CN105754896A - 一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法 - Google Patents

一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105754896A
CN105754896A CN201610207479.5A CN201610207479A CN105754896A CN 105754896 A CN105754896 A CN 105754896A CN 201610207479 A CN201610207479 A CN 201610207479A CN 105754896 A CN105754896 A CN 105754896A
Authority
CN
China
Prior art keywords
levulan
bacillus megaterium
bacterial strain
bacterium
levan
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610207479.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105754896B (zh
Inventor
江晓路
于晓萌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean University of China
Original Assignee
Ocean University of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean University of China filed Critical Ocean University of China
Priority to CN201610207479.5A priority Critical patent/CN105754896B/zh
Publication of CN105754896A publication Critical patent/CN105754896A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105754896B publication Critical patent/CN105754896B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/11—Bacillus megaterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一株分离于大型真菌子实体的细菌，其具有利用蔗糖生产果聚糖的特性。该菌株对营养要求简单、易培养、性状稳定、产糖量高，具有工业化应用的潜力。采用16S rDNA基因测序分析，并根据《伯杰氏细菌鉴定手册第九版》和《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化实验做进一步鉴定，确定了该菌株的种属并命名。将菌株接种于发酵培养基中，32℃摇瓶培养12h后，能够产生重均分子量为1000kDa至10000kDa的β?(2,6) ?D? Fru<i>f</i>（levan型果聚糖）。

Description

一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法
技术领域
生物技术。
背景技术
果聚糖是由β - D -呋喃果糖聚合而成的同多糖，根据连接键的不同，分为两种类型：菊粉型果聚糖(inulin-type)，分子量在0.1-1kDa间，是由β - (2, 1)键连接的D-呋喃果糖组成；另一种为levan果聚糖(levan-type)，又称为左聚糖，是由β - (2, 6)键连接的D-呋喃果糖形成的线状结构，也有一些含有β - (2, 1)键连接的分支结构。已报告的levan型果聚糖在分子的一个末端都有葡萄糖基团，其结构为Glu-Fru(n)。levan型果聚糖主要来源于微生物，由微生物产生的果聚糖合成酶合成，尤其是高分子量的果聚糖更多的是由微生物生产的，目前，报道的果聚糖的微生物来源有环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、产果聚糖气杆菌(Aerobacter levanicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链球菌(Streptococcus)、多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、盐单胞菌(Halomonas)、运动发酵单胞菌(Zymomoas mobilis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、酢酸菌(Gluconoacetobacter xylinus)、产左聚糖微杆菌(Microbacterium laevaniformans)、解淀粉欧文菌(Erwinia amylovora)、假单胞菌(Pseudomonas syringae)、重氮营养葡糖醋酸杆菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）等。通过专利检索：用Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株生产果聚糖，专利中涉及了一种能产生果聚糖的微生物Cellulomonas sp.nov.GJT07以及利用该菌株生产果聚糖的方法，此发明从果园土壤中分离纯化出的细菌Cellulomonas sp.nov.GJT07具有产生重均分子量为720kDa果聚糖的特性。另外，Rahnella sp.PJT09菌株也被报告可以生产果聚糖，其重均分子量为320kDa。大多数的levan果聚糖分子量集中在10kDa至1000kDa，而植物产生的levan果聚糖分子量一般小于10kDa。与植物果聚糖相比，微生物来源的果聚糖具有生产周期短、不受气候和地理环境条件限制和生理活性强等优点，且具有抗肿瘤、抗糖尿病、免疫增强、降血脂等多种重要的生物学功能，可用于制备纳米材料，在生物医药和功能食品等方面具有巨大的应用潜能，体现出巨大的潜在市场价值。
发明内容
本发明分离纯化出一株分离于大型真菌子实体的细菌Bacillus megaterium GJT321，其具有产生果聚糖的特性。采用革兰氏染色等形态学观察作为菌种的初步鉴定，通过16S rDNA基因测序和系统进化树分析，鉴定结果为Bacillus菌属，然后根据《伯杰氏细菌鉴定手册第九版》和《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化实验做进一步鉴定，确定该菌株为Bacillus megaterium，命名该菌株为Bacillus megaterium GJT321。
菌种保藏单位：中国典型培养物保藏中心。地址：中国武汉，武汉大学。保藏日期为2016年02月26日，保藏号为CCTCC M 2016073。
经GPC测定得到该多糖重均分子量范围为1000kDa-10000kDa，采用13C-NMR谱图、2D HSQC-NMR谱图和2D HMBC-NMR谱图对巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium GJT321生产的胞外多糖进行结构分析，确定为β - (2, 6) - D - Fruf（levan型果聚糖）。
附图说明
图1：Bacillus megaterium GJT321果聚糖的Sephacryl S-400 HR柱层析图
图2：Bacillus megaterium GJT321产生果聚糖的13C-NMR谱图
图3：Bacillus megaterium GJT321产生果聚糖的2D HSQC-NMR谱图
图4：Bacillus megaterium GJT321产生果聚糖的2D HMBC-NMR谱图
具体实施方式
本发明是通过以下技术路线实现的：
1、菌种分离鉴定：将大型真菌子实体样品，加入到装有25 ml富集培养基的三角瓶中，30℃, 160r/min摇瓶培养48h。然后将富集培养液用无菌生理盐水10倍稀释后，取0.2ml涂布分离培养基平板。28℃倒置培养48h，获得在平板上有粘稠透明外观的菌落，得到能够生产胞外多糖的细菌。富集培养基和分离培养基都是PDA平板培养基。按常规方法对菌株进行16S rDNA基因测序，将测序结果与Genebank中芽孢杆菌属（Bacillus）的序列进行比对相似度最高，确定实验菌种为芽孢杆菌Bacillus。对菌株进行生理生化实验和形态学观察，确定菌种为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，命名该菌株为Bacillus megaterium GJT321。菌种保藏单位：中国典型培养物保藏中心。地址：中国武汉，武汉大学。保藏日期为2016年02月26日，保藏号为CCTCC M 2016073。
2、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium GJT321胞外多糖的生产方法特征在于培养基组分、发酵条件和生产制备方法：
种子培养基和发酵培养基组分（g/L）：蔗糖40，酵母膏5，蛋白胨10，(NH4)2SO4 3，NaCl 3，MgSO4 0.05，CaCl2 0.05，K2HPO4 1 。
发酵条件：装液量为每100 mL三角瓶装30 mL培养基，接种量为7.5%（v/v），初始pH值为7.0，32 ℃，160 pm培养12 h。
生产制备步骤：
（1）菌种活化：将保存菌种接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，于32 ℃恒温培养24 h后，保存在4 ℃冰箱备用。
（2）种子培养基制备与接种培养：种子液培养基组分与产糖培养基组分相同，装液量每100 mL装30 mL培养基。将步骤（1）中的牛肉膏蛋白胨斜面菌种接种于种子培养基，在培养温度32 ℃、转速160 rpm的条件在培养24 h，获得种子培养液。
（3）发酵培养基制备与发酵培养：发酵培养基组分组分如上，pH值为7.0。将步骤（2）发酵好的种子液以7.5%（v/v）接种量接种于发酵培养基，在培养温度32 ℃、转速160 rpm的条件在培养12 h，获得levan果聚糖发酵液。
（4）多糖的制备：将步骤（3）得到的发酵培养物4000 rpm离心10 min离心去除菌体后，将发酵液煮沸10 min，同上方法离心，上清液pH调至7.0，加入1.5倍95%乙醇沉淀，静置2 h，4000 rpm离心10 min得到白色沉淀，用无水乙醇将沉淀洗两次后，将沉淀溶于水，冻干后即得Bacillus megaterium GJT321生产的levan果聚糖。
3、多糖鉴定：
（1）多糖的纯度鉴定：称取50 mg，溶于2 mL蒸馏水使其溶解，过0.22 μm水系过滤膜后，经Sephacryl S-400 HR凝胶层析，用超纯水洗脱，流速0.3 mL/min。经自动部分收集器收集后，各层析组分用苯酚-硫酸法检测糖分布，并以管号对OD490nm值作图。结果表明产品为均一正态峰，即为均一分子量片段的多糖（见附图1）。
（2）多糖分子量测定：采用高效凝胶渗透色谱法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）测定重均分子量。
标准曲线制作: 将葡聚糖系列标准品Dextran （重均分子量为2000.0 kDa, 133.8 kDa, 84.4 kDa, 41.1 kDa, 21.4 kDa, 10.0 kDa, 7.1 kDa, 4.6 kDa, 2.5 kDa, Sigma），加0.1 M Na2SO4超纯水配成5 mg/mL的标准溶液，GPC分析软件以标准葡聚糖分子量的对数对保留时间作图，绘制标准曲线。
HPGPC操作条件:仪器：高效液相色谱仪Agilent 1100型；凝胶柱：TSKgel GMPWXL GPC column（日本Tosoh公司）；流动相：0.1 M Na2SO4；流速：0.5 mL/min；检测器：示差折光检测器（RI）；温度：40 ℃；进样量：20 μL。采用GPC测定多糖分子量，结果为2236 kDa。
（3）多糖结构鉴定：将多糖酶解后，取分子量为7.6 kDa的多糖片段经Sephadex G-75凝胶层析纯化后作为核磁样品，称量25 mg样品，用0.6 mL 99% D2O溶解，置于核磁管内，加入3滴丙酮作为内标。在25 ℃下，采用Agilent Pro Pulse 500MHz核磁共振波谱仪，测定13C-NMR谱图（附图2）、2D HSQC-NMR谱图（附图3）和2D HMBC-NMR谱图（附图4）。通过谱图分析Bacillus megaterium GJT321胞外多糖为β - (2, 6) - Fruf（levan型果聚糖）。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Bacillus megateriumGJT321菌株16S rDNA基因序列：
GGGCAAAACGCGGATAGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCAGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTCTAGGAGCCAGCCGCCGTGTAGTCCTCTGCTTTG

Claims (3)

1.一种巨大芽孢杆菌，其特征在于其分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium GJT321），其保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2016年02月26日，保藏编号：CCTCC M 2016073。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌生产的levan型果聚糖，其结构为β - (2, 6) - D - Fruf，其特征在于它通过以下制备方法制得：
（1）将斜面培养基接种到已灭菌的种子培养基中，在培养温度32℃、转速160rpm的条件下培养24h，获得种子培养液；
（2）将种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，在培养温度32℃、转速160rpm的条件下培养12h，获得levan果聚糖发酵液；
（3）将发酵液离心去除菌体，煮沸10min后离心，取上清液；
（4）加入乙醇沉淀上述上清液，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶沉淀，用无水乙醇将沉淀洗涤两次，将沉淀溶于蒸馏水，冻干后即得Bacillus megaterium GJT321生产的levan果聚糖。
3.权利要求1中所述的巨大芽孢杆菌生产的levan型果聚糖，其重均分子量范围为1000kDa至10000kDa。
CN201610207479.5A 2016-04-06 2016-04-06 一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法 Active CN105754896B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610207479.5A CN105754896B (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610207479.5A CN105754896B (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105754896A true CN105754896A (zh) 2016-07-13
CN105754896B CN105754896B (zh) 2019-06-21

Family

ID=56333511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610207479.5A Active CN105754896B (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105754896B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322207A (zh) * 2021-06-08 2021-08-31 江苏海洋大学 一种微杆菌XL1及其在产Levan果聚糖中的应用
CN114480177A (zh) * 2021-12-29 2022-05-13 苏州科宁多元醇有限公司 一株高产Levan果聚糖的产左聚糖微杆菌及Levan果聚糖的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李兴军: "果聚糖的合成与利用", 《中国食物与营养》 *
陆娟等: "Levan 果聚糖的应用与生产研究进展", 《生物学杂志》 *
陆娟等: "Levan 蔗糖酶及其在Levan 果聚糖合成中的应用", 《微生物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322207A (zh) * 2021-06-08 2021-08-31 江苏海洋大学 一种微杆菌XL1及其在产Levan果聚糖中的应用
CN113322207B (zh) * 2021-06-08 2022-05-24 江苏海洋大学 一种微杆菌XL1及其在产Levan果聚糖中的应用
CN114480177A (zh) * 2021-12-29 2022-05-13 苏州科宁多元醇有限公司 一株高产Levan果聚糖的产左聚糖微杆菌及Levan果聚糖的应用
CN114480177B (zh) * 2021-12-29 2023-03-14 苏州科宁多元醇有限公司 一株高产Levan果聚糖的产左聚糖微杆菌及Levan果聚糖的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105754896B (zh) 2019-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106520641B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其胞外多糖的制备方法
CN106047780B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在联产细菌纤维素和γ-聚谷氨酸中的运用
CN109880758B (zh) 一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用
CN106995811B (zh) 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用
CN111909872B (zh) 类芽孢杆菌ZX1905及其生产的胞外多糖Lubcan和应用
CN101586090A (zh) 一种马乳酒亚种zw3菌株
CN103468611B (zh) 发酵培养基及制备方法和应用、乳酸菌葡聚糖的制备方法
CN111621448A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌sn-1及其发酵生产胞外多糖的方法
Zhao et al. The response surface optimization of exopolysaccharide produced by Weissella confusa XG-3 and its rheological property
Bhatia et al. Stepwise bioprocess for exopolysaccharide production using potato starch as carbon source
CN105420142B (zh) 一种来源于海洋生物的细菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生产琼胶酶的方法
CN102559799A (zh) 一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法
CN108034612A (zh) 一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法
CN105754896A (zh) 一种细菌及其生产高分子果聚糖的方法
CN105647990B (zh) 一种微生物胞外多糖及其制备方法
CN102311931A (zh) 用Rahnella sp.PJT09菌株生产的果聚糖
CN105440153B (zh) 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制备方法
CN104651284A (zh) 鞘氨醇单胞菌T-3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法
CN105567779A (zh) 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法
CN113322207A (zh) 一种微杆菌XL1及其在产Levan果聚糖中的应用
CN103865850A (zh) 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法
CN107739721A (zh) 产琼胶降解酶的芽孢杆菌Bacillus sp.W2017及其应用
CN104231106A (zh) 一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用
CN103484392A (zh) 用Pseudomonas fluorescens PGM37菌株生产葡甘聚糖
CN103898012A (zh) 一株海旋菌及制备琼胶酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant