CN102559799A - 一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，涉及使用生物方法合成多糖，是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株的保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460；具体步骤是：第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵；第二步，胞外多糖分离；第三步，多糖纯化，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品：

本发明方法所用内生真菌DT06是从蓝藻中分离出来的，克服了现有技术的原料来源不广泛，不易于分离和生产成本高的缺点。

Description

一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法

技术领域

本发明的技术方案涉及使用生物方法合成多糖，具体地说是一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法。 

背景技术

植物内生真菌一般能够合成多种特殊的天然胞外产物，不同的内生真菌所产生的胞外产物的结构和性质也不同。 

CN1594587公开了一种真菌胞外多糖复合物的制备及其应用，是从一种虫草真菌-中国弯颈霉的培养液中提取胞外多糖复合物，该发明的原料来源不广泛，生产成本高；CN1974753披露了可大量获得真菌胞外多糖的发酵和分离方法，该发明方法的缺点是生产周期长和产量低。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，所用内生真菌DT06是从蓝藻中分离出来的，克服了现有技术的原料来源不广泛，不易于分离和生产成本高的缺点。 

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，其具体步骤是： 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCCN0.4460，该菌株的核苷酸序列见序列表；该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum。 

斜面培养基配方：葡萄糖0.5～1g、酵母提取物0.05～0.1g、蛋白胨0.1～0.2g、琼脂1～1.5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面； 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖30～60g/L，硝酸钠2～3g/L，磷酸二氢钾0.5～1g/L，氯化钾0.1～1g/L，七水硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸铁0.01～0.1g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，选用以下两种方法的任意一种： 

A.蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵 

控制参数为：发酵温度25～27℃，摇床转数为130～150rpm，装料系数为30～50％(v/v)，接种量为1～10％(v/v)，pH控制在5.5～6.5，发酵周期为6～8天， 

B.蓝藻内生真菌TD06的深层发酵 

控制参数为：装料系数为75～90％(v/v)，接种量为1～20％(v/v)，pH＝5.5～7.0，温度25～30℃，罐压0.01～0.5Mpa，搅拌速度60～150rpm，空气流量0.4～1.0vvm； 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2～1/4，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀2～4倍体积的水，煮沸10～15分钟，然后加入质量百分比为0.2～2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2～1/4后加入与其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

上述一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，所涉及的原料均属公知和可以获得的，所涉及的具体工艺方法均是本技术领域的技术人员所熟知的。 

本发明的有益效果是： 

本发明一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法中所用的蓝藻内生真菌DT06是从蓝藻中分离出来的。通过对该菌的形态学和ITS1-5.8SrDNA-ITS2鉴定，确定该菌株为Simplicillium lanosoniveum一新变种，命名为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。该菌株属于虫草头孢类，产生的胞外多糖结构特殊，具有抗氧化、提高免疫功能等多种功效，将会成为一种新的高附加值产品。采用蓝藻内生真菌TD06生产胞外多糖的方法具有原料来源广、生产周期短、产量高、易于分离、生产成本低等优点。在蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵过程中除生产大量胞外多糖外，还产生营养价值相似的菌丝体，具有丰富的有机物质。在该发酵液 中分离的胞外多糖可广泛用于食品、药品和保健品等行业，因而具有广阔的市场前景。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 

图1为本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖的紫外光谱谱图。 

图2为本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖的红外光谱谱图。 

图3为本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖水解后的纸层析色谱图。 

图4为本本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖的13C-NMR谱图。 

图5为本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖的1H-NMR谱图。 

具体实施方式

图1表明，因蛋白质在280nm处有紫外吸收峰，核酸在260nm处有紫外吸收峰，由多糖紫外扫描图谱可看出本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖不含蛋白质及核酸等杂质。 

图2表明，红外图谱显示本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖在4000cm^-1至500 

cm^-1区具有多糖类物质的一般特征吸收峰。在3200cm^-1至3600cm^-1之间的3422.59cm^-1处出现一种强吸收峰，为糖分子中-OH的伸缩振动峰，表明多糖中存在分子内和分子间的氢键；在2500cm^-1至3000cm^-1之间的2929.05cm^-1处的吸收峰是多糖中C-H的伸缩振动峰，这一区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰；在1636.67cm^-1处的小吸收峰是-OH弯曲振动振动造成的；1418.57cm^-1处的小吸收峰是C-H的变角振动；1775cm^-1至1735cm^-1之间无吸收峰，说明无乙酰酯；1000cm^-1至1200cm^-1间的一组吸收峰是由糖环上的C-O-C伸缩振动所引起的，其中在1155.13cm^-1、1079.72cm^-1和1020.28cm^-1处各有一个吸收峰，它们是-OH的一级变角振动，说明该多糖中的单糖以吡喃糖的形式存在；844cm^-1附近有一吸收峰，是a端基差向异构的C-H变角振动的特征吸收峰，890cm^-1附近无吸收峰，说明该多糖含a糖苷键，不含β糖苷键；该多糖在810cm^-1和870cm^-1处无吸收峰，说明该多糖的组成中不含有甘露糖；在1260cm^-1和1730cm^-1处无吸收峰，说明该多糖中不含有酯基或乙酰基。 

图3中的1为葡萄糖，2为该多糖水解，3为半乳糖。由纸层析结果可知：本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖水解产生的两种单糖，一种为葡萄糖，另一种是半乳糖。 

图4和5表明，由氢谱图和碳谱图可看出，本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖在异头氢范围内和异头碳范围内均有三个吸收峰，其中前两个峰很接近，应为葡萄糖的两种键型，1-4-α-D-葡萄糖和α-D-葡萄糖，另一个吸收峰为半乳糖的异头氢和异头碳的吸收峰，氢谱中异头氢H1的三个吸收峰分别为5.409、5.372和4.965ppm，碳谱中异头碳C1的三个吸收峰分别为103.09、102.64和100.80ppm。 

            -α-D-葡萄糖-1-残基的核磁共振图谱 

                                                         

     1号位   2号位  3号位  4号位  5号位  6a号位  6b号位 

H    5.37    3.64   3.86   3.68   3.97   3.78    3.86 

C    103.09  74.03  72.35  76.30  75.92  63.58 

                                                         

            1-4-α-D-葡萄糖-1-残基的核磁共振图谱 

                                                         

     1号位   2号位  3号位  4号位  5号位  6a号位  6b号位 

H    5.41    3.63   3.86   3.66   3.97   3.78    3.86 

C    102.64  74.03  73.19  80.29  75.92  63.58 

                                                         

            1-6-α-D-半乳糖-1-残基的核磁共振图谱 

                                                         

     1号位   2号位  3号位  4号位  5号位  6a号位  6b号位 

H    4.96    3.85   4.03   3.91   4.00   3.71    3.95 

C    100.8   74.6   74.5   74.4   72.4   69.4 

                                                         

综合以上单糖组分纸层析、多糖红外谱图、紫外谱图、核磁共振谱图分析结果可知，本发明方法制得的藻类内生真菌胞外多糖为杂多糖，由两种单糖组成，组成单糖为α-D-葡萄糖和α-D-半乳糖。 

实施例1 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表。该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tiamjinienss Q.L.Dong。 

斜面培养基配方：葡萄糖0.5g、酵母提取物0.05g、蛋白胨0.1g、琼脂1g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面。 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钾0.1g/L，七水硫酸镁0.1g/L，硫酸铁0.01g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，采用蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵， 

控制参数为：发酵温度25℃，摇床转数为130rpm，装料系数为30％(v/v)，接种量为1％(v/v)，pH控制在5.5，发酵周期为6天， 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀2倍体积的水，煮沸10～15分钟，然后加入质量百分比为0.2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2后加入与其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h， 得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

实施例2 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表。该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。 

斜面培养基配方：葡萄糖0.75g、酵母提取物0.075g、蛋白胨0.15g、琼脂1.25g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面。 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖45g/L，硝酸钠2.5g/L，磷酸二氢钾0.75g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.3g/L，硫酸铁0.05g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，采用蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵， 

控制参数为：发酵温度26℃，摇床转数为140rpm，装料系数为40％(v/v)，接种量为5％(v/v)，pH控制在6，发酵周期为7天， 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/3，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀3倍体积的水，煮沸13分钟，然后加入质量百分比为1.1％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/3后加入其体积比为1∶1的95％(v/v)的的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤， 最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

实施例3 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表。该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。 

斜面培养基配方：葡萄糖1g、酵母提取物0.1g、蛋白胨0.2g、琼脂1.5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面。 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖60g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，硫酸铁0.1g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，采用蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵 

控制参数为：发酵温度27℃，摇床转数为150rpm，装料系数为50％(v/v)，接种量为10％(v/v)，pH控制在6.5，发酵周期为8天， 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/4，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀4倍体积的水，煮沸15分钟，然后加入质量百分比为2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/4后加入与其体积比为为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

实施例4 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表。该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。 

斜面培养基配方：葡萄糖0.5g、酵母提取物0.05g、蛋白胨0.1g、琼脂1g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面。 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钾0.1g/L，七水硫酸镁0.1g/L，硫酸铁0.01g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，采用蓝藻内生真菌TD06的深层发酵， 

控制参数为：装料系数为75％(v/v)，接种量为1％(v/v)，pH＝5.5，温度25℃，罐压0.01Mpa，搅拌速度60rpm，空气流量0.4vvm 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀2倍体积的水，煮沸10分钟，然后加入质量百分比为0.2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2后加入其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

实施例5 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表。该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。 

斜面培养基配方：葡萄糖0.8g、酵母提取物0.08g、蛋白胨0.15g、琼脂1.3g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面。 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖50g/L，硝酸钠2.5g/L，磷酸二氢钾1.3g/L，氯化钾0.6g/L，七水硫酸镁0.3g/L，硫酸铁0.6g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，采用蓝藻内生真菌TD06的深层发酵， 

控制参数为：装料系数为82％(v/v)，接种量为10％(v/v)，pH＝6.0，温度28℃，罐压0.25Mpa，搅拌速度100rpm，空气流量0.7vvm 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/3，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀3倍体积的水，煮沸13分钟，然后加入质量百分比为1.2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/3后加入其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

实施例6 

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表。该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。 

斜面培养基配方：葡萄糖1g、酵母提取物0.1g、蛋白胨0.2g、琼脂1.5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面。 

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵 

发酵培养基配方为：蔗糖60g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，硫酸铁0.1g/L； 

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，采用蓝藻内生真菌TD06的深层发酵， 

控制参数为：装料系数为90％(v/v)，接种量为20％(v/v)，pH＝7.0，温度25～30℃，罐压0.5Mpa，搅拌速度150rpm，空气流量1.0vvm 

第二步，胞外多糖分离 

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/4，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀4倍体积的水，煮沸15分钟，然后加入质量百分比为2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/4后加入其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品； 

第三步，多糖纯化 

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品： 

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。 

上述所有实施例中，所涉及的原料均属公知和可以获得的，所涉及的具体工艺方法均是本技术领域的技术人员所熟知的。 

Claims (1)

1.一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，其具体步骤是：

生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表；该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。

斜面培养基配方：葡萄糖0.5～1g、酵母提取物0.05～0.1g、蛋白胨0.1～0.2g、琼脂1～1.5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面；

第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵

发酵培养基配方为：蔗糖30～60g/L，硝酸钠2～3g/L，磷酸二氢钾0.5～1g/L，氯化钾0.1～1g/L，七水硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸铁0.01～0.1g/L；

将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，选用以下两种方法的任意一种：

A.蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵

控制参数为：发酵温度25～27℃，摇床转数为130～150rpm，装料系数为30～50％(v/v)，接种量为1～10％(v/v)，pH控制在5.5～6.5，发酵周期为6～8天，

B.蓝藻内生真菌TD06的深层发酵

控制参数为：装料系数为75～90％(v/v)，接种量为1～20％(v/v)，pH＝5.5～7.0，温度25～30℃，罐压0.01～0.5Mpa，搅拌速度60～150rpm，空气流量0.4～1.0vvm；

第二步，胞外多糖分离

将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2～1/4，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀2～4倍体积的水，煮沸10～15分钟，然后加入质量百分比为0.2～2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2～1/4后加入与其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品；

第三步，多糖纯化

将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品：

该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。

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