JPS6225A - 虫歯予防剤及びその製造方法 - Google Patents
虫歯予防剤及びその製造方法Info
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- C12Y302/01011—Dextranase (3.2.1.11)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、虫歯を予防するために使用する予防剤とその
製造方法に関するものである。
製造方法に関するものである。
（従来の技術）
虫歯の原因となるストレプトコッカス
ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａ
ｎｓ）は九この菌が産生ずる不溶性グルカン（ムタンと
も言う）（第１図参照）によって歯の表面に付着し、該
菌が口腔内に存在する庶Ｉ！圭−分解して生じる有機酸
の作用により、歯牙エナメル質を溶解すること゛によっ
て虫歯が起こることが判明している。
ｎｓ）は九この菌が産生ずる不溶性グルカン（ムタンと
も言う）（第１図参照）によって歯の表面に付着し、該
菌が口腔内に存在する庶Ｉ！圭−分解して生じる有機酸
の作用により、歯牙エナメル質を溶解すること゛によっ
て虫歯が起こることが判明している。
従って、虫歯を予防するためには、前記不溶性グルカン
を分解して虫歯菌の歯への付着を阻止すればよい。従来
は、虫歯菌と不溶性グルカンの複合体であるデンタル・
プラーク（ｄｅｎｔａｌ ｐｌａｑｕｅ ）即ち歯垢を
、歯ブラシで歯を磨くことにより機械的に除去していた
。
を分解して虫歯菌の歯への付着を阻止すればよい。従来
は、虫歯菌と不溶性グルカンの複合体であるデンタル・
プラーク（ｄｅｎｔａｌ ｐｌａｑｕｅ ）即ち歯垢を
、歯ブラシで歯を磨くことにより機械的に除去していた
。
また、最近では不溶性グルカンを分解する酵素であるα
−１，６グルカナーゼ（正式名はα−１，６グルカン６
−グルカノハイドロラーゼで、一般的にはデキストラナ
ーゼともいう）、或いはα−１，３グルカナーゼ（正式
名はα−１，３クルカン３−グルカノハイドロラーゼで
、−ａ的にはムタナーゼともいう）を歯磨剤に混入して
、上記デンタル・プラークを化学的に溶解・除去する歯
磨剤が提案（例えば、特開昭５７−１６５３１２号、特
開昭５０−５８２４３号）されている。
−１，６グルカナーゼ（正式名はα−１，６グルカン６
−グルカノハイドロラーゼで、一般的にはデキストラナ
ーゼともいう）、或いはα−１，３グルカナーゼ（正式
名はα−１，３クルカン３−グルカノハイドロラーゼで
、−ａ的にはムタナーゼともいう）を歯磨剤に混入して
、上記デンタル・プラークを化学的に溶解・除去する歯
磨剤が提案（例えば、特開昭５７−１６５３１２号、特
開昭５０−５８２４３号）されている。
（発明が解決しようとする問題点）
前記従来の歯ブラシを使用して歯を磨くことによりデン
タル・プラークを機械的に除去する方法では、歯ブラシ
の届かない箇所にデンタル・プラークが残留してしまう
という欠点があり、また、前記不溶性グルカンを分解す
る酵素を混入した歯磨剤を使用したとしても、歯を磨い
た後に水でうがいをした際、歯磨剤成分がほとんど流出
してしまうので、虫歯の予防効果は期待できなかった。
タル・プラークを機械的に除去する方法では、歯ブラシ
の届かない箇所にデンタル・プラークが残留してしまう
という欠点があり、また、前記不溶性グルカンを分解す
る酵素を混入した歯磨剤を使用したとしても、歯を磨い
た後に水でうがいをした際、歯磨剤成分がほとんど流出
してしまうので、虫歯の予防効果は期待できなかった。
この発明は上述の点に鑑みなされたもので、前記α−１
，３グルカナーゼ、若しくはα−１，６グルカナーゼ、
或いはその両方を産生ずる細菌中の遺伝子をクローニン
グして、口腔内常在細菌の細胞内に導入して形質発現さ
せ、この形質発現した口腔内常在細菌を口腔中に投与す
ることにより、不溶性グルカンを分解する一定濃度のα
−１，３グルカナーゼ、若しくはα−１，６グルカナー
ゼ、或いはその両方が常時口腔内に分泌されるようにし
て、虫歯を予防することを目的としている。
，３グルカナーゼ、若しくはα−１，６グルカナーゼ、
或いはその両方を産生ずる細菌中の遺伝子をクローニン
グして、口腔内常在細菌の細胞内に導入して形質発現さ
せ、この形質発現した口腔内常在細菌を口腔中に投与す
ることにより、不溶性グルカンを分解する一定濃度のα
−１，３グルカナーゼ、若しくはα−１，６グルカナー
ゼ、或いはその両方が常時口腔内に分泌されるようにし
て、虫歯を予防することを目的としている。
（実施例）
本発明の虫歯の予防剤及びその製造方法に関し、その一
実施例としてα−１，３グルカナーゼ遺伝子をクローニ
ングして口腔内常在細菌に導入して形質発現させる方法
について以下詳細に説明する。
実施例としてα−１，３グルカナーゼ遺伝子をクローニ
ングして口腔内常在細菌に導入して形質発現させる方法
について以下詳細に説明する。
虫歯菌ストレプトコッカス ミュタンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ） ＯＭＺ １７６株の
不溶性グルカンを唯一の炭素源とした最少培地に、本発
明者が居住する地域から取得した土壌標品を加え、２８
℃の温度で３日間培養した。尚、不溶性グルカンの製造
法については、恵比須の方法（大阪大学歯学雑誌、第２
１巻、第１１号、１９７６）に従った。
ｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ） ＯＭＺ １７６株の
不溶性グルカンを唯一の炭素源とした最少培地に、本発
明者が居住する地域から取得した土壌標品を加え、２８
℃の温度で３日間培養した。尚、不溶性グルカンの製造
法については、恵比須の方法（大阪大学歯学雑誌、第２
１巻、第１１号、１９７６）に従った。
次に、前記培地で培養された各種細菌を１２回継代を繰
り返し、これらの細菌を濃縮した後、前記培地と同一組
成の最少培地に０．２％不溶性グルカンを加えて形成し
た寒天平板に、前記濃縮細菌を塗布して培養しコロニー
を形成させた。３０℃の温度で数日間培養すると、不溶
性グルカンを分解するものはコロニーの周囲に透明な溶
解帯（ｈａｌｏ）を形成した。
り返し、これらの細菌を濃縮した後、前記培地と同一組
成の最少培地に０．２％不溶性グルカンを加えて形成し
た寒天平板に、前記濃縮細菌を塗布して培養しコロニー
を形成させた。３０℃の温度で数日間培養すると、不溶
性グルカンを分解するものはコロニーの周囲に透明な溶
解帯（ｈａｌｏ）を形成した。
継代用の液体最少培地として、
（ＮＨ＊） ｚｓＯｔ ０．１％Ｍｇ５Ｏ＊ ・
７１１０ ０．０００５％ＦｅＣ１ｇ”６ＨｔＱ
Ｏ，０００５％不溶性グルカン ０．０３ ％ を燐酸バッファーで ｐｕ ７．０に調整して滅菌した
。
７１１０ ０．０００５％ＦｅＣ１ｇ”６ＨｔＱ
Ｏ，０００５％不溶性グルカン ０．０３ ％ を燐酸バッファーで ｐｕ ７．０に調整して滅菌した
。
寒天平板用固形培地としては、上記最少培地に不溶性グ
ルカン０．２％を加えたものに、寒天１．２％を添加し
て滅菌したものを使用した。
ルカン０．２％を加えたものに、寒天１．２％を添加し
て滅菌したものを使用した。
Ｂ、この結果、上記その周囲に透明な溶解帯（ｈａｌｏ
）を形成したコロニーの中に、次の４種類の細菌が見つ
かった。
）を形成したコロニーの中に、次の４種類の細菌が見つ
かった。
（１）、バチルス サーキュランス ＢＣ−８（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＢＣ−８（微工研菌
条寄第７３３号） （ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３） ）（
２）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）Ｓｐ・ （３）、 （４）、 シュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ） ｓｐ。
ｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＢＣ−８（微工研菌
条寄第７３３号） （ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３） ）（
２）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）Ｓｐ・ （３）、 （４）、 シュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ） ｓｐ。
これらを純粋培養して調べたところ、（１）は上記溶解
帯（ｈａｌｏ）の形成が最も顕著であり、（２）がこれ
に次ぎ、（３）、 （４）では微弱であることが確認さ
れた。
帯（ｈａｌｏ）の形成が最も顕著であり、（２）がこれ
に次ぎ、（３）、 （４）では微弱であることが確認さ
れた。
従って、不溶性グルカンを分解する菌の内、（１）が最
も強力と考えられたので、この菌（以下ＢＣ−８菌とい
う）の分解酵素を調べることにした。このＢＣ−８菌は
、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓ）に属するのでバチルス サーキュラン
ス ＢＣ−８（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＢＣ−８）と命名した。
も強力と考えられたので、この菌（以下ＢＣ−８菌とい
う）の分解酵素を調べることにした。このＢＣ−８菌は
、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓ）に属するのでバチルス サーキュラン
ス ＢＣ−８（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＢＣ−８）と命名した。
このＢＣ−８菌をトリプティカーゼ ソイ ブロース（
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ ）培地〔
ディフコ（Ｄｉｆｃｏ ）社製〕で、３０℃の温度にて
培養すると、不溶性グルカンを添加した場合にのみ誘導
的に分解酵素の産生がみられた。
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ ）培地〔
ディフコ（Ｄｉｆｃｏ ）社製〕で、３０℃の温度にて
培養すると、不溶性グルカンを添加した場合にのみ誘導
的に分解酵素の産生がみられた。
前記ＢＣ−８菌を得た地域と同じ場所の土壌種晶から、
前記参考例１ａの不溶性グルカンの代わりに市販のデキ
ストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ＋和光純薬製、 Ｍ、 Ｗ
＝ １００．０００〜２００ 、０００）を加えた、上
記参考例１ａと同じ液体及び寒天固形最少培地を用いて
、デキストラナーゼ産生菌を多数分離することができた
。
前記参考例１ａの不溶性グルカンの代わりに市販のデキ
ストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ＋和光純薬製、 Ｍ、 Ｗ
＝ １００．０００〜２００ 、０００）を加えた、上
記参考例１ａと同じ液体及び寒天固形最少培地を用いて
、デキストラナーゼ産生菌を多数分離することができた
。
これらの菌をブルーデキストラン０．５％。
デキストラン０．５％を炭素源とする寒天固形最少培地
に接種し調べると、コロニーの周囲に透明な溶解帯を形
成した。このことによって、これらの分離菌はデキスト
ラナーゼを菌体外に分泌する菌であることが確認できた
。
に接種し調べると、コロニーの周囲に透明な溶解帯を形
成した。このことによって、これらの分離菌はデキスト
ラナーゼを菌体外に分泌する菌であることが確認できた
。
その中でも特に顕著な溶解帯を示したのは次の４株であ
る。
る。
（１） コリネバクテリウムｓｐ、 ＣＢ−８（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、 ＣＢ−８（（微
工研条寄第９９５号）（ＰＩ！ＲＭ ＢＰ−９９５）
） １株（２）放線菌 ＾ｃｔｉｎｏ＊ｙｃ
ｅｓ ｓｐ、 ３株これらのうち、（１）は増殖が
顕著で取扱やすい菌であるので、本発明者はこの菌から
デキストラナーゼ遺伝子をクローニングすることにした
。
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、 ＣＢ−８（（微
工研条寄第９９５号）（ＰＩ！ＲＭ ＢＰ−９９５）
） １株（２）放線菌 ＾ｃｔｉｎｏ＊ｙｃ
ｅｓ ｓｐ、 ３株これらのうち、（１）は増殖が
顕著で取扱やすい菌であるので、本発明者はこの菌から
デキストラナーゼ遺伝子をクローニングすることにした
。
不溶性グルカン分解酵素の活性は、超音波処理をして細
粉化した不溶性グルカンの懸濁液を基質に用いて、前記
ＢＣ−８菌の培養液を遠心分離して取得した上清または
それを硫安（７５％）飽和で沈澱させ、１０倍に濃縮し
たものを酵素液として測定した。３７℃で１６時間に０
．１μＨのブドー糖を生成する酵素活性を１単位とした
。
粉化した不溶性グルカンの懸濁液を基質に用いて、前記
ＢＣ−８菌の培養液を遠心分離して取得した上清または
それを硫安（７５％）飽和で沈澱させ、１０倍に濃縮し
たものを酵素液として測定した。３７℃で１６時間に０
．１μＨのブドー糖を生成する酵素活性を１単位とした
。
３（Ｘ溶性グルカン ” 素の 製）
前記ＢＣ−８菌を０．３％不溶性グルカンを含むトリプ
ティカーゼ ソイ ブロース培地〔ディフコ（Ｄｉｒｃ
ｏ）社製） ５００＋ｓｌで、温度３０℃、３日間培養
した遠心上滑を、硫安（７５％）飽和で塩析して生じた
沈澱を５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶かし
、この溶液を、ＤＢ−５２セルロースカラムに添加し、
同じ燐酸緩衝液に０〜０．５ＭのＮａＣ１を加えたイオ
ン濃度勾配によって溶出した。
ティカーゼ ソイ ブロース培地〔ディフコ（Ｄｉｒｃ
ｏ）社製） ５００＋ｓｌで、温度３０℃、３日間培養
した遠心上滑を、硫安（７５％）飽和で塩析して生じた
沈澱を５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶かし
、この溶液を、ＤＢ−５２セルロースカラムに添加し、
同じ燐酸緩衝液に０〜０．５ＭのＮａＣ１を加えたイオ
ン濃度勾配によって溶出した。
これの活性ピークを更にセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−１５０）カラムクロマトグラフィーにかけ
、５ＯＳ−ゲル電気泳動にかけると、分子量６８ Ｋ
ｄａｌ、（ｄａｌｔｏｎ） 、及び５４ Ｋｄａｌ、を
示す二つのバンドが存在した。このうち、６８ Ｋ ｄ
ａｌ、のバンドはα−１，３グルカナーゼであり、５４
Ｋ ｄａｌ、のバンドはα−１，６グルカナーゼの活
性を示すものであることは後述する。
ｅｘ Ｇ−１５０）カラムクロマトグラフィーにかけ
、５ＯＳ−ゲル電気泳動にかけると、分子量６８ Ｋ
ｄａｌ、（ｄａｌｔｏｎ） 、及び５４ Ｋｄａｌ、を
示す二つのバンドが存在した。このうち、６８ Ｋ ｄ
ａｌ、のバンドはα−１，３グルカナーゼであり、５４
Ｋ ｄａｌ、のバンドはα−１，６グルカナーゼの活
性を示すものであることは後述する。
Ｃ０上記参考例３のようにして精製した６８ Ｋｄａｌ
、の酵素は、過沃素酸処理または市販のデキストラナー
ゼによりα−１，６結合を壊してα−１，３結合のみを
残したグルカンに作用させても、還元糖を産生ずる活性
を有していた。
、の酵素は、過沃素酸処理または市販のデキストラナー
ゼによりα−１，６結合を壊してα−１，３結合のみを
残したグルカンに作用させても、還元糖を産生ずる活性
を有していた。
また、α−１，６結合からなる市販のデキストラン（Ｄ
ｅｘｔｒａｎ ）に働かせても殆ど還元糖を生じなかっ
た。
ｅｘｔｒａｎ ）に働かせても殆ど還元糖を生じなかっ
た。
更に、その酵素反応中に於ける還元糖の生成が、グルコ
ース単１１（ヘキソキナーゼにより定量）の生成に先行
すること等から、α−１，３結合を切断するエンド型（
ｅｎｄｏ型）グルカナーゼであることが判明した。
ース単１１（ヘキソキナーゼにより定量）の生成に先行
すること等から、α−１，３結合を切断するエンド型（
ｅｎｄｏ型）グルカナーゼであることが判明した。
かくて、この酵素をエンド型α−１，３グルカナーゼと
決定した。この正式名は「α−１，３グルカン３−グル
カノハイドロラーゼ１である。
決定した。この正式名は「α−１，３グルカン３−グル
カノハイドロラーゼ１である。
尚、同様にして５４ Ｋ ｄａｌ、の酵素はα−Ｌ６結
合を特異的に切断することが判明した。
合を特異的に切断することが判明した。
以上に述べたことから、ＢＣ−８菌はα−１，３グルカ
ナーゼとα−１，６グルカナーゼの二つの酵素を併せて
もつ菌であるといえる。
ナーゼとα−１，６グルカナーゼの二つの酵素を併せて
もつ菌であるといえる。
従来不溶性グルカンの除去には、α−１，３グルカナー
ゼ（ムタナーゼ）とα−１，６グルカナーゼ（デキスト
ラナーゼ）の協同作用が有効であることが判明している
。また、不溶性グルカンは、α−１，３結合が主である
ため、その酵素的分解にはα−１，３グルカナーゼが主
役を演じ、α−１，６グルカナーゼの協同作用で分解が
促進されることが明らかにされている。従って、不溶性
グルカン除去の目的に対しては、α−１，３グルカナー
ゼ、及びα−１，６グルカナーゼ遺伝子の両方ともクロ
ーニングして、これらを一つのプラスミド上につなぎ込
むことが望ましい。
ゼ（ムタナーゼ）とα−１，６グルカナーゼ（デキスト
ラナーゼ）の協同作用が有効であることが判明している
。また、不溶性グルカンは、α−１，３結合が主である
ため、その酵素的分解にはα−１，３グルカナーゼが主
役を演じ、α−１，６グルカナーゼの協同作用で分解が
促進されることが明らかにされている。従って、不溶性
グルカン除去の目的に対しては、α−１，３グルカナー
ゼ、及びα−１，６グルカナーゼ遺伝子の両方ともクロ
ーニングして、これらを一つのプラスミド上につなぎ込
むことが望ましい。
ここでは、先づ前記ＢＣ−８菌を用いたα−１，３グル
カナーゼ遺伝子のクローニングの実施例について以下に
述べる。
カナーゼ遺伝子のクローニングの実施例について以下に
述べる。
Ｄ、（α−１，３グルカナーゼ遺伝子のクローニング）
前記ＢＣ−８菌をトリプティカーゼ ソイ ブロース〔
ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕培地で培養し、ＤＮＡを
抽出した〔（ジェイ マーマー； Ｊ、Ｍａｒｍｕｒ
＋ Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、３＋ｐｐ、
２０８．１９６１）のＭａｒｍｕｒ Ｍｅｔｈｏｄ（マ
ーマー法）”を少し修正して実施した。〕。このＤＮ＾
をＣｓＣ１−ｔ！ｔＢｒ平衡密度勾配遠心法により遠心
分離したところ、プラスミドＤＮＡの存在は認められず
、染色体ＤＮＡの単一バンドだけが分離精製された。
ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕培地で培養し、ＤＮＡを
抽出した〔（ジェイ マーマー； Ｊ、Ｍａｒｍｕｒ
＋ Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、３＋ｐｐ、
２０８．１９６１）のＭａｒｍｕｒ Ｍｅｔｈｏｄ（マ
ーマー法）”を少し修正して実施した。〕。このＤＮ＾
をＣｓＣ１−ｔ！ｔＢｒ平衡密度勾配遠心法により遠心
分離したところ、プラスミドＤＮＡの存在は認められず
、染色体ＤＮＡの単一バンドだけが分離精製された。
このようにして精製したＤＮＡを透析後、制限酵素Ｈｃ
ｏ Ｒ１で切断した。
ｏ Ｒ１で切断した。
一方翫発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃ
ｔｏｒ） ｐＹＥＪ ００１プラスミド（第２図参照）
（市販されており、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａＩｓ（ファーマシアＰ−Ｌ バ
イオケミカルズ）社のＴｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ（分子生物学カタログ）
”、ｐｐ、 ２７．１９８３に記載されている。）を有
する大腸菌ＨＢＩＯＩ菌をＬ−培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ
）で３００ｍ１培養し、抽出した該ｐＹＥＪ ００１プ
ラスミドＤＮＡ も同じ制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１で切断し
た。尚、前記り一培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ ）は下記の組
成を有するものである・
ｌペプトン １０ｇ イーストエキス ５ｇ ブドウ糖 １ｇ ＮａＣ１５ｇ Ｈ２Ｏ１０００＋１１１ （ＰＨ７，２に調整）この
ようにして得られたＥｃｏ Ｒ１で切断したＢＣ−８菌
のＤＮＡ とｐＹＥＪ ００１プラスミドＤＮＡを各々
１μｇを含み、これに１酵素単位となるようにＤＮＡの
結合酵素Ｔ４リガーゼを添加して、４℃、１２時間酵素
反応させた。
ｔｏｒ） ｐＹＥＪ ００１プラスミド（第２図参照）
（市販されており、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａＩｓ（ファーマシアＰ−Ｌ バ
イオケミカルズ）社のＴｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ（分子生物学カタログ）
”、ｐｐ、 ２７．１９８３に記載されている。）を有
する大腸菌ＨＢＩＯＩ菌をＬ−培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ
）で３００ｍ１培養し、抽出した該ｐＹＥＪ ００１プ
ラスミドＤＮＡ も同じ制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１で切断し
た。尚、前記り一培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ ）は下記の組
成を有するものである・
ｌペプトン １０ｇ イーストエキス ５ｇ ブドウ糖 １ｇ ＮａＣ１５ｇ Ｈ２Ｏ１０００＋１１１ （ＰＨ７，２に調整）この
ようにして得られたＥｃｏ Ｒ１で切断したＢＣ−８菌
のＤＮＡ とｐＹＥＪ ００１プラスミドＤＮＡを各々
１μｇを含み、これに１酵素単位となるようにＤＮＡの
結合酵素Ｔ４リガーゼを添加して、４℃、１２時間酵素
反応させた。
このようにして２種のＤＮＡが結合されて組み替えプラ
スミドＤＮＡが生じるが、この組み替えプラスミドＤＮ
Ａをトリス−ＥＤＴＡ溶液（１０！ＩＩＭ Ｔｒｉｓ−
ＩＣＩ ＰＨ７，５，１ｍＭ ＥＩ）ＴＡ）で透析した
。
スミドＤＮＡが生じるが、この組み替えプラスミドＤＮ
Ａをトリス−ＥＤＴＡ溶液（１０！ＩＩＭ Ｔｒｉｓ−
ＩＣＩ ＰＨ７，５，１ｍＭ ＥＩ）ＴＡ）で透析した
。
次に、大腸菌に１２株ＨＢＩＯＩを受容菌として、前記
組み替えプラスミドＤＮＡによる形質転換を行った。
組み替えプラスミドＤＮＡによる形質転換を行った。
３、以乍、この遺伝子クローニングされたものを選び出
す方法について詳細に述べる。
す方法について詳細に述べる。
第２図に示した如く、発現ベクターｐＹＥＪ００１プラ
スミドのＣｍ ’遺伝子内のＥｃｏ Ｒ１サイ） （ｓ
ｉｔｅ）に、ある遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すると
Ｃｍ感受性になる筈である。またこの遺伝子の上流に存
在する合成プロモータ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ ）の働きによって正方向に入った遺伝子は
強力な発現が起こる筈である。
スミドのＣｍ ’遺伝子内のＥｃｏ Ｒ１サイ） （ｓ
ｉｔｅ）に、ある遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すると
Ｃｍ感受性になる筈である。またこの遺伝子の上流に存
在する合成プロモータ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏ
ｍｏｔｅｒ ）の働きによって正方向に入った遺伝子は
強力な発現が起こる筈である。
従って、アンピシリンを含む寒天平板を用いて、上記組
み替えｐＹＥＪ ００１プラスミドを受は取った大腸菌
にコロニーを作らせ、その各々をクロラムフェニコール
（Ｃｍ）を含むし寒天平板に−コ宛滅菌スティック（ｓ
ｔｉｃｋ ）で移せば、Ｃｍ感受性になった大腸菌はＥ
ｃｏ Ｒ１サイ） （ｓｉｔｅ）に何等かのＤＮＡ断片
が挿入されたものであるので、それらの内からα−１，
３グルカナーゼ遺伝子が挿入されたものを探せ獄良い訳
である。尚、Ｌ寒天平板は前記り一培地に１．５％の寒
天を含ませたものである・然しなから、大腸菌はダラム
陰性菌であるので・前記ＢＣ−８菌のように酵素を菌体
外に分泌することは期待できず、実際に数十個のコロニ
ーを不溶性グルカンを含む平板に移して調べた結果、α
−１，３グルカナーゼを分泌する形質転換体は一つも見
出し得ながった。
み替えｐＹＥＪ ００１プラスミドを受は取った大腸菌
にコロニーを作らせ、その各々をクロラムフェニコール
（Ｃｍ）を含むし寒天平板に−コ宛滅菌スティック（ｓ
ｔｉｃｋ ）で移せば、Ｃｍ感受性になった大腸菌はＥ
ｃｏ Ｒ１サイ） （ｓｉｔｅ）に何等かのＤＮＡ断片
が挿入されたものであるので、それらの内からα−１，
３グルカナーゼ遺伝子が挿入されたものを探せ獄良い訳
である。尚、Ｌ寒天平板は前記り一培地に１．５％の寒
天を含ませたものである・然しなから、大腸菌はダラム
陰性菌であるので・前記ＢＣ−８菌のように酵素を菌体
外に分泌することは期待できず、実際に数十個のコロニ
ーを不溶性グルカンを含む平板に移して調べた結果、α
−１，３グルカナーゼを分泌する形質転換体は一つも見
出し得ながった。
然し、上記ＣＩＩ＋感受性になった（Ｃａｂ’ ）大腸
凹を、不溶性グルカンを炭素源とした合成培地に接種し
たところ増殖するものが出現した。
凹を、不溶性グルカンを炭素源とした合成培地に接種し
たところ増殖するものが出現した。
この場合、受容菌のＨＢ １０１はＴｈｒ＋ Ｌｅｕ、
Ｐｒ。
Ｐｒ。
等のアミノ酸要求凹であるので、カザミノ酸を少量添加
した最少培地として、超音波でよく破砕して菌体内に入
り易くした不溶性グルカン０．２％を加えた培地を使用
した。
した最少培地として、超音波でよく破砕して菌体内に入
り易くした不溶性グルカン０．２％を加えた培地を使用
した。
従って、上記形質転換体はα−１，３グルカナーゼ遺伝
子を受は取ったために、その産物であるα−１，３グル
カナーゼを菌体外に分泌することはないが、不溶性グル
カンを炭素源として分解利用することが出来るようにな
ったものと推測される。
子を受は取ったために、その産物であるα−１，３グル
カナーゼを菌体外に分泌することはないが、不溶性グル
カンを炭素源として分解利用することが出来るようにな
ったものと推測される。
そこで、次にこの形質転換体をもう少し大量培養（ＩＡ
）して、プラスミドＤＮＡを抽出してＥｃｏ Ｒ１で切
断して、挿入されていたＤＮＡをゲル電気泳動で調べる
と、約３．ＯＫｂ（キロベース）の断片が入っているこ
とが判明した。
）して、プラスミドＤＮＡを抽出してＥｃｏ Ｒ１で切
断して、挿入されていたＤＮＡをゲル電気泳動で調べる
と、約３．ＯＫｂ（キロベース）の断片が入っているこ
とが判明した。
従ってこの大きさなら、前記参考例３にて判明したα−
１，３グルカナーゼ・タンパクの分子量６８ Ｋ ｄａ
ｌ、から計算した遺伝子の大きさをカバーするに充分な
ものであると考えられる。
１，３グルカナーゼ・タンパクの分子量６８ Ｋ ｄａ
ｌ、から計算した遺伝子の大きさをカバーするに充分な
ものであると考えられる。
事実、この３．ＯＫｂのＤＮＡ断片の中にα−１，３グ
ルカナーゼ遺伝子が存在することを証明するため次の実
験を行った。
ルカナーゼ遺伝子が存在することを証明するため次の実
験を行った。
（１）大腸菌ＨＢ １０１
（２） ｐＹＥＪ ００１をもつＨＢ １０１菌（３
） ３．ＯＫｂのＤＮＡ断片を喰え込んだｐＹＥＪｏ
ｏｌをもつ）１８１０１菌 上記３種類の菌を各々３０ｍ１宛０．２％不溶性二ヘル
カンを含む最少培地に培養して、参考例２０通りα−１
，３グルカナーゼの活性を定量した。期待通り、（３）
の菌だけにこの酵素の活性が認められた。
） ３．ＯＫｂのＤＮＡ断片を喰え込んだｐＹＥＪｏ
ｏｌをもつ）１８１０１菌 上記３種類の菌を各々３０ｍ１宛０．２％不溶性二ヘル
カンを含む最少培地に培養して、参考例２０通りα−１
，３グルカナーゼの活性を定量した。期待通り、（３）
の菌だけにこの酵素の活性が認められた。
かくして、ＢＣ−８菌のα−１，３グルカナーゼ遺伝子
が、首尾よく大腸菌のｐＹＥＪ ００１プラスミドにク
ローニングされたことが確認されたわけである。
が、首尾よく大腸菌のｐＹＥＪ ００１プラスミドにク
ローニングされたことが確認されたわけである。
Ｆ、上記の如く、大腸菌で前記ＢＣ−８菌のα−１，３
グルカナーゼ遺伝子の形質発現がみられたので、この遺
伝子をそのまま口腔内常在細菌内の適当なプラスミドに
入れ替えて、そこで形質発現できれば初期の目的を達成
できる筈である。
グルカナーゼ遺伝子の形質発現がみられたので、この遺
伝子をそのまま口腔内常在細菌内の適当なプラスミドに
入れ替えて、そこで形質発現できれば初期の目的を達成
できる筈である。
ところで、口腔内常在細菌の中で、ストレプトコッカス
サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉ
ｓ ）やストレプトコッカス サリバリウス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）は、最も
無害なバクテリアであり、特に歯に接種されペストレプ
トコッカス サンギスは、その接種箇所に２年半以上も
定着していたという報告もある（エム スバンパーグと
シイ ウェスターブレーン； Ｍ、 Ｓｖａｎｂｅｒｇ
＆ Ｇ、 Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ、 Ａｒｃｈｓ ｏ
ｒａｌ Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｌ、 ３Ｌ Ｎｏ、 Ｌ
ｐｐ、 １−４．１９８６）。これらのうちとりわけス
トレプトコッカス サンギス チャーリス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ Ｃｈａｌｌｉｓ）
株（ＮＣＴＣ７８６８）は形質転換による遺伝学的研究
が比較的進んだ材料であるので、本発明者はこれを選び
そのベクタープラスミドとしてｐＧＢ ３０１ 〔第３
図参照、（ベンテ等； Ｂｅｈｎｋｅ ｅｔ ａｔ＋
Ｍ、 Ｇ、 Ｇ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、 Ｖｏｌ、 １８
４＋ ｐ９．１１５−１２０＋ １９８１； Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ ５ｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ、 Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌｏｇｙ−１９８２”、
ｐｐ、 ２３９−２４２．１９８２ ）を利用すること
にした。
サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉ
ｓ ）やストレプトコッカス サリバリウス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）は、最も
無害なバクテリアであり、特に歯に接種されペストレプ
トコッカス サンギスは、その接種箇所に２年半以上も
定着していたという報告もある（エム スバンパーグと
シイ ウェスターブレーン； Ｍ、 Ｓｖａｎｂｅｒｇ
＆ Ｇ、 Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ、 Ａｒｃｈｓ ｏ
ｒａｌ Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｌ、 ３Ｌ Ｎｏ、 Ｌ
ｐｐ、 １−４．１９８６）。これらのうちとりわけス
トレプトコッカス サンギス チャーリス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ Ｃｈａｌｌｉｓ）
株（ＮＣＴＣ７８６８）は形質転換による遺伝学的研究
が比較的進んだ材料であるので、本発明者はこれを選び
そのベクタープラスミドとしてｐＧＢ ３０１ 〔第３
図参照、（ベンテ等； Ｂｅｈｎｋｅ ｅｔ ａｔ＋
Ｍ、 Ｇ、 Ｇ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、 Ｖｏｌ、 １８
４＋ ｐ９．１１５−１２０＋ １９８１； Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ ５ｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ、 Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌｏｇｙ−１９８２”、
ｐｐ、 ２３９−２４２．１９８２ ）を利用すること
にした。
Ｇ、 （ストレプトコッカス サンギスに導入したα
−１，３グルカナーゼ遺伝子の形 質発現） （１）、 ｐＧＢ ３０１を用いたストレプトコッカス
サンギスに導入したα−１，３グルカナーゼ遺伝子の形
質発現 第３図に示した如く、ストレブトコッカスサンギス チ
ャーリス株の細胞質中に存在するｐＧＢ ３０１プラス
ミドＤＮ＾は、Ｅｔａ’ （エリスロマイシン耐性）と
Ｃｍ’ （クロラムフェニコール耐性）という二つの薬
剤耐性マーカーを有し、Ｃ■′遺伝遺伝子側限酵素Ｂｓ
ｔＥＩＩサイトがある。
−１，３グルカナーゼ遺伝子の形 質発現） （１）、 ｐＧＢ ３０１を用いたストレプトコッカス
サンギスに導入したα−１，３グルカナーゼ遺伝子の形
質発現 第３図に示した如く、ストレブトコッカスサンギス チ
ャーリス株の細胞質中に存在するｐＧＢ ３０１プラス
ミドＤＮ＾は、Ｅｔａ’ （エリスロマイシン耐性）と
Ｃｍ’ （クロラムフェニコール耐性）という二つの薬
剤耐性マーカーを有し、Ｃ■′遺伝遺伝子側限酵素Ｂｓ
ｔＥＩＩサイトがある。
従って、ｐＧＢ ３０１プラスミドＤＮＡ ｔ−Ｂｓｔ
Ｅ■・制限酵素で切断して、その末端をＤＮＡポリメ
ラーゼ■によってフラシュエンドにした。
Ｅ■・制限酵素で切断して、その末端をＤＮＡポリメ
ラーゼ■によってフラシュエンドにした。
また別に、前記Ｅ項において、α−１，３グルカナーゼ
遺伝子の形質発現を確認した大腸菌の細胞質内のｐＹＥ
Ｊ ００１プラスミドＤＮＡを抽出し、３．ＯＫｂのＤ
ＮＡ断片を制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１で切り出し、その末端
をＤＮＡポリメラーゼＩによってフラシュエンドにした
。
遺伝子の形質発現を確認した大腸菌の細胞質内のｐＹＥ
Ｊ ００１プラスミドＤＮＡを抽出し、３．ＯＫｂのＤ
ＮＡ断片を制限酵素Ｅｃｏ Ｒ１で切り出し、その末端
をＤＮＡポリメラーゼＩによってフラシュエンドにした
。
次に上述のｐＧＢ ３０１プラスミドＤＮＡとα−１，
３グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡの断片を、１μｇ：１μｇ
の割合で混合して、Ｔ４リガーゼ１００単位によってフ
ラシュ末端同士を結合させて、組み替えプラスミドＤＮ
Ａを得た。
３グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡの断片を、１μｇ：１μｇ
の割合で混合して、Ｔ４リガーゼ１００単位によってフ
ラシュ末端同士を結合させて、組み替えプラスミドＤＮ
Ａを得た。
このようにして得られた組み替えプラスミドＤＮＡにお
いては、Ｃｌ１Ｆ遺伝子が分断される代わりに、Ｃｍ’
遺伝子の下流に入ったα−１，３グルカナーゼ遺伝子は
転写されて形質発現する筈である。
いては、Ｃｌ１Ｆ遺伝子が分断される代わりに、Ｃｍ’
遺伝子の下流に入ったα−１，３グルカナーゼ遺伝子は
転写されて形質発現する筈である。
実際に、ストレプトコッカス サンギスチャーリス株は
、α−１，３グルカナーゼ遺伝子約３．０ ｋｂ断片を
挿入することにより形質転換された。
、α−１，３グルカナーゼ遺伝子約３．０ ｋｂ断片を
挿入することにより形質転換された。
尚、上記形質転換の方法は、ルブラン及びハフセル（Ｌ
ｅ Ｂｌａｎｃ ＆ Ｈａｓｓｅｌｌ） （（Ｊ。
ｅ Ｂｌａｎｃ ＆ Ｈａｓｓｅｌｌ） （（Ｊ。
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） ） 、１２８（１）、
３４７−３５５ （１９７６）〕、及びマクリーナ他（
Ｍａｃｒｉｎａ ｅｔ ａｌ、） （（’（ｑｆｅｃ、
＆ Ｉｍｍ、 ） 、 ２８（３１，６９２−６９９（
１９８０）〕に従って行った。
３４７−３５５ （１９７６）〕、及びマクリーナ他（
Ｍａｃｒｉｎａ ｅｔ ａｌ、） （（’（ｑｆｅｃ、
＆ Ｉｍｍ、 ） 、 ２８（３１，６９２−６９９（
１９８０）〕に従って行った。
その結果、前記α−１，３グルカナーゼ遺伝子の組込み
の起こったｐＧＢ ３０１プラスミドを受は取ったスト
レプトコッカス サンギスチャーリス株菌は、エリスロ
マイシン（５０μｇ／ｍ ｌ）を添加したプレイン ハ
ート インフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉ
ｎｆｕｓ−ｉｏｎ （以下、Ｂ、 Ｈ，１，という）
〕寒天平板〔ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製）上にコロニ
ーを作った。それらを−個づつクロラムフェニコール（
１０μｓ／ｍＡりを含むＢ、 Ｈ，１，寒天平板に移し
て、Ｃ「（クロラムフェニコール惑受性）になったコロ
ニーの有無を調べた。Ｃｍ”になったストレプトコッカ
ス サンギス チャーリス株菌の大部分は、導入された
ｐＧＢ ３０１プラスミドＤＮＡ内に、α−１，３グル
カナーゼ遺伝子が挿入されていることが期待される。
の起こったｐＧＢ ３０１プラスミドを受は取ったスト
レプトコッカス サンギスチャーリス株菌は、エリスロ
マイシン（５０μｇ／ｍ ｌ）を添加したプレイン ハ
ート インフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉ
ｎｆｕｓ−ｉｏｎ （以下、Ｂ、 Ｈ，１，という）
〕寒天平板〔ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製）上にコロニ
ーを作った。それらを−個づつクロラムフェニコール（
１０μｓ／ｍＡりを含むＢ、 Ｈ，１，寒天平板に移し
て、Ｃ「（クロラムフェニコール惑受性）になったコロ
ニーの有無を調べた。Ｃｍ”になったストレプトコッカ
ス サンギス チャーリス株菌の大部分は、導入された
ｐＧＢ ３０１プラスミドＤＮＡ内に、α−１，３グル
カナーゼ遺伝子が挿入されていることが期待される。
実際にはα−１，３グルカナーゼ遺伝子断片が挿入され
る方向にも二通り有り得るので、その遺伝子が形質発現
するものは形質転換コロニ゛−の約３分の１であった。
る方向にも二通り有り得るので、その遺伝子が形質発現
するものは形質転換コロニ゛−の約３分の１であった。
即ち、ストレプトコッカス サンギスはダラム陽性菌で
あるので、元のＢＧ−８菌と同様にα−１，３グルカナ
ーゼを産生ずる場合にはこ菌体外に分泌することが期待
し得る。上記ＣＩＩＩ′になった菌のコロニーから滅菌
したステイクで、不溶性グルカンを添加したＢ、 Ｈ，
１，寒天平板に植菌して、直接α−１，３グルカナーゼ
の産生を溶解帯の有無によって調べた。
あるので、元のＢＧ−８菌と同様にα−１，３グルカナ
ーゼを産生ずる場合にはこ菌体外に分泌することが期待
し得る。上記ＣＩＩＩ′になった菌のコロニーから滅菌
したステイクで、不溶性グルカンを添加したＢ、 Ｈ，
１，寒天平板に植菌して、直接α−１，３グルカナーゼ
の産生を溶解帯の有無によって調べた。
かくして、初期の目的であった口腔内常在細菌であるス
トレプトコッカス サンギスの細胞内に、遺伝子操作に
よりクローニングされたα−１，３グルカナーゼ遺伝子
を導入して形質発現させることができた。
トレプトコッカス サンギスの細胞内に、遺伝子操作に
よりクローニングされたα−１，３グルカナーゼ遺伝子
を導入して形質発現させることができた。
（２）、 ｐＭＮ １を用いたストレプトコッカス サ
ンギスに導入したα−１，３グルカナーゼ遺伝子の形質
発現 第３図に示したように、ｐＧＢ ３０１はＥｍ’ （エ
リスロマイシン耐性）とＣｍ’ （クロラムフェニコー
ル耐性）という二つの安定した薬剤耐性マーカーを有し
、それ程太き（ないプラスミドである。しかしｐＧＢ
３０１をそのままの形で用いることは、下記の理由から
多少改良の余地がある。
ンギスに導入したα−１，３グルカナーゼ遺伝子の形質
発現 第３図に示したように、ｐＧＢ ３０１はＥｍ’ （エ
リスロマイシン耐性）とＣｍ’ （クロラムフェニコー
ル耐性）という二つの安定した薬剤耐性マーカーを有し
、それ程太き（ないプラスミドである。しかしｐＧＢ
３０１をそのままの形で用いることは、下記の理由から
多少改良の余地がある。
、１．ストレプトコッカス サンギスの細胞でのｐＧＢ
３０１のコピー数（ストレプトコッカス サンギスの
１細胞あたりのプラスミドＤＮＡの数）は約１０で多゛
いとは言えない。
３０１のコピー数（ストレプトコッカス サンギスの
１細胞あたりのプラスミドＤＮＡの数）は約１０で多゛
いとは言えない。
２、プラスミドの操作の際には、一般に細菌を少量培養
してプラスミドの大きさなどを簡単にチェックできるこ
とが好ましいが、上記１の理由によって、このプラスミ
ドをもっているストレプトコッカス サンギス（ｐＧＢ
３０１ ）を少量培養して、プラスミドの大きさなど
を簡単にチェックすることは難しい。更にまた大量培養
してプラスミドＤＮＡを得ることは複雑で長時間を要す
るのでやや効率が低い。
してプラスミドの大きさなどを簡単にチェックできるこ
とが好ましいが、上記１の理由によって、このプラスミ
ドをもっているストレプトコッカス サンギス（ｐＧＢ
３０１ ）を少量培養して、プラスミドの大きさなど
を簡単にチェックすることは難しい。更にまた大量培養
してプラスミドＤＮＡを得ることは複雑で長時間を要す
るのでやや効率が低い。
そこで、ｐＧＢ ３０１のもつ長所を活かしながら、上
記の欠点を補う意味で、ｐＧＢ ３０１と大腸菌のプラ
スミドｐｌＪｃ ９を結合させることにした。 ｐｕｃ
９は大腸菌のプラスミドの中で最モ小すク、且つコピ
ー数の多いものの一つで、ポリクローニングサイトがあ
る。
記の欠点を補う意味で、ｐＧＢ ３０１と大腸菌のプラ
スミドｐｌＪｃ ９を結合させることにした。 ｐｕｃ
９は大腸菌のプラスミドの中で最モ小すク、且つコピ
ー数の多いものの一つで、ポリクローニングサイトがあ
る。
ｐＧＢ ３０１ ＯＮＡを制限酵素Ｈａｅ ｍで切断（
１箇所）し、またｐｕｃ ９ ＤＮＡを制限酵素Ｓｍａ
Ｉで切断（１箇所）して、どちらも両端が平滑末端に
なった線状分子にする。次ぎに、この切断された両方の
ＤＮＡをＴ４ ＤＮ＾リガーゼによって結合させた。
１箇所）し、またｐｕｃ ９ ＤＮＡを制限酵素Ｓｍａ
Ｉで切断（１箇所）して、どちらも両端が平滑末端に
なった線状分子にする。次ぎに、この切断された両方の
ＤＮＡをＴ４ ＤＮ＾リガーゼによって結合させた。
この場合、上記制限酵素及びリガーゼは、下記の参考文
献に記載されている酵素を用い反応を行った。
献に記載されている酵素を用い反応を行った。
Ｈａｅ■： ミドルトン等； Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ
ｅｔ ａｌ。
ｅｔ ａｌ。
＊ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、 Ｖｏｌ、 ｔｏ、 ｐｐ、
４２−５０、１９７２： ロバーツ等； Ｒｏｂｅ
ｒｔｓｅｔ ａｌ、＋ Ｊ、 Ｍｏ１．＋ Ｂｉｏｌ、
、 Ｖｏｌ。
４２−５０、１９７２： ロバーツ等； Ｒｏｂｅ
ｒｔｓｅｔ ａｌ、＋ Ｊ、 Ｍｏ１．＋ Ｂｉｏｌ、
、 Ｖｏｌ。
９１・ ρｐ、１２１−１２３．１９７５ＳｍａＩ：エ
ンドウとロバーツＧ Ｅｎｄｏｗ ＆Ｒｏｂｅｒｔｓ＋
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋ Ｖｏｌ、１１２、
ｐｐ、 ５２１−５２９．１９７７； マツクバーラ
ンド； Ｍｅ、 Ｐａｒｌａｎｄ ｅｔａｌ、、
Ｊ、 νｔｒｏ１．． Ｖｏｌ、 １！Ｌ ９
ｐ、 １００６−１０１１．１９７６ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ：ウニイス等； Ｗｅｉｓｓ
ｅｔａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ＣＫｅｍ、、 Ｖ
ｏｌ、 ２４３、 ｐｐ、 ４５４３−４５５５．１９
６８Ｂ バネフト等； Ｐａｎｅｔ ａｔ ａｌ、
＋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ、 １２．
Ｉ）９．５０４５−５０５０．１９７３； ウィル
ソンとマレ−； Ｗｉｔｓｏｎ ＆ Ｍｕｒｒａｙ、
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｆ、 １３２．
ｐｐ、 ４７１−４９１．１９７９；マレ−等；Ｍｕｒ
ｒａｙ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ。
ンドウとロバーツＧ Ｅｎｄｏｗ ＆Ｒｏｂｅｒｔｓ＋
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋ Ｖｏｌ、１１２、
ｐｐ、 ５２１−５２９．１９７７； マツクバーラ
ンド； Ｍｅ、 Ｐａｒｌａｎｄ ｅｔａｌ、、
Ｊ、 νｔｒｏ１．． Ｖｏｌ、 １！Ｌ ９
ｐ、 １００６−１０１１．１９７６ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ：ウニイス等； Ｗｅｉｓｓ
ｅｔａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ＣＫｅｍ、、 Ｖ
ｏｌ、 ２４３、 ｐｐ、 ４５４３−４５５５．１９
６８Ｂ バネフト等； Ｐａｎｅｔ ａｔ ａｌ、
＋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ、 １２．
Ｉ）９．５０４５−５０５０．１９７３； ウィル
ソンとマレ−； Ｗｉｔｓｏｎ ＆ Ｍｕｒｒａｙ、
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｆ、 １３２．
ｐｐ、 ４７１−４９１．１９７９；マレ−等；Ｍｕｒ
ｒａｙ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｌ、 １３２． ｐｐ、 ４９３−
５０５ライゲーシヨンさせたＤＮＡで大腸菌ＪＭ １０
３ （Ｐｉ）−を形質転換させ、組み換えプラスミドを
もつ細胞を適当な指示プレート（メッシング等； Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 Ｖｏｌ、
７４． ｐｐ、 ’３６４２．１９７７；メッシング等
； Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ、 Ｖ
ｏｌ。
５０５ライゲーシヨンさせたＤＮＡで大腸菌ＪＭ １０
３ （Ｐｉ）−を形質転換させ、組み換えプラスミドを
もつ細胞を適当な指示プレート（メッシング等； Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 Ｖｏｌ、
７４． ｐｐ、 ’３６４２．１９７７；メッシング等
； Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ、 Ｖ
ｏｌ。
１９、 ｐｐ、 ２７６、１９８２）上で青いコロニー
中の白いコロニーとして検出した。これらのコロニーか
ら抽出したプラスミドＤＮＡを調べて、第４図のような
位置関係に連なったものをｐＭＮｌと名付け、以後α−
１，３グルカナーゼ遺伝子のクローニング・ベクターと
して用いた。
中の白いコロニーとして検出した。これらのコロニーか
ら抽出したプラスミドＤＮＡを調べて、第４図のような
位置関係に連なったものをｐＭＮｌと名付け、以後α−
１，３グルカナーゼ遺伝子のクローニング・ベクターと
して用いた。
ｐＭＮ １の性質は下記の通りである。
１、その分子の大きさは予想通り１２ ｋｂで、これは
ｐＧＢ ３０１ （９，８ｋｂ）とｐＵｃ ９ （２，
８ｋｂ）の和に相当する。
ｐＧＢ ３０１ （９，８ｋｂ）とｐＵｃ ９ （２，
８ｋｂ）の和に相当する。
２、大腸菌においても、ストレプトコッカスサンギスに
おいても増殖し得るシャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ
ｖｅｃｔｏｒ）であるも３、 Ｅｔａ’とＣ＃Ｉｒニ
加えテＡｌＩＩ′′（アンシビリン耐性遺伝子）をもち
、これらの形質のいずれもが大腸菌においてもストレブ
トコッカス サンギスにおいても発現される。
おいても増殖し得るシャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ
ｖｅｃｔｏｒ）であるも３、 Ｅｔａ’とＣ＃Ｉｒニ
加えテＡｌＩＩ′′（アンシビリン耐性遺伝子）をもち
、これらの形質のいずれもが大腸菌においてもストレブ
トコッカス サンギスにおいても発現される。
上記２，３はｐＭＮ Ｉ ＤＮＡをストレプトコッカス
サンギスの細胞に導入して形質転換させる実験の結果
明らかになった。尚、形質転換の方法は、ルブラン及び
ハラセル（ＬｅＢｌａｎｃ＆ Ｈａｓｓｅｌｌ） （（
Ｊ、ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
サンギスの細胞に導入して形質転換させる実験の結果
明らかになった。尚、形質転換の方法は、ルブラン及び
ハラセル（ＬｅＢｌａｎｃ＆ Ｈａｓｓｅｌｌ） （（
Ｊ、ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
） ） 、１２８（１）、３４７−３５５ （１９７６
） ） 、及びマクリーナ他（Ｍａｃｒｉｎａ ｅｔ
ａｌ、） （（Ｔｎｆｅｃ、＆Ｉｍｍ。
） ） 、及びマクリーナ他（Ｍａｃｒｉｎａ ｅｔ
ａｌ、） （（Ｔｎｆｅｃ、＆Ｉｍｍ。
） 、 ２８（３１，６９２−６９９（１９８０） ）
に従って行った。
に従って行った。
前記Ｅ項においてｐＹＥＪ ００１プラスミドの合成プ
ロモーターの下流にα−１，３グルカナーゼ遺伝子をク
ローニングできたことを記述した。然しなから、その活
性が期待したほど強（発現されなかったので、α−１，
３グルカナーゼ遺伝子が合成プロモーターに対して正方
向に挿入されているか否かの疑いがある。そこで、次ぎ
にα−１，３グルカナーゼ遺伝子の挿入の方向を決める
実験を行った。
ロモーターの下流にα−１，３グルカナーゼ遺伝子をク
ローニングできたことを記述した。然しなから、その活
性が期待したほど強（発現されなかったので、α−１，
３グルカナーゼ遺伝子が合成プロモーターに対して正方
向に挿入されているか否かの疑いがある。そこで、次ぎ
にα−１，３グルカナーゼ遺伝子の挿入の方向を決める
実験を行った。
・第５図に示したように、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼ
でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させたところ、Ａ→Ｂの方向で
あることが判明し、制限酵素Ｐｖｕｆｆサイトとの切断
距離関係から、逆方向であるという結論になった。再度
、３ ｋｂの断片をｐＹＥＪ ００１のＥｃｏ Ｒ１サ
イトにクローニングしたものを２０株以上得ることがで
きたが、ことごとく逆方向にクローニングされたもので
あった。
でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させたところ、Ａ→Ｂの方向で
あることが判明し、制限酵素Ｐｖｕｆｆサイトとの切断
距離関係から、逆方向であるという結論になった。再度
、３ ｋｂの断片をｐＹＥＪ ００１のＥｃｏ Ｒ１サ
イトにクローニングしたものを２０株以上得ることがで
きたが、ことごとく逆方向にクローニングされたもので
あった。
そこで、このことがなにを意味するか考察してみる。も
し、正方向に挿入されているならば、強力な形質発現が
起こり、α−１，３グルカナーゼが大量に産生されるこ
とが期待される。然し、現実にこのような株が全く分離
できなかったところをみると、ＢＣ−８菌のα−１，３
グルカナーゼのシグナルペプチドは大腸菌のシグナルペ
プチターゼによっては切り落とされず、従って強力な合
成プロモーターの下でその産生が強すぎると、菌体内に
蓄積した宿主菌を死滅させるものと思われる。
し、正方向に挿入されているならば、強力な形質発現が
起こり、α−１，３グルカナーゼが大量に産生されるこ
とが期待される。然し、現実にこのような株が全く分離
できなかったところをみると、ＢＣ−８菌のα−１，３
グルカナーゼのシグナルペプチドは大腸菌のシグナルペ
プチターゼによっては切り落とされず、従って強力な合
成プロモーターの下でその産生が強すぎると、菌体内に
蓄積した宿主菌を死滅させるものと思われる。
逆方向に入った場合は、ＢＣ−８菌のα−１，３グルカ
ナーゼ遺伝子の本来のプロモーターからの転写が起こる
のであるが、そのレベルは強力な合成プロモーターから
の転写に打ち消されて非常に滅弱させられると考えられ
る。
ナーゼ遺伝子の本来のプロモーターからの転写が起こる
のであるが、そのレベルは強力な合成プロモーターから
の転写に打ち消されて非常に滅弱させられると考えられ
る。
更に、大腸菌のトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ
）又はラクトーズプロモーター（ｐ、、ｅ）のような
誘導糸の強力なプロモーターの下流に、非誘導条件下で
α−１，３グルカナーゼ遺伝子を挿入した場合には、正
逆両方向のものが得られ、正方向ではα−１，３グルカ
ナーゼのかなり強い産生が見られた。
）又はラクトーズプロモーター（ｐ、、ｅ）のような
誘導糸の強力なプロモーターの下流に、非誘導条件下で
α−１，３グルカナーゼ遺伝子を挿入した場合には、正
逆両方向のものが得られ、正方向ではα−１，３グルカ
ナーゼのかなり強い産生が見られた。
結論として、α−１，３グルカナーゼを効率よく産生さ
せるためには、そのシグナルペプチド部分が大腸菌とス
トレプトコッカス サンギスで切り落とされ得るシグナ
ルペプチドになるように、ＤＮＡレベルで置換を工夫す
るとともに、プロモーターに対してα−１，３グルカナ
ーゼ遺伝子を正方向に挿入しなければならないというこ
とになる。
せるためには、そのシグナルペプチド部分が大腸菌とス
トレプトコッカス サンギスで切り落とされ得るシグナ
ルペプチドになるように、ＤＮＡレベルで置換を工夫す
るとともに、プロモーターに対してα−１，３グルカナ
ーゼ遺伝子を正方向に挿入しなければならないというこ
とになる。
上述のような方法で有効と思われる二つのシグナルペプ
チドを α−１，３グルカナーゼの頭につけることを試
みた。
チドを α−１，３グルカナーゼの頭につけることを試
みた。
（１）、前記Ｆ項で述べたように、Ａｍ’の産物である
β−ラクタマーゼは大腸菌でもストレプトコッカス サ
ンギスでも有効に発現するので、そのシグナルペプチド
に対応するＤＮＡ配列に、α−１，３グルカナーゼ遺伝
子のシグナルペプチドより後のＤＮＡ配列を結合させれ
ばよい。具体的には、大量等（１９８５年１２月４日、
東京で開催された「日本分子生物学会」の会合で発表）
によって改変されたｐＧＨ５４のシグナルペプチド相当
のＤＮＡ配列と、α−１，３グルカナーゼのシグナルペ
プチドより 後のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ合成装置（日本ゼオン＠（東
京都千代田区丸の内２−６−１古川総合ビル内）製のＤ
ＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ八−■の機種名Ｚｅｏｎ
Ｇｅｎｅｔ Ａ−ＩＩ ’）で人工的に合成したＤＮ
Ａ配列を介して結合させて、ｐＭＮ ２ （第６ａ図参
照）を作成した。
β−ラクタマーゼは大腸菌でもストレプトコッカス サ
ンギスでも有効に発現するので、そのシグナルペプチド
に対応するＤＮＡ配列に、α−１，３グルカナーゼ遺伝
子のシグナルペプチドより後のＤＮＡ配列を結合させれ
ばよい。具体的には、大量等（１９８５年１２月４日、
東京で開催された「日本分子生物学会」の会合で発表）
によって改変されたｐＧＨ５４のシグナルペプチド相当
のＤＮＡ配列と、α−１，３グルカナーゼのシグナルペ
プチドより 後のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ合成装置（日本ゼオン＠（東
京都千代田区丸の内２−６−１古川総合ビル内）製のＤ
ＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ八−■の機種名Ｚｅｏｎ
Ｇｅｎｅｔ Ａ−ＩＩ ’）で人工的に合成したＤＮ
Ａ配列を介して結合させて、ｐＭＮ ２ （第６ａ図参
照）を作成した。
（２）、ストレプトキナーゼ遺伝子がストレプトコッカ
ス エクイシミリスからクローニングされて、その塩基
配列も決定された（マルテとフエレッチｊ Ｍａｌｋｅ
＆Ｆｅｒｒｅｔｔｉ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 Ｖｏｌ、 ８１
．１）Ｉ）、 ３５５７−３５６１．１９８４Ｂマルヶ
等； Ｍａｌｋｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ、 Ｖ
ｏｌ。
ス エクイシミリスからクローニングされて、その塩基
配列も決定された（マルテとフエレッチｊ Ｍａｌｋｅ
＆Ｆｅｒｒｅｔｔｉ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 Ｖｏｌ、 ８１
．１）Ｉ）、 ３５５７−３５６１．１９８４Ｂマルヶ
等； Ｍａｌｋｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ、 Ｖ
ｏｌ。
３４、 ｐｐ、 ３５７−３６２．１９８５）。この酵
素はストレプトコッカス サンギスと同属のエクイシミ
リスは勿論、大腸菌でも菌体外に分泌されることが判明
しているので、この酵素のシグナルペプチドに相当する
ＤＮＡ配列をＤＮＡ合成装置で合成し、それにα−１，
３グルカナーゼのシグナルペプチドより下流のＤＮＡ配
列をつなぎ込むことによって、ｐＭＮ ３ （第６ｂ図
参照）を得た。ｐＭＮ ２とｐＭＮ ３プラスミドでも
って形質転換された大腸菌ＪＭ １０３をＥｖａ’ 、
Ｃａ＋７として得た。これら・の形質転換した細胞では
いずれもそのペリプラズムにα−１，３グルカナーゼを
かなり蓄積していることが確認された。
素はストレプトコッカス サンギスと同属のエクイシミ
リスは勿論、大腸菌でも菌体外に分泌されることが判明
しているので、この酵素のシグナルペプチドに相当する
ＤＮＡ配列をＤＮＡ合成装置で合成し、それにα−１，
３グルカナーゼのシグナルペプチドより下流のＤＮＡ配
列をつなぎ込むことによって、ｐＭＮ ３ （第６ｂ図
参照）を得た。ｐＭＮ ２とｐＭＮ ３プラスミドでも
って形質転換された大腸菌ＪＭ １０３をＥｖａ’ 、
Ｃａ＋７として得た。これら・の形質転換した細胞では
いずれもそのペリプラズムにα−１，３グルカナーゼを
かなり蓄積していることが確認された。
それで、次にｐＭＮ ２ とｐＭＮ ３プラスミドによ
ってストレプトコッカス サンギス株を形質転換させる
実験を行った。いずれの場合でも、ＥＩｌｒ、Ｃｌ１ｒ
として得た形質転換体のコロニーを一つづつ不溶性グル
カンを添加したＢ、Ｈ，１，寒天平板に植菌し直して調
べたところ、溶解帯が認められ、α−１，３グルカナー
ゼが大量に産生されていることが判明した。
ってストレプトコッカス サンギス株を形質転換させる
実験を行った。いずれの場合でも、ＥＩｌｒ、Ｃｌ１ｒ
として得た形質転換体のコロニーを一つづつ不溶性グル
カンを添加したＢ、Ｈ，１，寒天平板に植菌し直して調
べたところ、溶解帯が認められ、α−１，３グルカナー
ゼが大量に産生されていることが判明した。
かくして、初期の目的であった口腔内常在細菌であるス
トレプトコッカス サンギスの細胞でα−１，３グルカ
ナーゼ遺伝子を形質発現することに成功した。上述の通
り、プロモーターに対して、グルカナーゼ遺伝子を正方
向につなく′ことと、ストレプトコッカス サつなぎ替
えたことなどが成功のポイントであったと考えられる。
トレプトコッカス サンギスの細胞でα−１，３グルカ
ナーゼ遺伝子を形質発現することに成功した。上述の通
り、プロモーターに対して、グルカナーゼ遺伝子を正方
向につなく′ことと、ストレプトコッカス サつなぎ替
えたことなどが成功のポイントであったと考えられる。
以上、α−１，３グルカナーゼ遺伝子をクローニングし
て口腔内常在細菌に導入して形質発現させる方法につい
て述べてきたが、前記Ｂ項で述べたように、バチルス
サーキュランスＢＣ−８菌は、α−１，３グルカナーゼ
とともに、α−１，６グルカナーゼを産生ずる菌である
。従って、α−１，６グルカナーゼ遺伝子を前記実施例
に示したのと同様な遺伝子操作により、クローニングし
てストレプトコッカス サンギスの細胞に導入して形質
発現させることも可能である。
て口腔内常在細菌に導入して形質発現させる方法につい
て述べてきたが、前記Ｂ項で述べたように、バチルス
サーキュランスＢＣ−８菌は、α−１，３グルカナーゼ
とともに、α−１，６グルカナーゼを産生ずる菌である
。従って、α−１，６グルカナーゼ遺伝子を前記実施例
に示したのと同様な遺伝子操作により、クローニングし
てストレプトコッカス サンギスの細胞に導入して形質
発現させることも可能である。
また、前記実施例で用いたバチルス サーキュランス
ＢＣ−８菌の他に、α−１，３−グルカナーゼを産生ず
る菌：例えばシュドモナスＳＫ−０１（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ＳＫ−０１（微工研菌寄第４２７３号） （
ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、４２７３） ）のα−１，３−グ
ルカナーゼ遺伝子、或いはα−１，６−グルカナーゼを
産生ずる菌：例えば、コリネバクテリウムｓｐ、 ＣＢ
−８（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、 ＣＢ
−８（微工研条寄第９９５号）（ＦＨＲＭ ＢＰ−Ｎｏ
、 ９９５））、コリネバクテリウムＡＫ−０１（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＫ−０１（ｍ工研菌
寄第２５０５号） （ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、２５０５）
） 、フラボバクテリウムＢＫ−０１〜０６ （Ｆｌ
ａｖｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ ＢＫ−０１〜０６ （微工
研菌寄第１１９４号又は第１２８５号〜第１２８８号）
（ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、１１９４ ｏｒ ＦＥＲＭ
Ｐ−Ｎｏ、１２８５〜１２８８） ） 、バエシロマイ
セスＴＣＩ−Ｎｏ、９０１１ （Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃ
ｅｓＴＣＩ−Ｎｏ、９００１ （微工研菌寄第６６０２
号） （ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、６６０２） ） 、ペニ
シリウム・フェニキュローサムＩＡＭ−７０１３（（微
工研菌寄第１２９０号） （ＦＯＲＭ Ｐ−Ｎｏ、１２
９０） ）のα−１，６グルカナーゼ遺伝子を前記実施
例に示した方法と殆ど同様の遺伝子操作によりクローニ
ングして、その遺伝子をストレプトコッカス サンギス
の細胞内に導入して形質発現させることができる。
ＢＣ−８菌の他に、α−１，３−グルカナーゼを産生ず
る菌：例えばシュドモナスＳＫ−０１（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ＳＫ−０１（微工研菌寄第４２７３号） （
ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、４２７３） ）のα−１，３−グ
ルカナーゼ遺伝子、或いはα−１，６−グルカナーゼを
産生ずる菌：例えば、コリネバクテリウムｓｐ、 ＣＢ
−８（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、 ＣＢ
−８（微工研条寄第９９５号）（ＦＨＲＭ ＢＰ−Ｎｏ
、 ９９５））、コリネバクテリウムＡＫ−０１（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＫ−０１（ｍ工研菌
寄第２５０５号） （ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、２５０５）
） 、フラボバクテリウムＢＫ−０１〜０６ （Ｆｌ
ａｖｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ ＢＫ−０１〜０６ （微工
研菌寄第１１９４号又は第１２８５号〜第１２８８号）
（ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、１１９４ ｏｒ ＦＥＲＭ
Ｐ−Ｎｏ、１２８５〜１２８８） ） 、バエシロマイ
セスＴＣＩ−Ｎｏ、９０１１ （Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃ
ｅｓＴＣＩ−Ｎｏ、９００１ （微工研菌寄第６６０２
号） （ＦＥＲＭ Ｐ−Ｎｏ、６６０２） ） 、ペニ
シリウム・フェニキュローサムＩＡＭ−７０１３（（微
工研菌寄第１２９０号） （ＦＯＲＭ Ｐ−Ｎｏ、１２
９０） ）のα−１，６グルカナーゼ遺伝子を前記実施
例に示した方法と殆ど同様の遺伝子操作によりクローニ
ングして、その遺伝子をストレプトコッカス サンギス
の細胞内に導入して形質発現させることができる。
更に、前記Ｅ項で述べた通り、不溶性グルカンの除去に
は、α−１，３グルカナーゼとα−１，６グルカナーゼ
の協同作用が特に有効である。従って、一つのプラスミ
ド上の一つの強力なプロモーター（例えば、β−ラクタ
マーゼ、或いはストレプトキナーゼ遺伝子のプロモータ
）の下流に、α−１，３グルカナーゼ遺伝子とα−１，
６グルカナーゼ遺伝子をシリーズにつなぎ込んだプラス
ミドを作成して、これをストレプトコッカス サンギス
に導入すれば、同時に二つの酵素を産生ずるので、最も
有効に不溶性グルカンを除去できる。
は、α−１，３グルカナーゼとα−１，６グルカナーゼ
の協同作用が特に有効である。従って、一つのプラスミ
ド上の一つの強力なプロモーター（例えば、β−ラクタ
マーゼ、或いはストレプトキナーゼ遺伝子のプロモータ
）の下流に、α−１，３グルカナーゼ遺伝子とα−１，
６グルカナーゼ遺伝子をシリーズにつなぎ込んだプラス
ミドを作成して、これをストレプトコッカス サンギス
に導入すれば、同時に二つの酵素を産生ずるので、最も
有効に不溶性グルカンを除去できる。
尚、口腔内常在細菌には前述した如く、ストレプトコッ
カス サンギス以外にもストレプトコッカス サリバリ
ウス等の連鎖球菌が存在するので、これらにもストレプ
トコッカス サンギスを形質転換した方法と基本的に同
様な操作によって、この遺伝子を導入して発現させるこ
とが可能である。
カス サンギス以外にもストレプトコッカス サリバリ
ウス等の連鎖球菌が存在するので、これらにもストレプ
トコッカス サンギスを形質転換した方法と基本的に同
様な操作によって、この遺伝子を導入して発現させるこ
とが可能である。
（効果）
以上説明したとおり、この発明の虫歯予防剤は、虫歯の
原因である虫歯菌が産生した不溶性グルカンを分解する
酵素を産生ずるα−１，３グルカナーゼ遺伝子、又はα
−１，６グルカナーゼ遺伝子、或いはその両方の遺伝子
を導入して形質転換させた口腔内常在細菌を含有するか
ら、種々の手段により本発明にかかる虫歯予防剤を口腔
内の歯に付着させるようにすれば、口腔内に虫歯菌が産
生じた不溶性グルカンを分解する酵素を常時産生させる
ことができ、その結果虫歯を確実に且つ長期に亘り予防
することができるという効果を奏するものである。
原因である虫歯菌が産生した不溶性グルカンを分解する
酵素を産生ずるα−１，３グルカナーゼ遺伝子、又はα
−１，６グルカナーゼ遺伝子、或いはその両方の遺伝子
を導入して形質転換させた口腔内常在細菌を含有するか
ら、種々の手段により本発明にかかる虫歯予防剤を口腔
内の歯に付着させるようにすれば、口腔内に虫歯菌が産
生じた不溶性グルカンを分解する酵素を常時産生させる
ことができ、その結果虫歯を確実に且つ長期に亘り予防
することができるという効果を奏するものである。
第１図は不溶性グルカンの構造式を示す図、第２図は大
腸菌の細胞質内に存在するｐＹＥＪ００１プラスミドの
遺伝子地図を示す図、第３図はストレプトコッカス サ
ンギスの細胞質内に存在するｐＧＢ ３０１プラスミド
の遺伝子地図を示す図、第４図はストレプトコフカスサ
ンギスのプラスミドｐＧＢ ３０１（９，８ｋｂ）と大
腸菌のプラスミドｐＵｃ ９ （２，８ｋｂ）をそれぞ
れＨａｅ ｍとＳｍａ Ｉで切断し、Ｔ４ リガーゼに
より結合して得たシャトルベクターｐＭ８１の作成を示
す図、第５図はｐＹＥＪ ００１にクローニングされた
α−１，３グルカナーゼ遺伝子の転写方向（合成プロモ
ーターから始まるＣｍ’遺伝子とは逆方向）を示す図、
第６ａ図は９ＭＮ２の作成を示す図、第６ｂ図はｐＭＮ
３の作成を示す図である。 寡４図
腸菌の細胞質内に存在するｐＹＥＪ００１プラスミドの
遺伝子地図を示す図、第３図はストレプトコッカス サ
ンギスの細胞質内に存在するｐＧＢ ３０１プラスミド
の遺伝子地図を示す図、第４図はストレプトコフカスサ
ンギスのプラスミドｐＧＢ ３０１（９，８ｋｂ）と大
腸菌のプラスミドｐＵｃ ９ （２，８ｋｂ）をそれぞ
れＨａｅ ｍとＳｍａ Ｉで切断し、Ｔ４ リガーゼに
より結合して得たシャトルベクターｐＭ８１の作成を示
す図、第５図はｐＹＥＪ ００１にクローニングされた
α−１，３グルカナーゼ遺伝子の転写方向（合成プロモ
ーターから始まるＣｍ’遺伝子とは逆方向）を示す図、
第６ａ図は９ＭＮ２の作成を示す図、第６ｂ図はｐＭＮ
３の作成を示す図である。 寡４図
Claims (10)
- （１）、α−１，３グルカン３−グルカノハイドロラー
ゼ、若しくはα−１，６グルカン６−グルカノハイドロ
ラーゼ、或いはその両方の遺伝子ＤＮＡを、細胞内に導
入して形質発現させた口腔内常在細菌を、含有すること
を特徴とする虫歯予防剤。 - （２）、前記α−１，３グルカン３−グルカノハイドロ
ラーゼ、若しくはα−１，６グルカン６−グルカノハイ
ドロラーゼ、或いはその両方の遺伝子ＤＮＡを、バチル
ス サーキュランス ＢＣ−８菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＢＣ−８）から抽出した特許請求の範囲第１項に記載の
虫歯予防剤。 - （３）、前記α−１，３グルカン３−グルカノハイドロ
ラーゼ遺伝子ＤＮＡを、シュドモナス ＳＫ−０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＳＫ−０１）菌
から抽出した特許請求の範囲第１項に記載の虫歯予防剤
。 - （４）、前記α−１，６グルカン６−グルカノハイドロ
ラーゼ遺伝子ＤＮＡを、コリネバクテリウム ｓｐ．
ＣＢ−８菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．
ＣＢ−８）から抽出した特許請求の範囲第１項に記載
の虫歯予防剤。 - （５）、前記α−１，６グルカン６−グルカノハイドロ
ラーゼ遺伝子ＤＮＡを、コリネバクテリウムＡＫ−０１
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＫ−０１）菌か
ら抽出した特許請求の範囲第１項に記載の虫歯予防剤。 - （６）、虫歯菌が産生する不溶性グルカンの分解酵素で
あるα−１，３グルカン３−グルカノハイドロラーゼ、
若しくはα−１，６グルカン６−グルカノハイドロラー
ゼ、或いはその両方を産生する細菌を培養し、該菌中の
α−１，３グルカン３−グルカノハイドロラーゼ、若し
くはα−１，６グルカン６−グルカノハイドロラーゼ、
或いはその両方の遺伝子ＤＮＡを抽出して、大腸菌のプ
ラスミドＤＮＡに組み込み、該組み替えプラスミドＤＮ
Ａを大腸菌に導入して形質発現させ、前記α−１，３グ
ルカン３−グルカノハイドロラーゼ、若しくはα−１，
６グルカン６−グルカノハイドロラーゼ、或いはその両
方の遺伝子ＤＮＡの存在を確認した後、前記組み替えプ
ラスミドＤＮＡ中のα−１，３グルカン３−グルカノハ
イドロラーゼ、若しくはα−１，６グルカン６−グルカ
ノハイドロラーゼ、或いはその両方の遺伝子ＤＮＡを、
口腔内常在細菌から抽出したプラスミドＤＮＡに組み込
んで口腔内常在細菌に導入し、形質発現させることを特
徴とする虫歯予防剤の製造方法。 - （７）、前記α−１，３グルカン３−グルカノハイドロ
ラーゼ、若しくはα−１，６グルカン６−グルカノハイ
ドロラーゼ、或いはその両方の遺伝子ＤＮＡを、バチル
ス サーキュランス ＢＣ−８菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
ＢＣ−８）から抽出する特許請求の範囲第６項に記載の
虫歯予防剤の製造方法。 - （８）、前記α−１，３グルカン３−グルカノハイドロ
ラーゼ遺伝子ＤＮＡを、シュドモナス ＳＫ−０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＳＫ−０１）菌
から抽出する特許請求の範囲第６項に記載の虫歯予防剤
の製造方法。 - （９）、前記α−１，６グルカン６−グルカノハイドロ
ラーゼ遺伝子ＤＮＡを、コリネバクテリウム ｓｐ．
ＣＢ−８菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．
ＣＢ−８）から抽出する特許請求の範囲第６項に記載
の虫歯予防剤の製造方法。 - （１０）、前記α−１，６グルカン６−グルカノハイド
ロラーゼ遺伝子ＤＮＡを、コリネバクテリウムＡＫ−０
１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＫ−０１）菌
から抽出する特許請求の範囲第６項に記載の虫歯予防剤
の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5744385 | 1985-03-20 | ||
| JP60-57443 | 1985-03-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6225A true JPS6225A (ja) | 1987-01-06 |
Family
ID=13055798
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61063532A Pending JPS6225A (ja) | 1985-03-20 | 1986-03-20 | 虫歯予防剤及びその製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0195672B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6225A (ja) |
| KR (1) | KR940003689B1 (ja) |
| AU (1) | AU592328B2 (ja) |
| CA (1) | CA1321962C (ja) |
| DE (1) | DE3681946D1 (ja) |
| SU (1) | SU1720493A3 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63185381A (ja) * | 1987-01-27 | 1988-07-30 | Aizo Matsushiro | デキストラナ−ゼの製造方法 |
| US4810733A (en) * | 1987-10-19 | 1989-03-07 | Toyo Ink Mfg Co., Ltd | Color concentrates |
| JPH02157228A (ja) * | 1988-12-12 | 1990-06-18 | Hitachi Ltd | 微生物及びその利用方法 |
| JPH03244377A (ja) * | 1990-02-20 | 1991-10-31 | Aizo Matsushiro | 新規形質転換株およびその製造方法 |
| JP2009522330A (ja) * | 2006-01-04 | 2009-06-11 | マウデ ウィクストレム， | 微生物の成長を刺激する口内用健康促進生成物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0311469A3 (en) * | 1987-09-02 | 1990-05-30 | Plant Genetic Systems N.V. | Transformed lactic acid bacteria |
| JPH054927A (ja) * | 1991-06-28 | 1993-01-14 | Aizo Matsushiro | 乳酸菌含有組成物及びその製造方法 |
| IT1270123B (it) * | 1994-10-05 | 1997-04-28 | Dompe Spa | Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia |
| EP0882131A1 (en) * | 1996-02-09 | 1998-12-09 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Polypeptides having mutanase activity and nucleic acids encoding same |
| ES2174248T3 (es) * | 1996-04-16 | 2002-11-01 | Novozymes As | Composiciones para la eliminacion de una placa dental. |
| GB2327345B (en) * | 1997-07-18 | 1999-06-23 | Finnfeeds Int Ltd | Use of an enzyme for manufacturing an agent for controlling bacterial infection |
| US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| IL134936A0 (en) | 1997-09-10 | 2001-05-20 | Vion Pharmaceuticals Inc | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| US6962696B1 (en) | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
| MX343566B (es) | 2010-08-31 | 2016-11-09 | Centro Superior De Investig En Salud Publica (Csisp) * | Composiciones y probioticos/prebioticos anticaries. |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| AU2022224569A1 (en) * | 2021-02-17 | 2023-09-07 | Colgate-Palmolive Company | Prebiotic oral care compositions and methods |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57165312A (en) * | 1981-04-03 | 1982-10-12 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | Production of oral composition |
| FR2529569B1 (fr) * | 1982-07-02 | 1985-07-05 | Pasteur Institut | Microorganismes, notamment e. coli, transformes par une sequence d'adn originaire de c. thermocellum, compositions a activite cellulolytique issues de ces micro-organismes et procede pour les obtenir |
-
1986
- 1986-03-18 CA CA000504382A patent/CA1321962C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-19 EP EP86302044A patent/EP0195672B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-19 DE DE8686302044T patent/DE3681946D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-20 SU SU864027298A patent/SU1720493A3/ru active
- 1986-03-20 JP JP61063532A patent/JPS6225A/ja active Pending
- 1986-03-20 KR KR1019860002072A patent/KR940003689B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-03-20 AU AU54937/86A patent/AU592328B2/en not_active Ceased
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63185381A (ja) * | 1987-01-27 | 1988-07-30 | Aizo Matsushiro | デキストラナ−ゼの製造方法 |
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| JPH02157228A (ja) * | 1988-12-12 | 1990-06-18 | Hitachi Ltd | 微生物及びその利用方法 |
| JPH03244377A (ja) * | 1990-02-20 | 1991-10-31 | Aizo Matsushiro | 新規形質転換株およびその製造方法 |
| JP2009522330A (ja) * | 2006-01-04 | 2009-06-11 | マウデ ウィクストレム， | 微生物の成長を刺激する口内用健康促進生成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR860007377A (ko) | 1986-10-10 |
| EP0195672A3 (en) | 1988-07-06 |
| DE3681946D1 (de) | 1991-11-21 |
| AU592328B2 (en) | 1990-01-11 |
| AU5493786A (en) | 1986-09-25 |
| EP0195672A2 (en) | 1986-09-24 |
| EP0195672B1 (en) | 1991-10-16 |
| SU1720493A3 (ru) | 1992-03-15 |
| KR940003689B1 (ko) | 1994-04-27 |
| CA1321962C (en) | 1993-09-07 |
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