JP6750092B2

JP6750092B2 - ペジクラ属菌ｓｃ１３３７菌株およびそれを利用した三糖エステル誘導体の製造方法

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Publication number: JP6750092B2
Application number: JP2019504989A
Authority: JP
Inventors: 良雄徐; 孝義魏; ▲ジン▼花薛; 萍呉; 翰祥李
Original assignee: 中国科学院華南植物園
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2020-09-02
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: JP2019521700A; CN106867917B; CN106867917A; WO2018166159A1

Description

本発明は天然物分野に属し、具体的には、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７菌株およびそれを利用した三糖エステル誘導体の製造方法に関する。

オリゴ糖(ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ)は、２〜９個の単糖がグリコシド結合によって形成されるオリゴマーであり、結合された単糖の数によって、二糖、三糖、四糖、ないし九糖に分類される。オリゴ糖の中には、人や動物により消化・吸収できないが、特殊な生理機能を有するものがあり、機能性オリゴ糖と呼ばれている。現在、スタキオース、ラフィノース、ラクツロース、ラクチュロース、イソマルツロース、キシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、パラチノースオリゴ糖、大豆オリゴ糖、キトサンオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、ガラクトマンナンオリゴ糖およびゲンチオオリゴ糖など多くのオリゴ糖が添加物として食品分野に広く応用されている。

オリゴ糖と脂肪酸が結合してオリゴ糖エステルを形成した時、オリゴ糖エステル分子内に親油性と親水性の両方の官能基を持つことから、典型的な非イオン性バイオ界面活性剤の一種となる。一般的に、イオン性界面活性剤に比べ、糖エステルの方が、より高い生体適合性・生物分解性および安全性を有し、環境にやさしい界面活性剤の一種である。現在、糖エステルは食品、医薬品、発酵、化粧品、洗剤、化学肥料などの分野に広く応用されている。

よく見られる三糖の種類は多くなく、サトウキビに存在するラフィノース、竜胆の根に存在するゲンチアノース、松柏から分泌されるメレジトースやオオバコの種に存在するプランテオース（ｐｌａｎｔｅｏｓｅ）、および多糖類の部分加水分解生成物としてのマルトトリオースなどが挙げられる。三糖エステルに関する報告はさらに稀で、Ｓｍｉｔｈが１９９７年に酵素反応によりトレハロースとα−マンノースを基質としてオリゴ糖「６−Ο−α−マンノーストレハロース」を合成したことを除き、トレハロースの６−Ο−β−Ｌ−マンノシド及びその誘導体（糖エステルを含む）について研究した人がいない上、抗微生物（真菌）用途に関する報告もない。

本発明の第１の目的は、植物でよく見られる１２種類の病原性真菌に対して顕著な抑制活性を有すると共に、果物に対して鮮度保持効果を有する五つの化合物を産生することができる、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を提供することである。

本発明のペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７は、２０１７年２月１５日に広東省微生物菌種保管センター（ＧＤＭＣＣと略称す、住所：広州市先烈中路１００号大院５９号ビル広東省微生物研究所、郵便番号５１００７０）に保管され、寄託番号はＧＤＭＣＣＮｏ：６０１４４である。

前記の植物でよく見られる１２種類の病原性真菌に対して顕著な抑制活性を有すると共に、果物に対して鮮度保持効果を有する五つの化合物は、いずれも三糖エステル化合物であり、そのグリコシル基部分は、トレハロース及びトレハロースの６'位に結合したβ−Ｌ−マンノースから構成され、トレハロースの２位、３位、４位は、それぞれ３つのＣ５〜Ｃ１１の直鎖または側鎖を有する脂肪酸と結合し、具体的には化合物１、化合物２、化合物３、化合物４および化合物５であり、前記の化合物１の構造式を式１に示し、化合物２の構造式を式２に示し、化合物３の構造式を式３に示し、化合物４の構造式を式４に示し、化合物５の構造式を式５に示す。

本発明の第２の目的は、上記の化合物１〜５の製造方法を提供することであり、以下のステップを含むことを特徴とする。
前記化合物１〜５はペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の発酵培養物から分離して得られたものである。

好ましくは、具体的なステップは以下のとおりである。
ａ、ペジクラ属菌ＳＣ１３３７の発酵培養物を調製する。
ｂ、発酵培養物が固体の場合、発酵培養物をエタノールで抽出し、水でエタノールを取り除いた後の抽出物の懸濁液を調製し、さらに酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮し酢酸エチル抽出物を得る。あるいは発酵培養物が液体の場合、発酵培養物を酢酸エチルで抽出し、得られた抽出物を濃縮し、酢酸エチル抽出物を得る。
ｃ、酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムにローディングし、体積比９０:１０〜７０:３０のクロロホルム−メタノールの混合溶媒でグラジエント溶離を行い、類似の画分を薄層クロマトグラフィーで検出して合わせ、体積比８５：１５のクロロホルム−メタノールを展開溶媒として薄層板上で展開し、Ｒｆ値０．３〜０．４の画分ＡとＲｆ値０．２〜０．３の画分Ｂを回収する。
画分Ａに対し逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、体積分率８８％のメタノール水溶液でアイソクラティック溶離を行い、主点に集まった画分を回収して合わせた後、体積分率８８％のメタノール水溶液を移動相とした高速液体クロマトグラフィー精製で化合物５を得る。
画分Ｂに対してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、体積分率６５％〜８５％のメタノール水溶液でグラジエント溶離を行い、体積分率８５％のメタノール水溶液の溶出部分を回収して濃縮した後、体積分率８５％のメタノール水溶液を移動相とした高速液体クロマトグラフィーを用いた分離精製で化合物１〜４を得る。

前記のペジクラ属菌ＳＣ１３３７の発酵培養物の調製は、小麦固形培地を用いてペジクラ属菌ＳＣ１３３７を２４〜２８℃の暗所で静置培養し、固形発酵培養物を得ることであり、前記の小麦固形培地は質量比１：１．５の小麦と水を混合してなる。あるいは米固形培地を用いて、ペジクラ属菌ＳＣ１３３７を２４〜２８℃の暗所で１０〜３０日間静置培養し、固形発酵培養物を得ることであり、前記の米固形培地は１：１の質量比で米と水を混合したものである。あるいはＰＤＢ液体培地を用いて、ペジクラ属菌ＳＣ１３３７を２４〜２８℃の暗所で３〜８日間振とう培養し、液体発酵培養物を得ることであり、前記のＰＤＢ培地は１リットル当たりジャガイモ抽出物６ｇ、グルコース２０ｇを水で調製したもので、ｐＨ値は６．０〜６．５である。

本発明の第３の目的は化合物１、２、３、４又は５の製造におけるペジクラ属菌ＳＣ１３３７の応用を提供することである。

本発明は落羽松の枝内生菌から分離を行い、ペジクラ属菌ＳＣ１３３７を得ている。本菌が、植物でよく見られる１２種類の病原性真菌に対して顕著な抑制活性を有すると共に、果物に対して鮮度保持効果を有する五つの化合物を産生することができることから、本菌を用いて、植物でよく見られる１２種類の病原性真菌に対して顕著な抑制活性を有すると共に、果物に対して鮮度保持効果を有する上記の五つの化合物を製造し、植物の病原性真菌の予防治療と果物の鮮度保持に使用するなど、幅広い応用が見込まれる。

ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７は２０１７年２月１５日に広東省微生物菌種保管センター（ＧＤＭＣＣと略称す、住所：広州市先烈中路１００号大院５９号ビル広東省微生物研究所、郵便番号５１００７０）に保管され、寄託番号はＧＤＭＣＣＮｏ：６０１４４である。

ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７のコロニー形態を示す。ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の菌糸と胞子の形態を示す。

以下の実施例は本発明に関してより詳細に説明するものであり、本発明を限定するものではない。

（実施例１）
ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７及びその菌種の同定
本発明のペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７は華南植物園の落羽松の枝内生菌から分離して得られたものであり、分離方法は：採取した落羽松の枝サンプルを７５％エタノールで３０秒間表面消毒した後、再度質量分率１０％の次亜塩素酸ナトリウムで３分間消毒を行い、滅菌水で３回洗浄した後に乾燥させてＰＤＡ培地に接種し、２８℃のインキュベーターで５日間培養し、滅菌爪楊枝でターゲットのコロニーをピックアップして得た。前記のＰＤＡ培地は１リットル当たりジャガイモ抽出物６ｇ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇを水で調製したもので、ｐＨ値は６．０〜６．５であり、この培地を用いてペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を分離して得た。当該菌株はＰＤＡ培地での成長が遅く、１０日間の培養後、コロニーの平均直径は４ｃｍ未満で、縁がなめらかで、気菌糸の繁殖が旺盛で密度が低く、絨毛状を呈する。コロニー表面の中央部は灰褐色を呈し且つ濃緑色を帯び、縁は灰白色である。コロニー裏面の中央部は黒褐色を呈し、縁は薄い灰色に濃緑色を帯びる。滲出液はなく、可溶性色素が乏しい。菌糸の幅は２〜３μｍで、やや淡褐色を呈し、枝分かれし、隔壁を有する。胞子は長楕円形で、淡褐色を呈し、滑らかで、大きさは１４〜２２×４〜６μｍであり、コロニーの形態及び菌糸（胞子を含む）の形態はそれぞれ図１、図２で示したとおりである。典型的なＣＴＡＢ法で菌糸体からＤＮＡを抽出し、ＩＴＳ４（５’-３’）：ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣおよびＩＴＳ５（５’-３’）：ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧをプライマーとし、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）１μＬ、Ｐｒｉｍｅｒｓ（１０μＭ／ｅａｃｈ）２μＬ、Ｔａｑ酵素（５Ｕ／μＬ）０．３μＬ，テンプレートＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）５μＬ、ｄｄＨ_２Ｏ３２．７μＬの反応液を用いて，９４℃ ５ｍｉｎ、９４℃ ４０ｓ、５７-５２℃ １ｍｉｎ、７２℃ １ｍｉｎ、ｃｙｃｌｅｓ３５、７２℃ ６ｍｉｎのプログラムでＰＣＲ増幅を行った後、シークエンシングによって得られたＤＮＡ配列をＳＥＱＩＤＮＯ．１に示す。シークエンシング結果をＧｅｎｂａｎｋデータベースのＢｌａｓｔで検索およびアラインメント解析を行い、得られたＩＴＳ断片（合計９１７ｂｐ）の相同性とＰｅｚｉｃｕｌａｃｉｎｎａｍｏｍｅａの相同性が最も高く、ＩＴＳ類似性は９６％であった。このことから、当該菌をペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７と命名し、２０１７年２月１５日に広東省微生物菌種保管センター（ＧＤＭＣＣと略称す、住所：広州市先烈中路１００号大院５９号ビル広東省微生物研究所、郵便番号５１００７０）に保管し、寄託番号はＧＤＭＣＣＮｏ：６０１４４となった。

（実施例２）
５種の三糖エステル誘導体の製造およびその理化学的性質とスペクトルデータ
小麦固形培地（質量比１：１．５の小麦と水を混合してなる）を用いて、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を２８℃の暗所で１２日間静置培養し、固形発酵培養物を得た。

固形発酵培養物 (３．６Ｌ) を同体積の体積分率９５％のエタノール水溶液で３回浸漬し、毎回４８時間、浸漬液を合わせてろ過した後、減圧濃縮でエタノールを取り除き、水で１Ｌに定容し、さらに同体積の酢酸エチルで３回抽出を行い、得られた酢酸エチル抽出液を合わせ、濃縮することで１７．６ｇの酢酸エチル抽出物を得た。

酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラム（シリカゲル１００〜２００メッシュ、３００ｇ）にローディング、体積比９０:１０〜７０:３０のクロロホルム−メタノールの混合溶媒でグラジエント溶離を行い、類似の画分を薄層クロマトグラフィー（シリカゲルガラス板）で検出して合わせ、薄層板においてクロロホルム−メタノールの体積比８５：１５で展開した時のＲｆ値０．３〜０．４の画分を回収し、減圧濃縮後１．６９ｇの画分Ａが得られ、また、Ｒｆ値０．２〜０．３の画分を回収し、減圧濃縮後８．５０ｇの画分Ｂが得られた。

画分Ａに対し逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ、７５ μｍ、１５０ｇ、日本富士化学株式会社製）を行い、体積分率８８％のメタノール水溶液でアイソクラティック溶離し、主点に集まった画分を回収して合わせた後、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ-６ＡＤセミ分取高速液体クロマトグラフ、ＲＩＤ-１０Ａ検出器、日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ製；カラムはＳｈｉｍ-ｐａｃｋＰＲＣ-ＯＤＳ、１０×２５０ｍｍ、４．５ μｍ）で体積分率８８％のメタノール水溶液を移動相とし、流速５ｍｌ/ｍｉｎで精製することで、白色の粉末の化合物５（０．０３０ｇ、ｔ_Ｒ= ６０ｍｉｎ）が得られた。

画分Ｂを１．０ｇ取り、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ、７５ μｍ、１５０ｇ）を行い、体積分率６５％〜８５％のメタノール水溶液でグラジエント溶出し、８５％の溶出部分を回収して濃縮した後、高速液体クロマトグラフィー（検出器とカラムは同上）により、体積分率８７％のメタノール水溶液を移動相とし、流速５ｍｌ/ｍｉｎで、分離精製することで４種の白色粉末が得られ、それぞれ化合物１（０．１２２ｇ、ｔ_Ｒ = ５５ｍｉｎ）、化合物２（０．１２０ｇ、ｔ_Ｒ = ４５ｍｉｎ）、化合物３（０．０１０ｇ、ｔ_Ｒ = ３３ｍｉｎ）および化合物４（０．０２２ｇ，ｔ_Ｒ = ２８ｍｉｎ）となった。

化合物１は、白色粉末で、分子式Ｃ_４１Ｈ_７２Ｏ_１９、陽イオンＨＲＥＳＩＭＳｍ/ｚ８９１．４５５２［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４１Ｈ_７２Ｏ_１９Ｎａ, ８９１．４５６０）、陽イオンＥＳＩＭＳｍ/ｚ８９１［Ｍ＋Ｎａ］⁺，９０７［Ｍ＋Ｋ］⁺；陰イオンＥＳＩＭＳｍ/ｚ８６７［Ｍ−Ｈ］⁻、９０３［Ｍ + Ｃｌ］⁻である。^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲ（溶媒：重水素化メタノール）のデータは表１を参照。以上のスペクトルデータおよび二次元核磁気共鳴方法により、化合物１を６−Ο−β−Ｌ−マンノース−３−Ο−（２-メチルブチリル）−４−Ο−（８−メチルデカノイル）−２−Ο−（４−メチルヘキサノイル）トレハロースと同定し、その構造式は式１に示したとおりである。

そのうち、化合物２は、白色粉末で、分子式Ｃ_４０Ｈ_７０Ｏ_１９、陽イオンＨＲＥＳＩＭＳｍ／ｚ８７７．４４１１［Ｍ + Ｎａ］⁺ (ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４０Ｈ_７０Ｏ_１９Ｎａ、８７７．４４０４)、陽イオンＥＳＩＭＳｍ/ｚ８７７［Ｍ + Ｎａ］⁺；陰イオンＥＳＩＭＳｍ/ｚ８５３［Ｍ−Ｈ］⁻，８８９［Ｍ + Ｃｌ］⁻である。^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲ（溶媒：重水素化メタノール）のデータは表１を参照。以上のスペクトルデータおよび二次元核磁気共鳴方法により化合物２を４−Ο−デカノイル−６−Ο−β−Ｌ−マンノピラノシル−３−Ο−(２-メチルブチリル)−２−Ο−(４-メチルヘキサノイル)トレハロースと同定し、その構造式は式２に示したとおりである。

そのうち、化合物３は、白色粉末で、分子式Ｃ_３９Ｈ_６８Ｏ_１９、陽イオンＨＲＥＳＩＭＳｍ／ｚ８６３．４２５５［Ｍ＋Ｎａ］⁺ （ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３９Ｈ_６８Ｏ_１９Ｎａ、８６３．４２４７）、陽イオンＥＳＩＭＳｍ／ｚ８６３［Ｍ＋Ｎａ］⁺；陰イオンＥＳＩＭＳｍ／ｚ８３９［Ｍ−Ｈ］⁻，８７５［Ｍ＋Ｃｌ］⁻である。^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲ（溶媒：重水素化メタノール）のデータは表１を参照。以上のスペクトルデータおよび二次元核磁気共鳴方法により化合物３を６−Ο−β−Ｌ−マンノピラノシル−３−Ο−（２-メチルブチリル）−２−Ο−（４-メチルヘキサノイル）−４−Ο−（６-メチルオクタノイル）トレハロースと同定し、その構造式は式３に示したとおりである。

そのうち、化合物４は、白色粉末で、分子式Ｃ_３８Ｈ_６６Ｏ_１９、陽イオンＨＲＥＳＩＭＳｍ／ｚ８４９．４０８８［Ｍ＋Ｎａ］⁺ （ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３８Ｈ_６６Ｏ_１９Ｎａ、８４９．４０９１）、陽イオンＥＳＩＭＳｍ／ｚ８４９［Ｍ＋Ｎａ］⁺；陰イオンＥＳＩＭＳｍ／ｚ８２５［Ｍ−Ｈ］⁻である。^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲ（溶媒：重水素化メタノール）のデータは表２を参照。以上のスペクトルデータおよび二次元核磁気共鳴方法により、化合物４を６−Ο−β−Ｌ−マンノピラノシル−３−Ο−（２−メチルブチリル）−２−Ο−（４−メチルヘキサノイル）−４−Ο−オクタノイルトレハロースと同定し、その構造式は式４に示したとおりである。

そのうち、化合物５は、白色粉末で、分子式Ｃ_４３Ｈ_７４Ｏ_２０、陽イオンＥＳＩＭＳｍ/ｚ９３３ [Ｍ + Ｎａ]⁺，９４９ [Ｍ + Ｋ]⁺；陰イオンＥＳＩＭＳｍ/ｚ９０９ [Ｍ−Ｈ]⁻，９４５ [Ｍ + Ｃｌ]⁻である。^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲ（溶媒：重水素化メタノール）のデータは表２を参照。以上のスペクトルデータおよび二次元核磁気共鳴方法により、化合物５を６-Ｏ-β-Ｌ-マンノピラノシル-３-Ｏ-(２-メチルブチリル)-４-Ｏ-(８-メチルデカノイル)-２-Ｏ-(４-メチルヘキサノイル)-６'-Ｏ-アセチルトレハロースと同定し、その構造式は式５に示したとおりである。

表１化合物１〜３の^１Ｈ及び^１３ＣＮＭＲのデータ
★対応する位置の暫定情報は取り換え可能。

表２化合物４と５の^１Ｈ及び^１３ＣＮＭＲのデータ
★対応する位置の暫定情報は取り換え可能。

（実施例３）
実施例２で得られた三糖エステル（化合物１〜５）の、植物でよく見られる１２種類の科属の病原性真菌に対する生体外抑制活性評価試験
試験に用いた菌株は：１）Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉトマト輪紋病菌；２）Ｂｏｔｒｙｏｓｐｕａｅｒｉａｂｅｒｅｎｇｅｒｉａｎａリンゴ輪紋病菌；３）Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａトマト灰色かび病原菌；４）Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓマンゴー炭疽病菌；５）Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａバナナカルバラリアルナータ；６）Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍバナナ、スイカ萎凋病原菌；７）Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃｉｔｒｉ-ａｕｒａｎｔｉｉ柑橘白かび病菌；８）Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍｍａｙｄｉｓトウモロコシごま葉枯病菌；９）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｉｔａｌｉｃｕｍ柑橘青かび病原菌；１０）Ｐｅｒｏｎｏｐｈｙｔｈｏｒａｌｉｔｃｈｉｉライチべと病菌；１１）Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉイネ紋枯れ病菌；１２）Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａｖｉｒｅｎｓ稲こうじ病菌である。

寒天ディスク拡散法を用いて化合物１〜５の抗真菌活性を測定：復活させた測定用菌をそれぞれＰＤＡ固形培地入りのシャーレに接種し、Ｔ字形アプリケーターで均一に塗布して置いた; メタノールで５０ｍｇ/ｍＬの測定用試料溶液を調製し、試験を行う際に１０μＬ取ってペーパーディスク（直径６ｍｍ）に滴下し、クリーンベンチで乾かし、最終的に各ペーパーディスクに５００ｕｇの試料を含ませたペーパーディスクを上記のシャーレに敷き、２８℃の暗所で７２または９６時間培養した後、抗菌幅（抗菌幅は阻止円の平均直径）を測定した。同体積のメタノールを加えたペーパーディスクを陰性対照とする。

結果、三糖エステル抽出物及び化合物１〜５はいずれも前記の各種植物真菌の成長を抑制する効果を示した。結果は表３を参照。抗菌幅は１０〜２２ｍｍである。上記の三糖エステル抽出物は化合物１〜４を含む混合物であり、化合物１、２、３、４の質量比はおおよそ６０：３５：４：１である。

表３１２種類の植物の病原性真菌に対する三糖エステル抽出物および化合物１〜５の生体外抑制活性

（実施例４）
実施例２で得られた三糖エステル抽出物の、収穫後の柑橘の貯蔵における鮮度保持試験
供試試料：実施例２で得られた三糖エステル抽出物（質量比約６０：３５：４：１の化合物１、２、３、４を含有する４種の化合物の混合物である）を少量のエタノールに溶解し、水で２００、４００、６００ｍｇ/Ｌに希釈し、処理溶液とした。

柑橘果実を処理溶液に５分間浸し、乾かした後、７５％のアルコールで表面殺菌処理し、乾燥させたプラスチック製籠に入れ、０．０２ｍｍのポリエチレン製の薄膜の袋で密封包装し、２５℃で１５日間貯蔵し、病気感染指数に関して観察すると共に記録を行った。病気感染指数の計算方法は：明らかな感染なしの場合は０；軽微な感染の場合は１；感染面積が果実の１/４以下の場合は２；感染面積が果実の１/４−１/２の場合は３；発病面積が果実の１/２以上の場合は４とし、病気感染指数＝Σ（病菌感染度×対応する果実数）／（５×果実の総数）×１００％とする。各処理につき３回繰り返し、１回あたり６０個の果実を使用した。

供試果物：果樹園（従化市）から採取した砂糖橘。

試験結果は表４で示すとおりである。当該三糖エステル抽出物は採取後の柑橘の貯蔵過程での真菌の発生・発展に対して顕著な抑制作用を有し、一般的良く使われている化学合成抗真菌剤チウラムより優れ、チアベンダゾール相当の効果を持ち、顕著な防腐・鮮度保持効果を有する。当該三糖エステル抽出物の抗菌・鮮度保持効果は化学合成抗真菌剤ベルクートよりは少し劣れているが、ベルクートが比較的強い毒性を示すことから、２００４年よりＥＵより使用が禁止されている。

表４三糖エステル抽出物が採取後の柑橘の貯蔵における病原性真菌に対する抑制活性

（付記）
（付記１）
寄託番号ＧＤＭＣＣＮｏ：６０１４４として寄託されたペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７菌株。

（付記２）
化合物１〜５の製造方法であり、前記化合物１〜５は付記１に記載しているペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の発酵培養物から分離して得られることを特徴とし、前記化合物１の構造式を式１に示し、化合物２の構造式を式２に示し、化合物３の構造式を式３に示し、化合物４の構造式を式４に示し、化合物５の構造式を式５に示す、製造方法。

（付記３）
ａ、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の発酵培養物を調製し、
ｂ、発酵培養物が固体の場合、発酵培養物をエタノールで抽出し、水でエタノールを取り除いた後の抽出液の懸濁液を調製し、さらに酢酸エチル抽出で抽出物を得て、得られた抽出物を濃縮し酢酸エチル抽出物を得て、あるいは発酵培養物が液体の場合、発酵培養物を酢酸エチル抽出で抽出物を得て、抽出物を濃縮し酢酸エチル抽出物を得て、
ｃ、酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムにローディングし、体積比９０：１０〜７０：３０のクロロホルム−メタノールの混合溶媒でグラジエント溶離を行い、類似の画分を薄層クロマトグラフィーで検出して合わせ、体積比８５：１５のクロロホルム−メタノールを展開溶媒として薄層板で展開し、Ｒｆ値０．３〜０．４の画分ＡとＲｆ値０．２〜０．３の画分Ｂを回収し、
画分Ａに対し逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、体積分率８８％のメタノール水溶液でアイソクラティック溶離し、主点に集まった画分を回収して合わせた後、移動相の体積分率８８％のメタノール水を用いて溶液高速液体クロマトグラフィーで精製し化合物５を得て、
画分Ｂに対しシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、体積分率６５％〜８５％のメタノール水溶液でグラジエント溶離し、体積分率８５％のメタノール水溶液の溶出部分を回収して濃縮した後、体積分率８５％のメタノール水溶液を移動相とした高速液体クロマトグラフィーで分離精製を行い化合物１〜４を得る、
具体的なステップを含むことを特徴とする付記２に記載の製造方法。

（付記４）
前記のペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の発酵培養物の調製は、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を小麦固形培地とし、２４〜２８℃の暗所で静置培養し、固形発酵培養物を得て、前記の小麦固形培地は質量比１：１．５で小麦と水を混合したものであり、あるいはペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を米固形培地とし、２４〜２８℃の暗所で１０〜３０日間静置培養し、固形発酵培養物を得て、前記の米固形培地は質量比１：１で米と水を混合したものであり、あるいはペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７をＰＤＢ液体培地とし、２４〜２８℃の暗所で３〜８日間振とう培養し、液体発酵培養物を得て、前記のＰＤＢ培地は１リットル当たりジャガイモ抽出物６ｇ、グルコース２０ｇを水で調製したもので、ｐＨ値は６．０〜６．５であることを特徴とする付記３に記載の製造方法。

（付記５）
付記２に記載の化合物１、２、３、４又は５の製造におけるペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７菌の応用。

Claims

寄託番号ＧＤＭＣＣＮｏ：６０１４４として寄託されたペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７菌株。
化合物１〜５の製造方法であり、前記製造方法は、請求項１に記載しているペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を培養する工程を含み、前記化合物１の構造式を式１に示し、化合物２の構造式を式２に示し、化合物３の構造式を式３に示し、化合物４の構造式を式４に示し、化合物５の構造式を式５に示す、製造方法。
ａ、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の発酵培養物を調製し、
ｂ、発酵培養物が固体の場合、発酵培養物をエタノールで抽出し、水でエタノールを取り除いた後の抽出液の懸濁液を調製し、さらに酢酸エチル抽出で抽出物を得て、得られた抽出物を濃縮し酢酸エチル抽出物を得て、あるいは発酵培養物が液体の場合、発酵培養物を酢酸エチル抽出で抽出物を得て、抽出物を濃縮し酢酸エチル抽出物を得て、
ｃ、酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムにローディングし、体積比９０：１０〜７０：３０のクロロホルム−メタノールの混合溶媒でグラジエント溶離を行い、類似の画分を薄層クロマトグラフィーで検出して合わせ、体積比８５：１５のクロロホルム−メタノールを展開溶媒として薄層板で展開し、Ｒｆ値０．３〜０．４の画分ＡとＲｆ値０．２〜０．３の画分Ｂを回収し、
画分Ａに対し逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、体積分率８８％のメタノール水溶液でアイソクラティック溶離し、主点に集まった画分を回収して合わせた後、移動相の体積分率８８％のメタノール水を用いて溶液高速液体クロマトグラフィーで精製し化合物５を得て、
画分Ｂに対しシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、体積分率６５％〜８５％のメタノール水溶液でグラジエント溶離し、体積分率８５％のメタノール水溶液の溶出部分を回収して濃縮した後、体積分率８５％のメタノール水溶液を移動相とした高速液体クロマトグラフィーで分離精製を行い化合物１〜４を得る、
具体的なステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
前記のペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７の発酵培養物の調製は、ペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を小麦固形培地とし、２４〜２８℃の暗所で静置培養し、固形発酵培養物を得て、前記の小麦固形培地は質量比１：１．５で小麦と水を混合したものであり、あるいはペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７を米固形培地とし、２４〜２８℃の暗所で１０〜３０日間静置培養し、固形発酵培養物を得て、前記の米固形培地は質量比１：１で米と水を混合したものであり、あるいはペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７をＰＤＢ液体培地とし、２４〜２８℃の暗所で３〜８日間振とう培養し、液体発酵培養物を得て、前記のＰＤＢ培地は１リットル当たりジャガイモ抽出物６ｇ、グルコース２０ｇを水で調製したもので、ｐＨ値は６．０〜６．５であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
請求項２に記載の化合物１、２、３、４又は５の製造におけるペジクラ属菌（Ｐｅｚｉｃｕｌａｓｐ．）ＳＣ１３３７菌の使用。