JP2000342277A - イネのアントラニル酸シンターゼの第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子のプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 イネのアントラニル酸シンターゼ（ＡＳ）の
第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子に対するプロ
モーターをコードする遺伝子に該当する新規なＤＮＡを
取得する。 【解決手段】 特定の塩基配列を有する861 bpのサイズ
のプロモーターＤＮＡが、これを含有する878 bpのサイ
ズのＤＮＡ断片（すなわちＤＮＡ断片−ｐ１）として得
られた。また、上記と異る特定の塩基配列の特定部位の
856bpのサイズの塩基配列を有するプロモーターＤＮＡ
が、これを含有するところの第２の特定の塩基配列表に
記載された塩基配列を有する1660bpのサイズのＤＮＡ断
片（すなわちＤＮＡ−ｃ）として得られた。上記のＤＮ
Ａは、適当な植物細胞形質転換用プラスミドベクターに
連結し、そして得られた組換えプラスミドをイネのカル
ス細胞へ導入する場合に、プロモーターとして機能す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イネのアントラニ
ル酸シンターゼの第２アイソザイムのαサブユニットを
コードする遺伝子に対してプロモーター活性を有するプ
ロモーターＤＮＡ領域から成る新規なＤＮＡ、もしくは
該プロモーターＤＮＡ領域を内部に含むプロモーター活
性のある新規なＤＮＡに関し、またそれらＤＮＡの利用
に関する。

【０００２】

【従来技術】植物細胞内で機能することが可能なプロモ
ーターとして各種のプロモーターが知られている。プロ
モーターは、発現させようと所期する構造遺伝子を各種
のプロモーターと共にプラスミドベクターに連結するこ
とにより組換えプラスミドを作製することができ、そし
てその組換えプラスミドを植物細胞に導入することによ
って、植物細胞内で所期の構造遺伝子を発現させること
ができる点で有用である。これまで良く知られているプ
ロモーターであって植物細胞中で機能可能なプロモータ
ーとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプ
ロモーター〔Guilleyら、「Cell」30巻、763−773頁（1
982）〕、細菌のノパリンシンターゼプロモーター(ＮＯ
Ｓ)〔Ebartら、「Proc.Natl.Acad.Sci.」84巻、5745−5
749頁（1987）〕などが挙げられる。

【０００３】ところで、必須アミノ酸として知られてい
るトリプトファンが植物体中で生成される生合成経路に
おいて、コリスミン酸からアントラニル酸シンターゼ
（以下では、「ＡＳ」と略記することがある）の触媒作
用によってアントラニル酸が生成して、さらにアントラ
ニル酸から６段階の酵素反応によりインドール酢酸を経
てトリプトファンが生成することが知られている(生化
学実験講座、第11巻、652頁〜653頁、1976年、東京化学
同人）。

【０００４】これまで知られているＡＳは、複数のサブ
ユニットから構成されている。アラビドプシス(和名：
シロイヌナズナ)では、ＡＳとして２種類のアイソザイ
ムが存在し、しかもそれの第１のアイソザイムも、第２
のアイソザイムもそれぞれα、βの２つのサブユニット
からなることが知られている。これらの第１アイソザイ
ムのαサブユニット（ＡＳＡ１）、および 第２アイソ
ザイムのαサブユニット（ＡＳＡ２）をコードする２つ
の遺伝子は既に単離され、それらの塩基配列が解析され
ている〔「The Plant Cell」４巻、721−733頁（199
2）〕。また、イネについてもＡＳの第１アイソザイム
ＡＳＡ１のαサブユニットをコードする遺伝子が言及さ
れている〔「育種」、第46巻、別冊２、28頁（199
6）〕。

【０００５】本発明者らは、先に、イネのアントラニル
酸シンターゼ（ＡＳ）の第１アイソザイム及び第２のア
イソザイムのそれぞれのαサブユニットをコードする遺
伝子に該当する２つの新規なＤＮＡを単離する研究を行
い、そしてそれら新規なＤＮＡの塩基配列を決定するこ
とに成功し、また前記のＡＳの第１アイソザイムのαサ
ブユニットをコードする遺伝子に対するプロモーター活
性を有する新規なプロモーターＤＮＡを得ることに成功
した。

【０００６】こうして本発明者らによって先に得られた
ところの、イネのＡＳの第１アイソザイムのαサブユニ
ットをコードする遺伝子に該当する新規ＤＮＡの塩基配
列、および該ＡＳの第２アイソザイムのαサブユニット
をコードする遺伝子に該当する新規ＤＮＡの塩基配列、
ならびに前記のＡＳの第１アイソザイムのαサブユニッ
トの遺伝子に対するプロモーター活性を有する新規プロ
モーターＤＮＡの塩基配列は、国際特許出願、PCT/JP98
/03883号明細書（国際出願日は1998年８月31日であり、
1999年３月11日に刊行された国際公開 No.WO99/11800号
公報で公開）に記載されてある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イネ
のＡＳの第２アイソザイムのαサブユニットをコードす
る遺伝子に固有の新規なプロモーターＤＮＡを単離し、
そして該プロモーターＤＮＡの塩基配列を決定すること
にあり、さらには、この新規プロモーターＤＮＡを提供
し、またそれの利用方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った。すなわち、今回、
本発明者らは、イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブ
ユニットをコードする遺伝子の発現に有効なプロモータ
ーＤＮＡを単離する目的で研究を行った。その研究の結
果、後記に説明される手法によって、イネのＡＳの第２
アイソザイムのαサブユニット遺伝子を発現するのに有
効なプロモーター活性を有するＤＮＡ領域を内部に含有
する第１のＤＮＡ配列（後記されるＤＮＡ断片−ｐ１に
相当）と、該第１のＤＮＡ配列のＤＮＡを内部の一領域
に含有する第２のＤＮＡ配列（後記されるＤＮＡ断片−
ｐ２に相当）と、イネのＡＳの第２アイソザイムのαサ
ブユニット遺伝子を発現するのに有効なプロモーター活
性を有するＤＮＡ領域および該ＤＮＡ領域の上流域にあ
るＤＮＡ領域を内部に含有する第３のＤＮＡ配列（後記
されるＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｃに相当）とがあることを見
出すことに成功した。

【０００９】前記の第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配
列と第３のＤＮＡ配列との各々の塩基配列を、常用のシ
ークエンシング・キットにより決定した。前記の第１の
ＤＮＡ配列は、後記の配列表の配列番号１に記載された
861 bpのサイズの塩基配列をもつプロモーターＤＮＡ領
域を内部に含有する約878 bpのＤＮＡ断片であると認め
られた。また、前記の第２のＤＮＡ配列は、前記プロモ
ーター活性を有するプロモーターＤＮＡ領域を内部に含
有する第１のＤＮＡ配列のＤＮＡを、内部に一領域とし
て含有し且つ、配列表の配列番号２に記載された1254bp
のサイズの塩基配列をもつＤＮＡを内部領域に含有する
約1262bpのＤＮＡ断片であると認められた。さらに前記
の第３のＤＮＡ配列は、後記の配列表の配列番号９に記
載された1660bpのサイズの塩基配列をもつＤＮＡ断片で
あると認められた。

【００１０】従って、第１の本発明においては、配列表
の配列番号１に記載された塩基配列を有するＤＮＡであ
って、このＤＮＡには、イネのアントラニル酸シンター
ゼの第２アイソザイムのαサブユニットをコードする遺
伝子に対するプロモーター活性を有するＤＮＡ領域から
成ることを特徴とする、前記プロモーター活性を有する
新規なＤＮＡが提供される。この第１の本発明のＤＮＡ
は861 bpのサイズを有する。

【００１１】また、一般的には、生理活性を有するタン
パク質を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個
のアミノ酸が欠失されるか、及び（又は）他のアミノ酸
に置換されるか、及び（又は）１個もしくは複数個のア
ミノ酸が該アミノ酸配列中に付加されたアミノ酸配列で
も、元のアミノ酸配列のタンパク質の生理活性が維持さ
れる場合があることは当業者において広く認識されてい
る。

【００１２】また、第１の本発明のＤＮＡについては、
その塩基配列の一部分又は数部分に修飾が加えられた後
にも、イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニット
遺伝子に対するプロモーター活性を有するＤＮＡである
ことが可能である。換言すれば、第１の本発明によるＤ
ＮＡは配列番号１の塩基配列の中の１個又は複数個の塩
基、例えば、１、２又は３〜10個の塩基が欠失される
か、または別の塩基に改変されるか、または付加するか
した後にも、イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユ
ニット遺伝子に対するプロモーター活性を有する能力を
保有することができる。

【００１３】従って、第２の本発明において、配列表の
配列番号１に記載された塩基配列において１個もしくは
数個の塩基が付加されるか、および（または）欠失する
か、および（または）他の塩基により置換されて形成さ
れた塩基配列であるＤＮＡ、あるいは該塩基配列の少な
くとも一部を含むＤＮＡであって、かつ、植物細胞中で
プロモーター活性を有する新規ＤＮＡが提供される。

【００１４】また、第３の本発明においては、配列表の
配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡであって、
このＤＮＡの内部には、イネのアントラニル酸シンター
ゼの第２アイソザイムのαサブユニットをコードする遺
伝子に対するプロモーター活性を有するＤＮＡ領域を含
み、また該プロモーター活性を有する該ＤＮＡ領域に対
するエクソン部のＤＮＡ配列を含む新規ＤＮＡが提供さ
れる。この第３の本発明のＤＮＡは1254 bpのサイズを
有する。

【００１５】さらにまた、第１の本発明によるＤＮＡ、
あるいは第３の本発明によるＤＮＡは、これを植物細胞
中で発現できる既知のプラスミドベクターに遺伝子工学
の既知の技法で連結すると、組換えプラスミドを構築す
ることができる。

【００１６】従って、第４の本発明においては、配列表
の配列番号１または２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
であって、植物細胞中でプロモーター活性を有するＤＮ
Ａを含有するプラスミドが提供される。

【００１７】さらに、第４の本発明によるプラスミド
は、具体的には、例えば後記の実施例２に示される組換
えプラスミドｐＡＳＡ２ＰＧＵＳであることができる
が、該プラスミドを、植物細胞または植物体に導入する
と、植物中で発現させようと所期する構造遺伝子を発現
させることが可能である。

【００１８】従って、第５の本発明においては、配列表
の配列番号１に記載の塩基配列を有して且つプロモータ
ー活性を有する第１の本発明のＤＮＡの制御下におい
て、所期する構造遺伝子を植物細胞中で発現させる方法
が提供される。

【００１９】以下に、本発明を詳細に説明する。イネの
ＡＳの第２アイソザイムのαサブユニットをコードする
遺伝子の発現に有効である第１の本発明のプロモーター
活性のあるＤＮＡは、下記の各工程により取得すること
ができる。

【００２０】（１）イネのゲノミックＤＮＡの調製 イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）の茎葉、根、カルス
などの組織、好ましくは茎葉またはカルスから、常法に
よりゲノミックＤＮＡを抽出する。抽出したゲノミック
ＤＮＡからタンパク質などの夾雑物を除き、さらに超遠
心分離によりゲノミックＤＮＡの精製品を得る。

【００２１】（２）イネのゲノミックＤＮＡライブラリ
ーの作成 上記で得られたゲノミックＤＮＡ（精製品）を制限酵素
Ｓａｕ３Ａで部分消化する。得られた部分消化ゲノミ
ックＤＮＡをファージベクター、例えばλｇｔ11ベクタ
ーまたはλＺＡＰIIベクターなどに連結する。得られた
組換えベクターをλファージにパッケージする。こうし
て得られた組換えλファージを、宿主としての大腸菌に
感染させて増殖させると、ファージプラークとして、前
記の組換えλファージを大量に得ることができる。この
大量の組換えλファージをイネのゲノミックＤＮＡライ
ブラリーとして利用する。

【００２２】（３）イネのゲノミックＤＮＡライブラリ
ーからのプロモーター遺伝子の選択 上記で構築されたイネのゲノミックＤＮＡライブラリー
である組換えファージを用い、また後記の実施例１でイ
ネから作られたＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡを
利用することにより、プラーク・ハイブリダイゼーショ
ン法によって、イネのＡＳの第１アイソザイムと第２ア
イソザイムのそれぞれのαサブユニットの両方の遺伝子
のためのプロモーター領域に相当するＤＮＡ配列を含有
する組換えファージを、前記ゲノミックＤＮＡライブラ
リーからスクリーニングにより取得することができる。
このスクリーニングにより、10万個のファージプラーク
から、ＡＳの第１および第２アイソザイムの各々のαサ
ブユニット遺伝子に対するプロモーターＤＮＡ領域を含
むＤＮＡ配列が組み込まれたと判定できたファージプラ
ーク４個を単離することに本発明者らは成功した。

【００２３】（４）ゲノミックＤＮＡのクローニング 上記で得られた４個のプラークを別々に、制限酵素EcoR
Ｉで消化して、ＤＮＡのEcoRＩ切断−ＤＮＡ断片を含む
消化液を得る。これらのＤＮＡ消化液をアガロースゲル
にて電気泳動して、ＤＮＡ断片を分画し、そのアガロー
スゲルからEcoRＩ切断ＤＮＡ断片としての約 6.5 Kbp
（キロベースペア）のＤＮＡ−ａと、EcoRＩ切断ＤＮＡ
断片としての約 700bpのＤＮＡ―ｂとの、２つのＤＮＡ
断片を含むバンドをゲル切片として切り出す。次いで、
それらの２つのゲル切片を、ＤＮＡ精製キット、例えば
Geneclean II（フナコシ社製）により精製することによ
り、ＤＮＡ−ａの精製品と、ＤＮＡ―ｂの精製品とをそ
れぞれ得る。

【００２４】これら２種のＤＮＡ断片、すなわちＤＮＡ
−ａ断片とＤＮＡ−ｂ断片とを別々にＤＮＡライゲーシ
ョンキットにより、プラスミドベクターpBluescript SK
(+)のEcoR I切断部位に挿入、連結する。得られたそれ
ぞれの組換えベクターを、大腸菌XLI −BlueMRF´に導
入して、組換え大腸菌XLI−BlueMRF´／pBluescript−D
NA−aと、組換え大腸菌XLI−BlueMRF´／pBluescript−
DNA−b とを得る。これで得られた形質転換大腸菌を増
殖して、増殖された大腸菌細胞から、常法で抽出するこ
とにより上記の組換えプラスミドベクターのクローンpB
luescript−DNA−a と、pBluescript−DNA−b とを大量
に得る。この操作により、イネのＡＳ遺伝子に対するプ
ロモーターＤＮＡ領域を含むＤＮＡクローン２種を分離
して取得する。

【００２５】（５）クローニングされたプラスミドＤＮ
Ａのシークエンス解析 上記の（４）のように得た２種のＤＮＡクローンを、制
限酵素EcoRＩによりそれぞれ消化して、ＤＮＡ断片ＤＮ
Ａ−ａと、ＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｂとは別々に得る。これ
らＤＮＡ断片のそれぞれを、市販の塩基配列決定キット
で処理すると、これら２種のＤＮＡ断片ＤＮＡ−ａおよ
びＤＮＡ−ｂの各々の塩基配列を決定できる。

【００２６】このようにして解析したＤＮＡ断片、すな
わちＤＮＡ−ａと、ＤＮＡ−ｂとの塩基配列を分析する
と、ＤＮＡ断片ＤＮＡ−ａ（約6.5 kbp）は、イネのＡ
Ｓの第２アイソザイムαサブユニット遺伝子の全長1.8k
bpおよびイントロン部分（約4.5 kbp）を含み、さらに
その遺伝子の翻訳開始点の前（上流）にプロモーター遺
伝子の部分ＤＮＡ領域（約180 bpのサイズ) を追加的に
含んでいることが解った。また、ＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｂ
（約700 bp)は、該プロモーター遺伝子の部分ＤＮＡ領
域（約180bp)の上流にあるところの、該プロモーター遺
伝子の別段の部分ＤＮＡ領域を含むものにほぼ該当する
と推定された。

【００２７】（６）完全長のプロモーター遺伝子に相当
するＤＮＡの合成と単離 上記で得られた２種のＤＮＡ断片ＤＮＡ−ａとＤＮＡ−
ｂとの塩基配列を参考にして、３種類のオリゴヌクレオ
チド（後記の配列表の配列番号４、５および６のオリゴ
ヌクレオチド）をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション）法用のプライマー（相補的ＤＮＡ）として
化学合成的作成法により構築した。

【００２８】これらの３種類のオリゴヌクレオチドを用
いて２通りの組み合わせにより、それらオリゴヌクレオ
チドと前記（１）で得たイネのゲノミックＤＮＡ溶液と
の混合物を用いてＰＣＲ法増幅反応を行うと、前記の３
種類のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法で所要なプライ
マー（相補的ＤＮＡ）として働くことができ、そしてイ
ネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニットの遺伝子
のプロモーターに相当するＤＮＡ領域(861 bpのサイ
ズ）を内部に含有する約878 bpのサイズの第１のＤＮＡ
断片と、前記の第２アイソザイムのαサブユニットの遺
伝子のプロモーターに担当するＤＮＡ領域(861bpのサイ
ズ）を内部に含有する約1262 bpのサイズの第２のＤＮ
Ａ断片とが増幅できることが認められた。

【００２９】前記のＰＣＲ法増幅反応の反応液をアガロ
ースゲルにて電気泳動して、ＤＮＡ断片を分画し、その
アガロースゲルから、約878 bpのサイズの上記第１のＤ
ＮＡ断片（すなわちＤＮＡ断片−ｐ１と命名する）を含
むバンド、および約1262 bpのサイズの上記第２のＤＮ
Ａ断片（すなわちＤＮＡ断片―ｐ２と命名する）を含む
バンドを各々切り出す。それら各々のＤＮＡ断片−ｐ１
および−ｐ２をＤＮＡ精製キットにより精製することに
よりＤＮＡ断片−ｐ１の精製品とＤＮＡ断片−ｐ２の精
製品を回収する。

【００３０】このようにして得られたＤＮＡ断片−ｐ１
およびＤＮＡ断片−ｐ２は、これらを市販の塩基配列決
定キットで処理すると、これらのＤＮＡ断片の塩基配列
を決定できる。 その結果、ＤＮＡ断片−ｐ１の塩基配
列は、前記のＤＮＡ−ａのうちのプロモーターの部分Ｄ
ＮＡ領域と、ＤＮＡ−ｂ配列とを連結させ、更にその５
´側に制限酵素Pst I認識用の８bpのＤＮＡ領域および
３´側に制限酵素BamHI認識用の９ bpのＤＮＡ領域を連
結させてなるＤＮＡ配列の塩基配列と一致するものと認
められた。ＤＮＡ断片−ｐ１の全体の内部に含まれるプ
ロモーターＤＮＡ領域(861 bpのサイズ）のＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１に記載された塩基配列を有する
と認められた。

【００３１】また、ＤＮＡ断片−ｐ２の塩基配列は、前
記のＤＮＡ−ａのαサブユニット遺伝子翻訳開始点から
393 bp下流までのＤＮＡ領域と、前記のＤＮＡ−ａのう
ちのプロモーターの部分ＤＮＡ領域と、ＤＮＡ−ｂ配列
と、Pst I 認識用の８bpのＤＮＡ領域とを連結させてな
るＤＮＡ配列の塩基配列と一致した。ＤＮＡ断片−ｐ２
の全体の内部に含まれるところの、プロモーターＤＮＡ
領域(861bpのサイズ）と翻訳開始点から393bp 下流まで
のＤＮＡ領域とを連結してなるＤＮＡ配列は、配列表の
配列番号２に記載された塩基配列を有すると認められ
た。

【００３２】また、このＰＣＲ法により増幅された上記
のＤＮＡ断片―ｐ１は、その中央部にプロモーターＤＮ
Ａ領域（861 bp)を含むものであり、しかも、プライマ
ーとなる前記オリゴヌクレオチドを設計する際に、その
ＤＮＡ−ｐ１断片の５´側に制限酵素PstI切断サイトを
含む８ bpのサイズのＤＮＡ領域が付き、また、３´側
に制限酵素BamHI切断サイトを含む９ bpのサイズのＤＮ
Ａ領域が付き且つ合計878 bpのサイズを有するように構
築されている。そして、このＤＮＡ―ｐ１断片をプラス
ミドベクターpBluescript SK（＋）のPst I およびBamH
I切断部位に挿入、連結する。こうして得られた組換え
ベクターpBluescript −ＤＮＡ−ｐ１を導入した大腸菌
XLＩ−BlueMRF´は、大腸菌Escherichia coli JM109/pA
SA2Pと命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に
1999年３月１日より、受託番号FERM P-17273として寄託
されている。

【００３３】（７）プロモーター活性の検定 前記で得られたところの、イネのゲノミックＤＮＡクロ
ーンから分離された前記のＤＮＡ断片―ｐ１における、
ＡＳの第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子のため
のプロモーター活性のあるＤＮＡ領域すなわち前記のプ
ロモーターＤＮＡ領域（861 bp）について、そのプロモ
ーターとしての機能を確認するために、その活性の検定
試験を次のように行った。

【００３４】すなわち、前記の計878 bpのサイズのＤＮ
Ａ断片-ｐ１を、レポーター遺伝子であるβ-グルクロニ
ダーゼ(GUS)遺伝子を保持する市販のpBI101プラスミド
ベクター(Clontech社製）の制限酵素切断部位に挿入す
ることによって、組換えプラスミドベクターを作成し
た。この組換えプラスミドベクターを常法により植物細
胞、例えばイネ培養細胞へ導入して、市販のGUS活性測
定キットにより、前記のＤＮＡ断片-ｐ１における該プ
ロモーターＤＮＡ領域(配列番号１のＤＮＡ配列）がGUS
活性の発現に有効であることを確認することができる
(詳細は後記の実施例２参照)。

【００３５】第１の本発明のＤＮＡ（配列番号１）に
は、植物と植物病原菌との感染および認識過程において
重要な役割をはたすエリシター、例えば非特異的エリシ
ターとして知られているキチン、グルカンや特異的エリ
シター、また、病害抵抗性誘導物質により誘導される領
域を結合できる。さらに、第１の本発明のＤＮＡ（配列
番号１）には傷害により誘導される領域を結合できる。

【００３６】なお、一般にプロモーター活性を有するＤ
ＮＡの塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠
失、置換、挿入若しくは付加された場合であっても、そ
のように改変されたＤＮＡにおいてもプロモーター活性
が維持される場合があることは当業者において広く認識
されているところである。第１の本発明のＤＮＡは、こ
のような改変による修飾が加えられて形成されて、かつ
植物細胞中および植物体中でプロモーター活性を有する
ＤＮＡ断片とすることが可能である。従って、第２の本
発明において、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に
ついて、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若
しくは付加されて形成された、かつプロモーター活性を
有するＤＮＡが第１の本発明のＤＮＡの改変によって得
られる。ここで言う「数個」とは、好ましくは２〜９
個、より好ましくは２〜４個である。そのような改変さ
れたＤＮＡが第２の本発明によるＤＮＡであり、これは
例えば部位特異的変異法によって、特定の部位の１個ま
たは数個の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加され
るように第１の本発明のプロモーターＤＮＡの塩基配列
（配列番号１）を改変することによって得られる。この
ように改変された第２の本発明のＤＮＡのプロモーター
活性は、上記と同様にしてそれの検定を行うことで確認
ができる。

【００３７】また、イネのＡＳ遺伝子またはこれを有す
る細胞に変異処理を行い、これらの遺伝子もしくは細胞
から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有
するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするけれども配列番号１の塩基配列と部分的に
異なる塩基配列を有するＤＮＡを選別することによって
も、第２の本発明の改変されたＤＮＡを得ることができ
る。

【００３８】ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値で特定化することは困難であるが、一例を
示せば、相同性が高い核酸同士、例えば97％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイズリダイズし、それより相
同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げ
られる。

【００３９】前記したＰＣＲ法増幅反応で得たＤＮＡ断
片−ｐ２は、３´−末端にApa Ｉ切断サイトを有し、ま
た前記のとおり、配列表の配列番号２に記載された塩基
配列（1254 bpのサイズ）を有する第３の本発明のＤＮ
Ａを内部に含有するＤＮＡ断片である。第３の本発明の
ＤＮＡには、イネのＡＳの第２アイソザテムのαサブユ
ニット遺伝子に対するプロモーター活性を有するプロモ
ーターＤＮＡ領域と、該プロモーターＤＮＡ領域に対す
るエクソン部分のＤＮＡ配列とが含有される。そのエク
ソン部分のＤＮＡ領域により翻訳されるアミノ酸配列
は、配列表の配列番号３に記載の131個のアミノ酸から
構成される。

【００４０】さらに、第１の本発明のＤＮＡ配列および
第３の本発明のＤＮＡ配列は、本発明を完成するに際し
ては、上記のようにしてゲノミックＤＮＡライブラリー
から遺伝子工学の手法により単離されたものであるが、
本発明により、そのＤＮＡの塩基配列が明らかにされた
ので、配列番号１または２に示す塩基配列に基づいて化
学合成することによっても取得することができる。ま
た、前記の塩基配列に基づいて作成した適当な合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いると、、公知の方法で
イネのゲノミックＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法の
利用により取得することもできる。

【００４１】

【発明実施の形態】以下に、本発明を、実施例を示して
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限
定されるものではない。なお、以下の実施例で行われる
実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Molecular
Cloning」第２版(J. Sambrookら、Cold Spring Habor L
aboratorypress, 1989年発行）に記載される方法に従っ
た。

【００４２】実施例１ （１）イネのゲノミックＤＮＡの調製 日本産イネ（品種：日本晴）のカルス２ｇから公知のＣ
ＴＡＢ法（「クローニングとシークエンス」、262頁〜2
64頁、1989年、農村文化社）に従い、ゲノミックＤＮＡ
の２mgを抽出した。

【００４３】（２）イネのゲノミックＤＮＡライブラリ
ーの構築 10マイクログラムの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素Sa
u2A Iで部分消化した後、得られたＤＮＡ断片を、クロ
ーニングキット（Lambda ZAP II／EcoRI／CIPCloning K
it(STRATGENE社製））を用いてファージベクターにライ
ゲーションした。得られた組換えベクターを、Gigapack
II Gold Packaging Extractを用いてラムダファージに
パッケイジングを行った。得られた組換えλファージ
を、大腸菌 XLI−BlueMRF´に感染させ増殖させて、前
記の組換えファージを多数得た。これらの得られた組換
えファージを、イネのゲノミックＤＮＡライブラリーと
して後記の工程で用いた。

【００４４】（３）プローブＤＮＡの作製 イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニットの遺伝
子に対するプロモーターＤＮＡ断片をクローニングする
ために用いるＤＮＡプローブを、ＰＣＲ法用に作製す
る。このために、先ずプライマー設計を行った。そのた
めには、まずアラビドプシス（和名：シロイヌナズナ）
のアントラニル酸シンターゼの第１アイソザイムＡＳＡ
１および第２アイソザイムＡＳＡ２のそれぞれのαサブ
ユニットをコードする公知の遺伝子の既知の塩基配列お
よび既知のアミノ酸配列を参考にして、下記に示す塩基
配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを、プライマ
ー１とプライマー２として化学合成により作成した。

【００４５】（１）プライマー１（配列表の配列番号
７）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）： ５´―ＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＡＣ−
３´ （２）プライマー２（配列表の配列番号８）に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド）： ５´―ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴ
ＧＣ−３´ なお、上記２種類のオリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮ
Ａ合成装置（Model 391,アプライドバイオシステムズ社
製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにその
合成品をイオン交換HPLCで精製することにより行った。

【００４６】次に、上記のように構築された２種類の合
成オリゴヌクレオチドの各10pMを、第１のプライマーお
よび第２のプライマーとして用い、またアラビドプシス
の市販されているｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社
製）の１μｌを、テンプレイトとして用いた。前記の第
１および第２プライマー、ならびにアラビドプシスのｃ
ＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲ法用の増幅反応液〔10mM
のTris−HCl(pH 8.3）、1.5mMのMgCl２、50mMのKCl、0.
001％ゼラチン、pH8.3 ;４種類のヌクレオチドdNTPの各
2.5mMの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼTakara Ex T
aq、2.5単位〕50μｌに加えて、次にＤＮＡの増幅反応
を行った。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキッ
ト（ＰＣＲ Amplification Kit（宝酒造（株）社製）に
より調製した。

【００４７】ＰＣＲ法によるＤＮＡの上記の増幅反応
は、ＰＣＲ反応装置（PERKIN ELMER社製、ＤＮＡ、The
Thermal Cycler 480）を用いて、変性を94℃、30秒間、
アニーリングを55℃、１分間、また伸張（extension)を
72℃、２分間行う３つの反応操作を、25回繰り返すこと
によって実施した。上記のようにすると、アラビドプシ
スＡＳＡ１およびＡＳＡ２の２つのアイソザイムのαサ
ブユニットをコードする遺伝子に相当するＤＮＡ配列の
うちの一部分を構成しているＤＮＡ断片の増幅生成物が
生成される。これらＤＮＡ断片の増幅生成物をプローブ
ＤＮＡとして採取する。そして、該プローブＤＮＡを、
イネのｃＤＮＡライブラリーのクローニングに下記の通
り用いた。

【００４８】（４）イネのゲノミックＤＮＡライブラリ
ーからのプロモーター遺伝子の選択 上記（３）でアラビドプシスの前記の市販ｃＤＮＡライ
ブラリーからＰＣＲ法により得られたプローブＤＮＡ
を、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして標識プロー
ブＤＮＡを得た。該プローブＤＮＡの標識はDIG−ELISA
DNA labeling &Detection Kit（ベーリンガー・マンハ
イム社製）により行った。上記（２）で作製したイネの
前記のゲノミックＤＮＡライブラリーであるところの組
換えファージから、上記の標識プローブＤＮＡの利用に
より、イネのＡＳの第２アイソザイムαサブユニットを
コードする遺伝子の発現のためのプロモーターの遺伝子
に相当するＤＮＡ配列を組み込まれた組換えファージ
を、スクリーニングする。

【００４９】この組換えファージの上記スクリーニング
は次のように行う。すなわち、まず前記のイネ・ゲノミ
ックＤＮＡライブラリーの組換えファージのプラークを
1.5％寒天培地上に形成させた後、それらのファージプ
ラークをナイロン膜（アマシャム社製）ハイボンドＮに
転写した。こうしてナイロン膜に転写された組換えファ
ージのプラークに含まれているファージＤＮＡは、アル
カリ変性液(1.5ＭNaCl、2.0Ｍ NaOH）および中和液（1.
0Ｍ Tris-HCl pH５，2.0 Ｍ NaCl）でそれぞれ10分間処
理し、その後にＵＶ照射によりナイロン膜上に固定し
た。

【００５０】前記の転写されたファージＤＮＡが固定さ
れたナイロン膜をハイブリダイゼーション溶液（500mM
Ｎａ−Ｐｉバッファー、pH 7.2、７％ＳＤＳ、１Mm EDT
A）に浸し、さらに65℃で、10分間、浸漬処理を行っ
た。次に前記のＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡ
（10ng／ml）を加え、65℃で、15時間インキュベートす
ると、前記のプラーク・ハイブリダイゼーション反応が
行われた。

【００５１】その反応終了後に、洗浄液（40mM Ｎａ−
Ｐｉバッファー、pH 7.2、１％ＳＤＳ）で前記のナイロ
ン膜を20分間ずつ３回洗浄した。その後、上記のDIG−E
LISADNA labeling & Detection Kitを用いて、イネのＡ
Ｓの第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子に対する
プロモーターをコードする遺伝子ＤＮＡを含有した目的
の組換えファージの検出を行った。この検出に際して、
前記の標識プローブＤＮＡがハイブリダイズしてＸ線フ
ィルムで強くシグナルを発している４個の組換えファー
ジプラーク、すなわちイネのＡＳの第２アイソザイムの
αサブユニット遺伝子に対するプロモーター遺伝子が組
み込まれていると思われる４個のファージプラークが30
万個のファージプラークから、ナイロン膜上で探知する
ことができた。そして該ナイロン膜上から、イネのＡＳ
の第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子のためのプ
ロモーター遺伝子が組み込まれていると思われる前記の
４個の組換えファージプラークを単離して選抜するこ
と、すなわちスクリーニングすることができた。

【００５２】これら採取された４個のプラークの組換え
ファージから、λＤＮＡ単離キット（Lambda DNA purif
ication Kit（STRATAGENE社製））により、それぞれに
ファージプラークの４個ごとに別々に、λＤＮＡを単離
した。この際の上記のλＤＮＡの単離は、次のようにし
て行った。すなわち、前記の４個のプラークの各々のフ
ァージをそれぞれ別々に大量に増殖させた。それぞれの
培養液５mlに、DNase I(20mg／ml）50μｌ、RNase A
（２mg／ml）200μｌを加え、室温で15分間放置した。

【００５３】得られたファージ増殖溶液を15000rpm、４
℃で10分間遠心分離した。得られた上清に80％DEAE−セ
ルロース25ml加え、室温で10分間インキュベートした。
このようにインキュベートされた混合液を遠心分離し、
得られた上清に 0.5Ｍ EDTA２ml、Pronase（50mg／ml）
770μｌを加え、37℃で15分間放置した。さらに、５％C
TAB溶液〔１％CTAB（Cetyltrimethyl-ammonium bromid
e)、50mM Tris−HCl、pH 8.0、10mM EDTA〕1.5 mlを加
えた。こうして得られた混合物を65℃、３分間処理した
後、氷中で５分間放置した。こうして得られたそれぞれ
の反応液に１／10容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエ
タノールを加え、−20℃で約６時間放置し、その後、得
られた溶液を遠心分離した。それぞれの溶液から沈殿し
たラムダファージＤＮＡの４種を別々に乾燥させて、５
mlの水にそれぞれ溶解して保存した。

【００５４】上記の操作により単離された４種類のラム
ダファージＤＮＡが得られた。これらファージＤＮＡの
各５μｌを、Ｈバッファー（宝酒造社製）中で制限酵素
EcoRＩの10ユニットで別々に消化して、得られた消化反
応液を別々に分析した。その消化反応液を低融点アガロ
ース電気泳動法により分画して、部分消化ＤＮＡ断片を
採取した。その結果、４種類のラムダファージＤＮＡの
消化反応液から、約6.5kbpのＤＮＡ断片であるＤＮＡ−
ａを含むバンドのゲル切片と、約 700bpのＤＮＡ断片で
あるＤＮＡ−ｂを含むバンドのゲル切片とをアガロース
ゲルから切りだすことができた。次に、これら２つのゲ
ル切片から、それぞれに、GENECLEAN IIKit（フナコシ
社製）により分離して、ＤＮＡ断片ＤＮＡ−ａの精製品
とＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｂの精製品を得た。

【００５５】上記のようにイネのＡＳの第２アイソザイ
ムのαサブユニット遺伝子に対するプロモーターに相当
するＤＮＡ配列の一部領域を含有すると判定されたＤＮ
Ａ断片として、前記の２種類のＤＮＡ断片の精製品（す
なわちＤＮＡ−ａと、ＤＮＡ−ｂ）が得られた。これら
を別々にプラスミドベクターpBluescript II SK(＋）の
EcoRＩ切断部位にＤＮＡリゲーションキット（宝酒造社
製）により挿入、連結した。これによって組換えプラス
ミドベクターpBluescript−ＤＮＡ−ａと、pBluescript
−ＤＮＡ−ｂとを構築した。このように構築された組換
えプラスミドベクターの導入で大腸菌XLＩ−BlueMRF´
を形質転換した。これによって、組換え大腸菌XLＩ−Bl
ueMRF´／pBluescript―ＤＮＡ−ａと 組換え大腸菌XL
Ｉ−BlueMRF´／pBluescript―ＤＮＡ−ｂとをそれぞれ
に得た。

【００５６】組換えプラスミドを導入した上記の２種の
組換え大腸菌を培養し、組換えプラスミドをクローニン
グした。それらの培養細胞から、プラスミド精製キット
（ＱＩＡ filter Plasmid Midi kit、ＱＩＡＧＥＮ社
製）により前記の組換えプラスミドpBluescript―ＤＮ
Ａ−ａおよびpBluescript―ＤＮＡ−ｂを分離且つ精製
した。この精製により、上記で得られた形質転換された
組換え大腸菌から、50μｇ（50μｌ）の前記の組換えプ
ラスミドＤＮＡの２種を得た。

【００５７】これらのプラスミドＤＮＡの塩基配列を解
析するために次の操作を行った。 （５）クローニングされたＤＮＡのシークエンス解析 上記のクローニングで得られた２種類の組換えプラスミ
ドの各ＤＮＡ断片は、これを市販の塩基配列決定キット
で処理すると、それらのプラスミドＤＮＡ断片の塩基配
列を決定できる。そして、それら２種のプラスミドＤＮ
Ａ断片の内部に含有されたところの、イネのＡＳの第２
アイソザイムのαサブユニット遺伝子に対するプロモー
ター遺伝子に該当するプロモーターＤＮＡ領域の塩基配
列を判定できる。上記のプラスミドＤＮＡ断片の塩基配
列の決定を行うに当たっては、塩基配列決定キット（Au
toread Sequencing kit (Pharmacia Biotech社製）を用
いて、変性処理を行った後に自動シーケンサＡＬＦ Ｄ
ＮＡ Sequencer II（ファルマシア社製）で前記のプラ
スミドＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。

【００５８】このようにして上記の２種のプラスミドＤ
ＮＡ断片の塩基配列を判定した結果、前記の２種類の組
換えプラスミドすなわちpBluescript―ＤＮＡ−ａおよ
びpBluescript―ＤＮＡ−ｂの各々のＤＮＡ配列は、一
部が共通するが互いに相異なる塩基配列を有するもので
あることが解った。ここで塩基配列決定キットでの処理
過程においてプラスミドの断片として得られたＤＮＡ断
片ＤＮＡ−ａ(約6.5kbp）の塩基配列は、公知のアラビ
ドプシスのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニット遺
伝子の既知の塩基配列との相同性からみて、イネのＡＳ
の第２アイソザイムのαサブユニットのタンパク質をコ
ードしているＤＮＡ領域の一部分を含み、またそれに、
追加的に、翻訳開始点から上流にあるプロモーター領域
のうちの約180 bpの部分ＤＮＡ領域を含んでいることが
解った。

【００５９】また、前記のＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｂ（約70
0 bp）は、ＡＳの第２アイソザイムのαサブユニットの
タンパク質をコードする部分のＤＮＡ領域を含んでいる
ことがないが、ＡＳの第２アイソザイムのαサブユニッ
ト遺伝子に対するプロモーターＤＮＡの全領域のうちの
一部分（700 bp）に相当するＤＮＡ領域であると推定さ
れた。

【００６０】（６）完全長のプロモーター遺伝子ＤＮＡ
の作成と単離 さらに、イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニッ
ト遺伝子に対する完全長のプロモーターＤＮＡの作成を
行った。この作成のためには、上記でクローニングされ
て塩基配列が決定された前記のＤＮＡ−ａ断片およびＤ
ＮＡ−ｂ断片の塩基配列をもとにプライマーを作製し、
ＰＣＲ法を行った。

【００６１】そのためには、まず、前記のＤＮＡ合成装
置を利用して３種類のプライマーを合成した。すなわ
ち、ＤＮＡ−ｂ断片の塩基配列から設計された配列表の
配列番号４に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドであるプライマー３（ＡＳＡ２ＰＮ）と、ＤＮＡ−
ａ断片の塩基配列から設計された配列表の配列番号５に
記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプ
ライマー４（ＡＳＡ２ＰＣ）と、同じくＤＮＡ−ａの塩
基配列から設計された配列表の配列番号６に記載する塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマー５
（ＡＳＡＳ４）を化学合成により構築した。

【００６２】次に、上記のように構築された３種類の合
成オリゴヌクレオチドを、プライマー３とプライマー４
の組み合わせ（第１の組み合わせ）、プライマー３とプ
ライマー５の組み合わせ（第２の組み合わせ）とでＰＣ
Ｒ増幅反応を行った。プライマー各10pMを用い、上記
（１）で得られたイネのゲノミックＤＮＡをテンプレイ
トとして用いて、上記（３）と同様の方法でそれぞれの
組み合せに従ってＰＣＲ増幅反応をおこなった。

【００６３】それら増幅反応終了後、反応液を低融点ア
ガロース電気泳動により分画し、いずれの組み合せの増
幅反応においても増幅生成物が得られた。第１の組み合
わせにおいては、約878 bpのサイズの第１のＤＮＡ断片
（すなわちＤＮＡ断片−ｐ１）を含むバンドを切り出し
た。第２の組み合わせにおいては約1262 bpのサイズの
第２のＤＮＡ断片（すなわちＤＮＡ断片−ｐ２）を含む
バンドを切り出した。これら第１、第２ＤＮＡ断片を含
むのゲル切片からそれぞれＤＮＡ断片−ｐ１の精製品お
よびＤＮＡ断片−ｐ２の精製品を得た。

【００６４】ＤＮＡ断片−ｐ１の精製品をプラスミドベ
クターpBluescript II SK(＋）の制限酵素PstＩおよびB
amHＩ切断部位に前記と同様の方法により挿入、連結す
る。このようにして組換えプラスミドベクターpBluescr
ipt―ＤＮＡ−ｐ１を構築した。このように構築された
組換えプラスミドベクターの導入で大腸菌XLＩ−BlueMR
F´を形質転換して、組換え大腸菌XLＩ−BlueMRF´／pB
luescript―ＤＮＡ−ｐ１(大腸菌JM109/pASA2Pと称す；
FERM P−17273 として寄託）を得た。

【００６５】また、同様にＤＮＡ断片−ｐ２の精製品を
プラスミドベクターpBluescript IISK(＋）の制限酵素P
stＩおよびApaI切断部位に挿入、連結した。こうして、
組換えプラスミドベクターpBluescript―ＤＮＡ−ｐ２
を構築した後、これで形質転換された組換え大腸菌XLＩ
−BlueMRF´／pBluescript―ＤＮＡ−ｐ２を得た。これ
ら組換えプラスミドベクターを導入した上記の２種の組
換え大腸菌を培養してプラスミドをクローニングした。
培養された細胞から、前記と同様の方法により、前記の
組換えプラスミドpBluescript―ＤＮＡ−ａおよびpBlue
script―ＤＮＡ−ｂのそれぞれ50μｇ（50μｌ）の組換
えプラスミドＤＮＡを得た。

【００６６】このようにして大量に得た前記の２種の組
換えプラスミドＤＮＡの全体の塩基配列を塩基配列決定
キットにより決定した。その結果、前記の一方の組換え
プラスミドを酵素PstＩとBamHIとで切断して得られる前
記ＤＮＡ断片−ｐ１は、そのサイズが878 bpであって、
そして前記で得られたＤＮＡ−ｂの全ＤＮＡ領域（約70
0 bp）に対して、約6.5 kbpのサイズのＤＮＡ断片とし
てのＤＮＡ−ａの中における翻訳開始点から上流への約
180 bpまでのサイズのＤＮＡ領域と、５´側におけるPs
tＩ認識用の８ bpサイズのＤＮＡ領域と３´側における
BamHI認識用の９ bpのＤＮＡ領域とを結合させてなる構
造にほぼ該当することが判明した。

【００６７】ＤＮＡ断片−ｐ１は、イネのＡＳの第２ア
イソザイムのαサブユニット遺伝子に対するプロモータ
ーＤＮＡ領域（861 bp)を内部に含有するものであるこ
とが別段の研究から解った。ＤＮＡ断片−ｐ１内に含有
された該プロモーターＤＮＡ領域（861 bpサイズ）の塩
基配列は、配列表の配列番号１に示す。

【００６８】また、前記の他方の組換えプラスミドを酵
素PstＩとBam HIとで切断して得られる前記ＤＮＡ断片
−ｐ２は、それのサイズが約1262 bpであり、そして前
記で得られたＤＮＡ断片−ｐ１の５´側から869 bpまで
のＤＮＡ領域を含み、またＤＮＡ−ａのうちの翻訳開始
点から下流への翻訳領域のうちの約393 bpのＤＮＡ領域
を含む構造にほぼ該当することが判明した。

【００６９】ＤＮＡ断片−ｐ２は、イネのＡＳの第２ア
イソザイムのαサブユニット遺伝子に対する前記プロモ
ーターＤＮＡ領域（861bp のサイズ）を、ＤＮＡ断片−
ｐ１と共通に同じく含み、またＡＳの第２アイソザイム
のαサブユニット遺伝子の翻訳領域の一部分を含んで成
るＤＮＡ配列であることが解った。このＤＮＡ断片−ｐ
２であるＤＮＡは、イネのＡＳの第２アイソザイムのα
サブユニット遺伝子に対する該プロモーターＤＮＡ領域
（861 bpのサイズ）を内部に含み、さらに該プロモータ
ー活性ＤＮＡ領域に対するエクソン部のＤＮＡ配列を内
部に含んでなるＤＮＡ配列（配列表の配列番号２のＤＮ
Ａ）を内部に含有するものであることが認められる。

【００７０】実施例２ プロモーター活性の検定 １）上記の実施例１、（６）で得られたＤＮＡ断片−ｐ
１中に内在するところの、プロモーターＤＮＡ領域（86
1 bp）(配列番号１）を内部に含むＤＮＡ断片−ｐ１の
プロモーター活性を調べるために、このＤＮＡ断片−ｐ
１（すなわち、前記のクローニングで得られた組換えプ
ラスミドベクターpBluescript―ＤＮＡ−ｐ１を酵素お
よびPstI−BamHIで切断したＤＮＡ断片に相当）を、植
物細胞形質転換用ベクターpBI221（Clontech社製）のβ
―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の上流部分に組み
込むことにより、形質転換用ベクターを得た。

【００７１】形質転換用ベクターの作製は、pBI221のＤ
ＮＡ（10μｇ）を、Ｈバッファー中で制限酵素PstIおよ
びBamHI の10ユニットで消化した。その消化液をアガロ
ース電気泳動により約4.8 kbp付近をゲルから切り出
し、ＤＮＡ精製キットを用いて精製した後、10μｌの滅
菌水に溶解した。このようにして4.8 kbpのサイズを有
するベクター断片を得た。

【００７２】このプラスミドベクター断片溶液の５μｌ
と、上記のＤＮＡ断片−ｐ１であるＤＮＡ断片の５μｌ
とを混合した後、この混合液をＤＮＡリゲーションキッ
トで処理してＤＮＡの連結を行った。

【００７３】このようにして、プラスミドベクターpBI2
21の切断断片に対して、前記のイネのＡＳの第２アイソ
ザイムαサブユニット遺伝子のプロモーターＤＮＡ領域
（861 bp）を内部に含むＤＮＡ断片−ｐ１のＤＮＡ配列
を連結してなる環状の組換えプラスミドを作製した。こ
の組換えプラスミドをpASA2PGUSと称する。

【００７４】ベクターpASA2PGUSは、イネのＡＳの第２
アイソザイムのαサブユニット遺伝子のためのプロモー
ターＤＮＡ領域(861bp)の下流に、ＧＵＳ遺伝子を持
ち、さらに下流にＮＯＳターミネーターが連結されて成
り、5.6kbpのサイズを有する。

【００７５】２）イネのカルス細胞への検定用組換えベ
クターの導入 上記で作製して得られた組換えベクターpASA2PGUSをイ
ネのカルス細胞への導入を行った。

【００７６】まず、日本産イネ（品種：日本晴）の完熟
種子から籾殻を取り除いた。得られた種子を70％エタノ
ール溶液に１分間、ついで次亜塩素酸ナトリウム１％
（有効塩素濃度）溶液に60分間しんせきして種子を殺菌
処理した。公知のＭＳ培地の無機成分組成にショ糖30ｇ
／ｌ、植物ホルモンとして2,4−Ｄ ２mg／ｌ、寒天８ｇ
／ｌを添加してなる培地に、上記で殺菌したイネ種子を
置床した。28℃で45日間、2000ルックスの光を１日あた
り16時間照明しながらインキュベートした。カルスが形
成された後、それらカルスを胚乳部分から切り出し、孔
１mmのステンレスメッシュの篩をもちいて、１mm以下の
カルスをＰＣＶ(Paked Cell Volume;圧縮細胞量)として
３mlの量を得た。

【００７７】チタン酸カリウム製ウイスカＬＳ２０（チ
タン工業社製）５ｇを1.5 ml容のチューブにいれ、１時
間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させ
て、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入った
チューブに滅菌水１mlを入れ、よく攪拌した。ウイスカ
と滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このように
してウイスカを洗浄した。このウイスカ洗浄操作を３回
行った。その後、同チューブに公知のＲ２液体培地の0.
5mlを加えてウイスカ懸濁液を得た。

【００７８】上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチ
ューブに、１ mm以下のイネのカルスを250μｌ入れて攪
拌した。その後、その混合物を1000 rpmで10秒間遠心分
離し、カルスとウイスカを沈殿させ、上清を捨て、カル
スとウイスカの混合物を得た。この混合物を入れたチュ
ーブに、前記の組換えベクター（すなわち前記の組換え
プラスミドpASAP2GUS)の10μｌ（10μｇ）および形質転
換細胞の選抜用マーカーベクターとして公知の組換えベ
クターｐＣＨ（ハイグロマイシン耐性）とを加え、十分
振り混ぜて均一な混合物を得た。次にこの均一な混合物
の入ったチューブを、18000 × ｇで５分間遠心分離し
た。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３
回反復した。

【００７９】上記のようにして得られた、カルス細胞
と、ウイスカと、第１の本発明のＤＮＡ配列（配列番号
１）を含有する組換えプラスミドと、ベクターpCH を収
容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが
十分浸かるように設置した。周波数40 kHzの超音波を強
度0.25ｗ／cm^２で１分間照射した。照射後、30分間、４
℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した
混合物を、前記のＲ２液体培地で洗浄し、組換えベクタ
ーpASAP2GUS およびpCH が導入された目的の形質転換細
胞を得た。

【００８０】上記で組換えプラスミドおよびベクターを
導入して得た形質転換細胞を有するカルスを、3.5cmシ
ャーレに入れた。さらに、Ｒ２培地の無機成分組成にシ
ョ糖30ｇ／ｌと2,4-Ｄ ２mg／ｌを添加して得た液体培
地を３ ml加えた。その後に、28℃で2000ルックスの光
を１日当たり16時間照射しながらロータリーシェーカー
（50rpm)上でカルス細胞を培養しながら分裂細胞を得
た。

【００８１】培養３日目に、得られた分裂細胞のけんだ
く液３mlを、公知のＮ６培地の無機成分組成に、ショ糖
30g／ｌ、2，4-Ｄ 2mg／ｌ、ゲルライト３ｇ／ｌおよび
選抜用薬剤としてハイグロマイシン30mg／ｌを添加して
なる培地上に均一の広げた。培地上の細胞を、28℃で20
00ルックスの光を１日当たり16時間照射しながら１ヶ月
間培養した。１ヶ月後に、ハイグロマイシン含有培地上
で健全に生育している形質転換カルスを選抜し、組換え
プラスミドpASAP2GUS およびベクターpCH で形質転換さ
れているイネのカルス細胞を得た。

【００８２】３）ＧＵＳ活性の測定 上記で得られた組換えプラスミドpASAP2GUS で形質転換
されたイネのカルスにおけるＧＵＳ染色を、公知の方法
（「Plant Genetic Transformation and GeneExpressio
n A laboratory manual，324頁〜327頁、Blackwell Sie
ntificPublications ＬＴＤ）に準じて行った。

【００８３】すなわち、上記の形質転換したイネのカル
スを、28℃で３日間培養した後、カルス塊（0.5g）を24
個取り出し24穴のマイクロプレートに入れ、染色用バッ
ファー〔２mM Ｘ−Gluc（５-ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸）、50mM Na２PO
４、pH7.0）を 100μｌずつ添加して浸漬した。37℃で
一晩保温した後、カルスにエタノールを 100μｌずつ添
加して染色バッファーを取り除き、この操作を３回繰り
返した。その後、イネのカルス細胞の青色色素の沈着程
度（染色の程度）を調査した。対照区として、形質転換
していないイネのカルスを用いた。結果を表１に示す。

【００８４】 〔表１〕 染色の程度（カルス数） 濃 薄 無 本発明区（プラスミドｐＡＳＡ２ＰＧＵＳを ２０ ４ ０ 導入されたカルス細胞） 非形質転換カルス細胞区（対照区） ０ ０ ２４ 調査基準 濃 ： カルス細胞全体が濃く染色されている。 薄 ： カルス細胞の一部が染色されている。 無 ： 染色されていない。

【００８５】上記のように本発明区の形質転換されたカ
ルス細胞は青色に染色されてＧＵＳ活性が発現されたこ
とを示す。このことにより、塩基配列の解析の結果から
確認されたプロモーター領域それ自体に該当するＤＮＡ
配列である第１の本発明のＤＮＡは、プロモーターとし
て機能したことが証明される。

【００８６】さらに、本発明者は別段の研究を進めた。
その研究に当たって、前記の実施例１（４）で得られた
ところの、組換えラムダファージＤＮＡ断片としてのＤ
ＮＡ断片ＤＮＡ−ｂ（約700 bpのサイズ；実施例（５）
参照）を、それからの標識プローブＤＮＡの作成に用
い、しかもインド産イネから作られた組換えラムダファ
ージの形のゲノミックＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴ
ＥＣＨ社製）を用いて前記の標識プローブとのハイブリ
ダイゼーション反応を行う実験、およびその他の一連の
実験を行った。

【００８７】その結果、配列表の配列番号１に記載の塩
基配列を有するプロモーターＤＮＡ（861 bpのサイズ）
に比べて塩基配列の一部および塩基数の点で若干相違す
るけれども、イネのＡＳの第２アンソザイムαサブユニ
ット遺伝子に対するプロモーター活性を示すことのでき
る856 bpのサイズのプロモーターＤＮＡ領域を内部に含
有し且つ該プロモーターＤＮＡ領域までの上流ＤＮＡ領
域（648 bpのサイズ）ならびに該プロモーターＤＮＡ領
域の下流のエクソン部のＤＮＡ領域（157 bpのサイズ）
を内部に含有する1660bpのサイズのＤＮＡ断片ＤＮＡ−
ｃを得ることに成功した。このＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｃの
塩基配列を配列表の配列番号９に示す。

【００８８】従って、第６の本発明においては、配列表
の配列番号９に記載された1660bpのサイズの塩基配列の
649番目のｇから1503番目のａまでの856 bpのサイズの
塩基配列を有するＤＮＡであって、このＤＮＡは、イネ
のアントラニル酸シンターゼの第２アイソザイムのαサ
ブユニットをコードする遺伝子に対するプロモーター活
性を有するプロモーターＤＮＡ領域であることを特徴と
する、前記プロモーター活性を有するＤＮＡが提供され
る。

【００８９】さらに第７の本発明においては、配列表の
配列番号９に記載された1660bpのサイズの塩基配列を有
するＤＮＡであって、このＤＮＡの内部には、配列番号
９の塩基配列の649番目のｇから1503番目のａまでの856
bpのサイズの塩基配列を有して、且つイネのアントラ
ニル酸シンターゼの第２アイソザイムのαサブユニット
をコードする遺伝子に対するプロモーター活性を有する
プロモーターＤＮＡ領域を含み、さらに該プロモーター
ＤＮＡ領域の上流で配列番号９の塩基配列の１番目のｔ
から648番目のｔまでの上流ＤＮＡ領域を含み、また該
プロモーターＤＮＡ領域に対するエクソン部として、配
列番号９の塩基配列の1504番目のａから1660番目のｇま
でのＤＮＡ配列を含むＤＮＡが提供される。

【００９０】第６の本発明によるプロモーターＤＮＡを
見出した実験、ならびにプロモーター上流ＤＮＡ領域、
プロモーターＤＮＡ領域およびエクソンＤＮＡ領域より
なる第７の本発明のＤＮＡを得た実験の詳細を、後記の
実施例３で具体的に説明する。

【００９１】実施例３ （１）イネのゲノミックＤＮＡライブラリーからのプロ
モーター遺伝子およびプロモーターの上流域遺伝子の選
択 イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子
に対するプロモーターＤＮＡ領域およびプロモーターの
上流のＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片をクローニングする
ために用いるＤＮＡプローブを次のとおり作成する。す
なわち、実施例１（４）で単離した組換えラムダファー
ジＤＮＡ断片であるＤＮＡ−b（約700bp）を、ジゴキシ
ゲニン（DIG）でラベルして標識プローブＤＮＡを得
た。該プローブＤＮＡの標識はDIG-ELISA DNA labeli
ng ＆ Detection Kit（RocheDiagnostics社製）によ
り行なった。

【００９２】インド産イネOryza sativa（L.indica.va
r.IR36）のゲノミックＤＮＡライブラリー（組換えラム
ダファージの形でＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）から、上記の
標識プローブＤＮＡの利用により、実施例１（４）と同
様に、イネのＡＳの第２アイソザイムαサブユニットを
コードする遺伝子の発現のためのプロモーターＤＮＡ領
域およびその上流のＤＮＡ領域に相当するＤＮＡ配列を
組み込まれた組換えファージを選択する方法を行った。
実施例１（４）と同様な方法により選択した結果、3０
万個の組換えファージプラークから、ＡＳの第２アイソ
ザイムのαサブユニット遺伝子のプロモーターＤＮＡ領
域およびそれの上流のＤＮＡ領域を含むＤＮＡ配列が組
み込まれたと判定できたファージプラークの６個を、単
離して選抜できた。

【００９３】これら採取された６個のプラークの組換え
ファージの各々から、λＤＮＡ単離キット(Lamda DNA p
urification Kit STRATGENE社製)により、それぞれに
ファージプラークの６個ごとに別々に、λＤＮＡを単離
した。この際の上記のλＤＮＡの単離は、実施例１
（４）と同様な方法により行なった。

【００９４】上記の操作により単離された６種類のファ
ージＤＮＡが得られた。これらファージＤＮＡの各５μ
lを、Tバッファー（宝酒造社製）中で制限酵素XbaIとSa
cIIの各10ユニットで消化して、得られた消化反応液を
別々に次のとおり分析した。すなわち、その消化反応液
を低融点アガロース電気泳動法にかけて前記ファージＤ
ＮＡの消化ＤＮＡ断片を分画した。その結果、６種類の
ファージＤＮＡの消化反応液のそれぞれの電気泳動アガ
ロースゲルから、約1.7 KbpのＤＮＡ断片として、ＤＮ
Ａ断片ＤＮＡ−ｃを含むバンドのゲル切片を切り出し
た。次に、そのゲル切片からGenecleanII Kit（フナコ
シ社製）により分離し精製して、ＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｃ
の精製品を得た。

【００９５】上記のようにして得られたＤＮＡ断片ＤＮ
Ａ−ｃの精製品は、イネのＡＳの第２アイソザイムのα
サブユニット遺伝子に対するプロモーターＤＮＡ領域お
よびそれの上流のＤＮＡ領域に相当するＤＮＡ配列の一
部分を含有すると判定できたＤＮＡ断片である。このＤ
ＮＡ−ｃの精製品をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）により、プラスミドベクターpBluescript SK
(−)のXbaIとSacII切断部位に挿入、連結した。これに
よって、組換えプラスミドベクターpBluescript−ＤＮ
Ａ−ｃを構築した。この構築された組換えプラスミドベ
クターの導入で大腸菌JM109を形質転換した。これによ
って、組換え大腸菌JM109／pBluescript−ＤＮＡ−ｃを
得た。

【００９６】上記の組換えプラスミドベクターを導入し
た上記の組換え大腸菌JM 109／pBluescript−ＤＮＡ−
ｃを培養した。その培養細胞から、プラスミド精製キッ
ト(QIA filter Plasmid Midi kit、QIAGEN社製)によ
り、前記のようにしてクローニングされた組換えプラス
ミドを分離且つ精製した。この精製により、上記で得ら
れた形質転換された組換え大腸菌から、50μg(50μl)の
組換えプラスミドpBluescript−ＤＮＡ−ｃのＤＮＡを
得た。このプラスミドpBluescript−ＤＮＡ−ｃのＤＮ
Ａの塩基配列を解析するために、次の操作を行なった。

【００９７】（２）クローニングされたＤＮＡのシーク
エンス解析 上記のクローニングで得られたＤＮＡである組換えプラ
スミドpBluescript−ＤＮＡ−ｃのＤＮＡは、これを市
販の塩基配列解析キットで処理すると、そのプラスミド
ＤＮＡの塩基配列を決定できる。そして、そのプラスミ
ドＤＮＡ断片の内部に含有されたところの、イネＡＳの
第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子に対するプロ
モーター遺伝子に該当するプロモーターＤＮＡ領域の塩
基配列を判定できた。上記のプラスミドＤＮＡ断片の塩
基配列の決定は、実施例１（５）と同様な方法で行なっ
た。

【００９８】このようにすると、上記のＤＮＡ断片ＤＮ
Ａ−ｃの塩基配列を判定できた。その結果、前記のＤＮ
Ａ−ｃの断片は、実施例１（５）に記載の２種類のＤＮ
Ａ配列ＤＮＡ−aおよびＤＮＡ−bと一部が共通するが、
さらにそのプロモーターＤＮＡ領域の上流にあるＤＮＡ
領域をも含むＤＮＡ断片であることが解った。また、こ
のＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｃは、全体で1660bpのサイズを有
し、しかもイネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニ
ット遺伝子のエクソン部の一部分（157bp）を内部に含
み、さらにそのαサブユニット遺伝子の翻訳開始点の前
にプロモーター遺伝子の全ＤＮＡ領域とそれの上流域の
部分ＤＮＡ領域との両方（計1503bp）を内部に含んでい
ることが解った。前記のＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｃ(1660bp
のサイズ)の塩基配列の全体を配列表の配列番号９に記
載する。

【００９９】前記の組換えベクターpBluescript−ＤＮ
Ａ−ｃを導入した大腸菌JM109 pBluescript−ＤＮＡ−
ｃは、大腸菌Escherichia coli JM109/pＡＳA2P2として
命名され、工業技術院生命工学技術研究所に2000年2月1
5日より、受託番号FERMP-17735として寄託されている。

【０１００】（３）プロモーター活性検定用ベクターの
構築 上記で得られたＤＮＡ断片ＤＮＡ−ｃは、その中に内在
するプロモーター活性を有するプロモーターＤＮＡ領域
を内部に含むＤＮＡ断片(配列番号９)である。その内部
のプロモーターＤＮＡ領域のプロモーター活性を調べる
ために、このＤＮＡ断片ＤＮＡ−c（すなわち、前記で
得られた組換えプラスミドpBluescript−ＤＮＡ−ｃを
制限酵素XbaIと、SacIIで消化したＤＮＡ断片に相当）
を組込まれたプロモーター活性測定用プラスミドベクタ
ーを後記のように作成した。

【０１０１】すなわち、植物細胞形質転換用ベクターpI
G121Hm(Plant Cell Physiology、31巻６号，805-813ペ
ージ(1990))を、Ｔバッファー（宝酒造社製）中で制限
酵素XbaIとSacIの各10ユニットで消化した。その消化液
から、レポーター遺伝子であるβグルクロニターゼ(int
ronGUS)を含む、約2.2KbpのＤＮＡ断片を、低融点アガ
ロース電気遊動法により採取し、ＤＮＡ精製キットを用
いて分離精製した。この約2.2KbpのＤＮＡ断片を、植物
細胞形質転換用ベクターpBI221(Clontech社製)のXbaIと
SacI切断部位に、ＤＮＡライゲーションキットを用いて
挿入連結した、βグルクロニターゼ(intronGUS)を含む
植物形質転換用ベクターpBIG221を作成した。

【０１０２】上記のように作成したベクターpBIG221をK
バッファー（宝酒造社製）中で制限酵素BamHIの10ユニ
ットで消化し、さらにKlenow Fragmentの10ユニット
（宝酒造社製）によりＤＮＡ切断末端の平滑化反応を行
なった。反応後に、ＤＮＡ精製キットを用いて精製し
た。得られたBamHI消化ＤＮＡ断片（末端平滑化したも
の）をMバッファー（宝酒造社製）中で制限酵素HindIII
の10ユニットで消化した。その消化液をアガロース電気
泳動により約5.0Kbp付近のＤＮＡのバンドをゲルから切
り出し、ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。BamHI−H
indIIIで消化されたpBIG221ＤＮＡ断片（ＤＮＡ−Ｘと
称す）を得た。これを10μlの滅菌水に溶解した。

【０１０３】前記の組換えプラスミドベクターpBluescr
ipt−ＤＮＡ−ｃを、Tバッファー（宝酒造社製）中で制
限酵素SacIIの10ユニットで消化した後、T4 ＤＮＡPoly
merase（宝酒造社製）の10ユニットでＤＮＡ切断末端の
平滑化を行なった。その反応液はＤＮＡ精製キットを用
いて精製した後、平滑化されたＤＮＡ断片をMバッファ
ー（宝酒造社製）中で制限酵素HindIIIの10ユニットで
消化した。その消化液をアガロース電気泳動にかけ、約
1.7Kbp付近のバンドをゲルから切り出した。切り出され
たバンドのＤＮＡをＤＮＡ精製キットを用いて精製し
た。これによって、プラスシドベクターpBluescript−
ＤＮＡ−ｃをSacIIとHindIIIで消化した約1.7KbpのＤＮ
Ａ断片（ＤＮＡ−Ｙと称す）を得た。これを10μlの滅
菌水に溶解した。

【０１０４】このプラスミド断片ＤＮＡ−Ｙの溶液と、
前記のベクターpBIG221の消化断片ＤＮＡ−Ｘの各５μl
を混合した後、この混合液をＤＮＡライゲーションキッ
トで処理してＤＮＡの連結を行なった。このようにし
て、プラスミドベクターpBIG221由来のＤＮＡ断片ＤＮ
Ａ−ＸのHindIII切断部位に対して、前記のＡＳの第２
アイソザイムのαサブユニット遺伝子のプロモーターＤ
ＮＡ領域とその上流のＤＮＡ領域とを内部に含むＤＮＡ
断片ＤＮＡ−ｃ（配列番号９）を含有するＤＮＡ配列Ｄ
ＮＡ−Ｙを連結してなる環状の組換えプラスミドベクタ
ーが作成された。この組換えプラスミドをpASA2PIGと称
する。

【０１０５】ベクター pASA2PIG は、それの内部には、
イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブユニット遺伝子
のプロモーターＤＮＡ領域の下流に、intronGUS 遺伝子
を持ち、さらにその下流に NOS ターミネーターを連結
されて含有しているものであり、その全体は6.7Kbpのサ
イズを有する。

【０１０６】（４）イネのカルス細胞への検定用ベクタ
ーの導入 上記で作成して得られた組換えベクターpASA2PIGを、実
施例２（２）の方法により、イネのカルス細胞へ導入し
た。そして、形質転換されたカルスのGUS活性の測定を
行なった。その結果を表２に示す。

【０１０７】 ［表２］ 染色の程度（カルス数） 濃 薄 無 本発明区（プラスミドpASA2PIGを ３０ ２ ０ 導入された形質転換カルス細胞） 非形質転換カルス細胞区（対照区） ０ ０ ２０ 調査基準 濃：カルス細胞全体が濃く染色されている。 薄：カルス細胞の一部が染色されている。 無：染色されていない。

【０１０８】上記のように本発明区の形質転換カルス細
胞は、青色に染色されてGUS活性が発現されたことを示
す。このことにより、塩基配列の解析の結果から確認さ
れたプロモーター領域に該当するＤＮＡ配列である第６
の本発明のＤＮＡ（配列番号９）は、プロモーターとし
て機能したことが証明される。

【０１０９】

【発明の効果】イネのＡＳの第２アイソザイムのαサブ
ユニット遺伝子に対するプロモーター活性を有するプロ
モーターＤＮＡ領域に該当する第１の本発明および第６
の本発明のＤＮＡは、植物体中で外来の有用遺伝子の発
現を行う際のプロモーターとして利用することができ、
そして形質転換植物を作出するのに有用である。

【０１１０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hokko Chemical Industry Co., Ltd. MINISTRY OF AGRICULTURE, FORESTRY AND FISHERIES <120> Promoter for alpha-subunit gene of a second isozyme of anthranilate synthase of rice <130> 1497 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 861 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> STRANDNESS: double <220> <223> TOPOLOGY: linear <220> <223> MOLECULE TYPE : DNA(genomic) <400> 1 gaattcaaga tgggttccgt tcggcttgag gggaacaata aggtggccaa acgaggttga 60 cctcgaatta ttccctttcc ctgatacaca cgctagagga ggagatgggt tggtagaggg 120 gagggaacgc gcgacggtgg cgaggggata gggagagatg gccgccggag aggtggaggt 180 ggatcagtga ccatcgtggt taggctcatt tcattgaaaa tgagtgagtg gagaggggaa 240 gggagaaggg taagctgatc aaaattttta atgaatccac cagatagata tataaaatag 300 taatatatca aaaataattg taaaattcaa ataggaatag taaataacaa tgatatattt 360 taaaataggt aagtttataa ggggaaatat gtagtggaaa cttaaaaaat acaatacagt 420 tggatcgaaa aatggacgtc cgacatttat ccacgtcatc acgatttact catgagtact 480 tatgatgatg tgaacaaatc tcgtacattt tattttttat tgtaatttta agtttccacg 540 tatttttccc agtttataat ggcaccatct ccctctcccc atcgaggaag agtaaaccca 600 aaaacccatc tcgctagccg ccgccggcca caaccattcc tcacgacggg aggaagacga 660 aaaaaaaaaa aatcccactc cgtgttggta aaatccgact accacttcgg cctgtctcaa 720 tccaagaatt caagaatcga actcctttgg ggtcgcctcg ctgaatcttc cttatatata 780 cgcgctctcc cattcgcgtg tgctccaaat cgtagtgggg ggaagtggag ttgacgagct 840 gtggaaaaaa agcctatcgc a 861

【０１１１】 <210> 2 <211> 1254 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (862)..(1254) <220> <223> STRANDNESS: double <220> <223> TOPOLOGY: linear <220> <223> MOLECULE TYPE : DNA(genomic) <400> 2 gaattcaaga tgggttccgt tcggcttgag gggaacaata aggtggccaa acgaggttga 60 cctcgaatta ttccctttcc ctgatacaca cgctagagga ggagatgggt tggtagaggg 120 gagggaacgc gcgacggtgg cgaggggata gggagagatg gccgccggag aggtggaggt 180 ggatcagtga ccatcgtggt taggctcatt tcattgaaaa tgagtgagtg gagaggggaa 240 gggagaaggg taagctgatc aaaattttta atgaatccac cagatagata tataaaatag 300 taatatatca aaaataattg taaaattcaa ataggaatag taaataacaa tgatatattt 360 taaaataggt aagtttataa ggggaaatat gtagtggaaa cttaaaaaat acaatacagt 420 tggatcgaaa aatggacgtc cgacatttat ccacgtcatc acgatttact catgagtact 480 tatgatgatg tgaacaaatc tcgtacattt tattttttat tgtaatttta agtttccacg 540 tatttttccc agtttataat ggcaccatct ccctctcccc atcgaggaag agtaaaccca 600 aaaacccatc tcgctagccg ccgccggcca caaccattcc tcacgacggg aggaagacga 660 aaaaaaaaaa aatcccactc cgtgttggta aaatccgact accacttcgg cctgtctcaa 720 tccaagaatt caagaatcga actcctttgg ggtcgcctcg ctgaatcttc cttatatata 780 cgcgctctcc cattcgcgtg tgctccaaat cgtagtgggg ggaagtggag ttgacgagct 840 gtggaaaaaa agcctatcgc a atg gag tcc atc gcc gcc gcc acg ttc acg 891 Met Glu Ser Ile Ala Ala Ala Thr Phe Thr 1 5 10 ccc tcg cgc ctc gcc gcc cgc ccc gcc act ccg gcg gcg gcg gcg gcc 939 Pro Ser Arg Leu Ala Ala Arg Pro Ala Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala 15 20 25 ccg gtt aga gcg agg gcg gcg gta gcg gca gga ggg agg agg agg acg 987 Pro Val Arg Ala Arg Ala Ala Val Ala Ala Gly Gly Arg Arg Arg Thr 30 35 40 agt agg cgc ggc ggc gtg agg tgc tcc gcg ggg aag cca gag gca agc 1035 Ser Arg Arg Gly Gly Val Arg Cys Ser Ala Gly Lys Pro Glu Ala Ser 45 50 55 gcg gtg atc aac ggg agc gcg gcg gcg cgg gcg gcg gag gag gac agg 1083 Ala Val Ile Asn Gly Ser Ala Ala Ala Arg Ala Ala Glu Glu Asp Arg 60 65 70 agg cgc ttc ttc gag gcg gcg gag cgt ggg agc ggg aag ggc aac ctg 1131 Arg Arg Phe Phe Glu Ala Ala Glu Arg Gly Ser Gly Lys Gly Asn Leu 75 80 85 90 gtg ccc atg tgg gag tgc atc gtc tcc gac cac ctc acc ccc gtg ctc 1179 Val Pro Met Trp Glu Cys Ile Val Ser Asp His Leu Thr Pro Val Leu 95 100 105 gcc tac cgc tgc ctc gtc ccc gag gac aac atg gag acg ccc agc ttc 1227 Ala Tyr Arg Cys Leu Val Pro Glu Asp Asn Met Glu Thr Pro Ser Phe 110 115 120 ctc ttc gag tcc gtc gag cag ggg ccc 1254 Leu Phe Glu Ser Val Glu Gln Gly Pro 125 130

【０１１２】 <210> 3 <211> 131 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 3 Met Glu Ser Ile Ala Ala Ala Thr Phe Thr Pro Ser Arg Leu Ala Ala 1 5 10 15 Arg Pro Ala Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Val Arg Ala Arg Ala 20 25 30 Ala Val Ala Ala Gly Gly Arg Arg Arg Thr Ser Arg Arg Gly Gly Val 35 40 45 Arg Cys Ser Ala Gly Lys Pro Glu Ala Ser Ala Val Ile Asn Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ala Arg Ala Ala Glu Glu Asp Arg Arg Arg Phe Phe Glu Ala 65 70 75 80 Ala Glu Arg Gly Ser Gly Lys Gly Asn Leu Val Pro Met Trp Glu Cys 85 90 95 Ile Val Ser Asp His Leu Thr Pro Val Leu Ala Tyr Arg Cys Leu Val 100 105 110 Pro Glu Asp Asn Met Glu Thr Pro Ser Phe Leu Phe Glu Ser Val Glu 115 120 125 Gln Gly Pro 130

【０１１３】 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRANDNESS : single <220> <223> TOPOLOGY : linear <220> <223> ANTI-SENSE : NO <400> 4 aactgcagga attcaagatg aggttccg 28 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRANDNESS : single <220> <223> TOPOLOGY : linear <220> <223> ANTI-SENSE : YES <400> 5 cgcggatccg actccaatgc gataggc 27 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRANDNESS : single <220> <223> TOPOLOGY : linear <220> <223> ANTI-SENSE : YES <400> 6 ctcgacggac tcgaagagga agctg 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRANDNESS : single <220> <223> TOPOLOGY : linear <220> <223> ANTI-SENSE : NO <400> 7 catatgtctt cctctatgaa c 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STRANDNESS : single <220> <223> TOPOLOGY : linear <220> <223> ANTI-SENSE : YES <400> 8 ggatcctcat tttttcacaa atgc 24

【０１１４】 <210>9 <211>1660 <212>DNA <213>Oryza sativa <220> <221>CDS <222>(1504)..(1660) <220> <223>STRANDNESS:double <220> <223>TOPOLOGY:linear <220> <223>MOLECULE TYPE:DNA(genomic) <400>9 tctagattca ttaatattta tatgaatatg gacaatgcta aaaagtttta taatatgaaa 60 cggaggaagt agtaactagt gagagcatgg ttgtttctta tcccctcttt tattttttgg 120 gttaattgga tccatgtcat aacaaatttg caactcttaa aaaatatcat taccattcac 180 ctatttggtc ccatgacatt acaactttac atctatttga gatataccac tacttaccac 240 ttcaatgcat ttatcaaaat ttttggacta gtttcctcct ctatgctctc cttcggctgg 300 tgattggtgc tcctctactc caacggctct tccctctact cactctagcg gcgatgcacg 360 atgaggttgg ggcatgtggt tcccctcttc ctctcccctg tctactcatt ccggcagtgg 420 tgcatggcga ggtctgggtc ggtggttccc ttctcttcct ctccatcccc tcttacttcg 480 ggcagagtaa aatcggcaac ctcgataccg ccattgacat cctacgtttg tgttcctcgt 540 cactccactg tcgaatccac ctccatcatt gacaagcacg ctggccatgc ctaggtggct 600 cgccaaccta cacttgcttg acgacgacag agtctgtaag tggcgcctga attcaagatg 660 aggttccgtt cggcttgagg ggaacaataa ggtggccaaa cgaggttgac ctcgaattat 720 tccctttccc tgatacacac gctagaggag gagatggatt gggagagggg agggaacgcg 780 tgacggtggc gaggggatag ggagagatgg ccgccggaga ggtggaggtg gatcagtgac 840 catcgtggtt aggctcattt cattgaaaat gagtgagtgg agaggggaag ggagaaaggt 900 aagctgatca aaatttttaa tgaatccact agatagatat ataaaatagt gatatatcaa 960 aaataattgt aaaattcaaa tagaaatagt aaataacaat gatatatttt aaaataggta 1020 agtttataag gggaaatatg tagtggaaac ttgaaaaata cagttggatc gaaaaatgga 1080 cgtccgacat ttatccacgt catcacgatt tactcatgag tacttatgat gatgtgaacg 1140 aatctcggac atttattttt tattgtaatt tttaagtttc cacgtatttt cccagtttat 1200 aatggcaccg tctccctctc cccatcgagg aagagtaaac ccaaaaaccc atctcgctag 1260 ccgccgccgg ccacaaccat tcctcacgac gggaggaaga cgaaaaaaaa aaaatcccac 1320 tccgtgttgg taaaatccga ctaccacttc ggcctgtctc aatccaagaa ttcaagaatc 1380 gaactccttt ggggtcgcct cgctgaatct tccttatata tacgcgctct cccattcgcg 1440 tgtgctccaa atcgtagtgg ggggaagtgg agttgacgag ctgtggaaaa aaagcctatc 1500 gca atg gag tcc atc gcc gcc gcc acg ttc acg ccc tcg cgc ctc gcc 1548 Met Glu Ser Ile Ala Ala Ala Thr Phe Thr Pro Ser Arg Leu Ala 1 5 10 15 gcc cgc ccc gcc act ccg gcg gcg gcg gcg gcc ccg gtt aga gcg agg 1596 Ala Arg Pro Ala Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Val Arg Ala Arg 20 25 30 gcg gcg gta gcg gca gga ggg agg agg agg acg agt agg cgc ggc ggc 1644 Ala Ala Val Ala Ala Gly Gly Arg Arg Arg Thr Ser Arg Arg Gly Gly 35 40 45 gtg agg tgc tcc gcg g 1660 Val Arg Cys Ser Ala 50

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺川 輝彦 神奈川県厚木市森の里２−１−６−103 (72)発明者 長谷川 久和 神奈川県厚木市戸田1061番地の３ キャロ ットハウス２ Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA07 BA11 CA03 DA01 EA04 FA02 GA11 GA17 HA01 HA12 4B050 CC03 4B065 AA26X AA89Y AB01 BA02 BA25 CA27 CA53

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載された塩基配
   列を有するＤＮＡであって、このＤＮＡは、イネのアン
   トラニル酸シンターゼの第２アイソザイムのαサブユニ
   ットをコードする遺伝子に対するプロモーター活性を有
   するＤＮＡ領域から成ることを特徴とする、前記プロモ
   ーター活性を有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載された塩基配
   列において１個もしくは数個の塩基が付加されるか、お
   よび（または）欠失するか、および(または)、他の塩基
   により置換されて形成された塩基配列であるＤＮＡ、あ
   るいは該塩基配列の少なくとも一部を含むＤＮＡであっ
   て、かつ、植物細胞中でプロモーター活性を有するＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に記載された塩基配
   列を有するＤＮＡであって、このＤＮＡの内部には、イ
   ネのアントラニル酸シンターゼの第２アイソザイムのα
   サブユニットをコードする遺伝子に対するプロモーター
   活性を有するＤＮＡ領域を含み、さらに該プロモーター
   活性を有する該ＤＮＡ領域に対するエクソン部のＤＮＡ
   配列を含むＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１または２に記載され
   た塩基配列を有するＤＮＡであって、植物細胞中で発現
   されるプロモーター活性を有するＤＮＡを含有するプラ
   スミド。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列を
   有して且つプロモーター活性を有する請求項１に記載の
   ＤＮＡの制御下において、所期する構造遺伝子を植物細
   胞中で発現させる方法。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号９に記載された1660bp
   のサイズの塩基配列の649番目のｇから1503番目のａま
   での856 bpのサイズの塩基配列を有するＤＮＡであっ
   て、このＤＮＡは、イネのアントラニル酸シンターゼの
   第２アイソザイムのαサブユニットをコードする遺伝子
   に対するプロモーター活性を有するプロモーターＤＮＡ
   領域であることを特徴とする、前記プロモーター活性を
   有するＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号９に記載された1660bp
   のサイズの塩基配列を有するＤＮＡであって、このＤＮ
   Ａの内部には、配列番号９の塩基配列の649番目のｇか
   ら1503番目のａまでの856 bpのサイズの塩基配列を有し
   て、且つイネのアントラニル酸シンターゼの第２アイソ
   ザイムのαサブユニットをコードする遺伝子に対するプ
   ロモーター活性を有するプロモーターＤＮＡ領域を含
   み、さらに該プロモーターＤＮＡ領域の上流で配列番号
   ９の塩基配列の１番目のｔから648番目のｔまでの上流
   ＤＮＡ領域を含み、また該プロモーターＤＮＡ領域に対
   するエクソン部として、配列番号９の塩基配列の1504番
   目のａから1660番目のｇまでのＤＮＡ配列を含むＤＮ
   Ａ。