JP4719754B2 - イネのアントラニル酸シンターゼの第2アイソザイムのαサブユニットをコードする遺伝子に関連するDNA - Google Patents
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Description
「生化学実験講座」第11巻、652頁〜653頁、(1976年) 「The Plant Cell」4巻、721頁〜733頁、(1992年) 「育種学雑誌」46巻、別冊2、28頁、(1996年) 「Massachusetts Institute of Technology,Cambridge, MA」(1993年) しかしながら、本発明者の知る限りでは、イネのASAのアイソザイムのαサブユニットであるタンパク質のアミノ酸配列を解析したこと、およびイネのASAのアイソザイムのαサブユニットをコードする遺伝子を取得できた具体的な方法を報告する文献は知られていない。また、該遺伝子の発現に関わるプロモーター配列も知られていない。またイネのASAをコードする遺伝子を利用することを報告する文献も知られていない。
イネ (Oriza sativa) の種々な組織、例えば茎葉、根、カルスなどの組織、好ましくは緑色の茎葉から、常法により全RNAを抽出する。抽出された全RNAから蛋白質などの夾雑物を除いた後、さらにオリゴdTセルロースの充填カラムに通してpoly(A)+RNAを精製することによって、イネの全mRNAを得ることができる。
アラビドプシスのASAの第1アイソザイムのαサブユニットの遺伝子の既知の塩基配列と第2アイソザイムのαサブユニットの遺伝子の既知の塩基配列との間に共通に保存されている塩基配列 (オンラインデータベースEMBL: M92353) を参照して且つアラビドプシスのASAの第1アイソザイムが植物体でより強い発現力をもつことを勘案して、本発明者らは2種類のオリゴヌクレオチド (後記の配列表の配列番号8および9のオリゴヌクレオチド) をPCR法用のプライマー (相補的DNA) として化学合成により作製して構築した。
先に多数の組換えファージからなるプラークとして得られたイネのcDNAライブラリーの中で、所望のイネのASAのαサブユニットをコードするDNAを選択的に採取するのに用いられるプローブDNAを作製する。このプローブDNAの作製のために、前記の合成オリゴヌクレオチドよりなるプライマーを使用し、それで、PCR法によりテンプレートとしてのアラビドプシスのcDNAライブラリーからアラビドプシスのASAの第1および第2アイソザイムのαサブユニットの遺伝子の一部分をコードするDNAを増幅する。
先にイネのcDNAライブラリーとして得られた組換えファージの多数のプラークの中から、上記のプローブDNAをスクリーニング用に利用するファージプラーク-ハイブリダイゼーション法により、目的のイネのASAのαサブユニットの遺伝子に全体的に対応するDNA配列を組込まれた組換えファージよりなる数個のプラークを選抜する。
上記のようにイネのASAのαサブユニットの遺伝子に相当するDNA配列を内部に含有するDNA断片として、ファージから切出して収得されたDNAは、これをプラスミドベクターp Bluescript II SK(+)のEcoRI切断部位に挿入、連結して組換えプラスミドベクターを構築する。このように構築された組換えプラスミドベクターで大腸菌XL1-Blue MRF'を形質転換する。こうして得られた大腸菌形質転換体を培養して増殖させると、イネのASAのαサブユニット遺伝子に相当するDNA配列を含有するDNA断片を担う前記の組換えプラスミドをクローニングできる。従って、イネのASAのαサブユニットの遺伝子に対応するDNA配列を含有するDNA断片がクローニングできる。
(i) 上記のクローニングされた組換えプラスミドから制限酵素EcoRIによりイネのASAのαサブユニットの遺伝子に該当のDNA配列を内部に含有する2種類のDNA断片として、DNA断片XとDNA断片Yとを別々に切り出す。切り出されたDNA断片XおよびDNA断片Yをそれぞれに市販の塩基配列決定キットで処理すると、イネのASAのαサブユニットの遺伝子に該当するDNA配列を内部に含有するDNA断片XまたはDNA断片Yにおける全体の塩基配列を決定できる。上記のDNA断片Xについて、このように決定された塩基配列をもち且つイネのASAの第1アイソザイムのαサブユニットをコードするDNA配列は、後記の配列表の配列番号1に記載された塩基配列を有し、1734個の塩基から成る。このDNA配列を配列OSASA-1配列と命名する。このDNA配列OSASA-1は、第1の本発明によるDNAの一例である。
配列表の配列番号1に記載される1734個の塩基からなる第1の発明のDNA、すなわち前記のOSASA-1配列を含有するDNA断片を、DNAリゲーションキットの利用により、ベクターp Bluescript II SK (+) のEcoRI切断部位の間に挿入、連結することによって、前記の組換えプラスミドベクターpOSASA-1を得る。このベクターpOSASA-1を大腸菌XLl-Blue MRF'に導入し、これで得られた形質転換大腸菌を増殖する。増殖された大腸菌細胞から、常法で抽出することにより組換えプラスミドベクターpOSASA-1を大量に収得する。この操作により第1の発明によるDNA配列、すなわちOSASA-1配列をクローニングする。
DNA合成装置 (Model-391、アプライド バイオシステムズ社製) を利用して、下記の塩基配列を有する4種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成する。すなわち、下記のとおり、配列表の配列番号16に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーOSASN1と、配列番号17に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーOSASN2と、配列番号18に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーOSASC1と、配列番号19に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーOSASC2とを化学合成により作製する。
5'-GAGTCAGTTGACGAAGCGTATGAGG-3'
(ii) プライマーOSASAN2 (配列表の配列番号17に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー):
5'-GTACATTTGCTAACCCCTTTGAGG-3'
(iii) プライマーOSASAC1 (配列表の配列番号18に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー):
5'-CAAAGGGGTTAGCAAATGTACGC-3'
(iv) プライマーOSASAC2 (配列表の配列番号19に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー):
5'-GTTCAACGTTCATCAGTTTCTCCACC-3'
(3) 所要なDNA断片のPCR法による増殖と回収
所要なDNA断片を増殖して得るために、PCR法の第一段階として2つの反応、すなわち下記の (A) 反応と (B)反応とを行う。
次に、上記の(3)項で得られたDNA断片-Cを利用して、所望の改変D配列を含有するDNA断片を収得する。
前項 (4) で得られた改変D配列を含有するプラスミドを、次いで制限酵素EcoRIで処理することによって消化する。これによってEcoRI切断部位に隣接する5'-側端に塩基配列ATGを有し且つ3'-側端にもEcoRI切断部位を有する延伸部を有する改変D配列を含有するDNA断片を含有する消化反応液を得ることができる。
従来知られているトウモロコシのユビキチンプロモーター、1stイントロンおよびNOSターミネーターと、ホスフィノスリシン耐性遺伝子、さらに微生物にのみに効果の発現するアンピシリン耐性遺伝子とを含有する既知のプラスミドベクターpUBA(Plant Molecular Biology, 第18巻4号、675頁-689頁、1992年) をバッファー中で制限酵素BamHIおよびSacIで処理すると、ユビキチンプロモーターの下流で、1stイントロンの下流のBamHI切断部位で切断され、且つNOSターミネーターの上流のSacI切断部位で切断された約4.8Kbのサイズのベクター断片を得ることができる。
イネの完熟種子から籾殻を除き、得られた外皮付きコメ種子をエタノール溶液で殺菌、次いで次亜塩素酸ナトリウムの希水溶液で殺菌し、さらに滅菌水で洗浄する。
前項(a) に記載したように作製された、本発明DNAを正常に挿入、連結してある組換えベクター(すなわち、配列番号1のDNAを保有する前記のベクターpUb-OSASAW1、もしくは配列番号10のDNAを保有するベクターpUb-OSASAW2または配列番号12のDNAを保有するベクターpUb-OSASA1D) を、公知のアグロバクテリウム法によりイネのカルス細胞へ導入するために、まず宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) への組み込みを行う。組み込みは公知のエレクトロポレーション法(植物組織培養、第10巻2号、194頁-196頁、1993年)により行う。
上記のように得られたハイグロマイシン耐性の形質転換イネ植物細胞の中から、本発明DNAを外来遺伝子として十分に有効な量で含有する形質転換イネ植物細胞のみを再選抜する。
上記のように再選抜された5HT耐性の培養植物細胞を、植物組織培養用のMS培地にショ糖、植物ホルモンとしてのベンジルアデニン、ナフタレン酢酸、ゲルライトを添加してなる植物体再生用の分化培地に移植する。
上記のように再生された形質転換イネ植物から緑色の葉を採取する。採取された葉を液体窒素で凍結した後に破砕する。その葉破砕物から、J.Sambrookらの方法(Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Habor Laboratory Press、1989年に記載) に準じてDNAを抽出する。
形質転換植物の作出のために、植物細胞への直接的導入法に用いられる組換えベクターとして、従来知られているカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと、NOSターミネーターと、微生物にのみに効果の発現するアンピシリン耐性遺伝子とを含有する既知のプラスミドベクターpBI221(Clontech社製) を、バッファー中で制限酵素XbaIおよびSacIで処理すると、35Sプロモーターの下流のXbaI切断部位で切断され、且つNOSターミネーターの上流のSacI切断部位で切断された約3.8Kbのサイズのベクター断片を得ることができる。
イネの完熟種子から籾殻を除き、得られた外皮付きコメ種子をエタノール溶液で殺菌、次いで次亜塩素酸ナトリウムの希水溶液で殺菌し、さらに滅菌水で洗浄する。
前項(a) に記載したように作製された本発明DNAを正常に挿入、連結してある選抜用組換えベクターのpUBdW1あるいはpUBdW2を公知のウイスカーを用いる直接的導入法によりカルス細胞へ導入を行う。また、選抜用組換えベクターのpUb-OSASA1Dを公知のアグロバクテリウム法(細胞工学別冊、モデル植物の実験プロトコール、93頁〜98頁、1996年、秀潤社発行) によりカルス細胞へ導入を行う。
上記のように得られた選抜用組換えベクターpUBdW1またはpUBdW2を含有するカルス細胞を、N6培地にショ糖、2,4-PA、ゲルライトおよび選抜薬剤としてトリプトファン類縁化合物を10mg/L〜200mg/L〜200mg/L、好ましくは30mg/L〜50mg/Lを添加してなる選抜用培地の上に均一に広げて加える。さらに、暗所もしくは2000ルックスの光を1日当たり16時間照射しながら25〜28℃で20〜60日間、好ましくは25〜30日間培養する。
上記のように得られたトリプトファン類縁化合物耐性の形質転換イネ植物細胞から、形質転換イネ植物を得るために、前者の形質転換細胞を、MS培地にショ糖、植物ホルモンとしてベンジルアデニン、ナフタレン酢酸、ゲルライトおよび選抜薬剤としてトリプトファン類縁化合物を10mg/L〜200mg/L、好ましくは30mg/L〜50mg/L添加してなる植物体再生用の選抜分化培地に移植する。
イネ(Oriza sativa)の茎葉、根、カルスなどの組織、好ましくは茎葉またはカルスから、常法によりゲノミックDNAを抽出する。抽出したゲノミックDNAから蛋白質などの夾雑物を除き、さらに超遠心分離によりゲノミックDNAの精製品を得る。
上記で得られたゲノミックDNA (精製品) を制限酵素 EcoRIで部分消化する。得られたDNAの部分消化物をアガロースゲルにて電気泳動する。電気泳動により分画されたDNA断片をナイロン膜ハイボンドNに転写する。転写されたDNAは変性処理により、ナイロン膜に固定する。
得られたゲノミックDNAをファージベクターに連結し、得られた組換えベクターをλファージにパッケージする。こうして得られた組換えλファージを大腸菌に感染させて増殖させると、前記の組換えλファージの多量が得られる。この多量の組換えλファージをイネの分画ゲノミックDNAライブラリーとして利用する。
上記で構築されたイネのゲノミックDNAライブラリーである組換えファージを用い、また実施例1の(5)でアラビドプシスから作られたDIGラベルした標識プローブDNAを利用することによりプラーク・ハイブリダイゼーション法によって、イネのASA遺伝子のためのプロモーターの遺伝子に相当するDNA配列を含有する組換えファージを、前記ゲノミックDNAライブラリーからスクリーニングできる。このスクリーニングにより、該ライブラリーの10万個のファージプラークから、ASA遺伝子のプロモーター遺伝子が組込れたと判定できたファージプラーク3個を単離することに幸にも成功した。
上記で得られたEcoRI-DNA断片を、プラスミドベクターp Bluecsript II SK(+)のEcoRI切断部位に連結する。得られた組換えプラスミドベクターを大腸菌に導入して、クローニングする。大腸菌から組換えプラスミド・ベクターのクローンを分離する。
上記のように得た組換えプラスミド・ベクターのクローンを制限酵素RcoRIと制限酵素BamHIで消化する。こうして得たEccoRI-BamHI断片を塩基配列の解析にかける。
前記の得られたイネのゲノミックDNAクローンから分離された前記のDNA断片Zに含有されるところの、ASAの第1アイソザイムのαサブユニットの遺伝子のプロモーター領域について、そのプロモーターとしての機能を確認するために、その活性の検定試験を行った。すなわち、前記のDNA断片Zを、レポーター遺伝子であるβ-グルクロニダーゼ(GUS) 遺伝子を担持する市販のpBI101プラスミドベクター(Clontech社製) の制限酵素切断部位に挿入することによって、組換えプラスミドベクターを作成した。この組換えプラスミドベクターを常法によって植物細胞、例えばイネ培養細胞へ導入して、市販のGUS活性測定キットにより、該プロモーター領域がGUS活性の発現に有効であることを確認することができる。
本実施例はイネのアントラニル酸シンターゼ(ASA) の第1のアイソザイム(ASA1) のαサブユニットをコードする遺伝子と、第2のアイソザイム(ASA2) のαサブユニットをコードする遺伝子(すなわち、本件特許請求の範囲の請求項1または2のDNA)とを単離する方法を例示する。
イネ(品種: 日本晴) の種子を播種した。その後、栽培7日目の幼植物体の茎葉2gを液体窒素で凍結した。凍結した茎葉を乳鉢内で粉砕した。その粉砕物から、公知のAGPC法(Acid Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformを使用する方法)(実験医学、Vol. 9, No. 15 (11月号)、第99頁〜第102頁、1991年) に従い、全RNAの約2mgを抽出した。次に、上記で得られた全RNAから、Pharmacia Biotech社製のmRNA精製キット(mRNA Purification Kit) を用いてmRNAを単離した。こうしてイネの全mRNAの約30μgを得た。
上記(1) で得られたイネの全mRNAから、DNA合成キット(Pharmacia Biotech社製のTimeSaver cDNA Synthesis Kit) によりイネの全cDNAを得た。
イネのアントラニル酸シンターゼ(ASA) の第1のアイソザイム(ASA1) と第2のアイソザイム(ASA2) のそれぞれのαサブユニットをコードするcDNA断片をクローニングするのに用いるDNAプローブをPCR法用に作製する。このために、まずプライマーの設計を行った。そのためには、まずアラビドプシス(和名: シロイヌナズナ) のアントラニル酸シンターゼの第1のアイソザイムと第2のアイソザイムとのそれぞれのαサブユニットをコードする遺伝子の既知の塩基配列および既知のアミノ酸配列を参考にして、下記に示す塩基配列を有する2種類のオリゴヌクレオチドを、プライマーNo.1とプライマーNo.2として化学合成により作製した。
5'-CATATGTCTTCCTCTATGAAC-3'
プライマーNo.2(配列表の配列番号9) に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド):
5'-GGATCCTCATTTTTTCACAAATGC-3'
なお、上記の2種類のオリゴヌクレオチドの作製は、DNA合成装置(Model 391、アプライドバイオシステムズ社製) を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにその合成品をイオン交換HPLCで精製することにより行った。
次に、上記のように構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各10p.Mを第1のプライマーおよび第2のプライマーとして用い、またアラビドプシスの市販されるcDNAライブラリー(STRATAGENE社製) の1μlをテンプレイトとして用いた。第1および第2プライマーならびにアラビドプシスのcDNAライブラリーを、PCR法用の増幅反応液(10mMのTris-HCl(pH 8.3)、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、0.001%ゼラチン、pH 8.3; 4種のヌクレオチドdNTPの各2.5mMの混合物、およびDNAポリメラーゼTakara Ex Taq、2.5単位) 50μlに加えて、DNAの増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、PCRキット(PCR Amplification Kit(宝酒造(株)社製) により調製した。
上記(2)で構築されたイネのcDNAライブラリーである組換えラムダファージから、上記(4)でアラビドプシスのDNAライブラリーから作製したプローブDNAの利用により、イネのASAの2つのアイソザイムのαサブユニットをコードする遺伝子に対応するDNA配列を組込まれた組換えラムダファージをプラーク・ハイブリダイゼーション法により、スクリーニングにより採取する。
上記のように、イネのASAの2つのアイソザイムのαサブユニットをコードする遺伝子に相当するDNA配列を含有すると判定されたDNA断片として、前記の8種の各々の組換えファージから切出して収得されたDNA断片は、8種である。このようなDNA断片の各1種づつをプラスミドベクター p Bluescript II SK(+) のEcoRI切断部位にDNAリゲーション・キットにより挿入、連結することにより、組換えプラスミドベクターを構築した。このように構築された組換えプラスミドベクターの導入で大腸菌XLl-Blue MRF' を形質転換した。
(Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)を20mg/lの濃度で添加されてあるLB寒天培地(1%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母抽出物、0.5% NaCl、0.1% Glucose、pH 7.5、寒天1.5%含有) にプレーティングした。37℃で16時間、大腸菌を培養後、白色に発色してない大腸菌コロニーから、白色に発色している大腸菌コロニーを、前記の組換えファージのDNA断片を連結された組換えプラスミドベクターDNAで形質転換されてある大腸菌として、分離した。
上記のクローニングされた8種のDNAである組換えプラスミドDNAをそれぞれに市販の塩基配列決定キットで処理すると、それらのDNA断片の全体の塩基配列を決定できた。そして、それらのDNA断片の内部に含有されたイネのASA1のαサブユニットをコードする遺伝子に該当するDNAの塩基配列、ならびにイネのASA2のαサブユニットをコードする遺伝子に該当するDNAの塩基配列を判定できた。
前項(6)の操作により、最終的に組換えプラスミドDNAの8種が得られた。これら8種の組換えプラスミドDNA断片の各々のDNA断片全体の塩基配列が前項(7)で塩基配列決定キットにより決定された。
本例は、第3の発明(本件特許請求の範囲から除外されてあるが、特願2004-257204号の請求項1の発明)により得られた改変D配列と命名されたDNA配列(すなわち、配列表の配列番号12に記載された1734個の塩基からなる塩基配列を有するDNA配列) を含有するDNA断片の製造を例示する。
DNA合成装置(Model-391、アプライドバイオシステムズ社製) を利用して、4種のプライマーを合成した。すなわち、配列表の配列番号16に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマーOSASN1と、配列番号17に記載の塩基配列を有するプライマーOSASN2と、配列番号18に記載の塩基配列を有するプライマーOSASC1と、配列番号19に記載の塩基配列を有するプライマーOSASC2とを化学合成により構築した。
実施例1の(8)項において、イネのASA1のαサブユニットの遺伝子に相当するDNA配列すなわち前記のDNA配列OSASA-W1を含有すると判定されるDNA断片として、組換えファージから制限酵素EcoRIで切出して収得されたDNA断片OSASA-1は、プラスミドベクターp Bluescript II SK(+)のEcoRI切断部位にDNAリゲーション・キットにより連結されて、組換えプラスミドベクターpOSASA-1と命名)を構築した。このプラスミドベクターpOSASA-1が下記のPCR法でテンプレートとして利用された。
(i) PCR法の第1回段階
所要なDNA断片をPCR法による増幅反応により収得するために、PCR法の第1回段階として下記の(A)反応と(B)反応とを行った。
次に、PCR法の第2回段階として、前記の(A)反応および(B)反応で増幅したDNA断片-Aの精製品の1μlとDNA断片-Bの精製品の1μlを、増幅反応液(10mMのTris-HCl(pH8.3)、1mMのMgCl2、50mMのKCl, dNTPの各0.2mMの混合物およびLA Taq DNA ポリメラーゼの2.5ユニットを含有) 100μlに加えて、増幅反応を行った。この場合の増幅反応は、変性を94℃、5分間、アニーリングを65℃、10分と55℃、10分行い、また、伸張を72℃、1分行う3つの反応操作を1回実施した。
得られたプラスミドp Bluescript-DNA-DであるプラスミドDNAの10μlを、Hバッファー(宝酒造(株)社製)中でEcoRIの10ユニットで消化した。その消化反応液を低融点アガロース電気泳動により分画した。DNA配列OSASA-W1配列(1734 bpのサイズ) を内部に含有するDNA断片(DNA断片-βと称する) をアガロースから切出した。
本例は、配列表の配列番号1に示すDNA配列を外来遺伝子として、または配列番号12に示す塩基配列をもつ改変DNA配列を外来遺伝子として、イネ植物にアグロバクテリウム法で導入することからなるイネ植物の形質転換方法を例示する。また、本例で形質転換された植物のトリプトファン含量が増加されたことが例証された。
(i) トウモロコシのユビキチンプロモーターと、1stイントロンと、NOSターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有する5.6kbのサイズの既知のプラスミドベクターpUBAのDNA(10μg) を、Kバッファー(宝酒造(株)製) 中で制限酵素BamHIの10ユニットで消化した。消化反応液からDNAを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。このDNA乾燥物を10μlの滅菌水で溶解した後、DNAブランティング・キット(宝酒造社製)で平滑化した後、末端平滑化されたDNAを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。この乾燥物を10μlの滅菌水で溶解した後、Lバッファー(宝酒造(株)製) 中で制限酵素SacIの10ユニットで消化した。消化反応液からDNAを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。このようにして、ユビキチンプロモーターと、1stイントロンと、NOSターミネーターとアンピシリン耐性遺伝子を保有する約4.8kbのサイズのベクター断片を得た(添付図面の図1の左、参照)。
(i) トウモロコシのユビキチンプロモーターと、1stイントロンと、NOSターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有する5.6kbのサイズの既知のプラスミドベクターpUBAのDNA(10μg) から、前記の(i)および(ii)と同様にして、ユビキチンプロモーターと、1stイントロンと、NOSターミネーターとアンピシリン耐性遺伝子とを保有する約4.8kbのサイズのベクター断片を得た(図1の左、参照)。
(i) 上記の(2)(iii)で得られたプラスミドベクターpUBdD-W1のDNA(10μg) を、Hバッファー(宝酒造(株)製) 中で制限酵素SphIの10ユニットで消化し、その消化反応液からDNAを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。得られたベクター断片を10μlの滅菌水に溶解した(添付図面の第2図の右、参照)。そのベクター断片の水溶液の10μlをDNAブランティング・キット(宝酒造(株)製) で処理して、制限酵素切断部位の平滑化反応を行った。その反応液からDNAを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた後、10μlの滅菌水に溶解した。このベクター断片のDNA(10μg) をLバッファー(宝酒造(株)製) 中で制限酵素SacIの10ユニットで消化した後、消化反応液からDNAを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。このようにして、ユビキチンプロモーターおよび第3の発明による配列番号12の改変D配列を保有するベクター断片を得た(添付図面の図2の右の第3番目の図、参照)。
LB培地(バクトトリプトン10g/l、バクトイーストエクストラクト5g/l、NaCl 5μl pH7) の液体培地300mlに、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech社から購入)) を移植し、30℃で16時間振とう培養した後、培溶液を4℃で10分間冷却した後、遠心分離により細菌の沈殿を得た。細菌の沈殿物を氷冷した10%グリセロールで洗浄操作と遠心分離を3回繰り返した後、沈殿物を10mlの10グリセロールに溶解した。
イネ(品種: 日本晴)の完熟種子から籾穀を脱穀した。得られた外皮付きの種子を70%エタノール溶液に60秒間、ついで有効塩素約1%の次亜塩素酸ナトリウム溶液に6分間浸漬して種子を殺菌処理した。さらに種子を滅菌水で洗浄した。
上記のようにして得られた、遺伝子導入用の形質転換アグロバクテリウム(pUb-OSASA1D/LBA4404、あるいはpUb-OSASAW1/LBA4404) をAA培地の無機塩組成にショ糖20g/l、2,4-PA 2mg/l、カイネチン0.2mg/lおよびアセトシリンゴン10mg/lを添加してなる液体培地30mlにけんだくし菌液を得た。このけんだく液を9cmのシャーレに入れ、上記(5)で得られたイネのカルスを100個入れた後、5分間浸せきした。浸せき後、ペーパータオルで余分な菌液を除去した後、N6培地の無機塩組成にショ糖30g/l、グルコース10g/l、2,4-PA 2mg/l、ゲルライト2g/lおよびアセトシリンゴン10mg/lを添加してなる固体培地に、上記のしんせきしたカルスを各シャーレ当たり20個ずつ置床した。28℃で3日間、暗黒下で培養し、イネのカルスへのアグロバクテリウムの感染を行った。
上記(6) で組換えベクターが導入された形質転換カルスを、500mg/lカルベニシリンを添加してなる滅菌水で洗浄してアグロバクテリウム細菌を除去した。カルスから余分な水分を除いた後、カルスをN6培地の無機塩組成にショ糖30g/l、2,4-PA 2mg/l、カルベニシリン500mg/l、ハイグロマイシン50mg/l、ゲルライト2mg/lを添加してなる固体培地上に各シャーレ当たり20個ずつ移植した。25℃で21日間、2000ルックスの光を1日当たり16時間照明しながら培養して、ハイグロマイシン耐性の形質転換カルスを得た。
上記により得たハイグロマイシン耐性である形質転換カルスのうち、ベクターpUb-OSASA1Dに含有されて植物中で発現される機能を有する改変D配列が外来遺伝子として十分導入されて形質転換されたカルスのみを再選抜する。そのためには、形質転換カルス15個(直径5mm)を、N6培地の無機塩組成にショ糖30g/l、2,4-PA 2mg/l、カルベニシリン250mg/l、ゲルライト2g/lと細胞増殖阻害剤として働く5-メチルトリプトファン(以下、5MTという) (トリプトファンのアナログ体) の3×10−4Mを添加してなる固体培地上に移植した。25℃で21日間、2000ルックスの光を1日当たり16時間照明しながら培養した。前記の5MT添加培地で生育できた植物中で発現される機能を有する改変D配列含有の形質転換カルスをこのようにして再選抜した。
上記により得たハイグロマイシン耐性および5MT耐性である形質転換カルス培養の14〜15個を、MS培地の無機塩組成にショ糖の30g/l、ソルビトール30g/l、カサミノ酸の2g/l、NAA 1mg/l、BA 2mg/l、ハイグロマイシン50mg/l、ゲルライト4g/lを添加してなる固体培地に移植した。25℃で30日間、2000ルックスの光を1日当たり16時間照射しながら培養すると、形質転換カルスから芽と根が再生できた。再生した幼芽(長さ10〜30mmに生育した芽)を、ショ糖の30g/l、ゲルライトの2g/lを含むMS培地を入れた試験管(直径45mm、長さ25cm)に移植した。移植された幼芽を20日間培養して形質転換したイネ植物を得た。
上記のように再生されたイネ植物体に存在するASAをコードするDNAの解析をPCR法で次の手順により行った。
前項(10)で得られた、第1の発明によるDNAを保有するOSASA-W1配列を含有する組換えベクターpUb-OSASAW1を導入された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体と、第3の発明による改変D配列を含有する組換えベクターpUb-OSASA1Dを導入された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体とから、夫々に緑色の葉を採取した。
本例は、第3の発明による配列番号12のDNA配列を、外来遺伝子としてイネ植物に導入することからなる形質転換細胞の選抜方法と形質転換植物の作成方法を例示する。
外来遺伝子の導入用の組換えベクターとして、実施例3、(3)(iii)に記載の組換えベクターpUb-OSASA1Dまたは実施例3、(1)(iii)に示された組換えベクターpUBdDを用いた。
(i) アグロバクテリウム細菌法
上記の(1)に示した組換えベクターpUb-OSASA1Dを用いて実施例3の(4)と同様の方法によりアグロバクテリウム細菌の調製を行い、また実施例3の(5)と同様の方法によりイネのカルス細胞の調製を行い、実施例3の(6)と同様の方法によりイネのカルス細胞への導入操作を行った。
イネ(品種:日本晴) の完熟種子から籾穀を脱穀した。得られた外皮付きの種子を70%エタノール溶液に60秒間、ついで有効塩素約1%の次亜塩素酸ナトリウム溶液に6分間浸漬して種子を殺菌処理した。さらに種子を滅菌水で洗浄した。
本例は、イネのASA遺伝子のプロモーターの遺伝子に相当するDNAを収得する方法を例示する。
イネ(品種:日本晴) のカルス2gから、公知のCTAB法(クローニングとシークエンス: 1989年、262頁〜264頁、農村文化社) に従い、ゲノミックDNAの2mgを抽出した。
10マイクログラムの上記ゲノミックDNAを制限酵素EcoRIで部分消化した後、得られたDNA断片を0.8%アガロースゲルにて電気泳動した。電気泳動により分画したDNA断片をナイロン膜(アマシャム社製)ハイボンドNに転写した。このようにしてナイロン膜に転写したDNAはアルカリ変性液(1.5M NaCl、2.0M NaOH) および中和液(1.0 M Tris-HCl pH5、2.0M NaCl) でそれぞれ10分間処理し、その後に80℃、2時間処理してDNAをナイロン膜に固定した。
上記(2)で作製したイネのゲノミックDNAライブラリーである組換えファージから、実施例1の(5)で作製した標識プローブDNAの利用により、イネのASA遺伝子の発現のためのプロモーターの遺伝子に相当するDNA配列を組込まれた組換えファージをスクリーニングする。
上記のようにイネのASA遺伝子に相当するDNA配列を含有すると判定されたDNA断片として、3種のDNAのうちの各々のファージから制限酵素EcoRIで切り出されて収得された6.2kbのサイズのDNA断片は、これをプラスミドベクターpBluewscriptIISK(+)のEcoRI切断部位にDNAリゲーション・キットにより挿入、連結して組換えプラスミドベクターを構築した。このように構築された組換えプラスミドベクターの導入で大腸菌XL1-BlueMRF'を形質転換した。得られた形質転換株はエシエリヒア・コリXL1-Blue MRF'(Os-asa#7) と命名し、これは生命工学工業技術研究所に1997年8月18日にFERM P-16387として寄託され、また1998年8月7日以降はブダペスト条約の規約下にFERM BP-6452の受託番号で寄託されてある。
上記のクローニングされた3種類のDNAである組換えプラスミドを市販の塩基配列決定キットで処理すると、そのDNA断片の全体の塩基配列を決定できる。そして、そのDNA断片内部に含有されたイネのASA遺伝子のプロモーター遺伝子に該当するDNA配列を判定できる。上記の塩基配列の決定は、実施例1(7) の方法と同様に行った。
(i) 検定用の組換えベクターの作成
上記で得られたプロモーターDNA(配列番号7) のプロモーター活性を調べるため、このDNA(前記の(4) で得たEcoRI-BamHI断片) を植物細胞形質転換用ベクターpBI101(Clontech社製) のβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子の上流部分に組み込み形質転換用ベクターpGUS#3を得た。
上記で得られた組換えベクターpGUS#3を実施例3 (6)と同様の方法によりイネのカルス細胞への導入を行った。このようにして、組換えベクターpGUS#3が形質転換されているイネのカルス細胞を得た。
上記で得られた組換えベクターpGUS#3が形質転換されたイネのカルスを、28℃で3日間培養した後、カルスの約0.5gを乳鉢に入れ、500μlの抽出用バッファー50mM NaPO4(pH7)、10mM EDTA、0.1%TritonX100、0.1%Sarkosyl、10mM β-メルカプトエタノール) 中で添加し、磨砕した。磨砕液を1.5ml容のチューブに移し、17000×gの遠心速度で20分間遠心分離した。得られた上清のうち、10μlを新しいチューブに移し、基質である1mMの4-メチルアンペリフェリルグルクロナイド(4-MUG) 溶液の100μlを加えて混合した。得られた混合物を37℃で3時間反応させた。その反応液に3%炭酸水素ナトリウム溶液の1.8mlを添加して、混合した。それを蛍光分光光度計(日立社製、F2000型) にかけて蛍光吸収測定を行った。その際の365nm励起光、455nm発光の条件でGUS活性の評定を行った。
Claims (6)
- 配列表の配列番号11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、イネのアントラニル酸シンターゼの第2アイソザイムのαサブユニットであるタンパク質をコードするDNA。
- 配列表の配列番号10に記載の塩基配列を有するDNAである、請求項1に記載のDNA。
- イネのアントラニル酸シンターゼの第2アイソザイムのαサブユニットをコードするところの、配列表の配列番号10の塩基配列をもつ請求項2に記載のDNAを担持する組換えベクターを導入されて形質転換された植物細胞を有し、そして導入された前記DNAが発現可能であることを特徴とする、形質転換植物。
- 請求項3に記載の形質転換植物から採取された種子。
- 配列表の配列番号10に記載の塩基配列を有するDNA配列を担うDNA断片が組み込まれた組換えベクターであって、宿主細胞中で該DNA配列を発現することができる組換えベクター。
- 配列表の配列番号10に記載の塩基配列を有するDNA配列を担うDNA断片が組み込まれた組換えベクターであって、宿主細胞中で該DNA配列を発現することができる組換えベクターで形質転換された大腸菌。
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