FI115918B - Bakteeriksylanaasi, menetelmä sen valmistamiseksi sekä siihen soveltuva bakteerikanta, plasmidi siihen kuuluvine rakennegeeneineen, sekä leivontaväline ja leipomismenetelmä leivän valmistamiseksi sekäleipomotuotteet, joissa käytetään ksylanaasia - Google Patents

Description

115918

Bakteeriksylanaasi, menetelmä sen valmistamiseksi sekä siihen soveltuva bakteerikanta, plasmidi siihen kuuluvine rakennegeeneineen, sekä leivontaväline ja leipo-mismenetelmä leivän valmistamiseksi sekä leipomotuotteet, joissa käytetään ksy-lanaasia. - Bakteriexylanas, förfarande för dess framställning samt för detta lämplig 5 bakteriestam, plasmid med tillhörande strukturgen, ävensom bakningsmedel och bakningsförfaranden för tillverkningn av bräd och bageriprodukter under använd-ning av xylanas.

Keksinnön kohteena on uusi bakteeri-ksylanaasi, tämän valmistusmenetelmä sekä 10 tähän sopiva bakteerikanta, edelleen plasmidi, jossa on uuden ksylanaasin ekspres-sointiin sopiva geneettinen aines. Keksinnön kohteena on edelleen leivonta-aine ja tilavuutta nostava ja taikinaa parantava leivontamenetelmä leivän ja leivonnaisten valmistamiseksi käyttämällä uutta ksylanaasia.

15 Hiivaleivonnaisia valmistettaessa pyritään leivonnaisten suureen tilavuuteen, erityisesti vehnäleivällä ja sämpylöissä. Paistamistilavuus riippuu monesta tekijästä, jotka suurelta osalta ovat jauhon ominaisuuksia. Mutta myös parhaimmilla jauhoilla saavutettavissa olevat paistamistulokset jättävät toivomisen varaa vieläkin suuremmasta paistamistilavuudesta. Tilavuutta nostavien leivonta-apuaineiden etsinnän tavoit-20 teenä on toisaalta nostaa jo saavutettavissa olevaa paistamistilavuutta ja toisaalta myös saavuttaa vähintään vielä keskimääräisiä paistamistuloksia huonompilaatuisil-·:*·: lakin jauhoilla.

Tilavuutta nostaviin leivonta-apuaineisiin kuuluu emulgaattoreita, hapettimia, pelkis-25 timiä, hiivan aktivaattoreita, entsyymejä, kuten amylaaseja, proteaaseja ja pento-:T: sanaaseja, pH-stabilaattoreita, hyytelöaineita, rasvoja jne.

1/. : G. Reed ("Enzyme in Food Processing", Academic Press, New York, London 1966, s.

:, _ > .* 253 ff.) on todennut, että jauhoon liukenemattomat pentosaanit pienentävät pais- 30 tamistilavuutta. Sen vuoksi hän odotti saatavan hyviä paistamistuloksia käyttämällä .· · ·. mukana pentosanaaseja, jotka hajottavat pentosaaneja. Tällaisilla entsyymeillä tä- ,:. hän mennessä havaitut vaikutukset ovat vähäisiä eivätkä kaikissa tapauksissa tois- « » · ‘ . tettavia. A. Rotsch ("Brot und Gebäck", 1966, s. 91) havaitsi, että leivontaemulgaat- toreiden vaikutusta ei voitu parantaa käyttämällä samanaikaisesti mukana pento- 2 115918 sanaaseja tai vaikutus oli merkityksetön, so. että emulgaattoreita ja pentosanaa-seja samanaikaisesti käytettäessää vaikutus ei ole additiivinen. Pentosanaaseja on kuitenkin aika ajoin ehdotettu leivän tuoreena säilyttämiseen. Cooke ja Johansson (DT-AS 1 767 119) ovat todenneet, että tässä suhteessa pentosanaasit vaikuttavat 5 edullisemmin kuin leipomisemulgaattorit ja että näiden asemesta käytettäessä ne eivät kuitenkaan nostaneet paistamistilavuutta.

Pentosanaasien mukana käyttämistä on myös jo ehdotettu tapauksissa, joissa ruisjauhossa on epäedullinen pentosaani-tärkkelys-suhde, ja erityisesti, kun tällaisten 10 jauhojen taikinalla on liian korkea viskositeetti ruispentosaanien jälkiturpoamisesta johtuen. Tällaisia taikinoita paistettaessa leivän sydän repeytyy irti päällyskuoresta, koska taikina nousee korkeaan tilaan ja kuoren muodostuminen jähmettää tämän tilan uunissa. Paistamisen kuluessa kuoren sisäänsä sulkema tila ei täyty kokonaan, jolloin sydän repeytyy mainitulla tavalla irti. Pentosanaaseja lisäämällä hajotetaan 15 pentosaanit ja alennetaan vastaavasti voimakkaasti taikinan viskositeettia. Tämän seurauksena veden sitoutuminen on tasaisempi paistamisprosessin aikana ja sydämen repeytyminen kuoresta estyy. Kun jauhoja, joissa on tasainen suhde pentosaa-nin ja tärkkelyksen välillä, jatkokäsitellään, voidaan pentosanaaseja lisäämällä laskea taikinan viskositeettia niin paljon, että muodostuu litteitä leipiä. Pentosanaasin 20 lisääminen on tällöin siten edullista vain poikkeustapauksissa, mutta monissa tapa-::: uksissa se aiheuttaa kuitenkin haittoja. Vehnäjauhohiivan taikinoilla ei tällaisilla pen- •:'': tosanaaseilla ole saavutettavissa mitään huomattavaa vaikutusta.

• I

j ' : Kosmina on kuvannut kirjassa "Biochemie der Brotherstellung", Leipzig 1975, s. 324, : ’ : 25 vehnäjauhon nk. "jäännösjakeen", josta käytetään myös nimitystä vehnälima tai

Tailings, haitallista vaikutusta, kun sitä lisätään jauhoon valmistettaessa hiivaleivon-naisia vehnäjauhosta. Se tosin lisää vedensitomiskykyä, mutta pienentää tilavuutta • t ·, j : ja huonontaa leivän huokoisuutta. Nämä haitalliset vaikutukset voidaan estää esikä- : sittelemällä "jäännösjae" Trichoderma viride'stä saadulla sellulaasipreparaatilla (kau- 30 pallinen tuote "Meicelase" Meiji).

.Lisäksi on tunnettua, että taikinan ja siten leivonnaisen tilavuutta voidaan nostaa ' . lisäämällä entsyymejä, erityisesti amylaaseja ja/tai proteaaseja. Näihin toimenpitei siin ryhdytään erityisesti silloin, kun jauhot itsessään sisältävät liian vähän entsyy- 3 115918 mejä, mutta mainituilla entsyymeillä saavutettavissa oleva tilavuuden kasvu on kuitenkin vähäinen. Myös leivontaemulgaattoreiden lisääminen lisää jonkin verran tilavuutta. Tilavuutta voidaan edelleen lisätä muilla apuaineilla, kuten hiivan aktivaatto-reilla, hapettimilla ja pelkistimillä.

5

Patenttijulkaisusta DE-A 40 17 150 on tunnettua muodostaa leivonta-aktiivisia pen-tosanaasipreparaatteja siten, että mikro-organismien ksylanaasin muodostus indusoidaan beeta-metyyliksylosidilla. Tätä menetelmää voidaan käyttää sieni- ja bak-teeriviljelmissä. Muodostetun ksylanaasin ominaisuudet riippuvat voimakkaasti 10 tuottavan mikro-organismin valinnasta,

Vehnäjauhosta olevien hiivaleivonnaisten valmistamiseen on jo jonkin aikaa käytetty leivonta-apuaineita, joiden avulla on voitu nostaa vehnäjauhosta olevien hiivaleivonnaisten tilavuutta paljon enemmän kuin tähän mennessä on ollut mahdollista.

15

Mainittu leivonta-apuaine sisältää leivontaemulgaattoreiden ja muiden apuaineiden lisäksi pääasiallisesti amylaaseista muodostuvaa entsyymiseosta, joka aiheuttaa tilavuuden kasvun. Tietoja entsyymiseoksen ominaisuuksista ja saantitavasta ei ole julkistettu. Entsyymiseoksesta voidaan amylaasiaktiivisuuden lisäksi osoittaa ksyla-20 naasiaktiivisuus, jonka ominaisuusspektri osoittaa sen sieniksylanaasiksi. Ksylanaasit : T: kuuluvat pentosanaasien entsyymiryhmään. Tällä tavoin aikaansaatuun tilavuusvai- ·:·*: kutukseen ei päästä läheskään tavanomaisilla tunnetuilla ksylanaaseilla, jotka kaikki : : ’: ovat peräisin sienistä.

# · · • · Γ* : 25 Vaikkakin viime aikoina on taiottu erilaisia sellulaasipohjaisia leivontaentsyymejä, : joilla voidaan selvästi nostaa hiivaleivonnaisten tilavuutta, niiden vaikutus jää paljon jälkeen mainitun leivonta-apuaineen vaikutuksesta.

I t » I * :' ’': Keksinnön tavoitteena on tuoda käyttöön leivontaentsyymi, jonka vaikutus on sama : 30 kuin mainitulla leivonta-apuaineella, ja sen valmistusmenetelmä sekä menetelmä , - -, valmistaa hiivajauhosta hiivaleivonnaisia, joilla on vastaavasti suurempi tilavuus.

* · ’ ’ * Määrätyistä bakteeriviljelmistä havaittiin voitavan saada ksylanaaseja, joilla oli halu tut ominaisuudet. Keksijät ovat osoittaneet, että bakteeri-ksylanaasit, jotka voidaan 4 115918 valmistaa ekspressoimalla SEQ ID NO:2:n mukainen rakennegeeni, antavat halutun vaikutuksen leivontaentsyyminä käytettäessä.

Uusien ksylanaasien vaikutuksessa oletetaan olevan osuutensa jauhon liima-ainei-5 den osittaisella hajoamisella ja tästä seuraavalla paremmalla paisuvuudella, jolloin hajoaminen ei kuitenkaan aiheuta liukenemattomien ksylaanipartikkeleiden liukenemista. Taikinan viskositeettiin kohdistuva vaikutus on osoitettavissa. Taikinoista tulee villankuohkeita ja pehmeitä, mikä näyttää olevan syy-yhteydessä paistamistila-vuuden kasvuun. Koska hiivataikinoiden viskositeettikäyttäytyminen ja paistamistila-10 vuus riippuvat kuitenkin moninaisista muuttujista, se soveltuu vain keksinnölle oleellisen entsyymivaikutuksen karakterisointiin. Uusi ksylanaasi voidaan sitä vastoin identifioida yksiselitteisesti aminohapposekvenssinsä tai vastaavan nukleotidisek-venssinsä avulla ja erottaa tunnetuista ksylanaaseista.

15 Se poikkeaa tunnetusta G. Paice, R. Bourbonnais, M. Desrochers, L. Jurasek ja M. Yaguchi, Arch. Microbiol. 1986, voi. 144, 201-206) B. subtilis-ksylanaasista nukleoti-disekvenssin 45 asemassa ja aminohapposekvenssin 10 asemassa, jotka on merkitty alleviivaamalla SEQ ID NO:2:ssa. Sitä on sen vuoksi pidettävä uutena, tähän mennessä kuvaamattomana ksylanaasina. Kymmenestä poikkeavasta aminohaposta 20 kuusi on kypsän proteiinin osassa, joka (Paice'n et ai. mukaan) alkaa 28 aminoha-; ’:': pon pituisen Leader-peptidin lohkaisemisen jälkeen aminohaposta 29 SEQ ID

: · ·: NO:2:ssa ja joka käsittää 185 aminohappoa. Uuden ksylanaasin ainutlaatuisen lei- ; ;vontavaikutuksen oletetaan riippuvan osoitetuista eroista aminohapposekvenssissä -: ’ * *: yksinään tai yhdistelmänä.

Γ* : 25 : Ί': Kuvauksen liitteet: i : : SEQ ID NO:l sisältää koko RH1221:sta kloonatun DNA-sekvenssin. Nukleotidistä

’: 506 siinä on avoin lukukehys 213 aminohapolle. SEQ ID NO:2 sisältää SEQ ID

,.,,: 30 NO:l:n sisällä Bac. subtilis RH 1221:sta saadun keksinnön mukaisen ksylanaasin . ·. rakennegeenin sekä tämän ksylanaasin vastaavan aminohapposekvenssin. Tämä rakennegeeni on Bac. subtilis RH 1330:n plasmidissa pIK 91, jonka tallennusnumero v ! on DSM 7147.

5 115918

Keksinnön edut ja käyttöalat

Esillä olevan keksinnön mukaisilla bakteeriksylanaaseilla voidaan nostaa vehnäjauhosta olevien hiivaleivonnaisten tilavuutta 20 - 30 tilavuus-%, osittain jopa tätäkin 5 enemmän. Tämä vaikutus - jota ei muutoin havaita leivonta-aineilla - saavutetaan kaikilla vehnäjauhoilla, ja myös silloin, kun tämä on jo optimoitu paistamistilavuuden suhteen lisäämällä amylaaseja, proteaaseja ja emulgaattoreita. Tämän lisäksi taikinan laatu paranee ja se kuohkeutuu ja muodostuu villankuohkea taikina. Leivonnaisten huokoisuus tulee hienommaksi.

10

Keksinnön mukaiset edut saavutetaan valmistettaessa kaikkia vehnäjauhopohjaisia hiivaleivonnaisia. Keksinnöllä on suurin merkitys vehnäleivän ja sämpylöiden valmistukselle. Sitä voidaan kuitenkin käyttää edullisesti myös valmistettaessa maitosäm-pylöitä, hiivaleivoksia ja hiivakahvileipiä.

15

Bakteeri-ksylanaasi

Keksinnön mukainen ksylanaasi löytyy eri bakteereiden entsyymispektrissä. Tavallisilla valintamenetelmillä voidaan ksylanaasia muodostavista mikro-organismeista 20 valita sellaisia, jotka tuottavat erittäin aktiivista ja erittäin spesifistä keksinnön mu-kaista ksylanaasia. Yksi mahdollisuus identifioida keksinnön mukainen bakteeri-; · ksylanaasi on analysoida muodostuvan bakteerin vastainen rakennegeeni; tähän on ; : käytettävissä standardisoituja tutkimusmenetelmiä. Itse ksylanaasin identifioinnin : * * *: apuna voidaan käyttää rakennegeenin transkriptiota vastaavaksi peptidisekvenssiksi.

• V 25 :T: Uutta ksylanaasia tuottavia bakteerikantoja on löydetty seuraavissa Bacillus-suvun lajeissa: Bac. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. natto, B. mesentericus, B. lichenifor-i mis, B. stearothermophilus, B. cogulans, B. pumilus, B. megaterium, B. circulans ja : B. firmus. Vaikkakin haluttua ksylanaasia on mahdollista saada myös valittujen bak- ,,!.: 30 teerikantojen viljelysuodoksesta, on kuitenkin osoittautunut, että tämä ei täytä suu- . · · . rimittaiselle tekniselle tuotannolle asetettuja tuottavuusvaatimuksia. Nykyään käy- ,;, tettävissä olevilla perintöaineksen siirtämismenetelmillä on kuitenkin periaatteessa ’ , mahdollista siirtää ksylanaasin muodostumista määräävä perimäinformaatio jostakin edellä mainitusta mikro-organismista muihin, hyvin viljeltävissä oleviin mikro-orga- ή 115918 nismeihin ja ottaa entsyymi talteen näiden viljelmästä. Tuottavuutta voidaan näin merkittävästi nostaa.

Yksi tällä tavoin transformoitu bakteerikanta, jolle on annettu nimeksi B. subtilis RH 5 1330 pIK 91, tallennettiin tallennusnumerolla DSM 7147 Budapestin sopimuksen määräysten mukaisesti Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-kokoelmaan Braunscheig:ssa.

Sopivia kantoja on voitu löytää ksylanaasin muodostajien sarjatutkimuksissa. Niistä 10 saatu genomi voidaan geeniteknisillä menetelmillä siirtää määrättyihin plasmideihin, jotka voidaan laittaa helposti useampana kappaleena hyvin viljeltävissä oleviin, tok-silogisesti vaarattomiin bakteerikantoihin. Rekombinanttibakteerille on tällöin tunnusomaista suuri ksylanaasin tuottoisuus. Kasvattamalla rekombinanttibakteeria sopivissa viljelyolosuhteissa saadaan viljelyliuoksia tai -liemiä, joista ksylanaasi voi-15 daan saada talteen, esimerkiksi erottamalla liukenemattomat solu- ja ravintoliuos-komponentit, väkevöimällä suodos ultrasuodattamalla, seostamalla suoloilla tai orgaanisilla nesteillä tai kuivaamalla käyttäen spray-kuivausta, leijukerroskuivausta tai lyofilisointia. Ksylanaasi valmistetaan ja käytetään mieluummin granulaatti- tai jau-hemuodossa. Sieniviljelmiin nähden keksinnön mukaisilla bakteeriviljelmillä on se 20 etu, että ne tarvitsevat vain yhden - kahden päivän fermentaatioajan, kun taas sie-;T: niä käytettäessä viljelyaika on kolme - viisi päivää.

• · ; ; ’ ; Keksinnön mukaiselle ksylanaasille on tunnusomaista, että molekyylipaino on noin ΓΛ 20.000 daltonia, kun taas tunnettujen sieniksylanaasien molekyylipainot ovat mo- 25 ninkertaiset. Näillä tunnetuilla ksylanaaseilla ei saada aikaan vertailtavissa olevaa :T: hiivaleivonnaisten tilavuuden kasvua. Entsyymin aktiivisuus ksylaanin suhteen ilmoi tetaan ksylanaasiyksikköinä (UXyl), jolloin 1 UXyl vastaa sitä entsyymimäärää, joka ; : ; vapauttaa ksylaanista 30 °C:ssa standardiolosuhteissa pelkistäviä ryhmiä määrän, joka vastaa 1 pmoolia ksyloosia minuutissa. Uuden bakteeriksylanaasin pH-optimi ,,!.; 30 on pH-arvossa 6,0 ja vastaa siten paremmin taikinan pH-arvoa, jossa sen tulee toi- . · · ’. mia, kuin sieniksylanaasit, jotka toimivat optimaalisesti pH-arvossa 4,5 - 5,0.

’ . Ksylanaasin tilavuusvaikutus on leivontakokeessa osoittautunut suuresti riippuvai seksi annostelusta. Pienillä annostuksilla tilavuuden kasvu kasvaa aina käytetyn ent- 7 115918 syymimäärän kanssa, mutta tietyllä entsyymimäärällä saavutetaan korkein tilavuuden kasvu, jota ei voi enää ylittää vielä suuremmilla annostuksilla. Usein paistamisti-lavuus jälleen pienenee entsyymin huomatavalla yliannostuksella, mikä voidaan selittää ksylaanin etenevällä hajaantumisella. Keksinnön mukaisen ksylanaasin yllättä-5 vä teho perustuu luultavasti siihen, että sopivalla annostuksella se avaa suhteellisen nopeasti siemenessä liukenemattomat, rajallisesti turpoamiskykyiset vehnän lima-aineet voimakkaasti turpoaviksi, mutta yhä liukenemattomiksi partikkeleiksi, mutta hajottaa nämä suhteellisen hitaasti edelleen liukoisiksi hydrolyysituotteiksi. Sitä vastoin lukuisat tunnetut ksylanaasit hajottavat vehnän lima-aineen jatkuvasti liukoisiksi 10 lopputuotteiksi asti, jolloin välivaiheessa ei esiinny korkeaa turpoamistasoa.

Leivonta-aine

Keksinnön mukaista ksylanaasia ei ensisijaisesti käytetä sellaisenaan, vaan seoksena 15 muiden leivonta-apuaineiden kanssa leivonta-aineena. Tämä helpottaa annostelua ja tasaista sekoittumista muiden apuaineiden kanssa.

Entsyymin sekoittamiseen leivonta-aineeksi sopivat periaatteessa kaikki hiivaleivon-naisten valmistamiseen sopivat apuaineet. Sekoittaminen nestemäisten lähtöainei-20 den, kuten veden tai maidon kanssa ei kuitenkaan ole tarkoituksenmukaista, eikä ;T: myöskään hiivan kanssa. Hyvänä pidettyjä sekoituskomponentteja ovat jauho, soke- •: * * * ri, suola, rasvat ja leivontaemulgaattorit. Seoksia jauhon kanssa kutsutaan myös : f: jauhonparannusaineiksi. Hiivaleivonnaisten valmistuksessa käytetään usein mukana !v: leivontaemulgaattoreita sisustan ominaisuuksien parantamiseen. Tyypillisiä esimerk- 25 kejä ovat rasvahappojen mono-, di- ja triglyseridit, lesitiini ja diasetyyliviinihappoes-; Ί': teri. Suositellut keksinnön mukaiset leivonta-aineet sisältävät ksylanaasin sekoitet tuna tällaisten leivontaemulgaattoreiden kanssa. Tällaisiin leivonta-aineisiin voidaan : : ; haluttaessa laittaa mukaan myös muita leivontaentsyymejä, kuten amylaaseja tai : \proteaaseja. Ksylanaasiaktiivisuus on yleensä välillä 0,1-10 UXyl leivonta-aine- ,.; 30 grammaa kohti. Se valmistetaan sekoittamalla ksylanaasipreparaatti tasaisesti sekoi- * * . · ’. tusaineen kanssa, esimerkiksi sekoitusrummussa tai vaivauslaitteessa.

I t » I t t * , Itse ksylanaasia voidaan varastoida huoneen lämpötilassa useita vuosia ilman mai- i i i i t nittavaa aktiivisuustappiota. Leivonta-aineformulaatioilla, joissa ei ole aktiivisuutta 115918 s aiheuttavia komponentteja, kuten proteaaseja, omaavat yhtä hyvän säilytettävyy-den. Vesipitoisuuden tulisi olla alle 5 %, diasetyyliviinihappoemulgaattoreiden kanssa käytettynä alle 1 paino-%.

5 Leivontamenetelmät

Hiivaleivonnaisten valmistaminen vehnäjauhosta, hiivasta, vedestä tai maidosta, rasvasta, suolasta, sokerista ja mahdollisesti muista tavallisista apuaineista ja maku-apuaineista on yleisesti tunnettua. Keksinnön mukaisen leivonta-aineen mukana-10 käyttö ei edellytä mitään muutosta tavanomaisiin leivontamenetelmiin. Hiivan kehittymiseen tarvittava taikinanlepoaika riittää ksylanaasin vaikutukseen.

Vehnäleivän ja sämpylöiden valmistamista varten leivonta-ainetta annostellaan tavallisesti niin, että 100 kg vehnäjauhoa kohti käytetään 200 - 20.000 UXyl-yksikköä.

15 Sieniksylanaaseilla annostus on ensisijaisesti välillä 1000 ja 10.000 UXyl ja bak-teeriksylanaaseilla välillä 200 ja 2000 UXyl, kulloinkin 100 jauhokiloa kohti.

ESIMERKKI

20 1. Bacillus-kantojen seulonta •; * > * Maa- tai vesinäytteistä saadut tai julkisista kantakokoelmista hankittuja B. subtilis- bakteerikantoja viljeltiin ensin 37 °C:ssa 24 - 48 tuntia indikaattori-ravintoalustalla, * : joka muodostui ravinto-agarista ja johon oli lisätty 1 % hienojakoista ksylaania. Ksy- * ,· 25 lanaasia muodostavat kannat tunnistetaan yksittäisten pesäkkeiden ympärillä olevis- i ; ta hydrolyysirenkaista. 367 tutkitusta Bacillus-kannasta noin 229 kykeni hajottamaan ksylanaasia. Nämä siirrostettiin vinopinta-agarputkiin ja käytettiin kantaviljelminä : : seuraavissa kuvatuissa kokeissa.

,, j,; 30 Kantoja viljeltiin 24 tuntia 37 °C:ssa ravistelupulloissa steriilissä vesipitoisessa ravin- , ·, toliuoksessa, joka sisälsi 6 % soijajauhoa ja 4 % ksyloosia pH-arvossa 6,0 - 6,2.

* Kiintoaineksen erottamisen jälkeen määritetään ksylanaasiaktiivisuus vesiliuoksessa ' * ’ j pH-arvossa 6,0, joka on bakteeriksylanaasin pH-optimi. Tätä varten inkuboitiin seos ta, joka sisälsi 0,75 ml ksylaaniliuosta (Nutritional Biochemical Corporation, NBC, 9 115918 0,5-prosenttinen 0,04 m Na-asetaattipuskurissa pH 6,0) ja 0,25 ml entsyymiliuosta (sopiva laimennoksena), 30 °C:ssa 15 minuuttia. Muodostuneet pelkistävät ryhmät määritettiin sen jälkeen Somogyi'n ja Nelson'in menetelmällä (Lit.: Methods in En-zymology, Academic Press New York, London 1966 Voi. VIII, s. 7). Yksi UXyl-5 aktiivisuus vastaa sitä entsyymimäärää, joka vapauttaa minuutissa 30 °C:ssa stan-dardiolosuhteissa ksylaanista pelkistäviä ryhmiä määrän, joka vastaa 1 pmoolia ksy-loosia.

Ksylanaasimäärä luetaan kalibrointikäyrästä, joka on muodostettu käyttämällä puh-10 taan ksyloosin liuosta. Entsyymiliuokset on laimennettava niin, että pää- ja sokkoar-von väliset ekstinktioerot eivät ole enempää kuin 0,25 ekstinktioyksikköä.

Kantoja, joiden ksylanaasiaktiivisuus oli vähintään 2 UXyl/ml viljelyliuosta, löydettiin 80. Toisessa valintamenetelmässä tutkittiin näiden kantojen viljelysupernatanttien 15 tilavuutta nostava vaikutus leivontatestissä. Tällöin löydettiin 8 kantaa, jotka tuotavat keksinnön mukaista ksylanaasia käyttökelpoisia määriä, kun taas muut 72 kantaa muodostavat ksylanaasia, joilla ei ole lainkaan vaikutusta tilavuuteen tai vain vähäinen määrä tai jopa tilavuutta pienentävä vaikutus.

20 Seuraavassa taulukossa on annettu ksylanaasiaktiivisuus viljelysupernatantissa kuu-: ’;': delle mainitulle kannalle ja tilavuuden kasvu leivontakokeessa (esimerkki 8).

• : : Kannan numero Ksylanaasiaktiivisuus Tilavuuden kasvu »♦ * · : * · *: (UXyl/ml) leivontakokeessa 25 RH 1225 3,5 +45% RH 1223 4,0 + 36% RH 1221 6,0 + 31 % : RH 1242 2,4 +37% » * I » RH 1205 11,3 + 8% 30 RH 1114 8,0 -10% » · ,;, Entsyymin valmistamiseen laboratoriofermenttorissa valittiin esimerkissä 1 menesty- II· ’ *' * neistä kannoista yksi kanta, jolla oli korkea ksylanaasiaktiivisuus ja joka on luettavis sa Bacillus subtilis-lajiin ja jolle on tunnusomaista hyvä tilavuuden nostokyky leivon- 10 115918 takokeessa. Tälle kannalle annettiin nimeksi RH 1221.

Kuten entsyymien kehityksessä on tavanomaista, villityyppi-kannasta selektoitiin yksi muunnos, joka oli menettänyt kyvyn itiöityä ja muodostaa proteaaseja. Tätä kantaa, 5 joka oli sovitettu tuotannon tarpeisiin, käytetään seuraavassa esimerkissä 2 entsyymin valmistamiseen.

2. Bakteeri-ksylanaasin valmistaminen laboratoriofermenttorissa.

10 Ravintoliuoksen valmistamiseen käytetään litraa kohti: 60 g soijajauhoa 40 g ksyloosia 13 g ammoniumvetyfosfaattia 15 0,5 g magnesiumsulfaatti x 7 H20:a 5 g kalsiumkarbonaattia vesijohtovedellä 1000 g:aan.

Ksyloosia lukuun ottamatta sekoitetaan ravintokomponentit yhteen. pH säädetään 20 arvoon 6,0 - 6,2. Sterilointi tapahtuu fermenttorissa 121 °C:ssa, 30 minuuttia pai-neessa. Ksyloosiliuos steriloidaan erillään ja lisätään jäähdyttämisen jälkeen.

* ; : Ensin suoritetaan esiviljely. Tätä varten siirrostetaan ravistelupulloissa 400 ml edellä mainittua ravintoliuosta esimerkin 1 mukaisesta vinopinta-agarviljelmästä saadulla :v: 25 ympillä ja inkuboidaan 10 tuntia.

Laboratoriofermenttori siirrostetaan tämän esiviljelmän sisällöllä steriileissä olosuh-: teissä. Laboratoriofermenttori täytetään 8 litralla edellä kuvattua ravintoliuosta. Esi- : ’' ’: viljelmällä siirrostamisen jälkeen sekoitetaan kierrosnopeudella 700 k/min.

30 ja ilmastetaan 52 litralla ilmaa tuntia ja litraa kohti. 20 tunnin inkubointiajan jälkeen , · · ·, 37 °C:ssa erotetaan entsyymipitoinen liuos sentrifugoimalla tai suodattamalla ja tut- ,;, kitaan sen ksylanaasiaktiivisuus.

Myös proteaasiaktiivisuus määritetään. Se voi leivontakokeessa aiheuttaa liian voi- 11 115918 makkaan taikinan pehmenemisen. Proteaasiaktiivisuuden tulisi sen vuoksi olla mahdollisimman alhainen.

Selkeytetyn fermentaatioliuoksen ksylanaasiaktiivisuudeksi mitataan 30 UXyl/g. Liu-5 os sentrifugoidaan, väkevöidään ultrasuodattamalla ja lopuksi lyofilisoidaan, jolloin saadaan jauhemainen entsyymivalmiste, jonka aktiivisuus on 1500 UXyl/g. Ksyla-naasiaktiivisuus määritetään esimerkin 1 mukaisesti.

3. Erään Bacillus subtilis-rekombinanttikannan valmistaminen 10 B. subtilis-kannasta, jonka nimitys oli RH 1321 ja jolle oli ominaista suurempi tuottoisuus kuin RH 1221:11a, preparoitiin kromosomaalinen DNA Marmur'in (Journ. Mol.

Biol, nide 3, s. 208, 1961) menetelmällä ja osittaishydrolysoitiin restriktioentsyymillä Sau3A. Syntyneiden DNA-fragmenttien kokojakaantuman maksimi oli noin 3000 -15 5000 emäsparia.

Kaupallinen pUBllO-plasmidi pilkottiin täydellisesti restriktioentsyymillä BamHI ja tehtiin yhdessä edellä mainittujen DNA-fragmenttien kanssa ligatointiseokseksi.

20 Tämä transformoitiin ksylanaasi-negatiiviseen Bac-subtilis-mutanttiin, joka oli kehi-: :tetty mutatoimalla ja selektoimalla kaupallisesta Bac-subtilis Marburg 168 Hl-•: · ·· kannasta. Transformointi suoritettiin Spizizen-menetelmällä (Proc. natl. Acad. Sei.

: 44, 1958, s. 1072). Tällöin plasmidi-DNA:n ottaneet solut selektoitiin kanamysiini- : ‘ : antibiootilla, jolloin uuden kombinanttiplasmidin pUB110-osa sisältää kanamysiini- : ‘ ‘: 25 resistenttigeenin. Selektointia varten eroteltiin transformoidut solut kanamysiiniä : ’ i': sisältävällä ravintoalustalla, joka ilmoittaa ksylanaasin muodostumisen ylimääräises tä ksylaanipitoisuudesta johtuvana samentumana.

: ’ ’ : Niistä noin 20 000 pesäkkeestä, jotka olivat tulleet kanamysiinille resistentiksi plas- 30 midin sisäänoton vuoksi, löydettiin yksi pesäke, joka ilmoitti ksylanaasin muodostu-, · *. misesta pienen hydrolyysikehän muodossa. Pesäke eristettiin, monistettiin ja erotel- tiin uudelleen kanamysiini/ksylaani-ravintoalustalla. Jatkopesäkkeillä oli kaikilla ksy-‘ laani-hydrolyysikehä.

12 115918 4. Ksylanaasi-geenin sekvensointi RH 1221 :sta

Esimerkissä 3 saadusta pesäkkeestä eristettiin noin 6 kBp suuruinen plasmidi ja tälle annettiin nimeksi pIK91. Sanger'in menetelmällä sekvensoitiin lähtöplasmidiin 5 pUBHO insertoitu, RH 1221 :sta peräisin oleva DNA. Saatu sekvenssi on annettu uudelleen kuvauksen liitteessä SEQ ID NO:l:na. 1413 emäsparista löydettiin 213 aminohapolle Open Reading Frame (proteiinia koodaava sekvenssi), joka on annettu SEQ ID NO:2:ssa.

10 5. Ekspressoidun ksylanaasin tutkiminen leivontatestissä

Esimerkin 3 mukaisesti B. subtilis Mb 168 Hiissä kloonatun bakteeriksylanaasin tutkimista varten tehtiin ravistelupullokasvatuksia ja viljelysupernatantteja verrattiin luovuttajakannan RH 1221:n ja isäntäkannan Mb 168 Hl viljelysupernatantteihin.

15 Tätä varten siirrostettiin esiviljelmät, joissa kussakin oli 5 ml Standard I-Bouillon-lientä 100 ml haitattomissa Erlenmeyer-pulloissa, ja inkuboitiin nopeudella 200 k/min. 37 °C:ssa ympyräliikkeisessä ravistelulaitteessa, jossa liikehalkaisija oli 50 mm. Keksinnön mukaisella rekombinanttikannalla Mb 168 Hl pIK91 sisältää esivil-jelmä lisäksi 10 pg/ml kanamysiiniä. Esiviljelmistä siirrostettiin kulloinkin 15 ml 20 pääviljelyalustaa (4 % laktoosi, 6 % soijajauho, 1,3 % (NH4)2HP04, 0,5 % CaC03, 0,05 5 MgS04 x 7 H20 vesijohtovedessä, pH 6,5) 100 ml haitoilla varustetuissa Er-·:· i lenmeyer-pulloissa kulloinkin 150 piillä esiviljelmää ja inkuboitiin nopeudella 200 • : .· k/min. ja 37°C:ssa ympyräliikkeisessä ravistelulaitteessa, jossa liikehalkaisija oli 50 :‘ : mm. Sen jälkeen solut sentrifugoitiin pois ja viljelyn supernatantit analysoitiin. Saa- 25 tiin seuraavia tuloksia:

Kanta UXyl pH 6 Leivontakoe : Luovuttaja RH 1221 10,6 + 29% Γ': Kanta Mb 168 Hl 0,0 0% 30 Rekombin. Mb 168 Hl pIK91 2,8 +31%

Tulosten perusteella Mb 168 Hl pIK91 tuotti leivonta-aktiivista ksylanaasia, joka i * » ‘ . vaikutukseltaan on samanarvoinen kannasta RH 1221 saadun bakteeri-ksylanaasin kanssa, mutta tuottoisuudeltaan kuitenkin alhaisempi.

13 115918 6. Ksylanaasi-tuottoisuuden parantaminen B. subtilis 168 Hl pIK 91-kannan tuottoisuus ei riitä bakteeriksylanaasin taloudelliseen tuottamiseen. Jotta saataisiin tuottokyvyltään parempi kanta, joukko korkean 5 tuottokyvyn omaavia B. subtilis-lajin ksylanaasikantoja transformoitiin Chang'in ja Cohen'in menetelmällä (Molec. gen. Genet. 168, 1979, s. 111-115) pKI91:lla. pIK 91: n sisältävät transformantit tutkittiin ksylanaasin tuottavuuden suhteen esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Jatkovertailua varten transformoitiin alfa-amylaasin tekninen tuottokanta nimeltä BS22/17 ja viljeltiin ja analysoitiin samalla tavalla.

10

Viljelysupernatanteista saatiin seuraavat ksylanaasiaktiivisuudet:

Kanta UXyl/g Plasmidittoman isäntäkannan aktiivisuus (UXyl/g) 15 RH 1321 pIK 91 15,2 10,2 RH 1308 pIK 91 19,5 6,0 RH 1330 pIK 91 57,8 8,5 BS 22/17 pIK91 2,8 3,0 20 Tämä tulos osoittaa, että rekombinanttikannan tuottoisuutta ei voi ennustaa lähtö-kannan tuottoisuudesta. Kannat, joilla oli korkea lähtötuottoisuus, olivat kaikissa *:·*: tapauksissa rekombinaation jälkeen selvästi huonompia kuin rekombinanttikanta, : ; : jolla oli alhaisempi lähtötuottoisuus.

25 7. Bakteeri-ksylanaasin valmistaminen rekombinanttikannan B. subtilis RH 1330 pIK

:T: 91 avulla i 7.1 Kannan ylläpito: Kantaviljelmä siirrostettiin viikottain vinopinnoille, inkuboitiin : ’' ’: 224 tuntia 37 °C:ssa ja säilytettiin 4 °C:ssa. Vinopinta-alustan koostumus: 30 , - * . NZ-amiini, kaseiini, hydrolysoitu entsymaattisesti ,;. (kauppanimi Sigma C 0626) 10 g/l ' . Hiivauute (kauppanimi Sigma C 0626) 5 g/l

Keittosuola 8 g/l 14 115918

Agar 10 g/l tisl. vesi pH 7,2 NaOH:lla, sterilointi 30 minuuttia 121 °C:ssa. 45 °C:een jäähdyttämisen jäl-5 keen lisätään 10 mg/l kanamysiiniä ja valetaan heti petrimaljoille.

7.2 Esiviljelmä: 1 litran estolevyillä varustetut Erlenmeyer-pullot täytetään 100 ml:lla ravintoliuosta, jolla on seuraava koostumus: 10 NZ-amiini, kaseiini, hydrolysoitu entsymaattisesti (kauppanimi Sigma C 0626) 10 g/l

Hiivauute (kauppanimi Sigma C 0626) 5 g/l

Keittosuola 8 g/l 15 pH 7,2 NaOH:lla; sterilointi 30 minuuttia 121°C:ssa. 45°C:een jäähdyttämisen jälkeen lisätään 10 mg/l kanamysiiniä. Ravintoliuos siirrostetaan kantoviljelmällä 9.1 ja ravistellaan 16 tuntia 37 °C:ssa.

7.3 Esifermenttori: 8 I kohdassa 7.2 käytettyä ravintoliuosta siirrostetaan 500 mklla 20 esiviljelmää 7.2. Viljelyolosuhteet: 37 °C, ilmastus 4,8 Ι/min., sekoitus 700 k/min. 8 : ’:': tuntia.

: 7.4 Pääfermenttori: 100 I ravintoliuosta: • · 25 Soijajauho 80 g/l :T: Laktoosi 60 g/l

Diammoniumvetyfosfaatti 10 g/l i :': Magnesiumsulfaatti x 7 H20 0,5 g/l : ’' : kalsiumkarbonaatti 5 g/l 30 , · · ·, pH = 5,8 - 6,0, sterilointi 30 minuuttia 121 °C:ssa. 5 I esifermenttorin viljelyliuosta , , 9.3 siirrostetaan 37 °C:ssa. Viljelyolosuhteet: 37 °C, ilmastus 60 Ι/min., sekoitus 600 I I * • ’ k/min. 30 tuntia. Viljelyliuos selkeytetään tämän jälkeen suodattamalla ja erottamal la. Suodos eli supernatantti väkevöidään ultrasuodattamalla ja lyofilisoidaan. Saa 15 115918 daan noin 800 g lyofilisaattia, jonka aktiivisuus on 15 0000 UXyl/g.

8. Leivontakoe 5 100 paino-osasta jauhoa, 2 paino-osasta suolaa, 3 paino-osasta leivinhiivaa, 58 - 60 paino-osasta vettä ja 40 - 50 ppm:stä (laskettuna taikinan painosta) askorbiinihap-poa valmistettiin taikina spiraalivaivaimessa (valmistaja Kemper) 2 - 3 minuuttia alhaisemmalla nopeudella I ja 3 - 4 minuuttia korkeammalla nopeudella II. Taulukossa annetut entsyymimäärät lisättiin veteen ennen vaivaamisen aloittamista.

10 Vertailuna esimerkin 7 mukaisesti valmistetun bakteeri-ksylanaasin kanssa käytettiin jo mainittua ksylanaasipitoista entsyymiseosta. Taikinan lämpötila oli 25 - 27 °C. 20 minuutin taikinan lepoajan jälkeen taikina jaettiin vapaasti nousseen vehnäleivän valmistamiseksi 350 g paloiksi, muotoiltiin, nostatettiin 65 minuuttia 32 °C:ssa ja 80 % suhteellisessa ilman kosteudessa ja paistettiin 30 minuuttia 230 °C:ssa. Seuraa-15 vassa taulukossa on annettu leivän tilavuus eri entsyymin käyttömäärillä: ilman entsyymiä 1264 - 1296 cm3

Kaupasta saatavissa oleva leivontaentsyymi: 20 ; _:': 1500 UXyl/100 kg jauho 1304 cm3 •: · ·: 3000 UXyl/100 kg jauho 1304 cm3 : : ‘: 4500 UXyl/100 kg jauho 1372 cm3 Γ**: 25 Keksinnön mukainen esimerkin 7 mukainen bakteeri-ksylanaasi: • · · • > * 1500 UXyl/100 kg jauho 1392 cm3 i t: | 3000 UXyl/100 kg jauho 1468 cm3 :" ]: 4500 UXyl/100 kg jauho 1484 cm3 30 .·*·. Tämän mukaisesti keksinnön mukaisilla bakteeri-ksylanaaseilla voidaan saavuttaa .. kaupasta saatavissa olevan leivontaentsyymin ominaisuudet ja jopa ylittää ne.

t » I > » · ► I *s » * * 115918 16 SEQ 10 NO: 1

Ί GGATCGTGACGGTCGGCTTGTCCGTTCTCGGTATCGTTCTTTTCATTGTC CTCATGACGCTCGGCATCGTGGACGACGCGTTTAATAATATTGATGCCAA Aoi TACATATTAAAAAGGAAAATCCCGGCGCATCCGCCCGGGATTTTTTCTTA TTCCGCTTCTCCGACAACGGTAAAGTTTTTCTGCTTTGGATTTGCCAATA ZH CGGCGGCGAACAGCATTGACGTTGTATGCAGATATTCTTTCGACAAAAAA GTTTTTTCAAATAAAACGTTTCCTCAGAGTTTCAACTGAAATCACTCAGT 3i(. TCTGCGAAATAAAACTATGGCGGTACAAGACCACTCATCATACAATTTTT TGGGTCTTTGTAATTAAATTACAATTGTTCTTAATATTCACCCATGTATT

fai Catgctattatattgaaaggaacgatcaaaagcgttggcgttcgttaaat

ATTTACGAGTGCTGCCTCATGTCAAAGTCAGAAAAAATAGTATAGGAGGT Jor AACATATGTTTAAGTTTAAAAAGAAATTCTTAGTGGGATTAACGGCAGCT TTCATGAGTATCAGCATGTTTTCGGCAACCGCCTCTGCAGCTGGCACAGA ie/ TTACTGGCAAAATTGGACTGACGGGGGCGGGACAGTAAACGCAGTCAATG GCTCTGGCGGAAATTÄCAGTGTTAATTGGTCTAATACCGGGAATTTCGTT 7o/ GTTGGTAAAGGCTGGACTACAGGCTCGCCATTTAGAACAATAAACTATAA TGCCGGTGTTTGG0CGCCGAATGGOAATGGATATTTGACTTTATATGGCT fof GGACGAGATCGCCCCTCATCGAATATTATGTGGT.GGATTCATGGGGTACT TACAGACCTACCGGAACGTATAAAGGTACCGTAAAGAGTGATGGAGGTAC ?«»/ ATATGACATATATACAACGACACGTTATAACGCACCTTCCATTGATGGCG

, ..: ATAACACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTCCGCCAGTCGAAGAGACCG

. foe·/ ACCGGAAGCAACGCTGCAATCACTTTCAGCAATCATGTTAACGCATGGAA

: GAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTATCAAGTCTTAGCGA

« « t .

: y-'Oi CAGAAGGATATAAAAGCAGCGGAAGTTCTAATGTAACAGTGTGGTAACAG

I’V CTCATCTCTAATGAGGGGCAGCTAACGGGCTGCTGATCGTTCCTTGAGAA

:T: //2ci ATTTTATAATGATTGTGAAGAGGCGAACGGTTTTGGCATTACCGGAGGCA

GGATATTCTCCATCAGTTTTTTTAGCGCGTATTAAAATAAGAGTTCCGTC : //loi TTTTTTTGGTAACCCGCTTACAACAGACACCTTCACATAAGCCTTAAGCA

*’;;. J AAAT AAAAAT ATCCCGGTT ACC ACCTCCTTT AGTTTCGGAGGTTTTCTTC

' *; · ‘ JHoi ATTAAACAGATCC

t * |7 115918 SEQ IS NO: 2 506/1 536/11

ATG TTT AAG TTT AAA AAG ΛΛΛ TTC TTA GTG GGA ΤΤΛ ACG GCA GCT TTC ATG AGT ATC AGO

Met phe lys phe lys lys lys phe leu val gly leu thr ala ala, phe met ser ile ser 566/21 ' - 596/31

ATG TTT TCG GCA ACC GCC TCT GCA GCT GGC ACA GAT TAC TGG CAA ΛΛΤ TGG ACT GAC GGG

met phe ser ala thr ala scr ala ala gly thr asp tyr trp gin asn trp thr asp gly 626/41 656/51 GGC GGG ACA GTA AAC GCA GTC ΛΛΤ GGC TCT GGC GGA ΛΛΤ TAC AGT GTT ΑΛΤ TGG TCT ΛΑΤ gly gly thr vai asn ala val asn gly ser gly gly asn tyr ser val asn trp ser asn 606/61 . 716/n

ACC GGG ΛΛΤ TTC GTT GTT GGT AAA GGC TGG ACT ACA GGC TCG CCA TTT AGA ACA ΑΤΑ AAC

thr gly asn phe val val gly lys gly trp thr thr gly ser pro phe arg thr ile asn 746/01 . 776/91

TAT ΛΛΤ GCC GGT GTT T'GG GCG CCG ΛΛΤ GGC ΛΛΤ GGA TAT TTG ACT TTA TAT GGC TGG ACG

tyr asn al'i-gly val. trp. ala pro asn gly asn gly tyr leu thr leu tyr gly trp thr 006/101 . ’ . 036/111

AGA TCG CCC CTC ATC GAA. TAT TAT GTG GTG GAT TCA TGG GGT ACT TAC AGA CCT ACC GGA

arg ser pro leu ile glu tyr tyr vai vai asp scr tr? gly thr tyr arg pro thr gly 866/121 896/131

ACG TAT AAA GGT ACC GTA AAG AGT CAT GGA GGT ACA TAT GAC ΑΤΛ TAT ACA ACG ACA CGT

thr tyr lys gly thr val lys ser asp gly gly thr tyr asp lie tyr thr thr thr arg 926/141 ·_ 956/151

TAT AAC GCA CCT TCC ATT GAT GGC GAT AAC ACT ACT TTT ACG CAG TAC TGG AGT GTC CGC

tyr asn ala pro ser ile asp gly asp asn thr thr phe thr gin tyr trp ser val arg 906/161 1016/171

CAG TCG AAG AGA CCG ACC GGA ACC AAC GCT GCA ATC ACT TTC AGC ΛΛΤ CAT GTT AAC GCA

gin scr lys arg pro thr gly ser asn ala ala ile thr phe ser asn his val asn ala 1046/101 1076/191

TGG AAG AGC CAT GGA ATG ΛΛΤ CTG GGC AGT ΛΛΤ TGG GCT TAT CAA GTC TTA GCG ACA GAA

trp lys . ser his gly rr.et asn leu gly-ser asn trp ala tyr gin val-.leu ala thr glu V * 1106/201 1136/211 ·..·· GGA TAT AAA AGC AGC GGA AGT TCT ΛΛΤ GTA ACA GTG TGG ΤΛΛ

gly tyr lys ser ser gly ser ser asn vai thr vai trp OCH

• · · » * *

t I

< * »

Claims (13)

115918

1. Bakteeri-ksylanaasi, tunnettu siitä, että se voidaan valmistaa ekspressoimalla SEQ ID NO:2:n mukainen rakennegeeni. 5

2. Bakteeri-ksylanaasi, tunnettu siitä, että se voidaan valmistaa ekspressoimalla plasmidin genomi, joka on tallennusnumerolla DSM 7147 tallennetussa Bacillus sub-tilis:ssa.

3. Plasmidi pIK 91, joka on tallennusnumerolla DSM 7147 tallennetussa Bacillus sub- tilis:ssa ja johon on koodattu SEQ ID NO:2:n rakennegeeni, tähän kuuluva Leader-peptidisekvenssi sekä geenin Bacillus subtilis:ssa ekspressoimiseen tarvittavat DNA-sekvenssit.

4. Bakteeri-ksylanaasia tuottava bakteerikanta, erityisesti Bacillus subtilis-lajiin kuu luva, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO:2:n mukaisen rakennegeenin.

5. Bakteeri-ksylanaasia tuottava bakteerikanta, erityisesti Bacillus subtilis-lajiin kuuluva, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen plasmidin. 20

: : : 6. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista bakteeri-ksylanaasia, ·:· : tunnettu siitä, että viljellään tavalliseen tapaan bakteeria, joka sisältää SEQ ID : : : NO:2:n mukaisen rakennegeenin, ja muodostunut bakteeri-ksylanaasi otetaan tali’ * ’: teen viljelysuodoksesta. 25 * > :T:

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään taval liseen tapaan bakteeria, joka sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen plasmidin, ja i : : muodostunut bakteeri-ksylanaasi otetaan talteen viljelysuodoksesta.

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään , · · *, Bacillus-suvun bakteeria. 1. t > I I » ' .

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Ba- i · cillus subtilis-lajin bakteeria. 115918

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Bacillus subtilis'ia, jonka tallennusnumero on DSM 7147.

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen bakteeri-ksylanaasin käyttö hiivalla nosta-5 tettujen leivän ja leivonnaisten valmistamiseen.

12. Hiivalla nostatettujen leivän ja leivonnaisten valmistamiseen tarkoitettu leivonta-aine, joka sisältää tavanomaisia leivontaemulgaattoreita sekä vähintään yhtä leivon-taentsyymiä, tunnettu siitä, että se sisältää leivontaentsyyminä patenttivaatimuk- 10 sen 1 tai 2 mukaista bakteeri-ksylanaasia.

13. Leivontamenetelmä hiivalla nostatettujen leivän ja leivonnaisten valmistamiseksi jauhosta, vedestä ja muista tavanomaisista leivonta-apuaineista valmistamalla ja paistamalla taikina, tunnettu siitä, että taikinaan työstetään patenttivaatimuksen 1 15 tai 2 mukaista bakteeri-ksylanaasia. 1 * * * » • · » • · · I I « • » * » » I t t · i * i .· I . * 1 1 M » * > * * » * t 115918