CN104212742A - 一种链霉菌菌株及由它制备的具抗植物病原真菌的化合物及其应用 - Google Patents

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CN104212742A CN201410418250.7A CN201410418250A CN104212742A CN 104212742 A CN104212742 A CN 104212742A CN 201410418250 A CN201410418250 A CN 201410418250A CN 104212742 A CN104212742 A CN 104212742A
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赵沛基
周晓雪
李靖
杨银河
曾英
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Kunming Institute of Botany of CAS
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Abstract

本发明提供一种链霉菌FTY2菌株及由它制备的环己酰亚胺类化合物及其应用。本发明的生产菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)FTY2，该菌株已于2014年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.9133，菌种由16S rDNA鉴定。与现有的抗植物病原真菌农药相比，本发明具有对环境无污染、成本低、抗植物病原真菌效果较好的优点。首次发现天然产物的环己酰亚胺类化合物(cycloheximide)具抗真菌，能作为制备抗植物病原真菌药制剂和前体物质的应用。还提供了所述的链霉菌FTY2菌株和环己酰亚胺化合物在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。

Description

一种链霉菌菌株及由它制备的具抗植物病原真菌的化合物及其应用
技术领域：
本发明属生物农药技术领域，涉及一种链霉菌(Streptomyces sp.)FTY2菌株，及由其制备的具有抑制植物病原真菌的化合物及其制备方法和应用。 
背景技术：
农作物病虫草鼠害是农业生产上的重要生物灾害，是制约农业生产高产、优质、高效和持续发展的重要因素之一。我国农作物病虫草鼠等生物灾害种类多，粮食作物的主要病虫害有近200种(胡伯海.2002)。众多病虫害发生重、范围广，给农业生产造成巨大损失，约为农业总产值的20％～25％(王长燕等，2006)，因而严重影响我国的粮食生产和品质安全。植物保护作为防治农业病虫害的重要措施，对促进我国粮食生产安全和保障粮食安全的可持续发展有着十分重要的意义。因此，研究开发高效低毒的生物病虫害制剂已成为农业可持续发展的重要问题。现有技术中未见有一种链霉菌(Streptomyces sp.)FTY2菌株制备两个环己酰亚胺化合物(cycloheximide)以及它们抗植物病原真菌活性的报道。 
发明内容：
本发明的目的在于提供一类来源于榧树的内生链霉菌的链霉菌(Streptomyces sp.)FTY2菌株，由其制备的具有抑制植物病原真菌的化合物及其制备方法和应用。该化合物具有抗病原真菌(小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、棉红腐病菌(Fusarinum moniliforme)、三七丝核病菌(Verticillium cinnabarium)以及水稻稻瘟病菌(Phyricularia oryzae))的活性。 
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 
一种分离自榧树的内生链霉菌(Streptomyces sp.)菌株，编号为FTY2，由16S rDNA鉴定菌株，保藏号为CGMCC No.9133。 
如所述的链霉菌FTY2菌株，其DNA由下述方法制备而得： 
(1)将FTY2接种于液体淀粉培养基中，25℃，200rpm培养14天，过滤收集菌丝体； 
(2)选取适量菌丝体放入1.5mL离心管(EP管)中，同时在离心管中加入少量的石英砂和少量的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)； 
(3)在离心管(内有研磨好的材料粉末)中加入750μL 65℃水浴预热的4×CTAB提取液，充分研磨后，放入65℃水浴锅中温浴2-4h，期间每30min摇匀一次； 
(4)将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入等体积(750μL)的苯酚-氯仿-异戊醇混合液(25:24:1)，摇匀3～5min，12000rpm室温离心10min； 
(5)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇(500-550μL)混合液(若颜色较深可前两次使用苯酚-氯仿-异戊醇混合液，最后一次使用氯仿-异戊醇)，摇匀3～5min，12000rpm，室温离心10min；( 
(6)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，加入2/3体积(约350μL)的-20℃预冷的异丙醇(凝固点低，沉降DNA)，沉降DNA，充分混匀后(一定要充分摇匀，否则会冰冻)，于-20℃冰箱中静置保存2h； 
(7)将冷冻保存的离心管取出后置于室温中，待温度至室温后12000rpm室温离心15min。可见底部沉降DNA； 
(8)弃去上清液，用500μL的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1-2次，每次12000rpm室温离心1min后弃上清液(直接倒掉上清液即可，注意不要将DNA倒掉，倒的过程中可轻轻旋转使DNA贴在壁上)，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min使乙醇充分挥发(也可以开盖使其自然干燥)，干燥后加入灭菌的蒸馏水； 
(9)置于-20℃冰箱中保存备用。 
如所述的链霉菌FTY2菌株，其来源于榧树的内生链霉菌。 
所述的链霉菌FTY2菌株的制备方法，采自海拔2190m的云南省迪庆州维西县云南榧Torreya yunnanensis的新鲜枝条置于冰盒保存，带回实验室后，将新鲜枝叶用自来水冲洗15min，晾干后置于超净工作台上进行表面消毒，先用75％乙醇浸泡约1min，用无菌水涮洗3次，接着用15％的NaClO浸泡15min，用无菌水涮洗3次。取消毒后的3g叶片置于无菌研钵中加5mL无菌水研磨呈匀浆状，用三角涂布棒将200μL研磨液均匀涂布于含有重铬酸钾(50mg/L)的高氏1号固体培养基(可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂20g/L，pH 7.2～7.4)上，在25℃条件下培养20天，一个链霉菌菌落在平板上长出，挑取单一菌落，用划线法纯化后，菌株编号为FTY2。 
从所述的链霉菌FTY2菌株的固体发酵产物的乙酸乙酯部分分离得到的如下结构式所示的两个环己酰亚胺化合物， 
制备所述化合物1-2的方法，将链霉菌FTY2用固体平板的方式用燕麦培养基进行发酵培养，所述燕麦培养基为：燕麦粉20.0g，微量元素母液1mL，蒸馏水1000mL，pH 7.2；所述微量元素母液配方为：FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，蒸馏水100mL；121℃灭菌20min；在26℃发酵培养21d，发酵20L；固体发酵物切割后用80％:15％:5％的乙酸乙酯:甲醇:冰醋酸冷浸提取三次，提取液过滤减压浓缩除去有机相后溶于水中，加入相等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并经旋转蒸发仪浓缩后得粗提物；浸膏经200～300目硅胶柱色谱，以10:1→6:4的石油醚-乙酸乙酯及10:1→0:100的氯仿-甲醇梯度洗脱得10个组分Fr.1-Fr.10；组分Fr.8经200～300目硅胶，用100:15的石油醚-丙酮进行洗脱得到5个亚组分；Fr.8.3为白色粉末状，经Sephadex LH-20氯仿-甲醇1:1，得到Fr.8.3.1和Fr.8.3.2；Fr.8.3.2经半制备HPLC得到化合物1及2，具体条件为：环境温度下，使用250mm×10mm的RP-C18，流动相为水-甲醇溶液，水从60％降至0％，流速为3mL/min，检测波长为254nm。 
所述的链霉菌FTY2菌株在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。 
所述的环己酰亚胺化合物在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。 
本发明的化合物能作为制备抗植物病原真菌药制剂和前体物质的应用。本发明与现有的抗植物病原真菌农药相比，具有对环境无污染、成本低、抗植物病原真菌效果较好的优点。首次发现天然产物的环己酰亚胺类化合物(cycloheximide)具抗真菌，能作为制备抗植物病原真菌药制剂和前体物质的应用。 
附图说明：
图1为本发明两个环己酰亚胺化合物的结构示意图； 
图2为本发明化合物2单晶结构示意图。 
具体实施方式：
下面通过结合附图，借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受这些实施例的限制。 
实施例1： 
1、菌株FTY2发现以及16S rDNA的鉴定： 
采自海拔2190m的云南省迪庆州维西县云南榧Torreya yunnanensis的新鲜枝条置于冰盒保存，带回实验室后，将新鲜枝叶用自来水冲洗15min，晾干后置于超净工作台上进行表面消毒，先用75％乙醇浸泡约1min，用无菌水涮洗3次，接着用15％的NaClO浸泡15min，用无菌水涮洗3次。取消毒后的3g叶片置于无菌研钵中加5mL无菌水研磨呈匀浆状，用三角涂布棒将200μL研磨液均匀涂布于含有重铬酸钾(50mg/L)的高氏1号固体培养基(可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂20g/L，pH 7.2～7.4)上，在25℃条件下培养20天，一个链霉菌菌落在平板上长出，挑取单一菌落，用划线法纯化后，菌株编号为FTY2。 
本发明的生产菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)FTY2，该菌株已于2014年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010－64807355，传真：010－64807288，保藏号：CGMCC No.9133，菌种由16S rDNA鉴定。 
链霉菌DNA的提取采用改进的CTAB法，具体操作步骤如下： 
(1)将FTY2接种于液体淀粉培养基中，25℃，200rpm培养14天，过滤收集菌丝体； 
(2)选取适量菌丝体放入1.5mL离心管(EP管)中，同时在离心管中加入少量的石英砂和少量的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)； 
(3)在离心管(内有研磨好的材料粉末)中加入750μL 65℃水浴预热的4×CTAB提取液，充分研磨后，放入65℃水浴锅中温浴2-4h，期间每30min摇匀一次； 
(4)将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入等体积(750μL)的苯酚-氯仿-异戊醇混合液(25:24:1)，摇匀3～5min，12000rpm室温离心10min； 
(5)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇(500-550μL)混合液(若颜色较深可前两次使用苯酚-氯仿-异戊醇混合液，最后一次使用氯仿-异戊醇)，摇匀3～5min，12000rpm，室温离心10min； 
(6)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，加入2/3体积(约350μL)的-20℃预冷的异丙醇(凝固点低，沉降DNA)，沉降DNA，充分混匀后(一定要充分摇匀，否则会冰冻)，于-20℃冰箱中静置保存2h； 
(7)将冷冻保存的离心管取出后置于室温中，待温度至室温后12000rpm室温离心15min。可见底部沉降DNA； 
(8)弃去上清液，用500μL的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1-2次，每次12000rpm室温离心1min后弃上清液(直接倒掉上清液即可，注意不要将DNA倒掉，倒的过 程中可轻轻旋转使DNA贴在壁上)，然后将离心管置于37℃恒温箱中约20～30min使乙醇充分挥发(也可以开盖使其自然干燥)。干燥后加入灭菌的蒸馏水； 
(9)置于-20℃冰箱中保存备用。 
PCR扩增16S rDNA的基因片段： 
用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增rDNA片段，PCR体系及反应条件如下： 
引物名称         5’-3’ 
27F              AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 
1492R            TACGGYTACCTTGTTACGACTT 
表.1.PCR体系及其方法 
成分 50μL体系用量(μL)
10×Taq buffer 5
dNTP 4
模板(稀释100倍) 1
27F引物(12.5μM) 2
1492R引物(12.5μM) 2
H2O 35.8
rTaq 0.2
总体积 50
表.2.PCR方法 
测序结果通过比对NCBI内生细菌的序列，确认为链霉菌属(Streptomyces sp.)。 
2、化合物1-2的分离制备： 
本发明对链霉菌(Streptomyces sp.)FTY2的固体发酵产物进行了化学成分的研究，从其乙酸乙酯部分分离得到了2个化合物，分别为4-[2′-(3″(S),5″(S)-3″,5″-dimethyl-2″-oxocyclohexylidene)ethyl]piperidine-2,6-dione(1),、 4-[2′-(3″(R),5″(S)-3″,5″-dimethyl-2″-oxocyclohexylidene)ethyl]piperidine-2,6-dione(2)。化合物1及2首次作为天然产物分离得到。 
取上述步骤所得链霉菌FTY2采用固体平板的方式进行发酵培养。燕麦培养基：燕麦粉20.0g，微量元素母液1mL，蒸馏水1000mL，pH 7.2。微量元素母液配方：FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，蒸馏水100mL。121℃灭菌20min。在26℃发酵培养21d，发酵20L。固体发酵物切割后用乙酸乙酯(80％):甲醇(15％):冰醋酸(5％)冷浸提取三次。提取液过滤减压浓缩除去有机相后溶于水中，加入相等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并经旋转蒸发仪浓缩后得18g粗提物。浸膏经200～300目硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(10:1→6:4)及氯仿-甲醇(10:1→0:100)梯度洗脱得10个组分Fr.1-Fr.10。组分Fr.8(2.12g)经200～300目硅胶，用石油醚-丙酮(100:15)进行洗脱得到5个亚组分；Fr.8.3为白色粉末状，经Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1:1)，得到Fr.8.3.1和Fr.8.3.2；Fr.8.3.2经半制备HPLC得到化合物1(12.0mg)及2(16.0mg)，具体条件为：环境温度下，使用RP-C18(250mm×10mm)，流动相为水-甲醇溶液(水从60％降至0％)，流速为3mL/min，检测波长为254nm。 
化合物1和2的结构如图1所示。 
化合物(1)，白色粉末，C15H21NO3，ESI-MS m/z:286.1[M+Na]+；1H-NMR(500MHz,Acetone-d6)δ:6.44(1H,t,J＝7.7Hz,H-2′),2.70(1H,m,Hb-6″),2.65(2H,m,H-3),2.59(1H,m,H-3″),2.41(2H,m,H-5),2.41(1H,m,H-5″),2.31(2H,m,H-1′),2.23(1H,q,J＝9.8Hz,Ha-6″),2.07(1H,m,H-4),1.80(1H,m,Hb-4″),1.73(1H,m,Ha-4″),1.11(3H,d,J＝3.0Hz,3″-CH3),1.10(3H,d,J＝2.7Hz,5″-CH3)；13C-NMR(125MHz,Acetone-d6)δ:203.1(s,C-2″),172.8(s,C-2,C-6),138.8(s,C-1″),134.0(d,C-2′),40.8(d,C-3″),38.9(t,C-4″),38.1(t,C-5),38.1(t,C-3,),35.1(t,C-6″),33.1(t,C-1′),31.1(d,C-5″),26.9(d,C-4),21.3(q,5″-Me),17.1(q,3″-Me)。以上波谱数据与文献报道一致(Guo et al,2009；郭会芳等，2010)，故确定该化合物为4-[2′-(3″(S),5″(S)-3″,5″-dimethyl-2″-oxocyclohexylidene)ethyl]piperidine-2,6-dione。 
化合物(2)，白色结晶，C15H21NO3，ESI-MS m/z:286.1[M+Na]+；1H-NMR(500M Hz,Acetone-d6)δ:6.33(1H,t,J＝7.7Hz,H-2′),2.84(1H,m,Hb-6″),2.61(2H,q,J＝7.7Hz,H-3),2.36(2H,m,H-5),2.36(1H,m,H-4),2.35(1H,m,H-3″),2.28(1H,m,Hb-1′),2.23(1H,m,Ha-1′),1.96(1H,m,Hb-4″),1.92(1H,m,H-5″),1.89(1H,m,Hb-6″),1.26(1H,t,J＝12.7Hz,Ha-4″),1.05(3H,d,J＝6.7Hz,3″-CH3),1.03(3H,d,J＝2.9Hz,5″-CH3)； 13C-NMR(125MHz,Acetone-d6)δ:202.5(s,C-2″),172.9(s,C-2,C-6),139.6(s,C-1″),133.2(d,C-2′),44.5(d,C-3″),41.6(t,C-4″),38.1(t,C-5),38.0(t,C-3),36.7(t,C-6″),33.1(t, C-1′),31.1(d,C-5″),31.1(d,C-4),22.3(q,5″-Me),16.0(q,3″-Me)。以上波谱数据与文献报道一致(Guo et al,2009；郭会芳等，2010，故确定该化合物为4-[2′-(3″(R),5″(S)-3″,5″-dimethyl-2″-oxocyclohexylidene)ethyl]piperidine-2,6-dione。 
化合物2单晶Cu耙数据:C15H21NO3,M＝263.33,orthorhombic, α＝90.00°,β＝90.00°,γ＝90.00°,T＝100(2)K,space group C2221,Z＝8,μ(CuKα)＝0.709mm-1,6964reflections measured,2351independent reflections(Rint＝0.0427).The final R1values were 0.0392(I>2σ(I)).The final wR(F2)values were 0.1059(I>2σ(I)).The final R1values were 0.0393(all data).The final wR(F2)values were 0.1060(all data).The goodness of fit on F2was 1.075.Flack parameter＝0.3(3).(见图2)。 
实施例2： 
用液体浸入法检测本发明化合物的单体抗真菌活性的实验： 
为得到更详细的抗植物病原真菌活性数据，本发明将从FTY2中分离得到的化合物1-2进行抗植物病原真菌活性测试，抗真菌活性的最低抑菌浓度(MIC)依照微生物稀释法来测定，具体实验步骤如下：1)、4种植物病原真菌在固体PDA培养基上于24℃下培养10d；2)、化合物用DMSO溶解，各自配制成10mg/mL的母液；3)、4种植物病原真菌各自取6.0mg(鲜重)，放入含1.0mL SD broth(0.67％无氨基酵母氮源，2.0％葡萄糖)的1.5mL离心管(EP管)中充分研磨，用移液枪吸出，充分悬浮于9mL无菌SD broth中，再用SD broth进行梯度稀释：取1mL悬浮菌液于9mL SD中充分混匀，得10倍稀释菌液；取1mL悬浮菌液于9mL SD中充分混匀，得100倍稀释菌液；取1mL 10倍稀释菌液于9mL SD中充分混匀，得1000倍稀释菌液；取1mL 100倍稀释菌液于9mL SD中充分混匀，得10000倍稀释菌液；取1mL 1000倍稀释菌液于4mL SD中充分混匀，得5000倍稀释菌液。最后选取1:5000的稀释菌液进行反应。上述混匀过程均在无菌50mL锥形瓶中进行；4)、反应在无菌96深孔板中进行，反应体系为200μL，按不同浓度加入相应体积的化合物溶液和稀释菌液，用SD补足最终体积；5)、同时设定DMSO对照组和菌液空白对照组；6)、将96深孔板置于24℃下反应48h；7)、每个反应进行四次重复，结果观察与记录。 
表.3.所测试化合物对四种植物病原真菌的最低抑菌浓度MIC(μg/mL) 
本发明与现有的抗植物病原真菌农药相比，具有对环境无污染、成本低、抗植物病原真菌效果较好的优点。首次发现天然产物的环己酰亚胺类化合物(cycloheximide)具抗真菌，能作为制备抗植物病原真菌药制剂和前体物质的应用。 
。 

Claims (8)

1.一种分离自榧树的内生链霉菌Streptomyces sp.菌株，编号为FTY2，由16S rDNA鉴定菌株，保藏号为CGMCC No.9133。
2.如权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株，其特征在于其DNA由下述方法制备而得：
(1)将FTY2接种于液体淀粉培养基中，25℃，200rpm培养14天，过滤收集菌丝体；
(2)选取适量菌丝体放入1.5mL离心管即EP管中，同时在离心管中加入少量的石英砂和少量的PVP聚乙烯吡咯烷酮；
(3)在内有研磨好的材料粉末的离心管中加入750μL 65℃水浴预热的4×CTAB提取液，充分研磨后，放入65℃水浴锅中温浴2-4h，期间每30min摇匀一次；
(4)将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入等体积750μL的25:24:1的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，摇匀3～5min，12000rpm室温离心10min；
(5)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，再加入等体积500-550μL的氯仿-异戊醇混合液，当颜色较深时，前两次使用苯酚-氯仿-异戊醇混合液，最后一次使用氯仿-异戊醇，摇匀3～5min，12000rpm，室温离心10min；
(6)将上清液转移至一新的1.5mL的离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，沉降DNA，充分混匀后，于-20℃冰箱中静置保存2h；
(7)将冷冻保存的离心管取出后置于室温中，待温度至室温后12000rpm室温离心15min，底部沉降DNA；
(8)弃去上清液，用500μL的70％的乙醇和无水乙醇各冲洗1-2次，每次12000rpm室温离心1min后弃上清液，直接倒掉上清液，倒的过程中轻轻旋转使DNA贴在壁上，然后将离心管置于37℃恒温箱中20～30min使乙醇充分挥发或开盖使其自然干燥，干燥后加入灭菌的蒸馏水；
(9)置于-20℃冰箱中保存备用。
3.如权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株，其特征在于其来源于榧树的内生链霉菌。
4.权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株的制备方法，取云南榧Torreya yunnanensis的新鲜枝条置于冰盒保存，带回实验室后，将新鲜枝叶用自来水冲洗15-20min，晾干后置于超净工作台上进行表面消毒，先用75％乙醇浸泡1-2min，用无菌水涮洗3次，接着用15％的NaClO浸泡15-20min，用无菌水涮洗3次，取消毒后的3g叶片置于无菌研钵中加5mL无菌水研磨呈匀浆状，用三角涂布棒将200μL研磨液均匀涂布于含有50mg/L的重铬酸钾的高氏1号固体培养基上，所述培养基组成为：可溶性淀粉20g/L，KNO31g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂20g/L，pH 7.2～7.4，在25℃条件下培养20天，一个链霉菌菌落在平板上长出，
挑取单一菌落，用划线法纯化后，菌株编号为FTY2。
5.从权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株的固体发酵产物的乙酸乙酯部分分离得到的如下结构式所示的两个环己酰亚胺化合物，
6.制备权利要求5所述化合物1-2的方法，将链霉菌FTY2用固体平板的方式用燕麦培养基进行发酵培养，所述燕麦培养基为：燕麦粉20.0g，微量元素母液1mL，蒸馏水1000mL，pH 7.2；所述微量元素母液配方为：FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，蒸馏水100mL；121℃灭菌20min；在26℃发酵培养21d，发酵20L；固体发酵物切割后用80％:15％:5％的乙酸乙酯:甲醇:冰醋酸冷浸提取三次，提取液过滤减压浓缩除去有机相后溶于水中，加入相等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并经旋转蒸发仪浓缩后得粗提物；浸膏经200～300目硅胶柱色谱，以10:1→6:4的石油醚-乙酸乙酯及10:1→0:100的氯仿-甲醇梯度洗脱得10个组分Fr.1-Fr.10；组分Fr.8经200～300目硅胶，用100:15的石油醚-丙酮进行洗脱得到5个亚组分；Fr.8.3为白色粉末状，经Sephadex LH-20氯仿-甲醇1:1，得到Fr.8.3.1和Fr.8.3.2；Fr.8.3.2经半制备HPLC得到化合物1及2，具体条件为：环境温度下，使用250mm×10mm的RP-C18，流动相为水-甲醇溶液，水从60％降至0％，流速为3mL/min，检测波长为254nm。
7.权利要求1所述的链霉菌FTY2菌株在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。
8.权利要求5所述的环己酰亚胺化合物在制备抗植物病原真菌的农药中的应用。
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