CN101225362A - 蝉花的人工培养方法 - Google Patents

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邹晓
胡海燕
罗力
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Abstract

本发明公开了一种蝉花的人工培养方法，包括下述步骤：(1)从采集自然保护区的蝉拟青霉菌株中选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且培养后期明显具有角变分离的原始菌株，显微镜观察其角变均具有该种典型的产孢结构者为蝉拟青霉异核体菌株；(2)蝉拟青霉异核体菌株经用培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×106－1×107分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将感染体置于蝉拟青霉孢子液中感染后，20℃－28℃常温培养2至3周获得蝉花。本方法简单易行，能获得与自然山林采集的蝉花一样的感染体，极具市场推广价值。

Description

蝉花的人工培养方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体来说涉及一种利用昆虫病原真菌蝉拟青霉进行蝉花的人工培养方法。
背景技术
蝉花是大蝉草Cordyceps cicadae Shing的无性型蝉拟青霉Paecilomycescicadae(Miquel)Samson(Samson 1974)寄生山蝉若虫致死的虫和菌的复合体，因其头部长出的孢梗束形似花蕾故名蝉花。蝉花是一个古老名贵而又年轻极具开发价值的虫生真菌。在中国民间，蝉花是清热、解毒、驱风、镇痛和明目的名贵草药；主治小儿惊风、夜啼等。近年研究蝉拟青霉发酵菌丝体含有多种活性物质，如：甘露醇、生物碱、麦角甾醇、蛋白质、氨基酸、多糖、腺苷、维生素E、维生素A，不饱和脂肪酸，以及多种微量元素。并测定大多数活性成分高于天然蝉花含量。
动物试验表明，蝉拟青霉总多糖能通过大鼠脾脏、胸腺这两个主要免疫器官自由基的代谢以及激活肺巨噬细胞和腹腔巨噬细胞来增强机体的免疫功能；蝉拟青霉多糖使血液中的胆固醇下降，明显有利于体内脂质的运输与转化代谢，能增强老龄大鼠的免疫功能和减少体内脂质的含量，从而具有抗衰老作用。蝉拟青霉多糖能提高大鼠外周血WBC数，激活肺泡巨噬细胞，具有骨髓造血功能而提升机体的营养状况；蝉花明显提高小鼠在常压缺氧和高温下的存活时间，表明具有抗应激和抗疲劳作用，有较好的镇静催眠作用。
临床试验表明，蝉花有改善肾功能和减缓肾衰竭并发症的作用。蝉拟青霉多糖对人外周血单个核细胞及白血病细胞株增殖的调节作用，具有杀肿瘤活性。
毒性实验表明，急性毒理毒性实验，天然蝉花乙醇提取物小鼠灌胃60g·kg-1，观察72h，20只小鼠无1只死亡，给药后动物仅活动减少，24h后均恢复正常。亚急性毒性实验，3组大鼠分别以1，3，9g·kg-1灌胃给药，连续28d，结果动物的血常规，肝、肾功能和心电图均未见异常改变，对心、肝、脾、肺、肾等重要脏器病理学检查也未见异常改变。以上资料表明，蝉拟青霉在祖国医药中的应用和现代医学在药化、药理以及毒理研究中所取得成果是显而易见的。
蝉花一般生长在针阔叶混交林带，森林覆盖率为65.13％，大多分布在海拔700～950m，坡度为30～40°的向阳坡上，呈明显的垂直分布状态。据《证类本草》载：“蝉花，所在皆有，七月采。生苦竹林者良，花出土上”。其主要产地是在江浙、川、云、贵和福、广一带，但产量远远不能满足人们对蝉花用作药品和保健食品的需求。
发明内容
本发明的目的是克服上述缺点而提供的一种简单易行，能获得与自然山林采集的蝉花一样的感染体的蝉花的人工培养方法。
蝉花的人工培养方法，包括下述步骤：
(1)从采集自自然保护区的蝉拟青霉菌株中选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且培养后期明显具有角变(菌丝型、孢子型、致密型或稀疏型)分离的原始菌株，显微镜观察其角变均具有该种典型的产孢结构者为蝉拟青霉异核体菌株；
(2)蝉拟青霉异核体菌株经用培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×106-1×107分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将感染体置于蝉拟青霉孢子液中感染后，20℃-28℃常温培养2至3周获得蝉花。
上述的蝉花的人工培养方法，其中：培养基为查氏(Capek)、改良查氏(Capek+0.05％蛋白冻)、萨氏(Sabourd)或马铃薯葡萄糖(PDA)培养基。
上述的蝉花的人工培养方法，其中：感染体为家蚕老熟幼虫。
本发明的方法与现有技术相比，由以上技术可知，蝉拟青霉异核体菌株具有两亲特性而具有杂种优势，对试验昆虫具有比一般菌株有更高的致病能力，因此通过保存、筛选或配接合成的方式获得高致病力的异核体蝉拟青霉菌株，作为具有稳定感染家蚕能力的菌株。感染昆虫：选用家蚕作为感染对象获得蝉花，是因为家蚕感染白僵菌所得僵蚕本身是一位有名的传统中药，其安全性无可置疑。感染虫龄：选用家蚕老熟幼虫作感染体，这样虫态的幼虫已经不吃桑叶，而且对环境的微生物有了抗性即不容易感染杂菌，因而会获得纯净的蝉花。蝉拟青霉用查氏(Capek)、改良查氏(Capek+0.05％蛋白冻)、萨氏(Sabourd)或马铃薯葡萄糖(PDA)培养基培养蝉拟青霉孢子粉。本方法简单易行，能获得与自然山林采集的蝉花一样的感染体，极具市场推广价值。
具体实施方式
实施例1
从采集自自然保护区的蝉拟青霉菌株中选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且培养后期明显具有角变(菌丝型、孢子型、致密型或稀疏型)分离的原始菌株，显微镜观察其角变均具有该种典型的产孢结构者为蝉拟青霉异核体菌株；蝉拟青霉异核体菌株在查氏平板上25℃14天，菌落直径55mm，菌丝稀薄，白色，平展，背面豆汁黄；分生孢子梗着生在气生菌丝上，3.6μm宽，由2-5个瓶状小梗组成的轮生体；瓶状小梗长5.4-7.2×1.2-2.4μm，由一个球形膨大的基部和大约0.5μm宽的尖细的顶部组成；分生孢子长圆至柱形，4.8-6.0×1.8-3.0μm。萨氏平板上，25℃14天菌落直径70mm，白色绒毛状菌丝，具有放射线状的纹路，背面豆汁黄。
蝉拟青霉异核体菌株经用改良查氏(Capek+0.05％蛋白冻)培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×106分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将感染5龄家蚕，轻轻地放入蝉拟青霉孢子液中2至3秒钟后捞起，置入灭菌的培养皿内，20℃-28℃常温培养2至3周获得蝉花。
实施例2
从采集自自然保护区的蝉拟青霉菌株中，选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且明显具有角变分离的平板中，纯分离出孢子型和菌丝型的菌株保存在4℃冰箱，使用时混合接种用所获得的配接合成的异核体菌株，经用查氏(Capek)培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×106分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将感染5龄家蚕，轻轻地放入蝉拟青霉孢子液中2至3秒钟后捞起，置入灭菌的培养皿内，20℃-28℃常温培养2至3周获得蝉花。
实施例3
从采集自自然保护区的蝉拟青霉菌株中选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且培养后期明显具有角变(菌丝型、孢子型、致密型或稀疏型)分离的原始菌株，显微镜观察其角变均具有该种典型的产孢结构者为蝉拟青霉异核体菌株；蝉拟青霉异核体菌株在查氏平板上25℃14天，菌落直径55mm，菌丝稀薄，白色，平展，背面豆汁黄；分生孢子梗着生在气生菌丝上，3.6μm宽，由2-5个瓶状小梗组成的轮生体；瓶状小梗长5.4-7.2×1.2-2.4μm，由一个球形膨大的基部和大约0.5μm宽的尖细的顶部组成；分生孢子长圆至柱形，4.8-6.0×1.8-3.0μm。萨氏平板上，25℃14天菌落直径70mm，白色绒毛状菌丝，具有放射线状的纹路，背面豆汁黄。
蝉拟青霉异核体菌株经用萨氏(Sabourd)培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×107分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将已经开始吐丝并结成薄而透明的蚕茧剪开茧取出尚未脱皮的蚕，并置于蝉拟青霉孢子液中感染后，20℃-28℃常温培养2至3周获得蝉花。
实施例4
从采集自自然保护区的蝉拟青霉菌株中选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且培养后期明显具有角变(菌丝型、孢子型、致密型或稀疏型)分离的原始菌株，显微镜观察其角变均具有该种典型的产孢结构者为蝉拟青霉异核体菌株；蝉拟青霉异核体菌株在查氏平板上25℃14天，菌落直径55mm，菌丝稀薄，白色，平展，背面豆汁黄；分生孢子梗着生在气生菌丝上，3.6μm宽，由2-5个瓶状小梗组成的轮生体；瓶状小梗长5.4-7.2×1.2-2.4μm，由一个球形膨大的基部和大约0.5μm宽的尖细的顶部组成；分生孢子长圆至柱形，4.8-6.0×1.8-3.0μm。萨氏平板上，25℃14天菌落直径70mm，白色绒毛状菌丝，具有放射线状的纹路，背面豆汁黄。
蝉拟青霉异核体菌株经用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×107分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将已经开始吐丝并结成薄而透明的蚕茧剪开茧取出尚未脱皮的蚕，并置于蝉拟青霉孢子液中感染后，20℃-28℃常温培养2至3周获得蝉花。

Claims (3)

1.一种蝉花的人工培养方法，包括下述步骤：
(1)从采集自自然保护区的蝉拟青霉菌株中选择生长速度较快，菌落致密丰满，而且培养后期明显具有角变分离的原始菌株，显微镜观察其角变均具有该种典型的产孢结构者为蝉拟青霉异核体菌株；
(2)蝉拟青霉异核体菌株经用培养基培养蝉拟青霉1周后，采用0.05％吐温80水将蝉拟青霉孢子从培养皿或试管斜面洗下分生孢子并稀释成1×106-1×107分生孢子/ml浓度的蝉拟青霉孢子液，将感染体置于蝉拟青霉孢子液中感染后，20℃-28℃常温培养2至3周获得蝉花。
2.如权利要求1所述的蝉花的人工培养方法，其中：培养基为查氏、改良查氏、萨氏或马铃薯葡萄糖培养基。
3.如权利要求1所述的蝉花的人工培养方法，其中：感染体为家蚕老熟幼虫。
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