CN110724645A - 一种毕赤酵母突变菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体提供了一种毕赤酵母突变菌株及其应用。所述毕赤酵母的保藏编号为CCTCC NO:M2018374。所述毕赤酵母突变菌株能高效重组表达木聚糖酶，其发酵液的木聚糖酶酶活高达6744U/mL，比突变前提高了79%，且突变后重组表达的木聚糖酶的酶学性质并未因突变发生变化，最适作用pH均为2.5‑6，最适作用温度均为80℃。所述毕赤酵母突变菌株重组表达的木聚糖酶具有很高的酶活性，可广泛应用于低聚木糖生产领域。

Description

一种毕赤酵母突变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母突变菌株及其应用。

背景技术

低聚木糖也称木寡糖，由2～7个D-木糖以β-1，4糖苷键结合而成，以木二糖和木三糖为主。低聚木糖具有良好的生理学特性,主要表现在以下几方面:

(1)显著的双歧杆菌增殖能力。低聚木糖有明显的双歧杆菌增殖作用，而且除青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌外，大多数肠道菌对低聚木糖的利用都比较差。低聚木糖是目前发现有效用量最少的低聚糖。实验表明，每天只需口服 0.7g，2周后大肠杆菌中的双歧杆菌的比例从8.9%增加到17.9%，而拟杆菌(可能的致病菌)则从52.6%减少到44.4%；3周后，双歧杆菌的比例增加到20.2%，拟杆菌降至32.9%。

(2)不被消化特性。与其他的低聚糖相比，木二糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，且代谢不依赖胰岛素，可满足患有诸如糖尿病、肥胖病和高血脂症等特殊人群的需要。另外，与某些低聚糖产品含有可消化性单糖相比，他的主要伴随成分为木糖，略有特殊气味，具爽口甜味，也是一种不消化单糖，因此可不采用色谱分离技术进行分离纯化，普通浓度的低聚木糖产品就能满足食品加工的要求，同时又降低了生产成本。

(3)无龋齿性。低聚木糖不能被口腔内变异链球菌等细菌分解成粘着性的单糖如葡萄糖、果糖、半乳糖等，与蔗糖并用时能阻止蔗糖被龋齿病原菌作用而生成水不溶性的高分子葡聚糖(牙垢)，因此无龋齿性并具有抗龋齿性，适合作为儿童食品的甜味添加剂。

(4)促进人体对钙的吸收。摄入低聚木糖后，大鼠对钙的消化吸收率可提高23%，体内钙的保留率提高21%。因此低聚木糖可作为开发孕妇、老年食品的理想原料。

酶水解法（含物理或化学-酶联合法）是目前工业化生产低聚木糖的主要方法。木聚糖酶是可将木聚糖降解成木糖和低聚糖的一类酶的总称，通常所说的木聚糖酶即内切β-1,4-木聚糖酶，内切β-1,4-木聚糖酶作用于木聚糖主链，随机切开木聚糖内部的木糖苷键，将其分解为低聚糖。不同来源木聚糖酶的组成和性质不完全相同，但理化性质存在相似性，如相对分子质量在0.8万-14.5万、pH 在3-10 范围内稳定，最适范围为4-7；不同来源木聚糖酶等电点在3-10；不同来源的木聚糖酶氨基酸组成相差不大等。

自然界的木聚糖酶具有丰富的多样性，野口等人用纸浆漂白用的芽孢杆菌木聚糖酶来制备低聚木糖；荒木等用产碱杆菌（Alcaligenes）生产的β-1，3-木聚糖酶来酶解木聚糖；法国 Patrice等用梭状芽孢杆菌（Clostridium）的木聚糖酶从玉米芯制备低聚木糖，等等。虽然目前开发的可应用于低聚木糖生产的木聚糖酶种类很多，但普遍存在酶活水平低的问题，导致木聚糖酶的生产成本仍处于较高水平，限制了木聚糖酶在低聚木糖生产中的广泛应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种毕赤酵母突变菌株。所述毕赤酵母突变菌株是由构建得到的毕赤酵母工程菌在多次发酵过程中发生自然突变获得的，能大幅度提高木聚糖酶的表达量，且不影响木聚糖酶原有的酶学性质。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，所述菌株携带有用于重组表达木聚糖酶基因的重组质粒。

所述木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株毕赤酵母XN2（Pichia pastoris XN2），已于2018年6月15日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018374。

本发明还提供了所述毕赤酵母突变株在生产木聚糖酶中的应用。

本发明提供的毕赤酵母突变菌株XN2是由构建得到的毕赤酵母工程菌XN在多次发酵过程中发生自然突变获得的，能高效重组表达木聚糖酶，其发酵液中木聚糖酶酶活高达6744U/mL，比突变前提高了79%，且该突变菌株重组表达的木聚糖酶的酶学性质并未因突变发生变化，最适作用pH均为2.5-6，最适作用温度均为80℃。所述突变菌株能有效降低木聚糖酶的生产成本，从而有利于加快木聚糖酶在低聚木糖生产领域中的普遍应用。

附图说明

图1为突变前后毕赤酵母菌株发酵液中木聚糖酶相对酶活-pH变化曲线；

图2为突变前后毕赤酵母菌株发酵液中木聚糖酶相对酶活-温度变化曲线；

图3为突变前后毕赤酵母菌株的发酵进程曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J. 萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

实施例1：重组质粒的构建

申请人首先根据毕赤酵母密码子偏好性对木聚糖酶基因序列进行密码子优化，在第1个氨基酸密码子前增加6个碱基GAATTC（EcoR I酶切位点），在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC（Not I酶切位点），并由上海捷瑞公司合成，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

用限制性内切酶EcoR I和Not I（Fermentas）对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌（Transgen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen）。

使用质粒小量制备试剂盒（Axygen）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。从而说明重组质粒构建成功，命名为pPIC9K-XN。

实施例2：毕赤酵母工程菌株的构建

将重组质粒pPIC9K-XN用Sal I进行线性化，质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-XN，再在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

挑取单个转化子转接于BMGY培养基中，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，再转入BMM培养基中30℃ 250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达4 d后，离心去除菌体，得到含木聚糖酶的上清液，粗酶液经SDS-PAGE电泳检测，显示木聚糖酶的大小为40 kDa左右，测定木聚糖酶的活力，测定摇瓶水平木聚糖酶的表达量达到206U/ml，说明毕赤酵母工程菌株构建成功，命名为毕赤酵母XN（Pichia pastoris XN）。

（1）酶活单位的定义

在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5 mg/ml的木聚糖溶液中释放1 μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

（2）测定方法

取2 ml浓度为1%的木聚糖底物（pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制），加入到比色管中，37℃平衡10 min，再加入2 ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30 min。反应结束后，加入5 ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5 min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25 ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光值AE。

酶活计算公式：

XD=

式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2 g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1 mmol=1000 μmol。

实施例3：发酵放大

在20L发酵罐上进行毕赤酵母工程菌株XN的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1 g/L、磷酸二氢钾5.5 g/L、磷酸二氢铵55 g/L、硫酸钾20.3 g/L、硫酸镁16.4 g/L、氢氧化钾1.65 g/L、消泡剂0.05%。

发酵生产工艺：pH值5.0、温度25℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养24-26 h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60 min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在160 h左右。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液，并检测粗酶液中木聚糖酶酶活。结果显示，毕赤酵母XN最终的发酵酶活为3758 U/ml。

实施例4：毕赤酵母突变菌株的获得

申请人以上述构建得到的毕赤酵母XN为生产菌株，自2017年9月开始进行放大生产，至2018年5月共正常生产了24个批次，各批次发酵酶活基本稳定在3700-3800 U/ml左右。

2018年6月，申请人以毕赤酵母XN进行第25批次发酵生产时发现，发酵结束后，发酵液中木聚糖酶的酶活高达5100 U/ml，显著高于之前24个批次的发酵酶活，取得了意料不到的效果。

申请人取第25批次的发酵液涂布LB平板，30℃培养48h。将平板上长出的单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMM培养基，30℃ 250rpm振荡培养2 d，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2 d后，离心去除菌体，得到含木聚糖酶的上清液，测定木聚糖酶的活力，以原始菌株毕赤酵母XN为对照，分离筛选出一株木聚糖酶活力得到显著提高的突变菌株，命名为毕赤酵母XN2。所述毕赤酵母XN2是原始菌株毕赤酵母XN在发酵过程中发生自然突变获得的。

申请人进一步将毕赤酵母XN2进行摇瓶发酵（方法参照实施例2），并以原始菌毕赤酵母XN为对照。发酵结束后，测定发酵上清液中木聚糖酶的酶活力。结果显示，突变菌株毕赤酵母XN2发酵上清液中木聚糖酶酶活高达301U/ml，比原始菌毕赤酵母XN提高了46%。

实施例5：毕赤酵母突变株重组表达木聚糖酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的缓冲液，将上述原始菌毕赤酵母XN和突变菌毕赤酵母XN2的发酵上清液分别进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，原始菌毕赤酵母XN和突变菌毕赤酵母XN2重组表达的木聚糖酶相对酶活-pH变化曲线基本相同，最适作用pH均为2.5-6。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，pH5.5条件下，测定上述原始菌毕赤酵母XN和突变菌毕赤酵母XN2的发酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，原始菌毕赤酵母XN和突变菌毕赤酵母XN2重组表达的木聚糖酶相对酶活-温度变化曲线基本相同，最适作用温度均为80℃。

综上所述，本发明构建的原始菌株毕赤酵母XN在发酵过程中发生自然突变获得的突变菌株毕赤酵母XN2重组表达的木聚糖酶，其酶学性质与突变前相同，最适作用pH均为2.5-6，最适作用温度均为80℃。

实施例6：毕赤酵母突变株的高效表达

在20L发酵罐上进行原始菌毕赤酵母XN和突变菌毕赤酵母XN2的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1 g/L、磷酸二氢钾5.5 g/L、磷酸二氢铵55 g/L、硫酸钾20.3 g/L、硫酸镁16.4 g/L、氢氧化钾1.65 g/L、消泡剂0.05%。

发酵生产工艺：pH值5.0、温度25℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养24-26 h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60 min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在160 h左右。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

通过测定发酵过程中不同时间点发酵液中木聚糖酶活力，可得发酵进程曲线。结果如图3所示，发酵65h后，本发明所述突变菌毕赤酵母XN2的发酵液酶活开始显著高于原始菌毕赤酵母XN；发酵结束时，突变菌毕赤酵母XN2的最终发酵酶活高达6744 U/ml，比原始菌提高了79%，取得了意料不到的技术效果。而且，该突变菌株经多次传代后， 20L罐发酵产酶水平基本维持在6700-6800 U/ml的范围内，稳定性较好。

申请人已于2018年6月15日将突变菌株毕赤酵母XN2（Pichia pastoris XN2）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018374。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种毕赤酵母突变菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 383

<212> PRT

<213> Rasamsonia byssochlamydoides

<400> 1

Asp Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Phe Gly

1 5 10 15

Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Ser Asp Val Ala Tyr Glu Thr Gln

20 25 30

Leu Asn Asn Thr Gln Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly Asn Ser Met

35 40 45

Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Glu Gln Asn Thr Phe Thr Phe Ala Ala

50 55 60

Gly Asp Gln Ile Ala Asp Leu Ala Glu Ala Asn Gly Gln Ile Leu Arg

65 70 75 80

Cys His Asn Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu Pro Ser Trp Val Thr Ser

85 90 95

Gly Ser Trp Thr Asn Glu Thr Leu Leu Ala Ala Met Gln Asn His Ile

100 105 110

Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Gln Cys Tyr Ala Trp Asp Val

115 120 125

Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr Tyr Arg Asp Asn Val Phe

130 135 140

Tyr Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Ala Thr Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ala Asp Pro Asn Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile

165 170 175

Glu Tyr Ala Gly Val Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile Val Lys Leu

180 185 190

Val Gln Ser Tyr Gly Ala Arg Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ser His

195 200 205

Phe Ile Val Gly Glu Thr Pro Ser Thr Ser Thr Gln Ala Ser Asn Met

210 215 220

Ala Ser Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp

225 230 235 240

Ile Arg Met Gln Leu Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Thr Gln Gln Ser

245 250 255

Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Val Gln Ala Cys Val Asn Thr Pro Arg Cys

260 265 270

Val Gly Ile Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro

275 280 285

Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Asp Ala Cys Pro Trp Asp Asp Asn Tyr

290 295 300

Gln Lys Lys Pro Ala Tyr Tyr Gly Ile Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

Ala Ser Thr Thr Thr Val Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ala

325 330 335

Thr Thr Thr Ser Thr Gly Ser Ser Gly Thr Gly Val Ala Gln His Trp

340 345 350

Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser

355 360 365

Gly Tyr Thr Cys Thr Val Val Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

370 375 380

<210> 2

<211> 1152

<212> DNA

<213> Rasamsonia byssochlamydoides

<400> 2

gacggtttga acactgctgc taaggctatc ggtaagctgt acttcggtac tgctactgac 60

aacccagaat tgtccgacgt tgcttacgag actcagttga acaacactca ggacttcggt 120

cagatcactc caggtaactc tatgaagtgg gacgctactg aaccagagca gaacactttt 180

actttcgctg ctggtgacca gatcgctgat ttggctgaag ctaacggtca gattctgaga 240

tgccacaacc tggtttggta caaccagttg ccttcttggg ttacttctgg ttcctggacc 300

aacgagactt tgttggctgc tatgcagaac cacatcacca acgttgttac ccactacaag 360

ggtcagtgtt acgcttggga cgttgttaac gaagctttga acgacgacgg tacttacaga 420

gacaacgtgt tctaccagta catcggtgag gcttacatcc caatcgcttt tgctacagct 480

gctgctgcag atccaaacgt caagttgtac tacaacgact acaacatcga gtacgccggt 540

gttaaggcta ctgctgctca aaacatcgtt aagctggtcc aatcctacgg tgctagaatt 600

gacggtgttg gtctgcagtc tcacttcatc gttggtgaaa ctccatccac ttccactcag 660

gcttctaaca tggcttcctt cactgctttg ggtgttgagg ttgctatcac cgagttggac 720

atcagaatgc agttgccaga gactactgct ttgttgactc aacagtccac tgactaccaa 780

tccactgttc aggcttgtgt caacacccca agatgtgttg gtatcactat ctgggactgg 840

accgacaagt actcttgggt tccatctact ttctccggtt acggtgatgc ttgtccatgg 900

gatgacaact accaaaagaa gccagcctac tacggtatct tgactgctct tggtggatcc 960

gcttccacta ctactgttgg tactggtact actactacct ccactgctac aactacttct 1020

actggttctt ccggtactgg tgttgctcaa cattggggtc aatgtggtgg tattggttgg 1080

actggtccaa ctgtttgtgc ttccggttac acctgtactg tcgtcaaccc ttactactcc 1140

cagtgtttgt aa 1152

Claims (7)

1.一种毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌株携带有用于重组表达木聚糖酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的木聚糖酶，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.如权利要求3所述的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌株的保藏编号为CCTCC NO: M2018374。

5.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株在生产木聚糖酶中的应用。

6.权利要求4所述的毕赤酵母突变菌株在生产木聚糖酶中的应用。

7.一种生产木聚糖酶的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或4所述的菌株发酵生产木聚糖酶。

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