CN101942035A - 一种根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法 - Google Patents

一种根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，通过以下步骤完成：稀释预处理、絮凝除蛋白、离子交换、浓缩除盐、酒精醇沉和真空干燥，由本发明所述的从根瘤菌发酵液中提取和精制根瘤菌胞外多糖的方法具有工艺步骤少，效率高、成本低、适宜工业化生产的特点，而且制备的胞外多糖纯度高。

Description

一种根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法
技术领域
本发明涉及一种从根瘤菌发酵液中提取及精制根瘤菌胞外多糖的方法，属于生物技术领域。
背景技术
微生物多糖是细菌、真菌和蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物，根据在细胞内不同的存在形式，通常被分为三类：①构成微生物细胞成分的胞内多糖；②黏附在细胞表面上的胞壁多糖；③分泌到培养基中的胞外多糖，包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团。微生物多糖具有广泛的应用价值，如在工业生产与生活的许多领域中作为微生物絮凝剂、微生物采油中的生物化学调剖剂、食品添加剂、保鲜剂、抗癌医药品、包装材料等。
根瘤菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是对宿主植物特异性起决定性作用的一类重要物质，也是根瘤菌与宿主植物之间进行细胞识别的信息分子，具有免疫调节、抗肿瘤及其他一些功能。例如，来自特殊太阳花根瘤菌分泌的胞外多糖，已经开发成为一种名为根瘤菌胶的产品，该产品具有优异的锁水和水分平衡能力，且粘度随温度差的突变特性而会产生超凡的肤感，以及还会有舒缓皮肤，减轻红血丝，抗炎及产生皮肤的清凉感，从而作为一种化妆品原料广泛地被用于化妆品行业。
根瘤菌胞外多糖作为一种新型的糖资源，已经引起人们的关注。但根瘤菌胞外多糖的提取和精制方法却鲜有报道，国内只有山西大学韩勇等人(根瘤菌N613胞外多糖发酵条件及抗肿瘤作用研究，微生物学通报，2007年34(5)，909～913)研究了根瘤菌Rhizobium sp.N613胞外多糖的提取方法，经过加水稀释、离心去除菌体、真空浓缩、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、乙醇再次沉淀、真空干燥等步骤。此方法具有步骤多、提取成本高、且成品含有中性和碱性多糖缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种从根瘤菌发酵液中提取和精制根瘤菌胞外多糖的方法。此方法通过对提取和精制工艺的改良，获得高纯度根瘤菌胞外多糖，并且节省了成本。
本发明是通过下述步骤完成：
1)稀释预处理
在发酵液中加入1～10倍体积的蒸馏水，采用稀碱调溶液pH至8～10，开启搅拌并加热至60～80℃，并持续0.2～5小时；
2)絮凝除蛋白
在经稀释预处理的根瘤菌发酵液中加入絮凝剂，然后用稀酸调整溶液pH至4～6，搅拌，当有大块絮状物出现时停止，采用10000g离心30～120min，收集上清液；
3)离子交换
上清液采用0.5～2BV速度上阴离子交换剂(Cl-型)柱，采用酚-硫酸法检测多糖，漏吸停止上柱，采用蒸馏水冲洗至无色为止，采用2mol/L浓度的NaCl溶液洗脱，然后收集多糖洗脱峰；
4)浓缩除盐
收集的含多糖离子交换液，采取1000～100000Da分子量的超滤膜，控制过滤压力0.3～2.8Mpa，浓缩至多糖质量浓度至15～40％时停止；
5)酒精醇沉
在多糖浓缩液中，缓慢加入2～4倍体积质量浓度≥95％的酒精，并采用稀酸调至pH4～7，然后降温至-20～4℃，放置4～24小时醇沉，然后采用10000g离心30min，收集多糖沉淀物；
6)真空干燥
多糖沉淀置于40～70℃真空干燥箱内，控制相对真空度≥0.085Mpa，进行干燥，获得成品。
所述多糖是由植物、海澡或微生物所产生的酸性多糖。
所述多糖优选自微生物产生的酸性多糖。
所述絮凝除蛋白步骤中，所述絮凝剂为食品级，选自聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、壳聚糖、聚丙烯酰铵中的任意一种。
所述絮凝除蛋白步骤中，菌体分离方法采用离心分离或板框分离。
所述离子交换步骤中，所述阴离子交换剂采用DEAE-纤维素、DEAE-Sepharose、强或弱碱性阴离子交换聚丙乙烯系列树脂。
所述离子交换步骤中，所述阴离子交换剂优选为DEAE-纤维素。
所述在真空干燥步骤中，所述干燥的方式为真空干燥、喷雾干燥、滚筒干燥或流化床干燥方式。
而且在絮凝除蛋白步骤中，沉淀可根据残留多糖含量采取数次菌体洗涤，然后再合并过滤液。在酒精醇沉步骤中，所得多糖沉淀还可用酒精进行多次洗涤，以去除杂质和色素。
最后得到的多糖产品可作为一种提高免疫功能有效成份用于食品、保健品、化妆品或药品。
在本发明中，采用絮凝法去除蛋白，与传统多糖提取中除蛋白的三氯乙酸法、Sevage法、三氟三氯乙烷法等方法相比，具有成本低，处理工艺简单的特点；另外，在除去菌体和杂蛋白之后，本发明采用了超滤进行浓缩，与减压浓缩相比，具有低温的特点，在达到浓缩目的及避免色素的产生的同时，还可起到部分脱盐和除去小分子色素的目的；最后，由于具有多种生理功能的根瘤菌胞外多糖为一种酸性多糖，通过离子交换工序，可去除中性多糖及碱性多糖，达到进一步纯化多糖的目的。因此由本发明所述的根瘤菌发酵液中提取和精制根瘤菌胞外多糖的方法具有工艺步骤少，效率高、成本低、适宜工业化生产的特点，而且制备的胞外多糖纯度高。
具体实施方式
结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1、从根瘤菌发酵液中提取和精制根瘤菌胶的方法由下述工艺步骤完成：
发酵液的制备：发酵菌种采用紫云英根瘤菌Rhizobium astragula(CICC：20026)，斜面培养基配方：牛肉膏0.5％，蛋白胨3.9％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％，琼脂1.5～2.0％，pH7.2，培养温度30℃；摇床种子培养基除不加琼脂外，配制方法同上；发酵培养基配方：NaCl0.01％，葡萄糖2％，K2HPO40.4％，MgSO4.7H2O 0.5％，豆粕2％，Na2Mo4.2H2O0.002％，pH7.0，培养温度30℃；种子培养18小时后，按5％的接种量接入发酵罐，培养40小时后，经60℃灭酶30分钟，放罐获得发酵液。
1.稀释预处理：
在发酵液中加入3倍体积的蒸馏水，采用4％NaOH溶液调发酵液pH至8，开启搅拌并加热至80℃，并持续0.3小时，促使多糖得到稀释且降低溶液粘度。
2.絮凝除蛋白：
在根瘤菌发酵液加入0.04％终浓度的阴离子絮凝剂聚丙烯酸钠，然后用稀盐酸调节溶液pH至4，底部充气搅拌，当有大块絮状物出现时停止，采用10000g离心力离心30min，去除沉淀，获得多糖上清液。
3.离子交换
多糖上清液采用0.5～2BV速度上柱DEAE-纤维素柱(Cl-型)，采用酚-硫酸法检测多糖，漏吸停止上柱，采用蒸馏水冲洗至无色为止，然后采用2mol/L浓度的NaCl溶液洗脱，收集多糖洗脱峰。
4.超滤浓缩：
采取20000Da分子量的超滤膜，控制过滤压力0.5Mpa，过程中取样采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，当浓缩至多糖浓度至30％时停止。
5.酒精醇沉
在多糖浓缩液中，缓慢加入2倍体积质量浓度≥95％的酒精，并采用稀盐酸调至pH6，然后降温至4℃，放置24小时醇沉，然后采用10000g离心30min，收集多糖沉淀物。
6.真空干燥
多糖沉淀置于60℃真空干燥箱内，控制相对真空度≥0.085Mpa，进行干燥，获得产品。
实施例2
从根瘤菌发酵液中提取和精制根瘤菌胶的方法由下述工艺步骤完成：
发酵液的制备：发酵菌种采用放射形根瘤菌Rhizobiumradiobacter(CICC：10270)，斜面培养基配方：蛋白胨5克牛肉膏3克，氯化钠5克琼脂15克，蒸馏水1000毫升调PH至7.0；摇床种子培养基除不加琼脂外，配制方法同上；发酵培养基配方：NaCl0.01％，葡萄糖2％，K2HPO40.4％，MgSO4.7H2O 0.5％，豆粕2％，Na2Mo4.2H2O0.002％，pH7.0，培养温度30℃；种子培养20小时后，按3％的接种量接入发酵罐，培养48小时后，经60℃灭酶30分钟，放罐获得发酵液。
1.稀释预处理
在发酵液中加入2倍体积的蒸馏水，采用4％KOH溶液调发酵液pH至10，开启搅拌并加热至70℃，并持续1小时，促使多糖得到稀释且降低溶液粘度。
2.絮凝除蛋白
在根瘤菌发酵液加入0.05％终浓度的阴离子絮凝剂聚丙烯酸钠，然后用稀硫酸调节溶液pH至4.5，底部充气搅拌，当有大块絮状物出现时停止，控制板框过料压力至0.8MPa然后维持30分钟左右得到多糖过滤液。
3.离子交换
所得的多糖过滤液，采用1BV速度上柱DEAE-纤维素柱(Cl-型)，采用酚-硫酸法检测多糖，漏吸停止上柱，采用蒸馏水冲洗至无色为止，然后采用2mol/L浓度的NaCl溶液洗脱，收集多糖洗脱峰。
4.超滤浓缩
多糖洗脱峰采取100000Da分子量的超滤膜，控制过滤压力0.3Mpa，过程中取样采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，当浓缩至糖液浓度至25％时停止。
5.酒精醇沉
在多糖浓缩液中，缓慢加入3倍体积质量浓度≥95％的酒精，并采用稀硫酸调至pH5，然后降温至-20℃，放置8小时醇沉，然后采用10000g离心30min，收集多糖沉淀物。
6.真空干燥
多糖沉淀置于50℃真空干燥箱内，控制相对真空度≥0.085Mpa，进行干燥，获得产品。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征是：由下述步骤完成：
1)稀释预处理
在发酵液中加入1～10倍体积的蒸馏水，采用稀碱调溶液pH至8～10，开启搅拌并加热至60～80℃，并持续0.2～5小时；
2)絮凝除蛋白
在经稀释预处理的根瘤菌发酵液中加入絮凝剂，然后用稀酸调整溶液pH至4～6，搅拌，当有大块絮状物出现时停止，采用10000g离心30～120min，收集上清液；
3)离子交换
上清液采用0.5～2BV速度上阴离子交换剂(Cl-型)柱，采用酚-硫酸法检测多糖，漏吸停止上柱，采用蒸馏水冲洗至无色为止，然后用2mol/L浓度的NaCl溶液洗脱，收集多糖洗脱峰；
4)浓缩除盐
收集的含多糖离子交换液，采取1000～100000Da分子量的滤膜，控制过滤压力0.3～2.8Mpa，浓缩至多糖质量浓度至15～40％时停止；
5)酒精醇沉
在多糖浓缩液中，缓慢加入2～4倍体积质量浓度≥95％的酒精，并采用稀酸调至pH4～7，然后降温至-20～4℃，放置4～24小时醇沉，然后采用10000g离心30min，收集多糖沉淀物；
6)真空干燥
多糖沉淀置于40～70℃真空干燥箱内，控制相对真空度≥0.085Mpa，进行干燥，获得成品。
2.根据权利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述多糖是由植物、海澡或微生物所产生的酸性多糖。
3.根据权利要求2所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述多糖优选自微生物产生的酸性多糖。
4.根据权利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述絮凝除蛋白步骤中，所述絮凝剂为食品级，选自聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、壳聚糖、聚丙烯酰铵中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述絮凝除蛋白步骤中，菌体分离方法采用离心分离或板框分离。
6.根据权利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述离子交换步骤中，所述阴离子交换剂采用DEAE-纤维素、DEAE-Sepharose、强或弱碱性阴离子交换聚丙乙烯系列树脂。
7.根据权利要求6所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述离子交换步骤中，所述阴离子交换剂优选为DEAE-纤维素。
8.根据权利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于：所述在真空干燥步骤中，所述干燥的方式为真空干燥、喷雾干燥、滚筒干燥或流化床干燥方式。
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