KR20060013380A - 조직특이적 프로모터 - Google Patents

Abstract

목본의 목부 조직에서 차별적으로 발현되는 조직 특이적 프로모터(서열번호1 5)가 개시되어 있다. 이들 프로모터들은 예컨대, 식물에서 목부 성질을 바꾸거나 목부 조직에서 발현되는 유전자 발현을 특이적으로 조절하기 위해서 사용된다. 이들 프로모터들을 이용하여 변형된 목부 성질을 보이는 트랜스제닉 식물을 만들 수 있다.

Description

조직특이적 프로모터{Tissue Specific Promoters}

본 발명은 유전자 기술 분야에 관한 것으로, 보다 상세히 식물, 구체적으로 목본 형성층대의 목부(xylem) 발생 동안 유전자 발현을 구동하는 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 그러한 프로모터와 이의 실제적 용도를 가능케 한다.

식물에서 목부 형성은 발생학적으로 중요한 과정으로서 경제적 가치가 있는 섬유 생산에 있어서 또한 매우 중요하다. 나무에서 목질(wood) 형성은 경제적으로 지극히 중요한 이 과정의 예이다. 이는 초기 세포 분열로부터 시작하여 세포 팽창과 세포 자연사(apoptosis) 구역으로 종결되는 이차벽 형성을 통한 일련의 규정된 발생 현상의 결과이다. 목질부는 세포 원형질체의 자가소화(autolysis)로 종결되는 말단 분화를 겪는 측방분열조직인 유관속형성층으로부터 생성된다.

본 발명 연구에서 발명자들은 잘 확립된 다년생 목본 모델인 포플러를 이용하였다. 이는 빈번히 이용되는 또 다른 모델인 애기장대(Arabidopsis)보다 약 다섯 배 밖에 크지 않은 작은 게놈을 가지고 있다. 더 나아가, 포플러는 정방향 유전학(forward genetics)에서 광범위하게 사용되는 종이기도 하다. 포플러와 애기장대는 종족유전학적으로 밀접하게 관련되어 있으며, 애기장대 게놈의 완전한 서열과 더불어 십만 개 이상의 포플러 ESTs에 접근할 수 있기 때문에 목부 분화 연구에 있어서 이들 두 모델의 조합은 이상적이다.

유전자가 언제 어디서 활성인지는 이의 기능을 위해 중요하다. 조절의 한 단계는 전사 개시에서의 제어이다. 유전자의 전사 발현은 코딩 유전자의 업스트림(5')에 주로 위치해 있는(절대적이진 않다) 시스-활성(cis-acting) DNA 요소에 의해 제어된다. 육종 및 생산물 개발시 도구로써 유전자 기술과 GMOs(유전자 변형 유기체)를 사용할 때 두 가지의 기본 부분이 있다: 원하는 효과를 주는 유전자와 유전자 산물이 언제 어디서 얼마만큼 발현될지 결정하는 시스-활성 DNA 조절 서열. 조절은 또한 전사물의 안정도, 전사 개시 및 진행, 단백질 활성 등과 같은 단계에서도 일어난다. 상이한 특정 목부 형성 단계들 동안 유전자 발현을 구동하는 프로모터를 갖는 유전자들이 있다. 이들 프로모터들은 목부 성질을 유전학적으로 변형시키고 생성된 목부의 함량을 바꿀 때 특이적으로 유전자에 영향을 끼친다는 점에서 중요할 것이다. 이용가능한 프로모터의 수는 제한적으로서, 이는 새로운 프로모터가 목부 형성 연구와 조작에서 유전자 발현의 조율과 미세조율시 상당한 중요성을 갖게 됨을 의미한다.

고등한 종에서 세포 발생 동안 특정 과정의 변형은 나무의 성질을 개선하는 것에 관해서뿐만이 아니라 상업적 용도를 갖는 섬유를 가진 다른 식물에서도 상당한 상업적 관심을 갖는다. 그러한 변형을 위한 프로모터와 같은 새로운 도구가 필요하다.

Fredrik Sterky et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 (95), 13330-13335) 및 Magnus Hertzberg et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 (98) 14732-14737)는Populus tremula L. x tremuloides Michx. 및 Populus trichocarpa 'Trichobel'의 목질 형성 조직으로부터 5,629개의 ESTs를 포함하여 두 개의 포플러 종에서 대단위 유전자 발견 프로그램의 결과를 내놓았다. 이들 ESTs는 두 개의 cDNA 라이브러리에 대한 총 3,719개의 특유 전사물로서, 이들 전사물들 중 2,245개에 잠정적인 기능이 배당될 수 있었다. 저자들은 제시된 EST 데이터가 식물에서 이차 목부 및 사부(phloem) 형성시 관여된 유전자들을 동정함에 있어서 가치 있을 것이라고 서술하고 있으나, 어떻게 동정이 수행될 수 있는지에 대해서는 명확히 제시해주고 있지 않다.

다른 종래기술(Hertzberg et al.)로는 2995개의 ESTs의 포플러 유니젠(unigene) 세트의 cDNA 마이크로어레이를 사용하여 목부형성(xylogenesis)의 규정된 단계에서 cDNA 전사물을 프로파일화하였다.

그러나, Sterky et al., 및 Hertzberg et al.에 의해 발간된 정보의 실질적 사용을 가능케 하기 위해서는 새로운 접근법이 필요하다.

미국특허공개공보 U.S. 2002138870 A1는 바뀐 농업형질을 보이는 다양한 트랜스제닉 식물을 생산하기 위하여 4CL, Cald5H, AldOMT, SAD 및 CAD 유전자들과 이들의 조합을 비롯하여 페닐프로파노이드 경로로부터의 다중 유전자로 식물을 동시에 전환하는 방법에 대해 다루고 있다. 식물의 농업형질은 식물 게놈 내로 혼입된 특정 유전자들과 선택된 유전자들의 조합의 방향성에 의해서 조절된다. 이 미국특 허공보 U.S. 2002138870는 목부 발생시 트랜스유전자의 발현을 한정시킬 수 있는 것과 같이 조직 특이적 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다고 언급하고 있다.

여전히 새롭고 유용한 프로모터를 동정하는 것은 과제로 남아있다. 남아있는 하나의 특정 과제는 어떻게 잠정적으로 가장 중요한 유전자들과 이에 상응하는 프로모터를 동정하며 이들을 세포의 특정 발생 성질과 관련시키는 것이다. 또 하나의 과제는 모든 연관된 시스-활성 전사 제어 요소들을 클로닝하여 클로닝된 DNA단편들이 원하는 특정 발현 패턴으로 전사를 구동시키도록 하는 것이다.

특정 과제는 다른 식물 조직에서는 발현되지 않고 특정 식물에서 특정 세포 유형과 발생 단계 내지 기능과 관련된 특이적 프로모터를 동정하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 5; 서열번호 1 내지 5와 기능적으로 상동인 서열 및 서열번호 1 내지 5에 90% 이상의 상동성을 보이는 서열 중에서 선택되는, 식물 목부 형성 조직에서 특이적으로 발현되는 프로모터 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열을 이용가능케 함으로써 위에서 언급된 과제에 대한 해결책을 제공한다.

서열들은 도면 및 규정된 소프트웨어(PatentIn 3.1)를 사용하여 제작된 첨부서열목록에 제시되어 있다.

나아가, 본 발명은 트랜스제닉 식물과 이의 생산 방법 및 이러한 식물의 종자 및 묘목뿐만 아니라 첨부된 특허청구범위에 규정된 바와 같이 식물 목부에서 특정 유전자를 발현하는 방법 및 핵산 작제물을 이용가능케 한다.

본 발명은 하기의 설명, 실시예 및 도면에서 보다 상세히 기술될 것이다.

본 설명에서, 목부 형성 조직에서의 "목부(xylem)"라는 용어는 식물의 대부분의 수분과 미네랄을 운반하는 모든 관속 조직을 망라하도록 의도된다. 목부의 주요 도관 세포들은 가도관 및 도관 요소 또는 도관 요소이다. 이 둘은 이차벽을 가지며 성숙시 원형질체를 결여하고 있는 가늘고 긴 세포들이다. 목부 조직은 다양한 물질을 저장하는 대상유조직 세포들도 포함한다.

"유관속형성층(vascular cambium)"이라는 용어는 유관속분열조직 모세포들을 망라하며 이의 분열은 이차목부 및 이차사부를 생산한다.

"목질(wood)" 또는 "목질 형성 세포(wood forming cells)"라는 용어는 대사작용과 공정이 유관속분열조직의 발생에 관여하는 모든 세포들과 이의 최종 산물 모두를 망라한다. "나무(wood)"라는 용어는 물론, 일반적 의미로서 연질나무 및 경질 나무를 망라하도록 쓰인다.

"목질 형성 성질(wood formation properties)"이라는 용어는 생물학적, 화학적 및 생리학적 성질을 망라하며 예컨대, 세포 신장, 세포 팽창, 세포자연사, 탄수화물 대사, 섬유 길이, 섬유 두께, 및 다른 섬유 성질이 있으나, 이에 국한되지는 않는다.

"상동성(homology)"은 본원에서 서열간의 유사성의 척도로서 사용되며, 두 서열간의 서열 상동성이 높을수록 하이브리드화가 잘 일어난다. 하이브리드 형성은 당업자가 공지의 절차를 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명에서는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 보다 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 망라한다.

"기능적으로 상동(functionally homologous)"은 개시된 서열과 보다 낮은 구조적 상동성을 가질 수 있으나, 건강하거나 또는 병든 유기체의 생체내에서(in vivo) 상동적 기능, 예컨대 유사한 세포 기능을 갖는 동일하거나 또는 고도로 유사한 단백질을 코딩하는 것과 같은 기능을 보이는 것을 말한다. 본 발명은 개시된 서열에 기능적으로 상동인 서열을 망라한다.

본 설명의 맥락에서 "상보적(complementary)"은 두 개의 뉴클레오타이드 간에 정교한 짝짓기 능력을 말한다.

나아가, 본 발명의 맥락에서, "하이브리드화(hybridization)"는 왓슨-크릭, 후그스틴(Hoogsteem) 또는 역 후그스틴 수소 결합일 수 있는, 상보적인 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 염기간의 수소 결합을 말한다. 즉 상보성과 하이브리드화는 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA 표적간에 안정하고 특이적인 결합이 일어나기에 충분한 정도의 상보성 또는 정교한 짝짓기를 나타내기 위해서 사용되는 용어들이다.

안티센스 화합물은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 결합시 표적 DNA 또는 RNA의 정상 기능을 간섭하여 유용성의 상실을 초래할 때 특이적으로 하이브리드가능하며, 특이적 결합이 요망되는 조건 하에서 비-특이적 표적 서열에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다.

"엄격한 조건하에서 하이브리드화(hybridisation under stringent conditions)"란 문구는 당업자에게 잘 알려진 온도 및 완충액에 대한 척도를 말한다. 예컨대, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA (1989) 참조.

"기능적으로 삽입(Functionally inserted)" 또는 "작동가능케 삽입(operationally inserted)"은 서열이 숙주 게놈 내로 서열의 정확한 발현이 일어나도록 하는 방향성과 위치로, 적용되는 경우 프로모터와 함께 삽입된 것을 의미한다.

본 맥락에서 사용된 "변조(modulation)"는 유전자 발현에 있어서의 증가(자극) 또는 감소(억제)를 의미한다. 본 발명의 맥락에서 증가는 유전자 발현의 바람직한 변조 형태이고 mRNA가 바람직한 표적이다.

발생 단계에 특이적으로 발현되는 유전자의 선택은 목부 형성 조직 내에서 특정 세포에 유전자 발현을 지시하는 프로모터들을 동정하기 위해서 사용되었다. 클로닝과 분석시 이들 프로모터들은 조직 특이적인 것으로 보여졌다. 이들 프로모터들을 보유함으로써 목부 발생의 특정 단계에 관심이 있는 임의 유전자의 발현을 구동시키거나 목부(목질부)의 생산 및 성질에 영향을 끼칠 수 있게 되었다. 발현을 바꾸는 방법은 관심있는 유전자의 과다발현(ectopic) 및 과-발현(over-expression), 안티센스 조절, RNA 간섭, 유전자 침묵, 리보자임의 사용 등을 포함한다.

라이브러리는 목부 형성 조직 내 부분으로부터 창출되었는데, 세포 분열(A), 세포 팽창(ABC); 이차 세포벽 형성 (CDE); 세포 자연사(E)를 대표한다. 도2 참조.

조직 샘플들은 줄기의 형성층대로부터 탄젠트방향으로 단면을 취함으로써 준비되었다. 가로축 수-단면은 나중에 각 샘플의 조직 함량과 정확한 위치의 동정을 허용하도록 평행하게 수집되었다. 개별 단면들은 대략 0.5mg의 생체중에 상응하도록 30㎛ x 2mm x 20mm로 측정되었다. 단면들은 도2에 나타낸 바와 같이 상이한 발생 구역으로 함께 수집되었다. 상이한 구역의 단면은 세포의 해부학적 특징 및 방사상 직경에 기초하고 있었다. 이들 구역 내에서 유전자 프로파일은 고도의 조직 특이성을 보여주었다.

본 발명은 유전자 프로모터와 이의 사용을 개시하며, 이 프로모터는 cDNA마이크로어레이 분석의 동정을 통해 규명되었으며, 많은 개수의 서열들로부터 선택되었으며, 프로그래밍된 세포 죽음 또는 세포자연사로 들어가는 세포로 종결하는 성숙 목부 요소를 통해 형성층 내 미분화 분열조직에서 발견된다.

본 발명은 식물 목부 형성 조직에서 특이적으로 발현되는 프로모터 서열을 포함하는, 서열번호 1 내지 5; 서열번호 1 내지 5 중의 하나를 포함하는 서열 서열번호 1 내지 5에 기능적으로 상동인 서열 또는 서열번호 1 내지 5 중의 하나에 90% 이상의 상동성을 보이는 서열, 바람직하게는 91%, 보다 바람직하게는 92%, 보다 바람직하게는 93%, 보다 바람직하게는 94%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 96%, 보다 바람직하게는 97%, 보다 바람직하게는 98%, 가장 바람직하게는 99% 상동성을 보이는 서열 중에서 선택되는 단리된 핵산 서열을 이용가능케 한다.

위의 정의들은 서로들을 배제하지 않고 함께 작용할 수 있다. 예컨대, 80% 상동성 또는 70% 상동성과 같은 낮은 상동성을 보이지만 이들 서열에 기능적으로 등가물인 서열은 이 정의에 포함된다. 본 발명은 이들 서열 중 하나 이상에 엄격한 조건 하에서 하이브리드할 수 있는 서열도 망라한다.

본 발명의 일면은 프로모터 서열이 고등 식물에서 발현되는, 위에서 정의된 바와 같은 핵산 서열이다. 바람직하게 식물은 쌍자엽 목본이다. 그러한 식물로서 경질나무종인 포플러, 사시나무, 자작나무, 버드나무, 유칼립투스, 풍나무(리큐담버) 등과 연질나무종(침엽수) 가문비나무, 잎갈나무, 솔송나무, 소나무 등이 있으나 이에 국한되지는 않는다. 관심있는 다른 식물로는 소위 섬유식물 예컨대, 면, 삼베, 사이잘, 아마 등이 있으나 이에 국한되지는 않는다. 프로모터는 경제적으로 의미가 있는 식물들 가령, 밀, 옥수수, 감자 및 채종유 등에서도 관속 발생 도중 유전자 발현을 구동시키기 위해서 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 야생형과 비교시 변형된 성질, 예컨대, 야생형과 비교시 변형된 목질 형성 성질, 변형된 세포자연사 성질, 바뀐 뿌리 성질, 바뀐 개화 또는 잎 패턴 등을 보이는, 본원 서열들 중 하나 이상이 그 내로 기능적으로 삽입된 트랜스제닉 식물을 이용가능하게 만든다.

트랜스제닉 식물은 바람직하게 목본, 가장 바람직하게는 쌍자엽 목본이다. 그러한 트랜스제닉 식물로서 경질나무종인 포플러, 사시나무, 자작나무, 버드나무, 유칼립투스, 풍나무(리큐담버) 등과 연질 나무종(침엽수) 가문비나무, 잎갈나무, 솔송나무, 소나무 등이 있으나 이에 국한되지는 않는다. 관심있는 다른 식물로는 소위 섬유식물 예컨대, 면, 삼베, 사이잘, 아마 등이 있으나 이에 국한되지는 않는다. 프로모터는 경제적으로 의미가 있는 식물들 가령, 밀, 옥수수, 감자 및 채종유 등에서도 관속 발생 도중 유전자 발현을 구동시키기 위해서 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 식물의 특정 구역, 바람직하게는 식물의 목부에서 특정 유전자를 발현하는 방법을 이용가능하게 하는데 여기에서 본원 서열들 중의 하나 이상이 식물 내로 기능적으로 삽입되어 이용된다. 결과적으로 본 발명은 식물, 특히 목본에서 목부 형성 조직 발생을 조절하는 것을 가능케 하며, 여기에서 위에서 정의된 바와 같은 프로모터가 사용된다.

본 발명은 또한 게놈 내에 본원 서열을 운반하는 본 발명의 식물의 번식 산물, 예컨대, 종자, 과일, 원형질체, 식물 세포, 칼리 또는 뿌리와 같은 식물의 잘려진 부분 및 일부도 망라한다.

중간체도 또한 본 발명에 의해 망라되는데, 이는 위에서 정의한 바와 같은 서열을 포함하는 핵산 작제물이다. 그러한 작제물은 바람직하게 플라즈미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지를 포함한다.

본 발명은 야생형과 비교시 변형된 목질 형성 및/또는 세포자연사 성질을 보이는, 위에서 정의한 바와 같은 프로모터가 식물 내로 기능적으로 삽입된 트랜스제닉 식물의 생산 방법도 포함한다.

당업자들은 재조합 유전자 발현을 위해 벡터를 작제하고 프로토콜을 디자인할 수 있을 것이다.

프로모터 서열, 해독 리더 서열, 종결 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 이펙터 유전자, 표적 유전자 및 적절한 다른 서열 등을 포함하여 적절한 조절 서열을 함유하는 적당한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 보다 상세한 논의를 위해서는 예컨대, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2^ndedition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참고하기 바란다.

핵산 조작을 위한 알려진 많은 기술과 프로토콜들, 예컨대, 핵산 작제물, 돌연변이화, 서열화, DNA의 세포내 도입 및 유전자 발현 및 단백질 분석은 Ausabel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2^ndedition, John Wiley Sons, 1992에 상세하게 기술되어 있다.

항생제에 내성을 보이는 것과 같이 선별가능한 표현형을 제공하는 키메라 유전자로 구성된 선별가능한 유전 마커도 사용될 수 있다. 이러한 선별가능한 마커로는 카나마이신, 하이그로마이신, 포스포이노트리신, 클로로설프론, 메토트렉세이트, 젠타마이신, 스펙티노마이신, 이미다졸리논, d-아미노산 및 글리포세이트가 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자 및 벡터는 자연 환경으로부터 단리되거나 정제되어 실질적으로 순수하거나 균질한 형태 또는 요망되는 기능을 갖는 프로모터를 코딩하는 서열 외에 다른 기원 또는 관심있는 종의 핵산 또는 유전자가 없는 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 게놈 DNA를 포함할 수 있으며 전부 또는 일부가 합성일 수 있다. "단리되다(isolate)"라는 용어는 이들 모든 가능성을 망라한다.

서열 번호 1 내지 5의 하나 이상, 이들 서열 중 하나에 기능적으로 상동인 서열, 또는 이들 서열 중 하나에 90% 이상의 상동성을 보이는 서열을 포함하는 이들 DNA 절편으로 형질전환된 식물들은 식물 유전조작을 위해 이미 공지된 표준화된 기술에 의해 생산될 수 있다. DNA는 식물 세포 내로 임의 적당한 기술, 예컨대, 자연적 유전자 전달 능력을 보이는 아그로박테리아에 의해 운반되는 무력화된 Ti-플라즈미드 벡터, 입자 또는 마이크로프로젝타일 충격(microprojectile bombardment), 미세주입, 전기천공, 다른 형태의 DNA 직섭취, 리포좀 매개 DNA 섭취와 같은 기술을 사용하여 형질전환될 수 있다. 식물세포의 물리적 형질전환 방법은Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11에 수록되어 있다.

형질전환 후, 식물은 예컨대 업계에 표준화된 바와 같이 단일 세포, 칼러스 조직, 잎 디스크와 같은 것으로부터 재생될 수 있다. 거의 임의의 식물이 식물의 세포, 조직, 기관으로부터 완전히 재생될 수 있다. 이용가능한 기술은 Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II, and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984; Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; 또는Clapham et al., Gene Transfer by particle bombardment and Embryonic cultures of Picea abies and the production of transgenic plantlets에 나와 있다. Scandinavian Journal of Forest research 15 (2000) 151-160.

어떤 특정 형질전환 기술을 선택할지는 특정 식물 종을 형질전환시키는 기술의 효율과 본 발명을 실행하는 기술자의 선택한 특정 방법론에 대한 경험과 선호도에 의해 결정될 것이다. 핵산을 식물 세포 내로 도입하기 위해 특정 형질전환 시스템의 선택 또는 식물 재생 기술 내지 형질전환된 식물의 후-조작을 선택되는 기술의 선택이 본 발명에 필수적이거나 제한을 주지 않는다는 것이 당업자들에게는 명백할 것이다.

도 1은 게놈워크단편으로부터의 컨센서스 서열을 보여준다. 서열번호 1 내지 5의 서열에 상응하는1a) LMX2 A014P10U; 1b) LMX3 A044P26U; 1c) LMX4 A050P49U; 1d) LMX5 A055P19U; 1e) LMP1 A001P79U.

밑줄친 서열 = 프로모터 서열(GUS 작제물의 일부)

이탤릭체 서열 = EST로부터의 서열

ATG (진하게) = 잠재적 해독 개시 코돈

도2는 톨루이딘 블루로 염색된 하이브리드 사시나무 줄기의 단면을 보여준다. 이 샘플 위치들은 단면 아래에 검정색 막대기로 표시되어 있다.

도3은 클로닝된 프로모터로부터의 5개의 EST에 대한 발현 패턴을 보여준다. 이는 각각의 프로모터에 의해 야기된 주요 발현과 일치한다.

도 4는 상이한 식물 조직에서 선택된 유전자의 발현 수준에 대한 노던 블롯 분석 결과를 보여준다.

1번선: 정아: 약 1 cm의 상부 신초 팁.

2번선: 잎정맥: 주요 정맥들은 오래된 잎으로부터 수집되었다.

3번선: 신장줄기: 정아 아래에서 8개 줄기 마디까지의 절간. 모든 잎들과 싹들은 제거되었다.

4번선: 오래된 나뭇잎 크기에서 15 cm이상의 건강한 나뭇잎. 잎자루와 주요 정맥들은 제거되었다.

5번선: 사부: 15 cm줄기조각이 수집되었다. 이들은 목부 및 수피의 내부면을 스크래핑함으로써 사부와 목부 준비를 위해 사용되었다.

6번선: 뿌리: 뿌리털이 없는 뿌리 팁의 2-3 cm정점 부분.

7번선: 어린 잎: 크기에서 12 cm 미만의 나뭇잎. 잎자루와 주요 정맥들은 제거되었다.

8번선: 목부: 줄기 조각에 대해 수집된 조직(5번선 참조), 스크래핑된 목질부면.

1. 실험 시스템

목부 발생은 애기장대 및 백일초(Zinnia)를 포함하여 몇 개의 시스템에서 연구되어온 특별화된 형태의 식물 발생이다. 그러나 생체내 연구를 위하여 포플러 시스템은, 규정된 발생 단계에서 특정 조직의 정교하고 정확한 샘플수집을 허용하는 포플러 줄기의 고도로 조직화된 구조 때문에 우수하다.

이차 목부는 고도로 조직화되어 있고 상이한 세포주의 발생은 공간에서 엄격 하게 조화되어 있다. 본 발명은 동결절단기(cryotom)을 사용하여 형성층대로부터 규정된 발생 단계에서 상이한 조직들을 분리시켜 약 0.5mg 생체중을 지닌 30㎛ 단편들을 탄젠트 방향으로 동결절단(cryosectioning)하여 의해 생산하였다. 이 해부 기술은 도2에 도시된 바와 같이 특정 분화 단계에서 고도로 풍부한 세포를 갖는 샘플을 제공한다. 다섯 개의 샘플이 목질 형성의 개체발생(ontogeny)을 망라하도록 수집되었다: A) 분열 조직, B) 초기 팽창, C) 후기 팽창, D) 초기 이차 세포벽 형성 및 E) 후 세포 성숙 단계.

다른 분열조직과 같이 유관속형성층의 주기능(도2, 구역A)은 세포 분열 및 분화를 위해 패턴을 개시하는 것이다. 그러나 정단분열조직과 달리 유관속형성층은 두 개의 형태학적으로 뚜렷한 시원세포를 함유한다 축으로 길다란 추형 시원세포와 등축 방사 시원세포. 두 형태의 시원세포는 사부와 목부 요소의 방사상 세포주를 만들기 위해서 병층적으로 분열한다. 추형 시원세포로부터의 유도체는 축 세포 시스템을 만든다. 포플러와 같은 피자식물의 목질에서 이것은 두 개의 주요 세포 형태, 즉, 물 수송 기능을 수행하는 도관 요소 및 줄기의 기계적 지지 역할을 하는 섬유질로 구성되어 있다. 방사 시원세포는 체관 수액에 공급된 미네랄과 체관 수액에 공급된 탄수화물의 측면 수송에서 주역할을 수행하는 수평 방향의 방사상 세포를 제공한다. 줄기가 직경에서 증가함에 따라, 더 많은 시원세포가 필요하다. 추형 시원세포는 위장축(psedotransverse) 수층분열에 의해 형성되며, 상기 분열은 딸세포의 축소를 가져온다. 따라서 추형 시원세포는 형성층 분열조직에서 분열과 신장을 모두 한다.

세포 팽창대에서, 형성층 유도체는 세포 유형에 따라 상이한 극성을 지닌 채 커진다 (도2, 구역 B 및 C). 발달하는 섬유질은 방사상으로 팽창하고 팁 성장에 의해 길이가 증가하는데 도관은 방사상으로만 팽창한다. 도관 팽창은 빠르고 섬유질 팽창보다 훨씬 더 광범위하여 이들 세포들에게 이들의 형태학적 특징을 제공한다. 도관 분화는 또한 동시에 진행되는 섬유질 및 수선의 발달보다 훨씬 더 빠른 속도로 진행된다. 도관은 구역 C에 이에 따라 이미 형성된 이차 세포벽을 가지며 구역 E에서는 성숙과정을 마친다. 분열과 팽창 단계 동안(구역 A, B, 및 C), 포플러에서 주로 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈 및 펙틴으로 구성된 일차벽의 계속적인 생합성을 위한 요구가 있다. 도관과 접촉하고 있는 섬유질 요소와 방사 세포들(접촉 방사조직)은 도관과 접촉하지 않는 섬유질과 방사 세포들(단리 방사조직)보다 약간 더 빨리 분화한다. 따라서, 구역 C는 일차와 일차 + 이차 세포벽을 갖는 세포 형태의 혼합물을 포함한다.

세포 팽창이 완료되자마자, 이차세포벽은 모든 목부 세포 (구역 D)에 침적된다. 이 발생단계의 특징중의 하나는 일차세포벽에 존재하는 셀룰로오즈 미세피브릴의 무작위 조직이 이차세포벽에서 고도로 조직화된 나선형 구조로 변한다는 것이다. 이차세포벽의 셀룰로오즈 및 헤미셀룰로오즈 구조물은 셀룰로오즈 미세피브릴 방향성의 정도로부터 인식될 수 있는 수개의 층의 세포벽(S1, S2, S3)에 축적된다. 이차 세포벽 두께화의 마지막 단계에서 셀룰로오즈 및 헤미셀룰로오즈 구조물 내 간극은 세포 모서리에서부터 시작하여 안으로 전진하면서 리그닌화된다. 이차세포벽 형성 동안 목부 요소는 또한 도관/도관 및 도관/방사조직 접촉을 허용하는 홈 및 구멍의 네트워크를 형성하며 광범위하게 조각된다. 이러한 활동은 일차세포벽의 패턴화된 파괴를 수반한다. 성숙화 과정의 말기(구역 E)에 섬유질은 프로그래밍된 세포 괴사에 들어간다 (구역 C 및 D에서 도관은 더 일찍 프로그래밍된 세포 괴사에 들어간다). 반대로, 방사조직 세포들은 주변을 둘러싼 세포들의 리그닌화에 계속 기여하면서 수해 동안 수액나무에서 살아있는 채 남아있다.

2. 프로모터 클로닝 및 서열화

본 발명은 조직 특이적 전사물 프로파일화를 수행함으로써 조직 특이적 유전자 프로모터를 동정하는 과제에 이르렀다. 동결절단(cryo-sectioning)에 의해 특정 유형의 세포가 고도로 풍부한 샘플을 얻는 것이 가능하였다. 동결절단 기술과 관련하여 조직의 유기적인 특징은 특정 세포 유형이 고도로 풍부한 샘플을 제공하고 이리하여 조직 특이적 전사물 프로파일화를 가능케하였다.

본 발명자들은 하이브리드 사시나무(Populus tremula x tremuloides)에서 다섯 개의 유전자의 5'방향 업스트림 서열을 클로닝하였다. 이들 유전자들은 cDNA 마이크로어레이 분석에 기초시 목부(목질) 형성의 특정 단계 동안 모두 발현되었다(Hertzberg et al., 2001 PNAS). 수많은 선별 기준이 원하는 결과를 보증하기 위해서 마련되었다. 선별 기준은 하기를 포함한다: EST는 EST가 전장 오픈리딩프레임(ORF)을 포함함으로써 아마도 완전한 전사물을 함유한다는 것을 지시하는 애기장대 프로테옴의BLASTX 히트를 가져야 했고 EST는 관심있는 영역에서 분명한 차별적인 발현을 보였던 cDNA 마이크로어레이 데이터에 기초한 발현 패턴을 가져야 하였으며 또한 EST의 발현을 구동하는 프로모터가 강하다는 것을 제시하는 강한 하이브리드 화 신호를 가졌다.

다섯 개의 유전자I - V는 하기 표1에 주어진 EST에 의해 표현된다. 표에서 클로닝된 프로모터 단편을 위해 사용된 명칭과 프로모터가 우세하게 활성인 구역 역시 나타냈다.

진뱅크 EST nr	내부 EST nr:	하기 구역에서 발현됨:	클로닝된 프로모터 명칭	도 1에서의 유전자 번호
AI162215	A014P10U	C-D	LMX 2	1 (도 1a)
AI163548	A044P26U	C-D	LMX 3	2 (도 1b)
AI163880	A050P49U	D-E	LMX 4	3 (도 1c)
AI164126	A055P19U	C-D	LMX 5	4 (도 1d)
AI161513	A001P79U	A-B	LMP 1	5 (도 1e)

AI163548 EST를 위한 발현 패턴은 동일 유전자로부터 기원하는 EST인AI162928 (A027P19U)의 발현 패턴에 기초한다.

상이한 식물 부분에서 이들 유전자에 대한 발현 패턴이 노던 블롯 분석에 의해 분석되었다. 이 데이터는 유전자 LMX2 내지LMX5 모두가 이차 목부에서 우세하게 발현됨을 보여준다. LMP1 유전자는 보다 일반적인 발현 패턴을 가지나, 마이크로어레이 분석으로부터 제시되는 바와 같이 유관속형성층을 함유하는 샘플(3 및 5)에서 가장 높은 신호를 가진다. 이들 결과들은 이들 유전자가 형성층 세포 분화 도중 우세하게 발현되고, 이들 유전자의 5' 영역 (프로모터)을 클로닝하고 더 진행하기 위한 필수적인 다른 과정에서는 발현되지는 않음을 가리킨다.

노던 블롯 분석, 물질 및 방법

총 RNA는CTAB 기재 방법(Plant Molecular Biology Reporter volume 11 (2) 1993)을 사용하여 준비하였고 이어 QIAGEN Rneasy Plant Mini Kit를 사용하여RNA를 세척하였다. RNA 농축물은 Ribo Green RNA quantification kit (Molecular Probes Eugen, 오레곤)를 사용하여 결정하였고 RNA 품질은 아가로스 젤 분석에 의해 검사되었다. 상이한 샘플로부터 동일 함량(15 g)의 RNA를 포름알데히드 아가로스 젤 상에 분리시켰다(Sambrook, J; Fritsch, E, Maniatis, T., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, New York, 1989). 그리고나서 RNA는 표준 방법에 따라Hybond-N+ filter에 블롯팅되었고 필터에 UV-교차연결되었다. EcoR1/ Not1 단편을 EST 클론으로부터 회수하였다. 단편들을Ambion으로부터의Strip-EZ^TM DNA labelling kit를 사용하여 라벨링하였다. 하이브리드화는 65℃에서 처어치 완충액(Church buffer) 내에서 행해졌다(Church, G.M. and Gilbert, W. Genomic Sequencing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 1991-1995, 1984). 그리고나서 필터들은 0.5 % BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄ pH 7.2, 5 % SDS 내에서 15분동안 2번 및1 mM, EDTA, 40mM NaHPO₄ pH 7.2, 1에서 5분동안 4 번 세척(65℃에서)하였다. 하이브리드화 결과는 포스포이미저(phosphoimager Molecular Imager System GS525)를 사용하여 분석되었다. 각 필터는 두 번까지 사용되었으며, 재-탐침 전에Strip-EZ^TM DNA 키트 프로토콜을 사용하여 벗겨내었다.

프로모터 클로닝 및 식물 형질전환

업스트림 게놈 DNA 서열을 제조자의 추천에 따라 Clontech로부터 Universal GenomWalker^TM 키트를 사용하여 클로닝하였다. 8개의 게놈 워커 라이브러리가 작제되고 사용되었다. 가장 길거나 어떤 경우에는 가장 특정적으로 증폭된 단편들이pGEM-T-easy vector (Promega) 내로 클로닝되었고 서열화되었다. 서열화 후 EST 클론 및 추정 해독 개시 코돈(애기장대 프로테옴에서 최상의 blastx 히트내 개시 코돈에 기초)이 서열로 맵핑되었다(도1, 서열 1-5 참고). 이에 기초하여 PCR을 사용하여 하이브리드 사시나무 게놈 DNA로부터 추정 프로모터를 클로닝한 다음, 이어서 pPCV812.km 내로 라이게이션하여(R. Walden, C. Koncz, J. Schell. Methods in Plant Moll Cell Biol. 1, 175 (1990)) or into pGWFS7 (M. Karimi, D. Inze and A. Depicker. Trends in Plant Sciences 7 (5)193-195, 2002) 전사 프로모터GUS 리포터 작제물을 만들었다. 프로모터 단편은 개시코돈 업스트림10-50bp부터 시작하여 가능한한5 방향으로 멀게끔 디자인하여1093부터 1807 bp까지에 걸치는5 서열을 제공하였다. 이들 작제물은 아그로박테리아를 사용하여 하이브리드 사시나무 클론T89 내로 형질전환시켰으며 트랜스제닉 식물을 생산하였다(Nilsson O. et al., 트랜스제닉 하이브리드 사시나무 내 컬리플라워 모자이크 바이러스 25S 프로모터 루시퍼라제 발현의 공간적 패턴은 효소 분석 및 비-파괴 이미지화에 의해 관찰됨. Transgenic research 1. 209-220 (1992)). 뿌리 개시에 이어서 식물은 50% 팽창 클레이(Leca lattklinker, 크기 2-6 mm) 및 50% 흙 (Weibulls kronmull, YrkesPlantJord)의 화분에 옮겨져서 보조 열원으로서 Osram Powerstar HQI BT 400W 램프를 사용하여 18 시간의 명기와 6시간의 암기 주기를 갖는 그린 하우스에서 길러졌다.

GUS 분석

GUS 리포터 유전자 발현을 가시화하기 위해서 조직 단편 및 부분을 Nilsson et al (The Agrobacterium rhizogenes rolB and rolC promoters, Physiologia Plantarum 100: 456-462 (1997)) 및 Regan et al. (Accurate and high resolution in situ hybridization analysis of gene expression in secondary stem tissues, Plant J.19, 363-369 (1999))에 본질적으로 따라 X-gluc 내에서 염색하였다. 프로모터 LMX5상에서의 초기 결과는 관속 연관 발현을 보였으며 (애기장대 및 하이브리드 사시나무 둘 모두에서) LMP1에 대한 결과는 식물 재생 동안 애기장대에서는 관속 연관 발현을 보였고 하이브리드 사시나무에서는 뿌리- 및 정단 분열조직 연관 발현을 보였다.

이들 결과들은 목부 연관 발현을 위해 필요한 시스 활성 요소가 이들 작제물에 포함되었음을 가리키며, 이는 자명한 것이 아니므로 따라서 이들 서열들의 국재화가 전사 개시의 업스트림(5') 및 3' 둘 모두일 수 있었을 때 의외의 결과이다.

우선일 도중 행해진 보다 더 큰 2-3 m 고등 식물에서 Lmp1 및 Lmx5 프로모터의 추가 상세 분석은 이들 두 프로모터 각각에 대한 고도로 특이적인 발현 패턴을 밝혀냈다. Lmp1 Gus 라인의 줄기에서Gus 활성은 형성층 세포 + 팽창발생 하는 목부에 주로 존재하였고 이차 세포벽을 생산하는 어린 세포에 적은 양으로 존재하였다. Lmx 5는 이차 세포벽을 생산하는 어린 세포에서 가장 높은 발현을 보이며 형성층 세포 및 팽창하는 목부 세포에서 낮은 발현을 보이는 반대의 발현 패턴을 가졌다. 형성층의 모든 세포 및 어린 이차 세포벽 형성 세포에서 Lmp1 and Lmx5 둘 모두는 발현된다.

이들 프로모터 둘 모두는 뿌리 팁 및 잎과 줄기의 맥관계에서 활성이었다. 이들 프로모터 중 어느 것도 정단 분열조직에서 아무런 발현을 갖지 않는 것으로 보였으나 둘 모두는 어린 목부에서 발현하였으며 특히 Lmp1은 발달하는 맥관계 정단 분열조직에 근접하여 발현하였다. Lmx5도 또한 비록 나중 단계이긴 하나, 발달하는 맥관계에서 발현된다.

Lmx2, Lmx3 및 Lmx4 는 조직 배양의 나중 단계에서 트랜스제닉 포플러에서 분석되었다. 이들 세 개의 프로모터는 pKGWFS7 벡터 내로 클로닝되었다. Lmx2는 잎줄기 및 뿌리의 맥관계에서 발현되었다. 이는 또한 뿌리 팁에서도 발현되었다. 줄기에서 주된 발현은 형성층과 이차 세포벽 형성 세포로의 모든 경로에서 행해지는 것으로 보여진다. Lmx3은 뿌리 팁에서 발현되지는 않는다는 주목할만한 상이점을 가진 채 유사한 발현 패턴을 가지나 뿌리 팁으로부터 약 0.5 내지 약 7 mm의 뿌리 맥관계에서는 확실하게 발현된다. Lmx3는 또한 정단 분열조직 및 어린 엽원기(leaf primordial)에서 발현되며 맥관계로 한정되는 일차 줄기 발생 및 잎에서 후에 발현된다. Lmx4 유전자는 조직 배양에 존재하는 어린 조직에서 낮게 발현되었으나, 맥관계, 특히 분석된 샘플들 내에 존재하는 가장 오래된 맥관계에서의 발현은 확실히 보여질 수 있다.

본 발명이 비록 바람직한 태양에 대해서 설명되었으나, 이는 발명자들에게 현재로서 최선 실시예라고 여겨지는 것을 구축하는 것에 불과하며 당업자에게 자명한 바와 같이 다양한 변화 및 변형이 첨부된 특허청구범위에 개시된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 행해질 수 있음이 숙지되어야 할 것이다.

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tgcttgttag 660 agaaaatatt ctactaataa ataacttttg tcatactaag tcatgaaaaa tgtgatcttt 720 aatgatacaa gaacagaagt ccaaaagcag ggggggtaaa gaaagggaga ggttgcctat 780 atatttgcct tacacttact ctacaaggaa ccttttgcac ctaatgagcg taataaatag 840 tatagcayga tagcaatagc acaatagctc agaaatgata tagcttctaa ctaatataga 900 agacaacacg agcccaagat gttagccctc caacttatgc caccctaacc tgcgtttata 960 ctctaaaaag ataaatgtag aaaaaaagtg aaaacctaac tgtacatggc tttagcttta 1020 ctcctactca aacagccata aaaaatccca aaacgaggcc tctaaaagtg tcctcatcat 1080 tctgttgctt cag 1093 <210> 2 <211> 1245 <212> DNA <213> Populus tremula x tremuloides <400> 2 gaattcataa taattggatt ggacttgtct attttcttta gagatttatc aattgtgttt 60 tattttttaa catttattaa attaaatgga ctaggactat acatacctta tctatgatgt 120 atttagtatt gcgtttcaaa taggggttga ataaattttg aattttattt ctgtttaaaa 180 ttattttttt tatgttttca aatcgttttg atgtgctgat atcaaaaata attttgaaaa 240 aaatatatat tattttgatg tatttttgaa taaaaaatac tttgaaaaac aactggttat 300 tacagtctca aacactccta gtagtcttag gcatagttta 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atttgacctt ttcacttatt ygaaaagtca aatgttaatt tccaccgagc 780 tttatcctgt aaatagcgtg tttaatgcca gctgtaaata agatagatga tcgattttgt 840 atttacattc tcttatctta gacggaaagt tattaaaaaa ataaaataaa atagaaacct 900 acctaagatg tgaactcttg gcgtctctag ctgtttctgt ctctagaaca acctctacga 960 gtatagccga agcatatcct agcaagcttg aaccatatct actacctccc tccccgctat 1020 atatatataa accactcttc ttcctagaaa aaaaataacc ctcgatcttt ctttcttgtg 1080 cttatgttga ttttgtttga ttttcatata tcatgagcaa tataccaaga tct 1133 <210> 4 <211> 1807 <212> DNA <213> Populus tremula x tremuloides <220> <221> misc_feature <222> (616) <223> unknown amino <400> 4 gatgcaaaag ctggaatgag aatgcgctaa atgcgaaaag acagagagag cgaataaatc 60 gtgcaaaaaa aggagtgggg tgggtaacgg gttgagctag aagaagaaaa gggacaagtg 120 cactttagga ggggggcaac cagagcgtag atgataatgg ttcatgtgga aacaacacac 180 atgagcagtt ggtgagaact tgaatgaacc ctaacagccc aaccaaaccc ggagccaccc 240 ttaccgaacc accacttcta aaagtacacc atgccttttt cttgagcytg gttgcacagg 300 gtgccrggtg gggttgtttc gttttgggta atcatgcgat 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Claims (17)

1. 식물 목부(xylem) 형성 조직에서 특이적으로 발현되거나 활성인 프로모터 서열을 포함하는,

   서열 번호 1 내지 5,

   서열번호 1 내지 5 중 어느 하나와 기능적으로 상동인 서열,

   서열번호 1 내지 5 중 어느 하나와 90% 이상의 상동성을 보이는 서열

   중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산 서열.
2. 제1항에 있어서 식물 목부 형성의 특정 단계에서 서열이 발현되거나 활성인 핵산 서열.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서 프로모터 서열이 식물에서 발현되거나 활성인 핵산 서열.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서 프로모터 서열이 목본 또는 섬유식물에서 발현되거나 활성인 핵산 서열.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서 프로모터 서열이 목본에서 발현되거나 활성이며 목본은 쌍자엽식물인 핵산 서열.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서 프로모터 서열이 포플러, 사시나무, 자작나무, 버드나무, 유칼립투스, 풍나무(리큐담버), 가문비나무, 잎갈나무, 솔송나무, 소나무, 면, 삼베, 사이잘, 아마, 밀, 옥수수, 감자 및 채종유 중에서 선택되는 식물에서 발현되거나 활성인 핵산 서열.
7. 제1항 또는 제2항에 따른 서열 중 하나 이상이 트랜스제닉 식물 내로 기능적으로 삽입됨을 특징으로 하는, 야생형과 비교하여 변형된 목질 형성 성질을 보이는 트랜스제닉 식물.
8. 제1항 또는 제2항에 따른 서열 중 하나 이상이 트랜스제닉 식물 내로 기능적으로 삽입됨을 특징으로 하는, 야생형과 비교하여 변형된 세포자연사(apoptosis) 성질을 보이는 트랜스제닉 식물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서 트랜스제닉 식물이 목본 또는 섬유식물인 트랜스제닉 식물.
10. 제7항 또는 제8항에 있어서 트랜스제닉 식물이 포플러, 사시나무, 자작나무, 버드나무, 유칼립투스, 풍나무(리큐담버), 가문비나무, 잎갈나무, 솔송나무, 소나무, 면, 삼베, 사이잘, 아마, 밀, 옥수수, 감자 및 채종유 중에서 선택되는 트랜스제닉 식물.
11. 제1항 또는 제2항에 따른 서열 중 하나 이상을 사용함을 특징으로 하는 식물 목부에서 특정 유전자를 발현하는 방법.
12. 제1항에 따른 서열 중 하나 이상을 식물 내로 기능적으로 삽입함을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
13. 제7항 내지 제10항의 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 식물의 전파 물질로서 게놈 내에 하나 이상의 상기 서열을 운반하는 전파 물질.
14. 제13항에 있어서 전파 물질이 종자, 과일, 원형질체, 식물 세포, 칼리 또는 뿌리와 같이 식물의 잘려진 부분 또는 일부 중에서 선택되는 전파 물질.
15. 제1항 또는 제2항에 따른 서열을 포함하는 핵산 작제물.
16. 제15항에 있어서 작제물이 플라즈미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지 중에서 선택되는 벡터를 포함하는 핵산 작제물.
17. 제1항 또는 제2항에 따른 서열 중 하나 이상에 엄격한 조건하에서 하이브리드할 수 있는 핵산 서열.

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