CN104726343A - 藏红花内生真菌、粗多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种保藏编号为CCTCC No.M2013473的藏红花内生真菌（Penicillium sp.），还提供了通过该藏红花内生真菌制备得到的粗多糖及其制备方法和应用。本发明所制得的藏红花内生真菌粗多糖具有很好的抗氧化性，可作为天然抗氧化剂应用于食品、医药和化妆品等领域。

Description

藏红花内生真菌、粗多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种生物多糖及其制备方法和用途，特别是一种藏红花内生真菌、藏红花内生真菌粗多糖及其制备方法和用途。
背景技术
藏红花(Crocus sativus L.)也称西红花、番红花，系鸢尾科(Iridaceae)番红花属(Crocus L.)多年生草本植物。是我国一种名贵传统中药材。其性味甘平，具有活血化瘀、解郁安神、增强免疫力、降低胆固醇之功效。近年来，随着现代医学、药学以及分子生物学技术的飞速发展，发现藏红花在抗肿瘤、保护神经系统及抗心血管系统疾病等方面有良好功效，几乎无毒副作用。然而，藏红花只是柱头入药,产量极低；又因为其资源极其有限,致使其价格昂贵，一直被誉为“植物黄金”，难以满足市场的需求。
植物内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物组织和器官内部的菌，是与宿主植物在长期共同进化过程中衍生的一类微生物。1993年美国科学家Stierle等从短叶红豆杉分离得到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，掀起了从植物中分离内生真菌并对其药理活性和机理研究的热潮。至今研究表明，植物内生真菌可产生与宿主植物相似或相同活性成分的代谢产物。内生真菌有望成为代替药用植物的资源,从而解决部分药用植物资源短缺的问题。同时，内生真菌易于发酵培养，便于工业化生产。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产品产量、降低成本，满足市场的需求。还可解决许多药用植物资源被大量采伐而引起的资源和生态危机，有利于珍稀濒危药用植物资源的保护。
现有技术中，Escribano等(Escribano J.,Piqueras A.,Medina J.,et al.Production of a cytotoxic proteoglycan using callus culture of saffron corms(Crocussativus L.)[J].J.Biotechnol,1999,73(1):53-59.)研究发现,从藏红花球茎分离出的一种蛋白多糖能显著抑制体外Hela细胞的生长,对子宫上皮癌细胞也具有显著的细胞毒性作用。赵成刚等（赵成刚,瞿伟菁,黄一泓.西红花花瓣粗多糖提取纯化工艺及体外抗氧化研究[J].食品工业，2012,1:1-4.）对西红花花瓣粗多糖进行了提取，证实其对羟自由基、DPPH自由基均有一定的清除作用。
目前，对于藏红花内生真菌方面的研究报道还非常少，且对于藏红花内生真菌粗多糖的开发和应用更有待人们做进一步的探索和研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种藏红花内生真菌（Penicillium sp.）。
实现上述目的的技术方案如下。
一种藏红花内生真菌（Penicillium sp.），其保藏编号为CCTCC No.M2013473。
上述藏红花内生真菌（Penicillium sp.）在制备藏红花内生真菌粗多糖中的应用。
本发明的另一目的是提供一种藏红花内生真菌粗多糖。
具体技术方案如下。
一种藏红花内生真菌粗多糖，其是通过保藏编号为CCTCC No.M2013473的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）制备得到的。
本发明的另一目的是提供一种藏红花内生真菌粗多糖的制备方法。
实现该目的的技术方案如下。
一种藏红花内生真菌粗多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）以PYG液体培养基对保藏编号为CCTCC No.M2013473的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）进行发酵，将发酵产物过滤，得发酵液；
（2）将步骤（1）所得发酵液，经浓缩、离心、乙醇沉淀、离心、洗涤沉淀物和干燥，即得。
在其中一个实施例中，所述步骤（2）为：将所述发酵液，浓缩，离心弃沉淀，取上清液；上清液在搅拌下缓慢加入3倍以上（更优选为3～5倍）体积量的乙醇，静置，离心,得沉淀物；所述沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥，即得藏红花内生真菌粗多糖。
在其中一个实施例中，步骤（1）中所述发酵的操作条件为：接种量：1%以上（更优选为1～5%，V/V），发酵温度：25～28oC，摇床转速：100～200r/min，发酵周期：5～10天。
在其中一个实施例中，所述PYG液体培养基的配方为：酵母浸膏0.5～1.5g，蛋白胨1.5～2.5g，葡萄糖8～12g，氯化钠1.5～2.5g，pH6.8～7.2，加去离子水至总体积1000mL。
本发明的另一目的是提供上述藏红花内生真菌粗多糖的应用。
具体技术方案如下。
上述的藏红花内生真菌粗多糖在制备抗氧化剂中的应用。
上述的藏红花内生真菌粗多糖可作为抗氧化剂在制备食品、医药或化妆品的应用。
一种抗氧化剂，其活性物质包括有上述藏红花内生真菌粗多糖。
本发明所述的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）已于2013年10月14日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：武汉大学)，保藏日期2013年10月14日，保藏编号CCTCC No.M2013473。
本发明具有如下有益效果：
本发明针对药用植物藏红花资源稀缺、可用成分少、培养难以扩大而导致的产量低、价格昂贵的问题，根据植物内生真菌的共生理论，分离到一种新的藏红花内生真菌，再以其代谢产物为新药源，提供了一种藏红花内生真菌粗多糖，所得粗多糖具有显著的抗氧化活性，并表现出明显的量效相关性。在1.00mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为85.74±0.07%；在1.600mg/mL时，对羟自由基的清除率为92.80±0.28%；在6.0000mg/mL时，对超氧阴离子自由基清除率为43.91±1.15%。并能有效地抑制大鼠红细胞溶血及对脂质过氧化有明显地保护作用，能够抑制体系中MDA的生成：在2.0mg/mL时，对大鼠红细胞溶血抑制率为56.14±4.35%，对MDA生成抑制率为59.86±5.43%。试验结果表明，藏红花内生真菌粗多糖具有清除自由基及抑制脂质过氧化的作用，是一种天然的抗氧化剂，可应用于食品、医药和化妆品等领域。
本发明还提供了所述藏红花内生真菌粗多糖的制备方法，利用内生真菌发酵实现该生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足市场的需求。
附图说明
图1是本发明所述内生真菌的菌落正面。
图2是本发明所述内生真菌的菌落背面。
图3是本发明所述内生真菌的显微结构（200倍）。
图4为实施例2中，不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对DPPH自由基清除作用的试验结果。
图5为实施例2中，不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对羟自由基清除作用的试验结果。
图6为实施例2中，不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对超氧阴离子自由基清除作用的试验结果。
图7为实施例2中，不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对大鼠红细胞氧化性溶血抑制作用的试验结果。
图8为实施例2中，不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对大鼠红细胞MDA生成的抑制作用的试验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例是藏红花内生真菌粗多糖的制备方法实施例。
1、培养基的制备：
本发明所述的PDA培养基和PYG液体培养基是通过以下方法配得。
（1）PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂）：马铃薯200g（去皮，切成小块，适当去离子水煮沸20min，纱布过滤，弃马铃薯泥，取滤液），葡萄糖10g，琼脂15g，pH自然，去离子水定容至1000mL。
（2）PYG液体培养基：酵母浸膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖10g，氯化钠2g，pH6.8～7.2，去离子水定容至1000mL。
使用前培养基在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
2、菌种的活化：
所述内生真菌，是通过严格的表面消毒方法，运用内生真菌分离、纯化技术，从健康的藏红花球茎分离得到。该株菌的种属鉴定为Penicillium sp.。保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期2013年10月14日，保藏编号CCTCC No.M2013473。
在无菌条件下，用接种环挑取少许保藏于PDA斜面培养基的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）菌种，转接于装有PDA培养基的培养皿中，置恒温恒湿箱内，湿度为80%，温度为28℃，活化培养5天，得到活化菌种。
所述内生真菌，PDA培养基28℃培养3天，菌落直茎28mm,5天33mm，7天41mm。菌落边缘整齐，短绒毛状，菌丝疏松，浅青灰色，后转为灰绿色；菌落背面为肉桂色。显微镜观察菌丝体具横隔，多次分支，有细刺，分生孢子球状，排列成链。（参见图1、2、3）
本发明所述内生真菌的内转录间隔区序列（ITS）如下：
ATTGGCATCCTACCTGATCCGAGGTCACCTGAAAAGGATGATTGGTTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACTCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCGGGGGGACGGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTTATTTAGTTTATGCTCAGACTGCAATCTTCAGACAGAGTTCAATGGTGTCTCCGGTGCGCGCGGACCCGGGGGCAGAAGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCGCACCGAAGCAACAAGGTACAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTTACTTCCAAGGTTTAATGAAAAAGAGATGGGAGGAGGACTTGAACGAACCCTGATTCCGTGTTGTTAGAACTATGTTGCCAGAGGTGGAGCACTGAGGGTTGACGTTGAAGTTGTGGTTCT（SEQ ID NO.1)。
3、种子培养：
用打孔器在无菌条件下将活化菌种打成直径为6mm的菌块，将2块菌块接种于装有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶内，摇床培养，转速120r/min，28℃培养3天，得种子培养液。
4、发酵培养：
将种子培养液接种到装有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶内，摇床培养，接种量2%，转速120r/min，28℃培养7天，纱布过滤菌体，得发酵液。
5、醇沉、洗涤、干燥
将上述发酵液，真空浓缩至原体积（1L）的1/4，离心弃沉淀，取上清液。在搅拌下向上清液缓慢加入4倍体积量95%（V/V）乙醇，4℃静置12h，4000r/min离心15min，得沉淀物。沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，各洗涤三遍。60℃真空干燥，即得棕黑色粗多糖。
实施例2：
本实施例是对实施例1中制备得到的藏红花内生真菌粗多糖进行的体外抗氧化系列试验，所得试验结果如图4～图8所示。
1、试验方法
（1）对DPPH自由基的清除试验
样品管中加入0.5mL不同浓度的粗多糖溶液（终浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.75和1.00mg/mL）与3.5mL的0.1mmol/L溶于80％（V/V）乙醇的DPPH溶液（现配现用）；样品对照组中用80%乙醇代替DPPH溶液；空白组中用蒸馏水代替粗多糖溶液。以上各实验组溶液混匀后，置黑暗处，室温放置30min后，用0.5mL蒸馏水和3.5mL80%乙醇调零，于517nm处，1cm光径，测各管吸光度。维生素C（Vc）为阳性对照。按下公式计算粗多糖对DPPH自由基清除率：
DPPH清除率%=100×[A空白–(A样-A样对)]/A空白
（2）对羟自由基的清除试验
该试验方法是按羟自由基测试盒方法进行，具体试验方法参见羟自由基测试盒说明书（南京建成生物工程研究所，货号A018）。根据Fenton反应原理，取粗多糖溶液0.2mL(终浓度分别为0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、1.200和1.600mg/mL)，依次加入反应试剂，混匀，37℃恒温水浴反应1min，立即加入显色剂终止反应，混匀，室温放置20min后，1cm光径，550nm,双蒸水调零，测各管吸光度值。对照管中用等体积的蒸馏水代替粗多糖溶液。Vc为阳性对照。按下公式计算粗多糖对羟自由基的清除率。
羟自由基的清除率%=100×（A对-A样）/A对
（3）对超氧阴离子自由基的清除试验
该试验方法是按抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒进行，具体试验方法参见抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒说明书（南京建成生物工程研究所，货号A052）。模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，取粗多糖溶液50μL(终浓度分别为0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000、4.0000和6.0000mg/mL)，依次加入反应试剂，37℃恒温水浴反应40min，加入显色剂显色，混匀，10min后在550nm处测定吸光度。对照管中用等体积的蒸馏水代替粗多糖溶液。Vc为阳性对照。按下公式计算粗多糖对超氧阴离子自由基的清除率。
超氧阴离子自由基的清除率%=100×（A对-A样）/A对
（4）抑制H2O2诱导大鼠红细胞溶血及丙二醛(MDA)生成试验
SD大鼠眼眶采血,肝素钠抗凝,以3000r/min的转速离心10min,除去上清液,分离红细胞,生理盐水洗涤三次后，制成体积百分比浓度为1%的大鼠红细胞悬浮液。样品测定组为0.5mL不同浓度的粗多糖溶液（终浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mg/mL），加1mL1%大鼠红细胞悬浮液，0.2mL H2O2（终浓度为100mmol/L）；样品对照组用等体积生理盐水代替1%大鼠红细胞悬浮液；正常组用等体积生理盐水代替粗多糖溶液和H2O2；模型组用等体积的生理盐水代替粗多糖溶液。摇匀，37℃孵育1h后，3000r/min，离心10min。取上清液1mL，用3mL生理盐水稀释后，在415nm处，1cm光径，生理盐水调零，测定各管吸光度。再取上清液0.2mL，按丙二醛（MDA）测试盒方法（南京建成生物工程研究所，货号A003-1）测定各管中MDA含量。Vc为阳性对照。用以下公式据计算粗多糖抑制率。
溶血率%=100×（A样-A样对）/A模
溶血抑制率%=100×（模型组溶血率-样品组溶血率）/（模型组溶血率-正常组溶血率）
MDA含量（nmol/mL）=[（A测-A对照）/（A标准-A空白）]×标准品浓度（10nmol/mL）
MDA生成抑制率%=100×（模型组MDA含量-样品组MDA含量）/（模型组MDA含量-正常组MDA含量）
2、试验结果
（1）粗多糖对DPPH自由基的清除能力以清除率表示，清除率越高，说明粗多糖抗氧化作用越强。由图4可知，所述藏红花内生真菌粗多糖对DPPH自由基有显著的清除能力，清除作用随着浓度的增大而显著增强。在浓度为0.05～1.00mg/mL的浓度范围内，它的清除率为19.17±1.19%～85.74±0.07%。
（2）由图5可知，粗多糖对羟自由基的清除作用较强，其清除作用在0.025～1.600mg/mL剂量范围内显正相关量效关系。所述粗多糖在浓度为0.400mg/mL时，清除率已高达91.22±0.76%，与同浓度下的Vc清除率(98.99±0.20%)为同一水平。说明粗多糖对羟自由基有很强的清除活性。
（3）由图6可知，随着粗多糖浓度的增加,粗多糖对超氧阴离子自由基的清除活性也逐步增高，但整体能力稍弱，在浓度为6.0000mg/mL时,所述粗多糖的清除率为43.91±1.15%。说明该粗多糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除活性。
（4）由图7、8可知，粗多糖能够有效地抑制大鼠红细胞溶血和MDA的生成。随着粗多糖浓度的增加，溶血抑制率增强，体系中MDA的含量也逐渐减少。在浓度为2.0mg/mL时,所述粗多糖抑制红细胞溶血率为56.14±4.35%，对MDA生成抑制率为59.86±5.43%。说明粗多糖具有抑制H2O2诱导大鼠血红细胞溶血和MDA生成的活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.藏红花内生真菌（Penicillium sp.），其特征在于，其保藏编号为CCTCCNo.M2013473。
2.权利要求1所述的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）在制备藏红花内生真菌粗多糖中的应用。
3.一种藏红花内生真菌粗多糖，其特征在于，其是通过保藏编号为CCTCCNo.M2013473的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）制备得到的。
4.一种藏红花内生真菌粗多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）以PYG液体培养基对保藏编号为CCTCC No.M2013473的藏红花内生真菌（Penicillium sp.）进行发酵，将发酵产物过滤，得发酵液；
（2）将步骤（1）所得发酵液，经浓缩、离心、乙醇沉淀、离心、洗涤沉淀物和干燥，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）为：将所述发酵液，浓缩，离心弃沉淀，取上清液；上清液在搅拌下缓慢加入上清液3倍以上体积量的乙醇，静置，离心,得沉淀物；所述沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，取沉淀物，干燥，即得藏红花内生真菌粗多糖。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述发酵的操作条件为：接种量：1%（V/V）以上，发酵温度：25～28oC，摇床转速：100～200r/min，发酵周期：5～10天。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述PYG液体培养基的配方为：酵母浸膏0.5～1.5g，蛋白胨1.5～2.5g，葡萄糖8～12g，氯化钠1.5～2.5g，pH6.8～7.2，加去离子水至总体积1000mL。
8.权利要求3所述的藏红花内生真菌粗多糖在制备抗氧化剂中的应用。
9.权利要求3所述的藏红花内生真菌粗多糖作为抗氧化剂在制备食品、医药或化妆品的应用。
10.一种抗氧化剂，其特征在于，其活性物质包括有权利要求3所述藏红花内生真菌粗多糖。
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