KR102475419B1 - Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주 - Google Patents

Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)는 이중 라이소젠 균주로서 단일 라이소젠 균주를 이용한 것보다 CRM197의 발현양이 1.5배 내지 3배 증가하여 생산에 필요한 시간과 비용을 절약할 수 있다. 또한, Fe2 + 농도에 영향을 받지 않고 CRM197을 고농도로 발현시킬 수 있어 배양 배지 제조 중 Fe2 +를 제거하는 과정이 불필요해지고, 높은 농도의 Fe2 + 조건에서도 CRM197의 발현에 영향을 받지 않으면서 균 성장을 향상시킬 수 있어 결과적으로 CRM197의 생산성을 향상시킬 수 있다. 이를 통해, 궁극적으로는 CRM197을 보다 단순한 공정으로 고수율로 생산하여 제조비용을 절감함으로써 경제성 있는 접합백신 생산공정 개발이 가능하다.

Description

CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주{CORYNEBACTERIUM EXPRESSING HIGH LEVEL OF CRM197}
본 발명은 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)에 관한 것이다.
대부분의 단백질 항원 백신은 헬퍼 T 림프구(helper T lymphocyte) 도움에 의해 B 림프구가 자극되어 주로 IgG 항체에 의한 면역 반응이 일어나며, 기억 B 림프구(memory B lymphocyte)를 유도하여 추가 접종에 의한 면역 증강 효과를 나타낸다. 하지만 다당류 항원 백신의 경우 T 림프구의 도움 없이 B-림프구가 자극되어 IgG, IgM 항체를 생성하나 부스팅 되지 않아 항체 생성률이 낮다. 특히 면역계 발달이 미숙한 2세 미만의 영유아에게는 항체가 형성되지 않아 백신 효과가 미미하다. 이러한 다당체 백신의 문제점을 극복하기 위하여 1990년대 후반부터 다당체에 인위적으로 단백질을 결합시켜, 결합된 항원의 면역원성을 높이는 다당체-단백질 접합 백신이 개발되었다.
다당체-단백질 접합백신(이하, 접합백신)은 병원균으로부터 순수 분리한 피막 다당체에 전달단백질(Carrier protein)이라고 하는 면역증강용 단백질을 화학적으로 결합하여 제조한 백신으로서 결합된 전달단백질의 작용으로 MHC Class II를 통해 헬퍼 T 세포(helper T cell)에 T 세포 에피토프(T-cell epitope)를 제공하여 T 세포 반응을 유도하고 기억 B 세포(memory B cell) 생성을 유도함으로써 면역반응을 강화시켜 2세 미만의 영유아에서 효능이 우수하다.
면역효과를 증강시키는 전달단백질에는 여러 종류가 있으나 허가 받은 백신에 사용된 전달단백질의 수는 제한적이며 여기에는 파상풍톡소이드(Tetanus toxoid), 디프테리아톡소이드(Diphtheria toxoid), CRM197(디프테리아독소의 비독성변이체), H. influenzae protein D 및 Neisseria outer membrane protein complex(OMPC) 등이 있다. 그 외 연구 중인 전달단백질에는 rEPA(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A), KLH(keyhole limpet hemocyanin), 플라젤린(Flagellin) 등이 있다. 이 중, 접합백신 제조를 위해 사용되는 전달단백질인 CRM197은 디프테리아 독소를 코딩하는 tox 유전자에 단일 돌연변이가 일어나 52번 아미노산이 글리신(Glycine, Gly)에서 글루탐산(Glutamic acid, Glu)으로 치환되어 디프테리아 독소와 동일한 활성을 지니지만 독성을 가지지 않는다. 따라서 다른 전달단백질인 파상풍톡소이드나 디프테리아톡소이드와 달리 단백질 자체의 독성이 없어 접합백신 개발과정의 단순화가 가능하고 백신의 안전성이 높다는 장점이 있다.
CRM197은 최초 생산균주인 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria, 이하 C. diphtheriae)로부터 생산하는 천연형과 CRM197에 대한 유전자를 대장균이나 슈도모나스(Pseudomonas)에 도입하여 이들로부터 생산하는 재조합형의 두 종류가 있다. 현재까지 재조합형인 rCRM197을 전달단백질로 사용하여 허가 받은 접합백신의 예는 전 세계적으로 없으며 이러한 허가적인 이슈로 인해 재조합형보다는 천연형 CRM197이 접합백신의 원료로 선호되지만, 천연형 CRM197은 생산성이 낮은 문제가 있다. C. diphtheriae를 이용한 천연형 CRM197의 생산성이 낮은 원인은 CRM197을 코딩하는 tox 유전자가 C. diphtheriae 균주 유전체 내에 라이소젠의 형태로 1~2개 밖에 존재하지 않으며, 발현도 Fe2 +와 같은 인자에 의해 제한되고 있어 배지 중의 Fe2 + 농도가 낮게 조절되어야 하므로 이로 인해 충분한 세포성장을 확보하기가 어렵기 때문이다. 또한 낮은 Fe2 + 농도로 인해 균의 성장이 저해되는 현상과 남아있는 미량의 Fe2 +로 인해 CRM197 발현이 일부 억제되는 문제도 있다.
따라서, 생산공정의 단순화, 시간단축 및 CRM197 생산량 증진을 위해 Fe2 +의 농도와 관계없이 고농도의 CRM197을 발현하는 균주 개발의 필요성이 대두된다.
이에, 본 발명자들은 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)를 통한 천연형 CRM197의 낮은 생산성을 개선할 수 있는 방법을 연구하던 중, CRM197을 코딩하는 유전자를 2개 이상 보유하는 이중 라이소젠 균주를 개발하여 CRM197 생산성이 증가됨을 확인하고, 나아가 상기 이중 라이소젠 균주에 화학적 돌연변이를 유발하여 Fe2 + 농도에 영향을 받지 않고 CRM197을 고농도로 발현시킬 수 있는 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)를 코리네박테리오파지로 감염시켜 이중 라이소젠 균주를 제작하는 단계; 상기 이중 라이소젠 균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)을 처리하여 돌연변이 균주를 제작하는 단계; 및 상기 돌연변이 균주를 배지에서 배양하여 CRM197을 발현하는 돌연변이 균주를 선별하는 단계;를 포함하는, CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)를 이용한 CRM197의 생산방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)를 코리네박테리오파지로 감염시켜 이중 라이소젠 균주를 제작하는 단계; 상기 이중 라이소젠 균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)을 처리하여 돌연변이 균주를 제작하는 단계; 및 상기 돌연변이 균주를 배지에서 배양하여 CRM197을 발현하는 돌연변이 균주를 선별하는 단계;를 포함하는, CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)를 이용한 CRM197의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)는 이중 라이소젠 균주로서 단일 라이소젠 균주를 이용한 것보다 CRM197의 발현양이 1.5배 내지 3배 증가하여 생산에 필요한 시간과 비용을 절약할 수 있다. 또한, Fe2 + 농도에 영향을 받지 않고 CRM197을 고농도로 발현시킬 수 있어 배양 배지 제조 중 Fe2 +를 제거하는 과정이 불필요해지고, 높은 농도의 Fe2 + 조건에서도 CRM197의 발현에 영향을 받지 않으면서 균 성장을 향상시킬 수 있어 결과적으로 CRM197의 생산성을 향상시킬 수 있다. 이를 통해, 궁극적으로는 CRM197을 보다 단순한 공정으로 고수율로 생산하여 제조비용을 절감함으로써 경제성 있는 접합백신 생산공정 개발이 가능하다.
도 1은 코리네박테리움 디프테리아(C. diphtheriae) 배양액에 코리네박테리오파지 배양액을 첨가하여 코리네박테리움 디프테리아가 감염됨에 따른 용균반 형성을 나타낸 도이다.
도 2는 용균반 중앙에서 라이소젠 형태의 균이 자라 형성된 혼탁 용균반을 나타낸 도이다.
도 3은 다중 라이소젠 후보 균주를 선발하기 위하여 수행한 halo assay 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 C. diphtheriae의 유전체 및 파지가 삽입되는 위치에 따른 단일 라이소젠, 이중 라이소젠 형성 모식도를 나타낸 도이다.
도 5는 이중 라이소젠 형성 여부를 확인하기 위하여 실시한 PCR 결과를 나타낸 도이다. 좌측에는 단일 라이소젠의 PCR 결과, 우측에는 halo assay 결과를 통해 선별된 콜로니(Halo colony No.13)의 PCR 결과를 나타내었다(레인 1: attB1, 레인 2: attL1, 레인 3: attR1, 레인 4: attB2, 레인 5: attL2, 레인 6: attR2).
도 6은 동일 배지(철을 제거한 YC 배지)에서 배양한 단일 라이소젠 균주 및 이중 라이소젠 균주의 생장 정도를 확인하기 위하여 측정한 OD600 값의 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 동일 배지(철을 제거한 YC 배지)에서 배양한 단일 라이소젠 균주 및 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현량을 측정하기 위하여 실시한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 동일 배양기(철을 제거한 YC 배지)에서 배양한 단일 라이소젠 균주 및 이중 라이소젠 균주의 생장 정도를 확인하기 위하여 측정한 OD600 값의 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 동일 배양기(철을 제거한 YC 배지)에서 배양한 단일 라이소젠 균주 및 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현량을 측정하기 위하여 실시한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다(레인 1: MW 마커, 레인 2: CRM197 표준품, 레인 3~7: 단일 라이소젠 시간대별 배양액, 레인 8~12: 이중 라이소젠 시간대별 배양액).
도 10은 이중 라이소젠 균주의 안정성을 확인하기 위하여 실시한 PCR 결과를 나타낸 도이다(레인 1: attB1, 레인 2: attL1, 레인 3: attR1, 레인 4: attB2, 레인 5: attL2, 레인 6: attR2).
도 11은 높은 Fe2 + 농도 배지(초록색 선) 및 낮은 Fe2 + 농도 배지(파란색 선)에서 이중 라이소젠 균주의 생장 정도를 확인하기 위하여 측정한 OD600 값의 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 높은 Fe2 + 농도 배지 및 낮은 Fe2 + 농도 배지에서 단일 라이소젠 균주 및 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현량을 측정하기 위하여 실시한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다(레인 1: MW 마커, 레인 2: CRM197 표준품, 레인 3: 낮은 Fe2 + 농도 배지에서 단일 라이소젠 균주 배양액(OD=9.0), 레인 4: 낮은 Fe2 + 농도 배지에서 이중 라이소젠 균주 배양액(OD=7), 레인 5: 높은 Fe2 + 농도 배지에서 단일 라이소젠 균주 배양액(OD=21.2), 레인 6: 높은 Fe2 + 농도 배지에서 이중 라이소젠 균주 배양액(OD=18.5)).
도 13은 이중 라이소젠 균주 돌연변이 라이브러리 콜로니의 CRM197 발현 여부를 1차적으로 확인하기 위하여 낮은 Fe2 + 농도 배지에 1μg/mL의 Fe2 +을 첨가하여 콜로니들을 배양한 후 실시한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다(레인 1: CRM197 표준품, 레인 2: 돌연변이 전 이중 라이소젠, 레인 3: 돌연변이 균주 #1~50, 레인 4: 돌연변이 균주 #51~100, 레인 5: 돌연변이 균주 #101~150, 레인 6: 돌연변이 균주 #151~200).
도 14는 1차적으로 선별한 돌연변이 콜로니들을 1μg/mL의 Fe2 +를 첨가하여 배양 후 CRM197 발현 여부를 2차적으로 확인하기 위하여 실시한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다(레인 1: MW 마커, 레인 2: CRM197 표준품, 레인 3~10: 콜로니 #168~175).
도 15는 고농도 Fe2 + 존재 하에서 배양한 돌연변이 전과 후 이중 라이소젠 균주의 생장 정도를 확인하기 위하여 측정한 OD600 값의 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 고농도 Fe2 + 존재 하에서 배양한 돌연변이 전과 후 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현 양상을 나타낸 도이다(레인 1: MW 마커, 레인 2: CRM197 표준품, 레인 3: 돌연변이 전 이중 라이소젠 배양액, 레인 4: 돌연변이 후 이중 라이소젠(#169) 배양액).
도 17은 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주(#169)의 이중 라이소젠 상태 안정성을 확인하기 위하여 실시한 PCR 결과를 나타낸 도이다(레인 1: attB1, 레인 2: attL1, 레인 3: attR1, 레인 4: attB2, 레인 5: attL2, 레인 6: attR2).
도 18은 Fe2 +를 제거하지 않은 배지에서 단일 라이소젠 균주, 이중 라이소젠 균주 및 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주의 생장 정도를 확인하기 위하여 측정한 OD600 값의 변화를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)를 제공한다.
본 발명의 용어, “고농도로 발현”은 본 발명의 코리네박테리움 균주가 단일 라이소젠(lysogen) 균주 또는 단순 이중 라이소젠 균주(화학적 돌연변이 전 이중 라이소젠 균주)에 비해 높은 CRM197 생산능을 갖는 것을 의미한다.
상기 균주는 CRM197 생산량을 증가시키기 위하여 코리네박테리움 균주를 코리네박테리오파지로 감염시켜 다수 라이소젠(lysogen)을 도입한 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 유전체 내에 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 CRM197을 코딩하는 tox 유전자를 2개 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구현예들에 따른 상기 코리네박테리움 균주는 Fe2 +가 0.3μg/mL 이상의 고농도로 포함된 배지에서 배양하여도 효과적으로 생장할 수 있다. 또한, 고농도의 Fe2 + 하에서도 CRM197을 정상적으로 발현할 수 있다. CRM197을 코딩하는 tox 유전자는 C. diphtheriae의 유전체에 존재하는 다른 단백질인 DtxR에 의해 발현이 조절 되는데, DtxR은 Fe2 + 농도에 따라 영향을 받으면서 tox 유전자 발현을 억제하는 단백질(repressor)로 알려져있다. 따라서 궁극적으로는 Fe2 +의 농도가 CRM197의 발현양에 영향을 미치게 되며 Fe2 +의 농도가 0.3㎍/㎖ 이상일 경우 CRM197의 발현이 억제가 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 구현예들에 따른 코리네박테리움 균주는 화학적 돌연변이를 유발시켜 Fe2 +의 농도에 관계없이 고농도의 CRM197을 발현할 수 있다. 이로써, 단일 라이소젠 균주보다 증가된 CRM197 생산성을 가질 수 있으며, 구체적으로, 본 발명에 따른 코리네박테리움 균주는 단일 라이소젠 균주에 비해 CRM197을 1.5배 내지 3배 이상 높게 발현하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)를 코리네박테리오파지로 감염시켜 이중 라이소젠 균주를 제작하는 단계; 상기 이중 라이소젠 균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)을 처리하여 돌연변이 균주를 제작하는 단계; 및 상기 돌연변이 균주를 배지에서 배양하여 CRM197을 발현하는 돌연변이 균주를 선별하는 단계;를 포함하는, CRM197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 코리네박테리움 균주는 KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 배지는 Fe2 +가 0.3μg/mL 이상의 고농도로 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 (KCTC13549BP)를 이용한 CRM197의 생산방법을 제공한다.
이하, 하기의 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기의 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1. 신규 라이소젠 균주 라이브러리 확보
CRM197 발현이 증가된 다중 라이소젠 균주를 확보하기 위하여 코리네박테리움 디프테리아(이하, C. diphtheriae) 내에 파지가 추가 도입된 신규 라이소젠 균주 라이브러리를 제작하였다.
1-1. tox 유전자를 포함하는 파지의 분리
단일 라이소젠 균주에 용원성(Lysogen)으로 존재하는 파지를 용균(lysis) 회로로 유도하기 위해 지수성장기에 있는 단일 라이소젠의 C. diphtheriae 배양액에 UV를 약 30분~2시간 동안 조사하였다. UV 조사를 마친 배양액은 35℃, 200rpm에서 2시간 이상 배양 후 0.45㎛ 필터를 이용하여 박테리아는 제거하고 파지만 존재하는 배양액을 획득하였다. 한편, 상기 파지는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 CRM197을 코딩하는 tox 유전자를 포함한다.
1-2. 신규 라이소젠 라이브러리 제작
파지 배양액을 적절한 비율로 희석하고 상기 배양액 100㎕를 파지에 감염되지 않은 C. diphtheriae 배양액 100㎕에 섞은 뒤 한천이 약 0.3% 농도로 첨가된 TYE 배지에 첨가하였다. 배지가 굳기 전에 TYE 고체 배지에 붓고 35℃에서 2~3일간 배양하였다. 상기 TYE 배지의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.
TYE 배지 조성
조성물 양
Tryptose 10g
Yeast extract 5g
KH2PO4 5g
50% CaCl2 2mL
pH 7.4
그 결과, 시간이 지나면서 파지가 C. diphtheriae를 감염시킨 후 용균시키면서 투명한 용균반이 형성되며, 용균반 중앙에서 라이소젠 형태의 균이 자라 혼탁 용균반이 형성됨을 확인하였다. 혼탁 용균반이 형성된 다수의 플레이트를 제작하여 신규 라이소젠 균주 라이브러리를 확보하였다. 이를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 다중 라이소젠 후보 균주 선별
상기 실시예 1에서 제작한 신규 라이소젠 균주 라이브러리로부터 2개 이상의 파지가 도입된 다중 라이소젠 균주를 선별하였다. 먼저, 혼탁 용균반으로부터 균을 분리해내어 CRM197 항 혈청이 포함된 고체 배지에서 35℃에서 2~3일간 배양하였다. 상기 균은 성장하면서 콜로니를 형성하며, 그 주위로 CRM197을 분비하고, 이는 배지 내에 존재하는 CRM197 항 혈청과 반응하여 콜로니 주위에 고리(Halo)를 형성하였다. 이를 도 3에 나타내었다.
균의 CRM197 발현양이 높을수록 고리의 크기가 커지는바, 그 크기를 상대적으로 비교하여 큰 고리를 형성하는 다중 라이소젠 후보 균주를 다수 선별하였다.
실시예 3. 다중 라이소젠 균주의 확인
C. diphtheriae는 CRM197을 코딩하는 tox 유전자를 지니고 있는 코리네박테리오파지에 의해 감염될 수 있으며, 파지에 감염된 C. diphtheriae는 유전체 내에 프로파지(prophage)를 갖게 되고 CRM197을 발현하게 된다. 한편, C. diphtheriae는 유전체 내에 코리네박테리오파지가 도입될 수 있는 서열이 두 곳 존재하며, 이를 각각 attB1, attB2라 한다. 파지가 삽입되면 attB1은 attL1과 attR1으로, attB2는 attL2와 attR2로 나누어지는바, 나뉘어지는 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 각 서열의 증폭 여부를 통해 파지 삽입위치를 파악할 수 있다. C. diphtheriae의 유전체 및 파지가 삽입되는 위치에 따른 단일 라이소젠, 이중 라이소젠 형성 모식도를 도 4에 나타내었다.
구체적으로, 실시예 2에서 선별한 균주들의 단일 라이소젠 또는 이중 라이소젠 여부를 확인하기 위해 2개의 도입서열 각각에 대해 파지의 삽입여부를 확인할 수 있는 프라이머를 제작하여 PCR을 실시하였다. 사용한 모든 프라이머의 서열 및 상기 프라이머 사용에 따른 PCR 산물 예상 크기를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다. 또한, PCR 실시 결과를 도 5에 나타내었다.
PCR primer 서열
Sequence (5' → 3')
attB1 Forward GGC TCA ACC TGA TCG GCG TGG TGC T
Reverse GAG TAG GCA CAC AGC AAG AAA AA
attB2 Forward CGT ACG TCG GGA TCT GGG AAA GGT GGT CT
Reverse CGA AGA CTC ATG TGT AAT CGG TGT A
att P Forward CTA AGC TAT CGC TAT TTT TTG AAA
Reverse GTC AGC TGT GTC GAG TTC
Primer 사용에 따른 PCR product 예상 크기
Pair size(bp)
attB1 Forward attB1 736
Reverse attB1
attB2 Forward attB2 831
Reverse attB2
attL1 Forward attB1 475
Reverse attP
attR1 Forward attP 670
Reverse attB1
attL2 Forward attB2 599
Reverse attP
attR2 Forward attP 641
Reverse attB2
도 5에 나타낸 바와 같이, 항 혈청과 반응하여 고리를 형성한 콜로니 중 13번째 콜로니(Halo colony No.13)만 attB1과 attB2가 증폭되지 않으면서, attL1, attR1, attL2, attR2가 증폭됨을 확인하였다. 상기 attL1, attR1, attL2, attR2는 파지가 삽입된 경우 확인할 수 있는 서열이므로, 이를 통해 상기 13번째 콜로니는 두 곳의 삽입위치에 파지가 각각 하나씩 삽입된 이중 라이소젠 균주임을 확인하였다.
실시예 4. 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현 및 구조적 동일성 확인
상기 실시예 3에서 선별한 이중 라이소젠 균주가 CRM197을 정상적으로 발현하며 기존의 CRM197과 구조적으로 동일한지 여부를 확인하기 위해 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏, N-말단 및 C-말단 시퀀싱, 펩타이드 맵핑, 이황화 결합 위치, 분자량, pI 및 고차구조분석 등의 특성 분석을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
이중 라이소젠 균주 생산 CRM197의 구조 및 특성 확인
항목 기준 결과
SDS-PAGE 58kD 부근의 band 58kD 부근 band 확인
Western blot 58kD 부근의 band 58kD 부근 band 확인
N-terminal sequencing GADDVVDSSK GADDVVDSSK
C-terminal sequencing LSLFFEIKS LSLFFEIKS
Peptide mapping 이론치 이론치와 100% 일치
Disulfide bond C186=C201, C461=C471 C186=C201,C461=C471
Molecular weight (Intact Mass) 58,408 Da 58,408 Da
pI (Isoelectric focusing) 5.39 부근 (단일 라이소젠) 5.4
고차구조분석 (CD-spectroscopy) 단일 라이소젠과 비교 일치
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 이중 라이소젠 균주가 발현하는 CRM197은 기존의 단일 라이소젠 균주가 생산하는 CRM197과 구조 및 특성이 동일함을 확인하였다.
실시예 5. 이중 라이소젠 균주의 플라스크 배양양상 및 생산성 확인
파지의 추가 도입을 통해 획득한 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현양이 기존의 단일 라이소젠에 비해 높아졌는지 여부를 확인하기 위하여, 단일 라이소젠 균주와 이중 라이소젠 균주를 철을 제거한 YC 배지에서 하기 표 6의 배양 조건으로 배양하였다. YC 배지의 구체적인 조성은 하기 표 5에 나타내었다.
YC 배지(1L)의 조성
조성물 양 부피
Solution1 Yeast extract 20g 970mL
Casamino acid 10g
Tryptophan 50mg
KH2PO4 5g
CaCl2 1g
Solution 2 Distilled water to 970ml 2.0ml, 0.2 μm filter
MgSO4 22.5g
beta Alanine 115mg
Nicotinic acid 115mg
Pimelic acid 7.5mg
CuSO4 5H2O 0.5g
ZnSO4 5H2O 0.2g
MnCl2 4H2O 75mg
HCl (concentrated) 3.0ml
Solution 3 Distilled water to 100ml 1.0ml
L-cystine HCl 20g
HCl (concentrated) 20ml
Solution 4 Distilled water to 100ml 30.0ml
Maltose 50g
CaCl2 0.5g
Distilled water to 100ml
배양 조건
온도 35℃
배지 및 부피 YC 배지 100mL
통기 조건 호기성
교반속도 200rpm
각 시간 별로 샘플링한 배양액을 20ul씩 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하고, 나타난 CRM197의 밴드(58kD) 두께를 Densitometer로 측정하여 정량 비교하였다. 그 결과를 표 7, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
단일 라이소젠과 이중 라이소젠의 플라스크 CRM197 발현 비교
단일 라이소젠 (#1) 단일 라이소젠 (#2) 이중 라이소젠
표준품 대비 배양액의 CRM197 상대농도( % ) 53.3 53.5 55.5
배양액 최종 OD 14.4 14 8.0
단위 OD당 배양액의 CRM197 상대농도(%) 3.7 3.8 6.9
상기 표 7, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 같은 조건에서 동시간 동안 배양한 이중 라이소젠 균주가 단일 라이소젠 균주에 비해 균의 성장성은 다소 낮으나 균 성장 대비 CRM197 발현양은 약 1.8배 증가함을 확인하였다.
실시예 6. 이중 라이소젠 균주의 5L 배양기를 통한 배양양상 및 생산성 확인
배양기는 온도, 통기, pH 등이 조절되는바 배양 조건이 우수하여 플라스크에 비해 CRM197 발현이 우수한 장점이 있다. 단일 라이소젠 균주와 이중 라이소젠 균주를 배양기에서 배양하여 이중 라이소젠 균주의 CRM197 발현양이 기존의 단일 라이소젠에 비해 높아졌는지 여부를 확인하였다. 배지는 상기 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 YC 배지를 사용하였으며, 하기 표 8의 배양 조건으로 배양하였다.
5L 배양기 배양 조건
온도 35℃
배지 및 부피 YC 배지 2L
pH 7.6
통기 조건 DO 10%
교반속도 200rpm
각 시간 별로 샘플링한 배양액을 20ul씩 SDS-PAGE 겔에 로딩하고 전기영동을 실시하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하고, 나타난 CRM197의 밴드(58kD) 두께를 Densitometer로 측정하여 정량 비교하였다. 그 결과를 표 9, 도 8 및 도 9에 나타내었다.
단일 라이소젠과 이중 라이소젠의 5L 배양기 CRM197 발현 비교
단일 라이소젠 이중 라이소젠
표준품 대비 배양액의 CRM197 상대농도( % ) 63 70
배양액 최종 OD 17.0 10.5
단위 OD당 배양액의 CRM197상대농도 ( % ) 3.7 6.7
상기 표 9, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 같은 조건에서 동시간 동안 배양한 이중 라이소젠 균주가 단일 라이소젠 균주에 비해 단위 OD 당 CRM197 생산성이 약 1.8배 증가하였으며 이는 플라스크의 결과와 유사함을 확인하였다.
실시예 7. 이중 라이소젠 균주의 안정성 확인
일반적으로 다중 라이소젠 상태의 프로파지는 단일 라이소젠 상태의 프로파지보다 안정성이 떨어져 쉽게 소실되는 경향이 있다. 이에, 이중 라이소젠 균주 내의 프로파지가 안정하게 유지되는지 확인하기 위하여, 이중 라이소젠 균주를 12시간마다 총 10회 반복 계대 배양하였다. 이 배양액을 이용해 실시예 3과 동일한 방법으로 PCR을 실시하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 파지가 삽입된 경우 확인할 수 있는 attL1, attR1, attL2, attR2 서열이 증폭된 것을 확인하여, 이를 통해 이중 라이소젠 균주의 이중 라이소젠 상태가 안정적으로 유지됨을 확인하였다.
실시예 8. 철 이온에 의한 CRM197 발현 억제가 제거된 균주의 개발
C. diphtheriae에서 CRM197을 암호화 하는 tox 유전자는 배지 내에 Fe2 +가 0.3μg/mL 이상으로 존재할 경우, DtxR 단백질(Repressor)에 의해 발현이 억제되는 것으로 알려져 있기 때문에 CRM197의 생산을 위해서 배지 내의 Fe2 +를 제거하는 과정이 필요하다. 하지만 이러한 제거과정을 통해 배지 내의 Fe2 + 농도가 지나치게 낮아질 경우, 균이 정상적으로 성장하기 어렵기 때문에 균의 성장을 위해서는 tox 유전자의 발현을 극도로 제한하지 않는 정도의 Fe2 +을 공급해주어야 한다. 그러나, 균의 성장과 CRM197의 발현을 모두 높게 유지시키는 Fe2 +의 농도를 설정하기는 어려우며, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 단일 라이소젠 균주뿐만 아니라, 본 발명의 이중 라이소젠 균주 또한 높은 농도의 Fe2 +에 의해 CRM197의 발현이 억제되고, 반면 Fe2 +의 농도가 낮을 경우 균의 성장이 제한됨을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 Fe2 +에 의한 CRM197 발현 억제가 제거된 이중 라이소젠 균주를 제작하였다.
8-1. 이중 라이소젠 균주의 돌연변이 라이브러리 제작
철 함량이 높게 함유된 배지에서 CRM197이 다량 생산될 수 있는 균주를 선발하고자, 먼저 이중 라이소젠 균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)을 이용하여 무작위 돌연변이를 유발한 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 구체적으로, 지수 성장기에 있는 이중 라이소젠 균의 배양액을 원심분리한 후, 침전물을 PBS로 씻어주었다. 그 후 침전물을 NTG가 10~30ug/mL (사멸율 약 90% 유발)로 녹아 있는 0.05M tris aminomethane-malate buffer (pH6.0)에 OD가 약 0.8이 되도록 현탁하여 37℃에서 15분간 배양하였다. 그 후 다시 원심분리하고 침전물을 새로운 배지에 현탁하여 35℃에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간의 배양이 끝난 후, 배양물을 적당한 농도로 희석하여 고체배지에 도말하고 35℃에서 1~2일 동안 배양하여 콜로니들이 나타났을 때 이들을 냉장 보관하였다. 이 과정을 수 회 반복하여 돌연변이 라이브러리를 제작하였다.
8-2. 돌연변이 라이브러리로부터 철 이온 억제 제거 균주의 선별
상기 돌연변이 라이브러리의 콜로니를 루프를 이용하여 새로운 고체배지에 피킹한 후 번호를 매겨 35℃에서 1~2일간 배양하였다. 콜로니가 나타나면 루프 또는 이쑤시개를 이용하여 한 그룹당 30~50개의 콜로니를 Fe2 +를 1μg/mL가 되도록 첨가된 Low iron YC 배지에 현탁 후, 35℃에서 150rpm으로 24시간 배양하였다. 이후, 돌연변이 균주를 1차적으로 선별하기 위해 항 CRM197 혈청을 이용하여 배양액의 웨스턴 블랏을 수행하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 한 그룹의 배양액에서 CRM197이 고농도로 발현됨을 확인하였다. 정상적인 이중 라이소젠 균주의 경우, 1μg/mL의 Fe2 +를 첨가하면 DtxR에 의해 tox 유전자의 발현이 억제되어 CRM197이 발현되지 않는바, 상기 배양액에는 Fe2 + 농도와 상관없이 CRM197을 발현할 수 있는 균주가 포함되어 있음을 알 수 있었다. 상기 그룹에 포함된 콜로니를 Fe2 +를 1μg/mL 가 되도록 첨가된 Low iron YC 배지를 이용하여 각각 배양 후, CRM197의 발현을 SDS-PAGE로 확인하여 고농도의 Fe2 +에도 CRM197을 발현하는 균주를 2차적으로 선별하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
8-3. 철 이온 억제 제거 균주의 플라스크 배양을 통한 성장 및 생산성 확인
Fe2 + 농도가 높은 조건에서도 CRM197 발현이 이루어지는지 확인하기 위하여 Fe2+ 제거 과정을 거친 Low Iron YC 배지에 Fe2 + 를 1ug/mL가 되도록 첨가하여 Fe2 + 농도가 높은 배지를 제조하였다. 제조한 배지에서 돌연변이 전 이중 라이소젠 균주와 돌연변이를 통해 확보한 균주(#169)를 같은 조건하에서 배양 후, 배양액의 SDS-PAGE를 통해 CRM197 발현양을 비교하였다. 그 결과를 도 15와 16에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 두 균주 모두 Fe2 +가 충분한 조건에서 잘 성장하였으나, 도 16에 나타낸 바와 같이 돌연변이 전 이중 라이소젠 균주는 CRM197이 발현되지 않는 반면 돌연변이 균주(이하, 철 이온 억제 제거 균주 또는 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주)는 Fe2 +에 영향을 받지 않고 CRM197이 정상 발현됨을 확인하였다.
8-4. 철 이온 억제 제거 균주의 CRM197 발현 유전자 안정성 확인
이중 라이소젠 균주를 이용하여 NTG 돌연변이를 유도하는 경우 그 과정에서 이중 라이소젠 상태가 해제되거나 CRM197을 코딩하는 tox 유전자에 돌연변이가 발생할 수 있다. 이에, 이중 라이소젠의 유지 여부를 확인하기 위해 상기 실시예 8-2에서 선별한 철 이온 억제 제거 균주를 이용하여 실시예 3과 동일한 방법으로 PCR을 실시하고 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 파지가 삽입된 경우 확인할 수 있는 attL1, attR1, attL2, attR2 서열이 증폭된 것을 확인하여, 이를 통해 철 이온 억제 제거 균주의 이중 라이소젠 상태가 안정적으로 유지됨을 확인하였다.
또한, tox 유전자의 돌연변이 가능성을 확인하기 위해 철 이온 억제 제거 균주로부터 tox 유전자를 분리하여 염기서열을 확인하고, 억제 제거 균주가 생산한 CRM197의 전체 아미노산 서열을 확인하였다. 그 결과 철 이온 억제 제거 균주의 tox 유전자 서열과 CRM197 아미노산 서열에는 아무 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 9. 철 이온 비제거 배지에서의 배양, 발현 비교
본 발명의 이중 라이소젠 균주와 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주의 배양 및 CRM197 발현 양상을 Fe2 +를 인위적으로 제거하지 않은 YC 배지를 사용하여 5L 배양기에서 비교하였다. Fe2 +를 제거하지 않을 경우 YC 배지의 Fe2 + 농도는 약 0.7 μg/mL로 측정되었다. 그 결과를 표 10 및 도 18에 나타내었다.
Fe2 +를 제거하지 않은 배지에서의 5L 배양기 CRM197 발현 비교
단일 라이소젠 이중 라이소젠 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠
표준품 대비 배양액의 CRM197 상대농도( % ) 5 8 142
배양액 최종 OD 21.5 19.5 20.0
단위 OD당 배양액의 CRM197 상대농도(%) 0.2 0.4 7.1
표 10 및 도 18에 나타낸 바와 같이, Fe2 +를 제거하지 않은 배지에서 세 균주의 성장은 유사하나 단일 및 이중 라이소젠 균주는 Fe2 +의 억제효과로 인해 CRM197 발현이 매우 낮은데 비해 철 이온 억제가 제거된 이중 라이소젠 균주는 Fe2 + 존재하에서도 높은 발현양을 유지함을 확인하였다.
최종적으로, 표 9와 표 10의 결과를 참고하여 각 균주별 최대 생산성을 보이는 배양조건에서의 CRM197 표준품 대비 상대농도를 통해 세 균주의 최대 배양 생산성을 비교해 보면, 단일 라이소젠 균주는 63%, 이중 라이소젠 균주는 70% 인 반면 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주는 142%로서 단일 라이소젠 대비 약 2.3배, 이중 라이소젠 대비 약 2배 생산성이 향상됨을 확인하였다.
이상의 실험을 통해 고농도의 Fe2 + 존재 하에서도 CRM197을 고농도로 발현하는 효과를 확인한 코리네박테리움 균주(실시예 8-3의 균주 #169)는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01로 명명되었으며, 2018년 06월 15일자로 한국생명공학연구원(KCTC13549BP)에 기탁되었다.
상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 라이소젠 균주는 단일 라이소젠 균주에 비해 CRM197의 발현양이 현저히 증대되고, 철 이온 억제 제거 균주는 고농도의 Fe2 + 존재 하에서도 CRM197이 정상적으로 발현됨을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 철 이온 억제 제거 이중 라이소젠 균주는 Fe2 + 제거 공정이 불필요하여 공정의 단순화가 가능하며, Fe2 + 존재 하에서도 CRM197이 정상적으로 발현되어 경제적으로 CRM197의 생산성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13549BP 20180615
<110> Eubiologics.Co.,LTD <120> CORYNEBACTERIUM EXPRESSING HIGH LEVEL OF CRM197 <130> EUBIO1-4P <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Corynebacteriophage tox gene <400> 1 gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60 ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120 aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180 caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaaga gttttatagt 240 accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300 aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360 gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420 gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480 ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540 gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600 gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660 ggtagctcat tgtcatgcat aaatcttgat tgggatgtca taagggataa aactaagaca 720 aagatagagt ctttgaaaga gcatggccct atcaaaaata aaatgagcga aagtcccaat 780 aaaacagtat ctgaggaaaa agctaaacaa tacctagaag aatttcatca aacggcatta 840 gagcatcctg aattgtcaga acttaaaacc gttactggga ccaatcctgt attcgctggg 900 gctaactatg cggcgtgggc agtaaacgtt gcgcaagtta tcgatagcga aacagctgat 960 aatttggaaa agacaactgc tgctctttcg atacttcctg gtatcggtag cgtaatgggc 1020 attgcagacg gtgccgttca ccacaataca gaagagatag tggcacaatc aatagcttta 1080 tcgtctttaa tggttgctca agctattcca ttggtaggag agctagttga tattggtttc 1140 gctgcatata attttgtaga gagtattatc aatttatttc aagtagttca taattcgtat 1200 aatcgtcccg cgtattctcc ggggcataaa acacaaccat ttcttcatga cgggtatgct 1260 gtcagttgga acactgttga agattcgata atccgaactg gttttcaagg ggagagtggg 1320 cacgacataa aaattactgc tgaaaatacc ccgcttccaa tcgcgggtgt cctactaccg 1380 actattcctg gaaagctgga cgttaataag tccaagactc atatttccgt aaatggtcgg 1440 aaaataagga tgcgttgcag agctatagac ggtgatgtaa ctttttgtcg ccctaaatct 1500 cctgtttatg ttggtaatgg tgtgcatgcg aatcttcacg tggcatttca cagaagcagc 1560 tcggagaaaa ttcattctaa tgaaatttcg tcggattcca taggcgttct tgggtaccag 1620 aaaacagtag atcacaccaa ggttaattct aagctatcgc tattttttga aatcaaaagc 1680 tga 1683

Claims (9)

  1. 유전체 내에 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 CRM197을 코딩하는 tox 유전자를 2개 포함하고, N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG) 처리에 의해 돌연변이가 유도된 KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 유전체 내에 코리네박테리오파지의 유전체가 이중으로 도입된 이중 라이소젠(lysogen) 균주인 것을 특징으로 하는, KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 Fe2+가 0.3μg/mL 이상의 고농도로 포함된 배지에서 생장할 수 있는 것을 특징으로 하는, KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 단일 라이소젠 균주에 비해 CRM197을 1.5배 내지 3배 발현하는 것을 특징으로 하는, KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주.
  6. 코리네박테리움 균주(Corynebacterium diphtheriae)를 코리네박테리오파지로 감염시켜 이중 라이소젠 균주를 제작하는 단계;
    상기 이중 라이소젠 균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)을 처리하여 돌연변이 균주를 제작하는 단계; 및
    상기 돌연변이 균주를 배지에서 배양하여 CRM197을 발현하는 돌연변이 균주를 선별하는 단계;를 포함하는,
    CRM197을 고농도로 발현하는, KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배지는 Fe2+가 0.3μg/mL 이상의 고농도로 포함된 것을 특징으로 하는, CRM197을 고농도로 발현하는 KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주의 제조방법.
  8. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) EB01 균주를 이용한 CRM197의 생산방법.
  9. 유전체 내에 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 CRM197을 코딩하는 tox 유전자를 2개 포함하고 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG) 처리에 의해 돌연변이가 유도된, KCTC13549BP의 기탁번호를 가지는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 균주; 및
    Fe2+ 을 포함하는 배지; 를 포함하는 CRM197 생산용 조성물.
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