CN115605500A - 控制分生组织大小以改良作物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于修饰植物中的FACIATED EAR2(FEA2)基因、任选地修饰分生组织尺寸的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数的植物。

Description

控制分生组织大小以改良作物的方法
关于序列表电子提交的声明
根据37C.F.R.§1.821，经由EFS-Web提交了文件名为1499.26.WO_ST25.txt的ASCII文本格式的序列表，以代替其纸质副本。序列表大小为454,224字节，于2021年3月25日生成。该序列表在此通过引用将其公开内容并入说明书中。
优先权声明
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年3月26日提交的美国临时申请No.63/000,206的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于修饰植物中的FACIATED EAR2(FEA2)基因、任选地用于修饰分生组织尺寸的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数(kernel row number)的植物。
背景技术
新的植物器官在植物的称为分生组织的生长尖端处起始。在分生组织中维持着未分化干细胞群。在生长期间，分生组织将干细胞分配给新形成的器官，包括种子，同时保留一些干细胞以连续维持分生组织。已经描述了几种保守的分子机制，其控制干细胞群的大小以确保组织化生长和适当的分生组织大小。
由于玉米穗发育的模块化性质，较大的分生组织倾向于启动更多的花，因此，分生组织尺寸对穗行数和产量具有直接影响。在玉米穗的发育期间启动的花的数量直接限制了谷粒产量。围绕穗周围启动的增加数量的花(穗行数或KRN)是在玉米驯化期间选择的一个主要性状。通过育种的显著进步已经导致了穗行数的急剧增加，从作为玉米先辈的teosinte中的2行，到现代优秀玉米品种中的～8-20行。在各种玉米品系中，穗行数可以高达36。
在模型植物拟南芥模型中描述的经典调控途径中，分生组织顶点中的细胞分泌CLAVATA3(CLV3)肽，其移动通过质外体进入中心干细胞结构域，在那里它与包括CLAVATA1(CLV1)和CLAVATA2(CLV2)的若干富含亮氨酸的受体(LRR)相互作用。这种受体-配体相互作用刺激信号传导，其最终起到降低WUS表达和限制干细胞群扩增的作用。WUS的靶标之一是CLV3基因本身，通过这种方式，WUS起到限制其自身表达并维持干细胞稳态的作用(Fletcher,J.C.,Plants 7:87(2018))。
CLV1、CLV2或CLV3中功能丧失突变导致WUS结构域的扩增和增加的分生组织大小(Schoof等人,Cell 100:635–644(2000))。通常，这种分生组织大小的增加导致异常的植物生长，因为分生组织不受控制地膨胀并且变得紊乱，这种现象被称为扁化(Je等人,NatGenet 48:ng.3567(2016a))。重要的是，较大的分生组织不仅制造较大的器官，而且围绕较大区域的器官数量增加。由于分生组织大小和器官数目之间的这种关系，玉米CLV-WUS信号传导基因中的突变可以导致增加的花数目和产量。然而，虽然玉米CLV2直系同源物FACIATED EAR2(FEA2)中强的功能丧失突变导致扩大的分生组织和KRN的增加，但是穗是无序的，并且因此没有产量增加(Taguchi-Shiobara等人,Gene Dev 15:2755–2766(2001))。
需要用于调节分生组织大小的新策略以改善作物性能。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种植物或其植物部分，其包含在编码FEA2蛋白的内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中的至少一个非天然突变。
本发明的第二方面提供了一种植物细胞，其包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)CRISPR-Cas效应蛋白；和(b)引导核酸(gRNA、gDNA、crRNA、crDNA、sgRNA、sgDNA)，其包含与编码FEA2蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。
本发明的第三方面提供了在FEA2基因内包含至少一个非天然存在的突变的玉米植物细胞，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与所述FEA2基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。
本发明的第四方面提供了一种产生/培育无转基因的经过编辑的玉米植物的方法，包括：将本发明的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；和选择包含所述至少一个非天然突变且无转基因的子代玉米植物，从而产生无转基因的经过编辑的玉米植物。
本发明的第五方面提供了一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域中种植本发明的两株或更多株植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。
本发明的第六方面提供了一种在玉米FEA2蛋白的区域中产生变异的方法，包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码所述玉米FEA2蛋白的区域的玉米FEA2基因的区域，其中所述区域包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或者所述区域由SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列编码；以及使所述玉米FEA2基因的区域与所述编辑系统接触，从而将突变引入玉米FEA2蛋白的区域中；以及在FEA2蛋白的区域中产生变异。
本发明的第七方面提供了一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中编辑特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源FEA2基因内的靶位点，所述内源FEA2基因包含与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，从而在玉米植物细胞的内源FEA2基因中产生编辑并产生在所述内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物细胞。
第八方面提供了一种用于制造玉米植物的方法，其包括：(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域(例如DNA结合结构域；例如编辑系统)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；或结合编码与SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列；(b)从所述群中选择其中至少一个野生型内源FEA2基因已经被突变的玉米植物细胞；和(c)将所选择的植物细胞生长成玉米植物。
第九方面提供了一种用于增加玉米植物中的穗行数的方法，包括：(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞与靶向所述野生型内源FEA2基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与核酸结合结构域(例如DNA结合结构域；RNA结合结构域；例如编辑系统)连接，该核酸结合结构域结合野生型内源FEA2基因中的靶位点，其中所述野生型内源FEA2基因：(i)编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(iii)包含与SEQ IDNO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；或(iv)编码与SEQID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，以产生在野生型内源FEA2基因中包含突变的玉米植物细胞，从而产生包含在所述内源FEA2基因中具有至少一个突变的细胞的玉米植物；和(b)将所述玉米植物细胞生长成玉米植物，其在所述野生型内源FEA2基因中包含突变，从而产生具有突变的内源性FEA2基因并产生具有增加的穗行数的一个或多个穗的玉米植物，任选地其中所述具有增加的穗行数的所述一个或多个穗的长度没有实质性减小。
第十方面提供了用于产生包含具有突变的内源FEA2基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因(a)编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，以产生在野生型内源FEA2基因中包含突变的植物细胞，从而产生包含在内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
本发明的第十一方面提供了用于生产包含突变的内源FEA2基因并表现出增加的穗行数(例如产生具有增加的穗行数的穗，任选地基本上不缩短穗的长度)的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使所述玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因：(a)编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，从而生产包含具有突变的内源FEA2基因并表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分。
第十二方面提供了与FEA2基因中的靶位点结合的引导核酸，所述靶位点包含SEQID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列的核苷酸序列。
在第十三方面，提供了一种系统，其包含本发明的引导核酸和与所述引导核酸结合的CRISPR-Cas效应蛋白。
第十四方面提供了一种基因编辑系统，其包含与引导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述引导核酸包含与内源FEA2基因结合的间隔子序列。
在第十五方面，提供了一种复合物，所述复合物包含引导核酸和含有切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述引导核酸结合内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因：(a)编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，其中所述切割结构域切割所述FEA2基因中的靶标链。
在第十六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含(a)编码CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，所述CRISPR-Cas效应蛋白包含切割结构域，和(b)与内源FEA2基因中的靶位点结合的引导核酸，其中所述引导核酸包含与下述互补并与之结合的间隔子序列：(i)编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的核酸的一部分；(ii)与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列的一部分；(iii)与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列的一部分；和/或(iv)与编码SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列的序列具有至少90％序列同一性的序列。
在另一个方面，提供了一种在植物中的内源FEA2基因中产生突变的方法，包括：(a)将基因编辑系统靶向FEA2基因的编码相对于SEQ ID NO:68的氨基酸位置编号而言位于位置475、476、477、478或479处的氨基酸残基的部分，和(b)选择在相对于SEQ ID NO:68的氨基酸位置编号而言位于位置475-479之一处的替代氨基酸、任选地在位置477处的氨基酸残基处的替代氨基酸的植物。
本发明的另一方面提供了编码玉米FEA2蛋白的显性负突变(dominant negativemutation)、半显性突变(semi-dominant mutation)或弱的功能损失突变(weak loss-of-function mutation)的核酸。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:83-113中任一个的核苷酸序列和/或编码SEQ ID NO:159-186中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸的一部分包含SEQ ID NO:114-128中任一个的序列和/或编码SEQ ID NO:134-148中任一个的氨基酸序列。
本文还提供了如本文所述修饰的FEA2多肽，所述修饰的FEA2多肽包含相对于SEQID NO:74的氨基酸位置编号而言位于位置475、476、477、478或479处的一个或多个氨基酸残基中的突变和/或包含SEQ ID NO:134-148中任一个的氨基酸序列。
在另一方面，提供了包含本发明的核酸和/或如本文所述的修饰的FEA2多肽的玉米植物或其部分。
在另一方面，提供了一种玉米植物或其部分，其包含内源FEA2基因中的至少一种非天然突变，所述玉米植物表现出增加的穗行数(例如产生具有增加的穗行数的穗，任选地基本上不减少穗的长度)。在一些方面，提供了一种玉米植物，其还表现出增加的产量，和改善的抗病性，以及表现出维持的更大的分生组织和根分生组织。
还提供了在其基因组中包含通过本发明的方法产生的在子基因组中包含一种或多种突变的FACIATED EAR2(FEA2)基因的植物以及用于制造本发明的植物的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。
在下面的本发明描述中更详细地阐述了本发明的这些和其他方面。
序列的简要描述
SEQ ID NO：1-17是可用于本发明的示例性Cas12a氨基酸序列。
SEQ ID NO：18-20是可用于本发明的示例性Cas12a核苷酸序列。
SEQ ID NO：21-22是编码启动子和内含子的示例性调节序列。
SEQ ID NO：23-29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。
SEQ ID NO：30-40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。
SEQ ID NO：41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)序列。
SEQ ID NO:42-44提供V型CRISPR-Cas12a核酸酶的原间隔子邻近基序位置的实例。
SEQ ID NO:45-47提供可用于本发明的示例性肽标签和亲和多肽。
SEQ ID NO:48-58提供可用于本发明的RNA募集基序示例和相应的亲和多肽。
SEQ ID NO：59-60是可用于本发明的示例性Cas9多肽序列。
SEQ ID NO：61-71是可用于本发明的示例性Cas9多核苷酸序列。
SEQ ID NO：72是FEA2基因组序列的实例。
SEQ ID NO：73是FEA2编码(cds)序列的实例。
SEQ ID NO：74是FEA2多肽序列的实例。
SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76是FEA2多肽的示例性靶标区域。
SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78是FEA2基因组序列的示例性靶区域。
SEQ ID NO：79-82是可用于本发明的核酸引导的示例性间隔子序列。
SEQ ID NO：83-113是示例性的经编辑的FEA2核酸序列。
SEQ ID NO：114-128是图3中所示的经编辑的FEA2核酸序列的部分。
SEQ ID NO：129是FEA2核酸序列的一部分，其显示如图4中所示的用于编辑的示例性靶区域。
SEQ ID NO：130显示了图3中所示的共有FEA2核苷酸序列。
SEQ ID NO：131显示了图3中所示的共有野生型(WT)FEA2编码序列。
SEQ ID NO：132-148是图3中所示的经编辑的FEA2氨基酸序列的部分。
SEQ ID NO：149-153是图4所示的经编辑的FEA2核苷酸序列的部分。
SEQ ID NO：154-158是图4中所示的经编辑的FEA2氨基酸序列的部分。
SEQ ID NO:159-186是分别由经编辑的FEA2核酸序列SEQ ID NO:83-113编码的多肽。
附图说明
图1提供了FEA2多肽的图谱，其显示富含亮氨酸的重复(LRR)结构域的位置和一个靶区域实例。
图2提供了FEA2编码序列(cds)(SEQ ID NO：129)的区域或部分的示意图，其示出了LRR结构域和示例靶区域以及用于编辑靶区域的示例间隔子。间隔子1(SEQ ID NO:74)、间隔子2(SEQ ID NO:75)、间隔子3(SEQ ID NO:76)和间隔子4(SEQ ID NO:73)。
图3提供了经编辑的FEA2核酸和氨基酸序列的比对(从上到下，FEA2共有序列(分别为SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、对应的氨基酸序列SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133)、SEQ ID NO:114(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:134)、SEQ ID NO:115(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:135)、SEQ ID NO:116(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:136)、SEQ ID NO:117(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:137)、SEQ ID NO:118(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:138)、SEQ ID NO:119(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:139)、SEQ ID NO:120(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:140)、SEQ ID NO:121(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:141)、SEQ ID NO:122(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:142)、SEQ ID NO:123(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:143)、SEQID NO:124(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:144)、SEQ ID NO:125(对应的氨基酸序列SEQ IDNO:145)、SEQ ID NO:126(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:146)、SEQ ID NO:127(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:147)和SEQ ID NO:128(对应的氨基酸序列SEQ ID NO:148)。
图4示出了修饰内源性FEA2的靶区域以生成多个等位基因的结果。图A示出了对穗行数(KRN)的影响，下面包括来自包含所述经编辑的等位基因的植物的玉米芯的横截面照片及其图形描绘。图B显示经编辑的内源FEA2基因的区域和所产生的特定编辑(从上到下：内源WT FEA2基因(GUS对照)的部分(SEQ ID NO：149和相应的氨基酸序列SEQ ID NO：154)、P477＞S、(SEQ ID NO：150和相应的氨基酸序列SEQ ID NO：155)、P477＞C(SEQ ID NO：151和相应的氨基酸序列SEQ ID NO：156)、P477＞F(SEQ ID NO：152和相应的氨基酸序列SEQID NO：157)、终止2类(SEQ ID NO：153和相应的氨基酸序列SEQ ID NO：158)。图C提供每个经编辑的等位基因的平均穗行数(KRN)和平均穗长(cm)的条形图。
具体实施方式
现在将在下文中参考附图和实施例描述本发明，在实施例中示出了本发明的一些实施方式。该描述并非意在详细列出可以执行本发明的所有不同方式或者可以添加到本发明中的所有特征。例如，关于一个实施方式示出的特征可以并入其他实施方式中，并且关于一个特定实施方式示出的特征可以从该实施方式中删除。因此，本发明中包括，在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。另外，基于本发明的本公开，对本文提出的各种实施方式的许多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，它们并不脱离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些特定实施方式，而不是详尽地指定其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文在对本发明的描述中所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，且并不意图限制本发明。
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文，以获得与呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
除非上下文另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可以任何组合使用。此外，本发明还预期在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。举例来说，如果说明书中陈述组合物包含组分A、B和C，则其具体地表明可以省略A、B或C中的任何一个或其组合，以及单独地或以任何组合进行放弃。
如在本发明的描述和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”/“所述”旨在也包括其复数形式，除非上下文另有明确说明。
同样如本文所使用的，“和/或”是指“和”涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，当解释成替代方案(“或”)时指缺乏组合。
当提及诸如量或浓度等的可测量值时，如本文所用的术语“约”意在涵盖指定值以及指定值的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。例如，“约X”(其中X是可测量值)是指包括X以及X的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文中针对可测量值提供的范围可包含其中的任何其它范围及/或具体值。
如本文所用，诸如“在X和Y之间”/“X-Y”和“在约X和Y之间”/“约X-Y”的短语应被解释为包括X和Y。如本文所用，短语诸如“在约X与Y之间”/“约X-Y”意指“在约X与约Y之间”，短语诸如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。例如，如果公开了范围10到15，则还公开了11、12、13和14。
如本文中所使用的术语“包括”、“具有”和“包含”等是指存在所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组件，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组件和/或其群组的存在或添加。
如本文所用，过渡短语“基本上由……组成”是指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的本发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”不旨在被解释为等同于“包括”。
如本文所用，术语“增加”、“增加的”、“增强”、“增强的”(及其语法变型)描述了与对照相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。例如，包含如本文所述的FEA2基因中的突变的植物可以表现出增加的穗行数(例如产生具有增加的穗行数的穗)，其比不包含相同突变的对照植物的穗行数多至少约5％或更多，任选地，其中包含增加的穗行数的穗的长度没有实质性减小(例如与不包含相同FEA2突变的植物的穗相比，长度减小小于30％)。对照植物通常是与被编辑的植物相同的植物，但是对照植物尚未被类似地编辑，因此不包含所述突变。对照植物可以是等基因植物和/或野生型植物。因此，对照植物可以是与渐渐渗本文所述突变的受试植物相同的育种系、品种或栽培品种，但对照育种系、品种或栽培品种没有所述突变。在一些实施方案中，本发明的植物和对照植物之间的比较是在相同的生长条件下进行的，例如相同的环境条件(土壤、水合、光、热、营养物等)。
如本文所用，术语“减少”、“减少的”、“降低”、“降低的”(及其语法变体)描述了例如与对照物相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的减少。在特定实施方式中，该减少可以导致没有或基本上没有(即，不显著的量，例如小于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。
如本文所用，关于核酸分子和/或核苷酸序列(例如RNA或DNA)使用的术语“表达”、“表达的”等表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录并任选地被翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达感兴趣的多肽或例如功能性非翻译RNA。
“异源”或“重组”核苷酸序列是不与其被引入的宿主细胞天然关联的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝。“异源”核苷酸/多肽可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则其通过有意的人类干预从组合物和/或基因组基因座的其天然形式被实质性修饰。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型内源性FACIATED EAR2(FEA2)基因”是天然存在于参考生物体(例如玉米植物)中或其内源性的FEA2基因。
如本文所用，术语“杂合”是指其中不同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处的遗传状态。
如本文所用，术语“纯合”是指其中相同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处的遗传状态。
如本文所用，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
“无效等位基因”是由基因突变引起的非功能性等位基因，其导致完全缺乏相应蛋白质的产生或产生非功能性的蛋白质。
“显性负突变”是产生改变的基因产物(例如相对于野生型而言具有异常功能)的突变，该基因产物不利地影响野生型等位基因或基因产物的功能。例如，“显性负突变”可以阻断野生型基因产物的功能。显性负突变也可以被称为“反效等位基因突变”(anti-morphic mutation)。
“半显性突变”是指杂合生物体中表型的渐渗小于对纯合生物体观察到的渐渗的突变。
“弱的功能缺失突变”(weak loss-of-function mutation)是导致与野生型基因产物相比具有部分功能或功能降低(部分失活)的基因产物的突变。
“基因座”是染色体上基因或标记或等位基因所在的位置。在一些实施方式中，基因座可以涵盖一或多个核苷酸。
如本文所用，术语“所需等位基因”、“靶等位基因”和/或“感兴趣的等位基因”可互换使用，以指代与所需性状相关的等位基因。在一些实施方案中，取决于所需表型的性质，所需等位基因可以与给定性状的增加或减少(相对于对照)相关联。
当性状与标记连锁时以及当标记的存在是所需性状或性状形式是否存在于和/或在何种程度上将存在于包含所述标记的植物/种质中的指标时，则所述标记与所述性状“相关联”。类似地，当标记与等位基因或染色体间隔连锁时并且当标记的存在是所述等位基因或染色体间隔是否存在于包含该标记的植物/种质中的指标时，则所述标记与所述等位基因或所述染色体间隔“相关联”。
如本文所用，术语“回交”和“进行回交”是指后代植物返回与其亲本之一进行一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8等)杂交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渐渗的所需基因或基因座的亲本植物。“接受者”亲本(使用一次或多次)或“回交”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被渐渗其中的亲本植物。例如参见Ragot,M.et al.Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques,Vol.72,pp.45-56(1995)；和Openshaw et al.,Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,in Proceedings of theSymposium"Analysis of Molecular Marker Data,"pp.41-43(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指回交亲本的第二次使用，“BC2”是指回交亲本的第三次使用，等等。
如本文所用，术语“杂交”或“杂交的”是指通过授粉而配子融合以产生子代(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植物时)。术语“杂交”是指通过授粉融合配子以产生子代的动作。
如本文中所用，术语“渐渗(introgression)”、“进行渐渗(introgressing)”和“渐渗的(introgressed)”是指一个或多个基因座的所需等位基因或所需等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传递。例如，特定基因座的所需等位基因可以通过同一物种的两个亲本间的有性杂交传递给至少一个后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。或者，例如，等位基因的传递可以例如在融合的原生质体中通过两个供体基因组之间的重组发生，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需等位基因可以是标记、QTL、转基因等的选定等位基因。包含所需等位基因的后代可以与具有所需遗传背景的品系回交一次或多次(例如1次、2次、3次、4次或更多次)，选择所需等位基因，结果是所需等位基因变成固定在所需遗传背景中。例如，与非水胁迫条件下产量增加相关联的标记可从供体渐渗到不包含该标记且在非水胁迫条件下不显示产量增加的回交亲本。然后可以将得到的后代回交一次或多次，并进行选择，直至后代具有与在回交亲本背景下非水分胁迫条件下产量增加相关联的遗传标记。
“遗传图谱”是对给定物种中一条或多条染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格的形式描述。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离通过它们之间的重组频率来测量。可以使用多种标记检测基因座之间的重组。遗传图谱是作图群体、所用标记类型和不同群体间每个标记的多态性潜力的产物。基因座之间的顺序和遗传距离可以因遗传图谱的不同而不同。
如本文中所用，术语“基因型”是指个体(或个体群体)在一个或多个基因座的遗传组成，与可观察和/或可检测和/或表现的性状(表型)形成对比。基因型由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因定义。术语基因型可用于指个体在单个基因座、多个基因座的遗传组成，或者更一般地，术语基因型可用于指个体基因组中所有基因的个体遗传组成。基因型可以例如使用标记间接表征和/或通过核酸测序直接表征。
如本文中所用，术语“种质”指个体(例如植物)、个体群(例如植物品系、品种或家族)或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质，或来自其的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以与生物体或细胞分离。一般来说，种质提供了具有特定遗传组成的遗传物质，所述遗传物质为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传性质提供了基础。如本文中所用，种质包括可从其生长出新植物的细胞、种子或组织，以及可培养成完整植物的植物部分(例如叶、茎、芽、根、花粉、细胞等)。
如本文中所用，术语“栽培品种”和“品种”是指一组相似的植物，它们通过结构或遗传特征和/或性能可以与同一物种内的其它品种相区别。
如本文中所用，术语“外来的”、“外来品系”和“外来种质”是指任何非优良的植物、品系或种质。一般来说，外来植物/种质不源自任何已知的优良植物或种质，而是被选择来将一种或多种所需遗传元件引入育种程序(例如以将新颖等位基因引入育种程序)。
如本文中所用，植物育种上下文中的术语“杂种”是指通过不同品系或品种或物种的植物杂交(包括但不限于两个近交系之间的杂交)产生的遗传上相异的亲本的后代。
如本文中所用，术语“近交”是指基本上纯合的植物或品种。该术语可以指在整个基因组中基本上纯合的植物或植物品种，或者就特别感兴趣的基因组部分而言基本上纯合的植物或植物品种。
“单倍型”是个体在多个基因座的基因型，即等位基因的组合。通常，定义单倍型的遗传基因座是物理和遗传连锁的，即在同一染色体片段上。术语“单倍型”可以指特定基因座处的多态性，诸如单个标记基因座，或沿染色体区段的多个基因座处的多态性。
如本文中所用，术语“异源的”是指源自外来物种的核苷酸/多肽，或者，如果源自同一物种，则是通过有意的人为干预，在组成和/或基因组基因座上对其天然形式进行了实质性的修饰。
如本文中所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。当合成产生dsRNA时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已经显示出以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的强效反义抑制剂。也可以进行其他修饰，诸如对磷酸二酯骨架或RNA的核糖基团中的2’-羟基的修饰。
如本文中所用，术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5’末端至3'末端的序列，包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成的(例如化学合成的)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中任一种都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也可互换使用，是指核苷酸的杂多聚体。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以从左至右的5’至3’方向呈现，并且使用美国测序规则37 CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中阐述的用于表示核苷酸特征的标准代码来表示。如本文中所用，“5’区”可以指多核苷酸的最靠近多核苷酸5’末端的区域。因此，例如，多核苷酸的5’区中的元件可以位于从位于所述多核苷酸的5’末端的第一个核苷酸至位于该多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。如本文中所用，“3’区”可以指多核苷酸的最靠近多核苷酸3’末端的区域。因此，例如，多核苷酸的3’区中的元件可以位于从位于所述多核苷酸的3’末端的第一个核苷酸至位于该多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。
如本文中关于核酸所使用的，术语“片段”或“部分”是指相对于参考核酸而言长度缩短(例如缩短1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、20个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850或900个或更多个核苷酸或者其间的任何范围或数值)的核酸，并且其包含与所述参考核酸的相应部分相同或几乎相同(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成和/或由所述核苷酸序列组成。如果合适，这种核酸片段可以包含在更大的多核苷酸中作为其组分。例如，本发明的引导核酸的重复序列可以包含野生型CRISPR-Cas重复序列(例如野生型CRISPR-Cas重复序列；例如来自例如Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c等的CRISPR Cas系统的重复)的“部分”。
在一些实施方案中，核酸片段可包含编码FEA2多肽的核酸的约800、810、820、850、860、870、880、890、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1810、1820、1830、1840、1841、1842、1843、1844、1845、1850、1900、2000、2100、2200、2300或2319个连续核苷酸或者其中的任何范围或数值，基本上由其组成或由其组成，任选地，FEA2基因的片段可以是约850至约1000个连续核苷酸长，约750至约950个连续核苷酸长，约700至约800个连续核苷酸长，约500至约800个连续核苷酸长，约400至约600个连续核苷酸长，约300至约400个连续核苷酸长，约200至约300个连续核苷酸长，约100至约200个连续核苷酸长，约100至约150个连续核苷酸长，约50至约100个连续核苷酸长，约10至约50个连续核苷酸长，或其中的任何范围或值。
在一些实施方案中，“序列特异性核酸结合结构域”(例如序列特异性DNA结合结构域)可与编码本文所述的FEA2多肽的核苷酸序列的一个或多个片段或部分结合。
如本文关于多肽所使用的，术语“片段”或“部分”可指相对于参考多肽而言长度缩短的多肽，其包含与所述参考多肽的相应部分相同或几乎相同(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在适当的情况下，这种多肽片段可以包含在一个更大的多肽中作为其构成部分。在一些实施方案中，所述多肽片段包含参考多肽的至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、260个、270个、280个、290个或更多个连续氨基酸，基本上由所述连续氨基酸组成或由所述连续氨基酸组成。在一些实施方式中，多肽片段可包含FEA2多肽的约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550或600个连续氨基酸残基，或其间的任何范围或值(例如SEQ ID NO:74的片段或一部分(例如SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76))，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，缺失可以导致框内缺失等位基因。在一些实施方案中，这种缺失可以是显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变，其被包含在植物中时可以导致植物与不包含所述缺失的植物相比表现出增加的穗行数(例如产生表现出增加的穗行数的一个或多个穗)，任选地，其中表现出增加的穗行数的一个或多个穗的长度没有实质性减小。在一些实施方式中，这样的植物还可表现出增加的产量和增加的抗病性，以及更大的分生组织和根部分生组织的维持。在一些实施方案中，缺失可以是长度为约3个连续碱基对至约42个连续碱基对，任选长度为约9个连续碱基对至约33个连续碱基对(例如长度为约3至约11个氨基酸)的缺失。可以在多于一个位置编辑FEA2基因，从而提供包含多于一个突变的FEA2基因。
在一些实施方案中，针对核酸的“部分”或“区域”是指来自基因(例如FEA2基因)的至少2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，FEA2基因的一部分可以是约35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或更多个连续核苷酸(例如SEQ ID NO:72的核苷酸1500-1538或SEQ ID NO:73的核苷酸1417-1455；例如SEQID NO:77；或SEQ ID NO:72的核苷酸1488-1550或SEQ ID NO:73的核苷酸1405-1467，例如SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，关于多肽的“部分”或“区域”意指来自多肽(例如FEA2多肽)的至少2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，FEA2多肽的一部分可以是约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个连续的氨基酸残基(例如SEQ ID NO:74的氨基酸残基473-485；例如SEQ ID NO:75；或SEQ ID NO:74的氨基酸残基468-489；例如SEQ ID NO:76)。(参见例如图2-4)。
在一些实施方案中，“序列特异性核酸结合结构域”可与编码本文所述的FEA2多肽的核苷酸序列的一个或多个片段或部分结合。
如本文关于核酸所使用的，术语“功能性片段”是指编码多肽的功能性片段的核酸。
如本文中所用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA、抗微小RNA反义寡脱氧核糖核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可以能够用于或不能够用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区)。基因可以是“分离的”，其是指核酸实质性或基本上不含通常被发现与以其天然状态存在的所述核酸相关联的组分。此类组分包括来自重组生产的其他细胞材料、培养基和/或用于化学合成所述核酸的各种化学物质。
术语“突变”是指点突变(例如错义或无义，或导致移框的单个碱基对的插入或缺失)、插入、缺失和/或截短。当突变是氨基酸序列中的残基被另一个残基取代，或者序列中一个或多个残基的缺失或插入时，通常通过列出原始残基、随后是该残基在所述序列中的位置以及新取代的残基的身份来描述突变。截短可包括在多肽的C末端或在多肽的N末端的截短。多肽的截短可以是编码所述多肽的基因的相应5’端或3’端的缺失的结果。当将一个或多个碱基对的缺失或插入引入基因时，可以发生移框突变。基因中的移框突变可以导致产生与野生型多肽相比更长、更短或相同长度的多肽，这取决于第一终止密码子在所述基因的突变区域之后何时出现。
如本文中所用，术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“A-G-T”(5’至3’)与互补序列“T-C-A”(3’至5’)结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补性可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
如本文中所用，“互补”可以指与比较核苷酸序列有100％互补性，或者其可以指与比较核苷酸序列有小于100％互补性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等的互补性)。
具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中被称为“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列以及来自相同物种和其他物种的直向同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间以位置同一性百分比(即，序列相似性或同一性)表示的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法还包含与本发明核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文中所用，“直向同源”是指在物种形成期间从共同的祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有实质性的序列同一性(例如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。
如本文中所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述方法包括、但不限于在以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology(Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.编辑)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinje,G.编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press,New York(1991)。
如本文中所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中与测试(“受试”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“序列同一性百分比”可以指与参照多肽相比，氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
如本文中所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或多肽序列的上下文中，短语“实质性同一”/“实质性相同”或“实质性同一性”是指两个或更多个序列或亚序列在就最大对应性进行比较和比对时，具有如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％核苷酸或氨基酸残基同一性。在本发明的一些实施方案中，实质性同一性存在于本发明核苷酸序列的连续核苷酸区域中，所述连续核苷酸区域的长度为约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约15个核苷酸至约25个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约90个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约200个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约100个核苷酸至约400个核苷酸、约100个核苷酸至约500个核苷酸、约100个核苷酸至约600个核苷酸、约100个核苷酸至约800个核苷酸、约100个核苷酸至约900个核苷酸、或更多个核苷酸，或者其间的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，核苷酸序列可以在至少约20个核苷酸(例如约20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、50个、60个、70个或80个核苷酸或更多个)上实质性相同。
在本发明的一些实施方案中，实质性同一性存在于本发明多肽的连续氨基酸残基区域上，其为长度为约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基、约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约7个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约10个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约15个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约20个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约30个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约50个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约60个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约70个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约90个氨基酸残基至约100个氨基酸残基，或更多个氨基酸残基，以及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，多肽序列可以在至少约8个连续的氨基酸残基(例如长度约8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、130个、140个、150个、175个、200个、225个、250个、300个、350个或更多个氨基酸，或更多连续氨基酸残基)上彼此实质性相同。在一些实施方式中，两种或更多种FEA2多肽可以相同或基本上相同(例如至少70％至99.9％相同)；例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％相同或其间的任何范围或值。
对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过诸如以下的工具进行：Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，以及任选地通过这些算法的计算机化实现(诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(可作为
Figure BDA0003943796830000251
Wisconsin
Figure BDA0003943796830000252
(AccelrysInc.,San Diego,Ca)的一部分获得))进行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对的序列共有的相同组分的数目除以参考序列区段(例如整个参考序列或参考序列的较小确定部分)中组分的总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分的比较，或者是与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，对于翻译的核苷酸序列，也可以使用BLASTX2.0版，对于多核苷酸序列，使用BLASTN 2.0版来确定“同一性百分比”。
当两个核苷酸序列在严格条件下相互杂交时，也可以认为这两个序列是实质性互补的。在一些实施方案中，被认为实质性互补的两个核苷酸序列在高度严格条件下相互杂交。
核酸杂交实验如Southern和Northern杂交上下文中的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。核酸杂交的详细指南可见于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes第I部分第2章"Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier,New York(1993)。通常，在确定的离子强度和pH下，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比具体序列的热熔点(Tm)低约5℃。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件，使其等于特定探针的Tm。在Southern或northern印迹中，用于具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列在滤膜上杂交的严格杂交条件的实例是42℃下的50％甲酰胺和1mg肝素，其中杂交进行过夜。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃下用0.1 5MNaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下用0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook，同下)。通常，高严格洗涤之前是低严格性洗涤，以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤的实例是在45℃下用1x SSC洗涤15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的实例是在40℃下用4-6x SSC洗涤15分钟。对于短探针(例如约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及小于约1.0M Na离子的盐浓度，在pH 7.0至8.3下通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度通常为至少约30℃。还可通过加入诸如甲酰胺等去稳定剂来达到严格条件。一般来说，在特定的杂交测定中，信噪比为对于无关探针观察的信噪比的2倍(或更高)表明检测到了特异性杂交。如果在严格条件下不相互杂交的核苷酸序列编码的蛋白质实质性相同，则所述核苷酸序列仍然是实质性相同的。这可以在例如使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核苷酸序列的拷贝时发生。
可以对本发明的多核苷酸和/或重组核酸构建体(例如表达盒和/或载体)进行密码子优化以用于表达。在一些实施方案中，可以对本发明编辑系统的多核苷酸、核酸构建体、表达盒和/或载体(例如包含/编码序列特异性核酸结合结构域(例如来自多核苷酸引导的核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute蛋白和/或CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应蛋白)(例如I型CRISPR-Cas效应蛋白、II型CRISPR-Cas效应蛋白、III型CRISPR-Cas效应蛋白、IV型CRISPR-Cas效应蛋白、V型CRISPR-Cas效应蛋白或VI型CRISPR-Cas效应蛋白)、核酸酶(例如核酸内切酶(例如Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN))、脱氨酶蛋白/结构域(例如腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶)、编码逆转录酶或结构域的多核苷酸、编码5'-3’核酸外切酶多肽的多核苷酸和/或亲和多肽、肽标签等的序列特异性核酸结合结构域)进行密码子优化，以用于在植物中表达。在一些实施方案中，本发明的经密码子优化的核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体与未经密码子优化的参考核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体具有约70％至约99.9％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)同一性或更高同一性。
在本文所述的任何实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可以与多种启动子和/或其它调控元件可操作地连接，用于在植物和/或植物细胞中表达。因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体还可包含与一个或多个核苷酸序列可操作地连接的一个或多个启动子、内含子、增强子和/或终止子。在一些实施方案中，启动子可以与内含子(例如Ubi1启动子和内含子)可操作地相关联。在一些实施方案中，与内含子相关联的启动子可被称为“启动子区”(例如Ubi1启动子和内含子)。
如本文中提及多核苷酸时使用的“可操作地连接”或“可操作地相关联的”是指所示元件在功能上彼此相关，并且通常在物理上也相关。因此，如本文中所用，术语“可操作地连接”或“可操作地相关联的”是指单个核酸分子上功能上相关联的核苷酸序列。因此，与第二核苷酸序列可操作连接的第一核苷酸序列意指第一核苷酸序列被放置成与第二核苷酸序列处于功能关系中时的情况。例如，如果启动子实现核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子与所述核苷酸序列可操作地相关联。本领域技术人员将会理解，控制序列(例如启动子)不需要与与其可操作地相关联的核苷酸序列毗邻，只要控制序列能够指导其表达即可。因此，例如居间的不翻译、但仍转录的核酸序列可存在于启动子与所述核苷酸序列之间，并且所述启动子仍然可以被认为是可与该核苷酸序列“可操作地连接”。
如本文中所用，涉及多肽时，术语“连接的”是指一个多肽与另一个多肽的附接。多肽可以直接(例如通过肽键)或通过接头与另一多肽(在N-末端或C-末端)连接。
术语“接头”是本领域公认的，是指连接两个分子或部分(例如,融合蛋白的两个结构域，例如核酸结合多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽；或DNA核酸内切酶多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽)的化学基团或分子。接头可以由单个连接分子组成，或者可以包含不止一个连接分子。在一些实施方案中，接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，诸如二价有机部分。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸或者其可以是肽。在一些实施方案中，接头是肽。
在一些实施方案中，可用于本发明的肽接头的长度可为约2至约100个或更多个氨基酸，例如，约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多个氨基酸(例如长度为约2至约40个、约2至约50个、约2至约60个、约4至约40个、约4至约50个、约4至约60个、约5至约40个、约5至约50个、约5至约60个、约9至约40个、约9至约50个、约9至约60个、约10至约40个、约10至约50个、约10至约60个，或长度为约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个氨基酸至约26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多个氨基酸(例如长度为约105个、110个、115个、120个、130个、140个、150个或更多个氨基酸))。在一些实施方案中，肽接头可以是GS接头。
如本文中所用，关于多核苷酸的术语“连接的”或“融合的”是指一个多核苷酸与另一个多核苷酸的附接。在一些实施方案中，两个或更多个多核苷酸分子可以通过接头连接，所述接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，诸如二价有机部分。多核苷酸可以通过共价或非共价键联或结合(包括例如Watson-Crick碱基配对)或通过一个或多个连接核苷酸与另一个多核苷酸(在5’末端或3’末端)连接或融合。在一些实施方案中，某一结构的多核苷酸基序可插入另一多核苷酸序列中(例如引导RNA中发夹结构的延伸)。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是非天然存在的核苷酸。
“启动子”是控制或调节与所述启动子可操作地相关联的核苷酸序列(例如编码序列)的转录的核苷酸序列。由启动子控制或调节的编码序列可以编码多肽和/或功能性RNA。通常，“启动子”是指含有RNA聚合酶II的结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。通常，相对于相应编码序列的编码区的起始，启动子位于5’或上游。启动子可包含作为基因表达的调控子的其它元件；例如启动子区域。这些包括TATA盒共有序列，并且通常是CAAT盒共有序列(Breathnach和Chambon，(1981)Annu.Rev.Biochem.50:349)。在植物中，CAAT盒可用AGGA盒代替(Messing等，(1983)于Genetic Engineering of Plants,T.Kosuge,C.Meredith和A.Hollaender(编辑),Plenum Press，第211-227页中)。
可用于本发明的启动子可包括例如组成型、诱导型、时间调控型、发育调控型、化学调控型、组织优先型和/或组织特异性启动子，用于制备重组核酸分子，例如“合成核酸构建体”或“蛋白质-RNA复合物”。这些不同类型的启动子是本领域已知的。
启动子的选择可以根据表达的时间和空间要求而变化，也可以根据待转化的宿主细胞而变化。用于许多不同生物体的启动子是本领域公知的。基于本领域的广泛知识，可以为特定目标宿主生物选择合适的启动子。因此，例如，对模式生物中高度组成型表达的基因上游的启动子了解很多，此类知识可以容易地访问并在适当的情况下应用于其它系统中。
在一些实施方案中，在植物中有功能的启动子可以与本发明的构建体一起使用。可用于在植物中驱动表达的启动子的非限制性实例包括RubisCo小亚基基因1的启动子(PrbcS1)、肌动蛋白基因的启动子(Pactin)、硝酸还原酶基因的启动子(Pnr)和重复碳酸酐酶基因1的启动子(Pdca1)(参见，Walker等人，Plant Cell Rep.23:727-735(2005)；Li等人，Gene 403:132-142(2007)；Li等人，Mol Biol.Rep.37:1143-1154(2010))。PrbcS1和Pactin是组成型启动子，Pnr和Pdca1是诱导型启动子。Pnr受硝酸盐诱导，受铵抑制(Li等人，Gene 403:132-142(2007))，Pdca1受盐诱导(Li等人，Mol Biol.Rep.37:1143-1154(2010))。在一些实施方案中，可用于本发明的启动子是RNA聚合酶II(Pol II)启动子。在一些实施方案中，来自玉米的U6启动子或7SL启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自玉米的U6c启动子和/或7SL启动子可用于驱动引导核酸的表达。在一些实施方案中，来自大豆的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自大豆的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于驱动引导核酸的表达。
可用于植物的组成型启动子的实例包括但不限于，叶香树病毒启动子(cestrumvirus promotet,cmp)(美国专利第7,166,770号)、水稻肌动蛋白1启动子(Wang等人(1992)Mol.Cell.Biol.12:3399-3406；以及美国专利第5,641,876号)、CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313:810-812)、CaMV 19S启动子(Lawton等人(1987)Plant Mol.Biol.9:315-324)、nos启动子(Ebert等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:5745-5749)、Adh启动子(Walker等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(Yang&Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-4148)和遍在蛋白启动子。来源于遍在蛋白的组成型启动子在许多细胞类型中积累。已经从几种植物物种中克隆了遍在蛋白启动子用于转基因植物，例如向日葵(Binet等人，1991.Plant Science 79:87-94)、玉米(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.12:619-632)和拟南芥(Norris等人1993.Plant Molec.Biol.21:895-906)。已经在转基因单子叶植物系统中开发了玉米遍在蛋白启动子(UbiP)，专利公开EP 0 342 926中公开了其序列和构建用于单子叶植物转化的载体。遍在蛋白启动子适用于在转基因植物，尤其是单子叶植物中表达本发明的核苷酸序列。另外，由McElroy等人描述的启动子表达盒(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))可被容易地修饰以表达本发明的核苷酸序列，并且特别适用于单子叶宿主。
在一些实施方案中，组织特异性/组织偏好启动子可用于在植物细胞中表达异源多核苷酸。组织特异性或偏好性表达模式包括但不限于绿色组织特异性或偏好性、根特异性或偏好性、茎特异性或偏好性、花特异性或偏好性或者花粉特异性或偏好性表达模式。适于在绿色组织中表达的启动子包括许多调节参与光合作用的基因的启动子，这些启动子中的许多启动子已被从单子叶植物和双子叶植物中克隆出来。在一个实施方案中，可用于本发明的启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth&Grula,PlantMolec.Biol.12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括那些与编码种子贮藏蛋白(诸如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、油菜籽蛋白(napin)和菜豆蛋白)、玉米蛋白或油体蛋白(诸如油质蛋白)、或参与脂肪酸生物合成的蛋白(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因相关联的启动子，以及在胚胎发育期间表达的其它核酸(诸如Bce4，参见例如Kridl等人(1991)Seed Sci.Res.1:209-219；以及欧洲专利第255378号)。可用于在植物，特别是玉米中表达本发明核苷酸序列的组织特异性或组织偏好性启动子包括但不限于在根、髓、叶或花粉中指导表达的启动子。此类启动子公开于例如WO 93/07278(通过引用以其整体并入本文)中。可用于本发明的组织特异性或组织偏好性启动子的其它非限制性实例：美国专利6,040,504中公开的棉花rubisco启动子；美国专利5,604,121中公开的水稻蔗糖合酶启动子；de Framond(FEBS290:103-106(1991)；属于Ciba-Geigy的EP 0 452 269)描述的根特异性启动子；美国专利5,625,136(属于Ciba-Geigy)中描述的茎特异性启动子，其驱动玉米trpA基因的表达；WO01/73087中公开的夜香树夜香树黄叶卷曲病毒启动子；和花粉特异性或偏好性启动子，包括但不限于来自水稻的ProOsLPS10和ProOsLPS11(Nguyen等人，PlantBiotechnol.Reports 9(5):297-306(2015))、来自玉米的ZmSTK2_USP(Wang等人，Genome60(6):485-495(2017))、来自番茄的LAT52和LAT59(Twell等人，Development 109(3):705-713(1990))、Zm13(美国专利第10,421,972号)、来自拟南芥的PLA2-δ启动子(美国专利第7,141,424号)和/或来自玉米的ZmC5启动子(国际PCT公布第WO1999/042587号)。
植物组织特异性/组织偏好性启动子的其他实例包括但不限于根毛特异性顺式元件(RHE)(Kim等人，The Plant Cell 18:2958-2970(2006))、根特异性启动子RCc3(Jeong等人，Plant Physiol.153:185-197(2010))和RB7(美国专利第5459252号)、植物凝集素启动子(Lindstrom等人(1990)Der.Genet.11:160-167；和Vodkin(1983)Prog.Clin.Biol.Res.138:87-98)、玉米醇脱氢酶1启动子(Dennis等人(1984)NucleicAcids Res.12:3983-4000)、S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(Vander Mijnsbrugge等人(1996)Plant and Cell Physiology,37(8):1108-1115)、玉米光收获复合物启动子(Bansal等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3654-3658)、玉米热休克蛋白启动子(O'Dell等人(1985)EMBO J.5:451-458；和Rochester等人(1986)EMBO J.5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Cashmore,"Nuclear genes encoding the small subunit ofribulose-l,5-bisphosphate carboxylase”第29-39页:Genetic Engineering of Plants(Hollaender编辑，Plenum Press 1983；和Poulsen等人(1986)Mol.Gen.Genet.205:193-200)、Ti质粒甘露碱合酶启动子(Langridge等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-3223)、Ti质粒胭脂氨酸合酶启动子(Langridge等人(1989)，同上)，矮牵牛查尔酮异构酶启动子(van Tunen等人(1988)EMBO J.7:1257-1263)、大豆富含甘氨酸蛋白1启动子(Keller等人(1989)Genes Dev.3:1639-1646)、截短的CaMV 35S启动子(O'Dell等人(1985)Nature 313:810-812)、马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子(Wenzler等人(1989)PlantMol.Biol.13:347-354)、根细胞启动子(Yamamoto等人(1990)Nucleic Acids Res.18:7449)、玉米醇溶蛋白启动子(Kriz等人(1987)Mol.Gen.Genet.207:90-98；Langridge等人(1983)Cell 34:1015-1022；Reina等人(1990)Nucleic Acids Res.18:6425；Reina等人(1990)Nucleic Acids Res.18:7449；和Wandelt等人(1989)Nucleic Acids Res.17:2354)、球蛋白-1启动子(Belanger等人(1991)Genetics 129:863-872)、α-微管蛋白cab启动子(Sullivan等人(1989)Mol.Gen.Genet.215:431-440)、PEPCase启动子(Hudspeth&Grula(1989)Plant Mol.Biol.12:579-589)、R基因复合物相关启动子(Chandler等人(1989)Plant Cell 1:1175-1183)和查尔酮合酶启动子(Franken等人(1991)EMBO J.10:2605-2612)。
对种子特异性表达有用的是豌豆的豌豆球蛋白启动子(Czako等人(1992)Mol.Gen.Genet.235:33-40)；以及美国专利第5,625,136号中公开的种子特异性启动子。用于在成熟叶中表达的有用启动子是那些在衰老开始时被转换的启动子，诸如来自拟南芥的SAG启动子(Gan等人(1995)Science 270:1986-1988)。
另外，可以使用在叶绿体中有功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9的5’UTR和美国专利第7,579,516号中公开的其他启动子。可用于本发明的其它启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
可用于本发明的其它调控元件包括但不限于内含子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区。
可用于本发明的内含子可以是从植物中鉴定和分离的内含子，然后被插入到用于植物转化的表达盒。如本领域技术人员所理解的，内含子可以包含自我切除所需的序列，并被框内整合到核酸构建体/表达盒中。内含子可以用作间隔子来分隔一个核酸构建体中的多个蛋白质编码序列，或者可在一个蛋白质编码序列内部使用内含子来例如稳定mRNA。如果它们被用在蛋白质编码序列中，则它们被插入“框内”，其中包括切除位点。还可将内含子与启动子结合以改善或修饰表达。例如，可用于本发明的启动子/内含子组合包括但不限于玉米Ubi1启动子和内含子的组合(参见例如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)。
可用于本发明的内含子的非限制性实例包括来自ADHI基因(例如Adh1-S内含子1、2和6)、遍在蛋白基因(Ubi1)、RuBisCO小亚基(rbcS)基因、RuBisCO大亚基(rbcL)基因、肌动蛋白基因(例如肌动蛋白-1内含子)、丙酮酸脱氢酶激酶基因(pdk)、硝酸还原酶基因(nr)、重复碳酸酐酶基因1(Tdca1)、psbA基因、atpA基因或其任意组合的内含子。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”或可以包含在表达盒内。如本文中所用，“表达盒”意指包含例如一种或多种本发明的多核苷酸的重组核酸分子(例如编码序列特异性核酸(例如DNA)结合结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5’-3’核酸外切酶多肽或结构域的多核苷酸、引导核酸和/或逆转录酶(RT)模板)，其中一种或多种多核苷酸与一种或多种控制序列(例如启动子、终止子等)可操作地相关联。因此，在一些实施方案中，可以提供一个或多个表达盒，其被设计成表达例如本发明的核酸构建体(例如编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶多肽/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码5’-3’核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、编码肽标签的多核苷酸和/或编码亲和多肽的多核苷酸等，或者包含引导核酸、延伸的引导核酸和/或RT模板等)。当本发明的表达盒包含不止一个多核苷酸时，所述多核苷酸可以与驱动所有多核苷酸表达的单个启动子可操作地连接，或者所述多核苷酸可以与一个或多个单独的启动子可操作地连接(例如三个多核苷酸可以由一个、两个或三个启动子以任意组合驱动)。当使用两个或更多个不同的启动子时，所述启动子可以是相同的启动子，也可以是不同的启动子。因此，当包含在单个表达盒中时，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码CRISPR-Cas效应蛋白/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶多肽/结构域的多核苷酸(例如RNA依赖性DNA聚合酶)、和/或编码5’-3’核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、引导核酸、延伸的引导核酸和/或RT模板可以各自与单个启动子或任意组合的独立启动子可操作地连接。
包含本发明的核酸构建体的表达盒可以是嵌合的，意味着其至少一个组分相对于其至少一个其它组分是异源的(例如来自宿主生物的启动子可操作地连接到将在该宿主生物中表达的感兴趣多核苷酸，其中所述感兴趣多核苷酸来自不同于宿主的生物体，或者通常被发现不与该启动子相关联)。表达盒也可以是天然存在的，但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。
表达盒可以任选地包括转录和/或翻译终止区(即终止区)和/或在所选宿主细胞中有功能的增强子区。多种转录终止子和增强子是本领域已知的，并且可获得用于表达盒中。转录终止子负责转录的终止和正确的mRNA多聚腺苷酸化。终止区和/或增强子区对于转录起始区可以是天然的，对于例如编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等可以是天然的，或者可以是宿主细胞天然的，或者可以是另一来源天然的(例如对于例如启动子、编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等，或对于宿主细胞或其任意组合是外来的或异源的)。
本发明的表达盒还可包括编码选择标记的多核苷酸，其可用于选择转化的宿主细胞。如本文中所用，“选择标记”是指这样的多核苷酸序列，当其被表达时，对表达该标记的宿主细胞赋予独特的表型，从而使此类转化的细胞与那些不具有该标记的细胞相区别。这种多核苷酸序列可以编码选择标记或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予可通过化学手段，诸如通过使用选择剂(例如抗生素等)选择的性状，或者取决于该标记是否只是可通过观察或测试，诸如通过筛选(例如荧光)鉴定的性状。合适的选择性标记的许多实例是本领域已知的，并且可用于本文所述的表达盒中。
除了表达盒之外，本文所述的核酸分子/构建体和多核苷酸序列也可与载体结合使用。术语“载体”是指用于将核酸(或多种核酸)转移、递送或引入细胞的组合物。载体包含含有待转移、递送或引入的一种或多种核苷酸序列的核酸构建体(例如表达盒)。用于转化宿主生物体的载体是本领域公知的。一般类别的载体的非限制性实例包括呈双链或单链线性或环状形式的病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬菌体、人工染色体、微环或土壤杆菌(Agrobacterium)二元载体，其可以是或可以不是自我传递的或可移动的。在一些实施方案中，病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体。本文定义的载体可以通过整合入细胞基因组或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。另外还包括穿梭载体，所述穿梭载体是指天然地或通过设计能够在两种不同的宿主生物体中复制的DNA媒介物，所述宿主生物体可选自放线菌(actinomycetes)和相关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。在一些实施方案中，载体中的核酸处于合适的启动子或用于在宿主细胞中转录的其他调控元件的控制之下，并与其可操作地连接。载体可以是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，这可能包含其自身的启动子和/或其它调控元件，而在cDNA的情况下，这可能处于合适的启动子和/或其它调控元件的控制之下，以便在宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸或多核苷酸和/或包含其的表达盒可以包括在本文所述和本领域已知的载体中。
如本文中所用，“接触(contact)”、“接触(contacting)”、“接触(contacted)”及其语法变型是指在适于进行所需反应(例如转化、转录控制、基因组编辑、产生切口和/或切割)的条件下，将所需反应的组分放置在一起。例如，可在序列特异性DNA结合蛋白、逆转录酶和/或脱氨酶被表达并且序列特异性核酸结合蛋白与靶核酸结合的条件下，将靶核酸与序列特异性核酸结合蛋白(例如多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白))和脱氨酶或编码其的核酸构建体接触，并且可将逆转录酶和/或脱氨酶与序列特异性核酸结合蛋白融合，或者募集到序列特异性核酸结合蛋白(例如通过与序列特异性核酸结合蛋白融合的肽标签和与逆转录酶和/或脱氨酶融合的亲和标签)，因此，脱氨酶和/或逆转录酶位于靶核酸附近，从而修饰所述靶核酸。可以使用利用其他蛋白质-蛋白质相互作用募集逆转录酶和/或脱氨酶的其他方法，并且还可将RNA-蛋白质相互作用和化学相互作用用于蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸募集。
如本文中所用，涉及靶核酸的“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”包括编辑(例如突变)、共价修饰、交换/取代核酸/核苷酸碱基、删除、切割、切刻和/或改变靶核酸的转录控制。在一些实施方案中，修饰可以包括任何类型的一个或多个单碱基改变(SNP)。
在感兴趣多核苷酸的上下文中，“引入(Introducing)”、“引入(introduce)”、“引入(introduced)”(及其语法变型)是指将感兴趣核苷酸序列(例如多核苷酸、RT模板、核酸构建体和/或引导核酸)以使得该核苷酸序列能够进入细胞内部的方式呈递至植物、其植物部分或其细胞。
术语“转化”或“转染”可以互换使用，并且如本文中所用，是指将异源核酸导入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施方案中，可用本发明的多核苷酸/核酸分子稳定转化宿主细胞或宿主生物体(例如植物)。在一些实施方案中，可用本发明的多核苷酸/核酸分子瞬时转化宿主细胞或宿主生物体。
多核苷酸上下文中的“瞬时转化”意指多核苷酸被引入细胞，但不整合到细胞的基因组中。
在引入细胞的多核苷酸的上下文中,“稳定地引入(stably introducing)”或“被稳定地引入(stably introduced)”旨在指引入的多核苷酸被稳定整合到细胞的基因组中，因此细胞被所述多核苷酸稳定地转化。
如本文中所用，“稳定的转化”或“被稳定地转化”意指将核酸分子引入细胞并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够被其后代遗传，更具体地，被多个连续世代的后代遗传。如本文中所用，“基因组”包括细胞核和质体基因组，因此包括将核酸整合到例如叶绿体或线粒体基因组中。如本文中所用，稳定的转化也可指保持在染色体外的转基因(例如作为微小染色体或质粒)。
瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，所述测定或蛋白质印迹可以检测由引入生物体的一种或多种转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞基因组DNA与核酸序列的Southern印迹杂交分析来检测，所述核酸序列与导入生物体(例如植物)的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的Northern印迹杂交测定来检测，所述核酸序列与引入宿主生物体的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域公知的其它扩增反应来检测，所述聚合酶链式反应或其它扩增反应使用与转基因的靶序列杂交的特异性引物序列，导致转基因序列的扩增，这可以根据标准方法来检测。转化也可以通过本领域公知的直接测序和/或杂交方案来检测。
因此，在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列、多核苷酸、核酸构建体和/或表达盒可以瞬时表达，并且/或者它们可被稳定地整合到宿主生物体的基因组中。因此，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体(例如包含如本文所述用于编辑的多核苷酸的一个或多个表达盒)可被瞬时引入具有引导核酸的细胞中，因此，细胞中不保留DNA。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的核酸构建体引入植物细胞。转化方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送(例如通过土壤杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、浸润、PEG介导的核酸摄取以及导致核酸引入植物细胞的任何其他电、化学、物理(机械)和/或生物机制(包括其任意组合)的转化。转化真核生物体和原核生物体的方法是本领域公知的常规方法，并在整个文献中有描述(参见例如Jiang等人2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Ran等人Nature Protocols 8:2281–2308(2013))。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"inMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)，第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.7:849-858(2002))。
在本发明的一些实施方案中，细胞的转化可以包括核转化。在其他实施方案中，细胞的转化可以包括质体转化(例如叶绿体转化)。在又一另外的实施方案中，可以通过常规育种技术将本发明的核酸引入细胞。在一些实施方案中，可以通过土壤杆菌转化将多核苷酸、表达盒和/或载体中的一种或多种引入植物细胞。
因此，可以以本领域公知的许多方式将多核苷酸引入植物、植物部分、植物细胞。本发明的方法不依赖于将一种或多种核苷酸序列引入植物的特定方法，仅要它们进入细胞内部即可。当要引入不止一种多核苷酸时，它们可以作为单个核酸构建体的一部分装配，或者作为单独的核酸构建体装配，并且可以位于同一或不同的核酸构建体上。因此，所述多核苷酸可以在单个转化事件中或在分开的转化事件中被引入感兴趣细胞中，或者，多核苷酸可以作为育种方案的一部分被整合到植物中。
本发明提供了用于降低基因影响的方法和组合物，所述基因通常用于限制分生组织尺寸以产生具有较大分生组织的植物，以维持根分生组织，以增加穗行数(任选地，基本上不减少穗长(例如与不包含相同FEA2突变的植物的穗相比，不减少穗长超过30％))和产量，以及改善抗病性。
CLV1、CLV2和CLV3基因是利用类似机制来调节分生组织大小的若干重叠信号传导途径的一部分。植物表达许多CLV3样(CLE)肽，其由许多富含亮氨酸的重复(LRR)结构域感测，并且下游信号传导调节植物中的多个生长过程(Fletcher,J.C.,Plants 7:87(2018))。玉米中的CLV2直向同源物是FACIATED EAR2(FEA2)。
因此，如本文所述，编辑技术用于靶向植物中的FEA2基因，以产生具有较大分生组织、具有增加的穗行数、增加的产量和改善的抗病性的植物，以及产生维持其根分生组织的植物。可用于生产表现出增加的穗行数的植物的突变包括例如取代、缺失和插入。在一些方面，由编辑技术生成的突变可以是点突变、显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。
在一些实施方案中，本发明提供一种植物或其植物部分，所述植物或植物部分包含编码FEA2蛋白的内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中的至少一个非天然突变(例如1、2、3、4、5或更多个突变)。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变导致显性负突变、半显性突变和/或弱的功能损失突变。
在一些实施方案中，提供了一种植物细胞，所述植物细胞包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)CRISPR-Cas效应蛋白；和(b)引导核酸(gRNA、gDNA、crRNA、crDNA、sgRNA、sgDNA)，所述引导核酸包含与编码FEA2蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。所述编辑系统可用于在编码FEA2蛋白的内源性靶基因中产生突变。在一些实施方案中，所述突变是非天然突变。在一些实施方案中，编辑系统的引导核酸可包含SEQ ID NO:79-82(例如SEQ ID NO:79、80、81、82)中任一个的核苷酸序列(间隔子序列)。
植物、其植物部分或植物细胞的FEA2基因中的突变可以是任何类型的突变，包括碱基取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，非天然突变可以包括对A、T、G或C的碱基取代。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是从C到T(C>T)的碱基取代。在一些实施方案中，非天然突变可以是至少一个碱基对(例如1个碱基对至约50个碱基对)的缺失或至少一个碱基对(例如1个碱基对至约50个碱基对)的插入。在一些实施方案中，缺失可包括FEA2基因的1个碱基对至约10个连续碱基对(例如1、2bp至约3、4、5、6、7、8、9或10bp；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个连续碱基对)、1个碱基对至约20个连续碱基对(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续碱基对；例如1、2、3、4、5、6bp至约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续碱基对)、1个碱基对至约30个连续碱基对、1个碱基对至约40个连续碱基对、1个碱基对至约50个连续碱基对(例如1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个连续碱基对到约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个连续碱基对，或者其间的任何数值或范围。在一些实施方案中，缺失是框内缺失。
可用于本发明的内源FEA2基因可以(a)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。FEA2基因中的示例性非天然突变可导致突变的FEA2基因。内源FEA2基因中的示例性非天然突变可以编码FEA2蛋白。在一些实施方案中，突变的FEA2基因包含与SEQ ID NO:83-113的任何一个核酸序列至少约90％的序列同一性，或编码与SEQ ID NO:159-186的任何一个氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的多肽。在一些实施方案中，突变的FEA2基因包含与SEQ ID NO:114-128的核酸序列中的任一个具有至少约90％序列同一性的部分或区，或者编码与SEQ ID NO:134-148中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列的部分或区。
在一些实施方式中，与不具有所述至少一个突变(例如非天然突变)的植物相比，在内源FEA2基因中包含至少一个突变(例如非天然突变)的植物表现出增加的分生组织维持和/或增加的穗行数，任选地穗长没有实质性减小(例如减小少于30％)。在一些实施方案中，在内源FEA2基因中包含至少一个突变的所述植物是展现增加的穗行数的玉米植物。在一些实施方案中，在内源FEA2基因中包含至少一个突变的植物是展现增加的产量以及增加的抗病性的玉米植物。在一些实施方案中，植物(例如玉米植物)可以从本发明的植物部分和/或植物细胞再生，其中与不包含所述突变的植物(例如玉米植物)相比，再生的植物(例如再生的玉米植物)包含内源性FEA2基因中的突变和增加的穗行数的表型，任选地，其中具有增加的穗行数的穗的长度没有实质性减少(例如与不包含相同FEA2突变的植物的穗相比，展现出穗长减少不超过30％)。
在一些实施方案中，提供了玉米植物细胞，所述玉米植物细胞包含FEA2基因内的至少一个非天然突变，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与FEA2基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。在一些实施方案中，FEA2基因内的所述取代、插入或缺失产生显性负等位基因、半显性等位基因或弱的功能损失等位基因。在一些实施方案中，缺失产生框内缺失等位基因。在一些实施方案中，靶位点在FEA2基因的一个区域内，该区域包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性(例如约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％序列同一性)和/或编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如约95、96、97、98、99、99.5、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％序列同一性)的序列。在一些实施方式中，FEA2基因包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，提供了一种产生/培育无转基因的经编辑的玉米植物的方法，所述方法包括：使本发明的玉米植物(例如包含FEA2基因中的突变并且具有增加的穗行数的玉米植物，任选地穗长度没有实质性减少(例如减少小于30％))与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；以及选择包含所述至少一个非天然突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的经编辑的玉米植物。
本文还提供了一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域(例如田地(例如耕作田地、农田)、生长室、温室、娱乐区域、草坪和/或路边等)中种植本发明的两个或更多个玉米植物(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个玉米植物，其包含FEA2多肽中的突变并且具有增加的穗行数，任选地穗长度没有实质性减小(例如减少小于30％))，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。在一些实施方式中，所述多个植物还可以表现出更大的分生组织、增加的产量、增加的抗病性以及维持其根分生组织。
本发明还提供了一种在玉米FEA2蛋白的区域中产生变异的方法，包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码玉米FEA2蛋白的所述区域的玉米FEA2基因的区域，其中所述区域包含SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列，或者所述区域由SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列编码；以及使玉米FEA2基因的区域与编辑系统接触，从而将突变引入玉米植物细胞中FEA2蛋白的区域内；以及在所述FEA2蛋白的所述区域中产生变异。
在一些实施方式中，用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源FEA2基因内的靶位点，所述内源FEA2基因包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，从而在玉米植物细胞的内源FEA2基因中产生编辑并产生包含内源FEA2基因中的编辑的玉米植物细胞。内源FEA2基因编码FEA2蛋白，并且该编辑导致FEA2蛋白的编码区中氨基酸的变化。在一些实施方案中，编辑导致非天然存在的突变，包括但不限于缺失、取代或插入，其中编辑可以导致显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。在一些实施方案中，非天然存在的突变是缺失，任选地其中所述缺失包含FEA2基因的至少1bp至约50bp。在一些实施方案中，该缺失可以导致经编辑的FEA2核酸，其与SEQ ID NO:83-91、SEQ ID NO:92-98或SEQ ID NO:99-113中的任一个具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，缺失产生框内缺失等位基因，任选地，其中所述框内缺失包括与SEQ ID NO:91-98或105-108的序列中的任一者具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，缺失导致产生过早终止的密码子，任选地其中所述终止密码子缺失包括与SEQ ID NO:83-91、99或109-113的序列中的任一个具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述非天然存在的突变是取代，任选地其中所述取代包含FEA2基因的至少1bp至约5、6、7、8、9或10bp。在一些实施方案中，一个或多个取代产生与SEQ ID NO:100-104的任一个序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述缺失和/或取代在SEQ ID NO:74的FEA2多肽的区域内(例如氨基酸残基461-613或473-485，例如氨基酸残基461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489或490个或更多个氨基酸残基)产生变化。在一些实施方式中，所述内源FEA2基因编码FEA2蛋白，并且该编辑导致相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号而言在位于位置475、476、477、478或479处的氨基酸残基发生变化。
在一些实施方案中，编辑方法可以进一步包括从在内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物细胞再生玉米植物，从而产生其内源FEA2基因中包含该编辑并且与不包含所述编辑的对照玉米植物相比具有增加的穗行数的表型(例如产生具有增加的穗行数的一个或多个穗)的玉米植物，任选地其中所述具有增加的穗行数的一个或多个穗的长度没有实质性减小。
在一些实施方案中，用于制造玉米植物的方法，包括：(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域(例如DNA结合结构域，例如编辑系统)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)从其中至少一个野生型内源FEA2基因已经突变的群中选择玉米植物细胞；和(c)将所选择的植物细胞生长成玉米植物。
在一些实施方案中，一种增加玉米植物中的穗行数的方法，任选地不减少穗长度，所述方法包括(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞与靶向野生型内源FEA2基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合野生型内源FEA2基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如编辑系统)连接，其中所述野生型内源FEA2基因：(i)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(iii)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(iv)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，以产生在野生型内源FEA2基因中包含突变的玉米植物细胞，从而产生包含在内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在野生型内源FEA2基因中包含所述突变的玉米植物，从而产生具有突变的内源FEA2基因和增加的穗行数的玉米植物，任选地，其中穗长度没有实质性减少的穗长度(例如减小少于30％)。
在一些实施方案中，用于产生包含具有突变的内源FEA2基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因中的靶位点与包含切割结构域和DNA结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，以产生在野生型内源FEA2基因中包含突变的植物细胞，从而产生包含在内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
本文还提供了一种用于生产玉米植物或其部分的方法，所述玉米植物或其部分包含突变的内源FEA2基因，并且表现出增加的穗行数、增加的产率，和改善的抗病性，以及维持的更大的分生组织和根分生组织，所述方法包括使玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因：(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，从而产生包含具有突变的内源FEA2基因、并且表现出增加的穗行数(例如产生具有增加的穗行数的一个或多个穗)的玉米植物或其部分，任选地，其中具有增加的穗行数的一个或多个穗的长度没有实质性减少(例如减少小于30％)。
在一些实施方案中，包含在如本文所述的内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分包含与SEQ ID NO:83-98的任何一个序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方式中，核酸酶可以切割内源FEA2基因，从而将突变引入所述内源FEA2基因。可用于本发明的核酸酶可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸酶。此类核酸酶包括、但不限于锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如Fok1)和/或CRISPR-Cas效应物蛋白。同样，可用于本发明的任何核酸结合结构域(例如DNA结合结构域、RNA结合结构域)可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸结合结构域。此类核酸结合结构域包括、但不限于锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute和/或CRISPR-Cas效应物DNA结合结构域。
在一些实施方式中，提供了编辑玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因的方法，所述方法包括使所述玉米植物或植物部分中的FEA2基因中的靶位点与胞嘧啶碱基编辑系统接触，所述胞嘧啶碱基编辑系统包含胞嘧啶脱氨酶和与FEA2基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述FEA2基因(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，从而编辑所述玉米植物或其部分中的内源FEA2基因并产生包含在内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
在一些实施方式中，提供了编辑玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因的方法，所述方法包括使玉米植物或植物部分中的FEA2基因中的靶位点与腺苷碱基编辑系统接触，所述腺苷碱基编辑系统包含腺苷脱氨酶和与FEA2基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述FEA2基因(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，从而编辑所述玉米植物或其部分中的内源FEA2基因并产生包含在内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的植物或其部分。
在一些实施方案中，本文所述的经编辑的内源FEA2基因中的突变产生与SEQ IDNO:83-98的任何一个序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，提供了检测突变FEA2基因(内源FEA2基因中的突变)的方法，该方法包括在植物的基因组中检测编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列的核酸中的缺失，其中SEQ ID NO:74的氨基酸序列在相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号位于475、476、477、478或479位的一个或多个氨基酸残基中包含突变，任选地其中所述至少一个突变位于相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号位于477位的氨基酸残基处。在一些实施方案中，突变是C>T的核苷酸取代的结果。
在一些实施方案中，本发明提供了检测内源FEA2基因中的突变的方法，其包括在植物的基因组中检测突变的FEA2基因。在一些实施方案中，所述突变的FEA2基因包含与SEQID NO:83-113中任一个的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或者编码与SEQ IDNO:159-186的氨基酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，突变的FEA2基因包含与SEQ ID NO:114-128的核酸序列中的任一个具有至少约90％序列同一性的部分或区域，或者编码与SEQ ID NO:134-148中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列的部分或区域。
在一些实施方案中，本发明提供了产生包含内源FEA2基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括使包含内源FEA2基因中的至少一个突变的本发明植物(第一植物)与包含所述至少一个感兴趣多核苷酸的第二植物杂交以产生后代植物；以及选择包含所述FEA2基因中的至少一个突变和所述至少一个感兴趣多核苷酸的后代植物，从而产生包含内源FEA2基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。
本发明还提供了一种产生包含内源FEA2基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括将至少一个感兴趣多核苷酸引入包含FEA2基因中的至少一种突变的本发明植物中，从而产生包含FEA2基因中的至少一个突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是玉米植物。
在一些实施方案中，本发明提供了产生包含内源FEA2基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括将至少一个感兴趣多核苷酸引入包含内源FEA2基因中的至少一个突变的本发明植物中，从而产生包含FEA2基因中的至少一个突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是玉米植物。
感兴趣多核苷酸可以是能够赋予所需表型或以其它方式修饰植物的表型或基因型的任何多核苷酸。在一些实施方式中，感兴趣多核苷酸可以是赋予除草剂耐受性、昆虫抗性、疾病抗性、产量增加、营养物使用效率增加或非生物应激抗性的多核苷酸。
可用于本发明的FEA2包括任何FEA2，其中如本文所述的突变可以在包含所述突变的植物或其部分中赋予增加的穗行数。在一些实施方案中，FEA2多肽包含与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性(例如约95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)或者包含SEQ IDNO:75或SEQ ID NO:77的氨基酸序列的氨基酸序列(例如所述FEA2多肽包含含有FEA2多肽内的AGQIPAGLGMGR(SEQ ID NO:75)序列或含有FEA2多肽内的CNYLAGQIPAGLGMGRLHTL(SEQID NO:76)序列的结构域)。在一些实施方案中，FEA2基因可以包含与SEQ ID NO:72或SEQID NO:73的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性(例如约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列，或者FEA2基因在其内包含与SEQ ID NO:77或SEQID NO:78的核苷酸序列中的任一个具有至少90％同一性(例如约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，玉米植物中的内源FEA2基因中的所述至少一个非天然突变可以是取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，与不包含所述编辑/突变的对照玉米植物相比，玉米植物中的内源FEA2基因中的所述至少一个非天然突变可以是导致显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变的取代、缺失和/或插入，并且植物具有增加的穗行数的表型(例如产生具有增加的穗行数的生产穗的表型)，任选地，其中具有增加的穗行数的穗的长度没有实质性减小(例如，与不包含相同FEA2突变的植物相比，减少低于30％)。例如，所述突变可以是来自编码FEA2多肽的基因的一个或多个氨基酸残基(例如FEA2多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)的取代、缺失和/或插入，或者突变可以是至少1个核苷酸至约50个连续核苷酸(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49个或50个连续核苷酸、或其中的任何范围或值)(例如碱基取代、缺失和/或插入)的取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，缺失产生框内缺失等位基因。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是对A、T、G或C的碱基取代。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是从C到T(C>T)、C到A(C>A)或C到G(C>G)的碱基取代。
在一些实施方式中，内源FEA2基因中的突变可以在由编辑系统切割之后进行，所述编辑系统包含核酸酶和DNA结合结构域，所述DNA结合结构域结合至靶核酸(例如FEA2基因)内的靶位点，所述靶核酸包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列或与SEQ IDNO:77-78的任何一个核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，或编码包含与SEQ IDNO:74的氨基酸序列或SEQ ID NO:75-76的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的多肽的靶核酸(例如FEA2基因)。在一些实施方案中，所述核酸酶切割内源FEA2基因，并且将突变引入所述内源FEA2基因中。在一些实施方案中，切割导致内源FEA2基因中的突变，该基因包含与SEQ ID NO:83-98的任何一个序列具有至少90％同一性的序列。
本文还提供了与FEA2基因中的靶位点结合的引导核酸(例如gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，其中所述内源FEA2基因：(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(c)包含与SEQ ID NO:77-78的核苷酸序列中的任一个具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，引导核酸包含具有SEQ ID NO:75-76中任一个的核苷酸序列的间隔子。
在一些实施方案中，提供了与玉米植物中的FACIATED EAR2(FEA2)基因中的靶核酸结合的引导核酸，其中所述靶核酸位于由染色体4上的碱基对(bp)位置136,766,300至碱基对位置136,766,251限定并包括它们的染色体间隔中。关于玉米(Zea mays)，本发明的标记物在本文中针对标记物基因座在MaizeGDB互联网资源(maizegdb.org/assembly)的B73玉米基因组，版本4，“B73RefGen_v4”(assemblyaka B73RefGen_v4，AGPv4)中的标记物位置进行了描述。在一些实施方案中，本发明提供了一种引导核酸，其与具有Zm00001d051012(参考B73玉米基因组)的基因标识号(基因ID)的FACIATED EAR2(FEA2)基因中的靶核酸结合。
在一些实施方案中，提供了包含引导核酸的系统，所述引导核酸包含具有SEQ IDNO:79-82中任一个的核苷酸序列的间隔子和与所述引导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白。在一些实施方案中，所述系统还可包含与引导核酸缔合的tracr核酸和CRISPR-Cas效应蛋白，任选地其中tracr核酸和引导核酸共价连接。
本发明还提供了一种基因编辑系统，其包含与引导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白，并且所述引导核酸包含与FEA2基因结合的间隔子序列，所述FEA2基因(a)编码与SEQ IDNO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ IDNO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ IDNO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，引导核酸的间隔子序列可以包含SEQ ID NO:79-82中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因编辑系统还可包含与引导核酸缔合的tracr核酸和CRISPR-Cas效应蛋白，任选地其中所述tracr核酸和所述引导核酸共价连接。如本文所用，“与引导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白”是指在CRISPR-Cas效应蛋白和引导核酸之间形成的复合物，以将CRISPR-Cas效应蛋白引导至基因中的靶位点。
本发明还提供了一种复合物，其包含引导核酸和包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述引导核酸结合内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因，其中所述内源FEA2基因：(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，其中所述切割结构域切割FEA2基因中的靶标链。在一些实施方式中，所述切割结构域切割FEA2基因中的靶标链，使得其在包含与SEQ ID NO:83-98的任何一个序列具有至少90％同一性的序列的内源FEA2基因中产生突变。
在一些实施方式中，提供了表达盒，其包含(a)编码CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，其包含切割结构域和(b)与内源FEA2基因中的靶位点结合的引导核酸，其中所述引导核酸包含与下述互补并且与之结合的间隔子序列：(i)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的核酸的一部分；(ii)与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列的一部分；(iii)与SEQ ID NO:77或SEQID NO:78的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列的一部分；和/或(iv)与编码SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列的序列具有至少90％序列同一性的序列。
本文还提供了编码突变的FEA2基因的核酸，当存在于玉米植物或植物部分中时，与不包含FEA2突变的对照玉米植物相比，所述突变的FEA2基因导致玉米植物包含增加的穗行数的表型(例如产生具有增加的穗行数的穗的表型)，任选地，其中具有增加的穗行数的穗不具有显著减小的长度(例如，与不包含相同FEA2突变的植物的穗相比，长度减小小于30％)。在一些实施方案中，突变的FEA2基因可以包含与SEQ ID NO:83-113中任一个的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或者编码与SEQ ID NO:159-186的任何一个氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，突变的FEA2基因包含与SEQID NO:114-128的核酸序列中的任一个具有至少约90％序列同一性的部分或区域，或者编码与SEQ ID NO:134-148中的任一个具有至少约90％序列同一性的序列的部分或区域。
本发明的核酸构建体(例如包含序列特异性核酸结合结构域、CRISPR-Cas效应结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(RT)、RT模板和/或引导核酸等的构建体)和包含其的表达盒/载体可以用作本发明的编辑系统，用于修饰靶核酸(例如内源FEA2基因)和/或其表达。可以如本文所述(例如使用本发明的多肽、多核苷酸、RNPs、核酸构建体、表达盒和/或载体)修饰(例如突变，例如碱基编辑、切割、切口等)包含能够在如本文所述修饰时赋予增加的穗行数的内源FEA2基因的任何玉米植物，以增加玉米植物中的穗行数。与不包含突变的内源FEA2基因的植物或其部分相比，表现出增加的穗行数的植物中的穗行数可以增加约5％至约500％(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％或其中的任何范围或值；例如约5％至约10％、约5％至约20％、约10％至约20％、约10％至约50％、约20％至约50％、约30％至约50％或其中的任何范围或值)(例如多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15行)。在一些实施方案中，如本文所述表现出增加的穗行数的植物(例如产生具有增加的穗行数的穗的植物)产生长度没有实质性减小的穗。如本文所用，与不包含相同FEA2突变的植物相比，包含如本文所述的突变的植物的“长度没有实质性减小”的穗的长度减小小于30％(例如减小0％或减小约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30％)。
在一些实施方式中，提供了玉米植物或其植物部分，其包含位于染色体4上的碱基对(bp)位置136,766,300至碱基对位置136,766,251所定义并且包括它们的染色体间隔中的至少一个内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中的至少一个非天然突变。关于玉米(Zeamays)，本发明的标记物在本文中针对MaizeGDB互联网资源(maizegdb.org/assembly)中B73玉米基因组，版本4，“B73RefGen_v4”(assemblyaka B73RefGen_v4，AGPv4)中标记物基因组的位置进行了描述。在一些实施方案中，提供了玉米植物或其植物部分，所述玉米植物或其植物部分在基因标识号(基因ID)未Zm00001d051012(参考B73玉米基因组)的至少一个内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中包含至少一个非天然突变。
如本文中所用，术语“植物部分”包括、但不限于生殖组织(例如花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花芽、胚珠、种子和胚)；营养组织(例如叶柄、茎(stem)、根、根毛、根尖、髓、胚芽鞘、茎(stalk)、芽、枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如韧皮部和木质部)；特化细胞，诸如表皮细胞、薄壁细胞、厚角细胞、厚壁细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；愈伤组织；和插枝。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括在植物和/或植物部分中完整的植物细胞、植物原生质体、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。如本文中所用，“芽”是指包括叶和茎在内的地上部分。如本文中所用，术语“组织培养物”包括组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。
如本文中所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，其通常包括细胞壁，但也包括原生质体。本发明的植物细胞可呈分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是更高组织单位的一部分，例如植物组织(包括愈伤组织)或植物器官。“原生质体”是没有细胞壁或只有部分细胞壁的分离的植物细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，包含本发明核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括但不限于根细胞、叶细胞、组织培养物细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞等。在本发明的一些方面，植物部分可以是植物种质。在一些方面，植物细胞可以是不能再生为植物的非繁殖植物细胞。
“植物细胞培养物”意指植物单位例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同发育阶段的胚的培养物。
如本文中所用，“植物器官”是植物的独特且明显结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文中所用，“植物组织”是指组织成结构和功能单位的一群植物细胞。包括在植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括、但不限于完整植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞群。该术语在结合上面列出的或以其它方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织使用时，或者在不提及上面列出的或以其它方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织而使用时，并不意图排除任何其他类型的植物组织。
在本发明的一些实施方案中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中所述转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。在一些实施方案中，可以通过将所述转基因植物与非转基因植物杂交，并在后代中选择包含所需基因编辑但不包含用于产生所述编辑的转基因的植物，从由所述转基因组织或细胞发育的植物中消除所述转基因。
可用于本发明的编辑系统可以是现在已知或以后开发的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统，所述系统可以以靶特异性方式引入突变。例如，编辑系统(例如位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包括、但不限于CRISPR-Cas编辑系统、大范围核酸酶编辑系统、锌指核酸酶(ZFN)编辑系统、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)编辑系统、碱基编辑系统和/或先导编辑系统，其中的每一种都可以包含一种或多种多肽和/或一种或多种多核苷酸，当它们在细胞中作为系统表达时，可以以序列特异性方式修饰(突变)靶核酸。在一些实施方案中，编辑系统(例如位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包含一种或多种多核苷酸和/或一种或多种多肽，包括但不限于核酸结合结构域(DNA结合结构域)、核酸酶和/或其他多肽和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，编辑系统可以包含一个或多个序列特异性核酸结合结构域(DNA结合结构域)，其可以来自例如多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。在一些实施方案中，编辑系统可包含一个或多个切割结构域(例如核酸酶)，包括、但不限于核酸内切酶(例如Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应子蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，编辑系统可包含一种或多种多肽，所述多肽包括但不限于脱氨酶(例如胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶)、逆转录酶、Dna2多肽和/或5’flap核酸内切酶(FEN)。在一些实施方案中，编辑系统可以包含一种或多种多核苷酸，包括但不限于CRISPR阵列(CRISPR引导)核酸、延伸的引导核酸和/或逆转录酶模板。
在一些实施方案中，修饰或编辑FEA2基因的方法可包括将靶核酸(例如编码FEA2的核酸)与和脱氨酶结构域(例如腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)融合的碱基编辑融合蛋白(例如序列特异性核酸结合蛋白、序列特异性DNA结合蛋白(例如CRISPR-Cas效应蛋白或结构域))和引导核酸接触，其中所述引导核酸能够将所述碱基编辑融合蛋白引导/靶向靶核酸，从而编码所述靶核酸内的基因座。在一些实施方案中，碱基编辑融合蛋白和引导核酸可以包含在一种或多种表达盒中。在一些实施方案中，可将靶核酸与碱基编辑融合蛋白和包含引导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸结合融合蛋白和引导核酸可以以核糖核蛋白(RNP)的形式提供。在一些实施方案中，可将细胞与不止一种碱基编辑融合蛋白和/或一种或多种引导核酸接触，所述引导核酸可以靶向细胞中的一种或多种靶核酸。
在一些实施方案中，修饰或编辑FEA2基因的方法可包括将靶核酸(例如编码FEA2的核酸)与和肽标签融合的序列特异性核酸结合融合蛋白(例如序列特异性DNA结合蛋白(例如CRISPR-Cas效应蛋白或结构域)、脱氨酶融合蛋白(其包含与能够与肽标签结合的亲和多肽融合的脱氨酶结构域(例如腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶))和引导核酸接触，其中所述引导核酸能够将序列特异性核酸结合融合蛋白引导至/靶向靶核酸，序列特异性核酸结合融合蛋白能够通过肽标签-亲和多肽相互作用将脱氨酶融合蛋白募集到靶核酸，从而编辑靶核酸内的基因座。在一些实施方案中，可将序列特异性核酸结合融合蛋白与结合肽标签的亲和多肽融合，以及可将脱氨酶与肽标签融合，从而将脱氨酶募集到所述序列特异性核酸结合融合蛋白和靶核酸处。在一些实施方案中，所述序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和引导核酸可以包含在一个或多个表达盒中。在一些实施方案中，可将靶核酸与序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和包含引导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和引导核酸可以以核糖核蛋白(RNP)的形式提供。
在一些实施方案中，诸如先导编辑(prime editing)等方法可用于在内源FEA2基因中产生突变。在先导编辑中，将RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶，RT)和逆转录酶模板(RT模板)与序列特异性DNA结合结构域组合使用，所述序列特异性核酸结合结构域赋予以序列特异性方式识别并结合靶标的能力，并且也能够在靶标内引起含PAM链的切口。所述核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应蛋白，并且在该情况下，CRISPR阵列或引导RNA可以是包含延伸部分的延伸的引导核酸，所述延伸部分包含引物结合位点(primer binding site,PSB)和待整合到基因组(模板)中的编辑。类似于碱基编辑，先导编辑可以利用各种将用于编辑的蛋白质募集到靶位点的方法，此类方法包括在基因组编辑的选定过程中使用的蛋白质与核酸之间的非共价和共价相互作用。
如本文所用，“CRISPR-Cas效应蛋白”是切割或切开核酸、结合核酸(例如靶核酸和/或引导核酸)和/或鉴定、识别或结合如本文所定义的引导核酸的蛋白或多肽或其结构域。在一些实施方式中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是酶(例如核酸酶、内切核酸酶、切口酶等)或其部分，和/或可作为酶发挥功能。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白是指CRISPR-Cas核酸酶多肽或其结构域，其包含核酸酶活性或其中核酸酶活性已被降低或消除，和/或包含切口酶活性或其中切口酶已被降低或消除，和/或包含单链DNA切割活性(ssDNAse活性)或其中ssDNAse活性已被降低或消除，和/或包含自加工RNAse活性或其中自加工RNAse活性已被降低或消除。CRISPR-Cas效应蛋白可以与靶核酸结合。
在一些实施方案中，序列特异性核酸结合结构域(例如序列特异性DNA结合结构域)可以是CRISPR-Cas效应蛋白。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以来自I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统、IV型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或VI型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，本发明的CRISPR-Cas效应蛋白可以来自II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是II型CRISPR-Cas效应蛋白，例如Cas9效应蛋白。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是V型CRISPR-Cas效应蛋白，例如Cas12效应蛋白。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可包括但不限于Cas9、C2c1、C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3"、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5核酸酶，任选地其中CRISPR-Cas效应蛋白可以是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c效应蛋白。
在一些实施方案中，用于本发明的CRISPR-Cas效应蛋白可在其核酸酶活性位点(例如RuvC、HNH，例如Cas12a核酸酶结构域的RuvC位点，例如Cas9核酸酶结构域的RuvC位点和/或HNH位点)包含突变。在其核酸酶活性位点具有突变、因此不再包含核酸酶活性的CRISPR-Cas效应蛋白通常被称为“无活力的(dead)”，例如dCas。在一些实施方案中，与无突变的相同CRISPR-Cas效应蛋白(例如切口酶，例如Cas9切口酶、Cas12a切口酶)相比，在其核酸酶活性位点中具有突变的CRISPR-Cas效应蛋白结构域或多肽可具有受损的活性或降低的活性。
可用于本发明的CRISPR Cas9效应蛋白或CRISPR Cas9效应结构域可以是任何已知的或以后鉴定的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，CRISPR Cas9多肽可以是来自例如链球菌属某些种(Streptococcus spp.)(例如化脓性链球菌(S.pyogenes)、嗜热链球菌(S.thermophilus))、乳杆菌属某些种(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属某些种(Bifidobacterium spp.)、坎德勒氏菌某些种(Kandleria spp.)、明串珠菌属某些种(Leuconostoc spp.)、酒球菌属某些种(Oenococcus spp.)、片球菌属某些种(Pediococcusspp.)、魏斯氏菌属某些种(Weissella spp.)和/或欧陆森氏菌属某些种(Olsenella spp.)的Cas9多肽。示例性的Cas9序列包括、但不限于SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的氨基酸序列或者SEQ ID NO:61-71的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自化脓性链球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali等人，Science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于嗜热链球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(参见例如Horvath等人，Science,2010；327(5962):167-170，以及Deveau等人，J Bacteriol 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自变形链球菌(Streptococcus mutans)的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见例如Deveau等人，J BACTERIOL 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Cas9蛋白，其识别PAM序列基序NGRRT(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序N GRRV(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的Cas9多肽，其识别PAM序列基序N GATT或N GCTT(R＝A或G，V＝A、G或C)(参见，例如Hou等人，2013，1-6)。在上述实施方案中，N可以是任何核苷酸残基，例如A、G、C或T中的任一个。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是源自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的Cas13a蛋白，其识别单个3’A、U或C的原间隔子侧翼序列(PFS)(或RNA PAM(rPAM))序列基序，所述序列基序可以位于靶核酸内。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白可源自Cas12a，其是V型成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas核酸酶。参见例如SEQ ID NO:1-20。Cas12a在几个方面不同于更广为人知的II型CRISPR Cas9核酸酶。例如，Cas9识别位于其引导RNA(gRNA、sgRNA、crRNA、crDNA、CRISPR阵列)结合位点(原间隔子、靶核酸、靶DNA)3’的富含G的原间隔子邻近基序(PAM)(3’-NGG)，而Cas12a识别位于靶核酸5’的富含T的PAM(5’-TTN、5’-TTTN)。事实上，Cas9和Cas12a结合其引导RNA的方向与它们的N和C末端几乎相反。此外，Cas12a酶使用单引导RNA(gRNA，CRISPR阵列，crRNA)，而不是天然Cas9系统中发现的双引导RNA(sgRNA(例如crRNA和tracrRNA))，并且Cas12a加工其自身的gRNA。另外，Cas12a核酸酶活性产生交错的DNA双链断裂，而不是由Cas9核酸酶活性产生的平端，并且Cas12a依赖于单个RuvC结构域来切割两条DNA链，而Cas9利用HNH结构域和RuvC结构域来切割。
可用于本发明的CRISPR Cas12a效应蛋白/结构域可以是任何已知或后来鉴定的Cas12a多肽(以前称为Cpf1)(参见，例如美国专利第9,790,490号，就其中Cpf1(Cas12a)序列的公开内容将其通过引用并入本文)。术语“Cas12a”、“Cas12a多肽”或“Cas12a结构域”是指包含Cas12a多肽或其片段的RNA引导的核酸酶，其包含Cas12a的引导核酸结合结构域和/或Cas12a的活性、无活性或部分活性的DNA切割结构域。在一些实施方案中，可用于本发明的Cas12a可在核酸酶活性部位(例如Cas12a结构域的RuvC位点)中包含突变。在其核酸酶活性部位具有突变并因此不再包含核酸酶活性的Cas12a结构域或Cas12a多肽通常被称为deadCas12a(例如dCas12a)。在一些实施方案中，在其核酸酶活性部位中具有突变的Cas12a结构域或Cas12a多肽可能具有受损的活性，例如，可能具有切口酶活性。
任何可用于碱基编辑的脱氨酶结构域/多肽都可以用于本发明。在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶(或胞苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的胞嘧啶脱氨酶(参见，例如美国专利第0,167,457号和Thuronyi等人Nat.Biotechnol.37:1070–1079(2019)，其中每一篇都就其胞嘧啶脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。胞嘧啶脱氨酶可分别催化胞苷或脱氧胞苷水解脱氨为尿苷或脱氧尿苷。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的脱氨酶或脱氨酶结构域可以是胞苷脱氨酶结构域，催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是天然存在的胞嘧啶脱氨酶(包括但不限于灵长类动物(例如人、猴、黑猩猩、大猩猩)、狗、牛、大鼠或小鼠)的变体。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与野生型胞嘧啶脱氨酶具有约70％至约100％同一性(例如与天然存在的胞嘧啶脱氨酶具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，以及其中的任何范围或值)。
在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以是载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、人活化诱导脱氨酶(hAID)、rAPOBEC1、FERNY和/或CDA1，任选地是pmCDA1、atCDA1(例如At2g 19570)及其进化形式(例如SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的APOBEC1脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的APOBEC3A脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是CDA1脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDA1。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是FERNY脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FERNY。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与天然存在的胞嘧啶脱氨酶(例如进化的脱氨酶)的氨基酸序列具有约70％至约100％同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性)。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有约70％至约99.5％同一性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性)(例如与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)。在一些实施方案中，可以为了在植物中表达而对编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可与参考多核苷酸具有约70％至99.5％同一性。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)(例如尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂)多肽/结构域。因此，在一些实施方案中，编码CRISPR-Cas效应蛋白和胞嘧啶脱氨酶结构域(例如编码包含与胞嘧啶脱氨酶结构域融合的CRISPR-Cas效应蛋白结构域，和/或与肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应蛋白结构域，和/或与肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽融合的脱氨酶蛋白结构域的融合蛋白)的核酸构建体还可编码尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，任选地其中可以为了在植物中表达而对UGI进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了包含CRISPR-Cas效应多肽、脱氨酶结构域和UGI的融合蛋白和/或编码其的一种或多种多核苷酸，任选地，其中可以为了在植物中表达而对所述一种或多种多核苷酸进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其中可将CRISPR-Cas效应多肽、脱氨酶结构域和UGI与本文所述的肽标签和亲和多肽的任意组合融合，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到CRISPR-Cas效应多肽和靶核酸。在一些实施方案中，可将引导核酸与募集RNA基序连接，并且可将一个或多个脱氨酶结构域和/或UGI与能够与募集RNA基序相互作用的亲和多肽融合，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到靶核酸上。
可用于本发明的“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”可以是能够抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶碱基-切除修复酶的任何蛋白质。在一些实施方案中，UGI结构域包含野生型UGI或其片段。在一些实施方案中，可用于本发明的UGI结构域可以与天然存在的UGI结构域的氨基酸序列具有约70％至约100％同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性，以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，UGI结构域可包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有约70％至约99.5％序列同一性(例如与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)的多肽。例如，在一些实施方案中，UGI结构域可包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的片段，所述片段与SEQ ID NO:41的氨基酸序列的一部分连续核苷酸(例如10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个连续核苷酸；例如约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个至约50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个连续核苷酸)具有100％同一性。在一些实施方案中，UGI结构域可以是已知UGI(例如SEQ ID NO:41)的变体，其与已知UGI具有约70％至约99.5％序列同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列同一性，以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，可以为了在植物(例如植物)中表达而对编码UGI的多核苷酸进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可与参考多核苷酸具有约70％至约99.5％同一性。
可用于本发明的腺嘌呤脱氨酶(或腺苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知的或后来鉴定的腺嘌呤脱氨酶(参见，例如美国专利第10,113,163号，其就其腺嘌呤脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。腺嘌呤脱氨酶可以催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶可以分别催化腺苷或脱氧腺苷水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以催化DNA中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶可在靶核酸的有义(例如“+”；模板)链中产生A→G转换或在靶核酸的反义(如“-”，互补)链中产生T→C转换。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以是天然存在的腺嘌呤脱氨酶的变体。因此，在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以与野生型腺嘌呤脱氨酶具有约70％至100％同一性(例如与天然存在的腺嘌吟脱氨酶具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，所述脱氨酶不是天然存在的，并且可以被称为工程化的、突变的或进化的腺苷脱氨酶。因此，例如，工程化的、突变的或进化的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域可以与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域具有约70％至99.9％同一性(例如与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性，以及其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以来自细菌(例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等)。在一些实施方案中，可以对编码腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域的多核苷酸进行密码子优化以用于在植物中表达。
在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶结构域可以是野生型tRNA特异性腺苷脱氨酶结构域，例如tRNA特异性腺苷脱氨酶(TadA)和/或突变/进化的腺苷脱氨酶结构域，例如突变/进化的tRNA特异性腺苷脱氨酶结构域(TadA*)。在一些实施方案中，TadA结构域可来自大肠杆菌。在一些实施方案中，TadA可以被修饰，例如被截短，可以相对于全长TadA缺失一个或多个N-末端和/或C-末端氨基酸(例如，可以相对于全长TadA缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、6个、17个、18个、19个或20个N-末端和/或C-末端氨基酸残基)。在一些实施方案中，TadA多肽或TadA结构域不包含N-末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，野生型大肠杆菌TadA包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变/进化的大肠杆菌TadA*包含SEQ ID NO:31-40(例如SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以对编码TadA/TadA*的多核苷酸进行密码子优化而用于植物中表达。
胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨并产生胸苷(通过尿嘧啶中间体)，引起基因组中C至T的转换或互补链内G至A的转换。因此，在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的胞嘧啶脱氨酶在靶核酸的有义(例如“+”；模板)链中产生C→T的转换或在靶核酸的反义(如“-”，互补)链中产生G→A的转换。
在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶在靶核酸的有义(例如“+”；模板)链中产生A→G的转换或在靶核酸的反义(如“-”，互补)链中产生T→C的转换。
编码包含序列特异性核酸结合蛋白和胞嘧啶脱氨酶多肽的碱基编辑器的本发明核酸构建体，以及编码所述碱基编辑器的核酸构建体/表达盒/载体，可以与引导核酸组合用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生C→T或G→A突变，所述靶核酸包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生C→T或G→A突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生C→T或G→A突变以产生终止密码子；在编码序列中产生C→T或G→A突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接点。
编码包含序列特异性核酸结合蛋白和腺嘌呤脱氨酶多肽的碱基编辑器的本发明的核酸构建体，以及编码所述碱基编辑器的表达盒和/或载体可以与引导核酸组合用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生A→G或T→C突变，所述靶核酸包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生A→G或T→C突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生A→G或T→C突变以产生终止密码子；在编码序列中产生A→G或T→C突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接点。
包含CRISPR-Cas效应蛋白或其融合蛋白的本发明核酸构建体可与引导RNA(gRNA、CRISPR阵列、CRISPR RNA、crRNA)组合使用，以修饰靶核酸，所述引导RNA被设计成与编码的CRISPR-Cas效应蛋白或结构域一起发挥作用。可用于本发明的引导核酸包含至少一个间隔子序列和至少一个重复序列。引导核酸能够与由本发明的核酸构建体编码和表达的CRISPR-Cas核酸酶结构域形成复合物，并且所述间隔子序列能够与靶核酸杂交，从而将复合物(例如CRISPR-Cas效应子融合蛋白(例如与脱氨酶结构域融合的CRISPR-Cas效应子结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应子结构域，以募集脱氨酶结构域和任选地UGI)引导至靶核酸，其中靶核酸可以被脱氨酶结构域修饰(例如切割或编辑)或调节(例如调节转录)。
例如，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域连接的Cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可与Cas9引导核酸组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。在另一个实例中，编码与腺嘌呤脱氨酶结构域连接的Cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可与Cas9引导核酸组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的腺苷碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。
同样，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌脱氨酶结构域连接的Cas12a结构域(或其他选定的CRISPR-Cas核酸酶，例如C2c1、C2c3、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3’、Cas3"、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5)(例如融合蛋白)的核酸构建体可与Cas12a引导核酸(或用于其它选定的CRISPR-Cas核酸酶的引导核酸)组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑所述靶核酸。
如本文中所用，“引导核酸”、“引导RNA”、“gRNA”、“CRISPR RNA/DNA”、“crRNA”或“crDNA”意指包含至少一个与靶DNA互补(并与之杂交)的间隔子序列(例如原间隔子)和至少一个重复序列(例如V型Cas12a CRISPR-Cas系统的重复序列，或其片段或部分；II型Cas9CRISPR-Cas系统的重复序列，或其片段；V型C2c1 CRISPR Cas系统的重复序列或其片段；例如C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3’、Cas3"、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5的CRISPR-Cas系统的重复序列或其片段)的核酸，其中重复序列可与间隔子序列的5’末端和/或3’末端连接。本发明的gRNA的设计可以基于I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，Cas12a gRNA可以从5’至3’包含重复序列(全长或其部分(“柄(handle)”)；例如假结样结构)和间隔子序列。
在一些实施方案中，引导核酸可包含不止一个重复序列-间隔子序列(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个重复序列-间隔子序列)(例如重复序列-间隔子序列-重复序列，例如重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列，等等)。本发明的引导核酸是合成的、人造的和不是在自然界中发现的。gRNA可以相当长，可以用作适体(如在MS2募集策略中那样)或其他从间隔子垂悬的RNA结构。
如本文中所用，“重复序列”是指例如野生型CRISPR Cas基因座(例如Cas9基因座、Cas12a基因座、C2c1基因座等)的任何重复序列或与本发明核酸构建体编码的CRISPR-Cas效应蛋白一起发挥功能的合成crRNA的重复序列。可用于本发明的重复序列可以是CRISPR-Cas基因座(例如I型、II型、III型、IV型、V型或VI型)的任何已知或后来鉴定的重复序列，或者其可以是被设计成在I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系统中起作用的合成重复序列。重复序列可以包含发夹结构和/或茎环结构。在一些实施方案中，重复序列可以在其5’末端形成假结样结构(即，“柄”)。因此，在一些实施方案中，重复序列可以与来自野生型I型CRISPR-Cas基因座、II型CRISPR-Cas基因座、III型CRISPR-Cas基因座、IV型CRISPR-Cas基因座、V型CRISPR-Cas基因座和/或VI型CRISPR-Cas基因座的重复序列相同或实质性相同。来自野生型CRISPR-Cas基因座的重复序列可以通过已建立的算法，诸如使用通过CRISPRdb提供的CRISPRfinder(参见，Grissa等人Nucleic Acids Res.35(网络服务器发行):W52-7)来确定。在一些实施方案中，重复序列或其部分在其3’末端与间隔子序列的5’末端连接，从而形成重复序列-间隔子序列(例如引导核酸、引导RNA/DNA、crRNA、crDNA)。
在一些实施方案中，重复序列包含至少10个核苷酸，或基本上由至少10个核苷酸组成，或由至少10个核苷酸组成，这取决于具体的重复序列和包含该重复序列的引导核酸被加工还是未被加工(例如约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个至100个或更多个核苷酸，或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，重复序列包含约10至约20个、约10至约30个、约10至约45个、约10至约50个、约15至约30个、约15至约40个、约15至约45个、约15至约50个、约20至约30个、约20至约40个、约20至约50个、约30至约40个、约40至约80个、约50至约100个或更多个核苷酸，基本由所述核苷酸组成，或由所述核苷酸组成。
与间隔子序列的5’末端连接的重复序列可以包含重复序列的一部分(例如野生型重复序列的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，与间隔子序列的5’末端连接的重复序列的一部分在长度上可以是野生型CRISPR Cas重复核苷酸序列的约5至约10个连续核苷酸(例如约5个、6个、7个、8个、9个、10个核苷酸)，并且与野生型CRISPR Cas重复核苷酸序列的相同区域(例如5’末端)具有至少90％序列同一性(例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％))。在一些实施方案中，重复序列的一部分可在其5’末端包含假结样结构(例如“柄”)。
如本文中所用，“间隔子序列”是与靶核酸(例如靶DNA)(例如原间隔子)(例如序列的连续核苷酸)互补的核苷酸序列，其中所述序列(a)编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(c)包含与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或(d)编码与SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，间隔子序列可以包括、但不限于SEQ ID NO:79-82中任一个的核苷酸序列。间隔子序列可以与靶核酸完全互补或实质性互补(例如至少约70％(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)(例如99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)互补)。因此，在一些实施方案中，与靶核酸相比，间隔子序列可具有一个、两个、三个、四个或五个错配，所述错配可以是连续的或不连续的。在一些实施方案中，间隔子序列可以与靶核酸具有70％的互补性。在其他实施方案中，间隔子核苷酸序列可以与靶核酸具有80％的互补性。在其他实施方案中，间隔子核苷酸序列可与靶核酸(原间隔子)具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的互补性等。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核酸100％互补。间隔子序列可具有约15个核苷酸至约30个核苷酸(例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸，或其中的任何范围或值)的长度。因此，在一些实施方案中，间隔子序列可以在靶核酸(例如原间隔子)的长度为至少约15个核苷酸至约30个核苷酸的区域上具有完全互补性或实质性互补性。在一些实施方案中，间隔子长度约为20个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子长度为约21个、22个或23个核苷酸。
在一些实施方案中，引导核酸的间隔子序列的5’区域可以与靶DNA相同，而所述间隔子的3’区域可以与靶DNA(例如V型CRISPR-Cas)实质性互补，或者引导核酸的间隔子序列的3’区域可与靶DNA相同，而所述间隔子的5’区域可以与靶DNA(例如II型CRISPR-Cas)实质性互补，因此，间隔子序列与靶DNA的总体互补性可以小于100％。因此，例如，在V型CRISPR-Cas系统的引导核酸中，例如20个核苷酸的间隔子序列的5’区域(即，种子区域)中的前1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个核苷酸可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列的3’区中的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列5’末端的前1至8个核苷酸(例如前1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个核苷酸以及其中的任何范围)可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列3’区域的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)互补)。
作为另外的实例，在II型CRISPR-Cas系统的引导核酸中，例如20个核苷酸的间隔子序列的3’区域(即种子区)中的前1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个核苷酸可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列3’端的前1至10个核苷酸(例如前1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个核苷酸以及其中的任何范围)可以与靶DNA100％互补，而间隔子序列5’区中的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约50％(例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或其中的任何范围或值)互补)。
在一些实施方案中，间隔子的种子区长度可为约8至约10个核苷酸，长度可为约5至约6个核苷酸，或长度可为约6个核苷酸。
如本文中所用，“靶核酸”、“靶DNA”、“靶核苷酸序列”、“靶区域”或“基因组中的靶区域”是指植物基因组中与本发明的引导核酸中的间隔子序列完全互补(100％互补)或实质性互补(例如至少70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)互补)的区域。对CRISPR-Cas系统有用的靶区域可以紧邻生物体基因组(例如植物基因组)中PAM序列的3’(例如V型CRISPR-Cas系统)或5’(例如II型CRISPR-Cas系统)。靶区域可以选自紧邻PAM序列定位的至少15个连续核苷酸(例如16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸等)的任何区域。
“原间隔子序列”是指靶双链DNA，具体是指与CRISPR重复-间隔子序列(例如引导核酸、CRISPR阵列、crRNA)的间隔子序列完全互补或实质性互补(并杂交)的靶DNA的部分(例如，或基因组中的靶区域)。
在V型CRISPR-Cas(例如Cas12a)系统和II型CRISPR-Cas(Cas9)系统的情况下，原间隔子序列侧接(例如紧邻)原间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。对于IV型CRISPR-Cas系统，PAM位于非靶链的5’末端和靶链的3’末端(例如参见下文)。
Figure BDA0003943796830000741
在II型CRISPR-Cas(例如Cas9)系统的情况下，PAM紧邻靶区域的3’。I型CRISPR-Cas系统的PAM位于靶链的5’。III型CRISPR-Cas系统没有已知的PAM。Makarova等人描述了CRISPR系统的所有类别、类型和亚型的命名法(Nature Reviews Microbiology 13:722–736(2015))。引导结构和PAM由R.Barrangou(Genome Biol.16:247(2015))描述。
典型的Cas12a PAM富含T。在一些实施方案中，典型的Cas12aPAM序列可以是5’-TTN、5’-TTTN或5’-TTTV。在一些实施方案中，典型的Cas9(例如化脓性链球菌)PAM可以是5’-NGG-3’。在一些实施方案中，可以使用非典型的PAM，但是可能效率更低一些。
本领域技术人员可以通过已建立的实验和计算方法确定其他PAM序列。因此，例如，实验方法包括靶向两侧为所有可能的核苷酸序列的序列，并鉴定不经历靶向的序列成员，诸如通过靶质粒DNA的转化(Esvelt等人2013.Nat.Methods 10:1116-1121；Jiang等人2013.Nat.Biotechnol.31:233-239)。在一些方面，计算方法可包括对天然间隔子进行BLAST搜索以鉴定噬菌体或质粒中的原始靶DNA序列，并比对这些序列以确定邻近靶序列的保守序列(Briner和Barrangou 2014.Appl.Environ.Microbiol.80:994-1001；Mojica等人2009.Microbiology 155:733-740)。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明核酸构建体的表达盒和/或载体(例如本发明编辑系统的一个或多个组分)。在一些实施方案中，可以提供包含本发明的核酸构建体和/或一种或多种引导核酸的表达盒和/或载体。在一些实施方案中，编码碱基编辑器的本发明的核酸构建体(例如包含CRISPR-Cas效应蛋白和脱氨酶结构域的构建体(例如融合蛋白))或用于碱基编辑的组分(例如与肽标签或亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应蛋白，与肽标签或亲和多肽融合的脱氨酶结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的UGI)，可以包含在与包含所述一种或多种引导核酸的表达盒或载体相同的表达盒或载体上或者另外的表达盒或载体上。当编码碱基编辑器的核酸构建体或用于碱基编辑的组分包含在与包含引导核酸的表达盒或载体分开的表达盒或载体上时，可以例如在提供(例如与靶核酸接触)包含引导核酸的表达盒之前、与之同时或之后，将靶核酸以彼此之间的任何顺序与编码碱基编辑器或用于碱基编辑的组分的表达盒或载体和引导核酸接触(例如与其一起提供)。
如本领域已知的，本发明的融合蛋白可包含序列特异性核酸结合结构域、CRISPR-Cas多肽和/或与肽标签或与肽标签相互作用的亲和多肽融合的脱氨酶结构域，用于将脱氨酶募集到靶核酸。募集方法还可包括与RNA募集基序和脱氨酶(其与能够与RNA募集基序相互作用的亲和多肽融合)连接的引导核酸，从而将脱氨酶募集到靶核酸上。或者，化学相互作用可用于将多肽(例如脱氨酶)募集到靶核酸上。
可用于本发明的肽标签(例如表位)可包括、但不限于GCN4肽标签(例如Sun标签)、c-Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸-His亲和标签、RGD-His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV-G表位。可以与多肽连接的以及对于其存在可以与另一种多肽连接的相应的亲和多肽的任何表位，都可以在本发明中用作肽标签。在一些实施方案中，肽标签可包含1个或2个或更多个拷贝的肽标签(例如重复单元、多聚化表位(例如串联重复))(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个重复单元)。在一些实施方案中，与肽标签相互作用/结合的亲和多肽可以是抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是scFv抗体。在一些实施方案中，与肽标签结合的亲和多肽可以是合成的(例如为亲和相互作用而进化的)，包括但不限于亲和体、anticalin、单抗体(monobody)和/或DARPin(参见例如Sha等人，Protein Sci.26(5):910-924(2017))；Gilbreth(Curr Opin Struc Biol 22(4):413-420(2013))，美国专利第9,982,053号，就与亲和体、抗anticalin、单抗体和/或DARPin相关的教导将它们均通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，引导核酸可与RNA募集基序连接，待募集的多肽(例如脱氨酶)可与和所述RNA募集基序结合的亲和多肽融合，其中所述引导核酸与靶核酸结合，并且所述RNA募集基序与亲和多肽结合，从而将多肽募集到引导核酸处，并使靶核酸与所述多肽(例如脱氨酶)接触。在一些实施方案中，两种或更多种多肽可被募集到引导核酸，从而使靶核酸与两种或更多种多肽(例如脱氨酶)接触。
在一些实施方案中，与亲和多肽融合的多肽可以是逆转录酶，引导核酸可以是与RNA募集基序连接的延伸的引导核酸。在一些实施方案中，RNA募集基序可以位于延伸的引导核酸的延伸部分的3’末端(例如5’-3’，重复序列-间隔子-延伸的部分(RT模板-引物结合位点)-RNA募集基序)。在一些实施方案中，RNA募集基序可以嵌入延伸的部分。
在本发明的一些实施方案中，可将延伸的引导RNA和/或引导RNA与一个或两个或更多个RNA募集基序(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个基序，例如至少10至约25个基序)连接，任选地，其中所述两个或更多个RNA募集基序可以是相同的RNA募集基序或是不同的RNA募集基序。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以包括但不限于端粒酶Ku结合基序(例如Ku结合发夹)和相应的亲和多肽Ku(例如Ku异二聚体)、端粒酶Sm7结合基序和相应的亲和多肽Sm7、MS2噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)、PP7噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽PP7外壳蛋白(PCP)、SfMu噬菌体Com茎环和相应的亲和多肽Com RNA结合蛋白、PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)，和/或合成的RNA-适体和适体配体作为相应的亲和多肽。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以是MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以是PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)。
在一些实施方案中，用于募集多肽和核酸的组分可以是通过化学相互作用起作用的那些组分，包括但不限于：雷帕霉素诱导的FRB–FKBP的二聚化；生物素-链霉抗生物素蛋白素；SNAP标签；Halo标签；CLIP标签；由化合物诱导的DmrA-DmrC异二聚体；双功能配体(例如两种蛋白结合化学物质融合在一起，例如二氢叶酸还原酶(DHFR))。
在一些实施方案中，为了在植物中表达而优化的本发明的核酸构建体、表达盒或载体可以与包含相同多核苷酸(但其未针对在植物中表达而进行过密码子优化)的核酸构建体、表达盒或载体具有约70％至100％(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)同一性。
本文还提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸、引导核酸、核酸构建体、表达盒或载体的细胞。
现在将参考以下实施例描述本发明。应该理解的是，这些实施例并不旨在限制本发明的权利要求的范围，而是旨在作为某些实施方案的示例。技术人员想到的示例性方法的任何变化都落入本发明的范围内。
实施例
实施例1设计编辑构建体用于Fea2编辑
在享有产权的玉米系鉴定了Fea2基因的基因组序列。根据该参考序列，设计间隔子序列(SEQ ID NO:73-76)用于编辑构建体。所述编辑构建体包含CRISPR-Cas效应物和被设计成靶向由Fea2基因编码的FEA2蛋白的氨基酸位置477的间隔子序列。将间隔子与Cas-效应子切割酶或Cas-效应子碱基编辑复合物一起部署。
实施例2被编辑的E0植物的转化和选择
使用土壤杆菌将编码间隔子的载体(表1)以及选择的CRISPR-Cas效应子引入干燥的切下的玉米胚中。在体外用抗生素选择维持转化的组织以再生阳性转化体。选择健康的非嵌合植物(E0)并插入生长盘中。从再生植物收集组织(E0代)用于DNA提取，随后进行分子筛选来鉴定Fea2中的编辑。将鉴定为(1)健康、非嵌合和可育，具有(2)低转基因拷贝和(3)在位置477附近的编辑的植物推进到下一代。将满足所有上述标准的E0植物自交以产生E1代。将所选择的E1自交以产生E2代。我们鉴定了在氨基酸位置477处和周围具有缺失和取代的几个家族。
表1每个pWISE载体中存在的间隔子
Figure BDA0003943796830000781
实施例3性状活性的表型评估
将E1和E2材料的种子在平板上种植，然后在出苗后转移到罐中。所有材料在标准温室条件下栽培并生长至繁殖成熟。根据标准实践，在丝出现之前，用小纸袋覆盖出现的穗，并且在花期覆盖穗以便基于植物靠植物捕获花粉。在一些情况下，花期和出丝不同步，并且穗没有被授粉。我们将这些称为未被授粉的穗，并且在干燥后从植物中取出所有穗后，对它们分开评估穗行数测定值(如下所述)。
在穗收获和干燥之后，对所有穗手动计数穗行数。数据表示从最明确的行谱线的穗的中间部分取得的每穗三行计数的平均值。为了防止对行的双重计数，在计数开始的行之间插入标记(例如纸夹)，并且指定行计数应该停止的位置。
用Canon数码相机和EOS应用对所有穗进行光记录。随后将图像导入ImageJ中，并使用线轨迹函数测量所有的穗。在图像分析程序中通过设定比例以厘米为单位确定穗长，以输出在用沿着穗的长度从其尖端到穗的基部的线跟踪穗之后以厘米为单位的距离。未被编辑的种质(第01DKD2行)和用Gus质粒转化的品系被用作表型分型的野生型对照。表2和表3示出了源自自交E0穗的E1家族的穗行数(KRN)和穗长度测量值，表4和表5示出了源自自交E1穗的E2家族的穗行数和穗长度测量值。
表2 E1纯合等位基因
Figure BDA0003943796830000791
Figure BDA0003943796830000801
表3 E1纯合等位基因
Figure BDA0003943796830000802
Figure BDA0003943796830000811
表4 E2同源等位基因
Figure BDA0003943796830000812
表5 E2纯合等位基因
Figure BDA0003943796830000813
前述内容对本发明进行了说明，它们不应被解释为对本发明的限制。本发明由所附权利要求书限定，其中各权利要求的等同方式被包括在其中。
序列表
<110> Pairwise Plants Services, Inc.
Dale, Karlson
O'Connor, Devin
Graham, Nathaniel
<120> 控制分生组织大小以改良作物的方法
<130> 1499.26.WO
<150> US 63/000,206
<151> 2020-03-26
<160> 186
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1228
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种(Lachnospiraceae sp.)
<400> 1
Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
20 25 30
Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys
35 40 45
Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp
50 55 60
Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu
65 70 75 80
Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
85 90 95
Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn
100 105 110
Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu
115 120 125
Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe
130 135 140
Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn
145 150 155 160
Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile
165 170 175
Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys
180 185 190
Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys
195 200 205
Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe
210 215 220
Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile
225 230 235 240
Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
245 250 255
Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys
260 265 270
Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser
275 280 285
Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe
290 295 300
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys
305 310 315 320
Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe
340 345 350
Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp
355 360 365
Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp
370 375 380
Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu
385 390 395 400
Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu
405 410 415
Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser
420 425 430
Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys
435 440 445
Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys
450 455 460
Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr
465 470 475 480
Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile
485 490 495
Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr
500 505 510
Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro
515 520 525
Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala
530 535 540
Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys
545 550 555 560
Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly
565 570 575
Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met
580 585 590
Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro
595 600 605
Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly
610 615 620
Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys
625 630 635 640
Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn
645 650 655
Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu
660 665 670
Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys
675 680 685
Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile
690 695 700
Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His
705 710 715 720
Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile
725 730 735
Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys
740 745 750
Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys
755 760 765
Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr
770 775 780
Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile
785 790 795 800
Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val
805 810 815
Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp
820 825 830
Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly
835 840 845
Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn
850 855 860
Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu
865 870 875 880
Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile
885 890 895
Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys
900 905 910
Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn
915 920 925
Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln
930 935 940
Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys
945 950 955 960
Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile
965 970 975
Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe
980 985 990
Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr
995 1000 1005
Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp
1010 1015 1020
Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro
1025 1030 1035
Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser
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Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr
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Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val
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Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu
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Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala
1100 1105 1110
Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met
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1130 1135 1140
Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp
1145 1150 1155
Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala
1160 1165 1170
Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala
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Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp
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Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His
1220 1225
<210> 2
<211> 1307
<212> PRT
<213> 氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus sp.)
<400> 2
Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln
20 25 30
Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys
35 40 45
Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg
165 170 175
Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val
225 230 235 240
Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp
245 250 255
Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu
260 265 270
Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
275 280 285
Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr
325 330 335
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Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val
515 520 525
Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp
530 535 540
Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn
545 550 555 560
Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys
565 570 575
Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys
580 585 590
Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys
595 600 605
Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr
610 615 620
Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln
645 650 655
Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala
660 665 670
Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr
675 680 685
Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr
690 695 700
Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His
705 710 715 720
Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu
725 730 735
Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys
740 745 750
Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu
755 760 765
Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln
770 775 780
Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His
785 790 795 800
Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr
805 810 815
Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His
820 825 830
Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn
835 840 845
Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe
850 855 860
Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln
865 870 875 880
Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu
885 890 895
Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg
900 905 910
Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu
915 920 925
Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu
930 935 940
Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val
945 950 955 960
Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile
965 970 975
His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu
980 985 990
Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu
995 1000 1005
Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu
1010 1015 1020
Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly
1025 1030 1035
Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala
1040 1045 1050
Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro
1055 1060 1065
Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe
1070 1075 1080
Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu
1085 1090 1095
Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe
1100 1105 1110
Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly
1115 1120 1125
Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn
1130 1135 1140
Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys
1145 1150 1155
Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr
1160 1165 1170
Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu
1175 1180 1185
Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu
1190 1195 1200
Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu
1205 1210 1215
Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly
1220 1225 1230
Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys
1235 1240 1245
Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp
1250 1255 1260
Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu
1265 1270 1275
Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile
1280 1285 1290
Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1295 1300 1305
<210> 3
<211> 1241
<212> PRT
<213> Butyrivibrio proteoclasticus
<400> 3
Met Leu Leu Tyr Glu Asn Tyr Thr Lys Arg Asn Gln Ile Thr Lys Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Glu Leu Arg Pro Gln Gly Lys Thr Leu Arg Asn Ile Lys
20 25 30
Glu Leu Asn Leu Leu Glu Gln Asp Lys Ala Ile Tyr Ala Leu Leu Glu
35 40 45
Arg Leu Lys Pro Val Ile Asp Glu Gly Ile Lys Asp Ile Ala Arg Asp
50 55 60
Thr Leu Lys Asn Cys Glu Leu Ser Phe Glu Lys Leu Tyr Glu His Phe
65 70 75 80
Leu Ser Gly Asp Lys Lys Ala Tyr Ala Lys Glu Ser Glu Arg Leu Lys
85 90 95
Lys Glu Ile Val Lys Thr Leu Ile Lys Asn Leu Pro Glu Gly Ile Gly
100 105 110
Lys Ile Ser Glu Ile Asn Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Gly Val Leu Tyr
115 120 125
Asp Phe Ile Asp Lys Thr His Lys Asp Ser Glu Glu Lys Gln Asn Ile
130 135 140
Leu Ser Asp Ile Leu Glu Thr Lys Gly Tyr Leu Ala Leu Phe Ser Lys
145 150 155 160
Phe Leu Thr Ser Arg Ile Thr Thr Leu Glu Gln Ser Met Pro Lys Arg
165 170 175
Val Ile Glu Asn Phe Glu Ile Tyr Ala Ala Asn Ile Pro Lys Met Gln
180 185 190
Asp Ala Leu Glu Arg Gly Ala Val Ser Phe Ala Ile Glu Tyr Glu Ser
195 200 205
Ile Cys Ser Val Asp Tyr Tyr Asn Gln Ile Leu Ser Gln Glu Asp Ile
210 215 220
Asp Ser Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Gly Ile Met Asp Glu Asp Gly Ala
225 230 235 240
Lys Glu Lys Gly Ile Asn Gln Thr Ile Ser Glu Lys Asn Ile Lys Ile
245 250 255
Lys Ser Glu His Leu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Ile Leu Lys Gln Leu
260 265 270
His Lys Gln Ile Leu Glu Glu Arg Glu Lys Ala Phe Thr Ile Asp His
275 280 285
Ile Asp Ser Asp Glu Glu Val Val Gln Val Thr Lys Glu Ala Phe Glu
290 295 300
Gln Thr Lys Glu Gln Trp Glu Asn Ile Lys Lys Ile Asn Gly Phe Tyr
305 310 315 320
Ala Lys Asp Pro Gly Asp Ile Thr Leu Phe Ile Val Val Gly Pro Asn
325 330 335
Gln Thr His Val Leu Ser Gln Leu Ile Tyr Gly Glu His Asp Arg Ile
340 345 350
Arg Leu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu Lys Asn Thr Leu Glu Val Leu Pro
355 360 365
Arg Arg Thr Lys Ser Glu Asp Ala Arg Tyr Asp Lys Phe Val Asn Ala
370 375 380
Val Pro Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser His Thr Phe Asp Gly Leu Gln
385 390 395 400
Lys Met Thr Gly Asp Asp Arg Leu Phe Ile Leu Tyr Arg Asp Glu Leu
405 410 415
Ala Arg Asn Tyr Met Arg Ile Lys Glu Ala Tyr Gly Thr Phe Glu Arg
420 425 430
Asp Ile Leu Lys Ser Arg Arg Gly Ile Lys Gly Asn Arg Asp Val Gln
435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Phe Tyr Asp Glu Leu Thr Lys Phe Arg Ser Ala
450 455 460
Leu Arg Ile Ile Asn Ser Gly Asn Asp Glu Lys Ala Asp Pro Ile Phe
465 470 475 480
Tyr Asn Thr Phe Asp Gly Ile Phe Glu Lys Ala Asn Arg Thr Tyr Lys
485 490 495
Ala Glu Asn Leu Cys Arg Asn Tyr Val Thr Lys Ser Pro Ala Asp Asp
500 505 510
Ala Arg Ile Met Ala Ser Cys Leu Gly Thr Pro Ala Arg Leu Arg Thr
515 520 525
His Trp Trp Asn Gly Glu Glu Asn Phe Ala Ile Asn Asp Val Ala Met
530 535 540
Ile Arg Arg Gly Asp Glu Tyr Tyr Tyr Phe Val Leu Thr Pro Asp Val
545 550 555 560
Lys Pro Val Asp Leu Lys Thr Lys Asp Glu Thr Asp Ala Gln Ile Phe
565 570 575
Val Gln Arg Lys Gly Ala Lys Ser Phe Leu Gly Leu Pro Lys Ala Leu
580 585 590
Phe Lys Cys Ile Leu Glu Pro Tyr Phe Glu Ser Pro Glu His Lys Asn
595 600 605
Asp Lys Asn Cys Val Ile Glu Glu Tyr Val Ser Lys Pro Leu Thr Ile
610 615 620
Asp Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Phe Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Thr
625 630 635 640
Asn Ile Gly Ile Asp Gly Leu Thr Glu Glu Lys Phe Lys Asp Asp Cys
645 650 655
Arg Tyr Leu Ile Asp Val Tyr Lys Glu Phe Ile Ala Val Tyr Thr Arg
660 665 670
Tyr Ser Cys Phe Asn Met Ser Gly Leu Lys Arg Ala Asp Glu Tyr Asn
675 680 685
Asp Ile Gly Glu Phe Phe Ser Asp Val Asp Thr Arg Leu Cys Thr Met
690 695 700
Glu Trp Ile Pro Val Ser Phe Glu Arg Ile Asn Asp Met Val Asp Lys
705 710 715 720
Lys Glu Gly Leu Leu Phe Leu Val Arg Ser Met Phe Leu Tyr Asn Arg
725 730 735
Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Thr Phe Ile Gln Leu Phe Ser Asp Ser
740 745 750
Asn Met Glu His Thr Ser Met Leu Leu Asn Ser Arg Ala Met Ile Gln
755 760 765
Tyr Arg Ala Ala Ser Leu Pro Arg Arg Val Thr His Lys Lys Gly Ser
770 775 780
Ile Leu Val Ala Leu Arg Asp Ser Asn Gly Glu His Ile Pro Met His
785 790 795 800
Ile Arg Glu Ala Ile Tyr Lys Met Lys Asn Asn Phe Asp Ile Ser Ser
805 810 815
Glu Asp Phe Ile Met Ala Lys Ala Tyr Leu Ala Glu His Asp Val Ala
820 825 830
Ile Lys Lys Ala Asn Glu Asp Ile Ile Arg Asn Arg Arg Tyr Thr Glu
835 840 845
Asp Lys Phe Phe Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ser
850 855 860
Ala Arg Thr Leu Asp Tyr Ile Asn Asp Lys Val Glu Glu Asp Thr Gln
865 870 875 880
Asp Ser Arg Met Ala Val Ile Val Thr Arg Asn Leu Lys Asp Leu Thr
885 890 895
Tyr Val Ala Val Val Asp Glu Lys Asn Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser
900 905 910
Leu Asn Glu Ile Asp Gly Val Asn Tyr Arg Glu Leu Leu Lys Glu Arg
915 920 925
Thr Lys Ile Lys Tyr His Asp Lys Thr Arg Leu Trp Gln Tyr Asp Val
930 935 940
Ser Ser Lys Gly Leu Lys Glu Ala Tyr Val Glu Leu Ala Val Thr Gln
945 950 955 960
Ile Ser Lys Leu Ala Thr Lys Tyr Asn Ala Val Val Val Val Glu Ser
965 970 975
Met Ser Ser Thr Phe Lys Asp Lys Phe Ser Phe Leu Asp Glu Gln Ile
980 985 990
Phe Lys Ala Phe Glu Ala Arg Leu Cys Ala Arg Met Ser Asp Leu Ser
995 1000 1005
Phe Asn Thr Ile Lys Glu Gly Glu Ala Gly Ser Ile Ser Asn Pro
1010 1015 1020
Ile Gln Val Ser Asn Asn Asn Gly Asn Ser Tyr Gln Asp Gly Val
1025 1030 1035
Ile Tyr Phe Leu Asn Asn Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Cys Pro Asp
1040 1045 1050
Thr Gly Phe Val Asp Val Phe Asp Lys Thr Arg Leu Ile Thr Met
1055 1060 1065
Gln Ser Lys Arg Gln Phe Phe Ala Lys Met Lys Asp Ile Arg Ile
1070 1075 1080
Asp Asp Gly Glu Met Leu Phe Thr Phe Asn Leu Glu Glu Tyr Pro
1085 1090 1095
Thr Lys Arg Leu Leu Asp Arg Lys Glu Trp Thr Val Lys Ile Ala
1100 1105 1110
Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Lys Gly Glu Tyr Val Tyr
1115 1120 1125
Val Asn Asp Ile Val Arg Glu Gln Ile Ile Pro Ala Leu Leu Glu
1130 1135 1140
Asp Lys Ala Val Phe Asp Gly Asn Met Ala Glu Lys Phe Leu Asp
1145 1150 1155
Lys Thr Ala Ile Ser Gly Lys Ser Val Glu Leu Ile Tyr Lys Trp
1160 1165 1170
Phe Ala Asn Ala Leu Tyr Gly Ile Ile Thr Lys Lys Asp Gly Glu
1175 1180 1185
Lys Ile Tyr Arg Ser Pro Ile Thr Gly Thr Glu Ile Asp Val Ser
1190 1195 1200
Lys Asn Thr Thr Tyr Asn Phe Gly Lys Lys Phe Met Phe Lys Gln
1205 1210 1215
Glu Tyr Arg Gly Asp Gly Asp Phe Leu Asp Ala Phe Leu Asn Tyr
1220 1225 1230
Met Gln Ala Gln Asp Ile Ala Val
1235 1240
<210> 4
<211> 1238
<212> PRT
<213> 候选白蚁甲烷支原体(Candidatus Methanoplasma termitum)
<400> 4
Met Asn Asn Tyr Asp Glu Phe Thr Lys Leu Tyr Pro Ile Gln Lys Thr
1 5 10 15
Ile Arg Phe Glu Leu Lys Pro Gln Gly Arg Thr Met Glu His Leu Glu
20 25 30
Thr Phe Asn Phe Phe Glu Glu Asp Arg Asp Arg Ala Glu Lys Tyr Lys
35 40 45
Ile Leu Lys Glu Ala Ile Asp Glu Tyr His Lys Lys Phe Ile Asp Glu
50 55 60
His Leu Thr Asn Met Ser Leu Asp Trp Asn Ser Leu Lys Gln Ile Ser
65 70 75 80
Glu Lys Tyr Tyr Lys Ser Arg Glu Glu Lys Asp Lys Lys Val Phe Leu
85 90 95
Ser Glu Gln Lys Arg Met Arg Gln Glu Ile Val Ser Glu Phe Lys Lys
100 105 110
Asp Asp Arg Phe Lys Asp Leu Phe Ser Lys Lys Leu Phe Ser Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Glu Glu Ile Tyr Lys Lys Gly Asn His Gln Glu Ile Asp Ala
130 135 140
Leu Lys Ser Phe Asp Lys Phe Ser Gly Tyr Phe Ile Gly Leu His Glu
145 150 155 160
Asn Arg Lys Asn Met Tyr Ser Asp Gly Asp Glu Ile Thr Ala Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Ile Val Asn Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Leu Gln
180 185 190
Lys Tyr Gln Glu Ala Arg Lys Lys Tyr Pro Glu Trp Ile Ile Lys Ala
195 200 205
Glu Ser Ala Leu Val Ala His Asn Ile Lys Met Asp Ile Val Phe Ser
210 215 220
Leu Glu Tyr Phe Asn Lys Val Leu Asn Gln Glu Gly Ile Gln Arg Tyr
225 230 235 240
Asn Leu Ala Leu Gly Gly Tyr Val Thr Lys Ser Gly Glu Lys Met Met
245 250 255
Gly Leu Asn Asp Ala Leu Asn Leu Ala His Gln Ser Glu Lys Ser Ser
260 265 270
Lys Gly Arg Ile His Met Thr Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Glu
275 280 285
Lys Glu Ser Phe Ser Tyr Ile Pro Asp Val Phe Thr Glu Asp Ser Gln
290 295 300
Leu Leu Pro Ser Ile Gly Gly Phe Phe Ala Gln Ile Glu Asn Asp Lys
305 310 315 320
Asp Gly Asn Ile Phe Asp Arg Ala Leu Glu Leu Ile Ser Ser Tyr Ala
325 330 335
Glu Tyr Asp Thr Glu Arg Ile Tyr Ile Arg Gln Ala Asp Ile Asn Arg
340 345 350
Val Ser Asn Val Ile Phe Gly Glu Trp Gly Thr Leu Gly Gly Leu Met
355 360 365
Arg Glu Tyr Lys Ala Asp Ser Ile Asn Asp Ile Asn Leu Glu Arg Thr
370 375 380
Cys Lys Lys Val Asp Lys Trp Leu Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Ser
385 390 395 400
Asp Val Leu Glu Ala Ile Asp Arg Thr Gly Asn Asn Asp Ala Phe Asn
405 410 415
Glu Tyr Ile Ser Lys Met Arg Thr Ala Arg Glu Lys Ile Asp Ala Ala
420 425 430
Arg Lys Glu Met Lys Phe Ile Ser Glu Lys Ile Ser Gly Asp Glu Glu
435 440 445
Ser Ile His Ile Ile Lys Thr Leu Leu Asp Ser Val Gln Gln Phe Leu
450 455 460
His Phe Phe Asn Leu Phe Lys Ala Arg Gln Asp Ile Pro Leu Asp Gly
465 470 475 480
Ala Phe Tyr Ala Glu Phe Asp Glu Val His Ser Lys Leu Phe Ala Ile
485 490 495
Val Pro Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Asn Asn Leu
500 505 510
Asn Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Lys Asn Pro Thr Leu Ala Asn
515 520 525
Gly Trp Asp Gln Asn Lys Val Tyr Asp Tyr Ala Ser Leu Ile Phe Leu
530 535 540
Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Leu Gly Ile Ile Asn Pro Lys Arg Lys Lys
545 550 555 560
Asn Ile Lys Phe Glu Gln Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Tyr Arg Lys
565 570 575
Met Val Tyr Lys Gln Ile Pro Gly Pro Asn Lys Asn Leu Arg Pro Val
580 585 590
Phe Leu Thr Ser Thr Lys Gly Lys Lys Glu Tyr Lys Pro Ser Lys Glu
595 600 605
Ile Ile Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Lys His Ile Arg Gly Asp Lys Phe
610 615 620
Asp Leu Asp Phe Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile
625 630 635 640
Glu Lys His Lys Asp Trp Ser Lys Phe Asn Phe Tyr Phe Ser Pro Thr
645 650 655
Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Leu Asp Val Glu Lys Gln
660 665 670
Gly Tyr Arg Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ala Glu Thr Ile Asp Glu
675 680 685
Tyr Val Glu Lys Gly Asp Leu Phe Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp
690 695 700
Phe Val Lys Ala Ala Thr Gly Lys Lys Asp Met His Thr Ile Tyr Trp
705 710 715 720
Asn Ala Ala Phe Ser Pro Glu Asn Leu Gln Asp Val Val Val Lys Leu
725 730 735
Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Asp Lys Ser Asp Ile Lys Glu
740 745 750
Ile Val His Arg Glu Gly Glu Ile Leu Val Asn Arg Thr Tyr Asn Gly
755 760 765
Arg Thr Pro Val Pro Asp Lys Ile His Lys Lys Leu Thr Asp Tyr His
770 775 780
Asn Gly Arg Thr Lys Asp Leu Gly Glu Ala Lys Glu Tyr Leu Asp Lys
785 790 795 800
Val Arg Tyr Phe Lys Ala His Tyr Asp Ile Thr Lys Asp Arg Arg Tyr
805 810 815
Leu Asn Asp Lys Ile Tyr Phe His Val Pro Leu Thr Leu Asn Phe Lys
820 825 830
Ala Asn Gly Lys Lys Asn Leu Asn Lys Met Val Ile Glu Lys Phe Leu
835 840 845
Ser Asp Glu Lys Ala His Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn
850 855 860
Leu Leu Tyr Tyr Ser Ile Ile Asp Arg Ser Gly Lys Ile Ile Asp Gln
865 870 875 880
Gln Ser Leu Asn Val Ile Asp Gly Phe Asp Tyr Arg Glu Lys Leu Asn
885 890 895
Gln Arg Glu Ile Glu Met Lys Asp Ala Arg Gln Ser Trp Asn Ala Ile
900 905 910
Gly Lys Ile Lys Asp Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Lys Ala Val His
915 920 925
Glu Ile Thr Lys Met Ala Ile Gln Tyr Asn Ala Ile Val Val Met Glu
930 935 940
Glu Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln
945 950 955 960
Ile Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Met Leu Ile Asp Lys Met Asn Tyr Leu
965 970 975
Val Phe Lys Asp Ala Pro Asp Glu Ser Pro Gly Gly Val Leu Asn Ala
980 985 990
Tyr Gln Leu Thr Asn Pro Leu Glu Ser Phe Ala Lys Leu Gly Lys Gln
995 1000 1005
Thr Gly Ile Leu Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Lys Ile
1010 1015 1020
Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Leu Phe Asn Thr Ser Ser Lys
1025 1030 1035
Thr Asn Ala Gln Glu Arg Lys Glu Phe Leu Gln Lys Phe Glu Ser
1040 1045 1050
Ile Ser Tyr Ser Ala Lys Asp Gly Gly Ile Phe Ala Phe Ala Phe
1055 1060 1065
Asp Tyr Arg Lys Phe Gly Thr Ser Lys Thr Asp His Lys Asn Val
1070 1075 1080
Trp Thr Ala Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Met Arg Tyr Ile Lys Glu
1085 1090 1095
Lys Lys Arg Asn Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys Glu Ile Lys Glu
1100 1105 1110
Ala Leu Thr Ser Ser Gly Ile Lys Tyr Asp Gly Gly Gln Asn Ile
1115 1120 1125
Leu Pro Asp Ile Leu Arg Ser Asn Asn Asn Gly Leu Ile Tyr Thr
1130 1135 1140
Met Tyr Ser Ser Phe Ile Ala Ala Ile Gln Met Arg Val Tyr Asp
1145 1150 1155
Gly Lys Glu Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Ile Lys Asn Ser Lys Gly
1160 1165 1170
Glu Phe Phe Arg Thr Asp Pro Lys Arg Arg Glu Leu Pro Ile Asp
1175 1180 1185
Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Gly Glu Leu
1190 1195 1200
Thr Met Arg Ala Ile Ala Glu Lys Phe Asp Pro Asp Ser Glu Lys
1205 1210 1215
Met Ala Lys Leu Glu Leu Lys His Lys Asp Trp Phe Glu Phe Met
1220 1225 1230
Gln Thr Arg Gly Asp
1235
<210> 5
<211> 1281
<212> PRT
<213> 挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)
<400> 5
Met Asn Gly Asn Arg Ser Ile Val Tyr Arg Glu Phe Val Gly Val Ile
1 5 10 15
Pro Val Ala Lys Thr Leu Arg Asn Glu Leu Arg Pro Val Gly His Thr
20 25 30
Gln Glu His Ile Ile Gln Asn Gly Leu Ile Gln Glu Asp Glu Leu Arg
35 40 45
Gln Glu Lys Ser Thr Glu Leu Lys Asn Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg
50 55 60
Glu Tyr Ile Asp Lys Ser Leu Ser Gly Val Thr Asp Leu Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Leu Phe Glu Leu Met Asn Leu Val Gln Ser Ser Pro Ser Lys Asp
85 90 95
Asn Lys Lys Ala Leu Glu Lys Glu Gln Ser Lys Met Arg Glu Gln Ile
100 105 110
Cys Thr His Leu Gln Ser Asp Ser Asn Tyr Lys Asn Ile Phe Asn Ala
115 120 125
Lys Leu Leu Lys Glu Ile Leu Pro Asp Phe Ile Lys Asn Tyr Asn Gln
130 135 140
Tyr Asp Val Lys Asp Lys Ala Gly Lys Leu Glu Thr Leu Ala Leu Phe
145 150 155 160
Asn Gly Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Asp Phe Phe Glu Lys Arg Lys Asn
165 170 175
Val Phe Thr Lys Glu Ala Val Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Ile Val
180 185 190
His Glu Asn Ser Leu Ile Phe Leu Ala Asn Met Thr Ser Tyr Lys Lys
195 200 205
Ile Ser Glu Lys Ala Leu Asp Glu Ile Glu Val Ile Glu Lys Asn Asn
210 215 220
Gln Asp Lys Met Gly Asp Trp Glu Leu Asn Gln Ile Phe Asn Pro Asp
225 230 235 240
Phe Tyr Asn Met Val Leu Ile Gln Ser Gly Ile Asp Phe Tyr Asn Glu
245 250 255
Ile Cys Gly Val Val Asn Ala His Met Asn Leu Tyr Cys Gln Gln Thr
260 265 270
Lys Asn Asn Tyr Asn Leu Phe Lys Met Arg Lys Leu His Lys Gln Ile
275 280 285
Leu Ala Tyr Thr Ser Thr Ser Phe Glu Val Pro Lys Met Phe Glu Asp
290 295 300
Asp Met Ser Val Tyr Asn Ala Val Asn Ala Phe Ile Asp Glu Thr Glu
305 310 315 320
Lys Gly Asn Ile Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Val Asn Lys Tyr Asp
325 330 335
Glu Leu Asp Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Ser Lys Asp Phe Tyr Glu Thr
340 345 350
Leu Ser Cys Phe Met Ser Gly Asn Trp Asn Leu Ile Thr Gly Cys Val
355 360 365
Glu Asn Phe Tyr Asp Glu Asn Ile His Ala Lys Gly Lys Ser Lys Glu
370 375 380
Glu Lys Val Lys Lys Ala Val Lys Glu Asp Lys Tyr Lys Ser Ile Asn
385 390 395 400
Asp Val Asn Asp Leu Val Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Lys Glu Arg Asn
405 410 415
Glu Phe Lys Asn Ser Asn Ala Lys Gln Tyr Ile Arg Glu Ile Ser Asn
420 425 430
Ile Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala His Leu Glu Tyr Asp Asp His Ile
435 440 445
Ser Leu Ile Glu Ser Glu Glu Lys Ala Asp Glu Met Lys Lys Arg Leu
450 455 460
Asp Met Tyr Met Asn Met Tyr His Trp Ala Lys Ala Phe Ile Val Asp
465 470 475 480
Glu Val Leu Asp Arg Asp Glu Met Phe Tyr Ser Asp Ile Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Ile Val Pro Leu Tyr Asn Arg Val Arg Asn
500 505 510
Tyr Val Thr Gln Lys Pro Tyr Asn Ser Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe
515 520 525
Gln Ser Pro Thr Leu Ala Asn Gly Trp Ser Gln Ser Lys Glu Phe Asp
530 535 540
Asn Asn Ala Ile Ile Leu Ile Arg Asp Asn Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile
545 550 555 560
Phe Asn Ala Lys Asn Lys Pro Asp Lys Lys Ile Ile Gln Gly Asn Ser
565 570 575
Asp Lys Lys Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Lys Met Val Tyr Asn Leu Leu
580 585 590
Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly
595 600 605
Ile Glu Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Gly Tyr Asn Ala
610 615 620
His Lys His Ile Lys Thr Ser Glu Asn Phe Asp Ile Ser Phe Cys Arg
625 630 635 640
Asp Leu Ile Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Ile Glu Lys His Ala Glu Trp
645 650 655
Arg Lys Tyr Glu Phe Lys Phe Ser Ala Thr Asp Ser Tyr Ser Asp Ile
660 665 670
Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Met Gln Gly Tyr Arg Ile Asp Trp
675 680 685
Thr Tyr Ile Ser Glu Ala Asp Ile Asn Lys Leu Asp Glu Glu Gly Lys
690 695 700
Ile Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Glu Asn Ser Thr
705 710 715 720
Gly Lys Glu Asn Leu His Thr Met Tyr Phe Lys Asn Ile Phe Ser Glu
725 730 735
Glu Asn Leu Asp Lys Ile Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe
740 745 750
Tyr Arg Arg Ala Ser Val Lys Asn Pro Val Lys His Lys Lys Asp Ser
755 760 765
Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Lys Asn Gln Leu Asp Asn Gly Asp Val
770 775 780
Val Arg Ile Pro Ile Pro Asp Asp Ile Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys Met
785 790 795 800
Tyr Asn Gly Tyr Ile Lys Glu Ser Asp Leu Ser Glu Ala Ala Lys Glu
805 810 815
Tyr Leu Asp Lys Val Glu Val Arg Thr Ala Gln Lys Asp Ile Val Lys
820 825 830
Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Asp Lys Tyr Phe Ile His Thr Pro Ile Thr
835 840 845
Ile Asn Tyr Lys Val Thr Ala Arg Asn Asn Val Asn Asp Met Val Val
850 855 860
Lys Tyr Ile Ala Gln Asn Asp Asp Ile His Val Ile Gly Ile Asp Arg
865 870 875 880
Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Ser Val Ile Asp Ser His Gly Asn
885 890 895
Ile Val Lys Gln Lys Ser Tyr Asn Ile Leu Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys
900 905 910
Lys Lys Leu Val Glu Lys Glu Lys Thr Arg Glu Tyr Ala Arg Lys Asn
915 920 925
Trp Lys Ser Ile Gly Asn Ile Lys Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Ser
930 935 940
Gly Val Val His Glu Ile Ala Met Leu Ile Val Glu Tyr Asn Ala Ile
945 950 955 960
Ile Ala Met Glu Asp Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys
965 970 975
Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Ser Met Leu Ile Asn Lys
980 985 990
Leu Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Glu Lys Ser Val Asp Glu Pro Gly Gly
995 1000 1005
Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Val Pro Asp Asn Ile Lys
1010 1015 1020
Asn Leu Gly Lys Gln Cys Gly Val Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala
1025 1030 1035
Phe Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr Gly Phe Ile Ser Ala Phe
1040 1045 1050
Asn Phe Lys Ser Ile Ser Thr Asn Ala Ser Arg Lys Gln Phe Phe
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Met Gly Lys Thr Gln Trp Thr Val Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Leu
1100 1105 1110
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1115 1120 1125
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1130 1135 1140
Ile Asn Tyr Ala Asp Gly His Asp Ile Arg Ile Asp Met Glu Lys
1145 1150 1155
Met Asp Glu Asp Lys Lys Ser Glu Phe Phe Ala Gln Leu Leu Ser
1160 1165 1170
Leu Tyr Lys Leu Thr Val Gln Met Arg Asn Ser Tyr Thr Glu Ala
1175 1180 1185
Glu Glu Gln Glu Asn Gly Ile Ser Tyr Asp Lys Ile Ile Ser Pro
1190 1195 1200
Val Ile Asn Asp Glu Gly Glu Phe Phe Asp Ser Asp Asn Tyr Lys
1205 1210 1215
Glu Ser Asp Asp Lys Glu Cys Lys Met Pro Lys Asp Ala Asp Ala
1220 1225 1230
Asn Gly Ala Tyr Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Val Leu
1235 1240 1245
Lys Ile Lys Ser Glu Trp Thr Glu Asp Gly Phe Asp Arg Asn Cys
1250 1255 1260
Leu Lys Leu Pro His Ala Glu Trp Leu Asp Phe Ile Gln Asn Lys
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Arg Tyr Glu
1280
<210> 6
<211> 1300
<212> PRT
<213> 新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)
<400> 6
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
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65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
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Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
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Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Val Asn Tyr Ser Ser
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
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290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys
500 505 510
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515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
530 535 540
Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
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Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val
660 665 670
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675 680 685
Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln
690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp
725 730 735
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755 760 765
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770 775 780
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
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930 935 940
Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys
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1205 1210 1215
Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu
1265 1270 1275
Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu
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Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
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<210> 7
<211> 1206
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种
<400> 7
Met Tyr Tyr Glu Ser Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Val Ser Lys Thr Ile
1 5 10 15
Arg Asn Glu Leu Ile Pro Ile Gly Lys Thr Leu Asp Asn Ile Arg Gln
20 25 30
Asn Asn Ile Leu Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Gln Asn Tyr Glu His
35 40 45
Val Lys Gly Ile Leu Asp Glu Tyr His Lys Gln Leu Ile Asn Glu Ala
50 55 60
Leu Asp Asn Cys Thr Leu Pro Ser Leu Lys Ile Ala Ala Glu Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Asn Gln Lys Glu Val Ser Asp Arg Glu Asp Phe Asn Lys Thr
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Gln Asp Leu Leu Arg Lys Glu Val Val Glu Lys Leu Lys Ala His Glu
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Asn Phe Thr Lys Ile Gly Lys Lys Asp Ile Leu Asp Leu Leu Glu Lys
115 120 125
Leu Pro Ser Ile Ser Glu Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Glu Ser Phe Arg
130 135 140
Asn Phe Tyr Thr Tyr Phe Thr Ser Tyr Asn Lys Val Arg Glu Asn Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Asp Lys Glu Lys Ser Ser Thr Val Ala Tyr Arg Leu Ile Asn
165 170 175
Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Val Lys Ser Tyr Arg Phe Val
180 185 190
Lys Thr Ala Gly Ile Leu Ala Asp Gly Leu Gly Glu Glu Glu Gln Asp
195 200 205
Ser Leu Phe Ile Val Glu Thr Phe Asn Lys Thr Leu Thr Gln Asp Gly
210 215 220
Ile Asp Thr Tyr Asn Ser Gln Val Gly Lys Ile Asn Ser Ser Ile Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ala Asn Gly Phe Arg Lys Ile Pro
245 250 255
Lys Met Lys Met Leu Tyr Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Glu Ser
260 265 270
Phe Ile Asp Glu Phe Gln Ser Asp Glu Val Leu Ile Asp Asn Val Glu
275 280 285
Ser Tyr Gly Ser Val Leu Ile Glu Ser Leu Lys Ser Ser Lys Val Ser
290 295 300
Ala Phe Phe Asp Ala Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys Asn Val Tyr Val
305 310 315 320
Lys Asn Asp Leu Ala Lys Thr Ala Met Ser Val Ile Val Phe Glu Asn
325 330 335
Trp Arg Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn Gln Glu Tyr Asp Leu Ala Asn
340 345 350
Glu Asn Lys Lys Lys Asp Asp Lys Tyr Phe Glu Lys Arg Gln Lys Glu
355 360 365
Leu Lys Lys Asn Lys Ser Tyr Ser Leu Glu His Leu Cys Asn Leu Ser
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Glu Asp Ser Cys Asn Leu Ile Glu Asn Tyr Ile His Gln Ile Ser Asp
385 390 395 400
Asp Ile Glu Asn Ile Ile Ile Asn Asn Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
405 410 415
Ile Asn Glu His Asp Arg Ser Arg Lys Leu Ala Lys Asn Arg Lys Ala
420 425 430
Val Lys Ala Ile Lys Asp Phe Leu Asp Ser Ile Lys Val Leu Glu Arg
435 440 445
Glu Leu Lys Leu Ile Asn Ser Ser Gly Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu
450 455 460
Ile Val Tyr Ser Ala His Glu Glu Leu Leu Val Glu Leu Lys Gln Val
465 470 475 480
Asp Ser Leu Tyr Asn Met Thr Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Phe
485 490 495
Ser Thr Glu Lys Val Lys Leu Asn Phe Asn Arg Ser Thr Leu Leu Asn
500 505 510
Gly Trp Asp Arg Asn Lys Glu Thr Asp Asn Leu Gly Val Leu Leu Leu
515 520 525
Lys Asp Gly Lys Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Asn Thr Ser Ala Asn Lys
530 535 540
Ala Phe Val Asn Pro Pro Val Ala Lys Thr Glu Lys Val Phe Lys Lys
545 550 555 560
Val Asp Tyr Lys Leu Leu Pro Val Pro Asn Gln Met Leu Pro Lys Val
565 570 575
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580 585 590
Tyr Ser Asn Tyr Lys Lys Gly Thr His Lys Lys Gly Asn Met Phe Ser
595 600 605
Leu Glu Asp Cys His Asn Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser
610 615 620
Lys His Glu Asp Trp Ser Lys Phe Gly Phe Lys Phe Asp Thr Gln Ala
625 630 635 640
Ser Tyr Asn Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Lys Gln Gly
645 650 655
Tyr Lys Leu Thr Tyr Thr Asp Ile Asp Glu Thr Tyr Ile Asn Asp Leu
660 665 670
Ile Glu Arg Asn Glu Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe
675 680 685
Ser Met Tyr Ser Lys Gly Lys Leu Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Met
690 695 700
Met Leu Phe Asp Gln Arg Asn Ile Asp Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn
705 710 715 720
Gly Glu Ala Glu Val Phe Tyr Arg Pro Ala Ser Ile Ser Glu Asp Glu
725 730 735
Leu Ile Ile His Lys Ala Gly Glu Glu Ile Lys Asn Lys Asn Pro Asn
740 745 750
Arg Ala Arg Thr Lys Glu Thr Ser Thr Phe Ser Tyr Asp Ile Val Lys
755 760 765
Asp Lys Arg Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Thr Leu His Ile Pro Ile Thr
770 775 780
Met Asn Phe Gly Val Asp Glu Val Lys Arg Phe Asn Asp Ala Val Asn
785 790 795 800
Ser Ala Ile Arg Ile Asp Glu Asn Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg
805 810 815
Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Val Val Val Ile Asp Ser Lys Gly Asn
820 825 830
Ile Leu Glu Gln Ile Ser Leu Asn Ser Ile Ile Asn Lys Glu Tyr Asp
835 840 845
Ile Glu Thr Asp Tyr His Ala Leu Leu Asp Glu Arg Glu Gly Gly Arg
850 855 860
Asp Lys Ala Arg Lys Asp Trp Asn Thr Val Glu Asn Ile Arg Asp Leu
865 870 875 880
Lys Ala Gly Leu Tyr Leu Gln Val Val Asn Val Val Ala Lys Leu Val
885 890 895
Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Cys Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe
900 905 910
Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu
915 920 925
Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Leu Val Ile Asp Lys Ser Arg
930 935 940
Glu Gln Thr Ser Pro Lys Glu Leu Gly Gly Ala Leu Asn Ala Leu Gln
945 950 955 960
Leu Thr Ser Lys Phe Lys Ser Phe Lys Glu Leu Gly Lys Gln Ser Gly
965 970 975
Val Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Tyr Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Thr
980 985 990
Thr Gly Phe Ala Asn Leu Phe Tyr Met Lys Cys Glu Asn Val Glu Lys
995 1000 1005
Ser Lys Arg Phe Phe Asp Gly Phe Asp Phe Ile Arg Phe Asn Ala
1010 1015 1020
Leu Glu Asn Val Phe Glu Phe Gly Phe Asp Tyr Arg Ser Phe Thr
1025 1030 1035
Gln Arg Ala Cys Gly Ile Asn Ser Lys Trp Thr Val Cys Thr Asn
1040 1045 1050
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1160 1165 1170
Trp Val Leu Glu Gln Ile Arg Gln Lys Ser Glu Gly Glu Lys Ile
1175 1180 1185
Asn Leu Ala Met Thr Asn Ala Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr
1190 1195 1200
His Leu Leu
1205
<210> 8
<211> 1233
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种
<400> 8
Met Asp Tyr Gly Asn Gly Gln Phe Glu Arg Arg Ala Pro Leu Thr Lys
1 5 10 15
Thr Ile Thr Leu Arg Leu Lys Pro Ile Gly Glu Thr Arg Glu Thr Ile
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Arg Glu Gln Lys Leu Leu Glu Gln Asp Ala Ala Phe Arg Lys Leu Val
35 40 45
Glu Thr Val Thr Pro Ile Val Asp Asp Cys Ile Arg Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Asn Ala Leu Cys His Phe Gly Thr Glu Tyr Asp Phe Ser Cys Leu Gly
65 70 75 80
Asn Ala Ile Ser Lys Asn Asp Ser Lys Ala Ile Lys Lys Glu Thr Glu
85 90 95
Lys Val Glu Lys Leu Leu Ala Lys Val Leu Thr Glu Asn Leu Pro Asp
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Gly Leu Arg Lys Val Asn Asp Ile Asn Ser Ala Ala Phe Ile Gln Asp
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg Ile Thr Ala Leu Thr Val Trp Leu Pro Asp Arg Val Phe Glu Asn
165 170 175
Phe Asn Ile Phe Ile Glu Asn Ala Glu Lys Met Arg Ile Leu Leu Asp
180 185 190
Ser Pro Leu Asn Glu Lys Ile Met Lys Phe Asp Pro Asp Ala Glu Gln
195 200 205
Tyr Ala Ser Leu Glu Phe Tyr Gly Gln Cys Leu Ser Gln Lys Asp Ile
210 215 220
Asp Ser Tyr Asn Leu Ile Ile Ser Gly Ile Tyr Ala Asp Asp Glu Val
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Lys Asn Pro Gly Ile Asn Glu Ile Val Lys Glu Tyr Asn Gln Gln Ile
245 250 255
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260 265 270
Lys Gln Ile Leu Met Pro Val Glu Lys Ala Phe Phe Val Arg Val Leu
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290 295 300
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305 310 315 320
Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Gly Ser Arg Leu His Glu Leu Ser His
325 330 335
Val Ile Tyr Gly Asp His Gly Lys Leu Ser Gln Ile Ile Tyr Asp Lys
340 345 350
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355 360 365
Arg Lys Glu Ser Lys Lys Arg Leu Glu Gly Leu Glu Glu His Ile Arg
370 375 380
Lys Ser Thr Tyr Thr Phe Asp Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Glu Lys Asn
385 390 395 400
Val Met Ala Ala Tyr Ile Ala Ala Val Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ile
405 410 415
Met Arg Lys Glu Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Ser Lys Glu Asp Val
420 425 430
Lys Ile Arg Gly Asn Arg His Asn Thr Leu Ile Val Lys Asn Tyr Phe
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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565 570 575
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Arg Asp Asn Pro Glu Ala Asp Glu Phe Val Phe Leu Ser Gly Met Lys
595 600 605
Ala Pro Val Thr Ile Thr Arg Glu Thr Tyr Glu Ala Tyr Arg Tyr Lys
610 615 620
Leu Tyr Thr Val Gly Lys Leu Arg Asp Gly Glu Val Ser Glu Glu Glu
625 630 635 640
Tyr Lys Arg Ala Leu Leu Gln Val Leu Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Leu
645 650 655
Glu Asn Arg Met Ile Tyr Ala Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys Asp Leu
660 665 670
Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Ser Glu Phe Ile Lys Gln Val Glu Thr His
675 680 685
Asn Thr Phe Met Cys Trp Ala Lys Val Ser Ser Ser Gln Leu Asp Asp
690 695 700
Leu Val Lys Ser Gly Asn Gly Leu Leu Phe Glu Ile Trp Ser Glu Arg
705 710 715 720
Leu Glu Ser Tyr Tyr Lys Tyr Gly Asn Glu Lys Val Leu Arg Gly Tyr
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Glu Gly Val Leu Leu Ser Ile Leu Lys Asp Glu Asn Leu Val Ser Met
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Arg Thr Leu Leu Asn Ser Arg Pro Met Leu Val Tyr Arg Pro Lys Glu
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Ser Ser Lys Pro Met Val Val His Arg Asp Gly Ser Arg Val Val Asp
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Leu Tyr Arg Phe Phe Asn Asn Leu Leu Ile Lys Glu Lys Leu Gly Glu
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<210> 9
<211> 1227
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种
<400> 9
Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
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Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile
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Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser
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675 680 685
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885 890 895
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<210> 10
<211> 1264
<212> PRT
<213> 稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)
<400> 10
Met Glu Asp Tyr Ser Gly Phe Val Asn Ile Tyr Ser Ile Gln Lys Thr
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Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Lys Thr Leu Glu His Ile Glu
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Lys Lys Gln Phe Asp Leu Leu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Tyr Ala Ile
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Glu Ile Asp Ile Ser Gly His Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu
545 550 555 560
Thr Gly Lys Ile Tyr Ser Lys Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn
565 570 575
Ser Thr Leu Leu Lys Gly Trp Asp Glu Asn Arg Glu Val Ala Asn Leu
580 585 590
Cys Val Ile Phe Arg Glu Asp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asp
595 600 605
Lys Glu Asn Asn Thr Ile Leu Ser Asp Ile Pro Lys Val Lys Pro Asn
610 615 620
Glu Leu Phe Tyr Glu Lys Met Val Tyr Lys Leu Ile Pro Thr Pro His
625 630 635 640
Met Gln Leu Pro Arg Ile Ile Phe Ser Ser Asp Asn Leu Ser Ile Tyr
645 650 655
Asn Pro Ser Lys Ser Ile Leu Lys Ile Arg Glu Ala Lys Ser Phe Lys
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Glu Gly Lys Asn Phe Lys Leu Lys Asp Cys His Lys Phe Ile Asp Phe
675 680 685
Tyr Lys Glu Ser Ile Ser Lys Asn Glu Asp Trp Ser Arg Phe Asp Phe
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Lys Phe Ser Lys Thr Ser Ser Tyr Glu Asn Ile Ser Glu Phe Tyr Arg
705 710 715 720
Glu Val Glu Arg Gln Gly Tyr Asn Leu Asp Phe Lys Lys Val Ser Lys
725 730 735
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Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ile Phe Ser Lys Gly Lys Pro Asn Leu
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Leu Phe Glu Lys Leu Lys Tyr Pro Ile Leu Lys Asp Lys Arg Tyr Ser
820 825 830
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835 840 845
Lys Glu Arg Leu Asn Phe Asn Leu Lys Val Asn Glu Phe Leu Lys Arg
850 855 860
Asn Lys Asp Ile Asn Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu
865 870 875 880
Leu Tyr Leu Val Met Ile Asn Gln Lys Gly Glu Ile Leu Lys Gln Thr
885 890 895
Leu Leu Asp Ser Met Gln Ser Gly Lys Gly Arg Pro Glu Ile Asn Tyr
900 905 910
Lys Glu Lys Leu Gln Glu Lys Glu Ile Glu Arg Asp Lys Ala Arg Lys
915 920 925
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Ser Ile Val Ile His Gln Ile Ser Lys Leu Met Val Glu Asn Asn Ala
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Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Asn Ile Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln
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Lys Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp
980 985 990
Lys Leu Asn Phe Leu Val Phe Lys Glu Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly
995 1000 1005
Gly Val Leu Lys Ala Tyr Gln Leu Thr Asp Glu Phe Gln Ser Phe
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Glu Lys Leu Ser Lys Gln Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ser
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1115 1120 1125
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1145 1150 1155
Asp Ala Val Phe Phe Lys Ser Leu Leu Phe Tyr Ile Lys Thr Thr
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Leu Ser Leu Arg Gln Asn Asn Gly Lys Lys Gly Glu Glu Glu Lys
1175 1180 1185
Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Val Asp Ser Lys Gly Arg Phe Phe
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Asn Ser Leu Glu Ala Ser Asp Asp Glu Pro Lys Asp Ala Asp Ala
1205 1210 1215
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Val Leu Asn Glu Thr Lys Glu Glu Asn Leu Ser Arg Pro Lys Trp
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Lys Ile Lys Asn Lys Asp Trp Leu Glu Phe Val Trp Glu Arg Asn
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Arg
<210> 11
<211> 1373
<212> PRT
<213> 牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)
<400> 11
Met Leu Phe Gln Asp Phe Thr His Leu Tyr Pro Leu Ser Lys Thr Val
1 5 10 15
Arg Phe Glu Leu Phe Ile Asp Arg Thr Leu Glu His Ile His Ala Lys
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Lys Val Ile Leu Asp Asp Tyr His Arg Asp Phe Ile Ala Asp Met Met
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Leu Phe Lys Asp Gly Lys Glu Leu Gly Asp Leu Ala Lys Phe Val Ile
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Ala Gln Glu Gly Glu Ser Ser Pro Lys Leu Ala His Leu Ala His Phe
145 150 155 160
Glu Lys Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Gly Phe His Asp Asn Arg Lys Asn
165 170 175
Met Tyr Ser Asp Glu Asp Lys His Thr Ala Ile Ala Tyr Arg Leu Ile
180 185 190
His Glu Asn Leu Pro Arg Phe Ile Asp Asn Leu Gln Ile Leu Thr Thr
195 200 205
Ile Lys Gln Lys His Ser Ala Leu Tyr Asp Gln Ile Ile Asn Glu Leu
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Thr Ala Ser Gly Leu Asp Val Ser Leu Ala Ser His Leu Asp Gly Tyr
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Gly Gly Ile Ser Gly Glu Ala Gly Ser Pro Lys Ile Gln Gly Ile Asn
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His Asp Asp Glu Ser Val Gln Ala Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Phe Lys
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545 550 555 560
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565 570 575
Gly Trp Asp Leu Asn Lys Glu Lys Asp Asn Phe Gly Val Ile Leu Gln
580 585 590
Lys Asp Gly Cys Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Asp Lys Ala His Lys Lys
595 600 605
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610 615 620
Ile Tyr Lys Tyr Leu Glu Val Arg Lys Gln Phe Pro Lys Val Phe Phe
625 630 635 640
Ser Lys Glu Ala Ile Ala Ile Asn Tyr His Pro Ser Lys Glu Leu Val
645 650 655
Glu Ile Lys Asp Lys Gly Arg Gln Arg Ser Asp Asp Glu Arg Leu Lys
660 665 670
Leu Tyr Arg Phe Ile Leu Glu Cys Leu Lys Ile His Pro Lys Tyr Asp
675 680 685
Lys Lys Phe Glu Gly Ala Ile Gly Asp Ile Gln Leu Phe Lys Lys Asp
690 695 700
Lys Lys Gly Arg Glu Val Pro Ile Ser Glu Lys Asp Leu Phe Lys Asp
705 710 715 720
Ile Asn Gly Ile Phe Ser Ser Lys Pro Lys Leu Glu Met Glu Asp Phe
725 730 735
Phe Ile Gly Glu Phe Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Gln Asp Leu Val Asp
740 745 750
Gln Tyr Asn Ile Tyr Lys Lys Ile Asp Ser Asn Asp Asn Arg Lys Lys
755 760 765
Glu Asn Phe Tyr Asn Asn His Pro Lys Phe Lys Lys Asp Leu Val Arg
770 775 780
Tyr Tyr Tyr Glu Ser Met Cys Lys His Glu Glu Trp Glu Glu Ser Phe
785 790 795 800
Glu Phe Ser Lys Lys Leu Gln Asp Ile Gly Cys Tyr Val Asp Val Asn
805 810 815
Glu Leu Phe Thr Glu Ile Glu Thr Arg Arg Leu Asn Tyr Lys Ile Ser
820 825 830
Phe Cys Asn Ile Asn Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Leu Val Glu Gln Gly
835 840 845
Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Pro Lys Ala
850 855 860
His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Lys Ala Leu Phe Ser
865 870 875 880
Glu Asp Asn Leu Ala Asp Pro Ile Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Gln
885 890 895
Ile Phe Tyr Arg Lys Ala Ser Leu Asp Met Asn Glu Thr Thr Ile His
900 905 910
Arg Ala Gly Glu Val Leu Glu Asn Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys
915 920 925
Arg Gln Phe Val Tyr Asp Ile Ile Lys Asp Lys Arg Tyr Thr Gln Lys
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Met Thr Ile Lys Glu Phe Asn Lys Lys Val Asn Gln Ser Ile Gln Gln
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Tyr Asp Glu Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu
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Leu Tyr Leu Thr Val Ile Asn Ser Lys Gly Glu Ile Leu Glu Gln Cys
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Thr Thr Pro Tyr His Lys Ile Leu Asp Lys Arg Glu Ile Glu Arg
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Gln Asn Phe Glu Asn Ala Leu Ile Lys Lys Leu Asn His Leu Val
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Leu Lys Asp Lys Ala Asp Asp Glu Ile Gly Ser Tyr Lys Asn Ala
1115 1120 1125
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Glu Asn Ile Gln Ala Ser Gln Ala Phe Phe Gly Lys Phe Asp Lys
1175 1180 1185
Ile Cys Tyr Asn Ala Asp Lys Asp Tyr Phe Glu Phe His Ile Asp
1190 1195 1200
Tyr Ala Lys Phe Thr Asp Lys Ala Lys Asn Ser Arg Gln Ile Trp
1205 1210 1215
Thr Ile Cys Ser His Gly Asp Lys Arg Tyr Val Tyr Asp Lys Thr
1220 1225 1230
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1310 1315 1320
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1325 1330 1335
Leu Lys Gly Leu Trp Leu Leu Asn Glu Leu Lys Asn Ser Asp Asp
1340 1345 1350
Leu Asn Lys Val Lys Leu Ala Ile Asp Asn Gln Thr Trp Leu Asn
1355 1360 1365
Phe Ala Gln Asn Arg
1370
<210> 12
<211> 1352
<212> PRT
<213> Parcubacteria bacterium
<400> 12
Met Glu Asn Ile Phe Asp Gln Phe Ile Gly Lys Tyr Ser Leu Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Lys Thr Glu Asp Phe Leu
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Lys Asn Glu Asn Ser Tyr Asn Lys Ile Ile Gly Arg Ile Asn Lys Lys
305 310 315 320
Ile Lys Glu Tyr Arg Asp Gln Lys Ala Lys Asp Thr Lys Leu Thr Lys
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Ser Asp Phe Pro Phe Phe Lys Asn Leu Asp Lys Gln Ile Leu Gly Glu
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740 745 750
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755 760 765
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820 825 830
Phe Lys Leu Ser Gly Met Ala Glu Ile Phe Gln Arg Gln Pro Ser Val
835 840 845
Asn Glu Arg Glu Lys Ile Thr Thr Gln Lys Asn Gln Cys Ile Leu Asp
850 855 860
Lys Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Tyr Arg Arg Tyr Thr Glu Lys Lys Ile
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Met Phe His Met Ser Leu Val Leu Asn Thr Gly Lys Gly Glu Ile Lys
885 890 895
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915 920 925
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Ala Ser Leu Asn Glu Ile Asn Gly Val Asn Tyr Arg Asp Lys Leu Ile
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965 970 975
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1055 1060 1065
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Asn Leu Phe Ile Ser Asn Ala Glu Trp Asp Glu Ala Ala Arg Asp
1325 1330 1335
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1340 1345 1350
<210> 13
<211> 1260
<212> PRT
<213> 犬口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)
<400> 13
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Met Leu Gln Ser Phe Cys Glu Leu Tyr Lys Lys Asp His Arg Thr Glu
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210 215 220
Ile Ala Lys Glu Leu Glu His Ile Arg Ala Asp Phe Ser Ala Gly Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Lys Lys Asp Glu Arg Leu Glu Asp Ile Phe Ser Leu Asn Tyr
245 250 255
Tyr Ile His Val Leu Ser Gln Ala Gly Ile Glu Lys Tyr Asn Ala Leu
260 265 270
Ile Gly Lys Ile Val Thr Glu Gly Asp Gly Glu Met Lys Gly Leu Asn
275 280 285
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Leu Ser Tyr Leu Pro Glu Ser Phe Glu Lys Asp Glu Glu Leu Leu Arg
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Ala Leu Lys Glu Phe Tyr Asp His Ile Ala Glu Asp Ile Leu Gly Arg
340 345 350
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355 360 365
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Gly Asp Trp Asn Ala Ile Tyr Met Ala Arg Glu Arg Ala Tyr Asp His
385 390 395 400
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405 410 415
Lys Ala Leu Lys Gly Glu Glu Ser Ile Ser Leu Ala Asn Leu Asn Ser
420 425 430
Cys Ile Ala Phe Leu Asp Asn Val Arg Asp Cys Arg Val Asp Thr Tyr
435 440 445
Leu Ser Thr Leu Gly Gln Lys Glu Gly Pro His Gly Leu Ser Asn Leu
450 455 460
Val Glu Asn Val Phe Ala Ser Tyr His Glu Ala Glu Gln Leu Leu Ser
465 470 475 480
Phe Pro Tyr Pro Glu Glu Asn Asn Leu Ile Gln Asp Lys Asp Asn Val
485 490 495
Val Leu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Asn Ile Ser Asp Leu Gln Arg Phe
500 505 510
Leu Lys Pro Leu Trp Gly Met Gly Asp Glu Pro Asp Lys Asp Glu Arg
515 520 525
Phe Tyr Gly Glu Tyr Asn Tyr Ile Arg Gly Ala Leu Asp Gln Val Ile
530 535 540
Pro Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Ser
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Thr Arg Lys Val Lys Leu Asn Phe Gly Asn Ser Gln Leu Leu Ser Gly
565 570 575
Trp Asp Arg Asn Lys Glu Lys Asp Asn Ser Cys Val Ile Leu Arg Lys
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595 600 605
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Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Lys Pro Ser Pro
645 650 655
Lys Leu Leu Glu Gln Tyr Gly His Gly Thr His Lys Lys Gly Asp Thr
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Phe Ser Met Asp Asp Leu His Glu Leu Ile Asp Phe Phe Lys His Ser
675 680 685
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690 695 700
Thr Ala Thr Tyr Glu Asn Val Ser Ser Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asp
705 710 715 720
Gln Gly Tyr Lys Leu Ser Phe Arg Lys Val Ser Glu Ser Tyr Val Tyr
725 730 735
Ser Leu Ile Asp Gln Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Leu Asp Gly Lys Ala Glu Ile Phe Phe Arg Glu Lys Ser Leu Lys Asn
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Gln Lys Lys Gly Glu Glu Ser Leu Phe Glu Tyr Asp Leu Val Lys Asp
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
His Ile Arg Glu Ala Lys Asp Met His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly
865 870 875 880
Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Cys Val Ile Asp Ser Arg Gly Thr Ile
885 890 895
Leu Asp Gln Ile Ser Leu Asn Thr Ile Asn Asp Ile Asp Tyr His Asp
900 905 910
Leu Leu Glu Ser Arg Asp Lys Asp Arg Gln Gln Glu His Arg Asn Trp
915 920 925
Gln Thr Ile Glu Gly Ile Lys Glu Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln
930 935 940
Ala Val His Arg Ile Ala Glu Leu Met Val Ala Tyr Lys Ala Val Val
945 950 955 960
Ala Leu Glu Asp Leu Asn Met Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val
965 970 975
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Gln Leu Ile Asp Lys Leu
980 985 990
Asn Tyr Leu Val Asp Lys Lys Lys Arg Pro Glu Asp Ile Gly Gly Leu
995 1000 1005
Leu Arg Ala Tyr Gln Phe Thr Ala Pro Phe Lys Ser Phe Lys Glu
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Met Gly Lys Gln Asn Gly Phe Leu Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Asn
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Ser Met Trp Ile Leu Cys Thr His Gly Ser Arg Ile Lys Asn Phe
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Gln Lys Asn Gly Gln Trp Asp Ser Glu Glu Phe Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Glu Ala Phe Lys Ser Leu Phe Val Arg Tyr Glu Ile Asp
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Tyr Thr Ala Asp Leu Lys Thr Ala Ile Val Asp Glu Lys Gln Lys
1145 1150 1155
Asp Phe Phe Val Asp Leu Leu Lys Leu Phe Lys Leu Thr Val Gln
1160 1165 1170
Met Arg Asn Ser Trp Lys Glu Lys Asp Leu Asp Tyr Leu Ile Ser
1175 1180 1185
Pro Val Ala Gly Ala Asp Gly Arg Phe Phe Asp Thr Arg Glu Gly
1190 1195 1200
Asn Lys Ser Leu Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn
1205 1210 1215
Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Ala Leu Arg Gln Ile Arg Gln Thr
1220 1225 1230
Ser Glu Gly Gly Lys Leu Lys Leu Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp
1235 1240 1245
Leu Gln Phe Val Gln Glu Arg Ser Tyr Glu Lys Asp
1250 1255 1260
<210> 14
<211> 1324
<212> PRT
<213> 解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)
<400> 14
Met Glu Asn Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Leu Phe Gln Leu Asn Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Cys Glu Leu Leu Glu
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Glu Gly Lys Ile Phe Ala Ser Gly Ser Phe Leu Glu Lys Asp Lys Val
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Arg Ala Asp Asn Val Ser Tyr Val Lys Lys Glu Ile Asp Lys Lys His
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Lys Ile Phe Ile Glu Glu Thr Leu Ser Ser Phe Ser Ile Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Asp Cys Tyr Asn Glu Leu Lys Ala Phe Lys
85 90 95
Lys Asp Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu Val Lys Lys Thr Ala Leu Arg
100 105 110
Asn Lys Cys Thr Ser Ile Gln Arg Ala Met Arg Glu Ala Ile Ser Gln
115 120 125
Ala Phe Leu Lys Ser Pro Gln Lys Lys Leu Leu Ala Ile Lys Asn Leu
130 135 140
Ile Glu Asn Val Phe Lys Ala Asp Glu Asn Val Gln His Phe Ser Glu
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Phe Ser Gly Phe Glu Thr Asn Arg Glu Asn Phe Tyr
165 170 175
Ser Asp Glu Glu Lys Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Leu Val His Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Ile Phe Ile Lys Asn Ile Tyr Ile Phe Glu Lys Leu Lys
195 200 205
Glu Gln Phe Asp Ala Lys Thr Leu Ser Glu Ile Phe Glu Asn Tyr Lys
210 215 220
Leu Tyr Val Ala Gly Ser Ser Leu Asp Glu Val Phe Ser Leu Glu Tyr
225 230 235 240
Phe Asn Asn Thr Leu Thr Gln Lys Gly Ile Asp Asn Tyr Asn Ala Val
245 250 255
Ile Gly Lys Ile Val Lys Glu Asp Lys Gln Glu Ile Gln Gly Leu Asn
260 265 270
Glu His Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys His Lys Asp Arg Arg Leu Pro
275 280 285
Phe Phe Ile Ser Leu Lys Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Ala Leu
290 295 300
Ser Trp Leu Pro Asp Met Phe Lys Asn Asp Ser Glu Val Ile Asp Ala
305 310 315 320
Leu Lys Gly Phe Tyr Ile Glu Asp Gly Phe Glu Asn Asn Val Leu Thr
325 330 335
Pro Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Leu Asn Gly
340 345 350
Ile Phe Ile Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ser Ser Leu Ser Gln Asn Val
355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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Leu Leu Asp Ala Thr Lys Gln Phe Gln His Phe Ile Lys Pro Leu Leu
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545 550 555 560
Val Arg Asn Arg Leu Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Ile Arg
565 570 575
Leu Cys Phe Asn Lys Pro Lys Leu Met Thr Gly Trp Val Asp Ser Lys
580 585 590
Thr Glu Lys Ser Asp Asn Gly Thr Gln Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Arg
595 600 605
Lys Lys Asn Glu Ile Gly Glu Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Ile Ser Ser
610 615 620
Lys Ala Gln Leu Phe Arg Lys Asn Glu Ala Val Ile Gly Asp Tyr Glu
625 630 635 640
Arg Leu Asp Tyr Tyr Gln Pro Lys Ala Asn Thr Ile Tyr Gly Ser Ala
645 650 655
Tyr Glu Gly Glu Asn Ser Tyr Lys Glu Asp Lys Lys Arg Leu Asn Lys
660 665 670
Val Ile Ile Ala Tyr Ile Glu Gln Ile Lys Gln Thr Asn Ile Lys Lys
675 680 685
Ser Ile Ile Glu Ser Ile Ser Lys Tyr Pro Asn Ile Ser Asp Asp Asp
690 695 700
Lys Val Thr Pro Ser Ser Leu Leu Glu Lys Ile Lys Lys Val Ser Ile
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Asn Gly Ile Leu Ser Phe Lys Ser Phe Gln Ser Val Asn
725 730 735
Lys Glu Val Ile Asp Asn Leu Leu Lys Thr Ile Ser Pro Leu Lys Asn
740 745 750
Lys Ala Glu Phe Leu Asp Leu Ile Asn Lys Asp Tyr Gln Ile Phe Thr
755 760 765
Glu Val Gln Ala Val Ile Asp Glu Ile Cys Lys Gln Lys Thr Phe Ile
770 775 780
Tyr Phe Pro Ile Ser Asn Val Glu Leu Glu Lys Glu Met Gly Asp Lys
785 790 795 800
Asp Lys Pro Leu Cys Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Asp Leu Ser Phe
805 810 815
Ala Lys Thr Phe Ser Ala Asn Leu Arg Lys Lys Arg Gly Ala Glu Asn
820 825 830
Leu His Thr Met Leu Phe Lys Ala Leu Met Glu Gly Asn Gln Asp Asn
835 840 845
Leu Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ile Phe Tyr Arg Ala Lys Ser Leu Asp
850 855 860
Gly Asn Lys Pro Thr His Pro Ala Asn Glu Ala Ile Lys Cys Arg Asn
865 870 875 880
Val Ala Asn Lys Asp Lys Val Ser Leu Phe Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys
885 890 895
Asn Arg Arg Tyr Met Glu Asn Lys Phe Leu Phe His Leu Ser Ile Val
900 905 910
Gln Asn Tyr Lys Ala Ala Asn Asp Ser Ala Gln Leu Asn Ser Ser Ala
915 920 925
Thr Glu Tyr Ile Arg Lys Ala Asp Asp Leu His Ile Ile Gly Ile Asp
930 935 940
Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Tyr Ser Val Ile Asp Met Lys Gly
945 950 955 960
Asn Ile Val Glu Gln Asp Ser Leu Asn Ile Ile Arg Asn Asn Asp Leu
965 970 975
Glu Thr Asp Tyr His Asp Leu Leu Asp Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys
980 985 990
Ala Asn Arg Gln Asn Trp Glu Ala Val Glu Gly Ile Lys Asp Leu Lys
995 1000 1005
Lys Gly Tyr Leu Ser Gln Ala Val His Gln Ile Ala Gln Leu Met
1010 1015 1020
Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala Leu Glu Asp Leu Gly Gln Met
1025 1030 1035
Phe Val Thr Arg Gly Gln Lys Ile Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln
1040 1045 1050
Phe Glu Lys Ser Leu Val Asp Lys Leu Ser Tyr Leu Val Asp Lys
1055 1060 1065
Lys Arg Pro Tyr Asn Glu Leu Gly Gly Ile Leu Lys Ala Tyr Gln
1070 1075 1080
Leu Ala Ser Ser Ile Thr Lys Asn Asn Ser Asp Lys Gln Asn Gly
1085 1090 1095
Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Trp Asn Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1100 1105 1110
Val Thr Gly Phe Thr Asp Leu Leu Arg Pro Lys Ala Met Thr Ile
1115 1120 1125
Lys Glu Ala Gln Asp Phe Phe Gly Ala Phe Asp Asn Ile Ser Tyr
1130 1135 1140
Asn Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Glu Thr Asn Tyr Asp Lys Phe
1145 1150 1155
Lys Ile Arg Met Lys Ser Ala Gln Thr Arg Trp Thr Ile Cys Thr
1160 1165 1170
Phe Gly Asn Arg Ile Lys Arg Lys Lys Asp Lys Asn Tyr Trp Asn
1175 1180 1185
Tyr Glu Glu Val Glu Leu Thr Glu Glu Phe Lys Lys Leu Phe Lys
1190 1195 1200
Asp Ser Asn Ile Asp Tyr Glu Asn Cys Asn Leu Lys Glu Glu Ile
1205 1210 1215
Gln Asn Lys Asp Asn Arg Lys Phe Phe Asp Asp Leu Ile Lys Leu
1220 1225 1230
Leu Gln Leu Thr Leu Gln Met Arg Asn Ser Asp Asp Lys Gly Asn
1235 1240 1245
Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Val Ala Asn Ala Glu Gly Gln Phe Phe
1250 1255 1260
Asp Ser Arg Asn Gly Asp Lys Lys Leu Pro Leu Asp Ala Asp Ala
1265 1270 1275
Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Gly Leu Trp Asn Ile Arg
1280 1285 1290
Gln Ile Lys Gln Thr Lys Asn Lys Asp Asp Leu Asn Leu Ser Ile
1295 1300 1305
Ser Ser Thr Glu Trp Leu Asp Phe Val Arg Glu Lys Pro Tyr Leu
1310 1315 1320
Lys
<210> 15
<211> 1484
<212> PRT
<213> 异域菌门菌(Peregrinibacteria bacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1073)..(1073)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 15
Met Ser Asn Phe Phe Lys Asn Phe Thr Asn Leu Tyr Glu Leu Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Asp Thr Leu Thr Asn Met
20 25 30
Lys Asp His Leu Glu Tyr Asp Glu Lys Leu Gln Thr Phe Leu Lys Asp
35 40 45
Gln Asn Ile Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Leu Lys Pro Gln Phe Asp Glu
50 55 60
Ile His Glu Glu Phe Ile Thr Asp Ser Leu Glu Ser Lys Lys Ala Lys
65 70 75 80
Glu Ile Asp Phe Ser Glu Tyr Leu Asp Leu Phe Gln Glu Lys Lys Glu
85 90 95
Leu Asn Asp Ser Glu Lys Lys Leu Arg Asn Lys Ile Gly Glu Thr Phe
100 105 110
Asn Lys Ala Gly Glu Lys Trp Lys Lys Glu Lys Tyr Pro Gln Tyr Glu
115 120 125
Trp Lys Lys Gly Ser Lys Ile Ala Asn Gly Ala Asp Ile Leu Ser Cys
130 135 140
Gln Asp Met Leu Gln Phe Ile Lys Tyr Lys Asn Pro Glu Asp Glu Lys
145 150 155 160
Ile Lys Asn Tyr Ile Asp Asp Thr Leu Lys Gly Phe Phe Thr Tyr Phe
165 170 175
Gly Gly Phe Asn Gln Asn Arg Ala Asn Tyr Tyr Glu Thr Lys Lys Glu
180 185 190
Ala Ser Thr Ala Val Ala Thr Arg Ile Val His Glu Asn Leu Pro Lys
195 200 205
Phe Cys Asp Asn Val Ile Gln Phe Lys His Ile Ile Lys Arg Lys Lys
210 215 220
Asp Gly Thr Val Glu Lys Thr Glu Arg Lys Thr Glu Tyr Leu Asn Ala
225 230 235 240
Tyr Gln Tyr Leu Lys Asn Asn Asn Lys Ile Thr Gln Ile Lys Asp Ala
245 250 255
Glu Thr Glu Lys Met Ile Glu Ser Thr Pro Ile Ala Glu Lys Ile Phe
260 265 270
Asp Val Tyr Tyr Phe Ser Ser Cys Leu Ser Gln Lys Gln Ile Glu Glu
275 280 285
Tyr Asn Arg Ile Ile Gly His Tyr Asn Leu Leu Ile Asn Leu Tyr Asn
290 295 300
Gln Ala Lys Arg Ser Glu Gly Lys His Leu Ser Ala Asn Glu Lys Lys
305 310 315 320
Tyr Lys Asp Leu Pro Lys Phe Lys Thr Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Cys
325 330 335
Gly Lys Lys Lys Asp Leu Phe Tyr Thr Ile Lys Cys Asp Thr Glu Glu
340 345 350
Glu Ala Asn Lys Ser Arg Asn Glu Gly Lys Glu Ser His Ser Val Glu
355 360 365
Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gln Glu Ala Ile Asn Lys Tyr Phe Lys Ser
370 375 380
Asn Asn Asp Cys Glu Asn Ile Asn Thr Val Pro Asp Phe Ile Asn Tyr
385 390 395 400
Ile Leu Thr Lys Glu Asn Tyr Glu Gly Val Tyr Trp Ser Lys Ala Ala
405 410 415
Met Asn Thr Ile Ser Asp Lys Tyr Phe Ala Asn Tyr His Asp Leu Gln
420 425 430
Asp Arg Leu Lys Glu Ala Lys Val Phe Gln Lys Ala Asp Lys Lys Ser
435 440 445
Glu Asp Asp Ile Lys Ile Pro Glu Ala Ile Glu Leu Ser Gly Leu Phe
450 455 460
Gly Val Leu Asp Ser Leu Ala Asp Trp Gln Thr Thr Leu Phe Lys Ser
465 470 475 480
Ser Ile Leu Ser Asn Glu Lys Leu Lys Ile Ile Thr Asp Ser Gln Thr
485 490 495
Pro Ser Glu Ala Leu Leu Lys Met Ile Phe Asn Asp Ile Glu Lys Asn
500 505 510
Met Glu Ser Phe Leu Lys Glu Thr Asn Asp Ile Ile Thr Leu Lys Lys
515 520 525
Tyr Lys Gly Asn Lys Glu Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gln Trp Phe Asp
530 535 540
Tyr Thr Leu Ala Ile Asn Arg Met Leu Lys Tyr Phe Leu Val Lys Glu
545 550 555 560
Asn Lys Ile Lys Gly Asn Ser Leu Asp Thr Asn Ile Ser Glu Ala Leu
565 570 575
Lys Thr Leu Ile Tyr Ser Asp Asp Ala Glu Trp Phe Lys Trp Tyr Asp
580 585 590
Ala Leu Arg Asn Tyr Leu Thr Gln Lys Pro Gln Asp Glu Ala Lys Glu
595 600 605
Asn Lys Leu Lys Leu Asn Phe Asp Asn Pro Ser Leu Ala Gly Gly Trp
610 615 620
Asp Val Asn Lys Glu Cys Ser Asn Phe Cys Val Ile Leu Lys Asp Lys
625 630 635 640
Asn Glu Lys Lys Tyr Leu Ala Met Ile Lys Lys Gly Glu Asn Thr Leu
645 650 655
Phe Gln Lys Glu Trp Thr Glu Gly Arg Gly Lys Asn Leu Thr Lys Lys
660 665 670
Ser Asn Pro Leu Phe Glu Ile Asn Asn Cys Glu Ile Leu Ser Lys Met
675 680 685
Glu Tyr Asp Phe Trp Ala Asp Val Ser Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser
690 695 700
Thr Gln Leu Lys Ala Val Val Asn His Phe Lys Gln Ser Asp Asn Glu
705 710 715 720
Phe Ile Phe Pro Ile Gly Tyr Lys Val Thr Ser Gly Glu Lys Phe Arg
725 730 735
Glu Glu Cys Lys Ile Ser Lys Gln Asp Phe Glu Leu Asn Asn Lys Val
740 745 750
Phe Asn Lys Asn Glu Leu Ser Val Thr Ala Met Arg Tyr Asp Leu Ser
755 760 765
Ser Thr Gln Glu Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Phe Gln Lys Glu Tyr Trp
770 775 780
Glu Leu Leu Phe Lys Gln Glu Lys Arg Asp Thr Lys Leu Thr Asn Asn
785 790 795 800
Glu Ile Phe Asn Glu Trp Ile Asn Phe Cys Asn Lys Lys Tyr Ser Glu
805 810 815
Leu Leu Ser Trp Glu Arg Lys Tyr Lys Asp Ala Leu Thr Asn Trp Ile
820 825 830
Asn Phe Cys Lys Tyr Phe Leu Ser Lys Tyr Pro Lys Thr Thr Leu Phe
835 840 845
Asn Tyr Ser Phe Lys Glu Ser Glu Asn Tyr Asn Ser Leu Asp Glu Phe
850 855 860
Tyr Arg Asp Val Asp Ile Cys Ser Tyr Lys Leu Asn Ile Asn Thr Thr
865 870 875 880
Ile Asn Lys Ser Ile Leu Asp Arg Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr
885 890 895
Leu Phe Glu Ile Lys Asn Gln Asp Ser Asn Asp Gly Lys Ser Ile Gly
900 905 910
His Lys Asn Asn Leu His Thr Ile Tyr Trp Asn Ala Ile Phe Glu Asn
915 920 925
Phe Asp Asn Arg Pro Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Tyr Arg
930 935 940
Lys Ala Ile Ser Lys Asp Lys Leu Gly Ile Val Lys Gly Lys Lys Thr
945 950 955 960
Lys Asn Gly Thr Trp Ile Ile Lys Asn Tyr Arg Phe Ser Lys Glu Lys
965 970 975
Phe Ile Leu His Val Pro Ile Thr Leu Asn Phe Cys Ser Asn Asn Glu
980 985 990
Tyr Val Asn Asp Ile Val Asn Thr Lys Phe Tyr Asn Phe Ser Asn Leu
995 1000 1005
His Phe Leu Gly Ile Asp Arg Gly Glu Lys His Leu Ala Tyr Tyr
1010 1015 1020
Ser Leu Val Asn Lys Asn Gly Glu Ile Val Asp Gln Gly Thr Leu
1025 1030 1035
Asn Leu Pro Phe Thr Asp Lys Asp Gly Asn Gln Arg Ser Ile Lys
1040 1045 1050
Lys Glu Lys Tyr Phe Tyr Asn Lys Gln Glu Asp Lys Trp Glu Ala
1055 1060 1065
Lys Glu Val Asp Xaa Trp Asn Tyr Asn Asp Leu Leu Asp Ala Met
1070 1075 1080
Ala Ser Asn Arg Asp Met Ala Arg Lys Asn Trp Gln Arg Ile Gly
1085 1090 1095
Thr Ile Lys Glu Ala Lys Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Ile Arg
1100 1105 1110
Lys Ile Ala Asp Leu Ala Val Asn Asn Glu Arg Pro Ala Phe Ile
1115 1120 1125
Val Leu Glu Asp Leu Asn Thr Gly Phe Lys Arg Ser Arg Gln Lys
1130 1135 1140
Ile Asp Lys Ser Val Tyr Gln Lys Phe Glu Leu Ala Leu Ala Lys
1145 1150 1155
Lys Leu Asn Phe Leu Val Asp Lys Asn Ala Lys Arg Asp Glu Ile
1160 1165 1170
Gly Ser Pro Thr Lys Ala Leu Gln Leu Thr Pro Pro Val Asn Asn
1175 1180 1185
Tyr Gly Asp Ile Glu Asn Lys Lys Gln Ala Gly Ile Met Leu Tyr
1190 1195 1200
Thr Arg Ala Asn Tyr Thr Ser Gln Thr Asp Pro Ala Thr Gly Trp
1205 1210 1215
Arg Lys Thr Ile Tyr Leu Lys Ala Gly Pro Glu Glu Thr Thr Tyr
1220 1225 1230
Lys Lys Asp Gly Lys Ile Lys Asn Lys Ser Val Lys Asp Gln Ile
1235 1240 1245
Ile Glu Thr Phe Thr Asp Ile Gly Phe Asp Gly Lys Asp Tyr Tyr
1250 1255 1260
Phe Glu Tyr Asp Lys Gly Glu Phe Val Asp Glu Lys Thr Gly Glu
1265 1270 1275
Ile Lys Pro Lys Lys Trp Arg Leu Tyr Ser Gly Glu Asn Gly Lys
1280 1285 1290
Ser Leu Asp Arg Phe Arg Gly Glu Arg Glu Lys Asp Lys Tyr Glu
1295 1300 1305
Trp Lys Ile Asp Lys Ile Asp Ile Val Lys Ile Leu Asp Asp Leu
1310 1315 1320
Phe Val Asn Phe Asp Lys Asn Ile Ser Leu Leu Lys Gln Leu Lys
1325 1330 1335
Glu Gly Val Glu Leu Thr Arg Asn Asn Glu His Gly Thr Gly Glu
1340 1345 1350
Ser Leu Arg Phe Ala Ile Asn Leu Ile Gln Gln Ile Arg Asn Thr
1355 1360 1365
Gly Asn Asn Glu Arg Asp Asn Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Arg
1370 1375 1380
Asp Glu Asn Gly Lys His Phe Asp Ser Arg Glu Tyr Trp Asp Lys
1385 1390 1395
Glu Thr Lys Gly Glu Lys Ile Ser Met Pro Ser Ser Gly Asp Ala
1400 1405 1410
Asn Gly Ala Phe Asn Ile Ala Arg Lys Gly Ile Ile Met Asn Ala
1415 1420 1425
His Ile Leu Ala Asn Ser Asp Ser Lys Asp Leu Ser Leu Phe Val
1430 1435 1440
Ser Asp Glu Glu Trp Asp Leu His Leu Asn Asn Lys Thr Glu Trp
1445 1450 1455
Lys Lys Gln Leu Asn Ile Phe Ser Ser Arg Lys Ala Met Ala Lys
1460 1465 1470
Arg Lys Lys Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys
1475 1480
<210> 16
<211> 1245
<212> PRT
<213> 猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)
<400> 16
Met Lys Thr Gln His Phe Phe Glu Asp Phe Thr Ser Leu Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Ser Lys Thr Ile Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Leu Glu
20 25 30
Asn Ile Lys Lys Asn Gly Leu Ile Arg Arg Asp Glu Gln Arg Leu Asp
35 40 45
Asp Tyr Glu Lys Leu Lys Lys Val Ile Asp Glu Tyr His Glu Asp Phe
50 55 60
Ile Ala Asn Ile Leu Ser Ser Phe Ser Phe Ser Glu Glu Ile Leu Gln
65 70 75 80
Ser Tyr Ile Gln Asn Leu Ser Ile Ser Glu Ala Arg Ala Lys Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Met Arg Asp Thr Leu Ala Lys Ala Phe Ser Glu Asp Glu Arg
100 105 110
Tyr Lys Ser Ile Phe Lys Lys Glu Leu Val Lys Lys Asp Ile Pro Val
115 120 125
Trp Cys Pro Ala Tyr Lys Ser Leu Cys Lys Lys Phe Asp Asn Phe Thr
130 135 140
Thr Ser Leu Val Pro Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Leu Tyr Thr Ser
145 150 155 160
Asn Glu Ile Thr Ala Ser Ile Pro Tyr Arg Ile Val His Val Asn Leu
165 170 175
Pro Lys Phe Ile Gln Asn Ile Glu Ala Leu Cys Glu Leu Gln Lys Lys
180 185 190
Met Gly Ala Asp Leu Tyr Leu Glu Met Met Glu Asn Leu Arg Asn Val
195 200 205
Trp Pro Ser Phe Val Lys Thr Pro Asp Asp Leu Cys Asn Leu Lys Thr
210 215 220
Tyr Asn His Leu Met Val Gln Ser Ser Ile Ser Glu Tyr Asn Arg Phe
225 230 235 240
Val Gly Gly Tyr Ser Thr Glu Asp Gly Thr Lys His Gln Gly Ile Asn
245 250 255
Glu Trp Ile Asn Ile Tyr Arg Gln Arg Asn Lys Glu Met Arg Leu Pro
260 265 270
Gly Leu Val Phe Leu His Lys Gln Ile Leu Ala Lys Val Asp Ser Ser
275 280 285
Ser Phe Ile Ser Asp Thr Leu Glu Asn Asp Asp Gln Val Phe Cys Val
290 295 300
Leu Arg Gln Phe Arg Lys Leu Phe Trp Asn Thr Val Ser Ser Lys Glu
305 310 315 320
Asp Asp Ala Ala Ser Leu Lys Asp Leu Phe Cys Gly Leu Ser Gly Tyr
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Ile Tyr Val Ser Asp Ala His Leu Ala Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Asn Ile Phe Asp Arg Trp Asn Tyr Ile Ser Asp Ala Ile Arg Arg
355 360 365
Lys Thr Glu Val Leu Met Pro Arg Lys Lys Glu Ser Val Glu Arg Tyr
370 375 380
Ala Glu Lys Ile Ser Lys Gln Ile Lys Lys Arg Gln Ser Tyr Ser Leu
385 390 395 400
Ala Glu Leu Asp Asp Leu Leu Ala His Tyr Ser Glu Glu Ser Leu Pro
405 410 415
Ala Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr Phe Thr Ser Leu Gly Gly Gln Lys
420 425 430
Tyr Leu Val Ser Asp Gly Glu Val Ile Leu Tyr Glu Glu Gly Ser Asn
435 440 445
Ile Trp Asp Glu Val Leu Ile Ala Phe Arg Asp Leu Gln Val Ile Leu
450 455 460
Asp Lys Asp Phe Thr Glu Lys Lys Leu Gly Lys Asp Glu Glu Ala Val
465 470 475 480
Ser Val Ile Lys Lys Ala Leu Asp Ser Ala Leu Arg Leu Arg Lys Phe
485 490 495
Phe Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ala Glu Ile Arg Arg Asp Ser Ser
500 505 510
Phe Tyr Ala Leu Tyr Thr Asp Arg Met Asp Lys Leu Lys Gly Leu Leu
515 520 525
Lys Met Tyr Asp Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Tyr Ser
530 535 540
Ile Glu Lys Phe Lys Leu His Phe Asp Asn Pro Ser Leu Leu Ser Gly
545 550 555 560
Trp Asp Lys Asn Lys Glu Leu Asn Asn Leu Ser Val Ile Phe Arg Gln
565 570 575
Asn Gly Tyr Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Thr Pro Lys Gly Lys Asn Leu
580 585 590
Phe Lys Thr Leu Pro Lys Leu Gly Ala Glu Glu Met Phe Tyr Glu Lys
595 600 605
Met Glu Tyr Lys Gln Ile Ala Glu Pro Met Leu Met Leu Pro Lys Val
610 615 620
Phe Phe Pro Lys Lys Thr Lys Pro Ala Phe Ala Pro Asp Gln Ser Val
625 630 635 640
Val Asp Ile Tyr Asn Lys Lys Thr Phe Lys Thr Gly Gln Lys Gly Phe
645 650 655
Asn Lys Lys Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Asp Phe Tyr Lys Glu Ala Leu
660 665 670
Thr Val His Glu Trp Lys Leu Phe Asn Phe Ser Phe Ser Pro Thr Glu
675 680 685
Gln Tyr Arg Asn Ile Gly Glu Phe Phe Asp Glu Val Arg Glu Gln Ala
690 695 700
Tyr Lys Val Ser Met Val Asn Val Pro Ala Ser Tyr Ile Asp Glu Ala
705 710 715 720
Val Glu Asn Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe
725 730 735
Ser Pro Tyr Ser Lys Gly Ile Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys
740 745 750
Ala Leu Phe Ser Glu Gln Asn Gln Ser Arg Val Tyr Lys Leu Cys Gly
755 760 765
Gly Gly Glu Leu Phe Tyr Arg Lys Ala Ser Leu His Met Gln Asp Thr
770 775 780
Thr Val His Pro Lys Gly Ile Ser Ile His Lys Lys Asn Leu Asn Lys
785 790 795 800
Lys Gly Glu Thr Ser Leu Phe Asn Tyr Asp Leu Val Lys Asp Lys Arg
805 810 815
Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Ser Ile Asn Tyr
820 825 830
Lys Asn Lys Lys Ile Thr Asn Val Asn Gln Met Val Arg Asp Tyr Ile
835 840 845
Ala Gln Asn Asp Asp Leu Gln His Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn
850 855 860
Leu Leu Tyr Ile Ser Arg Ile Asp Thr Arg Gly Asn Leu Leu Glu Gln
865 870 875 880
Phe Ser Leu Asn Val Ile Glu Ser Asp Lys Gly Asp Leu Arg Thr Asp
885 890 895
Tyr Gln Lys Ile Leu Gly Asp Arg Glu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Arg
900 905 910
Gln Glu Trp Lys Ser Ile Glu Ser Ile Lys Asp Leu Lys Asp Gly Tyr
915 920 925
Met Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys Asn Met Val Val Glu His Lys
930 935 940
Ala Ile Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Leu Ser Phe Met Lys Gly Arg
945 950 955 960
Lys Lys Val Glu Lys Ser Val Tyr Glu Lys Phe Glu Arg Met Leu Val
965 970 975
Asp Lys Leu Asn Tyr Leu Val Val Asp Lys Lys Asn Leu Ser Asn Glu
980 985 990
Pro Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Tyr Gln Leu Thr Asn Pro Leu Phe Ser
995 1000 1005
Phe Glu Glu Leu His Arg Tyr Pro Gln Ser Gly Ile Leu Phe Phe
1010 1015 1020
Val Asp Pro Trp Asn Thr Ser Leu Thr Asp Pro Ser Thr Gly Phe
1025 1030 1035
Val Asn Leu Leu Gly Arg Ile Asn Tyr Thr Asn Val Gly Asp Ala
1040 1045 1050
Arg Lys Phe Phe Asp Arg Phe Asn Ala Ile Arg Tyr Asp Gly Lys
1055 1060 1065
Gly Asn Ile Leu Phe Asp Leu Asp Leu Ser Arg Phe Asp Val Arg
1070 1075 1080
Val Glu Thr Gln Arg Lys Leu Trp Thr Leu Thr Thr Phe Gly Ser
1085 1090 1095
Arg Ile Ala Lys Ser Lys Lys Ser Gly Lys Trp Met Val Glu Arg
1100 1105 1110
Ile Glu Asn Leu Ser Leu Cys Phe Leu Glu Leu Phe Glu Gln Phe
1115 1120 1125
Asn Ile Gly Tyr Arg Val Glu Lys Asp Leu Lys Lys Ala Ile Leu
1130 1135 1140
Ser Gln Asp Arg Lys Glu Phe Tyr Val Arg Leu Ile Tyr Leu Phe
1145 1150 1155
Asn Leu Met Met Gln Ile Arg Asn Ser Asp Gly Glu Glu Asp Tyr
1160 1165 1170
Ile Leu Ser Pro Ala Leu Asn Glu Lys Asn Leu Gln Phe Asp Ser
1175 1180 1185
Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asp Leu Pro Val Asp Ala Asp Ala Asn
1190 1195 1200
Gly Ala Tyr Asn Val Ala Arg Lys Gly Leu Met Val Val Gln Arg
1205 1210 1215
Ile Lys Arg Gly Asp His Glu Ser Ile His Arg Ile Gly Arg Ala
1220 1225 1230
Gln Trp Leu Arg Tyr Val Gln Glu Gly Ile Val Glu
1235 1240 1245
<210> 17
<211> 1250
<212> PRT
<213> Smithella sp.
<400> 17
Met Gln Thr Leu Phe Glu Asn Phe Thr Asn Gln Tyr Pro Val Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Lys Asp Phe Ile
20 25 30
Glu Gln Lys Gly Leu Leu Lys Lys Asp Glu Asp Arg Ala Glu Lys Tyr
35 40 45
Lys Lys Val Lys Asn Ile Ile Asp Glu Tyr His Lys Asp Phe Ile Glu
50 55 60
Lys Ser Leu Asn Gly Leu Lys Leu Asp Gly Leu Glu Lys Tyr Lys Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Lys Gln Glu Lys Asp Asp Lys Asp Lys Lys Ala Phe Asp
85 90 95
Lys Glu Lys Glu Asn Leu Arg Lys Gln Ile Ala Asn Ala Phe Arg Asn
100 105 110
Asn Glu Lys Phe Lys Thr Leu Phe Ala Lys Glu Leu Ile Lys Asn Asp
115 120 125
Leu Met Ser Phe Ala Cys Glu Glu Asp Lys Lys Asn Val Lys Glu Phe
130 135 140
Glu Ala Phe Thr Thr Tyr Phe Thr Gly Phe His Gln Asn Arg Ala Asn
145 150 155 160
Met Tyr Val Ala Asp Glu Lys Arg Thr Ala Ile Ala Ser Arg Leu Ile
165 170 175
His Glu Asn Leu Pro Lys Phe Ile Asp Asn Ile Lys Ile Phe Glu Lys
180 185 190
Met Lys Lys Glu Ala Pro Glu Leu Leu Ser Pro Phe Asn Gln Thr Leu
195 200 205
Lys Asp Met Lys Asp Val Ile Lys Gly Thr Thr Leu Glu Glu Ile Phe
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Phe Asn Lys Thr Leu Thr Gln Ser Gly Ile Asp Ile
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Val Ile Gly Gly Arg Thr Pro Glu Glu Gly Lys Thr Lys
245 250 255
Ile Lys Gly Leu Asn Glu Tyr Ile Asn Thr Asp Phe Asn Gln Lys Gln
260 265 270
Thr Asp Lys Lys Lys Arg Gln Pro Lys Phe Lys Gln Leu Tyr Lys Gln
275 280 285
Ile Leu Ser Asp Arg Gln Ser Leu Ser Phe Ile Ala Glu Ala Phe Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 3987
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gaaatcatgg acgcggtgga gacaggcaaa ctgtacctct tccagatata caacaaagac 2280
ttcgctaagg ggcaccacgg gaagcccaac cttcatacgc tctactggac gggcctattc 2340
agccccgaaa atctggccaa gacctccatc aagctgaacg gccaagcgga gctgttctac 2400
agacccaaga gccggatgaa gcggatggcc cacaggctcg gcgagaaaat gcttaacaaa 2460
aagttgaagg accagaaaac ccctatcccc gacaccctct accaggaact gtacgactac 2520
gtgaaccaca ggctctcgca cgacctttcc gacgaggccc gtgccctact cccgaacgtc 2580
attaccaaag aggtttcgca cgagatcatc aaggaccggc ggttcacgag cgacaagttt 2640
ttctttcacg tccccatcac ccttaactac caggcggcca actccccatc caagttcaac 2700
cagcgtgtga atgcctacct caaggagcac ccagagaccc cgatcattgg gatcgaccgg 2760
ggcgagcgga acctgatcta catcaccgtc atcgactcga cgggcaagat tcttgagcag 2820
agatcgttga ataccataca gcagttcgac taccagaaga aactcgacaa ccgcgagaag 2880
gagcgcgtgg cggcccgcca ggcgtggtcc gtcgttggga cgattaagga cttgaaacaa 2940
ggttatctgt cccaagtcat ccacgagatc gttgatctga tgatccacta tcaggcagtg 3000
gtggtgctgg agaatctcaa cttcggcttc aagagtaagc ggacgggaat cgccgagaag 3060
gccgtgtacc agcagttcga gaagatgctg atcgacaagc tcaactgcct tgtgctgaaa 3120
gactacccgg ccgagaaggt cggcggcgtc ctcaacccgt accaacttac cgaccagttc 3180
acctccttcg ccaagatggg cactcagtcc gggttcttgt tctacgtccc cgcaccttac 3240
acctctaaga tcgaccctct gactggcttc gtagatccat tcgtgtggaa gaccattaag 3300
aaccacgaga gccgcaagca cttcctggag ggcttcgact tcctgcacta cgacgtgaag 3360
accggggact tcatccttca cttcaagatg aaccggaacc tcagcttcca gcggggcctg 3420
ccggggttca tgcccgcctg ggacatcgtg ttcgagaaga acgagaccca gttcgacgcg 3480
aagggcacgc ccttcatcgc cgggaagcgt atcgtgccgg tgatcgagaa ccatcgtttc 3540
acgggtcgct accgtgacct ctacccggcg aacgagctta tcgcactcct ggaggagaag 3600
ggcatcgtct tccgggacgg ctccaacatc ctcccgaaac tgctggaaaa cgacgactct 3660
cacgccatcg acacgatggt ggccctcatc cggtccgtgc tccaaatgcg gaacagcaac 3720
gccgccaccg gtgaggacta catcaacagc ccggtccggg atctgaacgg ggtgtgcttc 3780
gattcgcggt tccagaatcc tgagtggccg atggacgcgg atgcaaacgg ggcgtaccac 3840
atcgcgctca agggccagtt acttctgaac caccttaagg agtctaaaga tttgaaactc 3900
cagaacggga tctcgaacca ggactggctg gcctacatcc aagagttgcg gaacggcagc 3960
aagaagcggc ggattaagca agattag 3987
<210> 21
<211> 1592
<212> DNA
<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)
<400> 21
actgttaata atttttaaac gtcagcgcac taaaaaaacg aaaagacgga cacgtgaaaa 60
taaaaaacac acactagttt atgacgcaat actattttac ttatgatttg ggtacattag 120
acaaaaccgt gaaagagatg tatcagctat gaaacctgta tacttcaata cagagactta 180
ctcatatcgg atacgtacgc acgaagtatc atattaatta ttttaatttt taataaatat 240
tttatcggat acttatgtga tactctacat atacacaagg atatttctaa gatactttat 300
agatacgtat cctagaaaaa catgaagagt aaaaaagtga gacaatgttg taaaaattca 360
ttataaatgt atatgattca attttagata tgcatcagta taattgattc tcgatgaaac 420
acttaaaatt atatttcttg tggaagaacg tagcgagaga ggtgattcag ttagacaaca 480
ttaaataaaa ttaatgttaa gttcttttaa tgatgtttct ctcaatatca catcatatga 540
aaatgtaata tgatttataa gaaaattttt aaaaaattta ttttaataat cacatgtact 600
attttttaaa aattgtatct tttataataa tacaataata aagagtaatc agtgttaatt 660
tttcttcaaa tataagtttt attataaatc attgttaacg tatcataagt cattaccgta 720
tcgtatctta attttttttt aaaaaccgct aattcacgta cccgtattgt attgtacccg 780
cacctgtatc acaatcgatc ttagttagaa gaattgtctc gaggcggtgc aagacagcat 840
ataatagacg tggactctct tataccaaac gttgtcgtat cacaaagggt taggtaacaa 900
gtcacagttt gtccacgtgt cacgttttaa ttggaagagg tgccgttggc gtaatataac 960
agccaatcga tttttgctat aaaagcaaat caggtaaact aaacttcttc attcttttct 1020
tccccatcgc tacaaaaccg gttcctttgg aaaagagatt cattcaaacc tagcacccaa 1080
ttccgtttca aggtataatc tactttctat tcttcgatta ttttattatt attagctact 1140
atcgtttaat cgatcttttc ttttgatccg tcaaatttaa attcaattag ggttttgttc 1200
ttttctttca tctgattgaa atccttctga attgaaccgt ttacttgatt ttactgttta 1260
ttgtatgatt taatcctttg tttttcaaag acagtcttta gattgtgatt aggggttcat 1320
ataaattttt agatttggat ttttgtattg tatgattcaa aaaatacgtc ctttaattag 1380
attagtacat ggatattttt tacccgattt attgattgtc agggagaatt tgatgagcaa 1440
gtttttttga tgtctgttgt aaattgaatt gattataatt gctgatctgc tgcttccagt 1500
tttcataacc catattcttt taaccttgtt gtacacacaa tgaaaaattg gtgattgatt 1560
catttgtttt tctttgtttt ggattataca gg 1592
<210> 22
<211> 2000
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 22
gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60
tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120
ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180
tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240
ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360
ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420
ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480
aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540
tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720
gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780
accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900
acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960
ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020
ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080
atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140
caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200
gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320
ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380
attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440
atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500
ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560
acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620
atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680
gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740
ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860
ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920
agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980
ctgttgtttg gtgatacttc 2000
<210> 23
<211> 228
<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 23
Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu Arg
20 25 30
Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His Ser
35 40 45
Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val Asn
50 55 60
Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr Arg
65 70 75 80
Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys Ser
85 90 95
Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu Phe
100 105 110
Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His His Ala Asp Pro Arg Asn Arg Gln
115 120 125
Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met Thr
130 135 140
Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asn Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg Leu
165 170 175
Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys Leu
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile Ala
195 200 205
Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp Ala
210 215 220
Thr Gly Leu Lys
225
<210> 24
<211> 199
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 24
Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His
1 5 10 15
Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr
20 25 30
Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met
35 40 45
Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys
50 55 60
Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile
85 90 95
Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala
100 105 110
Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg
115 120 125
Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg
130 135 140
Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His
145 150 155 160
Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn
195
<210> 25
<211> 621
<212> DNA
<213> 海七鳃鳗(Petromyzon marinus)
<400> 25
acagatgcag agtatgtgag aattcacgaa aagctggaca tctatacctt caagaagcag 60
ttctttaaca ataagaagtc tgtgagccat aggtgctacg tgctgttcga gctgaagaga 120
aggggtgaaa gaagggcatg tttttggggg tatgctgtga acaagcccca gtctggaact 180
gagagaggca ttcacgccga aattttcagc atcagaaagg tggaggaata cctgagggat 240
aaccctggac agtttacaat taattggtat tctagctggt ctccatgcgc tgactgtgcc 300
gagaagatcc tggaatggta caaccaggag ctgagaggaa atggccatac cctgaagatt 360
tgggcctgca agctgtacta tgaaaagaac gcaagaaatc agatcggact gtggaacctg 420
agggataatg gtgtggggct gaacgtgatg gtgtccgagc actatcagtg ctgtagaaag 480
attttcattc agtcctcaca taatcagctg aacgagaata gatggctgga aaagactctg 540
aagagggctg agaagagaag gtccgaactg tcaattatga tccaggtgaa gatcctgcac 600
accactaagt cacctgccgt g 621
<210> 26
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Phe Glu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Glu Leu Arg Lys Glu Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Lys Ser Gly Lys Leu Trp Arg His Trp
20 25 30
Cys Gln Asn Asn Arg Thr Gln His Ala Glu Val Tyr Phe Leu Glu Asn
35 40 45
Ile Phe Asn Ala Arg Arg Phe Asn Pro Ser Thr His Cys Ser Ile Thr
50 55 60
Trp Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys Ala Glu Cys Ser Gln Lys Ile Val
65 70 75 80
Asp Phe Leu Lys Glu His Pro Asn Val Leu Glu Ile Tyr Val Ala Arg
85 90 95
Leu Tyr Tyr His Glu Asp Glu Arg Asn Arg Gln Gly Leu Arg Asp Leu
100 105 110
Val Asn Ser Gly Val Thr Ile Arg Ile Met Asp Leu Pro Asp Tyr Asn
115 120 125
Tyr Cys Trp Lys Thr Phe Val Ser Asp Gln Gly Gly Asp Glu Asp Tyr
130 135 140
Trp Pro Gly His Phe Ala Pro Trp Ile Lys Gln Tyr Ser Leu Lys Leu
145 150 155 160
<210> 27
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Thr Asp Ala Glu Tyr Val Arg Ile His Glu Lys Leu Asp Ile Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Lys Lys Gln Phe Ser Asn Asn Lys Lys Ser Val Ser His Arg Cys
20 25 30
Tyr Val Leu Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Arg Arg Ala Cys Phe
35 40 45
Trp Gly Tyr Ala Val Asn Lys Pro Gln Ser Gly Thr Glu Arg Gly Ile
50 55 60
His Ala Glu Ile Phe Ser Ile Arg Lys Val Glu Glu Tyr Leu Arg Asp
65 70 75 80
Asn Pro Gly Gln Phe Thr Ile Asn Trp Tyr Ser Ser Trp Ser Pro Cys
85 90 95
Ala Asp Cys Ala Glu Lys Ile Leu Glu Trp Tyr Asn Gln Glu Leu Arg
100 105 110
Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Val Cys Lys Leu Tyr Tyr Glu
115 120 125
Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn Gly
130 135 140
Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg Lys
145 150 155 160
Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp Leu
165 170 175
Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Arg Arg Ser Glu Leu Ser Ile
180 185 190
Met Phe Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val
195 200 205
<210> 28
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Ser Ser Lys Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu Arg
20 25 30
Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His Ser
35 40 45
Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val Asn
50 55 60
Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr Arg
65 70 75 80
Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys Ser
85 90 95
Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro Asn Val Thr Leu Phe
100 105 110
Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His Leu Ala Asn Pro Arg Asn Arg Gln
115 120 125
Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met Thr
130 135 140
Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp His Asn Phe Val Asn Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asn Glu Ser His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg Leu
165 170 175
Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys Leu
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Ser Gln Leu Thr Ser Phe Thr Ile Ala
195 200 205
Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp Ala
210 215 220
Thr Gly Leu Lys
225
<210> 29
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Ser Phe Glu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Glu Leu Arg Lys Glu Thr Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Lys Ser Gly Lys Leu Trp Arg His
20 25 30
Trp Cys Gln Asn Asn Arg Thr Gln His Ala Glu Val Tyr Phe Leu Glu
35 40 45
Asn Ile Phe Asn Ala Arg Arg Phe Asn Pro Ser Thr His Cys Ser Ile
50 55 60
Thr Trp Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys Ala Glu Cys Ser Gln Lys Ile
65 70 75 80
Val Asp Phe Leu Lys Glu His Pro Asn Val Asn Leu Glu Ile Tyr Val
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Tyr Pro Glu Asn Glu Arg Asn Arg Gln Gly Leu Arg
100 105 110
Asp Leu Val Asn Ser Gly Val Thr Ile Arg Ile Met Asp Leu Pro Asp
115 120 125
Tyr Asn Tyr Cys Trp Lys Thr Phe Val Ser Asp Gln Gly Gly Asp Glu
130 135 140
Asp Tyr Trp Pro Gly His Phe Ala Pro Trp Ile Lys Gln Tyr Ser Leu
145 150 155 160
Lys Leu
<210> 30
<211> 166
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 30
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile
35 40 45
Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 31
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 32
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ser Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 33
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Leu Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Asn Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 34
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Leu Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Asn Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 35
<211> 1763
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
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1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
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<210> 36
<211> 1565
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
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435 440 445
Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser
450 455 460
Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly
465 470 475 480
Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala
485 490 495
Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala
500 505 510
Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp
515 520 525
Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr
530 535 540
Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile
545 550 555 560
Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile
565 570 575
Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg
580 585 590
Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro
595 600 605
His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu
610 615 620
Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile
625 630 635 640
Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn
645 650 655
Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro
660 665 670
Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe
675 680 685
Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val
690 695 700
Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu
705 710 715 720
Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe
725 730 735
Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr
740 745 750
Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys
755 760 765
Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe
770 775 780
Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp
785 790 795 800
Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile
805 810 815
Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg
820 825 830
Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu
835 840 845
Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile
850 855 860
Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu
865 870 875 880
Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp
885 890 895
Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly
900 905 910
Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro
915 920 925
Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu
930 935 940
Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met
945 950 955 960
Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu
965 970 975
Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile
980 985 990
Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu
995 1000 1005
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln
1010 1015 1020
Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
1025 1030 1035
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val
1040 1045 1050
Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro
1055 1060 1065
Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu
1070 1075 1080
Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr
1085 1090 1095
Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe
1100 1105 1110
Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val
1115 1120 1125
Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn
1130 1135 1140
Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
1145 1150 1155
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
1160 1165 1170
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
1175 1180 1185
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser
1190 1195 1200
Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met
1205 1210 1215
Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr
1220 1225 1230
Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr
1235 1240 1245
Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn
1250 1255 1260
Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala
1265 1270 1275
Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys
1280 1285 1290
Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu
1295 1300 1305
Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp
1310 1315 1320
Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr
1325 1330 1335
Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys
1340 1345 1350
Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg
1355 1360 1365
Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly
1370 1375 1380
Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr
1385 1390 1395
Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1400 1405 1410
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys
1415 1420 1425
Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys
1430 1435 1440
Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln
1445 1450 1455
His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe
1460 1465 1470
Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu
1475 1480 1485
Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala
1490 1495 1500
Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro
1505 1510 1515
Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1520 1525 1530
Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser
1535 1540 1545
Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly
1550 1555 1560
Gly Asp
1565
<210> 38
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile
35 40 45
Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly
180 185 190
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp
195 200 205
Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu
210 215 220
Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu
225 230 235 240
Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu
245 250 255
Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu
260 265 270
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala
275 280 285
Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr
305 310 315 320
Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp
325 330 335
Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val
340 345 350
Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
355 360
<210> 39
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Arg Phe Phe Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 40
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn
165
<210> 41
<211> 83
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌噬菌体 AR9
<400> 41
Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val
1 5 10 15
Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile
20 25 30
Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu
35 40 45
Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr
50 55 60
Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Lys Met Leu
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> n是a, c, g或u
<400> 42
nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> n是a, c, g或t
<400> 43
aaannnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> n是a, c, g或t
<400> 44
tttnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 45
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg
1 5 10 15
Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly
20
<210> 46
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
Glu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
50 55 60
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
65 70 75 80
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
100 105 110
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
115 120 125
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
145 150 155 160
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
165 170 175
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
195 200 205
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
210 215 220
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly
<210> 47
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Met Gly Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
20 25 30
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Leu Phe Lys Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu
85 90 95
Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp
180 185 190
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Lys Asp Asn Gly
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Asp Asp Thr
210 215 220
Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser
275
<210> 48
<211> 66
<212> DNA
<213> 贝酵母(Saccharomyces bayanus)
<400> 48
ttcttgtcgt acttatagat cgctacgtta tttcaatttt gaaaatctga gtcctgggag 60
tgcgga 66
<210> 49
<211> 605
<212> PRT
<213> 人
<400> 49
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met
35 40 45
Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile
50 55 60
Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg
65 70 75 80
Asp Leu Leu Ala Trp Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser Val
85 90 95
Asn Phe Lys Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly Ala Lys
100 105 110
Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln Lys Arg
115 120 125
Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Val
130 135 140
Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys Met Ser
145 150 155 160
His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His Gly Asn
165 170 175
Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp Leu Arg
180 185 190
Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu His Leu Lys Lys Pro Gly Gly Phe
195 200 205
Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu
210 215 220
Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu Asp Leu Leu
225 230 235 240
Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu Ser Arg Leu
245 250 255
Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly Ile Tyr Asn
260 265 270
Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu Tyr Arg Glu
275 280 285
Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn Thr Ser Thr
290 295 300
Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Leu Lys Arg
325 330 335
Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro Leu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val Tyr Pro Glu
355 360 365
Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala Leu Leu Ile
370 375 380
Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr Thr Pro Arg
385 390 395 400
Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln Glu Glu Glu
405 410 415
Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe Gln Leu Val
420 425 430
Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe Thr Glu Lys
435 440 445
Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala Ile Val Glu
450 455 460
Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn Pro Val Leu
465 470 475 480
Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Met Glu
485 490 495
Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu Ala Met Asn
500 505 510
Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu Val Tyr Pro
515 520 525
Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys His Asp Asn
530 535 540
Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser Glu Glu Glu
545 550 555 560
Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe Thr Val Pro
565 570 575
Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Lys
580 585 590
Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln Asp
595 600 605
<210> 50
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Trp Leu Cys Met Asp Val Gly
1 5 10 15
Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala Glu
35 40 45
Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr Asp
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His Arg
65 70 75 80
His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Lys
85 90 95
Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile Val
100 105 110
Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu Lys
115 120 125
Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser
130 135 140
Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser Glu
145 150 155 160
Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn Leu
165 170 175
Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val Lys
180 185 190
Lys Thr Thr Trp Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp Ile Gln Lys
195 200 205
Glu Thr Val Tyr Cys Leu Asn Asp Asp Asp Glu Thr Glu Val Leu Lys
210 215 220
Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile Val Pro Phe
225 230 235 240
Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Lys Cys
245 250 255
Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln Arg Arg Phe
260 265 270
Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg Asp Asp Glu
275 280 285
Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu Asp Asp Leu
290 295 300
Asp Ile Trp Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg Ala Asn Pro
305 310 315 320
Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr Glu Cys Leu
325 330 335
Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln Tyr Met Phe
340 345 350
Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu Ala Gln Leu
355 360 365
Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala Lys Lys Asp
370 375 380
Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr Lys Ile Pro
385 390 395 400
Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His Arg Ala Leu
405 410 415
His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile Trp Asn Met
420 425 430
Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile Pro Leu Ser
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Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys Lys Asp Gln
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Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp Gly Pro Thr
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Ala Lys
<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> 嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)
<400> 51
aatttttgga 10
<210> 52
<211> 83
<212> PRT
<213> 嗜热碱甲烷杆菌
<400> 52
Gly Ser Val Ile Asp Val Ser Ser Gln Arg Val Asn Val Gln Arg Pro
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Leu Asp Ala Leu Gly Asn Ser Leu Asn Ser Pro Val Ile Ile Lys Leu
20 25 30
Lys Gly Asp Arg Glu Phe Arg Gly Val Leu Lys Ser Phe Asp Leu His
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Met Asn Leu Val Leu Asn Asp Ala Glu Glu Leu Glu Asp Gly Glu Val
50 55 60
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Ile Ser Pro
<210> 53
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<212> DNA
<213> 噬菌体MS2
<400> 53
gcgcacatga ggatcaccca tgtgc 25
<210> 54
<211> 116
<212> PRT
<213> 噬菌体MS2
<400> 54
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115
<210> 55
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<212> DNA
<213> 噬菌体PP7
<400> 55
ataaggagtt tatatggaaa ccctta 26
<210> 56
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<212> PRT
<213> 噬菌体PP7
<400> 56
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
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<400> 57
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<210> 58
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<212> PRT
<213> 志贺氏菌噬菌体
<400> 58
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<210> 59
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
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1 5 10 15
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<210> 60
<211> 1367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
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Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn
1220 1225 1230
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1235 1240 1245
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1265 1270 1275
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
1280 1285 1290
Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile
1295 1300 1305
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1310 1315 1320
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1355 1360 1365
<210> 61
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 61
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accgacgagt acaaggtgcc atccaagaag ttcaaggtcc tcggcaacac tgaccggcac 120
agcattaaga agaacctgat tggggcgctg ctgttcgatt cgggggagac tgcggaggcg 180
accaggctga agcggactgc gcgccggagg tacaccagga ggaagaatcg gatctgctac 240
ctccaggaga ttttctcgaa tgagatggcc aaggtggacg attccttctt ccatcgcctg 300
gaggagtcgt tcctcgttga ggaggacaag aagcatgaga ggcatcccat tttcgggaat 360
atcgttgacg aggtggctta ccatgagaag tacccgacca tctaccatct gcggaagaag 420
ctcgtcgatt cgaccgataa ggccgacctg cggctgatct acctggccct cgcgcacatg 480
attaagttcc ggggccattt cctcatcgag ggcgacctca acccggacaa ctcggacgtg 540
gataagctct tcattcagct cgtgcagaca tacaaccagc tcttcgagga gaatcccatt 600
aacgcctcgg gggtcgacgc taaggctatt ctctcggctc ggctgtcgaa gtcgcgccgg 660
ctggagaatc tcattgccca gctcccaggc gagaagaaga acggcctctt cggcaacctg 720
attgccctgt cgctggggct cacaccgaat ttcaagtcga acttcgacct cgccgaggac 780
gctaagctcc agctcagcaa ggatacttac gatgatgacc tcgataacct gctcgcccag 840
attggggatc agtacgcgga tctgttcctc gcggccaaga atctcagcga tgctattctc 900
ctgtcggaca ttctccgcgt caacacagag attactaagg ccccactgtc ggcgagcatg 960
attaagaggt acgatgagca tcatcaggac ctgacactgc tcaaggcgct ggtccggcag 1020
cagctccccg agaagtacaa ggagattttc ttcgatcagt caaagaatgg gtacgcgggc 1080
tacattgatg gcggcgcgtc ccaggaggag ttctacaagt tcattaagcc catcctggag 1140
aagatggacg ggaccgagga gctgctggtg aagctcaatc gggaggacct gctccggaag 1200
cagcgcacat tcgacaatgg ctcgattcct caccagattc acctgggcga gctgcacgcc 1260
attctccgca ggcaggagga cttctacccg ttcctcaagg acaaccgcga gaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccggat tccatactac gtggggccgc tcgcgcgggg gaactcccgg 1380
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gtcgacaagg gcgctagtgc gcagtcattc attgagagga tgaccaattt cgataagaac 1500
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aagtacgacg agaacgacaa attgatccgc gaggtcaagg ttattacgct caagagcaaa 2880
cttgtcagcg atttccgcaa ggacttccag ttctacaagg tgagggagat taacaactac 2940
caccatgcac atgatgccta cttgaacgca gtggtgggga ccgcgcttat taaaaagtac 3000
cctaagttgg agtcagagtt cgtttatggg gactacaagg tgtacgacgt ccggaagatg 3060
attgcaaagt ctgaacagga aatcgggaag gccaccgcca aatatttctt ctacagtaac 3120
attatgaatt tttttaagac tgaaattact ctcgcaaacg gcgagatcag gaagcgtccc 3180
ctcatcgaga caaacgggga gaccggggag atagtctggg acaaggggcg ggacttcgct 3240
acggtgagga aggtgctctc gatgccacaa gtgaacatcg tcaaaaagac agaggtgcag 3300
accggtggct tctcaaagga gtcaatcctg ccaaaacgta acagcgacaa gctcatcgcc 3360
cgcaagaaag actgggaccc taagaagtat ggtgggttcg actcaccgac ggtcgcatac 3420
tccgttctgg tcgtggcaaa ggtggaaaag ggcaagtcca aaaaactgaa atccgtgaag 3480
gagttgcttg gcattaccat catggaacgc agcagcttcg agaagaaccc cattgacttc 3540
ctggaggcta aagggtacaa ggaggtcaag aaagatttaa ttattaagct acctaagtac 3600
agcttgttcg agctggagaa cggccgaaaa cgaatgctcg catccgccgg ggaacttcaa 3660
aagggcaacg agcttgcgct gccctccaag tacgtgaact tcctgtactt ggcatcccac 3720
tacgagaaac tcaagggtag cccagaggac aacgagcaga agcagctatt cgtggagcag 3780
cacaagcact acctcgacga gataatcgag cagatcagtg agttcagtaa gcgggtgata 3840
ctcgcggacg ccaacttgga caaggtgctt agtgcctaca acaagcaccg tgacaagccc 3900
atccgagaac aggctgagaa catcatccac cttttcactc tgacaaacct cggtgctccc 3960
gccgccttca aatacttcga cactaccatc gacaggaagc gctacacatc tacgaaggaa 4020
gttcttgacg ctacgcttat tcatcagtct atcacagggc tgtacgagac aaggatcgac 4080
cttagccaac tcggcgggga t 4101
<210> 72
<211> 2391
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 72
gccgcggcga cgcccgaggc ctgcaaaacc ctaaccactc aggttctgcc ggccaccgcc 60
accaccacca ccagtccacc accatgctga cagccactcc cctaccccat cagctcctgg 120
ccaccttcct cctcgtcctg gcgtcggcga cccaacctgc agtccctgcc tccaccgacc 180
gcgcagcgct tctcgccttc cgcgcgtccc tgtcgccgcc ctcccgcgcc gcgctatcct 240
cgtggagcgg cccgctctcg ccatcctggc tcggcgtgtc gctccacccc gccacggcgc 300
cagccccttc ggtcaccact ccctccgttg ccgaactctc gctccggggc ctcaacctca 360
cgggcgtgat ccccgcggcg ccgctcgcgc tcctccgacg tctccggacg ctcgacctct 420
ccgccaacgc gctttcggga gagcttccct gctccctccc gcgctcgctc ctcgcgctcg 480
acctctcccg caacgcgctc tcgggggctg tccccacctg cctgccgtcc tcgctccccg 540
cgctccgcac cctcaacctc tccgccaact tcctccgcct cccgctctcc ccgcgtctct 600
ccttccccgc gcgcctcgct gcccttgatc tctcccgcaa cgccatctcc ggcgccgtcc 660
cgccgcggat cgtcgccgac cccgacaact ccgctctcct cctcctcgac ctctcccaca 720
accgcttctc cggcgagatc cccgccggta tcgcagccgt acggagcctg caggggcttt 780
ttctcgcgga caaccagctt tccggggaca ttcctccggg gatagggaac ctgacctatt 840
tgcaggtgct ggatttgtcg aataaccgat tgtccggttc agtgcctgcc ggacttgcag 900
gctgcttcca gcttctgtac ctgcagcttg ggggtaacca gctctctggg gcactccgtc 960
cggagctcga cgcactagct agtctcaagg ttctagattt gtcgaataac aagatatctg 1020
gggagattcc cctgccgctg gctgggtgca ggtctttgga ggtggtggac ttgtcaggaa 1080
atgagatctc cggtgagctc agcagtgctg tagcgaaatg gctgagcttg aagttcttat 1140
cactggctgg taaccagctc tccggccacc tacctgactg gatgttctcg ttccccctgc 1200
tccagtggct tgatttgtct agtaataagt ttgtgggttt catcccagat ggggggttca 1260
atgtcagtga agtgcttaac ggtggaggtg gtcaggggac tccatcagag agtgtgcttc 1320
caccccaatt gtttgtgtca gcttctgtgg acacggtgtc atggcagttg gatttggggt 1380
atgatgttca ggcaactact ggtatagacc tgtctgggaa tgagctctgt ggggagatac 1440
cagaagggtt ggttgacatg aaggggttgg agtatttgaa cctctcctgt aattacttgg 1500
ctgggcagat ccctgcgggg cttgggggca tggggaggtt gcatacgctt gacttctcac 1560
ataatgggct gtcaggggag gtgcctcctg gaattgcagc catgacagtg cttgaggtgc 1620
ttaacctctc ctacaatagc ctgtctgggc ctttgccaac aacgaagttc ccaggagcat 1680
tagctggaaa cccaggaatt tgcagtggga aagggtgctc tgagaatgca aggactccag 1740
aagggaaaat ggaaggtagc aatcaccgcg gttggcttgg tggctggcat ggagagaatg 1800
gatgggtatc tcttggtgca ttttgtatca gcacaatgac tagcttctat gtatcattag 1860
caaccttact atgctcctct aatgcaagaa acttcgtgtt tcggcctgtg agggttgaat 1920
attaacaaga ggggagattg caaaatcagg ttgttttgaa gttcgagcga ctctggtctg 1980
cagctgatta acaagaaata tgagcatatg agatggatat cttcagccaa gaggaagtgc 2040
tgtctctttt aatgatcaat caagctctct tgattgtttc ctaatattct tgatcttggg 2100
atgtgtagat ctagttctaa tattcctact gttatagaat gcaatcacct gctggtgctt 2160
ggttgtagcc ctggcgtgtt tggaggattg gacaccaagg atgcacataa tttgaagcgc 2220
tggtactgtg aaccacttca gatgtaaata ttttctttgg tttttagttc tgatctagtt 2280
taaaactgga catgtattta gtgttgttga gctacctttc gatgttatat tatgtcaatt 2340
tgctggaaga tcatttgata acaattgtct aatccagtgg attagtcgtg t 2391
<210> 73
<211> 1842
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 73
atgctgacag ccactcccct accccatcag ctcctggcca ccttcctcct cgtcctggcg 60
tcggcgaccc aacctgcagt ccctgcctcc accgaccgcg cagcgcttct cgccttccgc 120
gcgtccctgt cgccgccctc ccgcgccgcg ctatcctcgt ggagcggccc gctctcgcca 180
tcctggctcg gcgtgtcgct ccaccccgcc acggcgccag ccccttcggt caccactccc 240
tccgttgccg aactctcgct ccggggcctc aacctcacgg gcgtgatccc cgcggcgccg 300
ctcgcgctcc tccgacgtct ccggacgctc gacctctccg ccaacgcgct ttcgggagag 360
cttccctgct ccctcccgcg ctcgctcctc gcgctcgacc tctcccgcaa cgcgctctcg 420
ggggctgtcc ccacctgcct gccgtcctcg ctccccgcgc tccgcaccct caacctctcc 480
gccaacttcc tccgcctccc gctctccccg cgtctctcct tccccgcgcg cctcgctgcc 540
cttgatctct cccgcaacgc catctccggc gccgtcccgc cgcggatcgt cgccgacccc 600
gacaactccg ctctcctcct cctcgacctc tcccacaacc gcttctccgg cgagatcccc 660
gccggtatcg cagccgtacg gagcctgcag gggctttttc tcgcggacaa ccagctttcc 720
ggggacattc ctccggggat agggaacctg acctatttgc aggtgctgga tttgtcgaat 780
aaccgattgt ccggttcagt gcctgccgga cttgcaggct gcttccagct tctgtacctg 840
cagcttgggg gtaaccagct ctctggggca ctccgtccgg agctcgacgc actagctagt 900
ctcaaggttc tagatttgtc gaataacaag atatctgggg agattcccct gccgctggct 960
gggtgcaggt ctttggaggt ggtggacttg tcaggaaatg agatctccgg tgagctcagc 1020
agtgctgtag cgaaatggct gagcttgaag ttcttatcac tggctggtaa ccagctctcc 1080
ggccacctac ctgactggat gttctcgttc cccctgctcc agtggcttga tttgtctagt 1140
aataagtttg tgggtttcat cccagatggg gggttcaatg tcagtgaagt gcttaacggt 1200
ggaggtggtc aggggactcc atcagagagt gtgcttccac cccaattgtt tgtgtcagct 1260
tctgtggaca cggtgtcatg gcagttggat ttggggtatg atgttcaggc aactactggt 1320
atagacctgt ctgggaatga gctctgtggg gagataccag aagggttggt tgacatgaag 1380
gggttggagt atttgaacct ctcctgtaat tacttggctg ggcagatccc tgcggggctt 1440
gggggcatgg ggaggttgca tacgcttgac ttctcacata atgggctgtc aggggaggtg 1500
cctcctggaa ttgcagccat gacagtgctt gaggtgctta acctctccta caatagcctg 1560
tctgggcctt tgccaacaac gaagttccca ggagcattag ctggaaaccc aggaatttgc 1620
agtgggaaag ggtgctctga gaatgcaagg actccagaag ggaaaatgga aggtagcaat 1680
caccgcggtt ggcttggtgg ctggcatgga gagaatggat gggtatctct tggtgcattt 1740
tgtatcagca caatgactag cttctatgta tcattagcaa ccttactatg ctcctctaat 1800
gcaagaaact tcgtgtttcg gcctgtgagg gttgaatatt aa 1842
<210> 74
<211> 613
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 74
Met Leu Thr Ala Thr Pro Leu Pro His Gln Leu Leu Ala Thr Phe Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ala Ser Ala Thr Gln Pro Ala Val Pro Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Pro Pro Ser Arg
35 40 45
Ala Ala Leu Ser Ser Trp Ser Gly Pro Leu Ser Pro Ser Trp Leu Gly
50 55 60
Val Ser Leu His Pro Ala Thr Ala Pro Ala Pro Ser Val Thr Thr Pro
65 70 75 80
Ser Val Ala Glu Leu Ser Leu Arg Gly Leu Asn Leu Thr Gly Val Ile
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Leu Ala Leu Leu Arg Arg Leu Arg Thr Leu Asp Leu
100 105 110
Ser Ala Asn Ala Leu Ser Gly Glu Leu Pro Cys Ser Leu Pro Arg Ser
115 120 125
Leu Leu Ala Leu Asp Leu Ser Arg Asn Ala Leu Ser Gly Ala Val Pro
130 135 140
Thr Cys Leu Pro Ser Ser Leu Pro Ala Leu Arg Thr Leu Asn Leu Ser
145 150 155 160
Ala Asn Phe Leu Arg Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Ser Phe Pro Ala
165 170 175
Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu Ser Arg Asn Ala Ile Ser Gly Ala Val
180 185 190
Pro Pro Arg Ile Val Ala Asp Pro Asp Asn Ser Ala Leu Leu Leu Leu
195 200 205
Asp Leu Ser His Asn Arg Phe Ser Gly Glu Ile Pro Ala Gly Ile Ala
210 215 220
Ala Val Arg Ser Leu Gln Gly Leu Phe Leu Ala Asp Asn Gln Leu Ser
225 230 235 240
Gly Asp Ile Pro Pro Gly Ile Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Val Leu
245 250 255
Asp Leu Ser Asn Asn Arg Leu Ser Gly Ser Val Pro Ala Gly Leu Ala
260 265 270
Gly Cys Phe Gln Leu Leu Tyr Leu Gln Leu Gly Gly Asn Gln Leu Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Arg Pro Glu Leu Asp Ala Leu Ala Ser Leu Lys Val Leu
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Asn Lys Ile Ser Gly Glu Ile Pro Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Cys Arg Ser Leu Glu Val Val Asp Leu Ser Gly Asn Glu Ile Ser
325 330 335
Gly Glu Leu Ser Ser Ala Val Ala Lys Trp Leu Ser Leu Lys Phe Leu
340 345 350
Ser Leu Ala Gly Asn Gln Leu Ser Gly His Leu Pro Asp Trp Met Phe
355 360 365
Ser Phe Pro Leu Leu Gln Trp Leu Asp Leu Ser Ser Asn Lys Phe Val
370 375 380
Gly Phe Ile Pro Asp Gly Gly Phe Asn Val Ser Glu Val Leu Asn Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ser Glu Ser Val Leu Pro Pro Gln Leu
405 410 415
Phe Val Ser Ala Ser Val Asp Thr Val Ser Trp Gln Leu Asp Leu Gly
420 425 430
Tyr Asp Val Gln Ala Thr Thr Gly Ile Asp Leu Ser Gly Asn Glu Leu
435 440 445
Cys Gly Glu Ile Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr
450 455 460
Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly Leu
465 470 475 480
Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu
485 490 495
Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr Val Leu Glu Val
500 505 510
Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Ser Gly Pro Leu Pro Thr Thr Lys
515 520 525
Phe Pro Gly Ala Leu Ala Gly Asn Pro Gly Ile Cys Ser Gly Lys Gly
530 535 540
Cys Ser Glu Asn Ala Arg Thr Pro Glu Gly Lys Met Glu Gly Ser Asn
545 550 555 560
His Arg Gly Trp Leu Gly Gly Trp His Gly Glu Asn Gly Trp Val Ser
565 570 575
Leu Gly Ala Phe Cys Ile Ser Thr Met Thr Ser Phe Tyr Val Ser Leu
580 585 590
Ala Thr Leu Leu Cys Ser Ser Asn Ala Arg Asn Phe Val Phe Arg Pro
595 600 605
Val Arg Val Glu Tyr
610
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 75
Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Met Gly Arg
1 5 10
<210> 76
<211> 21
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 76
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Arg Leu His Thr Leu
20
<210> 77
<211> 39
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 77
gctgggcaga tccctgcggg gcttgggggc atggggagg 39
<210> 78
<211> 63
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 78
tgtaattact tggctgggca gatccctgcg gggcttgggg gcatggggag gttgcatacg 60
ctt 63
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 79
cagatccctg cggggcttgg ggg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 80
caacctcccc atgcccccaa gcc 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 81
tgcggggctt gggggcatgg gga 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 82
catgccccca agccccgcag gga 23
<210> 83
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 83
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag atccctgcgg ggcttgggca tggggaggtt gcatacgctt gacttctcac 120
ataatgggct gtcaggggag gtgcctcctg gaattgcagc catgacagtg cttgaggtgc 180
ttaacctctc ctacaatagc ctgt 204
<210> 84
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 84
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag attgcttggg ggcatgggga ggttgcatac gcttgacttc tcacataatg 120
ggctgtcagg ggaggtgcct cctggaattg cagccatgac agtgcttgag gtgcttaacc 180
tctcctacaa tagcctgt 198
<210> 85
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 85
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcgg gcttgggggc atggggaggt tgcatacgct tgacttctca cataatgggc 120
tgtcagggga ggtgcctcct ggaattgcag ccatgacagt gcttgaggtg cttaacctct 180
cctacaatag cctgt 195
<210> 86
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 86
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcgg gcttgggggc atggggaggt tgcatacgct tgacttctca cataatgggc 120
tgtcagggga ggtgcctcct ggaattgcag ccatgacagt gcttgaggtg cttaacctct 180
cctacaatag cctgt 195
<210> 87
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 87
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag agggcttggg ggcatgggga ggttgcatac gcttgacttc tcacataatg 120
ggctgtcagg ggaggtgcct cctggaattg cagccatgac agtgcttgag gtgcttaacc 180
tctcctacaa tagcctgt 198
<210> 88
<211> 202
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 88
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag atccctgcgg ggggggcatg gggaggttgc atacgcttga cttctcacat 120
aatgggctgt caggggaggt gcctcctgga attgcagcca tgacagtgct tgaggtgctt 180
aacctctcct acaatagcct gt 202
<210> 89
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 89
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag aggggcttgg gggcatgggg aggttgcata cgcttgactt ctcacataat 120
gggctgtcag gggaggtgcc tcctggaatt gcagccatga cagtgcttga ggtgcttaac 180
ctctcctaca atagcctgt 199
<210> 90
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 90
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag aggggcttgg gggcatgggg aggttgcata cgcttgactt ctcacataat 120
gggctgtcag gggaggtgcc tcctggaatt gcagccatga cagtgcttga ggtgcttaac 180
ctctcctaca atagcctgt 199
<210> 91
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 91
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag ggcttggggg catggggagg ttgcatacgc ttgacttctc acataatggg 120
ctgtcagggg aggtgcctcc tggaattgca gccatgacag tgcttgaggt gcttaacctc 180
tcctacaata gcctgt 196
<210> 92
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 92
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag atcctgcttg ggggcatggg gaggttgcat acgcttgact tctcacataa 120
tgggctgtca ggggaggtgc ctcctggaat tgcagccatg acagtgcttg aggtgcttaa 180
cctctcctac aatagcctgt 200
<210> 93
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 93
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag atccggcttg ggggcatggg gaggttgcat acgcttgact tctcacataa 120
tgggctgtca ggggaggtgc ctcctggaat tgcagccatg acagtgcttg aggtgcttaa 180
cctctcctac aatagcctgt 200
<210> 94
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 94
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag ggacttgggg gcatggggag gttgcatacg cttgacttct cacataatgg 120
gctgtcaggg gaggtgcctc ctggaattgc agccatgaca gtgcttgagg tgcttaacct 180
ctcctacaat agcctgt 197
<210> 95
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 95
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag gggcttgggg gcatggggag gttgcatacg cttgacttct cacataatgg 120
gctgtcaggg gaggtgcctc ctggaattgc agccatgaca gtgcttgagg tgcttaacct 180
ctcctacaat agcctgt 197
<210> 96
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 96
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcag cggcttgggg gcatggggag gttgcatacg cttgacttct cacataatgg 120
gctgtcaggg gaggtgcctc ctggaattgc agccatgaca gtgcttgagg tgcttaacct 180
ctcctacaat agcctgt 197
<210> 97
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 97
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattactt 60
ggctgggcgg cttgggggca tggggaggtt gcatacgctt gacttctcac ataatgggct 120
gtcaggggag gtgcctcctg gaattgcagc catgacagtg cttgaggtgc ttaacctctc 180
ctacaatagc ctgt 194
<210> 98
<211> 173
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 98
accagaaggg ttggttgaca tgaaggggtt ggagtatttg aacctctcct gtaattacat 60
ggggaggttg catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg 120
aattgcagcc atgacagtgc ttgaggtgct taacctctcc tacaatagcc tgt 173
<210> 99
<211> 1839
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 99
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 117
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatt actgcggggc ttgggggcat 60
ggggaggttg catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg 120
aattgcagcc atgac 135
<210> 118
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 118
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatt gttgcggggc ttgggggcat 60
ggggaggttg catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg 120
aattgcagcc atgac 135
<210> 119
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 119
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatt tgtgcggggc ttgggggcat 60
ggggaggttg catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg 120
aattgcagcc atgac 135
<210> 120
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 120
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatc ctgcttgggg gcatggggag 60
gttgcatacg cttgacttct cacataatgg gctgtcaggg gaggtgcctc ctggaattgc 120
agccatgac 129
<210> 121
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 121
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagcgg cttgggggca tggggaggtt 60
gcatacgctt gacttctcac ataatgggct gtcaggggag gtgcctcctg gaattgcagc 120
catgac 126
<210> 122
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 122
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcggctt gggggcatgg ggaggttgca 60
tacgcttgac ttctcacata atgggctgtc aggggaggtg cctcctggaa ttgcagccat 120
gac 123
<210> 123
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 123
gtatttgaac ctctcctgta attacatggg gaggttgcat acgcttgact tctcacataa 60
tgggctgtca ggggaggtgc ctcctggaat tgcagccatg ac 102
<210> 124
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 124
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatt gcttgggggc atggggaggt 60
tgcatacgct tga 73
<210> 125
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 125
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagagg gcttgggggc atggggaggt 60
tgcatacgct tga 73
<210> 126
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 126
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagagg ggcttggggg catggggagg 60
ttgcatacgc ttgacttctc acataatggg ctgtcagggg aggtgcctcc tggaattgca 120
gccatga 127
<210> 127
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 127
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatc cctgcggggg gggcatgggg 60
aggttgcata cgcttgactt ctcacataat gggctgtcag gggaggtgcc tcctggaatt 120
gcagccatga 130
<210> 128
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 128
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagggc ttgggggcat ggggaggttg 60
catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg aattgcagcc 120
atga 124
<210> 129
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 129
tgtggggaga taccagaagg gttggttgac atgaaggggt tggagtattt gaacctctcc 60
tgtaattact tggctgggca gatccctgcg gggcttgggg gcatggggag gttgcatacg 120
cttgacttct cacataatgg gctgtcaggg gaggtgcctc ctggaatt 168
<210> 130
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(47)
<223> n是a, c, g或t
<400> 130
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagnnn nnnnnnnggc ttgggggcat 60
ggggaggttg catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg 120
aattgcagcc atgac 135
<210> 131
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 131
gtatttgaac ctctcctgta attacttggc tgggcagatc cctgcggggc ttgggggcat 60
ggggaggttg catacgcttg acttctcaca taatgggctg tcaggggagg tgcctcctgg 120
aattgcagcc atgac 135
<210> 132
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(16)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 132
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 133
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 133
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 134
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 134
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu
20 25 30
Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40
<210> 135
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 135
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Phe Ala Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 136
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 136
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Ser Ala Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 137
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 137
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Thr Ala Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 138
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 138
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Val Ala Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 139
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 139
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Cys Ala Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40 45
<210> 140
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 140
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser
20 25 30
Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40
<210> 141
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 141
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Leu Gly Gly
1 5 10 15
Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly
20 25 30
Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40
<210> 142
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 142
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Arg Leu Gly Gly Met
1 5 10 15
Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu
20 25 30
Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr
35 40
<210> 143
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 143
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp
1 5 10 15
Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala
20 25 30
Met Thr
<210> 144
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 144
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Ala Trp Gly
1 5 10 15
His Gly Glu Val Ala Tyr Ala
20
<210> 145
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 145
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Ala Trp Gly
1 5 10 15
His Gly Glu Val Ala Tyr Ala
20
<210> 146
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 146
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Gly Leu Gly
1 5 10 15
Ala Trp Gly Gly Cys Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln
20 25 30
Gly Arg Cys Leu Leu Glu Leu Gln Pro
35 40
<210> 147
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 147
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ala Trp Gly Gly Cys Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys
20 25 30
Gln Gly Arg Cys Leu Leu Glu Leu Gln Pro
35 40
<210> 148
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 148
Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Gly Leu Gly Ala
1 5 10 15
Trp Gly Gly Cys Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln Gly
20 25 30
Arg Cys Leu Leu Glu Leu Gln Pro
35 40
<210> 149
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 149
gggcagatcc ctgcggggct tgggggcatg gggaggt 37
<210> 150
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 150
gggcagattt ctgcggggct tgggggcatg gggaggt 37
<210> 151
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 151
gggcagattt gtgcggggct tgggggcatg gggaggt 37
<210> 152
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 152
gggcagattt ttgcggggct tgggggcatg gggaggt 37
<210> 153
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 153
gggcagggct tgggggcatg gggaggt 27
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 154
Gly Gln Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Met Gly Arg
1 5 10
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 155
Gly Gln Ile Ser Ala Gly Leu Gly Gly Met Gly Arg
1 5 10
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 156
Gly Gln Ile Cys Ala Gly Leu Gly Gly Met Gly Arg
1 5 10
<210> 157
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 157
Gly Gln Ile Phe Ala Gly Leu Gly Gly Met Gly Arg
1 5 10
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 158
Gly Gln Gly Leu Gly Ala Trp Gly Gly
1 5
<210> 159
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 159
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly Leu Gly His Gly Glu
20 25 30
Val Ala Tyr Ala
35
<210> 160
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 160
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Ala Trp Gly His Gly Glu Val Ala
20 25 30
Tyr Ala
<210> 161
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 161
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Arg Ala Trp Gly His Gly Glu Val Ala Tyr
20 25 30
Ala
<210> 162
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 162
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Ala Trp Gly His Gly Glu Val Ala
20 25 30
Tyr Ala
<210> 163
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 163
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly Gly Ala Trp Gly Gly
20 25 30
Cys Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln Gly Arg Cys Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Gln Pro
50
<210> 164
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 164
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Gly Leu Gly Ala Trp Gly Gly Cys
20 25 30
Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln Gly Arg Cys Leu Leu
35 40 45
Glu Leu Gln Pro
50
<210> 165
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 165
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Gly Leu Gly Ala Trp Gly Gly Cys Ile
20 25 30
Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln Gly Arg Cys Leu Leu Glu
35 40 45
Leu Gln Pro
50
<210> 166
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 166
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Leu Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu
20 25 30
His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro
35 40 45
Gly Ile Ala Ala Met Thr Val Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn
50 55 60
Ser Leu
65
<210> 167
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 167
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Arg Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu
20 25 30
His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro
35 40 45
Gly Ile Ala Ala Met Thr Val Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn
50 55 60
Ser Leu
65
<210> 168
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 168
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Gly Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His
20 25 30
Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly
35 40 45
Ile Ala Ala Met Thr Val Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser
50 55 60
Leu
65
<210> 169
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 169
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His
20 25 30
Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly
35 40 45
Ile Ala Ala Met Thr Val Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser
50 55 60
Leu
65
<210> 170
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 170
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Arg Leu Gly Gly Met Gly Arg Leu His Thr
20 25 30
Leu Asp Phe Ser His Asn Gly Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile
35 40 45
Ala Ala Met Thr Val Leu Glu Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser Leu
50 55 60
<210> 171
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 171
Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asn Tyr Met Gly Arg Leu His Thr Leu Asp Phe Ser His Asn Gly
20 25 30
Leu Ser Gly Glu Val Pro Pro Gly Ile Ala Ala Met Thr Val Leu Glu
35 40 45
Val Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Ser Leu
50 55
<210> 172
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
Met Leu Thr Ala Thr Pro Leu Pro His Gln Leu Leu Ala Thr Phe Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ala Ser Ala Thr Gln Pro Ala Val Pro Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Pro Pro Ser Arg
35 40 45
Ala Ala Leu Ser Ser Trp Ser Gly Pro Leu Ser Pro Ser Trp Leu Gly
50 55 60
Val Ser Leu His Pro Ala Thr Ala Pro Ala Pro Ser Val Thr Thr Pro
65 70 75 80
Ser Val Ala Glu Leu Ser Leu Arg Gly Leu Asn Leu Thr Gly Val Ile
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Leu Ala Leu Leu Arg Arg Leu Arg Thr Leu Asp Leu
100 105 110
Ser Ala Asn Ala Leu Ser Gly Glu Leu Pro Cys Ser Leu Pro Arg Ser
115 120 125
Leu Leu Ala Leu Asp Leu Ser Arg Asn Ala Leu Ser Gly Ala Val Pro
130 135 140
Thr Cys Leu Pro Ser Ser Leu Pro Ala Leu Arg Thr Leu Asn Leu Ser
145 150 155 160
Ala Asn Phe Leu Arg Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Ser Phe Pro Ala
165 170 175
Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu Ser Arg Asn Ala Ile Ser Gly Ala Val
180 185 190
Pro Pro Arg Ile Val Ala Asp Pro Asp Asn Ser Ala Leu Leu Leu Leu
195 200 205
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<223> 合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 185
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Gly Asp Ile Pro Pro Gly Ile Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Val Leu
245 250 255
Asp Leu Ser Asn Asn Arg Leu Ser Gly Ser Val Pro Ala Gly Leu Ala
260 265 270
Gly Cys Phe Gln Leu Leu Tyr Leu Gln Leu Gly Gly Asn Gln Leu Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Arg Pro Glu Leu Asp Ala Leu Ala Ser Leu Lys Val Leu
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Asn Lys Ile Ser Gly Glu Ile Pro Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Cys Arg Ser Leu Glu Val Val Asp Leu Ser Gly Asn Glu Ile Ser
325 330 335
Gly Glu Leu Ser Ser Ala Val Ala Lys Trp Leu Ser Leu Lys Phe Leu
340 345 350
Ser Leu Ala Gly Asn Gln Leu Ser Gly His Leu Pro Asp Trp Met Phe
355 360 365
Ser Phe Pro Leu Leu Gln Trp Leu Asp Leu Ser Ser Asn Lys Phe Val
370 375 380
Gly Phe Ile Pro Asp Gly Gly Phe Asn Val Ser Glu Val Leu Asn Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ser Glu Ser Val Leu Pro Pro Gln Leu
405 410 415
Phe Val Ser Ala Ser Val Asp Thr Val Ser Trp Gln Leu Asp Leu Gly
420 425 430
Tyr Asp Val Gln Ala Thr Thr Gly Ile Asp Leu Ser Gly Asn Glu Leu
435 440 445
Cys Gly Glu Ile Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr
450 455 460
Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Ile Pro Ala Gly Gly
465 470 475 480
Ala Trp Gly Gly Cys Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln
485 490 495
Gly Arg Cys Leu Leu Glu Leu Gln Pro
500 505
<210> 186
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 186
Met Leu Thr Ala Thr Pro Leu Pro His Gln Leu Leu Ala Thr Phe Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ala Ser Ala Thr Gln Pro Ala Val Pro Ala Ser Thr Asp
20 25 30
Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Pro Pro Ser Arg
35 40 45
Ala Ala Leu Ser Ser Trp Ser Gly Pro Leu Ser Pro Ser Trp Leu Gly
50 55 60
Val Ser Leu His Pro Ala Thr Ala Pro Ala Pro Ser Val Thr Thr Pro
65 70 75 80
Ser Val Ala Glu Leu Ser Leu Arg Gly Leu Asn Leu Thr Gly Val Ile
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Leu Ala Leu Leu Arg Arg Leu Arg Thr Leu Asp Leu
100 105 110
Ser Ala Asn Ala Leu Ser Gly Glu Leu Pro Cys Ser Leu Pro Arg Ser
115 120 125
Leu Leu Ala Leu Asp Leu Ser Arg Asn Ala Leu Ser Gly Ala Val Pro
130 135 140
Thr Cys Leu Pro Ser Ser Leu Pro Ala Leu Arg Thr Leu Asn Leu Ser
145 150 155 160
Ala Asn Phe Leu Arg Leu Pro Leu Ser Pro Arg Leu Ser Phe Pro Ala
165 170 175
Arg Leu Ala Ala Leu Asp Leu Ser Arg Asn Ala Ile Ser Gly Ala Val
180 185 190
Pro Pro Arg Ile Val Ala Asp Pro Asp Asn Ser Ala Leu Leu Leu Leu
195 200 205
Asp Leu Ser His Asn Arg Phe Ser Gly Glu Ile Pro Ala Gly Ile Ala
210 215 220
Ala Val Arg Ser Leu Gln Gly Leu Phe Leu Ala Asp Asn Gln Leu Ser
225 230 235 240
Gly Asp Ile Pro Pro Gly Ile Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Gln Val Leu
245 250 255
Asp Leu Ser Asn Asn Arg Leu Ser Gly Ser Val Pro Ala Gly Leu Ala
260 265 270
Gly Cys Phe Gln Leu Leu Tyr Leu Gln Leu Gly Gly Asn Gln Leu Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Arg Pro Glu Leu Asp Ala Leu Ala Ser Leu Lys Val Leu
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Asn Lys Ile Ser Gly Glu Ile Pro Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Cys Arg Ser Leu Glu Val Val Asp Leu Ser Gly Asn Glu Ile Ser
325 330 335
Gly Glu Leu Ser Ser Ala Val Ala Lys Trp Leu Ser Leu Lys Phe Leu
340 345 350
Ser Leu Ala Gly Asn Gln Leu Ser Gly His Leu Pro Asp Trp Met Phe
355 360 365
Ser Phe Pro Leu Leu Gln Trp Leu Asp Leu Ser Ser Asn Lys Phe Val
370 375 380
Gly Phe Ile Pro Asp Gly Gly Phe Asn Val Ser Glu Val Leu Asn Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gln Gly Thr Pro Ser Glu Ser Val Leu Pro Pro Gln Leu
405 410 415
Phe Val Ser Ala Ser Val Asp Thr Val Ser Trp Gln Leu Asp Leu Gly
420 425 430
Tyr Asp Val Gln Ala Thr Thr Gly Ile Asp Leu Ser Gly Asn Glu Leu
435 440 445
Cys Gly Glu Ile Pro Glu Gly Leu Val Asp Met Lys Gly Leu Glu Tyr
450 455 460
Leu Asn Leu Ser Cys Asn Tyr Leu Ala Gly Gln Gly Leu Gly Ala Trp
465 470 475 480
Gly Gly Cys Ile Arg Leu Thr Ser His Ile Met Gly Cys Gln Gly Arg
485 490 495
Cys Leu Leu Glu Leu Gln Pro
500

Claims (74)

1.一种植物或其植物部分，其在编码FEA2蛋白的内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中包含至少一个非天然突变。
2.根据权利要求1所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。
3.根据权利要求1或2所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是碱基取代、缺失和/或插入。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变包括向A、T、G或C的碱基取代。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是至少一个碱基对的缺失，任选地约1个碱基对至约50个连续碱基对的缺失。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是至少一个碱基对的插入。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变导致相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号而言位于位置475、476、477、478和/或479处的一个或多个被取代的氨基酸残基，任选地其中所述至少一个非天然突变是SEQ ID NO:74的位置477处的碱基取代。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的植物或其部分，其中所述FEA2蛋白包含与SEQ IDNO:74具有至少95％序列同一性的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的植物或其部分，其中所述内源FACIATED EAR2(FEA2)基因包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73具有至少90％序列同一性的序列。
10.根据前述权利要求中任一项上述的植物或其部分，其中所述植物是玉米。
11.根据权利要求10所述的植物或其部分，其中包含所述至少一个非天然突变的所述玉米植物具有增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。
12.一种包含编辑系统的植物细胞，所述编辑系统包括：
(a)CRISPR-Cas效应蛋白；和
(b)引导核酸，其包含与编码FEA2蛋白的内源靶基因具有互补性的间隔子序列。
13.根据权利要求12所述的植物细胞，其中所述内源靶基因包含与SEQ ID NO：72或SEQID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
14.根据权利要求12或13所述的植物细胞，其中所述内源靶基因编码FEA2蛋白，所述FEA2蛋白包含与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的植物细胞，其中所述引导核酸包含SEQ ID NO:79-82的核苷酸序列中任一个所示的序列。
16.根据权利要求12-14中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞是玉米细胞。
17.由权利要求1-11中任一项所述的植物部分或权利要求12-16中任一项所述的植物细胞再生的植物。
18.根据权利要求17所述的植物，其中所述植物是玉米植物，并且包含增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。
19.一种玉米植物细胞，其包含FEA2基因内的至少一个非天然突变，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与FEA2基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。
20.根据权利要求19所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变是显性负等位基因、半显性等位基因或弱的功能损失等位基因。
21.根据权利要求20所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点在FEA2基因的区域内，所述区域包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
22.根据权利要求20所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点在FEA2基因的区域内，所述区域编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述编辑系统还包含核酸酶，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点，并且FEA2基因内的所述至少一个非天然突变在被所述核酸酶切割之后进行。
24.根据权利要求23所述的玉米植物细胞，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如Fok1)或CRISPR-Cas效应物蛋白。
25.根据权利要求19-24中任一项是的玉米植物细胞，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute或CRISPR-Cas效应物核酸结合结构域。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述FEA2基因内的所述至少一个非天然突变是插入和/或缺失。
27.根据权利要求19-25中任一项的玉米植物细胞，其中所述FEA2基因内的所述至少一个非天然突变包括点突变。
28.根据权利要求19-27中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变导致相对于SEQ ID NO：74的氨基酸位置编号而言位于位置475、476、477、478或479处的一个或多个被修饰的氨基酸残基，任选地，其中所述至少一个非天然突变包含SEQ ID NO：74的位置477处的修饰的氨基酸残基。
29.由权利要求19-28中任一项的植物细胞再生的玉米植物，其包含所述FEA2基因内的所述至少一个非天然突变。
30.根据权利要求29所述的玉米植物，其中与不包含含有所述至少一个非天然突变的FEA2基因的对照植物相比，所述玉米植物包含增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。
31.一种产生/培育无转基因的编辑过的玉米植物的方法，其包括：
将权利要求1-11、17、18、29或30中任一项所述的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入无转基因的所述玉米植物中；
选择包含所述至少一个非天然突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的编辑过的玉米植物。
32.一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植株的方法，所述方法包括在生长区域中种植权利要求1-11、17、18、29或30中任一项所述的两个或更多个植物，从而提供与不包含所述至少一个非天然突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。
33.一种在玉米FEA2蛋白的区域中产生变异的方法，所述方法包括：
将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码玉米FEA2蛋白的所述区域的玉米FEA2基因的区域中，其中所述玉米FEA2蛋白的所述区域包含SEQ ID NO:75或SEQID NO:76的氨基酸序列，或者所述玉米FEA2蛋白的所述区域由SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列编码；以及
使玉米FEA2基因的区域与编辑系统接触，从而将突变引入玉米FEA2蛋白的区域并在FEA2蛋白的所述区域中产生变异。
34.一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割所述玉米植物细胞中的内源FEA2基因内的靶位点，所述内源FEA2基因包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，从而在所述玉米植物细胞的内源FEA2基因中产生编辑，以及产生包含在所述内源FEA2基因中的所述编辑的玉米植物细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述靶位点包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中还包括从在所述内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物细胞再生玉米植物，以产生在其内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述编辑导致非自然突变。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中在其内源FEA2基因中包含所述编辑的所述玉米植物具有增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，其中所述内源FEA2基因编码FEA2蛋白，并且所述编辑导致相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号而言位于475、476、477、478或479位的氨基酸残基的变化。
40.一种用于制造玉米植物的方法，其包括：
(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞的群体与连接到核酸结合结构域的核酸酶接触(例如编辑系统)，其结合与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列或与编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列具有至少90％序列同一性的序列；
(b)从野生型内源FEA2基因已经突变的群体中选择玉米植物细胞。从而产生在内源FEA2基因中包含至少一个突变的玉米植物细胞；和
(c)将所选的玉米植物细胞生长成玉米植物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述至少一个突变是显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。
42.一种用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其中包括：
(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞与靶向野生型内源FEA2基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合所述野生型内源FEA2基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如编辑系统)连接，其中所述野生型内源FEA2基因：
(i)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列％序列同一性的序列；
(ii)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
(iii)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或
(iv)编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列，以产生在所述野生型内源FEA2基因中包含突变的玉米植物细胞；和
(b)将所述玉米植物细胞生长成在所述野生型内源FEA2基因中包含所述突变的玉米植物，由此生产具有突变的内源性FEA2基因和增加的穗行数的玉米植物，任选地没有实质性减少穗长度。
43.生产包含具有突变的内源FEA2基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，所述方法包括：
使所述玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因中的靶位点与包含切割结构域和DNA结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源FEA2基因中的靶位点，
其中所述内源FEA2基因：
(a)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
(c)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或
(d)编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
从而产生包含在所述内源FEA2基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
44.生产包含突变的内源FEA2基因并表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分的方法，所述方法包括：
使所述玉米植物或植物部分中的内源FEA2基因中的靶位点与包含切割结构域和DNA结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源FEA2基因中的靶位点，
其中所述内源FEA2基因：
(a)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
(c)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或
(d)编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
从而产生包含具有突变的内源FEA2基因、并且表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分，任选地其中穗长度没有实质性减少。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述核酸酶切割所述内源FEA2基因，从而将所述突变引入所述内源FEA2基因。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中所述突变是非天然突变。
47.根据权利要求40-46中任一项所述的方法，其中所述突变是显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述突变是取代、插入和/或缺失。
49.根据权利要求40-48中任一项的方法，其中所述突变包括点突变。
50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述突变是一个碱基对到约50个碱基对的缺失。
51.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中所述突变位于相对于SEQ ID NO：74的氨基酸位置编号而言475、476、477、478或479位的一个或多个氨基酸残基中。
52.根据权利要求40-51中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、核酸内切酶或CRISPR-Cas效应物蛋白。
53.根据权利要求40-52中任一项所述的方法，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute或CRISPR-Cas效应物DNA结合结构域。
54.一种与FEA2基因中的靶位点结合的引导核酸，所述靶位点包含SEQ ID NO：77或SEQID NO：78的核苷酸序列或者编码SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列的核苷酸序列。
55.根据权利要求54所述的引导核酸，其中所述引导核酸包含间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:79-82的核苷酸序列中的任一个。
56.一种系统，其包含权利要求54或权利要求55所述的引导核酸和与所述引导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白。
57.根据权利要求56所述的系统，其还包含与所述引导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸和所述引导核酸是共价连接的。
58.一种基因编辑系统，其包含与引导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述引导核酸包含结合内源FEA2基因的间隔子序列。
59.根据权利要求58所述的基因编辑系统，其中所述FEA2基因：
(a)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
(c)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或
(d)编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
60.根据权利要求58或59所述的基因编辑系统，其中所述引导核酸包含间隔子序列，所述间隔子序列包含SEQ ID NO:79-82的核苷酸序列中的任一个。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的基因编辑系统，其还包含与所述引导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸和所述引导核酸是共价连接的。
62.一种复合物，其包含引导核酸和包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述引导核酸结合内源FEA2基因中的靶位点，其中所述内源FEA2基因:
(a)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
(c)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；和/或
(d)编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
其中所述切割结构域切割所述FEA2基因中的靶标链。
63.一种表达盒，其包含(a)编码包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸和(b)与内源FEA2基因中的靶位点结合的引导核酸，其中所述引导核酸包含与下述互补并与之结合的间隔子序列：
(i)编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的核酸的部分；
(ii)包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列的部分；
(iii)包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列的部分；和/或
(iv)与编码SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列的序列具有至少90％序列同一性的序列。
64.编码玉米FEA2蛋白的显性负突变、半显性突变或弱的功能缺失突变的核酸。
65.根据权利要求64所述的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO:83-113中任一个的序列。
66.根据权利要求64所述的核酸，其中所述核酸编码SEQ ID NO：159-186中任一个的氨基酸序列。
67.根据权利要求64所述的核酸，其中所述核酸的一部分包含SEQ ID NO:114-128中任一个的多核苷酸。
68.根据权利要求64所述的核酸，其中所述核酸的一部分编码SEQ ID NO:134-148中任一个的多肽。
69.修饰的玉米FEA2蛋白，其中包含在相对于SEQ ID NO：74的氨基酸位置编号而言位置475、476、477、478或479处的一个或多个氨基酸残基中的突变。
70.修饰的玉米FEA2蛋白，其包含SEQ ID NO:134-148中任一个的氨基酸序列。
71.玉米植物或其部分，其包含权利要求64-68中任一项所述的核酸，或者权利要求69或70所述的修饰的玉米FEA2蛋白。
72.一种在植物中的内源性FEA2基因中产生突变的方法，其包括：
(a)将基因编辑系统靶向编码对应于SEQ ID NO：72的位置475-480的氨基酸的FEA2基因的部分，和
(b)选择相对于SEQ ID NO：74的氨基酸位置编号而言在位置475-480之一处包含氨基酸残基的取代的植物，任选地，其中所述取代位于相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号而言位置477处的氨基酸残基处。
73.一种玉米植物或其植物部分，其在具有Zm00001d051012的基因标识号(基因ID)的至少一个内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中包含至少一个非天然突变。
74.一种引导核酸，其结合具有Zm00001d051012的基因标识号(基因ID)的FACIATEDEAR2(FEA2)基因中的靶核酸。
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