CN109566272A - 一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基，该方法的羊肚菌培养基中添加了CaSO₄，CaSO₄的浓度为5～20g/L，所述羊肚菌培养基中的PDA培养基可由圆杨树叶的水提物配制，本发明中添加CaSO₄ 5～20g/L，可显著促进羊肚菌菌体的生长，并能显著提高羊肚菌多糖的产量，利用该培养基，将羊肚菌在22～28℃培养3～5天，能够促进羊肚菌菌丝的生长，促进羊肚菌产生胞外多糖，显著提高羊肚菌产量，适用于大规模工业化生产。

Description

一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基

技术领域

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基。

背景技术

羊肚菌(Morchella esculenta)别名羊肚蘑、编笠菌、羊肚菜，其菌盖表面凹凸不平、形状似羊肚，因而得名。隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)，其受欢迎程度在欧洲仅次于块菌(Tuber ssp.)。它不仅美味可口，还含有丰富的营养，它的氨基酸含量为所有食用菌之首，羊肚菌具有抗肿瘤，提高免疫能力，抗病毒，抑制肿瘤的功能，广为人所喜爱。

羊肚菌是一种野生名贵食药用真菌，具有多种保健和药理功效，最早收录于李时珍的《本草纲目》。传统中医认为其性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功效。最近又有研究发现，羊肚菌还能降血脂、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等，它的水提物还可以一定程度保护化学性肝损伤，减轻放疗化疗对癌症患者造成的毒副作用。

由于羊肚菌本身具有的高经济价值和实用价值，其市场价格一直居高不下。面对巨大的市场需求，单纯靠人工采摘野生羊肚菌是相对不足的；同时，过度的采摘也造成了野生资源的破坏。人工栽培技术的发展无疑是解决这一问题的最佳途径。

国内学者于20世纪50年代就自然状态下羊肚菌的半人工栽培进行了详细的研究，获得了子实体。四川绵阳市食用菌研究所从1985年开始试种羊肚菌，1990年第1次获得子实体，室内栽培可收获子实体0.2～0.3kg/m²，现有技术中的羊肚菌培养中菌丝生长速度较慢，菌核的形成通常需要10-11天，且菌丝体中多糖含量在0.28-0.3％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基，促进羊肚菌菌丝的生长，缩短羊肚菌菌丝体的培养时间，显著提高羊肚菌中的多糖含量，本发明的羊肚菌菌丝体多糖含量高达0.3-0.5g/100g，显著提高羊肚菌产量，适用于大规模工业化生产。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种羊肚菌的培养方法，包括以下步骤：

1)将羊肚菌接种至凝固的PDA培养基中，于23～38℃下培养3～5天，菌丝长满平板；

2)取上述步骤1)中的菌饼，接种至羊肚菌培养基中，封口后于23-28℃下培养时间4～5天，获得羊肚菌菌丝体；

其中，所述羊肚菌培养基由向PDA培养基中添加CaSO₄ 5～20g/L后，灭菌、凝固获得。

进一步，所述PDA培养基由向圆杨树叶的水提物中添加马铃薯150～250g/L、淀粉或葡萄糖15～30g/L、牛肉膏5～10g/L和琼脂15～20g/L获得。

又，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。

一种羊肚菌培养基，包括含圆杨树叶水提物的PDA培养基和CaSO₄，其中CaSO₄的质量浓度为5～20g/L；其中，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。

本发明的羊肚菌培养基中，加入牛肉膏和圆杨树叶提取物可以使该超群呈现良好的羊肚菌生长态势，表现出菌丝粗壮、生长速度快、菌核数量多的特点。

在羊肚菌的培养过程中，不同的矿质元素和植物激素对羊肚菌生长的作用效果不同，一些无机盐和微量元素是细胞的重要组成成分，一些在调节细胞膜透性和酶活性方面起重要的作用；本发明添加了外源钙元素，外源添加钙元素能够稳定细胞膜的结构，保持细胞壁的完整性，同时添加适量的钙元素能增加细胞对如盐、干旱、冻害、病虫害的抗性，减轻重金属或酸性物质对细胞的毒害作用；同时，钙对于碳水化合物的合成具有重要的调节作用，钙元素的含量需要保持一定的浓度因为钙浓度太低时原生质膜结构解体，通透性增强，使细胞内的小分子有机物和无机物外渗增多，导致细胞死亡。钙浓度太高时导致细胞渗透压增加，细胞失水而死亡。本发明中，CaSO₄对羊肚菌产生胞外多糖表现为双重作用，既可以促进羊肚菌产生胞外多糖产生，高浓度条件下也可抑制其产生。

本发明中，在羊肚菌的生长初期，菌丝处于幼龄阶段，呈灰白色或浅黄色，有光泽，壁薄质少，分枝少，尖端分泌有针尖大的无色露珠，随之气生菌丝产生，并沿管壁上爬，菌丝尖端呈多指状或树枝状分枝，开始时分枝少，而后逐渐增多并交织成网状；生长中期菌丝渐呈深黄色至浅褐色，有光泽和露珠；成熟阶段的菌丝粗，呈褐色，壁厚质多，分枝较多，大多分枝呈锐角，少数呈直角，还可见有两两直角分枝相互吻合，相互沟通的菌丝；接种后第七天菌丝开始分泌针尖大的浅褐色色素，随着色素的产生，菌丝开始老化，颜色由褐色转为深褐色，光泽随之消失；转管成活率亦随菌龄的增长而下降，老龄阶段的菌丝无色，内无细胞质，毡绒型和颗粒型菌丝均是由短菌丝交织或聚集而成的，前者菌丝长宽比为3：1，有细胞质，分枝多，后者菌丝长宽比为2：1，近似椭圆型，有细胞质，多分枝；本发明中，菌丝粗壮且生长速度快，培养8-9天后，即可形成菌核。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的培养基中，在PDA培养基中添加CaSO₄ 5～20g/L，能促进羊肚菌菌丝的生长，显著提高羊肚菌产量，并能促使羊肚菌胞外多糖的产生，多糖含量为0.3-0.5g/100g，比常规的培养的菌丝体多糖含量提高50％以上，对羊肚菌胞内多糖的产生总量没有明显的影响，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1羊肚菌菌丝随PDA培养基中添加不同浓度CaSO₄的生长情况。

图2为本发明实施例2羊肚菌多糖随PDA培养基中添加不同浓度CaSO₄的产量变化情况。

图3为本发明实施例1中羊肚菌培养11天时的情况。

图4为常规PDA培养基中羊肚菌培养11天时的生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

材料：超群羊肚菌；PDA培养基；玻璃纸；葡萄糖(105℃恒温烘干至恒重)；乙醇(95％食用级，分析纯)；苯酚(重蒸馏)；硫酸(分析纯)等。

仪器：MV-1601型紫外及可见光分光光度计(日本岛津公司)；MICROCL17RCentrifuge离心机(Thermo)；电炉；恒温水浴锅等。

菌株：供试菌株为超群羊肚菌。

PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水或圆杨树叶提取物1000mL。

菌种的活化：

将配置好的PDA培养基于高压蒸汽灭菌锅灭菌，无菌环境下将灭完菌的培养基倒入灭过菌且干燥的培养皿制成平板培养基。待培养基凝固后，在平板中央接入菌种，最后将平板于25℃培养箱中培养，待菌丝长满平板后4℃保存备用。

实施例1矿质元素CaSO₄对羊肚菌生长的影响

将矿质元素CaSO₄按0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20g/L分别加入到PDA培养基中，以0g/L的培养基作为对照，配置成含有不同浓度CaSO₄的培养基，于高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。

准备灭菌后干燥的直径为90mm的培养皿若干，在无菌环境下向爱那个培养皿中分别倒入适量的培养基，待培养基冷却凝固；培养基冷却凝固之后，在每个培养基中央定量接种1块直径8mm的菌饼(使用内径为8mm的打孔器)，每种培养基接三皿，用封口膜将培养基封口，于25摄氏度的培养箱中培养；以培养皿正中央为原点，在培养皿上画“十”字，沿着“十”字每天测量一次羊肚菌菌丝分别在四个方向上的生长长度，并做好记录，结果参见图1。

由图1可以看出，CaSO₄对羊肚菌菌丝的生长起促进作用，随着CaSO₄质量浓度的升高促进作用也越来越强，但是在CaSO₄的质量浓度为0～1g/L时，促进作用并不明显，只是有微弱的作用。当CaSO₄的质量浓度≥5g/L时，促进作用才开始明显起来，促进羊肚菌菌丝生长的最适CaSO₄的质量浓度10g/L为左右，高于或低于10g/L时促进作用则逐渐减弱。方差分析结果表明，不同质量浓度的CaSO₄对羊肚菌菌丝生长的影响为显著(P≤0.05)。

因此，CaSO₄对羊肚菌菌丝的生长起促进的作用。

实施例2矿质元素CaSO₄对羊肚菌中多糖含量的影响

1.配制培养基：

PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水或圆杨树叶提取物1000mL。

CaSO₄：质量浓度分别为1、5、10、15、20g/L。

2.培养并收集菌丝

配置具有不用CaSO₄质量浓度的PDA培养基，其中，CaSO₄质量浓度分别为1g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L，对羊肚菌进行培养，待其长满平板再收集菌丝待测。

具体步骤为：配置培养基，于高压蒸汽灭菌锅进行灭菌；无菌环境下将灭好菌的培养基倒入灭过菌且干燥的培养皿，待其凝固；将凝固后的培养基表明贴上一层裁剪好且灭过菌的玻璃纸，玻璃纸大小以略小于培养皿为宜；

接种，每种培养基接5皿以保证之后收集到足够的菌丝，于25℃培养箱中培养；待其完全长满培养皿时取出，刮取菌丝并收集于5mL离心管中，同样也收集足量的培养基于5mL离心管中，存放于-70℃冷冻以备用。

3.测定多糖总量

用蒽酮比色法测定羊肚菌中的多糖：

(1)样品的提取、净化

利用多糖可经热水提取又不溶于乙醇的特性，用热水提取多糖后，用乙醇沉淀、精化。取2g样品，加入100ml水，煮沸提取30min，冷却后2500r/min离心5min。取上清液于一烧杯中，残渣再加入100mL水，煮沸提取30min，收集上清液于同一烧杯中，残渣再重复提取一次，将三次收集的有提取液的烧杯在电炉上加热、浓缩至30mL左右冷却，再加入100mL乙醇使多糖析出，沉淀30min后2500r/min离心3min，弃去上清液，残渣再加入50mL乙醇搅拌清洗后同样离心弃上清液，残渣再清洗一次后，用约80℃热水70mL溶解残渣，转移至一200mL容量瓶中，冷却后定容备用。

(2)显色剂配制：

取1g蒽酮，用浓硫酸500mL溶解，临用时配制，所用试剂均为分析纯。

(3)配制葡萄糖标准溶液：

精确称取干燥至恒重的葡萄糖0～1000g，加水溶解定容至1000mL，浓度为0.1mg/mL。

(4)制备标准曲线：

取0.1mg/mL的葡萄糖标准液0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL于10mL试管中，用水补足至1mL，将全部试管浸人冰水中，各加人蒽酮显色剂3mL后同时摇匀，再将试管放人沸水浴中煮沸15min取出，立即放人冰水中，冷却5min后在室温中平衡10min，使用0.5cm的比色杯，在620nm波长下进行比色，测得OD值，进行回归计算，得出回归方程为Y＝5.68X-0.005，r＝0.9996。

(5)测定样品：

将⑴中准备好的备用液稀释10倍，取稀释液1mL加入10mL试管中，各加人蒽酮显色剂3mL后同时摇匀，再将试管放人沸水浴中煮沸15min取出，立即放人冰水中，冷却5min后在室温中平衡10min，用0.5cm的比色杯，在620nm波长下进行比色，测得OD值，以水作空白对照，从标准曲线中查糖含量计算多糖，具体结果参见图2。

从图2可以看出，羊肚菌胞内多糖的产生总量不随CaSO₄质量浓度的变化而产生明显的规律变化，羊肚菌胞内多糖总量的曲线变化一直比较平稳，即CaSO₄对羊肚菌胞内多糖的产生总量没有明显的影响。

但是CaSO₄对于胞外多糖的产生总量却有很明显的影响，由图2可以观察到，适量浓度的CaSO₄可以促使羊肚菌产生胞外多糖，而浓度过大或过小则会抑制羊肚菌胞外多糖的产生。

以PDA培养基中不含CaSO₄的培养基为对比例，本实施例和对比例培养11天后的生长情况参见图3，由图3可见，本发明中的培养基培养的菌丝体在第11天时已经形成较多菌核，而常规培养基培养的羊肚菌菌丝体还未见菌核，因此，利用本发明，比普通培养基培养的菌丝体形成菌核的时间要早，这有利于缩短生产周期，减少生产成本。

本发明控制PDA培养几种CaSO₄浓度为5～20g/L，可显著促进羊肚菌产生胞外多糖产生。

Claims (5)

1.一种羊肚菌菌丝体的培养方法，包括以下步骤：

1)将羊肚菌接种至凝固的PDA培养基中，于23～38℃下培养3～5天，菌丝长满平板；

2)取上述步骤1)中的菌饼，接种至羊肚菌培养基中，封口后于23-28℃下培养时间4～5天，获得羊肚菌菌丝体；

其中，所述羊肚菌培养基由向PDA培养基中添加CaSO₄ 5～20g/L后，灭菌、凝固获得。

2.根据权利要求1所述羊肚菌的培养方法，其特征在于，所述PDA培养基由向圆杨树叶的水提物中添加马铃薯150～250g/L、淀粉或葡萄糖15～30g/L、牛肉膏5～10g/L和琼脂15～20g/L获得。

3.根据权利要求2所述羊肚菌的培养方法，其特征在于，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。

4.根据权利要求1所述羊肚菌的培养方法，其特征在于，获得的羊肚菌中，多糖含量为0.30-0.50g/100g。

5.一种羊肚菌培养基，包括含圆杨树叶水提物的PDA培养基和CaSO₄，其中CaSO₄的质量浓度为5～20g/L；其中，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。