CN102703480A - α-葡聚糖酶和工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种全新α-葡聚糖酶的基因序列以及氨基酸序列，提供了含有其基因序列的表达载体和含有该表达载体的基因工程重组菌株，提供了从细丽毛壳中分离纯化一种α-葡聚糖酶的方法。本发明提供的细丽毛壳α-葡聚糖酶基因序列是首次报道，为进一步的研究和开发该酶奠定了基础。本发明提供的重组菌株产生的α-葡聚糖酶为分泌型的胞外可溶性蛋白，简化了后续的提取和纯化工艺，有利于实现大规模的工业化生产，填补我国在α-葡聚糖酶开发方面的空白。

Description

α-葡聚糖酶和工程菌及应用

技术领域

本发明涉及蛋白纯化和基因工程领域，更具体地，涉及一种细丽毛壳α-葡聚糖酶的纯化工艺，一种细丽毛壳α-葡聚糖酶的基因克隆和基因工程菌的构建。 

背景技术

α-葡聚糖是一种由α-D吡喃葡萄糖单体通过(1-6)，(1-3)等糖苷键形式连接而成的多糖，多为右旋糖苷。不同类型糖苷键所占比例随不同的α-葡聚糖而变化。在医药工业中，分子量20KD，40KD，70KD的低聚α-葡聚糖是优良的血浆代用品，在临床上用于治疗失血性休克等，具有增加血容量，改善微循环等作用。α-葡聚糖是许多致病链球菌胞外多糖的重要成分，与龋齿的发生，致病菌的粘附，能量代谢，抵抗抗菌类药物渗透等过程息息相关。在制糖工业中，α-葡聚糖是微生物(如肠膜明串珠菌，链球菌属等)在感染甘蔗的过程中形成的。这些微生物能够分泌葡聚糖蔗糖酶，催化蔗糖生成葡萄糖并聚合而成α-葡聚糖。在蔗汁中葡聚糖浓度可高达1％，严重的会生成白色的固体状物质(俗称“蔗饭”)。α-葡聚糖的存在严重影响从糖汁澄清到糖的精炼等一系列工艺流程。例如糖分的直接损失；虚高糖分旋光度造成物料衡算的困难，进而影响生产；严重增加糖液的粘度致使澄清，过滤和输送等过程困难；与蔗糖共结晶致使产品纯度不高；糖晶异常，适用性差，无法在饮料等高端领域中使用等。α-葡聚糖酶是可降解α-葡聚糖成低聚葡聚糖或葡萄糖的一类酶的总称。α-葡聚糖酶的应用主要集中在生产药用低聚右旋糖酐，增强抗菌类药物的疗效，预防牙菌斑的形成，防止蔗糖转化为α-葡聚糖，从而缓解α-葡聚糖在制糖过程中的负面影响等方面。 

α-葡聚糖酶普遍存在于微生物中，具有多种类型和功能，部分品种已实现了工业化生产。其中青霉，毛壳菌等真菌来源的α-葡聚糖酶被认为是工业适用性状最好最高效的。诺维信，杰能科和Sankyo等公司已经开发了α-葡聚糖酶酶制剂产品并且进行了大量的应用研究。为了满足我国制糖行业可持续发展的要求，实现制糖工艺的清洁，节能和环保，α-葡聚糖酶的研究开发亟待进行。基于现有的α-葡聚糖酶研究，毛壳菌来源的α-葡聚糖酶的应用效果最为理想，但是在蛋白数据库中一直没有相关的序列报道。因此，获取毛壳菌来源α-葡聚糖酶的基因或是蛋白序列，才有可能构建基因工程菌，为该酶的开发利用奠定基础。 

发明内容

在对α-葡聚糖酶的研究过程中，本申请的发明人发现细丽毛壳(chaetomium gracile)具有 很好的α-葡聚糖酶活性。通过蛋白纯化技术，成功分离得到一种电泳纯的α-葡聚糖酶。通过基因克隆技术，成功克隆到一种α-葡聚糖酶基因。测序比对发现该α-葡聚糖酶基因尚未被NCBI等数据库收录，为一新发现的基因。因此，本发明的目的之一在于提供细丽毛壳来源的一种α-葡聚糖酶的分离纯化方法；目的之二是提供细丽毛壳来源的一种α-葡聚糖酶的基因；目的之三是提供包括该α-葡聚糖酶的表达载体和利用该载体构建的重组基因工程菌株。 

本发明蛋白纯化采用的技术方案是：采用Potato dextran培养基进行细丽毛壳的产酶发酵。发酵结束后，收集发酵液上清，硫酸铵沉淀，透析，DEAE-sepharose fast flow阴离子交换柱层析，SDS-PAGE检测。 

本发明基因克隆采用的技术方案是：提取细丽毛壳的基因组，根据α-葡聚糖酶的保守序列设计引物，通过PCR扩增得到细丽毛壳葡聚糖酶的部分序列，再根据该序列设计数对特异性引物，应用基因走读技术，扩增得到两侧序列。分析两侧序列，再设计引物扩增得到α-葡聚糖酶的完整基因序列(如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NI：2所示)。当然，如本领域的技术人员所知，本发明的α-葡聚糖酶基因还可以是编码由序列表中SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列；而本发明的α-葡聚糖酶不仅仅是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。 

本发明提供的包括α-葡聚糖酶基因的核苷酸序列的表达载体是用常规方法将本发明的α-葡聚糖酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不限于这些载体。较佳的是将PCR扩增到的α-葡聚糖酶基因产物和表达载体pPIC9K连接得到重组质粒。 

本发明提供的转化体，是将包含本发明的α-葡聚糖酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，如感受态毕赤酵母KM71或GS115中得到基因工程菌。 

其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是毕赤酵母，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株。 

本发明提供的α-葡聚糖酶重组菌株可用于α-葡聚糖的水解。在医药领域，α-葡聚糖酶可用于药用低聚葡聚糖的生产；或者用来增强抗生素类药物的疗效；此外，α-葡聚糖酶与肿瘤专一性抗体结合后还可作为与葡聚糖耦合药物的靶标，定向治疗癌症。在口腔疾病防治中，α-葡聚糖酶可以与氟化钠等药物配合使用，既减少了氟化物的毒性，又可以起到良好的抑制牙 菌斑发生，预防龋齿的作用。在制糖工业中，α-葡聚糖酶可以将α-葡聚糖转化为小分子的寡糖或是单糖，减少糖液粘度，加速沉降，缩短蒸煮时间，提高糖产量和质量。这种酶法处理工艺对于实现制糖工业的清洁，低碳，环保具有重要意义。 

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。 

本申请所采用的蛋白质纯化技术主要有：蛋白质的柱层析分离技术等。 

本申请所采用的基因操作技术主要有：基因克隆和基因的真核表达技术等。 

在本发明的实施例中使用的毕赤酵母Pichia patoris KM71、Pichia patoris GS115及pPIC9K载体均购自Novagen公司，引物均由英俊(invitrogen)公司合成。 

本发明所指α-葡聚糖酶活测定方法以α-葡聚糖dextran 2000为底物。 

本发明所指α-葡聚糖酶活测定方法的国际酶活单位的定义为：在本测定条件下，每分钟水解α-葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为一个酶活力单位(IU)。 

在本发明的下述实施例中， 

Potato dextran培养基的配方如下：10％potato，1％peptone，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，1％Dextran T2000，pH natural。 

Luria Bertani培养基的配方如下：1％ trptone，0.5％ yeast extract，1％ Nacl； 

BMGY培养基的配方如下：1％ yeast extract，2％ peptone，100mM K₃PO₄，pH 7.0，1.34％YNB，4×10^-5％ biotin，1％ glycerol； 

BMMY培养基的配方如下：1％ yeast extract，2％ peptone，100mM K₃PO₄，pH 7.0，1.34％YNB，4×10^-5％ biotin，0.5％ methanol； 

YPD液体培养基培养的配方如下：1％ yeast extraction，2％ peptone，1％ glucose； 

MD固体培养基配方如下：1.34％ YNB，4×10^-5％biotin，2％ glucose，1.5％ agar。 

在本发明的下述实施例中，酶活测定的方法如下： 

取15ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(吸取前摇匀)(4.5)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，50℃水解10min. 

反应步骤及试剂，溶液用量见下表： 

国际酶活单位的定义：在本测定条件下，每分钟水解α-葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。 

酶活计算公式： 

酶活＝(测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖浓度umol/μl)×(反应体积200μl)×(稀释倍数)/(酶量20μl)/(反应时间10min) 

如果酶活力单位定义为：在本测定条件下，每分钟水解α-葡聚糖产生1μg还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。 

则酶活计算公式： 

酶活＝(测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖浓度umol/μl×180g/mol)×(反应体积200μl)×(稀释倍数)/(酶量20μl)/(反应时间10min) 

那么与国际单位IU的换算关系为 

1U＝180×IU(μg/ml.min) 

在本发明的下述实施例中使用的原始细丽毛壳购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号CGMCC为：3.3783。 

本发明的下述实施例中细丽毛壳α-葡聚糖酶的发酵生产，基因克隆等研究的技术路线如图所示，具体过程见下述实施例。 

实施例1、细丽毛壳α-葡聚糖酶的发酵和分离纯化 

1.1 细丽毛壳α-葡聚糖酶的7L发酵罐培养 

接种细丽毛壳至固体Potato dextran培养基上，28℃-30℃培养7-10天至产生大量的孢子。接种孢子悬液至液体Potato dextran培养基中进一步的活化培养2-3天。按照10％的接种量，将活化好的种子液接种装有3L发酵培养基的7L发酵罐，并在28℃发酵培养。发酵期间实时监控发酵液的pH，溶氧，以及酶活表达等情况。3-5天产酶达到峰值，停止培养。 

1.2 细丽毛壳α-葡聚糖酶的分离纯化 

将培养好的发酵液在4℃，10000rpm离心5min。收集上清液，加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃静置沉淀4-12小时。4℃，12000rpm离心15min收集沉淀，用去离子水溶解后于透析袋中透析充分去除硫酸铵。得到的透析液用于DEAE-sepharose fast flow阴离子交换柱层析 分离。收集buffer洗脱组分的活峰进行SDS-PAGE检测，可以得到具有活性的单条带，蛋白纯度达到90％以上。电泳检测图见附图1。 

实施例2、细丽毛壳α-葡聚糖酶基因的克隆 

2.1、提取细丽毛壳的基因组和mRNA 

细丽毛壳在产酶培养基上生长三天，收集菌体，采用真菌核酸的快速提取方法提取基因组。DNA提取的具体步骤如下： 

1)从培养皿上刮取菌体或.抽滤收获菌体，放入研钵中，加入液氮后研磨成粉末。 

2)将粉末转移至5ml的离心管中，向离心管中加入一定量的DNA抽提液(Tris-HCl(pH 7.5)0.2M，NaCl 0.5M，EDTA 0.01M，SDS 1％)，振荡使其混合均匀。 

3)加入与抽提液等体积的酚+氯仿+异戊醇(体积比25∶24∶1)，在振荡器上剧烈振荡3-6min，7000rpm、4℃离心5-6min。 

4)转移上清液至一新离心管，加入等体积的氯仿+异戊醇(体积24∶1)，混匀后7000rpm，4℃，离心5-6min。 

5)将上清液转移到一新离心管，向该离心管中加入2.5倍体积的无水乙醇(加入10μl 0.1M的醋酸钠有利于DNA沉淀)，-20℃放置0.5h。取出离心管，10000rpm，4℃，离心10min，弃上清液，60℃烘箱干燥10min，加入适量的双蒸水溶解沉淀即得到DNA，于-20℃保存备用。 

细丽毛壳mRNA的提取和RT-PCR的操作严格按照Takara公司的RNA抽提试剂盒以及MLV反转录酶的说明进行。 

2.2、兼并引物的设计 

根据真菌α-葡聚糖酶的保守序列，设计出扩增α-葡聚糖酶基因的两对兼并引物，兼并引物序列如下： 

2.3、PCR法扩增部分细丽毛壳α-葡聚糖酶基因序列 

以细丽毛壳的基因组或是cDNA为模板，巢式PCR法扩增细丽毛壳α-葡聚糖酶的部分基因序列。 

第一轮PCR以P1和P4为引物，细丽毛壳基因组或是cDNA为模板，反应参数为：94℃变性8min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃保温10min。 

第二轮PCR以P2和P3为引物，第一轮PCR产物为模板，反应参数为：94℃变性8min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃保温10min。 

通过两轮PCR扩增，得到了一条约为800bp的DNA条带。将该片段连接到pMD19-T-vector上后，挑取阳性菌落送交华大基因研究所测序。 

2.4、细丽毛壳α-葡聚糖酶两端序列的扩增 

根据测序得到的DNA序列，设计上游和下游各三条特异性引物，并结合Takara的基因走读试剂盒中的四条通用引物，进行两端序列的扩增。 

扩增得到的产物回收后送华大基因研究所测序验证。 

2.5、完整细丽毛壳α-葡聚糖酶基因序列的克隆和序列分析 

根据5′端和C′端扩增结果，设计引物，以基因组为模板，进行全基因的高保真taq酶扩增。回收扩增得到的片段，连接pMD19 simple T载体，筛选阳性克隆，送交华大基因研究所进行测序。 

通过上述实验最终获得的α-葡聚糖酶基因(SEQ ID NO：1)全长1788bp，编码595个氨基酸(SEQ ID NO：2)和一个终止密码子，分子量约为65.87KD。将其(SEQ ID NO：2)氨基酸序列在NCBI上进行序列比对，发现与来源于Penicillium pinophilum，Lipomyces starkeyi，Verticillium albo-atrum VaMs.102的α-葡聚糖酶的相似性分别为69％，66％和45％，因此，可以确定该基因为一全新的α-葡聚糖酶基因。 

实施例3、毕赤酵母(P.pastoris)工程菌GS115-dex的构建 

3.1、表达载体pPIC9K-dex的构建 

根据pPIC9K质粒多克隆位点的序列特点，设计上下游引物 

pEN：5′-CCGGAATTCATTCGACAGCGCGCTGGCA-3′， 

pEC：5′-ATCGCGGCCGCTTAACGAATGACCCACTGC-3′ 

以基因组为模板，进行PCR。PCR产物dex和pPIC9K质粒用EcoRI和NotI双酶切，切胶回收后通过T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，双酶切验证结果如 附图2所示。 

进一步进行测序验证，保证连接无误，从而获得表达载体pPIC9K-dex。 

3.2、电转化毕赤酵母GS115 

按照毕赤酵母表达手册的要求，将表达载体pPIC9K-dex用SacI限制性内切酶线性化后电转法毕赤酵母GS115感受态细胞。置于28℃培养，培养2-3天，直至单菌落出现。挑取单菌落，依次转接到遗传霉素抗性递增(1mg/ml，3mg/ml，5mg/ml)的MD平板上进一步筛选高拷贝子。 

3.3、重组毕赤酵母的PCR鉴定 

挑取单菌落，分别接种于BMGY培养基中，30℃，200rpm，培养18h后，取1ml菌液用于提取基因组。5000rpm离心5min，去上清，加100μl含有1mg/ml溶菌酶的无菌水重悬。37℃裂解30min，液氮研磨，加入DNA提取缓冲液500μl，60℃放置30-60min。加入等体积氯仿抽提一次。取上清加入等体积的异丙醇沉淀。75％乙醇洗涤沉淀，待干后用20μl无菌水溶解。即为重组子的基因组，用作PCR鉴定的模板。引物采用pAOX5′通用引物(AOX5′：GACTGGTTCCAATTGACAAGC)和pEC，扩增条件同表达载体构建时一致。并以空载体转化的毕赤酵母基因组为空白，扩增结果如附图3所示。 

dex基因已整合到毕赤酵母基因组并正确表达，且为Mut⁺表型。 

实施例4、毕赤酵母的发酵培养和蛋白表达检测 

4.1、毕赤酵母的发酵培养 

将获得的毕赤酵母阳性重组子以1％接种量接种于30ml BMGY液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养40-48小时后，于无菌条件下离心沉淀细胞，并转入30ml BMMY液体培养基中，28℃，200rpm继续培养。每24小时加入0.5％甲醇诱导培养，培养7天，每天取样测定。 

4.2目的蛋白的电泳检测 

收集诱导第5天的发酵上清液，硫酸铵沉淀后，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，结果见附图4。 

实施例5、重组α-葡聚糖酶和原始α-葡聚糖酶的理化性质测定。 

5.1、最适温度测定 

按照标准酶活测定方法，测定不同反应温度下(45℃、50℃、56℃、61℃、65℃)，重组α-葡聚糖酶和原始α-葡聚糖酶的酶活，从而确定各自的最适反应温度。测定结果如附图5所示，重组α-葡聚糖酶和原始α-葡聚糖酶的最适反应温度分别为55℃和60℃。 

5.2、温度稳定性测定 

将重组α-葡聚糖酶和原始α-葡聚糖酶分别在不同温度下(30℃、40℃、50℃、55.7℃、61 ℃、66.1℃以及70℃)静置1h，快速置于冰上30s，按照标准酶活方法测定酶活。结果如附图6所示。重组α-葡聚糖酶在50℃放置1h后活力保持在95％以上，而原始α-葡聚糖酶活力则降到了47％，重组α-葡聚糖酶的热稳定性优于原始α-葡聚糖酶。 

5.3、最适pH测定 

用pH2，3，4，5，6，7，8的磷酸盐缓冲液配置1％的反应底物，用于最适反应pH测定。测定结果如附图7所示。可见，重组α-葡聚糖酶和原始细丽毛壳α-葡聚糖酶的最适反应pH一致，均为pH4。 

5.4、pH稳定性 

将两种酶在不同pH缓冲液在室温条件下放置1h后测定残留酶活。测定结果如附图8所示。可见，天然细丽毛壳α-葡聚糖酶在pH4-8范围内的稳定性良好，重组酶的pH稳定区间稍窄，在pH5-8范围内稳定性良好。 

 附图说明：

图1：细丽毛壳α-葡聚糖酶各步纯化组分的电泳检测。图中M：蛋白分子量标准；1：细丽毛壳发酵液；2：硫酸铵沉淀液；3：DEAE-sepharose fast flow阴离子交换柱层析洗脱的活性组分。图2：pPIC9k-dex双酶切验证。图中M：Marker；1：pPIC9k质粒；2：pPIC9k质粒双酶切；3：dex胶回收产物；4：pPIC9k-dex质粒；5：pPIC9k-dex质粒双酶切。图3：重组子的PCR验证结果。图中M：DNA Marker；1：转化pPIC9K空载体的对照；2-4：dex片段转化的毕氏酵母GS115的三个阳性重组子。图4：SDS-PAGE鉴定dex片段在毕赤酵母中的表达情况。图中M：为蛋白Marker；1：GS115的pPIC9K空载体转化子的发酵浓缩液；2-4：三个GS115的dex转化子的发酵浓缩液。图5：α-葡聚糖酶最适温度测定图。图6：α-葡聚糖酶温度稳定性测定图。图7：α-葡聚糖酶最适pH测定图。图8：α-葡聚糖酶pH稳定性测定图。

Claims (10)

1.一种α-葡聚糖酶的基因，是下列核苷酸序列之一：

1)其为序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

2)编码由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。

2.一种α-葡聚糖酶，其是序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。

3.包括权利要求1所述的α-葡聚糖酶基因的核苷酸序列的表达载体。

4.一种高效表达α-葡聚糖酶的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株表达α-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或为其无义突变序列。

5.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，编码所述α-葡聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，编码所述α-葡聚糖酶的基因位于重组质粒上或整合在染色体上。

7.如权利要求4所述的基因工程菌株，其是将权利要求3所述的表达载体转化到宿主微生物中得到的基因工程菌株。

8.如权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，该宿主微生物为毕赤酵母GS115，得到的基因工程菌株为毕赤酵母GS115-dex。

9.如权利要求4或5所述的α-葡聚糖酶基因工程菌株可用于水解α-葡聚糖的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的α-葡聚糖酶能够将长链的α-葡聚糖降解成低聚α-葡聚糖，异麦芽糖，或是葡萄糖，从而在医药，口腔卫生，制糖工业等各个领域获得应用。

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