JP2003088377A - 植物への病害抵抗性付与方法 - Google Patents
植物への病害抵抗性付与方法Info
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- JP2003088377A JP2003088377A JP2001281185A JP2001281185A JP2003088377A JP 2003088377 A JP2003088377 A JP 2003088377A JP 2001281185 A JP2001281185 A JP 2001281185A JP 2001281185 A JP2001281185 A JP 2001281185A JP 2003088377 A JP2003088377 A JP 2003088377A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】病害抵抗性植物を作出するための方法を提供す
ること。 【解決手段】植物への病害抵抗性付与のための、以下の
いずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白
質をコードする核酸の使用、等。（ａ）シロイヌナズナ
由来の特定のアミノ酸配列（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコ
ードされるアミノ酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性
を付与する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列
ること。 【解決手段】植物への病害抵抗性付与のための、以下の
いずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白
質をコードする核酸の使用、等。（ａ）シロイヌナズナ
由来の特定のアミノ酸配列（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコ
ードされるアミノ酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性
を付与する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物に病害抵抗性
を付与するための、ジンクフィンガー蛋白質をコードす
る核酸または該蛋白質の使用に関する。
を付与するための、ジンクフィンガー蛋白質をコードす
る核酸または該蛋白質の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】各種
病原微生物により引き起こされる農作物の病害は、作物
栽培において減収の主要な要因となっている。そこでこ
のような病害の発生を抑えるために、病害抵抗性植物の
育成が必要とされており、病害抵抗性植物を作出する方
法の開発が求められている。
病原微生物により引き起こされる農作物の病害は、作物
栽培において減収の主要な要因となっている。そこでこ
のような病害の発生を抑えるために、病害抵抗性植物の
育成が必要とされており、病害抵抗性植物を作出する方
法の開発が求められている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる状況
の下、鋭意検討した結果、ある種のジンクフィンガー蛋
白質をコードする核酸を植物に導入することにより、当
該植物に病害に対する抵抗性が付与されることを見出
し、本発明に至った。すなわち、本発明は、 １）植物への病害抵抗性付与のための、以下のいずれか
のアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質をコー
ドする核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ２）植物への病害抵抗性付与のための、以下のいずれか
のアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質の使
用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ３）アブラナ科植物への病害抵抗性付与のための、以下
のいずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋
白質をコードする核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ４）植物への青枯れ病抵抗性付与のための、以下のいず
れかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質を
コードする核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ５）植物細胞において12-oxo-phytodienoate reductase
遺伝子の発現量を増加させるための、以下のいずれかの
アミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質をコード
する核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列を提供するものである。
の下、鋭意検討した結果、ある種のジンクフィンガー蛋
白質をコードする核酸を植物に導入することにより、当
該植物に病害に対する抵抗性が付与されることを見出
し、本発明に至った。すなわち、本発明は、 １）植物への病害抵抗性付与のための、以下のいずれか
のアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質をコー
ドする核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ２）植物への病害抵抗性付与のための、以下のいずれか
のアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質の使
用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ３）アブラナ科植物への病害抵抗性付与のための、以下
のいずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋
白質をコードする核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ４）植物への青枯れ病抵抗性付与のための、以下のいず
れかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質を
コードする核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 ５）植物細胞において12-oxo-phytodienoate reductase
遺伝子の発現量を増加させるための、以下のいずれかの
アミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質をコード
する核酸の使用、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
ジンクフィンガー蛋白質は、システイン残基またはヒス
チジン残基がZn原子と結合して部分的なペプチド構造を
形成しうるような、“ジンクフィンガードメイン”を有
する蛋白質である。ジンクフィンガー蛋白質は、ジンク
フィンガードメインに含まれるシステイン残基またはヒ
スチジン残基の組合わせにより、Cys2/Hys2型（TFIIIA
など）、Cys2/Cys2型（GATA、DOFなど）の２つに大きく
分類される。植物のCys2/Hys2型ジンクフィンガー蛋白
質には、ジンクフィンガードメイン内にQALGGH配列と呼
ばれる保存領域が存在する。本発明には、以下のいずれ
かのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質（以
下、本蛋白質と記す。）を用いることができる。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列。
ジンクフィンガー蛋白質は、システイン残基またはヒス
チジン残基がZn原子と結合して部分的なペプチド構造を
形成しうるような、“ジンクフィンガードメイン”を有
する蛋白質である。ジンクフィンガー蛋白質は、ジンク
フィンガードメインに含まれるシステイン残基またはヒ
スチジン残基の組合わせにより、Cys2/Hys2型（TFIIIA
など）、Cys2/Cys2型（GATA、DOFなど）の２つに大きく
分類される。植物のCys2/Hys2型ジンクフィンガー蛋白
質には、ジンクフィンガードメイン内にQALGGH配列と呼
ばれる保存領域が存在する。本発明には、以下のいずれ
かのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質（以
下、本蛋白質と記す。）を用いることができる。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列。
【０００５】ここで、上記の「ストリンジェントな条件
下にハイブリダイズ」するＤＮＡとしては、例えば、
（１）高イオン濃度下[例えば、6XSSC（900mMの塩化ナ
トリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）等が挙げられ
る。]に、42℃の温度条件でハイブリダイズさせること
により、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡまたは配列番号２で示される塩基配列を有する
ＤＮＡと、DNA-DNAハイブリッドを形成し、（２）低イ
オン濃度下[例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウ
ム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）等が用いられる。]
に、65℃の温度条件で30分間洗浄した後でも該ハイブリ
ッドが維持されうるＤＮＡをあげることができる。具体
的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２で示さ
れる塩基配列の塩基番号66〜551で表される塩基配列を
有するＤＮＡなどをあげることができ、配列番号１で示
されるアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａをあげることもできる。ここで、複数個とは、２〜約
１５０個程度、好ましくは２〜約１００個程度、更に好
ましくは２〜約５０個程度である。かかるアミノ酸の欠
失、置換もしくは付加には、生物の種差、個体差もしく
は組織間の差異等により天然に生じる変異も含まれる。
下にハイブリダイズ」するＤＮＡとしては、例えば、
（１）高イオン濃度下[例えば、6XSSC（900mMの塩化ナ
トリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）等が挙げられ
る。]に、42℃の温度条件でハイブリダイズさせること
により、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡまたは配列番号２で示される塩基配列を有する
ＤＮＡと、DNA-DNAハイブリッドを形成し、（２）低イ
オン濃度下[例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウ
ム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）等が用いられる。]
に、65℃の温度条件で30分間洗浄した後でも該ハイブリ
ッドが維持されうるＤＮＡをあげることができる。具体
的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２で示さ
れる塩基配列の塩基番号66〜551で表される塩基配列を
有するＤＮＡなどをあげることができ、配列番号１で示
されるアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａをあげることもできる。ここで、複数個とは、２〜約
１５０個程度、好ましくは２〜約１００個程度、更に好
ましくは２〜約５０個程度である。かかるアミノ酸の欠
失、置換もしくは付加には、生物の種差、個体差もしく
は組織間の差異等により天然に生じる変異も含まれる。
【０００６】本蛋白質をコードする核酸、例えば、本蛋
白質をコードするＤＮＡ（以下、本ＤＮＡと記す。）
は、植物、より具体的には例えば、シロイヌナズナ等の
アブラナ科の植物などから、「Molecular Cloning: A L
aboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Mo
lecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等
に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法によ
り調製することができる。具体的には例えば、シロイヌ
ナズナ等の植物の細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａを鋳型とし、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列の５’末端側の約２０塩基程度以上の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１で
示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端
側の約２０塩基程度以上の塩基配列に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い
て、以下に示すような反応条件にてポリメラーゼチェイ
ン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、本
ＤＮＡを増幅することができる。また、上記の染色体Ｄ
ＮＡまたはｃＤＮＡがベクターに挿入されてなるＤＮＡ
ライブラリーを鋳型とする場合には、例えば、配列番号
２で示される塩基配列の３’非翻訳領域から選ばれる約
２０塩基程度以上の塩基配列に相補的な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３で示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、ライブラリ
ー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩
基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチ
ド（例えば、配列番号４で示される塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド）とをプライマーとして用いてＰＣＲ
を行うことにより、本ＤＮＡを増幅することもできる。
尚、上記のようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの
５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていて
もよい。ＰＣＲの条件としては、具体的には例えば、鋳
型DNAを1ng含み、上記のような組合せのプライマーをそ
れぞれ200nM含み、４種類のｄＮＴＰを各々200μMとな
るよう含み、10×rTaqバッファー（宝酒造社製）を5μl
含み、TaKaRa rTaq（5U/μl、宝酒造社製）を0.25μlを
含む50μlの反応液を用い、94℃にて1分間次いで65℃に
て2分間さらに72℃にて3分間の保温を１サイクルとして
これを４０サイクル繰り返す条件をあげることができ
る。
白質をコードするＤＮＡ（以下、本ＤＮＡと記す。）
は、植物、より具体的には例えば、シロイヌナズナ等の
アブラナ科の植物などから、「Molecular Cloning: A L
aboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Mo
lecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等
に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法によ
り調製することができる。具体的には例えば、シロイヌ
ナズナ等の植物の細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａを鋳型とし、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列の５’末端側の約２０塩基程度以上の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１で
示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端
側の約２０塩基程度以上の塩基配列に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い
て、以下に示すような反応条件にてポリメラーゼチェイ
ン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、本
ＤＮＡを増幅することができる。また、上記の染色体Ｄ
ＮＡまたはｃＤＮＡがベクターに挿入されてなるＤＮＡ
ライブラリーを鋳型とする場合には、例えば、配列番号
２で示される塩基配列の３’非翻訳領域から選ばれる約
２０塩基程度以上の塩基配列に相補的な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３で示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、ライブラリ
ー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩
基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチ
ド（例えば、配列番号４で示される塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド）とをプライマーとして用いてＰＣＲ
を行うことにより、本ＤＮＡを増幅することもできる。
尚、上記のようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの
５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていて
もよい。ＰＣＲの条件としては、具体的には例えば、鋳
型DNAを1ng含み、上記のような組合せのプライマーをそ
れぞれ200nM含み、４種類のｄＮＴＰを各々200μMとな
るよう含み、10×rTaqバッファー（宝酒造社製）を5μl
含み、TaKaRa rTaq（5U/μl、宝酒造社製）を0.25μlを
含む50μlの反応液を用い、94℃にて1分間次いで65℃に
て2分間さらに72℃にて3分間の保温を１サイクルとして
これを４０サイクル繰り返す条件をあげることができ
る。
【０００７】本ＤＮＡは、シロイヌナズナ等の植物の細
胞由来の染色体ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライ
ブラリーに、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する約２０塩基以上の塩基からなる
ＤＮＡをプローブとして、後述する条件にてハイブリダ
イズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出
しこれを回収することによって取得することもできる。
かかるプローブとして用いられるＤＮＡの具体例として
は、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、配
列番号２で示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤ
ＮＡ、該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮ
Ａ等があげられる。
胞由来の染色体ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライ
ブラリーに、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する約２０塩基以上の塩基からなる
ＤＮＡをプローブとして、後述する条件にてハイブリダ
イズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出
しこれを回収することによって取得することもできる。
かかるプローブとして用いられるＤＮＡの具体例として
は、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、配
列番号２で示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤ
ＮＡ、該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮ
Ａ等があげられる。
【０００８】染色体ＤＮＡライブラリーにプローブをハ
イブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダ
イゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げ
ることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクタ
ーの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるラ
イブラリーがプラスミドベクターを用いて構築されてい
る場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行う。
具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを、ライブラリ
ーの作製に用いられたプラスミドベクターが複製可能な
微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転
換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで
培養を行う。ライブラリーがファージベクターを用いて
作製されている場合には、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを行う。具体的にはまず、ライブラリーの作製に用
いられたファージベクターが複製可能な微生物とライブ
ラリーのファージとを感染可能な条件下で混合した後、
更に軟寒天培地と混合し、これを寒天培地にまく。その
後、プラークが現れるまで培養を行う。次いで、前記の
いずれのハイブリダイゼーションの場合も、前記の培養
を行った寒天培地の表面にメンブレンを載せ、形質転換
体コロニーまたはプラーク中のファージ粒子を該メンブ
レンに転写する。このメンブレンをアルカリ処理した
後、中和処理し、次いで、形質転換体もしくはファージ
粒子から溶出したＤＮＡを該メンブレンに固定する処理
を行う。より具体的に例えば、プラークハイブリダイゼ
ーションの場合には、前記寒天培地の上にニトロセルロ
ースメンブレンまたはナイロンメンブレン等、具体的に
は例えば、Hybond-N+(アマシャム社登録商標)等を置
き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着
させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（1.5M 塩
化ナトリウム、0.5N NaOH）に約３分間浸してファージ
粒子を溶解させてファージDNAをメンブレン上に溶出さ
せた後、中和溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5Mトリス-
塩酸緩衝液pH7.5）に約５分間浸す。該メンブレンを洗
浄液（0.3M塩化ナトリウム、30 mMクエン酸ナトリウ
ム、0.2M トリス-塩酸緩衝液pH7.5）で約５分間洗った
後、例えば、約８０℃で約９０分間減圧下に保温するこ
とによりファージDNAをメンブレンに固定する。
イブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダ
イゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げ
ることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクタ
ーの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるラ
イブラリーがプラスミドベクターを用いて構築されてい
る場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行う。
具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを、ライブラリ
ーの作製に用いられたプラスミドベクターが複製可能な
微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転
換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで
培養を行う。ライブラリーがファージベクターを用いて
作製されている場合には、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを行う。具体的にはまず、ライブラリーの作製に用
いられたファージベクターが複製可能な微生物とライブ
ラリーのファージとを感染可能な条件下で混合した後、
更に軟寒天培地と混合し、これを寒天培地にまく。その
後、プラークが現れるまで培養を行う。次いで、前記の
いずれのハイブリダイゼーションの場合も、前記の培養
を行った寒天培地の表面にメンブレンを載せ、形質転換
体コロニーまたはプラーク中のファージ粒子を該メンブ
レンに転写する。このメンブレンをアルカリ処理した
後、中和処理し、次いで、形質転換体もしくはファージ
粒子から溶出したＤＮＡを該メンブレンに固定する処理
を行う。より具体的に例えば、プラークハイブリダイゼ
ーションの場合には、前記寒天培地の上にニトロセルロ
ースメンブレンまたはナイロンメンブレン等、具体的に
は例えば、Hybond-N+(アマシャム社登録商標)等を置
き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着
させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（1.5M 塩
化ナトリウム、0.5N NaOH）に約３分間浸してファージ
粒子を溶解させてファージDNAをメンブレン上に溶出さ
せた後、中和溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5Mトリス-
塩酸緩衝液pH7.5）に約５分間浸す。該メンブレンを洗
浄液（0.3M塩化ナトリウム、30 mMクエン酸ナトリウ
ム、0.2M トリス-塩酸緩衝液pH7.5）で約５分間洗った
後、例えば、約８０℃で約９０分間減圧下に保温するこ
とによりファージDNAをメンブレンに固定する。
【０００９】このように調製されたメンブレンを用い
て、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーショ
ンを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、「Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（198
9）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に
準じて行うことができる。プローブに用いるＤＮＡを放
射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガ
ー社または宝酒造社製のRandom Labeling Kit等を用い
ることができる。また、通常のPCR反応液中のdCTPを(α
-32P)dCTPに替えて、プローブに用いるDNAを鋳型にして
PCRを行うことにより、32P標識されたプローブＤＮＡを
調製することもできる。また、プローブに用いるＤＮＡ
を蛍光色素で標識する場合には例えば、DIG-High Prime
DNA Labeling and Detection Starter Kit II（Roche
社製）等を用いることができる。ハイブリダイゼーショ
ンを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例え
ば、450mM〜900mMの塩化ナトリウムおよび45mM〜90mMの
クエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム
(以下、SDSと記す。)を0.1%〜1.0%の濃度で含み、変性
した非特異的DNAを0μg/ml〜200μg/mlの濃度で含み、
場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピ
ロリドン等をそれぞれ0%〜0.2%の濃度で含んでいてもよ
いプレハイブリダイゼーション液を、上記のようにして
作製したメンブレン1cm2当たり50μl〜200μlの割合で
準備し、該溶液に前記メンブレンを浸して42℃〜65℃で
1時間〜4時間程度保温する。次いで例えば、450mM〜900
mMの塩化ナトリウムおよび45mM〜90mMのクエン酸ナトリ
ウムを含み、SDSを0.1%〜1.0%の濃度で含み、変性した
非特異的DNAを0μg/ml〜200μg/mlの濃度で含み、場合
によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリ
ドン等をそれぞれ0%〜0.2%の濃度で含んでいてもよいハ
イブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得
られたプローブ（メンブレン1cm2当たり1.0x104cpm〜2.
0x106cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン1cm2当
たり50μl〜200μlの割合で準備し、該溶液にメンブレ
ンを浸し42℃〜65℃で12時間〜20時間程度保温する。次
いで、メンブレンを取り出し、15mM〜300mMの塩化ナト
リウム、1.5mM〜30mMクエン酸ナトリウムおよび0.1%〜
1.0%のSDS等を含む42℃〜65℃の洗浄液等を用い、5分間
〜15分間の洗浄を2回〜４回程度行う。さらに、メンブ
レンを2xSSC溶液（300mM塩化ナトリウム、30mMクエン酸
ナトリウム）等で軽くすすいだ後乾燥させる。このメン
ブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供し
てメンブレン上のプローブの位置を検出することによ
り、用いたプローブとハイブリダイズするDNAのメンブ
レン上の位置を検出する。また、DIG-High Prime DNA L
abeling and Detection Starter Kit II（Roche社製）
等の市販のハイブリダイゼーション用キットを使用し、
該キットに含まれるハイブリダイゼーション用溶液を用
いてプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼ
ーションを行うこともできる。ハイブリダイゼーション
の後、例えば、メンブレンを0.1% SDSを含む2XSSC中、
室温で5分間2回洗浄し、引き続き0.1% SDS を含む0.5XS
SC中、65℃で15分間2回洗浄する。洗浄されたメンブレ
ンを、該キットに含まれる検出用処理液で順次処理して
メンブレン上のプローブの位置を検出することにより、
用いたプローブとハイブリダイズするDNAのメンブレン
上の位置を検出する。上記のようにして検出されたDNA
のメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天
培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを
有するクローンを単離することができる。
て、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーショ
ンを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、「Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（198
9）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に
準じて行うことができる。プローブに用いるＤＮＡを放
射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガ
ー社または宝酒造社製のRandom Labeling Kit等を用い
ることができる。また、通常のPCR反応液中のdCTPを(α
-32P)dCTPに替えて、プローブに用いるDNAを鋳型にして
PCRを行うことにより、32P標識されたプローブＤＮＡを
調製することもできる。また、プローブに用いるＤＮＡ
を蛍光色素で標識する場合には例えば、DIG-High Prime
DNA Labeling and Detection Starter Kit II（Roche
社製）等を用いることができる。ハイブリダイゼーショ
ンを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例え
ば、450mM〜900mMの塩化ナトリウムおよび45mM〜90mMの
クエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム
(以下、SDSと記す。)を0.1%〜1.0%の濃度で含み、変性
した非特異的DNAを0μg/ml〜200μg/mlの濃度で含み、
場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピ
ロリドン等をそれぞれ0%〜0.2%の濃度で含んでいてもよ
いプレハイブリダイゼーション液を、上記のようにして
作製したメンブレン1cm2当たり50μl〜200μlの割合で
準備し、該溶液に前記メンブレンを浸して42℃〜65℃で
1時間〜4時間程度保温する。次いで例えば、450mM〜900
mMの塩化ナトリウムおよび45mM〜90mMのクエン酸ナトリ
ウムを含み、SDSを0.1%〜1.0%の濃度で含み、変性した
非特異的DNAを0μg/ml〜200μg/mlの濃度で含み、場合
によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリ
ドン等をそれぞれ0%〜0.2%の濃度で含んでいてもよいハ
イブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得
られたプローブ（メンブレン1cm2当たり1.0x104cpm〜2.
0x106cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン1cm2当
たり50μl〜200μlの割合で準備し、該溶液にメンブレ
ンを浸し42℃〜65℃で12時間〜20時間程度保温する。次
いで、メンブレンを取り出し、15mM〜300mMの塩化ナト
リウム、1.5mM〜30mMクエン酸ナトリウムおよび0.1%〜
1.0%のSDS等を含む42℃〜65℃の洗浄液等を用い、5分間
〜15分間の洗浄を2回〜４回程度行う。さらに、メンブ
レンを2xSSC溶液（300mM塩化ナトリウム、30mMクエン酸
ナトリウム）等で軽くすすいだ後乾燥させる。このメン
ブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供し
てメンブレン上のプローブの位置を検出することによ
り、用いたプローブとハイブリダイズするDNAのメンブ
レン上の位置を検出する。また、DIG-High Prime DNA L
abeling and Detection Starter Kit II（Roche社製）
等の市販のハイブリダイゼーション用キットを使用し、
該キットに含まれるハイブリダイゼーション用溶液を用
いてプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼ
ーションを行うこともできる。ハイブリダイゼーション
の後、例えば、メンブレンを0.1% SDSを含む2XSSC中、
室温で5分間2回洗浄し、引き続き0.1% SDS を含む0.5XS
SC中、65℃で15分間2回洗浄する。洗浄されたメンブレ
ンを、該キットに含まれる検出用処理液で順次処理して
メンブレン上のプローブの位置を検出することにより、
用いたプローブとハイブリダイズするDNAのメンブレン
上の位置を検出する。上記のようにして検出されたDNA
のメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天
培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを
有するクローンを単離することができる。
【００１０】このようにして得られた本ＤＮＡは、例え
ば、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロ
ジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編、農村文化社1989
年）152-174頁に記載されている方法に準じて、塩基配
列の解析に適当なベクター、例えば、プラスミド等にサ
ブクローニングした後、例えば、モレキュラー クロー
ニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)［J.,S
ambrook, E.,F.,Frisch,T.,Maniatis 著、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー 発行 (Cold Spring H
arbor Laboratory press)、1989年］13.42-13.74頁等に
記載されているプライマーエクステンション法に準じ
て、ダイデオキシ法等により塩基配列の決定を行うこと
ができる。ダイデオキシ法による塩基配列の決定は、蛍
光ラベルされたダイデオキシヌクレオチドを用いる市販
のシークエンスキット、例えば、Dyeterminator cycle
sequencing kit（PEアプライドバイオシステムズ社製）
等を利用し、市販のオートDNAシークエンサー、例え
ば、DNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシス
テムズ社製）等を用いて行うことができる。得られる塩
基配列データを市販の遺伝子解析ソフトウェア、例え
ば、GENETYX（SDC社）を用いて解析し、遺伝子の全塩基
配列を決定する。
ば、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロ
ジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編、農村文化社1989
年）152-174頁に記載されている方法に準じて、塩基配
列の解析に適当なベクター、例えば、プラスミド等にサ
ブクローニングした後、例えば、モレキュラー クロー
ニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)［J.,S
ambrook, E.,F.,Frisch,T.,Maniatis 著、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー 発行 (Cold Spring H
arbor Laboratory press)、1989年］13.42-13.74頁等に
記載されているプライマーエクステンション法に準じ
て、ダイデオキシ法等により塩基配列の決定を行うこと
ができる。ダイデオキシ法による塩基配列の決定は、蛍
光ラベルされたダイデオキシヌクレオチドを用いる市販
のシークエンスキット、例えば、Dyeterminator cycle
sequencing kit（PEアプライドバイオシステムズ社製）
等を利用し、市販のオートDNAシークエンサー、例え
ば、DNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシス
テムズ社製）等を用いて行うことができる。得られる塩
基配列データを市販の遺伝子解析ソフトウェア、例え
ば、GENETYX（SDC社）を用いて解析し、遺伝子の全塩基
配列を決定する。
【００１１】本ＤＮＡは、上記のようにして植物等から
クローニングし調製することができる。また、本ＤＮＡ
は、植物等からクローニングされたＤＮＡに、例えば部
位特異的変異導入法やランダム変異導入法などによって
塩基の欠失、置換または付加を導入して調製することも
でき、化学合成により調製することもできる。
クローニングし調製することができる。また、本ＤＮＡ
は、植物等からクローニングされたＤＮＡに、例えば部
位特異的変異導入法やランダム変異導入法などによって
塩基の欠失、置換または付加を導入して調製することも
でき、化学合成により調製することもできる。
【００１２】上記のようにして得られる本ＤＮＡを植物
細胞に導入して該ＤＮＡを発現する形質転換細胞を取得
し、該形質転換細胞から植物個体を再生させることによ
り、病害抵抗性植物を作出することができる。本ＤＮＡ
を植物細胞に導入して該ＤＮＡを発現する形質転換細胞
を取得するには、例えば、（１）植物細胞内で機能可能
なプロモーター、（２）本ＤＮＡ、および（３）植物細
胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で前記
の順序に結合させてなる発現ベクターを構築し、これを
植物細胞に導入して形質転換する。
細胞に導入して該ＤＮＡを発現する形質転換細胞を取得
し、該形質転換細胞から植物個体を再生させることによ
り、病害抵抗性植物を作出することができる。本ＤＮＡ
を植物細胞に導入して該ＤＮＡを発現する形質転換細胞
を取得するには、例えば、（１）植物細胞内で機能可能
なプロモーター、（２）本ＤＮＡ、および（３）植物細
胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で前記
の順序に結合させてなる発現ベクターを構築し、これを
植物細胞に導入して形質転換する。
【００１３】植物細胞で機能可能なプロモーターとして
は、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモ
ーター（特表昭60-500796及び特開平6-315381）、ノパ
リン合成酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オクトピン
合成酵素遺伝子（OCT）プロモーター、rbsS（ribulose
1,5-bisphosphate carboxylaseの小サブユニット）プロ
モーター、Cab（chlorophyll a/b binding protein）プ
ロモーター（Science、1989年、244巻、174頁）等が挙
げられる。植物細胞で機能可能なターミネーターとし
て、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のター
ミネーター、NOS（ノパリン合成酵素）遺伝子由来のタ
ーミネーター等が挙げられる。なお、ここで、「機能可
能な形で」とは、構築された発現ベクターを植物細胞に
導入し形質転換させた場合に、該植物細胞内で本ＤＮＡ
が発現されるように、プロモーターの制御下に本ＤＮＡ
を組み込まれた状態を意味する。
は、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモ
ーター（特表昭60-500796及び特開平6-315381）、ノパ
リン合成酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オクトピン
合成酵素遺伝子（OCT）プロモーター、rbsS（ribulose
1,5-bisphosphate carboxylaseの小サブユニット）プロ
モーター、Cab（chlorophyll a/b binding protein）プ
ロモーター（Science、1989年、244巻、174頁）等が挙
げられる。植物細胞で機能可能なターミネーターとし
て、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のター
ミネーター、NOS（ノパリン合成酵素）遺伝子由来のタ
ーミネーター等が挙げられる。なお、ここで、「機能可
能な形で」とは、構築された発現ベクターを植物細胞に
導入し形質転換させた場合に、該植物細胞内で本ＤＮＡ
が発現されるように、プロモーターの制御下に本ＤＮＡ
を組み込まれた状態を意味する。
【００１４】本ＤＮＡの発現ベクターを植物細胞に導入
し、該植物細胞を形質転換する際には、更に、例えばハ
イグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、
ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
等から選ばれる選択マーカー遺伝子を本ＤＮＡの発現ベ
クターと同時に植物細胞に導入するのが好ましい。この
際、選択マーカー遺伝子と本ＤＮＡとを同一のベクター
上に組み込んで導入してもよいし、選択マーカー遺伝子
を有するベクターと本ＤＮＡの発現ベクターとを併用し
てもよい。
し、該植物細胞を形質転換する際には、更に、例えばハ
イグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、
ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
等から選ばれる選択マーカー遺伝子を本ＤＮＡの発現ベ
クターと同時に植物細胞に導入するのが好ましい。この
際、選択マーカー遺伝子と本ＤＮＡとを同一のベクター
上に組み込んで導入してもよいし、選択マーカー遺伝子
を有するベクターと本ＤＮＡの発現ベクターとを併用し
てもよい。
【００１５】上記のような本ＤＮＡの発現ベクターを、
アグロバクテリウム感染方法（特公平2-58917および特
開昭60-70080）、プロトプラストへのエレクトロポーレ
ーション方法（特開昭60-251887及び特開平5-68575）、
またはパーティクルガン方法（特表平5-508316及び特開
昭63-258525）等の手段により植物細胞に導入し、形質
転換された植物細胞を選抜する。選抜された形質転換細
胞から、例えば、内宮著、植物遺伝子操作マニュアル
（トランスジェニック植物の作り方）1990年、講談社サ
イエンティフィック（ISBN4-06-153513-7 C3045）、27-
55頁に記載の植物細胞培養方法により植物個体を再生す
ることによって形質転換された植物を得ることができ
る。
アグロバクテリウム感染方法（特公平2-58917および特
開昭60-70080）、プロトプラストへのエレクトロポーレ
ーション方法（特開昭60-251887及び特開平5-68575）、
またはパーティクルガン方法（特表平5-508316及び特開
昭63-258525）等の手段により植物細胞に導入し、形質
転換された植物細胞を選抜する。選抜された形質転換細
胞から、例えば、内宮著、植物遺伝子操作マニュアル
（トランスジェニック植物の作り方）1990年、講談社サ
イエンティフィック（ISBN4-06-153513-7 C3045）、27-
55頁に記載の植物細胞培養方法により植物個体を再生す
ることによって形質転換された植物を得ることができ
る。
【００１６】より具体的には、例えば、上記のような本
ＤＮＡの発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス(Agrobacterium tumefaciens) C58等に挿入し
てアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換株
を取得し、該形質転換株を、例えば、島本・岡田監修、
モデル植物の実験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ
編（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）、1996
年、秀潤社、99-108頁等に記載されているルート法を用
いて、植物の根組織に感染させる。例えば、発芽10〜14
日目の幼植物の根組織を切り出し、カルス誘導させた
後、上記のアグロバクテリウム培養懸濁液と共培養させ
て感染させる。感染処理した外植片をカナマイシン等の
選択薬剤の入ったシュート形成培地に移植して培養し、
再生シュートをさらにルート形成培地に移植して発根さ
せる。得られた幼植物をポットに移植して培養すること
により、本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物を得る
ことができる。また、さやと花茎が黄色になったら採種
して、形質転換された植物体のT1種子を得ることができ
る。
ＤＮＡの発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス(Agrobacterium tumefaciens) C58等に挿入し
てアグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換株
を取得し、該形質転換株を、例えば、島本・岡田監修、
モデル植物の実験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ
編（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）、1996
年、秀潤社、99-108頁等に記載されているルート法を用
いて、植物の根組織に感染させる。例えば、発芽10〜14
日目の幼植物の根組織を切り出し、カルス誘導させた
後、上記のアグロバクテリウム培養懸濁液と共培養させ
て感染させる。感染処理した外植片をカナマイシン等の
選択薬剤の入ったシュート形成培地に移植して培養し、
再生シュートをさらにルート形成培地に移植して発根さ
せる。得られた幼植物をポットに移植して培養すること
により、本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物を得る
ことができる。また、さやと花茎が黄色になったら採種
して、形質転換された植物体のT1種子を得ることができ
る。
【００１７】本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物に
おける本ＤＮＡの発現は、例えば形質転換植物の葉等か
ら全RNAを抽出し、導入した本ＤＮＡに特異的なプロー
ブを用いたノザンハイブリダイゼーション解析を行うこ
とにより確認することができる。また、例えば形質転換
植物の葉等から蛋白質を抽出し、導入した本ＤＮＡにコ
ードされる本蛋白質に対する抗体を用いた免疫化学的解
析等を行うことにより、本ＤＮＡの発現を確認すること
もできる。
おける本ＤＮＡの発現は、例えば形質転換植物の葉等か
ら全RNAを抽出し、導入した本ＤＮＡに特異的なプロー
ブを用いたノザンハイブリダイゼーション解析を行うこ
とにより確認することができる。また、例えば形質転換
植物の葉等から蛋白質を抽出し、導入した本ＤＮＡにコ
ードされる本蛋白質に対する抗体を用いた免疫化学的解
析等を行うことにより、本ＤＮＡの発現を確認すること
もできる。
【００１８】本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物
に、植物病原体を感染させ、病徴の程度を本ＤＮＡが導
入されていない植物（野生型植物）と比較することによ
り、該形質転換植物の病害抵抗性の度合いを確認するこ
とができる。感染させる植物病原体として、例えば、青
枯れ病菌（Ralstonia solanacearum）、Pseudomonas sy
ringae、Erysiphe cichoracearum、灰色カビ病菌、Pero
nospora parasiticaなどが挙げられる。具体的には例え
ば、本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物の根組織あ
るいは葉組織に、Deslandes et al. (1998) Molecular
Plant-Microbe interaction 第11巻、659-667頁等に記
載の方法を用いて植物病原体を感染させる。例えば、プ
ラスチックポットで培養している植物の根組織を一部切
断して傷つけた後、その培養土に植物病原体液を注入し
て感染させる。1〜３週間程度培養した後に、病徴の程
度を調査することにより、該形質転換植物の病害抵抗性
を確認することができる。
に、植物病原体を感染させ、病徴の程度を本ＤＮＡが導
入されていない植物（野生型植物）と比較することによ
り、該形質転換植物の病害抵抗性の度合いを確認するこ
とができる。感染させる植物病原体として、例えば、青
枯れ病菌（Ralstonia solanacearum）、Pseudomonas sy
ringae、Erysiphe cichoracearum、灰色カビ病菌、Pero
nospora parasiticaなどが挙げられる。具体的には例え
ば、本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物の根組織あ
るいは葉組織に、Deslandes et al. (1998) Molecular
Plant-Microbe interaction 第11巻、659-667頁等に記
載の方法を用いて植物病原体を感染させる。例えば、プ
ラスチックポットで培養している植物の根組織を一部切
断して傷つけた後、その培養土に植物病原体液を注入し
て感染させる。1〜３週間程度培養した後に、病徴の程
度を調査することにより、該形質転換植物の病害抵抗性
を確認することができる。
【００１９】上記のようにしてＤＮＡを植物細胞に導入
して該ＤＮＡを発現する形質転換細胞を取得し、該形質
転換細胞から植物個体を再生させることにより、病害抵
抗性を示す植物を取得することができる。かかる本発明
の方法を適用可能な植物としては、例えば、アブラナ、
ハクサイ、カブラ、キャベツ、ナタネ、ダイコン、シロ
イヌナズナなどのアブラナ科等の植物を挙げることがで
きる。
して該ＤＮＡを発現する形質転換細胞を取得し、該形質
転換細胞から植物個体を再生させることにより、病害抵
抗性を示す植物を取得することができる。かかる本発明
の方法を適用可能な植物としては、例えば、アブラナ、
ハクサイ、カブラ、キャベツ、ナタネ、ダイコン、シロ
イヌナズナなどのアブラナ科等の植物を挙げることがで
きる。
【００２０】ジャスモン酸（JA）やサリチル酸（SA）
は、植物が病原体感染などのストレスを受けた際に合成
される二次シグナル物質として知られている。これらの
二次シグナル物質が合成されると、植物内においてスト
レスを防御する機能を導くストレス抵抗性遺伝子の発現
が誘導される。ストレス抵抗性遺伝子の例として、感染
特異的（PR）遺伝子が挙げられる。PR遺伝子によりコー
ドされる蛋白質（PR蛋白質）は、種々の防御機能を有す
ることが報告されている。PR蛋白質は、一般に、等電点
が塩基性側にある塩基性PR蛋白質、および等電点が酸性
側にある酸性PR蛋白質の２つのタイプに分類される。塩
基性PR蛋白質は、植物が病原体感染や傷ストレスのよう
なストレス環境下にさらされた場合、ジャスモン酸やエ
チレンにより誘導される。酸性PR蛋白質は、サリチル酸
により誘導されることが知られており、植物の病原体感
染に対する全身獲得抵抗性（SAR）に関与すると考えら
れている。12-oxo-phytodienoate reductaseは、上記の
ような植物のストレス抵抗性を誘導するジャスモン酸の
生合成経路を構成する酵素の１つである。
は、植物が病原体感染などのストレスを受けた際に合成
される二次シグナル物質として知られている。これらの
二次シグナル物質が合成されると、植物内においてスト
レスを防御する機能を導くストレス抵抗性遺伝子の発現
が誘導される。ストレス抵抗性遺伝子の例として、感染
特異的（PR）遺伝子が挙げられる。PR遺伝子によりコー
ドされる蛋白質（PR蛋白質）は、種々の防御機能を有す
ることが報告されている。PR蛋白質は、一般に、等電点
が塩基性側にある塩基性PR蛋白質、および等電点が酸性
側にある酸性PR蛋白質の２つのタイプに分類される。塩
基性PR蛋白質は、植物が病原体感染や傷ストレスのよう
なストレス環境下にさらされた場合、ジャスモン酸やエ
チレンにより誘導される。酸性PR蛋白質は、サリチル酸
により誘導されることが知られており、植物の病原体感
染に対する全身獲得抵抗性（SAR）に関与すると考えら
れている。12-oxo-phytodienoate reductaseは、上記の
ような植物のストレス抵抗性を誘導するジャスモン酸の
生合成経路を構成する酵素の１つである。
【００２１】上記のようにして本ＤＮＡを植物細胞に導
入して発現させることにより、該細胞における12-oxo-p
hytodienoate reductase遺伝子の発現量を増加させるこ
とができる。12-oxo-phytodienoate reductase遺伝子の
発現量の増加は、例えば、該遺伝子に特異的なプローブ
を用いたノザンハイブリダイゼーション解析を行うこと
により確認することができる。また、例えば、該遺伝子
に特異的なプローブが固定化されたＤＮＡチップを用い
たマイクロアレイ解析により確認することもできる。例
えば、本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物および野
生型植物の葉からpolyA+RNAを調製し、それぞれを異な
る色素等で標識した後、該遺伝子に特異的なプローブが
固定化されたＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、マイ
クロアレイ解析することにより、本ＤＮＡが導入されて
なる形質転換植物において野生型植物よりも12-oxo-phy
todienoate reductase遺伝子の発現量が増加しているこ
とを確認することができる。12-oxo-phytodienoate red
uctase遺伝子に特異的なプローブが固定化されたＤＮＡ
チップとしては、例えば、IntelliGeneTM Arabidopsis
CHIP I（宝酒造）を用いることができる。
入して発現させることにより、該細胞における12-oxo-p
hytodienoate reductase遺伝子の発現量を増加させるこ
とができる。12-oxo-phytodienoate reductase遺伝子の
発現量の増加は、例えば、該遺伝子に特異的なプローブ
を用いたノザンハイブリダイゼーション解析を行うこと
により確認することができる。また、例えば、該遺伝子
に特異的なプローブが固定化されたＤＮＡチップを用い
たマイクロアレイ解析により確認することもできる。例
えば、本ＤＮＡが導入されてなる形質転換植物および野
生型植物の葉からpolyA+RNAを調製し、それぞれを異な
る色素等で標識した後、該遺伝子に特異的なプローブが
固定化されたＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、マイ
クロアレイ解析することにより、本ＤＮＡが導入されて
なる形質転換植物において野生型植物よりも12-oxo-phy
todienoate reductase遺伝子の発現量が増加しているこ
とを確認することができる。12-oxo-phytodienoate red
uctase遺伝子に特異的なプローブが固定化されたＤＮＡ
チップとしては、例えば、IntelliGeneTM Arabidopsis
CHIP I（宝酒造）を用いることができる。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】実施例１ 配列番号１で示されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有する本ＤＮＡのクローニ
ング 配列番号２で示される塩基配列の塩基番号704〜733で表
される塩基配列に相補的な塩基配列（配列番号３で示さ
れる塩基配列）を有するオリゴヌクレオチドG142と、λ
DNAのアーム部位の部分塩基配列（配列番号４で示され
る塩基配列）を有するオリゴヌクレオチドks-30を、DNA
合成装置（PEアプライドシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用いて調製した。渡辺・杉浦著、
クローニングとシークエンス（植物バイオテクノロジー
実験マニュアル）1989年、農村文化社に記載されている
方法に従って発芽10日目のシロイヌナズナの実生より調
製されたcDNAが、λDNAに挿入されてなるcDNAライブラ
リー由来のDNAを鋳型として、上記オリゴヌクレオチドk
s-30とオリゴヌクレオチドG142とを用いてPCRを行っ
た。鋳型DNAを1ng含み、上記のような組合せのプライマ
ーをそれぞれ200nM含み、４種類のｄＮＴＰを各々200μ
Mとなるよう含み、10×rTaqバッファー（宝酒造社製）
を5μl含み、TaKaRa rTaq（5U/μl、宝酒造社製）を0.2
5μlを含む50μlの反応液を用い、反応は、94℃にて1分
間次いで65℃にて2分間さらに72℃にて3分間の保温を１
サイクルとしてこれを４０サイクル行った。その結果、
約750bpの長さのDNAが増幅された。増幅されたDNAをＴ
Ａベクター（invitrogen）にクローニングし、ABI PRIS
MTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit (Perkin elmer)を用いてDye terminator法により
塩基配列を決定した。その結果、配列番号２で示される
塩基配列の塩基番号1〜733で表される塩基配列が明らか
となった。
配列をコードする塩基配列を有する本ＤＮＡのクローニ
ング 配列番号２で示される塩基配列の塩基番号704〜733で表
される塩基配列に相補的な塩基配列（配列番号３で示さ
れる塩基配列）を有するオリゴヌクレオチドG142と、λ
DNAのアーム部位の部分塩基配列（配列番号４で示され
る塩基配列）を有するオリゴヌクレオチドks-30を、DNA
合成装置（PEアプライドシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用いて調製した。渡辺・杉浦著、
クローニングとシークエンス（植物バイオテクノロジー
実験マニュアル）1989年、農村文化社に記載されている
方法に従って発芽10日目のシロイヌナズナの実生より調
製されたcDNAが、λDNAに挿入されてなるcDNAライブラ
リー由来のDNAを鋳型として、上記オリゴヌクレオチドk
s-30とオリゴヌクレオチドG142とを用いてPCRを行っ
た。鋳型DNAを1ng含み、上記のような組合せのプライマ
ーをそれぞれ200nM含み、４種類のｄＮＴＰを各々200μ
Mとなるよう含み、10×rTaqバッファー（宝酒造社製）
を5μl含み、TaKaRa rTaq（5U/μl、宝酒造社製）を0.2
5μlを含む50μlの反応液を用い、反応は、94℃にて1分
間次いで65℃にて2分間さらに72℃にて3分間の保温を１
サイクルとしてこれを４０サイクル行った。その結果、
約750bpの長さのDNAが増幅された。増幅されたDNAをＴ
Ａベクター（invitrogen）にクローニングし、ABI PRIS
MTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit (Perkin elmer)を用いてDye terminator法により
塩基配列を決定した。その結果、配列番号２で示される
塩基配列の塩基番号1〜733で表される塩基配列が明らか
となった。
【００２４】実施例２ （間接導入用本ＤＮＡRHL41発
現ベクターの構築） 配列番号２で示される塩基配列の塩基番号1〜733で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本ＤＮＡRHL41と
記す。）を植物細胞に導入して発現させるために、植物
間接導入用発現ベクターを構築した。実施例１で得られ
た本ＤＮＡRHL41を含有するベクターのＤＮＡを制限酵
素NotI（宝酒造）で消化した後、T4 DNApolymerase（宝
酒造製：ブランティングキット）を用いてその末端を平
滑化し、さらに制限酵素SacI（宝酒造）で消化した。得
られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供して分離し
た後、約750bpの長さの本ＤＮＡRHL41を含むゲル部分を
回収した。回収されたゲルからPrep-A-Gene DNA purifi
cation system（BIO-RAD）を用いてＤＮＡを精製した
（DNA−Ａ）。一方、pBIN19由来のGUS発現バイナリーベ
クターpIG121-HMを制限酵素XbaI（宝酒造）で消化した
後、T4 DNA polymerase（宝酒造製：ブランティングキ
ット）を用いてその末端を平滑化し、さらに制限酵素Sa
cIで消化した。上記と同様にして、pIG121-HMからGUSを
コードするＤＮＡが取り除かれてなるDNAを回収した（D
NA−Ｂ）。DNA−ＡとDNA−Ｂを、T4 DNA ligase （宝酒
造製：DNAライゲーションキット）を用いてつなぎ合
せ、大腸菌HB101株コンピテントセル（宝酒造）に導入
し、カナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマ
イシン耐性株からプラスミドDNAを回収することによ
り、間接導入用本ＤＮＡRHL41発現ベクターpIG-RHL41-S
（図１）を得た。
現ベクターの構築） 配列番号２で示される塩基配列の塩基番号1〜733で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本ＤＮＡRHL41と
記す。）を植物細胞に導入して発現させるために、植物
間接導入用発現ベクターを構築した。実施例１で得られ
た本ＤＮＡRHL41を含有するベクターのＤＮＡを制限酵
素NotI（宝酒造）で消化した後、T4 DNApolymerase（宝
酒造製：ブランティングキット）を用いてその末端を平
滑化し、さらに制限酵素SacI（宝酒造）で消化した。得
られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供して分離し
た後、約750bpの長さの本ＤＮＡRHL41を含むゲル部分を
回収した。回収されたゲルからPrep-A-Gene DNA purifi
cation system（BIO-RAD）を用いてＤＮＡを精製した
（DNA−Ａ）。一方、pBIN19由来のGUS発現バイナリーベ
クターpIG121-HMを制限酵素XbaI（宝酒造）で消化した
後、T4 DNA polymerase（宝酒造製：ブランティングキ
ット）を用いてその末端を平滑化し、さらに制限酵素Sa
cIで消化した。上記と同様にして、pIG121-HMからGUSを
コードするＤＮＡが取り除かれてなるDNAを回収した（D
NA−Ｂ）。DNA−ＡとDNA−Ｂを、T4 DNA ligase （宝酒
造製：DNAライゲーションキット）を用いてつなぎ合
せ、大腸菌HB101株コンピテントセル（宝酒造）に導入
し、カナマイシン耐性株を選抜した。選抜されたカナマ
イシン耐性株からプラスミドDNAを回収することによ
り、間接導入用本ＤＮＡRHL41発現ベクターpIG-RHL41-S
（図１）を得た。
【００２５】実施例３ （本ＤＮＡRHL41発現ベクター
が導入された形質転換植物の作出） 実施例２で調製された発現ベクターpIG-RHL41-Sをカル
シウム処理法によりAgrobacterium tumefaciens C58株
に導入した。pIG-RHL41-Sが導入されたAgrobacterium t
umefaciens C58株を、島本・岡田監修、モデル植物の実
験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ編（細胞工学別
冊、植物細胞工学シリーズ４）、1996年、秀潤社、99-1
08頁に記載されているルート法を用いて、シロイヌナズ
ナに感染させ遺伝子導入した。具体的には、10〜14日目
の無菌植物（Arabidopsis thalianaWS）の根の断片をメ
スを用いて切り出し、2,4-D 0.5mg/l、kinetin 0.1mg/l
を含むカルス形成培地(CIM)に置床して6日間培養した。
得られた外植片をアグロバクテリウム（pIG-RHL41-Sが
導入されたAgrobacterium tumefaciens C58株）菌液に
浸した後、新しいCIM培地に置床し3日間培養した。外植
片を洗浄した後、50mg/l カナマイシン、0.15mg/l IA
A、0.5mg/l 2iPを含むシュート形成培地(SIM)に置床し
培養した。一週間ごとに新しいSIM培地に移植して培養
を続け、5〜10mmの大きさになった再生シュートを切り
取り、0.5mg/lIBAを含むルート形成培地(RIM)に移植
し、更に培養した。発根した個体を培養土に植え換えて
生育させ、さやと花茎が黄色になったときにT1種子を採
種した。
が導入された形質転換植物の作出） 実施例２で調製された発現ベクターpIG-RHL41-Sをカル
シウム処理法によりAgrobacterium tumefaciens C58株
に導入した。pIG-RHL41-Sが導入されたAgrobacterium t
umefaciens C58株を、島本・岡田監修、モデル植物の実
験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ編（細胞工学別
冊、植物細胞工学シリーズ４）、1996年、秀潤社、99-1
08頁に記載されているルート法を用いて、シロイヌナズ
ナに感染させ遺伝子導入した。具体的には、10〜14日目
の無菌植物（Arabidopsis thalianaWS）の根の断片をメ
スを用いて切り出し、2,4-D 0.5mg/l、kinetin 0.1mg/l
を含むカルス形成培地(CIM)に置床して6日間培養した。
得られた外植片をアグロバクテリウム（pIG-RHL41-Sが
導入されたAgrobacterium tumefaciens C58株）菌液に
浸した後、新しいCIM培地に置床し3日間培養した。外植
片を洗浄した後、50mg/l カナマイシン、0.15mg/l IA
A、0.5mg/l 2iPを含むシュート形成培地(SIM)に置床し
培養した。一週間ごとに新しいSIM培地に移植して培養
を続け、5〜10mmの大きさになった再生シュートを切り
取り、0.5mg/lIBAを含むルート形成培地(RIM)に移植
し、更に培養した。発根した個体を培養土に植え換えて
生育させ、さやと花茎が黄色になったときにT1種子を採
種した。
【００２６】実施例４ （本ＤＮＡRHL41発現ベクター
が導入された形質転換植物の病害抵抗性） 実施例３で得られた本ＤＮＡRHL41発現ベクターが導入
された形質転換植物のT 1種子を50μg/mlカナマイシンを
含む選択培地に播種し、21℃/24時間明所の条件下に2週
間培養した後、培養土を含むプラグポットに鉢上げし、
さらに23℃/24時間明所の条件下に1週間培養した。ま
た、本ＤＮＡRHL41発現ベクターが導入されていないAra
bidopsis thaliana WS（以下、野生型植物と記す。）を
同様に培養した。得られた形質転換植物および野生型植
物について、プラグポットの上端から約1cmの箇所をメ
スで一部切断することにより根の一部を切断した後、そ
れぞれのプラグポット内の培養土に、菌濃度1ｘ105/ml
の青枯れ病菌（Ralstonia solanacearum）液を1ml注入
した。23℃/14時間明所/8時間暗所の条件下に24日間培
養した。その結果、野生型植物ではロゼッタ葉の白色化
が認められたのに対して、形質転換植物では野生型植物
に見られるような白色化がほとんど認められず、本ＤＮ
ＡRHL41発現ベクターが導入された形質転換植物が病害
抵抗性を示すことが明らかとなった。
が導入された形質転換植物の病害抵抗性） 実施例３で得られた本ＤＮＡRHL41発現ベクターが導入
された形質転換植物のT 1種子を50μg/mlカナマイシンを
含む選択培地に播種し、21℃/24時間明所の条件下に2週
間培養した後、培養土を含むプラグポットに鉢上げし、
さらに23℃/24時間明所の条件下に1週間培養した。ま
た、本ＤＮＡRHL41発現ベクターが導入されていないAra
bidopsis thaliana WS（以下、野生型植物と記す。）を
同様に培養した。得られた形質転換植物および野生型植
物について、プラグポットの上端から約1cmの箇所をメ
スで一部切断することにより根の一部を切断した後、そ
れぞれのプラグポット内の培養土に、菌濃度1ｘ105/ml
の青枯れ病菌（Ralstonia solanacearum）液を1ml注入
した。23℃/14時間明所/8時間暗所の条件下に24日間培
養した。その結果、野生型植物ではロゼッタ葉の白色化
が認められたのに対して、形質転換植物では野生型植物
に見られるような白色化がほとんど認められず、本ＤＮ
ＡRHL41発現ベクターが導入された形質転換植物が病害
抵抗性を示すことが明らかとなった。
【００２７】実施例４ （本ＤＮＡRHL41発現ベクター
が導入された形質転換植物における12-oxo-phytodienoa
te reductase遺伝子発現量の解析） 実施例３で得られた本ＤＮＡRHL41発現ベクターが導入
された形質転換植物のT 1種子を50μg/mlカナマイシンを
含む選択培地に播種し、21℃/24時間明所の条件下に2週
間培養した後、培養土を含むプラグポットに鉢上げし、
さらに23℃/24時間明所の条件下に1週間培養した。ま
た、野生型植物を同様に培養した。得られた形質転換植
物および野生型植物からISOGENキット（ニッポンジー
ン）を用いて全RNAを単離し、得られた全RNAからOligot
exTM-MAG mRNA Purification kit （宝酒造）を用いてP
oly(A)+mRNAを精製した。得られたPoly(A)+mRNAを鋳型
とし、AMV Reverse Transcriptase（宝酒造）を用いた
逆転写反応を行うことにより、Cy3またはCy5-dUTPをと
りこませながらｃＤＮＡを合成した。、形質転換植物由
来cDNAにはCy3をとりこませ、野生型植物由来cDNAにはC
y5をとりこませた。得られた両ｃＤＮＡを混合し、ハイ
ブリ液（6xSSC、0.2%SDS、5xDenhardt's溶液、carrierD
NA）中でArabidopsis CHIP I（宝酒造）と、65℃で、1
5.5時間ハイブリダイズさせた。CHIPを洗浄した後、Aff
ymetrix 418 Array Scannerを用いてシグナルを検出
し、BioDiscovery ImaGene Ver.4.0を用いてデータ解析
した。House keeping genesを用いてシグナル強度を補
正し、Cy3/Cy5比を算出した。その結果、本ＤＮＡRHL41
発現ベクターが導入された形質転換植物では、12-oxo-
phytodienoate reductase 遺伝子の２つのホモログにつ
いて、発現量がそれぞれ野生型植物の4.5倍および3.7倍
に増加していることが示された（表１）。
が導入された形質転換植物における12-oxo-phytodienoa
te reductase遺伝子発現量の解析） 実施例３で得られた本ＤＮＡRHL41発現ベクターが導入
された形質転換植物のT 1種子を50μg/mlカナマイシンを
含む選択培地に播種し、21℃/24時間明所の条件下に2週
間培養した後、培養土を含むプラグポットに鉢上げし、
さらに23℃/24時間明所の条件下に1週間培養した。ま
た、野生型植物を同様に培養した。得られた形質転換植
物および野生型植物からISOGENキット（ニッポンジー
ン）を用いて全RNAを単離し、得られた全RNAからOligot
exTM-MAG mRNA Purification kit （宝酒造）を用いてP
oly(A)+mRNAを精製した。得られたPoly(A)+mRNAを鋳型
とし、AMV Reverse Transcriptase（宝酒造）を用いた
逆転写反応を行うことにより、Cy3またはCy5-dUTPをと
りこませながらｃＤＮＡを合成した。、形質転換植物由
来cDNAにはCy3をとりこませ、野生型植物由来cDNAにはC
y5をとりこませた。得られた両ｃＤＮＡを混合し、ハイ
ブリ液（6xSSC、0.2%SDS、5xDenhardt's溶液、carrierD
NA）中でArabidopsis CHIP I（宝酒造）と、65℃で、1
5.5時間ハイブリダイズさせた。CHIPを洗浄した後、Aff
ymetrix 418 Array Scannerを用いてシグナルを検出
し、BioDiscovery ImaGene Ver.4.0を用いてデータ解析
した。House keeping genesを用いてシグナル強度を補
正し、Cy3/Cy5比を算出した。その結果、本ＤＮＡRHL41
発現ベクターが導入された形質転換植物では、12-oxo-
phytodienoate reductase 遺伝子の２つのホモログにつ
いて、発現量がそれぞれ野生型植物の4.5倍および3.7倍
に増加していることが示された（表１）。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【発明の効果】本発明により、病害抵抗性植物を提供す
ることが可能となる。
ることが可能となる。
【００３０】［配列表フリーテキスト］
配列番号３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００３１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Sumitomo Chemical Co., Ltd.
<120> A method for preparing desease resistance plant
<130> P153312
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 162
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
Met Val Ala Ile Ser Glu Ile Lys Ser Thr Val Asp Val Thr Ala Ala
1 5 10 15
Asn Cys Leu Met Leu Leu Ser Arg Val Gly Gln Glu Asn Val Asp Gly
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Arg Val Phe Thr Cys Lys Thr Cys Leu Lys Gln Phe
35 40 45
His Ser Phe Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys Pro
50 55 60
Asn Asn Asp Ala Leu Ser Ser Gly Leu Met Lys Lys Val Lys Thr Ser
65 70 75 80
Ser His Pro Cys Pro Ile Cys Gly Val Glu Phe Pro Met Gly Gln Ala
85 90 95
Leu Gly Gly His Met Arg Arg His Arg Asn Glu Ser Gly Ala Ala Gly
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Arg Ala Leu Leu Pro Glu Pro Thr Val Thr Thr
115 120 125
Leu Lys Lys Ser Ser Ser Gly Lys Arg Val Ala Cys Leu Asp Leu Ser
130 135 140
Leu Gly Met Val Asp Asn Leu Asn Leu Lys Leu Glu Leu Gly Arg Thr
145 150 155 160
Val Tyr
<210> 2
<211> 733
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> CDS
<222> (66)..(554)
<400> 2
acaaaccaca agaggatcat ttcatttttt attgtttcgt tttaatcatc atcatcagaa 60
gaaaa atg gtt gcg ata tcg gag atc aag tcg acg gtg gat gtc acg gcg 110
Met Val Ala Ile Ser Glu Ile Lys Ser Thr Val Asp Val Thr Ala
1 5 10 15
gcg aat tgt ttg atg ctt tta tct aga gtt gga caa gaa aac gtt gac 158
Ala Asn Cys Leu Met Leu Leu Ser Arg Val Gly Gln Glu Asn Val Asp
20 25 30
ggt ggc gat caa aaa cgc gtt ttc aca tgt aaa acg tgt ttg aag cag 206
Gly Gly Asp Gln Lys Arg Val Phe Thr Cys Lys Thr Cys Leu Lys Gln
35 40 45
ttt cat tcg ttc caa gcc tta gga ggt cac cgt gcg agt cac aag aag 254
Phe His Ser Phe Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys
50 55 60
cct aac aac gac gct ttg tcg tct gga ttg atg aag aag gtg aaa acg 302
Pro Asn Asn Asp Ala Leu Ser Ser Gly Leu Met Lys Lys Val Lys Thr
65 70 75
tcg tcg cat cct tgt ccc ata tgt gga gtg gag ttt ccg atg gga caa 350
Ser Ser His Pro Cys Pro Ile Cys Gly Val Glu Phe Pro Met Gly Gln
80 85 90 95
gct ttg gga gga cac atg agg aga cac agg aac gag agt ggg gct gct 398
Ala Leu Gly Gly His Met Arg Arg His Arg Asn Glu Ser Gly Ala Ala
100 105 110
ggt ggc gcg ttg gtt aca cgc gct ttg ttg ccg gag ccc acg gtg act 446
Gly Gly Ala Leu Val Thr Arg Ala Leu Leu Pro Glu Pro Thr Val Thr
115 120 125
acg ttg aag aaa tct agc agt ggg aag aga gtg gct tgt ttg gat ctg 494
Thr Leu Lys Lys Ser Ser Ser Gly Lys Arg Val Ala Cys Leu Asp Leu
130 135 140
agt cta ggg atg gtg gac aat ttg aat ctc aag ttg gag ctt gga aga 542
Ser Leu Gly Met Val Asp Asn Leu Asn Leu Lys Leu Glu Leu Gly Arg
145 150 155
aca gtt tat tga ttttatttat tttccttaaa ttttctgaat atatttgttt 594
Thr Val Tyr
160
ctctcattct ttgaattttt cttaatattc tagattatac atacatccgc agatttagga 654
aactttcata gagtgtaatc ttttctttct gtaaaaatat attttacttg tagcattgga 714
gatttgttat gagattatc 733
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer
for PCR
<400> 3
gataatctca taacaaatct ccaatgctac 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide primer
for PCR
<400> 4
ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg 30
【図１】本ＤＮＡRHL41発現ベクターpIG-RHL41-Sの構造
とその構築過程を示す図である。
とその構築過程を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA17 CA19
CB02 CD03 CD07 CD09 CD13
CD17 CD21
4B024 AA08 BA80 CA04 CA12 CA20
DA01 DA05 EA04 GA11 GA17
GA27 HA11
4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14
BA02 BA25 BA30 BB01 BC31
CA24 CA47 CA53
Claims (5)
- 【請求項１】植物への病害抵抗性付与のための、以下の
いずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白
質をコードする核酸の使用。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 - 【請求項２】植物への病害抵抗性付与のための、以下の
いずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白
質の使用。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 - 【請求項３】アブラナ科植物への病害抵抗性付与のため
の、以下のいずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィ
ンガー蛋白質をコードする核酸の使用。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 - 【請求項４】植物への青枯れ病抵抗性付与のための、以
下のいずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー
蛋白質をコードする核酸の使用。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列 - 【請求項５】植物細胞において12-oxo-phytodienoate r
eductase遺伝子の発現量を増加させるための、以下のい
ずれかのアミノ酸配列を有するジンクフィンガー蛋白質
をコードする核酸の使用。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ
酸配列であり、かつ植物に病害抵抗性を付与する能力を
有する蛋白質のアミノ酸配列
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001281185A JP2003088377A (ja) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | 植物への病害抵抗性付与方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001281185A JP2003088377A (ja) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | 植物への病害抵抗性付与方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003088377A true JP2003088377A (ja) | 2003-03-25 |
Family
ID=19105060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001281185A Pending JP2003088377A (ja) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | 植物への病害抵抗性付与方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003088377A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321162A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-01-18 | 左开井 | 抗植物枯萎病和黄萎病的GbRPS1基因及其应用 |
-
2001
- 2001-09-17 JP JP2001281185A patent/JP2003088377A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321162A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-01-18 | 左开井 | 抗植物枯萎病和黄萎病的GbRPS1基因及其应用 |
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