tacプロモーター（Ｐtac）によって制御される
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子(GST)の下
流にCaMTL3 cDNAを連結してpGEX-MTL3を構築した。アン
ピシリン耐性遺伝子（Ampｒ）、ラックリプレッサー遺
伝子（laclｑ）、pBR322複製起点（pBR322ori）、制限
酵素認識部位（Smal及びNotl）を図中に示す。
【図３】 図３は薄層クロマトグラフィーによる酵素反
応生成物の検出を示す。（Ａ）は酵素反応液を展開した
後、オートラジオグラフィーによってメチル基（メチル
−１４Ｃ）が付加された酵素反応生成物のスポットを検
出した状態を示すTLCパネルである。（Ａ）のパネルの
左側には各生成物の位置を示す。（Ｂ）は標品を展開し
た後、紫外光によって標品のスポットを検出した状態を
示すTLCパネルである。（Ａ）と（Ｂ）のパネル間にス
ポットの原点と移動率（Rf値）を示す。ＧＳＴは組換え
タンパク質(GST)、ＭＴＬ３は組換えタンパク質(GST-MT
L3)、ＸＲはキサントシン、７ｍＸＲは７−メチルキサ
ントシン、７ｍＸは７−メチルキサンチン、星印は非特
異的生成物、SAMはＳ−アデノシル−Ｌ−（メチル−
１４Ｃ）メチオニンをそれぞれ意味する。
応生成物の検出を示す。（Ａ）は酵素反応液を展開した
後、オートラジオグラフィーによってメチル基（メチル
−１４Ｃ）が付加された酵素反応生成物のスポットを検
出した状態を示すTLCパネルである。（Ａ）のパネルの
左側には各生成物の位置を示す。（Ｂ）は標品を展開し
た後、紫外光によって標品のスポットを検出した状態を
示すTLCパネルである。（Ａ）と（Ｂ）のパネル間にス
ポットの原点と移動率（Rf値）を示す。ＧＳＴは組換え
タンパク質(GST)、ＭＴＬ３は組換えタンパク質(GST-MT
L3)、ＸＲはキサントシン、７ｍＸＲは７−メチルキサ
ントシン、７ｍＸは７−メチルキサンチン、星印は非特
異的生成物、SAMはＳ−アデノシル−Ｌ−（メチル−
１４Ｃ）メチオニンをそれぞれ意味する。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NARA INSTITUTE of SCIENCE and TECHNOLOGY, HITACHI ZOSEN CORPORATIO
N, KABUSHIKI KAISHA TOYOTA CHUO KENKYUSHO
<120> Xanthosine methyltransferase and its use
<130>
<140>
<141>
<150>
<151>
<160> 3
<170> Microsoft Word
<210> 1
<211> 372
<212> PRT
<300>
<301> Ogawa, M., Herai, Y., Koizumi, N., Kusano, T., and Sano, H.
<302> 7-Methylxanthine Methyltransferase of Coffee Plants.Gene Isolation
and Enzymatic Properties.
<303> Journal of Biological Chemistry
<304> 276
<305> 11
<306> 8213-8218
<307> 2001-03-16
<308> BAB39215
<309> 2000-09-11
<400> 1
Met Glu Leu Gln Glu Val Leu Arg Met Asn Gly Gly Glu Gly 14
Asp Thr Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Asn Gln Leu Val 28
Leu Ala Lys Val Lys Pro Val Leu Glu Gln Cys Val Arg Glu 42
Leu Leu Arg Ala Asn Leu Pro Asn Ile Asn Lys Cys Ile Lys 56
Val Ala Asp Leu Gly Cys Ala Ser Gly Pro Asn Thr Leu Leu 70
Thr Val Arg Asp Ile Val Gln Ser Ile Asp Lys Val Gly Gln 84
Glu Lys Lys Asn Glu Leu Glu Arg Pro Thr Ile Gln Ile Phe 98
Leu Asn Asp Leu Phe Pro Asn Asp Phe Asn Ser Val Phe Lys 112
Leu Leu Pro Ser Phe Tyr Arg Lys Leu Glu Lys Glu Asn Gly 126
Arg Lys Ile Gly Ser Cys Leu Ile Gly Ala Met Pro Gly Ser 140
Phe Tyr Ser Arg Leu Phe Pro Glu Glu Ser Met His Phe Leu 154
His Ser Cys Tyr Cys Leu Gln Trp Leu Ser Gln Val Pro Ser 168
Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Ile Ser Thr Asn Lys Gly Ser 182
Ile Tyr Ser Ser Lys Ala Ser Arg Leu Pro Val Gln Lys Ala 196
Tyr Leu Asp Gln Phe Thr Lys Asp Phe Thr Thr Phe Leu Arg 210
Ile His Ser Glu Glu Leu Phe Ser His Gly Arg Met Leu Leu 224
Thr Cys Ile Cys Lys Gly Val Glu Leu Asp Ala Arg Asn Ala 238
Ile Asp Leu Leu Glu Met Ala Ile Asn Asp Leu Val Val Glu 252
Gly His Leu Glu Glu Glu Lys Leu Asp Ser Phe Asn Leu Pro 266
Val Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Glu Val Lys Cys Ile Val Glu 280
Glu Glu Gly Ser Phe Glu Ile Leu Tyr Leu Glu Thr Phe Lys 294
Val Leu Tyr Asp Ala Gly Phe Ser Ile Asp Asp Glu His Ile 308
Lys Ala Glu Tyr Val Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Tyr Glu 322
Pro Ile Leu Ala Ser His Phe Gly Glu Ala Ile Ile Pro Asp 336
Ile Phe His Arg Phe Ala Lys His Ala Ala Lys Val Leu Pro 350
Leu Gly Lys Gly Phe Tyr Asn Asn Leu Ile Ile Ser Leu Ala 364
Lys Lys Pro Glu Lys Ser Asp Val 372
<210> 2
<211> 1316
<212> DNA
<213> Coffea arabica
<220>
<221> CDS
<222> (45)…(1163)
<300>
<308> AB048793
<309> 2000-09-11
<400> 2
ctttggcagt cccaatttga tttatgtaca agtcctgcat atgaatggag 50
ctccaagaag tcctgcggat gaatggaggc gaaggcgata caagctacgc 100
caagaattca gcctacaatc aactggttct cgccaaggtg aaacctgtcc 150
ttgaacaatg cgtacgggaa ttgttgcggg ccaacttgcc caacatcaac 200
aagtgcatta aagttgcgga tttgggatgc gcttctggac caaacacact 250
tttaacagtt cgggacattg tccaaagtat tgacaaagtt ggccaggaaa 300
agaagaatga attagaacgt cccaccattc agatttttct gaatgatctt 350
ttcccaaatg atttcaattc ggttttcaag ttgctgccaa gcttctaccg 400
caaacttgag aaagaaaatg gacgcaaaat aggatcgtgc ctaatagggg 450
caatgcccgg ctctttctac agcagactct tccccgagga gtccatgcat 500
tttttacact cttgttactg tcttcaatgg ttatctcagg ttcctagcgg 550
tttggtgact gaattgggga tcagtacgaa caaagggagc atttactctt 600
ccaaagcaag tcgtctgccc gtccagaagg catatttgga tcaatttacg 650
aaagatttta ccacatttct aaggattcat tcggaagagt tgttttcaca 700
tggccgaatg ctccttactt gcatttgtaa aggagttgaa ttagacgccc 750
ggaatgccat agacttactt gagatggcaa taaacgactt ggttgttgag 800
ggacatctgg aggaagaaaa attggatagt ttcaatcttc cagtctatat 850
accttcagca gaagaagtaa agtgcatagt tgaggaggaa ggttcttttg 900
aaattttata cctggagact tttaaggtcc tttacgatgc tggcttctct 950
attgacgatg aacatattaa agcagagtat gttgcatctt ccgttagagc 1000
agtttacgaa cccatcctcg caagtcattt tggagaagct attatacctg 1050
acatattcca caggtttgcg aagcatgcag caaaggttct ccccttgggc 1100
aaaggcttct ataataatct tatcatttct ctcgccaaaa agccagagaa 1150
gtcagacgtg taaaagtttg tttttgtgtt ggggaaagga ataagtgccg 1200
ttgggggtct ttcgggtatt gtgcttttta tattatattg ttttgtatcc 1250
gtaataaaag tggtgtgtaa gaataagata tttgacatat attattttca 1300
aaaaaaaaaa aaaaaa 1316
<210> 3
<211> 1316
<212> RNA
<213> Coffea arabica
<220>
<221> CDS
<222> (45)…(1163)
<300>
<308> AB048793
<309> 2000-09-11
<400> 3
cuuuggcagu cccaauuuga uuuauguaca aguccugcau augaauggag 50
cuccaagaag uccugcggau gaauggaggc gaaggcgaua caagcuacgc 100
caagaauuca gccuacaauc aacugguucu cgccaaggug aaaccugucc 150
uugaacaaug cguacgggaa uuguugcggg ccaacuugcc caacaucaac 200
aagugcauua aaguugcgga uuugggaugc gcuucuggac caaacacacu 250
uuuaacaguu cgggacauug uccaaaguau ugacaaaguu ggccaggaaa 300
agaagaauga auuagaacgu cccaccauuc agauuuuucu gaaugaucuu 350
uucccaaaug auuucaauuc gguuuucaag uugcugccaa gcuucuaccg 400
caaacuugag aaagaaaaug gacgcaaaau aggaucgugc cuaauagggg 450
caaugcccgg cucuuucuac agcagacucu uccccgagga guccaugcau 500
uuuuuacacu cuuguuacug ucuucaaugg uuaucucagg uuccuagcgg 550
uuuggugacu gaauugggga ucaguacgaa caaagggagc auuuacucuu 600
ccaaagcaag ucgucugccc guccagaagg cauauuugga ucaauuuacg 650
aaagauuuua ccacauuucu aaggauucau ucggaagagu uguuuucaca 700
uggccgaaug cuccuuacuu gcauuuguaa aggaguugaa uuagacgccc 750
ggaaugccau agacuuacuu gagauggcaa uaaacgacuu gguuguugag 800
ggacaucugg aggaagaaaa auuggauagu uucaaucuuc cagucuauau 850
accuucagca gaagaaguaa agugcauagu ugaggaggaa gguucuuuug 900
aaauuuuaua ccuggagacu uuuaaggucc uuuacgaugc uggcuucucu 950
auugacgaug aacauauuaa agcagaguau guugcaucuu ccguuagagc 1000
aguuuacgaa cccauccucg caagucauuu uggagaagcu auuauaccug 1050
acauauucca cagguuugcg aagcaugcag caaagguucu ccccuugggc 1100
aaaggcuucu auaauaaucu uaucauuucu cucgccaaaa agccagagaa 1150
gucagacgug uaaaaguuug uuuuuguguu ggggaaagga auaagugccg 1200
uugggggucu uucggguauu gugcuuuuua uauuauauug uuuuguaucc 1250
guaauaaaag ugguguguaa gaauaagaua uuugacauau auuauuuuca 1300
aaaaaaaaaa aaaaaa 1316
CaMTL3 cDNAの増幅に用いたCaCS-SmaI(5-AATTCCCGGGATG
GAGCTCCAAGAAGTCC-3)プライマーは45から63番目の塩基
（ATGGAGCTCCAAGAAGTCC）に結合し、CaCS-NotI(5-GCGGC
CGCTTACACGTCTGACTTCTC-3)プライマーは1146から1163番
目の塩基（GAGAAGTCAGACGTGTAA）に結合する。
GAGCTCCAAGAAGTCC-3)プライマーは45から63番目の塩基
（ATGGAGCTCCAAGAAGTCC）に結合し、CaCS-NotI(5-GCGGC
CGCTTACACGTCTGACTTCTC-3)プライマーは1146から1163番
目の塩基（GAGAAGTCAGACGTGTAA）に結合する。
【引用文献】(1) Ashihara,H. and Crozier, A. (2001)
Caffeine: a well known but littlementioned compou
nd in plant science. Trends Plant Sci. 6, 407-413 (2) Ogawa, M., Herai, Y., Koizumi, N., Kusano, T.
and Sano, H. (2001) 7-Methylxanthine methyltransfe
rase of coffee plants. Gene isolation and enzymati
c properties. J. Biol. Chem. 276, 8213-8218
Caffeine: a well known but littlementioned compou
nd in plant science. Trends Plant Sci. 6, 407-413 (2) Ogawa, M., Herai, Y., Koizumi, N., Kusano, T.
and Sano, H. (2001) 7-Methylxanthine methyltransfe
rase of coffee plants. Gene isolation and enzymati
c properties. J. Biol. Chem. 276, 8213-8218
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】
【実施例】本発明を下記の実施例により具体的に説明す
る。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるもので
はない。 (1) 発現ベクターの構築 完全長のコード配列を含む、コーヒーノキ由来のCaMTL3
cDNA(配列番号：２)をPyrobest DNA Polymerase（宝酒
造）を用いてPCR法によって増幅した。プライマーに
は、CaMTL3 cDNA(配列番号：２)の配列をもとに作成し
たCaCS-SmaI(5'-AATTCCCGGGATGGAGCTCCAAGAAGTCC-3')及
びCaCS-NotI(5'-GCGGCCGCTTACACGTCTGACTTCTC-3')を用
いた。鋳型にはコーヒーノキ由来のcDNAライブラリーか
ら単離されたファージミドクローン35(後述の文献(2))
を用いた。増幅したCaMTL3 cDNA断片をベクターpBluesc
ript II KS-(Stratagene社製)のEco RVサイトへ挿入
し、塩基配列決定を行うことによって塩基置換や欠失が
無いことを確認した。ベクターpBluescript II KS-に挿
入されたCaMTL3 cDNA断片を制限酵素Sma I及び制限酵素
NotIで切断し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GS
T)発現ベクターであるpGEX-4T-2(Amersham Bioscience
s)のSma I/Not Iサイトへ挿入した。以上の操作によっ
て、GSTとCaMTL3の融合タンパク質(GST-MTL3)を大腸菌
において発現させるための組換えベクターpGEX-MTL3を
構築した。これを図２に示す。
る。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるもので
はない。 (1) 発現ベクターの構築 完全長のコード配列を含む、コーヒーノキ由来のCaMTL3
cDNA(配列番号：２)をPyrobest DNA Polymerase（宝酒
造）を用いてPCR法によって増幅した。プライマーに
は、CaMTL3 cDNA(配列番号：２)の配列をもとに作成し
たCaCS-SmaI(5'-AATTCCCGGGATGGAGCTCCAAGAAGTCC-3')及
びCaCS-NotI(5'-GCGGCCGCTTACACGTCTGACTTCTC-3')を用
いた。鋳型にはコーヒーノキ由来のcDNAライブラリーか
ら単離されたファージミドクローン35(後述の文献(2))
を用いた。増幅したCaMTL3 cDNA断片をベクターpBluesc
ript II KS-(Stratagene社製)のEco RVサイトへ挿入
し、塩基配列決定を行うことによって塩基置換や欠失が
無いことを確認した。ベクターpBluescript II KS-に挿
入されたCaMTL3 cDNA断片を制限酵素Sma I及び制限酵素
NotIで切断し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GS
T)発現ベクターであるpGEX-4T-2(Amersham Bioscience
s)のSma I/Not Iサイトへ挿入した。以上の操作によっ
て、GSTとCaMTL3の融合タンパク質(GST-MTL3)を大腸菌
において発現させるための組換えベクターpGEX-MTL3を
構築した。これを図２に示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９１】その後、展開溶媒として水/酢酸/n-ブタノ
ール(2:1:4,v/v/v)を用いて1.5時間展開を行った。酵素
反応液を展開した部分に増感剤(En３ Hance;Dupont NE
N)を噴霧し、X線フィルム(BioMax MS;Kodak)を用いてオ
ートラジオグラフィー(−８０℃で３日間の露光)を行
い、レーベル化されたメチル基(メチル-１４C)が付加さ
れた酵素反応生成物のスポットを検出した。標品を展開
した部分に紫外光を照射して標品のスポットを検出し
た。TLCによる解析の結果を図３に示す。
ール(2:1:4,v/v/v)を用いて1.5時間展開を行った。酵素
反応液を展開した部分に増感剤(En３ Hance;Dupont NE
N)を噴霧し、X線フィルム(BioMax MS;Kodak)を用いてオ
ートラジオグラフィー(−８０℃で３日間の露光)を行
い、レーベル化されたメチル基(メチル-１４C)が付加さ
れた酵素反応生成物のスポットを検出した。標品を展開
した部分に紫外光を照射して標品のスポットを検出し
た。TLCによる解析の結果を図３に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９２】図３から分かる様に、組換えタンパク質GS
T-MTL3の精製試料は、メチル基受容体であるキサントシ
ン[XR]の存在下で、メチル基供与体である[SAM]を消費
し、７−メチルキサントシン[7mXR]を生成した。すなわ
ち、この試料は、キサントシン[XR]のメチル化による７
−メチルキサントシン[7mXR]の生成反応を触媒すること
が分かった。
T-MTL3の精製試料は、メチル基受容体であるキサントシ
ン[XR]の存在下で、メチル基供与体である[SAM]を消費
し、７−メチルキサントシン[7mXR]を生成した。すなわ
ち、この試料は、キサントシン[XR]のメチル化による７
−メチルキサントシン[7mXR]の生成反応を触媒すること
が分かった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/38
9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 19/38 5/00 Ｃ
(72)発明者 上藤 洋敬
奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科
学技術大学院大学 先端科学技術研究調査
センター内バイオテクノロジー開発技術研
究組合内
(72)発明者 佐野 浩
奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科
学技術大学院大学 遺伝子教育研究センタ
ー内
(72)発明者 小泉 望
奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科
学技術大学院大学 遺伝子教育研究センタ
ー内
(72)発明者 新名 惇彦
奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科
学技術大学院大学 バイオサイエンス研究
科内
Ｆターム(参考） 2B030 AA03 AB03 CA17 CA19 CB03
CD02 CD07 CD09
4B024 AA01 AA08 BA10 BA79 CA04
DA01 DA05 DA06 DA11 GA11
HA08
4B050 CC01 CC03 DD13 EE10 LL01
LL02 LL05
4B064 AE57 CA02 CA05 CA11 CA19
CA21 CB30 CC24 CD12 DA01
DA10
4B065 AA01X AA26X AA57X AA88X
AA89X AA89Y AB01 AC14
BA01 CA16 CA29 CA41 CA44
CA53
Claims (24)
- 【請求項１】 下記の塩基配列(a)(b)のいずれかを有す
るDNA分子。 (a)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有し、
プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する
酵素活性を有するポリペプチドであるキサントシンメチ
ル化酵素をコードする塩基配列、(b)上記塩基配列(a)
に、該塩基配列(a)がコードするポリペプチドが上記酵
素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、欠失又は挿
入を行って得られた変異塩基配列。 - 【請求項２】 上記塩基配列(a)及び上記変異塩基配列
(b)がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものである請求項１に記載のDNA分子。 - 【請求項３】 上記塩基配列(a)が、配列表の配列番
号：２の塩基配列からなる請求項１又は２に記載のDNA
分子。 - 【請求項４】 下記の塩基配列(a)(b)のいずれかを有す
るRNA分子。 (a)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有し、
プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する
酵素活性を有するポリペプチドであるキサントシンメチ
ル化酵素をコードする塩基配列、(b)上記塩基配列(a)
に、該塩基配列(a)がコードするポリペプチドが上記酵
素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、欠失又は挿
入を行って得られた変異塩基配列。 - 【請求項５】 上記塩基配列(a)及び上記変異塩基配列
(b)がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものである請求項４に記載のRNA分子。 - 【請求項６】 上記塩基配列(a)が、配列表の配列番
号：３の塩基配列からなる請求項４又は５に記載のRNA
分子。 - 【請求項７】 請求項１〜３のいずれかに記載のDNA分
子の有する塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配
列であって、上記酵素活性を有する植物細胞に導入され
て発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得
るDNA分子。 - 【請求項８】 請求項４〜６のいずれかに記載のRNA分
子の有する塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配
列であって、上記酵素活性を有する植物細胞に導入され
て発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得
るRNA分子。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに記載のDNA分
子又はRNA分子を含むベクター。 - 【請求項１０】 微生物及び植物の少なくとも一方の細
胞内で、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を
触媒する酵素活性を有するキサントシンメチル化酵素を
発現させることができるか、もしくは該キサントシンメ
チル化酵素の発現を阻害する機能を有する請求項９に記
載のベクター。 - 【請求項１１】 請求項９又は１０に記載のベクターで
形質転換された微生物、植物体、植物組織又は植物細
胞。 - 【請求項１２】 請求項９又は１０に記載のベクター
が、感染により導入された請求項１５に記載の微生物、
植物体、植物組織又は植物細胞。 - 【請求項１３】 請求項１１又は１２に記載の微生物、
植物体、植物組織又は植物細胞を用いて、キサントシン
メチル化酵素の粗抽出物を製造する、又は更にその精製
品を製造する方法。 - 【請求項１４】 請求項１１又は１２に記載の微生物、
植物組織又は植物細胞を培養するか、植物体を栽培し
て、キサントシンメチル化酵素の粗抽出物を製造する、
又は更にその精製品を製造する方法。 - 【請求項１５】 請求項１１又は１２に記載の微生物、
植物体、植物組織又は植物細胞を用いて７−メチルキサ
ントシン又は７−メチルキサンチンを製造する方法。 - 【請求項１６】 請求項１１又は１２に記載の微生物、
植物組織又は植物細胞を培養するか、植物体を栽培し
て、７−メチルキサントシン又は７−メチルキサンチン
を製造する方法。 - 【請求項１７】 請求項１１又は１２に記載の微生物、
植物体、植物組織又は植物細胞を用いてメチルキサンチ
ン類の組成を改変する方法。 - 【請求項１８】 請求項１１又は１２に記載の微生物、
植物組織又は植物細胞を培養するか、植物体を栽培し
て、メチルキサンチン類の組成を改変する方法。 - 【請求項１９】 メチルキサンチン類が、７−メチルキ
サントシン、７−メチルキサンチン、パラキサンチン、
テオブロミン及びカフェインからなる群から選ばれる少
なくとも１つの化合物である請求項１７又は１８に記載
の方法。 - 【請求項２０】 上記形質変換体が、コーヒーノキ（Co
ffea）属植物、ツバキ（Camellia）属植物、コラノキ
（Cola）属植物、モチノキ（Ilex）属植物、ネエア（Ne
ea）属植物、アオギリ（Firmiana）属植物、ポーリニア
（Paullinia ）属植物又はカカオノキ（Theobroma ）属
植物である請求項１７又は１８に記載の方法。 - 【請求項２１】 下記のアミノ酸配列(a)(b)のいずれか
を有するタンパク質からなり、かつ、プリン環の７位で
のキサントシンのメチル化を触媒する酵素活性を有する
キサントシンメチル化酵素。 (a)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列、 (b)配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列に、上記
酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置換、挿入
又は欠失を行って得られた変異アミノ酸配列。 - 【請求項２２】 上記アミノ酸配列(a)をコードする塩
基配列及び上記変異アミノ酸配列(b)をコードする塩基
配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得
るものである請求項２１に記載のキサントシンメチル化
酵素。 - 【請求項２３】 請求項２１又は２２に記載のキサント
シンメチル化酵素、もしくは請求項１３又は１４に記載
の方法で得られたキサントシンメチル化酵素の精製品
と、キサントシンと、Ｓ−アデノシルメチオニンとを含
む混合液をインキュベーションして、７−メチルキサン
トシンを生成させる、７−メチルキサントシンの製造
法。 - 【請求項２４】 請求項１３又は１４に記載の方法で得
られたキサントシンメチル化酵素の粗抽出物と、キサン
トシンと、Ｓ−アデノシルメチオニンとを含む混合液を
インキュベーションして、７−メチルキサンチンを生成
させる、７−メチルキサンチンの製造法。
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| JP2002088770A JP2003274973A (ja) | 2002-03-27 | 2002-03-27 | キサントシンメチル化酵素およびその用途 |
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| JP2002088770A JP2003274973A (ja) | 2002-03-27 | 2002-03-27 | キサントシンメチル化酵素およびその用途 |
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