JP2000050874A - Ｎａ＋−ＡＴＰアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Na⁺-ATPアーゼ遺伝子の提供 【解決手段】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質を
コードする遺伝子。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なく
とも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつNa⁺-ATPアーゼ活性を有する
タンパク質

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Na⁺-ATPアーゼ、
該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換え
ベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質
転換体を用いるNa ⁺-ATPアーゼの製造方法、該遺伝子を
含むトランスジェニック植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞膜は、原核細胞や真核細胞など全て
の細胞において、脂質二重層と呼ばれる切れ目のない厚
さ4〜5nmの脂質分子の二重層にタンパク質が非共有結合
的に埋め込まれた共通の構造を有している。そして、膜
を構成するタンパク質には、特定の分子の細胞内外への
輸送に関与するものや、膜で進行する反応を触媒する膜
結合性の酵素などがある。

【０００３】一般的に、脂質二重層は、内部が疎水性で
あるため、電荷をもっている上に水和度が高いイオンや
極性分子にとっては非常に通りにくい壁となっている。
なかでもNa⁺は、人工脂質二重を用いた実験において、
他のイオン(例えば、K⁺、Cl⁺など)よりも透過性が低
く、例えば水分子の透過性と比べると約1/10⁹の透過性
しかないことが知られている。

【０００４】しかし、細胞膜は、これらのイオンにも透
過性を示す。細胞膜においてそのような透過性を担って
いるのが、膜輸送タンパク質である。例えば、Na⁺-ATP
アーゼは、P-Typeと呼ばれるATPアーゼの一群に属し、N
a⁺/K⁺-ATPアーゼとともに細胞内Na⁺イオンの排出機構と
して働いていることが推定されている。ところで、現在
までに、動物由来のH⁺/K⁺-ATPアーゼ遺伝子、Ca²⁺-ATP
アーゼ遺伝子、酵母由来のCa²⁺-ATPアーゼ遺伝子、H⁺-A
TPアーゼ遺伝子、Na⁺-ATPアーゼ遺伝子、細菌由来のMg
²⁺-ATPアーゼ遺伝子、植物由来のH⁺-ATPアーゼ遺伝子、
Ca²⁺-ATPアーゼ遺伝子などP-TypeのATPアーゼをコード
する遺伝子が種々の生物からクローニングされている。

【０００５】しかし、植物においてはNa⁺輸送系のATPア
ーゼは報告が無く、その遺伝子の塩基配列も報告されて
いない。細胞質内に進入したNa⁺イオンを除去する仕組
みとしては、Na⁺/H⁺-アンチポーターという別の輸送系
の存在が知られているが、この遺伝子の塩基配列もまだ
知られていない。一方、過剰なNa⁺イオンの存在は、細
胞とって有害であり、生体に生育阻害を引き起こす。従
って、Na⁺イオンを除去するためのタンパク質を植物体
で発現させることにより、耐塩性の作物を作出できる可
能性がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、P-TypeのAT
Pアーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有
する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換
体、該形質転換体を用いるNa⁺-ATPアーゼの製造方法、
該遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供すること
を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、単細胞遊泳性の
藻類ヘテロシグマ・アカシヲ(Heterosigma akashiwo)の
cDNAライブラリーから、新規なNa⁺-ATPアーゼ遺伝子を
単離することに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
組換えタンパク質である。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なく
とも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつNa⁺-ATPアーゼ活性を有する
タンパク質 さらに、本発明は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコ
ードするNa⁺-ATPアーゼ遺伝子である。

【０００９】(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なく
とも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつNa⁺-ATPアーゼ活性を有する
タンパク質 さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝
子である。

【００１０】(c) 配列番号１で表される塩基配列からな
るDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNAとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNa⁺-AT
Pアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA さらに、本発明は、上記の遺伝子を含有する組換えベク
ターである。

【００１１】さらに、本発明は、上記の組換えベクター
を含む形質転換体である。さらに、本発明は、上記の形
質転換体を培地に培養し、得られる培養物からNa ⁺-ATP
アーゼを採取することを特徴とするNa⁺-ATPアーゼの製
造方法である。さらに、本発明は、上記の遺伝子を含む
トランスジェニック植物である。以下、本発明を詳細に
説明する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明者らは、公知のP-TypeのAT
Pアーゼ間で、よく保存されているアミノ酸配列から、
それらに対応するcDNA配列を類推した。そしてその類推
配列をもとに、配列番号５及び配列番号６に記載の配列
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。次
いで、この合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、
ヘテロシグマ・アカシヲ由来のcDNAを鋳型としてPCR反
応を行い、得られたPCR産物の各DNAの塩基配列を決定
し、ATPアーゼをコードすると推定されるPCR断片を得
た。得られた断片の部分配列に基づきPCRプライマーを
合成し、cDNAを鋳型として、5'RACE及び3'RACEを行うこ
とにより、本発明のNa⁺-ATPアーゼタンパク質をコード
する全長遺伝子をクローニングした。

【００１３】本発明の遺伝子は、以下のようにしてクロ
ーニングすることができる。 １．ヘテロシグマ属に属する藻類の培養 本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子の採取源となる生物とし
て、ヘテロシグマ属に属する藻類、例えば、ヘテロシグ
マ・アカシヲ(Heterosigma akashiwo)などが挙げられ
る。ヘテロシグマ・アカシヲは、湾港部河口付近など汽
水性のつよい水域から沖合にいたるまでの広い範囲に生
息する単細胞遊泳性の藻類で、細胞は、前端が円頭で後
端に向かって細くなる楕円形に近い形態を有する。細胞
全体は偏平であり、肩の部分から腹面にかけて斜めに走
る溝状部から亜等長の２本の鞭毛がでている。

【００１４】本発明に用いられるヘテロシグマ・アカシ
ヲは、海水中に発生した赤潮から分離したり、国立環境
研究所から購入することにより、入手することができ
る。そして、改変ASP-7培地等の培地中で、光照射下、1
5〜25℃で約８時間〜約１ヶ月間培養することにより増
殖させることができる。 ２．Na⁺-ATPアーゼ遺伝子のクローニング (1) cDNAの作製及びPCRによるNa⁺-ATPアーゼ遺伝子の
クローニング 上記１．において得られた藻類からmRNAを調製する。mR
NAの調製は、通常行われる手法により行うことができ
る。例えば、上記藻類を、グアジニン試薬、フェノール
試薬等で処理して全RNAを得た後、オリゴdT-セルロース
やセファロース2Bを担体とするポリU-セファロース等を
用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によ
りポリ(A)⁺RNA(mRNA)を得ることができる。ここで、mRN
Aの精製には、市販のmRNA精製キット(例えば、mRNA Pur
ification Kit(Pharmacia 社製)など)を用いることもで
きる。

【００１５】このようにして得られたmRNAを鋳型とし
て、市販のキット(例えば、cDNA合成モジュール(Amersh
am社製)など)を用い、オリゴdTプライマー及び逆転写酵
素により、一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから
二本鎖cDNAを合成することにより、本発明の遺伝子をク
ローニングするためのcDNAを得ることができる。上記の
ようにして得られるcDNAを用いて目的のDNAを単離する
方法としては、例えば、公知のP-TypeのATPアーゼ遺伝
子間で良く保存されたアミノ酸配列に対応する縮重セン
スプライマーを合成し、これを用いて縮重ポリメラーゼ
連鎖反応(縮重PCRともいう)を行い、次いで得られた目
的遺伝子の部分配列に基づきプライマーを合成し、該プ
ライマーを用いて5'RACE及び3'RACEを行うことにより、
本発明の遺伝子を取得する方法等が挙げられる。ここで
RACE(rapid amplificationof cDNA ends)とは、cDNAの
塩基配列が部分的にわかっている場合に、その既知領域
の塩基配列情報を基にPCRを行って、cDNA末端までの未
知領域をクローニングする方法である。未知領域が上流
(5'側)の場合を5'RACE、下流(3'側)の場合を3'RACEとい
う。例えば5'RACEの場合、既知の塩基配列を基にアンチ
センスプライマー(GSP1)を合成し、GSP1をプライマーと
した逆転写反応を行う。次いで、cDNAと２本鎖を作って
いるmRNAをRNaseHで分解すると、１本鎖の第１鎖cDNAが
得られる。この第１鎖cDNAは、5'末端にGSP1の配列を有
する一方3'末端は未知の配列で終っている。従ってこの
未知配列をPCRで増幅するために該3'末端にアンカー配
列を付加する。アンカー配列を付加後、該アンカー配列
に相補的なヌクレオチドプライマーと配列のわかってい
る部分領域に特異的なアンチセンスプライマーを用いて
PCRを行うことにより、5'上流の未知領域を含むcDNAを
増幅することができる。

【００１６】縮重PCRに用いられる鋳型DNAとしては、前
記cDNA以外にもゲノムDNAも挙げられる。また、縮重プ
ライマーとしては、例えばセンス鎖については、Cys Se
r Asp Lys Thr Gly Thr (配列番号３）に基づいて合成
した5' -TG(T/C)TCIGA(T/C)AA(A/G)ACIGGIAC-3'（配列
番号５）を、アンチセンス鎖についてはThr Gly Asp Gl
y Val Asn Asp(配列番号４)に基づいて合成した5'-TC(G
/A)TTIACICC(G/A)TCICCIGT -3' (配列番号６)を用いる
ことができる。但し、本発明においてはこれらのプライ
マーに限定されるものではない。 (2) 塩基配列の決定 5'RACE及び3'RACEにより得られたDNA断片について塩基
配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバ
ートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことが
できるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-E
LMER社製373A DNAシークエンサー等）を用いて配列決定
が行われる。

【００１７】配列番号１に本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝
子の塩基配列を、配列番号２に本発明のNa⁺-ATPアーゼ
タンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸
配列からなるタンパク質がNa⁺-ATPアーゼ活性を有する
限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミ
ノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例え
ば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１
個、好ましくは１〜50個程度、さらに好ましくは1〜20
個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号２で表
わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１
〜50個程度、さらに好ましくは１〜20個のアミノ酸が付
加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ
酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜50個程度、さ
らに好ましくは１〜20個のアミノ酸が他のアミノ酸に置
換してもよい。

【００１８】また、上記遺伝子とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズすることができるDNAも本発明の
遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例え
ば、ナトリウム濃度が15〜750mM、好ましくは15〜100mM
であり、温度が37〜65℃、好ましくは60℃での条件をい
う。なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や G
apped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法に
より、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異
導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-
G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のL
A PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて
行うことができる。

【００１９】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定され
ると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNA
ないしゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該
塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダ
イズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることがで
きる。 ３．組換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。

【００２０】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322, pBR325,pUC118, pUC119, pUC
18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB11
0,pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp2
4, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλフ
ァージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワ
クシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイル
スなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

【００２１】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮
されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
等が挙げられる。

【００２２】(2) 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
DNAを発現できるものであれば特に限定されるものでは
ない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシ
ェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtili
s)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomon
as putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロ
ティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細
菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharom
ycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizo
saccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、C
HO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9、Sf21等
の昆虫細胞が挙げられる。

【００２３】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草
菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus su
btilis)MI 114、207-21などが挙げられる。

【００２４】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中
で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例え
ばtrpプロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモータ
ー、P_Rプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来す
るプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどの
ように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いて
もよい。

【００２５】細菌への組換えベクターの導入方法として
は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定される
ものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[C
ohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 6
9：2110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げら
れる。酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス
・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカ
ロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒ
ア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。
この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるも
のであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、
gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモ
ーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプ
ロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1
プロモーター等が挙げられる。

【００２６】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et
al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェ
ロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh,
H.：J. Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。

【００２７】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用い
られる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プ
ロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用
いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子
プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベ
クターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。

【００２８】昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、S
f21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクタ
ーの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リ
ポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用
いられる。 ４．本発明のNa⁺-ATPアーゼタンパク質の生産 本発明のタンパク質は、本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子
によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または
該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前
記変異が導入されたアミノ酸配列を有するものである。
なお、本発明のタンパク質をNa⁺-ATPアーゼタンパク質
ともいう。

【００２９】本発明のNa⁺-ATPアーゼタンパク質は、前
記形質転換体を培養し、その培養物から採取することに
より得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あ
るいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体
の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形
質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通
常の方法に従って行われる。

【００３０】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転
換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、
天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、スクロース、デン
プン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エ
タノール、プロパノール等のアルコール類が用いられ
る。

【００３１】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ
ム等が用いられる。

【００３２】培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養
などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間
中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有
機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応
じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培
地に添加してもよい。

【００３３】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地
に添加してもよい。

【００３４】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO₂存
在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。

【００３５】培養後、本発明のNa⁺-ATPアーゼタンパク
質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は
細胞を破砕することによりNa⁺-ATPアーゼタンパク質を
抽出する。また、本発明のNa⁺-ATPアーゼタンパク質が
菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をその
まま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去
する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般
的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜
組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発
明のNa⁺-ATPアーゼタンパク質を単離精製することがで
きる。

【００３６】５．本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子を導入
した耐塩性植物の作製 (1) 植物導入用組換えベクターの作製及びアグロバクテ
リウムの形質転換 植物導入用組換えベクターは、前記１．で得られた遺伝
子を、そのまま又は所望により適当な制限酵素で消化
し、あるいは、適切なリンカーを連結して構築すること
ができる。DNAを挿入するためのベクターとして、pBI10
1、pBI121、pGA482等のバイナリーベクターやpLGV23Ne
o、pNCAT、pMON200などの中間ベクターが挙げられる。

【００３７】アグロバクテリウムのバイナリーベクター
系を用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列
(LB,RB)間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクタ
ーを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベク
ターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA440
4、EHA101、C58C1Rif^R等に、凍結融解法、エレクトロポ
レーション法等により導入し、これを植物への形質導入
用に用いる。

【００３８】植物体内で、外来遺伝子などを発現させる
ためには、構造遺伝子の前後に、それぞれ植物用のプロ
モーターとターミネーターを配置させる必要がある。本
発明で利用可能なプロモーターとしては、例えばカリフ
ラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の35S転写物[Jeffer
son, R.A. et al.: The EMBO J 6:3901-3907(1987)]、
トウモロコシのユビキチン[Christensen, A.H. et al.:
Plant Mol. Biol.18:675-689(1992)]、ノパリン合成酵
素(NOS)遺伝子、オクトピン(OCT)合成酵素遺伝子、イネ
のアクチン(Act1)遺伝子等のプロモーターが挙げられ、
ターミネーター配列としては、例えばカリフラワーモザ
イクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のター
ミネーター等が挙げられる。但し、植物体内で機能する
ことが知られているプロモーターやターミネーターであ
れば、これらのものに限定されない。

【００３９】また、必要に応じてプロモーター配列と本
発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子との間に、遺伝子の発現を
増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロ
コシのアルコールデヒドロゲナーゼ(Adh1)のイントロン
[Genes＆ Development 1:1183-1200(1987)]を導入する
ことができる。さらに、効率的に目的の形質転換細胞を
選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を併用して
もよい。その際に使用する選択マーカーとしては、抗生
物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与する
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(htp)遺伝
子、ビアラホス(bialaphos)に対する抵抗性を付与する
ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(bar)
遺伝子、ブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与する
ブラストサイジンＳデアミナーゼ(BSD)遺伝子などが挙
げられる。本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子及び選択マー
カー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良
いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組
換えDNAを用いてもよい。

【００４０】(2) 植物宿主への本発明のNa⁺-ATPアーゼ
遺伝子の導入 本発明において、植物宿主とは、植物培養細胞、栽培植
物の植物体、植物の器官(例えば葉、花弁、茎、根、根
茎、種子等)、又は組織(例えば表皮、師部、柔組織、木
部、維管束等)のいずれをも意味するものである。ここ
で植物宿主としては、イネ、ムギ、タバコ、トマト、シ
ロイヌナズナなど様々な植物が挙げられる。

【００４１】本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子による植物
宿主の形質転換は、該Na⁺-ATPアーゼ遺伝子を含むベク
ターをアグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パ
ーティクルガン法、又はポリエチレングリコール法など
で植物宿主に導入することにより行うことができる。あ
るいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導
入して形質転換することもできる。

【００４２】パーティクルガン法による直接遺伝子導入
は、選択マーカー遺伝子を含むベクターとNa⁺-ATPアー
ゼ遺伝子を含むベクターとを混合して、同時に植物の細
胞に撃ち込むコトランスフォーメーション(co-transfor
mation)法により行うことができる。形質転換の結果得
られるシュート、毛状根などは、細胞培養、組織培養又
は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られ
ている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモ
ンの投与などにより植物体に再生させることができる。

【００４３】本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子が導入され
た植物は、選択マーカーによるスクリーニング、又はNa
⁺-ATPアーゼ遺伝子若しくはその発現産物の解析によ
り、Na⁺-ATPアーゼ遺伝子を保持する形質転換細胞を選
択することが可能である。得られた植物体は、土壌又は
バーミキュライトを詰めたポットで栽培し、株分けす
る。このようにして得られたNa⁺-ATPアーゼ遺伝子導入
植物も、本発明の範囲に含まれる。本発明によるNa⁺-AT
Pアーゼ遺伝子導入植物は、Na⁺-ATPアーゼの働きにより
塩ストレスに耐性が付与された性質を有するものであ
る。ここで塩ストレスとは、植物の生育を抑制し得る程
度の量のNa⁺イオンの存在により、植物の生育に負の影
響を与えるストレスをいう。

【００４４】(3) 本発明の遺伝子の植物組織での発現部
位の分析 得られた形質転換植物及びその次世代に目的とするNa⁺-
ATPアーゼ遺伝子が組み込まれていることの確認は、こ
れらの細胞及び組織から常法に従ってDNAを抽出し、公
知のPCR法又はサザン分析を用いて導入した遺伝子を検
出することにより行うことができる。

【００４５】また、本発明のNa⁺-ATPアーゼ遺伝子の植
物組織内での発現部位は、例えば各組織におけるmRNAの
発現又はタンパク質の発現を解析することにより確認す
ることができる。具体的には、本発明のNa⁺-ATPアーゼ
遺伝子の発現の確認方法として、RT-PCR、ノーザン分析
等が挙げられ、Na⁺-ATPアーゼの発現の確認方法とし
て、Na⁺-ATPアーゼに対する抗体を用いたウエスタン分
析等が挙げられる。

【００４６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例１〕ヘテロシグマ・アカシヲの培養 ヘテロシグマ・アカシヲOHE-1株は、国立環境研究所か
ら購入した。この細胞を、300 mlの三角フラスコ中の15
0 mlの改変ASP-7培地(培地１リットル当り：NaCl 25g、
MgSO₄・7H₂O 9g、KCl 0.7g、CaCl₂・2H₂O 0.3g、NaNO₃ 50
mg、 NaH₂PO₄・2H₂O 20mg、Na₂SiO₃・9H₂O 10mg、ビタミ
ンB₁₂ 1μg、 Tris 1g、NTA 70mg、H₃BO₃ 34mg、Na₂EDTA
・2H₂O 30mg、FeCl₃・6H₂O 1.9mg、MnCl₂・4H₂O 1.0mg、Co
SO₄・7H₂O0.028mg、ZnSO₄・7H₂O 1.4mg、pH 8.0)に、細胞
密度が1 x 10³ 細胞／mlになるように播種し、連続光照
射下（52−78μmol photone ／m² ・s）、20±1℃で10日
間培養した。最終細胞密度は3 x 10⁵ 細胞／mlから5 x
10⁵ 細胞／mlとなった。得られた1.5 x 10⁹の細胞を、5
0 mlのチューブ４本に分割して、650×g、4℃、8分間の
遠心で回収し、ペレットを液体窒素で急速凍結し、−70
℃に保存した。

【００４７】〔実施例２〕ヘテロシグマ・アカシヲ Na⁺
-ATPアーゼcDNAのクローニング (1) ヘテロシグマ・アカシヲ mRNAの調整 実施例１により得られたヘテロシグマ・アカシヲから、
SDS／フェノール法によってmRNAを調製した。すなわ
ち、実施例１において調製した細胞を含むチューブ４本
にそれぞれ、抽出バッファー(0.2 M Tris-Cl (pH 9.
0)、 1 M NaCl、 0.1M EDTA、２％SDS、0.1％β-メルカ
プトエタノール)５ml、フェノール溶液(フェノール500
gを温浴して、2.5 gヒドロキシキノリン、300 ml滅菌蒸
留水、50 ml1M Tris-Cl (pH 8.0)を混合して作ったも
の)５mlを加え、ポリトロン(Kinematica社製)を用い、
最高速度で、３分間、氷冷下で破砕した。次いで、各々
のチューブに10 mlクロロホルム／イソアミルアルコー
ル(24:1)を加え１分撹拌、卓上遠心機（スイングタイ
プ）3000 rpm、30分遠心分離した。水相を回収し、そこ
にまた10 mlのフェノール液を加え、10分間撹拌、続け
て10 mlクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、
１分間撹拌後、3000 rpm、15分遠心分離した。水相を取
り、フェノール、クロロホルムの処理をさらに２回繰り
返した。水相を回収し、等容量のクロロホルム／イソア
ミルアルコールを加え、１分間撹拌し、遠心3000 rpm、
15分。水相に1/4体積の10 M LiClを加え-20℃で一晩放
置した。

【００４８】14000 rpm、20分、4℃で遠心分離後、ペレ
ットに400 μl TEを加えて１本にまとめた。100 mlの10
M LiCl を加え、14000 rpm、20分、4℃で遠心分離する
ことにより、ペレット得た。このリチウム沈殿をさらに
２回繰り返した後、ペレットをTEに懸濁することにより
全RNAを得た。吸光度測定法により得られたRNA量を測定
したところ、1.84 mgであった。

【００４９】次いで、得られた全RNAからmRNA Purifica
tion Kit(Pharmacia社製)を用いて、mRNAを調製した。
すなわち、0.92mgの全RNAを、1.0mlの溶出バッファーに
溶解し、65℃で５分間加熱後、氷中で急冷した。これ
に、0.2mlのサンプルバッファーを加え、既に高塩バッ
ファーで平衡化しておいたオリゴdTセルロースカラムに
通し、次いで、溶出用バッファーを加えてポリ(A)⁺RNA
(mRNA)を溶出・精製した。RNAの量をUV分光器により測定
したところ、mRNAは27μgであった。

【００５０】(2) cDNAの合成 上記(1)により得られたmRNAを鋳型として、cDNA合成モ
ジュール(Amersham社製)を用いて二本鎖cDNAの合成を行
った。すなわち、まず以下の組成で一本鎖cDNAを合成し
た。

【００５１】 ポリ(A+)RNA ５μl(2.0μg) ５×第１鎖合成反応用溶液(250mM Tris-HCl(pH 8.3) ８μl 250mM KCl,50mM MgCl₂) 80mMピロリン酸ナトリウム溶液 ２μl 20単位/μlヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター ２μl 10×dNTPミックス(10mM各dATP,dGTP,dTTP,dCTP) ４μl 0.5μg/mlオリゴ(ｄT)_12-18 ２μl 滅菌水 15μl 全量 38μl

【００５２】上記溶液に、逆転写酵素２μl(100単位；S
TRATAGENE社製)を添加して、室温で42℃で60分間インキ
ュベートすることにより１本鎖cDNAを合成した。

【００５３】次に、得られた１本鎖cDNAの反応液に、以
下の試薬を順に加えた。 １本鎖cDNA反応液 40 μl 第２鎖合成用溶液 80 μl 大腸菌RNase H 2μl 大腸菌DNAポリメラーゼI 13.2μl 滅菌水 65 μl 全量 200.2μl

【００５４】上記反応液を、12℃で60分間、次いで22℃
で60分間インキュベートし、その後70℃で10分間の酵素
失活処理を行うことにより２本鎖cDNAを合成した。Poly
A⁺ RNA 5 μgからcDNA約４μgが合成できた。

【００５５】(3) P-TypeのATPアーゼの保存的アミノ酸
配列に特異的な縮重プライマーの作製 P-TypeのATPアーゼ間でよく保存されているアミノ酸配
列をもとに、縮重プライマーを合成した。すなわち、
５'縮重センスプライマー配列として、Cys Ser Asp Lys
Thr Gly Thr(配列番号３）に基づいてP1プライマー5'-
TG(T/C)TCIGA(T/C)AA(A/G)ACIGGIAC-3'(配列番号５)
を、３'縮重アンチセンスプライマーとして、Thr Gly A
sp Gly Val Asn Asp (配列番号４)に基づいてＡＢプラ
イマー5'-TC(G/A)TTIACICC(G/A)TCICCIGT-3'(配列番号
６)を合成した。なお、合成オリゴヌクレオチドは、全
自動DNA合成機(ABI社製)を使用して化学合成した。

【００５６】(4) 縮重プライマーを用いたRT-PCR 上記(2)で得られたcDNAを鋳型として、上記(3)で作製し
た縮重プライマーを用いてPCRを行った。PCRの反応液の
組成は以下の通りである。

【００５７】 cDNA溶液 0.5μl(80ng) 滅菌水 38μl PCR用緩衝液(500mM KCl、100mMTris-HCl(pH8.3) 5μl 15ｍM MgCl₂、0.1％(w/v)ゼラチン) 20mM dNTPミックス 4μl 20μM P1プライマー(センス) 1μl 20μM ABプライマー(アンチセンス) 1μl 10U/μl Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer社製) 0.5μl 全量 50μl

【００５８】上記反応液をよく混合後、ミネラルオイル
を25μl重層した。PCRは、94℃で１分間の熱変性、53又
は55℃で２分間のアニーリング、72℃で３分間の伸長反
応の条件を１サイクルとして、40サイクル行った。反応
終了後、TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA)50μl、
クロロホルム100μlを加え混合し、室温、12,000×gで
３分間遠心し、上層を新しいマイクロチューブに回収し
た。回収量を増すため、残ったクロロホルム層にTEを50
μl添加し混合後、同条件で遠心分離を行った。それぞ
れの水層画分約150μlに、10μgのグリコーゲン、15μl
の３M酢酸ナトリウム、及び400μlのエタノールを加
え、よく混合後、４℃、12,000×gで20分間遠心しPCR産
物をペレット化した。このPCR産物を1.0％アガロースゲ
ル電気泳動に供試し、1200bp付近の大きさのPCR産物を
ゲルがら切り出した。このゲル断片を新しいマイクロチ
ューブに移し細かく潰した後、PCR産物をゲルから抽出
した。得られた抽出物を、室温、12,000×gで10分間遠
心後、上清を新しいマイクロチューブに回収した。沈殿
を200μlの抽出液で洗浄し、先の上清を合せた。この上
清をフェノール処理後、エタノール沈殿し、PCR産物を
得た。

【００５９】次いで、このPCR産物を、TAベクター (Inv
itrogen社製)のクローニング部位に連結し、この組換え
プラスミドを大腸菌JM109株に形質転換した。単一コロ
ニーをLB培地中で培養し、プラスミドを精製しシークエ
ンスコアキット(ABI社製)を用い、蛍光自動DNAシーケン
サー(ABI社製、377型)により解析した。塩基配列を決定
したいくつかのPCR産物の中から、ATPアーゼと推定され
る1239bpのPCR産物(配列番号７)を得た。

【００６０】(5) 5'RACE法及び3'RACE法を用いたNa⁺-AT
Pアーゼ遺伝子の全長領域のクローニング 本発明の遺伝子の全長配列をクローニングするために、
上記(4)において得られたPCR産物に基づいて、5'RACE及
び3'RACE用のプライマーを合成した。5'RACE用のプライ
マーとして5'-TTCAGCTCCCAGCCGGGCACCG-3'(配列番号８)
を、3'RACE用のプライマーとしては5'-CAAGGCGGAGGTGGT
GCTGGGC-3'(配列番号９)を合成した。

【００６１】500 ngの二本鎖cDNAに50 pmolのTaKaRa Ec
oR Iアダプターをライゲーションした後にリン酸化を行
い、スピンカラムで余剰のアダプターを除去した後、Ta
KaRaLA PCR in vitro Cloningキットに付属のEcoR I Ca
ssetteのライゲーションを行った。反応終了後、エタノ
ール沈殿によりcDNAを回収し、10μlの滅菌蒸留水に溶
解させたものをその後のPCRの鋳型として用いた。

【００６２】次いで、上記のプライマーと鋳型DNAを用
い、TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit(TAKARA社製)
により、5'RACE及び3'RACEを行った。PCRの反応の組成
は以下の通りである。 cDNA溶液 0.5μl(25ng) 10×LA PCR緩衝液II(TAKARA社製) 2.5μl 20mM dNTPミックス ４μl 10 pmol/μl 5'RACE用プライマー又は3'RACE用プライマー １μl 10 pmol/μl CassetteプライマーC2 １μl ５U/μl TaKaRa LA Taq(TAKARA社製) 0.25μl 滅菌水 15.75μl 全量 25μl

【００６３】反応条件は、95℃（１分）を1サイクル、9
5℃（30秒）、67℃（２分）、72℃（2分）を30サイクル
行った。5'RACEで増幅されてきた2200 bp及び3'RACEで
増幅されてきた3000 bpの増幅された断片をTAベクター
にサブクローニングし、定法に従いダイデオキシ法によ
り塩基配列を決定した。その結果、得られたヘテロシグ
マ・アカシヲ Na⁺-ATPアーゼ cDNAのオープンリーディ
ングフレームは3990 bp、アミノ酸残基1330から成る推
定分子量146,308のタンパク質をコードしていることが
明らかとなった。

【００６４】

【発明の効果】本発明により、Na⁺-ATPアーゼ、該酵素
をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体
を用いるNa⁺-ATPアーゼの製造方法、該遺伝子を含むト
ランスジェニック植物が提供される。本発明の遺伝子
は、耐塩性植物の作出に有用である。

【００６５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nobuyoshi Maeno, Director General, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries <120> Na⁺-ATPase gene <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4467 <212> DNA <213> Heterosigma akashiwo <220> <221> CDS <222> (82)..(4071) <400> 1 tgccggagac tttcattcca gtgagaaact ggtgacaggc ctgattgaga caactttctc 60 aaagaaggcc gtcccattgc g atg ggg cta atg aaa aag aaa gcc ggc ggc 111 Met Gly Leu Met Lys Lys Lys Ala Gly Gly 1 5 10 gac tcg aac agt cgc cgg gtt gac gac ttg aaa aag aat gtc gtg atg 159 Asp Ser Asn Ser Arg Arg Val Asp Asp Leu Lys Lys Asn Val Val Met 15 20 25 act gaa cac aag gag gag tgg gag gag ctt ttc gcc aag ctg ggg tcc 207 Thr Glu His Lys Glu Glu Trp Glu Glu Leu Phe Ala Lys Leu Gly Ser 30 35 40 agc gtt gag ggc ctg agc cag gaa gag gcg cag aag cgc aac cgt gaa 255 Ser Val Glu Gly Leu Ser Gln Glu Glu Ala Gln Lys Arg Asn Arg Glu 45 50 55 ttt ggt gac gac cgc ctg acg ccg cct ccc acc acg ccc aag tgg gtc 303 Phe Gly Asp Asp Arg Leu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Lys Trp Val 60 65 70 aag ttc ctg aag gag atg acg ggc ttc ttc tcg ctg ctg ctc tgg ggc 351 Lys Phe Leu Lys Glu Met Thr Gly Phe Phe Ser Leu Leu Leu Trp Gly 75 80 85 90 gga ggc atc ctc tgc ttc att cgc tac ggt cta cgc aag gag gtg gac 399 Gly Gly Ile Leu Cys Phe Ile Arg Tyr Gly Leu Arg Lys Glu Val Asp 95 100 105 aac atg tac ctg ggc att gtg ctc ttc gcg gtg gtc ttc gtg acg ggc 447 Asn Met Tyr Leu Gly Ile Val Leu Phe Ala Val Val Phe Val Thr Gly 110 115 120 tgc ttc agc ttt ttc cag aac agc aag agc gag aac ctg atg aag agt 495 Cys Phe Ser Phe Phe Gln Asn Ser Lys Ser Glu Asn Leu Met Lys Ser 125 130 135 ttc gag aag ctg ctg ccg ccc tcg atc aac gcc aag cgc aat ggc gag 543 Phe Glu Lys Leu Leu Pro Pro Ser Ile Asn Ala Lys Arg Asn Gly Glu 140 145 150 ttc atc aag gtg ccc tcg gag aag ctg gtc aag ggc gac gtg atc cgg 591 Phe Ile Lys Val Pro Ser Glu Lys Leu Val Lys Gly Asp Val Ile Arg 155 160 165 170 ctg gag ggc ggc gag ctg gtg ccc tgc gac gtg cgc atc atc acc tgc 639 Leu Glu Gly Gly Glu Leu Val Pro Cys Asp Val Arg Ile Ile Thr Cys 175 180 185 acg gac aac tgc gtg gtg gac aac gcc tcg ctc acg ggg gag gcc gag 687 Thr Asp Asn Cys Val Val Asp Asn Ala Ser Leu Thr Gly Glu Ala Glu 190 195 200 ccc cag aag cgc aag aac gag gcc acg cac gat gag ccg ctg gaa acg 735 Pro Gln Lys Arg Lys Asn Glu Ala Thr His Asp Glu Pro Leu Glu Thr 205 210 215 gcg aac ctg gcc ttc ttc ggc acg aac gtg ccc gag ggc tcc ctg gag 783 Ala Asn Leu Ala Phe Phe Gly Thr Asn Val Pro Glu Gly Ser Leu Glu 220 225 230 ggt gtg gtg gtg aac atc ggc gac gac acc gtc atg ggc cgc att gcc 831 Gly Val Val Val Asn Ile Gly Asp Asp Thr Val Met Gly Arg Ile Ala 235 240 245 250 tcg ctc acc ctg cag gtg ggc gcc cag cag acc ccg atc aac aag gag 879 Ser Leu Thr Leu Gln Val Gly Ala Gln Gln Thr Pro Ile Asn Lys Glu 255 260 265 atc cac cac ttc atc ctg atc atc tcc tcc atc gcc atc ttc ctg ggc 927 Ile His His Phe Ile Leu Ile Ile Ser Ser Ile Ala Ile Phe Leu Gly 270 275 280 gtg acc ttc ttc atc atc ggg ctg gcg ctg ggc acg gag ctg atc gag 975 Val Thr Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ala Leu Gly Thr Glu Leu Ile Glu 285 290 295 aat ctg gtc ttc ctg atc tcc atc atc gtc gcc aac gtg ccc gag ggc 1023 Asn Leu Val Phe Leu Ile Ser Ile Ile Val Ala Asn Val Pro Glu Gly 300 305 310 ctg ctg gcc acg gtg acg gtg tgc ctg acg ctg acc gcg cgc cgc atg 1071 Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu Thr Leu Thr Ala Arg Arg Met 315 320 325 330 cac tcg aag atg gtg ctg gtg aag aac ctg gag ggc gtg gag acg ctg 1119 His Ser Lys Met Val Leu Val Lys Asn Leu Glu Gly Val Glu Thr Leu 335 340 345 ggg tcc acc tcg tgc atc tgc tcg gac aag acg ggc acg gtc acg cag 1167 Gly Ser Thr Ser Cys Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Val Thr Gln 350 355 360 aac atc atg acc gtg gct cag atc gtg tac ggc aac caa gac gcc gtg 1215 Asn Ile Met Thr Val Ala Gln Ile Val Tyr Gly Asn Gln Asp Ala Val 365 370 375 cac atc cag gac aca ggc tcc tcg ctg agc cac ggg ctg aag acg tac 1263 His Ile Gln Asp Thr Gly Ser Ser Leu Ser His Gly Leu Lys Thr Tyr 380 385 390 aac ccg gag aac gcc gcc ttc cag tcg ctg ctg cgg tgc gcc atg ctg 1311 Asn Pro Glu Asn Ala Ala Phe Gln Ser Leu Leu Arg Cys Ala Met Leu 395 400 405 410 aac aac acc tcc acc ttt ggg aag tac cgc ctg gac gag aac ggg gac 1359 Asn Asn Thr Ser Thr Phe Gly Lys Tyr Arg Leu Asp Glu Asn Gly Asp 415 420 425 ccc acg gac gag ctg ctg ccg ttc aag gcg gag gtg gtg cag ggc gac 1407 Pro Thr Asp Glu Leu Leu Pro Phe Lys Ala Glu Val Val Gln Gly Asp 430 435 440 ggc agc gtg atc gag cag gtg atg tgg cgc gtg aac ggc aac gcc tcc 1455 Gly Ser Val Ile Glu Gln Val Met Trp Arg Val Asn Gly Asn Ala Ser 445 450 455 gag gcg gcc atg atc aag ttc gcg cag aac cac gag gac gtg gac gac 1503 Glu Ala Ala Met Ile Lys Phe Ala Gln Asn His Glu Asp Val Asp Asp 460 465 470 ttc cgc aaa cgt aac ccg atg gtg ttc cag atc cca ttc aac tcg cgc 1551 Phe Arg Lys Arg Asn Pro Met Val Phe Gln Ile Pro Phe Asn Ser Arg 475 480 485 490 aac aag tac caa gtg cac gta cac tgc cag gag aag ttc aac cag gag 1599 Asn Lys Tyr Gln Val His Val His Cys Gln Glu Lys Phe Asn Gln Glu 495 500 505 gac ggc acg aac tcc ggc ccg cgc gtg gtg ctg atg aag ggc gcc ccc 1647 Asp Gly Thr Asn Ser Gly Pro Arg Val Val Leu Met Lys Gly Ala Pro 510 515 520 gag cgc gtg ctg gcc cgc tgc tcg cag gcc aag ctg ggc ggc aac att 1695 Glu Arg Val Leu Ala Arg Cys Ser Gln Ala Lys Leu Gly Gly Asn Ile 525 530 535 gtg ccc atg acc ccg gag ctg atg gcc gag att gag cgg ctg cag gtg 1743 Val Pro Met Thr Pro Glu Leu Met Ala Glu Ile Glu Arg Leu Gln Val 540 545 550 cag atg tcc gcc aac ggc ctc cgc gtg ctg ggg ttc gcc gag cgc gag 1791 Gln Met Ser Ala Asn Gly Leu Arg Val Leu Gly Phe Ala Glu Arg Glu 555 560 565 570 ctg ccc aag acc aag ttc ccc gcg gac tac aag tac cac gac ggc agc 1839 Leu Pro Lys Thr Lys Phe Pro Ala Asp Tyr Lys Tyr His Asp Gly Ser 575 580 585 gag gag gac aag agc acg ccc aac ttc ccg ctg ggc gag ttc gcg atg 1887 Glu Glu Asp Lys Ser Thr Pro Asn Phe Pro Leu Gly Glu Phe Ala Met 590 595 600 gag gcc gag cgc gag aag aac ccg ccc aag ctg ccc gtg cac gac gcg 1935 Glu Ala Glu Arg Glu Lys Asn Pro Pro Lys Leu Pro Val His Asp Ala 605 610 615 tcc atg cag ggc ctg atc ttc atc ggg ctg atg gcc ctg atc gac ccc 1983 Ser Met Gln Gly Leu Ile Phe Ile Gly Leu Met Ala Leu Ile Asp Pro 620 625 630 ccg cgg ccg gcg gtg ccc ggc gcc gtg gag aag tgc aag acg gcc ggc 2031 Pro Arg Pro Ala Val Pro Gly Ala Val Glu Lys Cys Lys Thr Ala Gly 635 640 645 650 gtg aag gtg atc atg gtc acg ggc gac cac ccg gtg acg gcg cag gcc 2079 Val Lys Val Ile Met Val Thr Gly Asp His Pro Val Thr Ala Gln Ala 655 660 665 atc gcg cag aag gtg ggc atc ctc tgg tcc aag acg cgc gcg gag gcg 2127 Ile Ala Gln Lys Val Gly Ile Leu Trp Ser Lys Thr Arg Ala Glu Ala 670 675 680 atg gcg cac aac gag gcc tac cag ctg aac ccg ggg gac gcc ggc ttt 2175 Met Ala His Asn Glu Ala Tyr Gln Leu Asn Pro Gly Asp Ala Gly Phe 685 690 695 gag gac ccg gag gag tgc aag gcc att gcg gtg ccc ggc tgg gag ctg 2223 Glu Asp Pro Glu Glu Cys Lys Ala Ile Ala Val Pro Gly Trp Glu Leu 700 705 710 aac aac gac atg acc gag gag gcc tgg gac gcc atc ctg gac aac cca 2271 Asn Asn Asp Met Thr Glu Glu Ala Trp Asp Ala Ile Leu Asp Asn Pro 715 720 725 730 cag gtg gtg ttc gcg cgg acc tcc ccg cag cag aag ctg gtc att gtc 2319 Gln Val Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln Gln Lys Leu Val Ile Val 735 740 745 tcg gag aac cag aag cgc ggg cac att gtg gcg gtg acg ggc gac ggc 2367 Ser Glu Asn Gln Lys Arg Gly His Ile Val Ala Val Thr Gly Asp Gly 750 755 760 gtg aac gac tcg ccc gcg ctg aag cag gcg gac atc ggc gtg gcc atg 2415 Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Gln Ala Asp Ile Gly Val Ala Met 765 770 775 ggc atc agc ggg tcc gag gtg tcc aag cag gcg gcg gac atg atc ctg 2463 Gly Ile Ser Gly Ser Glu Val Ser Lys Gln Ala Ala Asp Met Ile Leu 780 785 790 ctg gac gac aac ttc gcc tcc atc gtg gcg ggc gtg gag gag ggc cgc 2511 Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Ala Gly Val Glu Glu Gly Arg 795 800 805 810 ctg atc ttc gac aac ctg aag aag agc atc tgc tac acg ctg acc tcg 2559 Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ser Ile Cys Tyr Thr Leu Thr Ser 815 820 825 aac atc ccc gag atc tcg ccc ttc ctg tgc ttc atc gtg atc ggc acc 2607 Asn Ile Pro Glu Ile Ser Pro Phe Leu Cys Phe Ile Val Ile Gly Thr 830 835 840 ccg ctg ccg ctc agc acc gtg ctc atc ctt ggc atc gac ctg ggc acg 2655 Pro Leu Pro Leu Ser Thr Val Leu Ile Leu Gly Ile Asp Leu Gly Thr 845 850 855 gac atg gtg ccg gcc atc tcc atg gcc tac gag cag gcc gag gcg gac 2703 Asp Met Val Pro Ala Ile Ser Met Ala Tyr Glu Gln Ala Glu Ala Asp 860 865 870 atc atg aag cgc ccc ccg cgc gac tcc cag ctg gac cgc ctg gtg acc 2751 Ile Met Lys Arg Pro Pro Arg Asp Ser Gln Leu Asp Arg Leu Val Thr 875 880 885 890 aag aag ctc atc gtg ttc gcc tac ctg cag atc ggc atg atc cag gcc 2799 Lys Lys Leu Ile Val Phe Ala Tyr Leu Gln Ile Gly Met Ile Gln Ala 895 900 905 gcg gcc ggc ttc tac acc tgg atg gtg gtg ctc aac gac tac ggc ttc 2847 Ala Ala Gly Phe Tyr Thr Trp Met Val Val Leu Asn Asp Tyr Gly Phe 910 915 920 ccc ccg cac atc ctc ccc ggg ctg ggc cgc ggc ggc ttc tgg cag cag 2895 Pro Pro His Ile Leu Pro Gly Leu Gly Arg Gly Gly Phe Trp Gln Gln 925 930 935 cac ccg ctg tac tgc aag ttc gac ggc ggc cag tac gtg tcc ctc gac 2943 His Pro Leu Tyr Cys Lys Phe Asp Gly Gly Gln Tyr Val Ser Leu Asp 940 945 950 ggc gag gcc tcg tct gac ctg gac ccc agc tct gac gcg ccc acg cgc 2991 Gly Glu Ala Ser Ser Asp Leu Asp Pro Ser Ser Asp Ala Pro Thr Arg 955 960 965 970 gcc tac ccc ttc tgg gac gtt ggg gac cac ggc aac atc gtg aac tgc 3039 Ala Tyr Pro Phe Trp Asp Val Gly Asp His Gly Asn Ile Val Asn Cys 975 980 985 gag ttc ccc atc aag aac ctg agg ggt ggc tcg ggc gtg ccc tcc ggc 3087 Glu Phe Pro Ile Lys Asn Leu Arg Gly Gly Ser Gly Val Pro Ser Gly 990 995 1000 ttc gac atc tct gag gcg gac acc tac gac gac agc agc acc tcg ggc 3135 Phe Asp Ile Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Asp Asp Ser Ser Thr Ser Gly 1005 1010 1015 ttc aac cag atg acc tac gag tcg ctg ctg gct ctg gag gcg cag aac 3183 Phe Asn Gln Met Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Ala Leu Glu Ala Gln Asn 1020 1025 1030 tac ttc cac tac gtg cct tgg cgc gca cgc cag tcg cct ttc tgg aag 3231 Tyr Phe His Tyr Val Pro Trp Arg Ala Arg Gln Ser Pro Phe Trp Lys 1035 1040 1045 1050 aac agc tgg ttc ttc tgg gac gtg gag gat gag gag acg ccc ggc ggg 3279 Asn Ser Trp Phe Phe Trp Asp Val Glu Asp Glu Glu Thr Pro Gly Gly 1055 1060 1065 gcc ttc ggc ggc gcg gcg gac atc acc tac ttc ctg cac cag aag gcg 3327 Ala Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ile Thr Tyr Phe Leu His Gln Lys Ala 1070 1075 1080 ggc ctc tgg agc ctg tgc gcc aag gac gag gac ctg tcc gag ggc acg 3375 Gly Leu Trp Ser Leu Cys Ala Lys Asp Glu Asp Leu Ser Glu Gly Thr 1085 1090 1095 ggc aat tcg gac ttc ctc ggc acc cag gcc gcc tgg gac ctg tac gag 3423 Gly Asn Ser Asp Phe Leu Gly Thr Gln Ala Ala Trp Asp Leu Tyr Glu 1100 1105 1110 aac gac ttc gac ttc acg ggc gtc ggg gcc tgc tca gtg aac agc gcg 3471 Asn Asp Phe Asp Phe Thr Gly Val Gly Ala Cys Ser Val Asn Ser Ala 1115 1120 1125 1130 acc atg aag aat cag atg tac aag gac gcc tac ttc tgc aac aac tac 3519 Thr Met Lys Asn Gln Met Tyr Lys Asp Ala Tyr Phe Cys Asn Asn Tyr 1135 1140 1145 ccg cac tcc tcg ggc tac gcc agc ggc gcc aag ccg ggg tgc gag gcg 3567 Pro His Ser Ser Gly Tyr Ala Ser Gly Ala Lys Pro Gly Cys Glu Ala 1150 1155 1160 ggc gcc aac acg cac ccg ctc aac aac gtc tgg tgc gcg gac tcg tgc 3615 Gly Ala Asn Thr His Pro Leu Asn Asn Val Trp Cys Ala Asp Ser Cys 1165 1170 1175 tcc cag gcc tgc tat gag gcg ggc ggc gac ggc ggg gac gcg tac aac 3663 Ser Gln Ala Cys Tyr Glu Ala Gly Gly Asp Gly Gly Asp Ala Tyr Asn 1180 1185 1190 tgc gcc aac gtg gcc tcg cgc atg gcg cag aag gag gcg ctg cac cac 3711 Cys Ala Asn Val Ala Ser Arg Met Ala Gln Lys Glu Ala Leu His His 1195 1200 1205 1210 gcg cag ggc tcg tac ttc gtc tcg atc gtg atc gtg cag tgg gcc gac 3759 Ala Gln Gly Ser Tyr Phe Val Ser Ile Val Ile Val Gln Trp Ala Asp 1215 1220 1225 ctg ctc atc tgc aag acg cgc tgg ctg agc ctg cgc cag cag ggc atg 3807 Leu Leu Ile Cys Lys Thr Arg Trp Leu Ser Leu Arg Gln Gln Gly Met 1230 1235 1240 aag aac tcc acg atg aac ttc gcg ctg ttc ttc gag acg ctg ctg gcc 3855 1245 1250 1255 ggc tgg ctg tgc tac tgc ctg ccc atc aac gtg ggc ctg ggc acg cgc 3903 Gly Trp Leu Cys Tyr Cys Leu Pro Ile Asn Val Gly Leu Gly Thr Arg 1260 1265 1270 aac ctg cgc ttc acg cac tgg ttc ccg gcc atc ccc ttc tcc gtg gcc 3951 Asn Leu Arg Phe Thr His Trp Phe Pro Ala Ile Pro Phe Ser Val Ala 1275 1280 1285 1290 atc ttc gtg tac gac gag gtc cgc aag tac ctc atg cgc acc acg tcc 3999 Ile Phe Val Tyr Asp Glu Val Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Thr Ser 1295 1300 1305 ccc gag acc acc gac aag gcc acc ggc cag gtc acc cgc att gcg ggc 4047 Pro Glu Thr Thr Asp Lys Ala Thr Gly Gln Val Thr Arg Ile Ala Gly 1310 1315 1320 tgg ctc gag acc aac acc tac tat taggcggtac tagtacgccg ggcgtggcag 4101 Trp Leu Glu Thr Asn Thr Tyr Tyr 1325 1330 gcgggcgacg tctcttcttc actgccagca gcttttccgg gaacaatgga ggaagatgat 4161 gatgtgctac tgacacccac caacggtgtg atgtaaatga aatgacaaag cccaatcaat 4221 tgcgagttgt ggtgggtggt ggtgggatgg ttgttgttgg gtggatgatg ggttgttgtt 4281 gtccgttatg ctttgtgttg cggatcgcgg acaaggtttt gttgttctgc tgtgtgtggt 4341 ctgcagctcc acttcatctt ccttgctgct tcgcatcctg tatcatcaaa ttcttcttgt 4401 tgtgttgtat tattattata taacttcttg ttgtgttgta ttatcattat attatcaaaa 4461 aaaaaa 4467 <210> 2 <211> 1330 <212> PRT <213> Heterosigma akashiwo <400> 2 Met Gly Leu Met Lys Lys Lys Ala Gly Gly Asp Ser Asn Ser Arg Arg 1 5 10 15 Val Asp Asp Leu Lys Lys Asn Val Val Met Thr Glu His Lys Glu Glu 20 25 30 Trp Glu Glu Leu Phe Ala Lys Leu Gly Ser Ser Val Glu Gly Leu Ser 35 40 45 Gln Glu Glu Ala Gln Lys Arg Asn Arg Glu Phe Gly Asp Asp Arg Leu 50 55 60 Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Lys Trp Val Lys Phe Leu Lys Glu Met 65 70 75 80 Thr Gly Phe Phe Ser Leu Leu Leu Trp Gly Gly Gly Ile Leu Cys Phe 85 90 95 Ile Arg Tyr Gly Leu Arg Lys Glu Val Asp Asn Met Tyr Leu Gly Ile 100 105 110 Val Leu Phe Ala Val Val Phe Val Thr Gly Cys Phe Ser Phe Phe Gln 115 120 125 Asn Ser Lys Ser Glu Asn Leu Met Lys Ser Phe Glu Lys Leu Leu Pro 130 135 140 Pro Ser Ile Asn Ala Lys Arg Asn Gly Glu Phe Ile Lys Val Pro Ser 145 150 155 160 Glu Lys Leu Val Lys Gly Asp Val Ile Arg Leu Glu Gly Gly Glu Leu 165 170 175 Val Pro Cys Asp Val Arg Ile Ile Thr Cys Thr Asp Asn Cys Val Val 180 185 190 Asp Asn Ala Ser Leu Thr Gly Glu Ala Glu Pro Gln Lys Arg Lys Asn 195 200 205 Glu Ala Thr His Asp Glu Pro Leu Glu Thr Ala Asn Leu Ala Phe Phe 210 215 220 Gly Thr Asn Val Pro Glu Gly Ser Leu Glu Gly Val Val Val Asn Ile 225 230 235 240 Gly Asp Asp Thr Val Met Gly Arg Ile Ala Ser Leu Thr Leu Gln Val 245 250 255 Gly Ala Gln Gln Thr Pro Ile Asn Lys Glu Ile His His Phe Ile Leu 260 265 270 Ile Ile Ser Ser Ile Ala Ile Phe Leu Gly Val Thr Phe Phe Ile Ile 275 280 285 Gly Leu Ala Leu Gly Thr Glu Leu Ile Glu Asn Leu Val Phe Leu Ile 290 295 300 Ser Ile Ile Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr 305 310 315 320 Val Cys Leu Thr Leu Thr Ala Arg Arg Met His Ser Lys Met Val Leu 325 330 335 Val Lys Asn Leu Glu Gly Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Cys Ile 340 345 350 Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Val Thr Gln Asn Ile Met Thr Val Ala 355 360 365 Gln Ile Val Tyr Gly Asn Gln Asp Ala Val His Ile Gln Asp Thr Gly 370 375 380 Ser Ser Leu Ser His Gly Leu Lys Thr Tyr Asn Pro Glu Asn Ala Ala 385 390 395 400 Phe Gln Ser Leu Leu Arg Cys Ala Met Leu Asn Asn Thr Ser Thr Phe 405 410 415 Gly Lys Tyr Arg Leu Asp Glu Asn Gly Asp Pro Thr Asp Glu Leu Leu 420 425 430 Pro Phe Lys Ala Glu Val Val Gln Gly Asp Gly Ser Val Ile Glu Gln 435 440 445 Val Met Trp Arg Val Asn Gly Asn Ala Ser Glu Ala Ala Met Ile Lys 450 455 460 Phe Ala Gln Asn His Glu Asp Val Asp Asp Phe Arg Lys Arg Asn Pro 465 470 475 480 Met Val Phe Gln Ile Pro Phe Asn Ser Arg Asn Lys Tyr Gln Val His 485 490 495 Val His Cys Gln Glu Lys Phe Asn Gln Glu Asp Gly Thr Asn Ser Gly 500 505 510 Pro Arg Val Val Leu Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Val Leu Ala Arg 515 520 525 Cys Ser Gln Ala Lys Leu Gly Gly Asn Ile Val Pro Met Thr Pro Glu 530 535 540 Leu Met Ala Glu Ile Glu Arg Leu Gln Val Gln Met Ser Ala Asn Gly 545 550 555 560 Leu Arg Val Leu Gly Phe Ala Glu Arg Glu Leu Pro Lys Thr Lys Phe 565 570 575 Pro Ala Asp Tyr Lys Tyr His Asp Gly Ser Glu Glu Asp Lys Ser Thr 580 585 590 Pro Asn Phe Pro Leu Gly Glu Phe Ala Met Glu Ala Glu Arg Glu Lys 595 600 605 Asn Pro Pro Lys Leu Pro Val His Asp Ala Ser Met Gln Gly Leu Ile 610 615 620 Phe Ile Gly Leu Met Ala Leu Ile Asp Pro Pro Arg Pro Ala Val Pro 625 630 635 640 Gly Ala Val Glu Lys Cys Lys Thr Ala Gly Val Lys Val Ile Met Val 645 650 655 Thr Gly Asp His Pro Val Thr Ala Gln Ala Ile Ala Gln Lys Val Gly 660 665 670 Ile Leu Trp Ser Lys Thr Arg Ala Glu Ala Met Ala His Asn Glu Ala 675 680 685 Tyr Gln Leu Asn Pro Gly Asp Ala Gly Phe Glu Asp Pro Glu Glu Cys 690 695 700 Lys Ala Ile Ala Val Pro Gly Trp Glu Leu Asn Asn Asp Met Thr Glu 705 710 715 720 Glu Ala Trp Asp Ala Ile Leu Asp Asn Pro Gln Val Val Phe Ala Arg 725 730 735 Thr Ser Pro Gln Gln Lys Leu Val Ile Val Ser Glu Asn Gln Lys Arg 740 745 750 Gly His Ile Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala 755 760 765 Leu Lys Gln Ala Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser Glu 770 775 780 Val Ser Lys Gln Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala 785 790 795 800 Ser Ile Val Ala Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu 805 810 815 Lys Lys Ser Ile Cys Tyr Thr Leu Thr Ser Asn Ile Pro Glu Ile Ser 820 825 830 Pro Phe Leu Cys Phe Ile Val Ile Gly Thr Pro Leu Pro Leu Ser Thr 835 840 845 Val Leu Ile Leu Gly Ile Asp Leu Gly Thr Asp Met Val Pro Ala Ile 850 855 860 Ser Met Ala Tyr Glu Gln Ala Glu Ala Asp Ile Met Lys Arg Pro Pro 865 870 875 880 Arg Asp Ser Gln Leu Asp Arg Leu Val Thr Lys Lys Leu Ile Val Phe 885 890 895 Ala Tyr Leu Gln Ile Gly Met Ile Gln Ala Ala Ala Gly Phe Tyr Thr 900 905 910 915 920 925 Gly Leu Gly Arg Gly Gly Phe Trp Gln Gln His Pro Leu Tyr Cys Lys 930 935 940 Phe Asp Gly Gly Gln Tyr Val Ser Leu Asp Gly Glu Ala Ser Ser Asp 945 950 955 960 Leu Asp Pro Ser Ser Asp Ala Pro Thr Arg Ala Tyr Pro Phe Trp Asp 965 970 975 Val Gly Asp His Gly Asn Ile Val Asn Cys Glu Phe Pro Ile Lys Asn 980 985 990 Leu Arg Gly Gly Ser Gly Val Pro Ser Gly Phe Asp Ile Ser Glu Ala 995 1000 1005 Asp Thr Tyr Asp Asp Ser Ser Thr Ser Gly Phe Asn Gln Met Thr Tyr 1010 1015 1020 Glu Ser Leu Leu Ala Leu Glu Ala Gln Asn Tyr Phe His Tyr Val Pro 025 1030 1035 1040 Trp Arg Ala Arg Gln Ser Pro Phe Trp Lys Asn Ser Trp Phe Phe Trp 1045 1050 1055 Asp Val Glu Asp Glu Glu Thr Pro Gly Gly Ala Phe Gly Gly Ala Ala 1060 1065 1070 Asp Ile Thr Tyr Phe Leu His Gln Lys Ala Gly Leu Trp Ser Leu Cys 1075 1080 1085 Ala Lys Asp Glu Asp Leu Ser Glu Gly Thr Gly Asn Ser Asp Phe Leu 1090 1095 1100 Gly Thr Gln Ala Ala Trp Asp Leu Tyr Glu Asn Asp Phe Asp Phe Thr 105 1110 1115 1120 Gly Val Gly Ala Cys Ser Val Asn Ser Ala Thr Met Lys Asn Gln Met 1125 1130 1135 Tyr Lys Asp Ala Tyr Phe Cys Asn Asn Tyr Pro His Ser Ser Gly Tyr 1140 1145 1150 Ala Ser Gly Ala Lys Pro Gly Cys Glu Ala Gly Ala Asn Thr His Pro 1155 1160 1165 Leu Asn Asn Val Trp Cys Ala Asp Ser Cys Ser Gln Ala Cys Tyr Glu 1170 1175 1180 Ala Gly Gly Asp Gly Gly Asp Ala Tyr Asn Cys Ala Asn Val Ala Ser 185 1190 1195 1200 Arg Met Ala Gln Lys Glu Ala Leu His His Ala Gln Gly Ser Tyr Phe 1205 1210 1215 Val Ser Ile Val Ile Val Gln Trp Ala Asp Leu Leu Ile Cys Lys Thr 1220 1225 1230 Arg Trp Leu Ser Leu Arg Gln Gln Gly Met Lys Asn Ser Thr Met Asn 1235 1240 1245 Phe Ala Leu Phe Phe Glu Thr Leu Leu Ala Gly Trp Leu Cys Tyr Cys 1250 1255 1260 Leu Pro Ile Asn Val Gly Leu Gly Thr Arg Asn Leu Arg Phe Thr His 265 1270 1275 1280 Trp Phe Pro Ala Ile Pro Phe Ser Val Ala Ile Phe Val Tyr Asp Glu 1285 1290 1295 Val Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Thr Ser Pro Glu Thr Thr Asp Lys 1300 1305 1310 Ala Thr Gly Gln Val Thr Arg Ile Ala Gly Trp Leu Glu Thr Asn Thr 1315 1320 1325 Tyr Tyr 1330 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <400> 3 Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <400> 4 Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp 1 5 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the conservative sequence of P-type ATPase. <220> <221> modified base <222> 6 <223> i <220> <221> modified base <222> 15 <223> i <220> <221> modified base <222> 18 <223> i <400> 5 tgytcngaya aracnggnac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the conservative sequence of P-type ATPase. <220> <221> modified base <222> 6 <223> i <220> <221> modified base <222> 9 <223> i <220> <221> modified base <222> 15 <223> i <220> <221> modified base <222> 18 <223> i <400> 6 tcrttnacnc crtcnccngt 20 <210> 7 <211> 1239 <212> DNA <213> Heterosigma akashiwo <400> 7 tgctcggaca agacgggcac ggtcacgcag aacatcatga ccgtggctca gatcgtgtac 60 ggcaaccaag acgccgtgca catccaggac acaggctcct cgctgagcca cgggctgaag 120 acgtacaacc cggagaacgc cgccttccag tcgctgctgc ggtgcgccat gctgaacaac 180 acctccacct ttgggaagta ccgcctggac gagaacgggg accccacgga cgagctgctg 240 ccgttcaagg cggaggtggt gcagggcgac ggcagcgtga tcgagcaggt gatgtggcgc 300 gtgaacggca acgcctccga ggcggccatg atcaagttcg cgcagaacca cgaggacgtg 360 gacgacttcc gcaaacgtaa cccgatggtg ttccagatcc cattcaactc gcgcaacaag 420 taccaagtgc acgtacactg ccaggagaag ttcaaccagg aggacggcac gaactccggc 480 ccgcgcgtgg tgctgatgaa gggcgccccc gagcgcgtgc tggcccgctg ctcgcaggcc 540 aagctgggcg gcaacattgt gcccatgacc ccggagctga tggccgagat tgagcggctg 600 caggtgcaga tgtccgccaa cggcctccgc gtgctggggt tcgccgagcg cgagctgccc 660 aagaccaagt tccccgcgga ctacaagtac cacgacggca gcgaggagga caagagcacg 720 cccaacttcc cgctgggcga gttcgcgatg gaggccgagc gcgagaagaa cccgcccaag 780 ctgcccgtgc acgacgcgtc catgcagggc ctgatcttca tcgggctgat ggccctgatc 840 gaccccccgc ggccggcggt gcccggcgcc gtggagaagt gcaagacggc cggcgtgaag 900 gtgatcatgg tcacgggcga ccacccggtg acggcgcagg ccatcgcgca gaaggtgggc 960 atcctctggt ccaagacgcg cgcggaggcg atggcgcaca acgaggccta ccagctgaac 1020 ccgggggacg ccggctttga ggacccggag gagtgcaagg ccattgcggt gcccggctgg 1080 gagctgaaca acgacatgac cgaggaggcc tgggacgcca tcctggacaa cccacaggtg 1140 gtgttcgcgc ggacctcccc gcagcagaag ctggtcattg tctcggagaa ccagaagcgc 1200 gggcacattg tggcggtgac gggcgacggc gtgaacgac 1239 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the PCR product. <400> 8 ttcagctccc agccgggcac cg 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on the PCR product. <400> 9 caaggcggag gtggtgctgg gc 22

【００６６】

【配列表フリーテキスト】

【００６７】

【配列番号５】 P-typeのATPアーゼにみられる保存的
配列の基づいて設計したオリゴヌクレオチド。６、15、
１8番目の塩基はイノシン。

【００６８】

【配列番号６】 P-typeのATPアーゼにみられる保存的
配列の基づいて設計したオリゴヌクレオチド。６、９、
15、18番目の塩基はイノシン。

【００６９】

【配列番号８】 １回目のPCRにより得られたPCRs産物
の塩基配列の基づいて設計したオリゴヌクレオチド。

【００７０】

【配列番号９】 １回目のPCRにより得られたPCRs産物
の塩基配列の基づいて設計したオリゴヌクレオチド。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年７月１２日（１９９９．７．１
２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD02 CD07 CD09 4B024 AA08 BA11 CA04 DA06 EA04 GA14 GA19 HA01 4B050 CC03 DD01 LL10 4B065 AA26X AA83Y AA89X AB01 BA03 BA24 CA31 CA53

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なく
   とも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつNa⁺-ATPアーゼ活性を有する
   タンパク質
2. 【請求項２】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するNa⁺-ATPアーゼ遺伝子。 (a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なく
   とも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつNa⁺-ATPアーゼ活性を有する
   タンパク質
3. 【請求項３】 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。 (c) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNA (d) 配列番号１で表される塩基配列からなるDNAとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつNa⁺-AT
   Pアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地に培養
   し、得られる培養物からNa⁺-ATPアーゼを採取すること
   を特徴とするNa⁺-ATPアーゼの製造方法。
7. 【請求項７】 請求項２又は３に記載の遺伝子を含むト
   ランスジェニック植物。