CN110724646A

CN110724646A - 一种毕赤酵母菌株及其在木聚糖酶生产中的应用

Info

Publication number: CN110724646A
Application number: CN201810775085.9A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 赵凯; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2020-01-24

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体提供了一种毕赤酵母突变菌株及其在木聚糖酶生产中的应用。所述毕赤酵母的保藏编号为CCTCC NO:M2018375。所述毕赤酵母突变菌株能高效重组表达木聚糖酶，其摇瓶发酵上清液中木聚糖酶酶活高达146 U/ml，比出发菌提高了67.8%；20L罐发酵上清液中木聚糖酶酶活高达813 U/mL，比出发菌提高了62%，取得了意料不到的技术效果。

Description

一种毕赤酵母菌株及其在木聚糖酶生产中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母菌株及其在木聚糖酶生产中的应用。

背景技术

木聚糖是自然界中的一种丰富的再生资源，是最具代表性的半纤维素，占半纤维素的1/3～1/2，是除纤维素外，自然界中最丰富的多糖。与纤维素相比，半纤维素更易被微生物降解转化，降解产物木糖在酶的作用下可转变为乙醇。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，通过水解木糖分子β-1, 4-糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖和木二糖等低木聚糖，及少量木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶的应用方面，饲料行业是较早应用的领域，可破碎植物细胞壁，增殖肠道内的双歧杆菌，促进畜禽对饲料的吸收率；食品工业中，利用木聚糖酶提高面团的柔软性和拉力，从而改善产品的质地。在酿酒工业中，木聚糖酶一方面可作用于谷物细胞壁中的木聚糖，加快淀粉酶的作用，提高发酵度，另一方面利用木聚糖酶作用于半纤维素层，降低发酵液粘度，改善啤酒口感和清亮度；另外，木聚糖酶在医药、纺织工业、洗涤等行业中也有广泛的应用。

我国是啤酒生产大国，啤酒业对国民经济的发展有重要影响。啤酒生产原料中由于β-葡聚糖和木聚糖含量较高，造成麦汁过滤困难，酒液混浊，啤酒滤膜堵塞等问题。为解决这些问题需要大量的资金和技术投入，这样就增加了啤酒的生产成本。而木聚糖酶可以和β-葡聚糖酶协同作用，从而解决滤膜堵塞问题，可提高酒液的澄清度，降低酿酒成本。对酒液的澄清，目前研究较多的是自然静置、过滤、加悬浮澄清剂等物理过滤方法，添加絮凝澄清助剂等，并且在加入过程中用量或时间控制不当会严重影响澄清效果，而且除了会影响酒体本身的稳定性外，还会带来新的不稳定的因素；对于目前应用的多种过滤机还需经常更换过滤材料，费时、费力，并且严重影响产品的质量和产量。而一些酶制剂的应用，由于其活化前处理工艺复杂，成本偏高，澄清效果也未达到理想状态。木聚糖酶应用于酒液澄清是一个有潜在应用价值的研究方向。但目前现有的木聚糖酶生产菌株产量普遍偏低，导致木聚糖酶的生产成本较高，限制了其在啤酒生产中的广泛应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种毕赤酵母突变菌株。所述毕赤酵母突变菌株是由构建得到的毕赤酵母工程菌经紫外诱变获得的，其能大幅度提高木聚糖酶的表达量，且不影响木聚糖酶原有的酶学性质。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，所述菌株携带有用于重组表达木聚糖酶基因的重组质粒。

所述木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株毕赤酵母XL2（Pichia pastoris XL2），已于2018年6月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018375。

本发明还提供了所述毕赤酵母突变株在生产木聚糖酶中的应用。

本发明通过紫外筛选获得突变菌株毕赤酵母XL2能高效重组表达木聚糖酶，其摇瓶发酵上清液中木聚糖酶酶活高达146 U/ml，比出发菌提高了67.8%；20L罐发酵上清液中木聚糖酶酶活高达813 U/mL，比出发菌提高了62%，取得了意料不到的技术效果。而且，与出发菌相比，突变菌株毕赤酵母XL2重组表达的木聚糖酶的酶学性质并未发生变化，最适作用pH均为3-7，最适作用温度均为60℃。所述突变菌株毕赤酵母XL2可广泛应用于木聚糖酶的生产，有利于显著降低该酶的生产成本，进而促进该酶在啤酒生产领域中的广泛应用。

附图说明

图1：出发菌和突变菌毕赤酵母XL2发酵上清液pH-相对酶活曲线；

图2：出发菌和突变菌毕赤酵母XL2发酵上清液温度-相对酶活曲线；

图3：出发菌和突变菌毕赤酵母XL2发酵进程曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

实施例1：重组质粒的构建

申请人首先根据毕赤酵母密码子偏好性对木聚糖酶基因序列进行密码子优化，在第1个氨基酸密码子前增加6个碱基GAATTC(EcoR I酶切位点)，在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC(Not I酶切位点)，并由上海捷瑞公司合成，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

用限制性内切酶EcoR I和Not I(Fermentas)对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。

使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。从而说明重组质粒构建成功，命名为pPIC9K- XL。

实施例2：毕赤酵母工程菌株的构建

将重组质粒pPIC9K-XL用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/ pPIC9K-XL，再在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

挑取单个转化子转接于BMGY培养基中，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，再转入BMM培养基中30℃ 250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达4 d后，离心去除菌体，得到含木聚糖酶的上清液，粗酶液经SDS-PAGE电泳检测，显示木聚糖酶的大小为40 kDa左右，测定木聚糖酶的活力，测定摇瓶水平木聚糖酶的表达量达到87U/ml，说明毕赤酵母工程菌株构建成功，命名为毕赤酵母XL（Pichia pastoris XL）。

（1）酶活单位的定义

在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5 mg/ml的木聚糖溶液中释放1 μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

（2）测定方法

取2 ml浓度为1%的木聚糖底物（pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制），加入到比色管中，37℃平衡10 min，再加入2 ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30 min。反应结束后，加入5 ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5 min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25 ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光值AE。

酶活计算公式：

X_D=

式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；A _E为酶反应液的吸光度；A _B为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C₀为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2 g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1 mmol=1000 μmol。

实施例3：毕赤酵母XL的诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母XL为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其木聚糖酶的产量。

将毕赤酵母XL接种于YPD平板，30℃培养2-3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁶个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板。30℃培养48h。

第一轮紫外诱变共获得了约360个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMM培养基，30℃ 250rpm振荡培养2 d，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2 d后，离心去除菌体，得到含木聚糖酶的上清液，测定木聚糖酶的活力，以出发菌XL为对照，筛选出发酵酶活力得到显著提高的突变菌株。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中木聚糖酶的酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了15轮诱变筛选，最终获得3株木聚糖酶产量显著高于出发菌的突变菌株，分别命名毕赤酵母XL1，XL2，XL3。

将上述筛选获得的3株突变菌XL1，XL2，XL3分别转接于BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养1 d后，再转入BMM培养基中，30℃，250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇；诱导表达4 d后，离心去除菌体，得到发酵上清液；将发酵上清液进行木聚糖酶酶活检测。结果显示，上述突变菌株中毕赤酵母XL2发酵上清液酶活最高，达到146U/ml，比出发菌毕赤酵母XL提高了67.8%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2018年6月15日将突变菌株毕赤酵母XL2（Pichia pastoris XL2）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018375。

实施例4：木聚糖酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的缓冲液，将上述出发菌毕赤酵母XL和突变菌毕赤酵母XL2的发酵上清液分别进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，出发菌毕赤酵母XL和突变菌毕赤酵母XL2重组表达的木聚糖酶相对酶活-pH变化曲线基本相同，最适作用pH均为3.5-6.5。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，pH5.5条件下，测定上述出发菌毕赤酵母XL和突变菌毕赤酵母XL2的发酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，出发菌毕赤酵母XL和突变菌毕赤酵母XL2重组表达的木聚糖酶相对酶活-温度变化曲线基本相同，最适作用温度均为70℃。

综上所述，本发明通过紫外筛选获得的突变菌株XL2重组表达的木聚糖酶，其酶学性质与突变前相同，最适作用pH均为3.5-6.5，最适作用温度均为70℃。

实施例5：发酵放大

在20L发酵罐上进行出发菌毕赤酵母XL和突变菌毕赤酵母XL2的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1 g/L、磷酸二氢钾5.5 g/L、磷酸二氢铵55 g/L、硫酸钾20.3 g/L、硫酸镁16.4 g/L、氢氧化钾1.65 g/L、消泡剂0.05%。

发酵生产工艺：pH值5.0、温度25℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养24-26 h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60 min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在160 h左右。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

通过测定发酵过程中不同时间点发酵液中木聚糖酶活力，可得发酵进程曲线。结果如图3所示，发酵50h后，本发明所述突变菌毕赤酵母XL2的发酵液酶活开始显著高于出发菌；发酵结束时，出发菌毕赤酵母XL的最终发酵酶活为501 U/ml，而突变菌毕赤酵母XL2的最终发酵酶活高达813 U/ml，比出发菌提高了62.3%，取得了意料不到的技术效果。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种毕赤酵母菌株及其在木聚糖酶生产中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> PRT

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 1

Val Gly Leu Asp Gln Ala Ala Val Ala Lys Gly Leu Gln Tyr Phe Gly

1 5 10 15

Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp Ile Pro Tyr Val Thr Gln

20 25 30

Leu Asn Asn Thr Ala Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly Asn Ser Met

35 40 45

Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly Thr Phe Thr Phe Thr Asn

50 55 60

Gly Asp Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Leu Arg

65 70 75 80

Cys His Thr Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu Pro Ser Trp Val Thr Ser

85 90 95

Gly Thr Trp Thr Asn Ala Thr Leu Thr Ala Ala Leu Lys Asn His Ile

100 105 110

Thr Asn Val Val Ser His Tyr Lys Gly Lys Cys Leu His Trp Asp Val

115 120 125

Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr Tyr Arg Thr Asn Ile Phe

130 135 140

Tyr Thr Thr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Ala Ala Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu

165 170 175

Glu Tyr Gly Gly Ala Lys Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ile Val Gln Leu

180 185 190

Val Lys Asn Ala Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ala His

195 200 205

Phe Ser Val Gly Thr Val Pro Ser Thr Ser Ser Leu Ile Ser Val Leu

210 215 220

Gln Ser Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Tyr Thr Glu Ala Asp

225 230 235 240

Val Arg Ile Leu Leu Pro Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ala Gln Gln Ser

245 250 255

Ser Asp Phe Gln Ala Leu Val Gln Ser Cys Val Gln Thr Thr Gly Cys

260 265 270

Val Gly Phe Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro

275 280 285

Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Ala Leu Pro Trp Asp Glu Asn Leu

290 295 300

Val Lys Lys Pro Ala Tyr Asn Gly Leu Leu Ala Gly Met Gly Val Thr

305 310 315 320

Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Lys Thr

325 330 335

Thr Thr Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ser Thr Gly Thr Thr Ala Ala His

340 345 350

Trp Gly Gln Cys Gly Gly Leu Asn Trp Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala

355 360 365

Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Tyr Val Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

370 375 380

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400> 2

gttggtttgg accaagctgc tgttgctaag ggtctgcaat acttcggtac tgctactgac 60

aacccagagt tgactgacat cccatacgtt acccagttga acaacactgc tgacttcggt 120

cagatcactc caggtaactc tatgaagtgg gacgctactg aaccatctca gggtactttc 180

actttcacca acggtgacgt tatcgctgac ttggctgaag gtaacggtca gtacttgaga 240

tgtcacaccc tggtttggta caaccagttg ccttcttggg ttacttccgg tacttggact 300

aacgctactt tgactgctgc cctgaagaac cacatcacca acgttgtttc tcactacaag 360

ggaaagtgct tgcactggga cgttgttaac gaagctttga acgacgacgg tacttacagg 420

accaacatct tctacactac tatcggtgag gcttacatcc caattgcttt tgctgctgct 480

gcagctgctg atccagatgc taagttgttc tacaacgact acaacttgga gtacggtggt 540

gctaaggctg cttctgctag agctatcgtt cagttggtta agaacgctgg tgccaagatt 600

gacggtgttg gattgcaagc tcacttctcc gttggtactg ttccttctac ttcctccttg 660

atctctgtct tgcagtcctt cactgctttg ggtgttgagg ttgcttacac tgaggctgac 720

gttagaatct tgttgccaac tactgctacc actttggctc aacaatcctc cgacttccaa 780

gctttggttc agtcctgtgt tcagaccact ggttgtgttg gtttcactat ctgggactgg 840

actgacaagt actcttgggt tccatccact ttctctggtt acggtgctgc tttgccatgg 900

gacgaaaact tggtcaagaa gccagcttac aacggtttgt tggctggtat gggtgttact 960

gttactacca ccactactac aactaccgct actgccactg gtaagactac taccacaact 1020

gctggtgctg catccactgg tactactgct gctcattggg gtcaatgtgg tggtttgaat 1080

tggtccggtc caactgtttg tgcttccggt tacacttgta cctacgtgaa cgactactac 1140

tcccagtgtt tgtaa 1155

Claims

1.一种毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌株携带有用于重组表达木聚糖酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的木聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述的木聚糖酶，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌株是对权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株进行紫外诱变后筛选获得的。

5.如权利要求4所述的毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌株的保藏编号为CCTCC NO: M2018375。

6.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株在生产木聚糖酶中的应用。

7.权利要求4所述的毕赤酵母突变菌株在生产木聚糖酶中的应用。

8.一种生产木聚糖酶的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或4所述的菌株发酵生产木聚糖酶。