NL8400365A

NL8400365A - Werkwijze voor het bereiden van met difterietoxine verwante eiwitten.

Info

Publication number: NL8400365A
Application number: NL8400365A
Authority: NL
Original assignee: Sclavo Spa
Priority date: 1983-02-08
Filing date: 1984-02-06
Publication date: 1984-09-03
Also published as: DE3404434C2; CA1212642A; FR2540516B1; NL192208C; JPH0789950B2; ES8505408A1; DE3404434A1; LU85197A1; US4925792A; ES529698A0; CH660375A5; NL192208B; FR2540516A1; JPS6034918A

Description

^ ·; 843013/vdV/sn

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bereiden van met difterie- toxine verwante eiwitten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een met difterie-*toxine verwant eiwit, door inWe^rfbloeibaar voedingsmedium met een concentratie aan ijzerionen van 0,05 yjg/ml tot 0,5^g/ml^bij een temperatuur van 30°C tot 40°C, in 5 een neutrale kweekomgeving en onder aerobe omstandigheden, van een micro-organisme behorende tot het geslacht Corynebacterium diphtheriae met twee mutant^fagen die het met het difterie toxine verwante eiwit coderen op een niet-tandem wijze in hun chromosomen.

Difterie^toxine is een eiwit dat bijzonder giftig is ten 10 opzichte van eukaryotische cellen.

Een dergelijk toxine bestaat uit twee sub-eenheden, nl.: het B-fragment dat gebonden kan worden aan receptoren welke aanwezig zijn op het membraan van de eukaryotische cel en het A-fragment dat giftig is en na binnendringen in de cellen de eiwitsynthese daarvan 15 blokkeert.

Het difterie^-toxine wordt gecodeerd door een gen, waarvan de primaire structuur recentelijk bepaald is (C. Ratti, R. Rappuoli, E.G. Giannini, Nucleic Acid Research, 11, 6589, 6595, (1983), en dat aanwezig is in het DNA van enkele verwante bacteriofagen (|3,^ CJ ) 20 die Corynebacterium diphtheriae kunnen infecteren (J.J, Costa et al., J. Bacteriol., 148, 124-130 (1981); V, Freeman, J.Bacteriol. 61, 675-688 (1951)).

Deze fagen kunnen na infecteren van de bacterie deze oplossen en hierdoor doden waardoor zij opgenomen worden in de bacteriële 25 chromosomen, waar zij slapende blijven en gerepliceerd worden als de bacterie gerepliceerd wordt.

De DNA van de geïntegreerde faag zal tezamen met het bacteriële chromosoom overgedragen worden aan dochtercellen die derhalve 8400365 r ' Ik -2- het eiwit^oderende gen bevatten.

Op het ogenblik wordt difterie^-toxine bereid door kweken van de PWg stam en, na verwijdering van de giftwerking met formol, gebruikt voor de bereiding van antidifterie/vaccin.

5 Recentelijk zijn mutanten van de jSfaag verkregen door be handeling met nitrosoguanidine door Uchida et al. (Nature New Biol., 233^8-11, (1973)).

Deze mutantfagen die geïntegreerd worden in het bacteriele chromosoom van het Corynebacterium diphtheriae micro-organisme, 10 coderen de synthese van met difterie-droxine verwante eiwitten, waarvan zij verschillen in structuur en/of funktie vanwege de aanwezigheid van één of meer in het structurele gen van het toxine opgenomen mutaties.

Eiwitten van het bovengenoemde type zijn aangeduid als kruis-15 reagerende materialen (CRM) daar zij een immunologische reactie geven met het difterie^toxine.

Van de verschillende geïsoleerde mutantfagen, zijn in het bijzonder de fagen onderzocht die de eiwitten CRM 176, CRM 197, CRM 228 en CRM 45 coderen (Uchida et al., J. Biol. Chem., 218, 20 3838-3844 (1973)).

Meer in het bijzonder is het CRM 45 een eiwit bestaande uit een fragment A verwant met de structuur en funktie van die van het difterie toxine en een fragment B waarin geen segment voorkomt dat in staat is om het eiwit te binden aan> de op het oppervlak van eu-25 karyotische cellen aanwezige receptoren.

Het gevolg is dat CRM 45, niettegenstaande het een fragment A bezit dat volledig werkzaam is in vitro, geen in vivo werkzaamheid vertoont, daar het niet in staat is om in de cellen binnen te dringen.

Het fragment B bezit daarentegen, in ongewijzigde toestand, 30 de hydrofobe structuur die noodzakelijk is om het fragment A naar het inwendige van de cel te brengen. Vanwege deze eigenschappen, dat wil zeggen aanwezigheid van het werkzame fragment A, en de aanwezigheid in het fragment B van een structuur die nodig is om het 8400365 t » -3- fragment A in het inwendige van de cel te kunnen brengen, alsmede afwezigheid van het gedeelte voor het herkennen van de receptoren van de celmembranen, is overwogen om het CRM 45 te gebruiken voor het bereiden van hybride«^toxinen. Door vervangen van het ontbrekende 5 segment door een stof zoals een antilichaam, monoclonaal antilichaam, hormoon of andere stof van bx2.ogis.ch belang, die wel specifieke moleculen op het oppervlak van enkele cellen kan herkennen, zoals doelcellen, werd een hybride toxine verkregen dat in staat is om slechts enkele soorten van cellen te doden. Een dergelijk hybride 10 toxine kan een selectieve toepassing vinden in de farmacologie en vooral bij de behandeling van enkele typen tumoren (F. Bacha et al., J. Biol. Chem., 258, 1565-1570, (1983)).

Het CRM 197 eiwit bezit hetzelfde molecuulgewicht als het difterie toxine en bestaat uit fragmenten B die identiek zijn wat 15 hun funktie en structuur betreft aan die van het toxine en uit een fragment A dat niet giftig is en van het oorspronkelijke fragment verschilt door een aminozuur. Het CRM 197 dat atoxisch is, is immunologisch niet verschillend van het difterie toxine en kan derhalve een vervangingsmiddel zijn voor het difterie^toxoxde zoals op 20 het ogenblik gebruikt voor de bereiding van het vaccin. Een behandeling van CRM 197 met formol is voldoende voor het verkrijgen van een bevredigend beschermingsniveau van difterie-'antilichamen in Guinese biggetjes (M. Porro et al., J. Infect Dis., 142, 5 (1980)).

Tot nu toe zijn echter verdere ontwikkelingen van produkten 25 afgeleid van met het difterie^toxine verwante eiwitten en verkregen volgens de werkwijze als beschreven door Uchida, afgeremd door de lage opbrengsten bij het kweken van dergelijke eiwitten.

De onderhavige uitvinding beoogt nu een werkwijze te verschaffen voor de bereiding van met difterie^toxine verwante eiwitten, 30 welke gekenmerkt is door het kweken in een vloeibaar voedingsmedium met een concentratie aan ijzerionen var. 0,05^fg/ml tot 0,5pg/ml, bij een temperatuur van 30°C tot 40 C, in een neutrale kweekomgeving en onder aerobe omstandigheden, van een micro-organisme behorende tot 8400365

' r * W

-4- het geslacht Corynebacterium diphtheriae met twee mutantfagen die coderen voor het met het difterie toxine verwante eiwit en geïntegreerd zijn op een niet-tandem wijze in hun chromosomen.

Meer in het bijzonder beoogt de uitvinding een werkwijze te 5 verschaffen voor het bereiden van CRM 45 met opbrengsten van 50 Lf/ml tot 200 Lf/ml en CRM 197 met opbrengsten van 30 Lf/ml tot 60 Lf/ml door kweken van de C7 (β45) Mg stam met twee fi45 mutantfagen die op een niet-tandem wijze in hun chromosomen geïntegreerd zijn en door kweken van de C7 (β 197) M^ stam met βΐ97 fagen die geïnte-10 greerd zijn op een niet-tandem wijze in hun chromosomen.

De onderhavige uitvinding berust in wezen op de tamelijk verrassende vondst dat de Corynebacterium diphtheriae Cy (ATCC 27010) stam in zijn eigen chromosoom twee hechtingsplaatsen attB bezit waar het DNA van de faag opgenomen kan worden. De lyses van een faag 15 volgens de Campbell methode (Epitomes Adv. Genetics, 11, 101-145, (1982)) zoals weergegeven in fig. 1A, veronderstelt het splijten van het circulaire DNA van de faag op een specifiek punt attP, en de integratie op een eveneens specifiek punt van de· bacteriele chromosoom, attB, welke de bevestigingsplaats genoemd wordt. Tot nu toe * / r / 20 zijn in alle bekende configuraties een enkele attP plaats en een enkele attB plaats geïdentificeerd.

Vastgesteld is nu dat de Corynebacterium diphtheriae Cy (ATCC 27010) stam in zijn chromosoom twee bevestigingsplaatsen bezit, attB^ en attB2, waar het DNA van de faag geïntegreerd kan 25 worden. Door gebruik te maken van het TYE kweekmedium, zoals gemodificeerd door aanvraagster, zijn volgens de lysigeniseringswerkwijze van die bacterie, de volgende lysigene stammen verkregen: monolysigenen, als de faag slechts eenmaal aanwezig is op de plaats attB^ of attB2, twinlysigenen (tandem) als twee fagen gelijktijdig 30 aanwezig zijn op een enkele attB plaats en niet-tandem twinlysigenen als twee fagen gelijktijdig aanwezig zijn, de ene op de plaats attB^ en de andere op de plaats attB2 (fig. 1B).

Volgens de onderhavige uitvinding is de Corynebacterium 8400365 -5- diphtheriae Cj (ATCC 27010) geïnfecteerd met een mutantfaag die codeert voor het met het difterie^toxine verwante eiwit door uitzaaien op een CY kweekmedium.

Na 48 uur kweken bij 35°C wordt lyses van de faagplaten waar-5 genomen, die in hun inwendige een niet doorzichtige zone bevatten tengevolge van de groei van deze bacteriën, waarbij de faag geïntegreerd is in het bacteriele chromosoom.

De stammen zijn steriel gekweekt en uitgezaaid op een CY medium om afzonderlijke kolonies te isoleren, die vervolgens geana-10 lyseerd kunnen worden om de aanwezigheid van lysigene fagen aan te tonen volgens de "faag vrijmakingsproef" (Miller et al., Virology, 29, 410-425, (1966)).

Een twinlysigeen onderzoek is uitgevoerd op basis van het feit dat de lysigenen welke twee paren van de geïntegreerde faag 15 bevatten, twee coderende genen bevatten voor het met difterie toxine verwante eiwit zodat zij een dubbele hoeveelheid van dit eiwit kunnen vormen.

Platen zijn bereid uit het TYE kweekmedium die elk 3,4,6,8, 12 U/ml difterie antitoxine serum bevatten en elk lysigeen is ver-20 volgens onderzocht voor elke afzonderlijke serumconcentratie door plaatoverdracht. Het door de verschillende lysigenen door diffusie op de agar-agar gevormde eiwit werd neergeslagen uit het in het medium aanwezige antilichaam, waardoor een halo ontstaat waarvan de grootte direct evenredig was met de hoeveelheid door de afzonderlijke 25 kolonies gevormd CRM.

In de platen die een antilichaam concentratie bevatten van 3 U/ml vormden alle lysigenen een identieke halo . In de platen met een tussenliggende concentratie, 4-6 U/ml antilichaam werden halos van verschillende afmetingen waargenomen, zeer kleine voor de mono-30 lysigenen en grotere voor de twinlysigenen*

In de platen die een antilichaam concentratie bevatten van 8 tot 12 U/ml vertoonden alleen de twinlysigenen een neerslaghalo.

Fig. 2 toont een foto van een TYE plaat die 6 U/ml anti- 84 0 0 o o 5 r , + -6- lichaam bevat, waardoor het mogelijk is om drie halo’s van verschillende grootte te onderscheiden, overeenkomende met verschillende , lysigenen: monolysigenen (kleine halc'), tandem twinlysigenen (haloo A) en niet-tandem twinlysigenen (halo ' B).

5 Het aantonen dat de lysigenen met de grotere halo twee in hun respectievelijke chromosomen geïntegreerde fagen bevatten is uitgevoerd door de moleculaire opbouw van de fagen vast te stellen door zuivering van het chromosomaal DNA volgens de bekende werkwijzen. Uit fig. 1B blijkt dat splijting van het faag DNA op de 10 punten A en B met een beperkend enzym, leidt tot de vorming van een AB fragment, terwijl bij gebruik van hetzelfde enzym voor het mono-lysigeen, twee fragmenten A en B verkregen worden, die beide een deel van het bacteriële chromosoom bevatten, vier fragmenten voor het niet-tandem twinlysigeen en drie voor het tandem twinlysigeen.

15 De analyses uitgevoerd volgens de Southern vlek methode (J.Mol.Biol., 98, 503-517, (1975) onder toepassing van het β Bam 32 4 fragment met een met P gelabelde attP plaats weergegeven in fig. 3, komen zowel wat aantal als plaatsen van de banden overeen met die welke voorspeld zijn op basis van de analyse van fig, 1B.

20 In fig. 3 geeft het DNA van de faag een enkele band (A), die van het monolysigeen twee banden (B), die van het niet-tandem twinlysigeen vier banden (C), terwijl het tandem twinlysigeen drie banden geeft, waarvan een tezamen met die van faag (D) beweegt.

De stabiliteit van de twinlysigenen is onderzocht door uit 25 oude kweken (5 dagen oud) afzonderlijke kolonies te nemen, deze te enten op een CY medium en met de halo methode de aanwezigheid van een of twee fagen aan te tonen. De analyse gaf de volgende resultaten: de tandem twinlysigenen waren buitengewoon instabiel tengevolge van het ontbreken van een faag en werden derhalve omgezet in monolysi-30 genen. Uit 250 onderzochte kolonies ontstonden ongeveer 180 monolysigenen, terwijl de twinlysigenen van het niet-tandem type buitengewoon stabiel waren: uit 450 onderzochte kolonies ontstond geen enkel monolysigeen.

8400365 -7- a

Volgens de onderhavige uitvinding is de Cy stam geïnfecteerd met de |345 mutant faag die codeert voor het CRM45 eiwit en de ^197 faag die codeert voor het CRM 197 waarbij de volgende lysigene stammen geïsoleerd zijn: Cy (j£45)Mg en Cy (|l197)Mg (monolysigenen), 5 Cy (^45)M|^ en Cy (|3T97)Mg (tandem twinlysigenen), en Cy (|345)Mg en Cy (|3l97)M.j(niet-tandem twinlysigenen). De stammen Cy (j345)Mg en Cy (|S197)M^ zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection Accession onder de aanduidingen ATCC-39526 en ATCC-39255,

De verschillende lysigene stammen zijn onderzocht op vorming 10 van CRM 45 en CRM 197 door kweken onder aerobe omstandigheden en in een vloeibaar voedingsmedium met een concentratie aan ijzerionen van 0,05^ig/ml tot Ö,5^g/ml, bij voorkeur 0,1 ^jg/ml, bij een temperatuur van 30°C tot 40°C, bij voorkeur van 35°C tot 37°C bij een pH van neutraal gedurende een periode die nodig was om een aanzien-15 lijke hoeveelheid eiwitten in het kweekmedium te vormen.

Het eiwit werd vervolgens geïsoleerd en gezuiverd volgens een van de aan de deskundige bekende werkwijzen.

De bij de werkwijze gebruikte kweekmedia waren de volgende: TYE medium voor het vormen van de precipitatie halo,.

20 Het volgende medium is gemodificeerd ten opzichte van het oorspronkelijke Pappenheimer medium (Inf.Imm., 18, 203-209 (1977)) en bezit de volgende samenstelling: tryptose: 10 g, gistextract: 5 g; NaCl: 5 g; K^PO^: 5 g; water: 1 liter.

De pH werd ingesteld op een waarde van 7,4 en 2 ml CaC^ 25 (50%) aan het medium toegevoegd voor behandeling in de autoclaaf.

Het neerslag laat men bezinken waarna men 2 ml/1 toevoegt van een oplossing II, 1 ml/1 van een oplossing III en 12 ml/1 van een zuivere agar-agar.

Tenslotte werd antidifterie paardenbloedserum toegevoegd 30 in concentraties van 4,6,8 of 12 U/ml in overeenstemming met de te verwachten halo.

CY medium voor de vorming van CRM eiwitten.

Gistextract: 20 g, caseïneaminozuren 10 g, 1/£-tryptofaan 8400365 3 ^ μ§μ 5 ml, Kh^PO^ 5 g, 1 liter water, worden bij een pH 7,4 aan de kook gebracht en worden nog steeds kokend op een Whatman filter gefiltreerd. Toegevoegd werden 2 ml van oplossing II, 1 ml van oplossing III en vervolgens werd het reactiemengsel in een autoclaaf geplaatst.

5 Voor het gebruik werd 3 ml van een oplossing van maltose en CaC^ per 100 ml medium toegevoegd.

Oplossing II

MgSO^.Th^O 22,5 g, alanine 115 mg, nicotinezuur 115 mg. Men voegt 1 ml water toe en geconcentreerd zoutzuur om de bestanddelen 10 op te lossen, daarna 7,5 mg pimelinezuur, 5 ml CuSO^.öh^O (1%), 4 ml van een l%-ZnS0^.5H^Ö, 1,5 ml l^-MnClg^gO en 3 ml geconcentreerd zoutzuur waarna aangevuld werd tot 100 ml.

Oplossing III

L-cystine 20 g; geconcentreerd zoutzuur 20 ml, water aanvullend 15 tot 100 ml, Maltose-Cad^ oplossing:

Maltose 50 g, 2 ml 50$ CaC^/ 1 9 HT^PO^ en aanvullen tot 100 ml met water. De pH wordt ingesteld op 7,4 en de oplossing gefiltreerd op Whatman 40 papier, waarna de oplossing in een autoclaaf geplaatst Wordt.

20 Beschrijving van de tekeningen:

Fig. IA: Lysigenisatie werkwijze volgens Campbell.

Het faag DNA wordt gebroken op een specifiek punt attP en geïntegreerd op een eveneens specifiek punt attB van het bacteriële chromosoom, 25 Fig. 1B: Lysigeniseringswerkwijze bij Corynebacterium diphtheriae

Cj (ATCC 27010). Het faag DNA wordt gebroken op het bevestigingspunt attP en kan geïntegreerd worden op de twee bevestigingsplaatsen attB^ en attB£ die aanwezig zijn in het bacteriële chromosoom om monolysigenen, tandem twin-30 lysigenen en niet-tandem twinlysigenen te geven.

Fig. 2 : Plaat met TYE medium dat 6 U/ml anti difterie serum bevat.

Er kunnen drie precipitatie halo’s onderscheiden worden, nl.: zeer kleine haloë (monolysigenen), intermediaire halo A

8400365 . ' * ? -9- (tandem twinlysigenen) en grote halo B (niet-tandem twinlysigenen).

Fig. 3 : Analyse van het DNA van de lysigenen volgens de Southern vlek methode. Het DNA is gesplitst met BamH.j en de fragmen- 5 ten zijn gescheiden op agarose gel (1,3$) en overgebracht op nitrocellulose, waarna zij gehybridiseerd zijn met het 32 ^Bam 4 fragment dat de met P gelabelde attP plaats bevatte. Het pBam 4 fragment komt overeen met het fragment AB van fig. 1B. Men ziet een enkel fragment AB in het faag 10 DNA (A), twee fragmenten AB in het monolysigeen (B), vier fragmenten in het niet tandem twinlysigeen (C) en drie fragmenten in het tandem twinlysigeen (D).

Fig. 4 ; Vorming van CRM 197 met de monolysigeen stam Cy ( £l97)Mgï symbool 0; 15 de tandem twinlysigeen stam Cj ( p!97)Mgi symbool V ; de niet tandem twinlysigeen stam Cy ( |3l97)M.j: symbool; Q. ,

De kleine zwarte rechthoeken geven de optische dichtheid van de kweekvloeistof aan.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe zonder haar 20 echter te beperken.

Voorbeeld 1

Men gebruikt 125 ml kolven die elk 10 ml van een CY medium bevatten, welke 15 minuten bij 120°C gesteriliseerd worden. De kolven worden geënt met een hoeveelheid overeenkomende met een platina 25 oog van de volgende lysigene stammen: C-, ( p!97)Mg, Cj ( (3197)Mg en Cj (β!97)Μ| die 24 uren bij 35°C op CY platen gekweekt zijn.

De aldus geënte kolven worden een nacht bij 35°C gekweekt.

0,1 ml van elke kweekvloeistof wordt geënt in een Erlen-meyer kolf met een inhoud van 125 ml>die elk 10 ml van een ijzervrij 30 CY medium bevatten aangevuld met 0,1 ^ig/ml Fe*"^ en vervolgens geplaatst op een roterende roerder die roert met een snelheid van 240 omwentelingen per minuut gedurende 45 uren bij een temperatuur van 35°C.

Elke twee uren worden monsters onttrokken, waarvan de optische 8400365

J <r Γ . C

-10- dichtheid en de in de bovenstaande vloeistof afgegeven hoeveelheden CRM 197 bepaald wérden* De optische dichtheid bedroeg 590 nm met een Perkin-Elmer Mod. 35 spectrofotometer (lichtbaan 1 cm) en CRM 197 wordt bepaald met de immunoelectroforetische methode van Murfy et al., 5 J. Clin. Microbiol., 7, 91-96 (1978)) en/of uitvlokking (G. Ramon, C.R. Soc.Biol., 86, 661-671, (1922)). Lf/ml geeft de eenheid van uitvlokking aan zoals beschreven door G. Ramon in C.R. Soc. Biol.

(Paris), 86, 661-671 (1922)).

De verkregen resultaten zijn vermeld in fig. 4. De produktie lövan CRM 197 begint niet alvorens de optische dichtheid van de kweek-vloeistof een waarde bezit van 4,5-5 optische dichtheden (O.D.) overeenkomende met het einde van de logarithmische fase.

Als het eindgedeelte van de laatstgenoemde fase begint, begint ook de massieve vorming van CRM 197 en gaat door tot het begin 15van de stationaire fase (ongeveer 20 uren), waarbij dan de maximale optische dichtheid en de maximale hoeveelheid CRM 197 waargenomen worden.

Na 24 uur kweken, neemt de CRM 197 vorming af met 25$ na 30 uren en na 45 uren bedraagt de afname zelfs 2075$. Het verloop van de vorming van CRM 197 is vrijwel dezelfde voor de verschillende lysigenen, terwijl de produktie: 20 Lf/ml voor de monolysigenen bedraagt, 30 Lf/ml voor de tandem twinlysigenen en 60

Voorbeeld II

Lf/ml voor de niet tandem twinlysigenen bedraagt/ Volgens dezelfde werkwijze als beschreven in voorbeeld 1 bereidt men entmedia van 25C7 (£45)M3, C7 (^45)Mn en C? (jU5)Mg.

0,1 ml van elke kweekvloeistof wordt geënt in 125 ml kolven die elk 10 ml van een ijzervrij CY medium bevatten aangevuld met 0,1 yjg/ml Fe++.

De kolven worden 36 uren geïncubeerd bij een temperatuur van 3035°C op een roterende roerder (240 omwentelingen per minuut).

Monsters onttrokken na 20 en 30 uren van het begin van de fermentatie worden geanalyseerd op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld 1 ter bepaling van de optische dichtheid en de vorming van 8400365 . « ° $ -11- in de bovenstaande vloeistof afgegeven CRM 45.

De verkregen resultaten zijn samengevat in de onderstaande, tabel: TABEL 1 5 Lysogene Optische Dichtheid CRM 45 ^jg/ml stammen 20 h 30 h 20 h 30 h .

C7 ((645)M3 4,5 9,7 16 31,5 C7(|345)M11 4,5 9,8 22 42 C7(£45)M8 4,7 10 40 70 10 De bovengenoemde resultaten geven aan dat de maximale vorming van CRM 45 bereikt wordt na 30 uren kweken en vrijwel dezelfde is voor de monolysigenen als voor de tandem twinlysigenen en bijna tweemaal zoveel als die voor de niet' tandem lysigenen.

Voorbeeld 3 15 Een voorkweekvloeistof van het lysigeen Cj (|S 45)Mg werd be reid als beschreven in voorbeeld 1 en 2 ml van deze voorkweekvloeistof werden overgebracht in twee 2.000 ml Erlenmeyer kolven die elk 500 ml niet ijzer bevattend CY medium bevatten,aangevuld met 0,1 ^jg/ml Fe^en gekweekt onder roeren (240 omwentelingen per minuut) bij een 20 temperatuur van 35°C gedurende 24 uren.

1.000 ml van de verkregen lysige kweekvloeistof werd ge-ent in 40 liter van een CY kweekmedium met een concentratie aan Fe ionen van 0,1 ^jg/ml, aanwezig in een fermentatievat met een volume van 50 liter en gekweekt bij een temperatuur van 37°C door beluchten 25 met een snelheid van 15 1/min vanaf de bodem naar de top, roeren met een snelheid van 600 omwentelingen per minuut en handhaven van de pH van het kweekmedium op 6,5 tot 7,5 met een 20^-glucose oplossing of met 4-Si NaOH gedurende 40 uren. De hoeveelheid CRM 45 bedroeg na 30 uren kweken 200 Lf/ml. De verkregen kweekvloeistof werd gecen- 8400335 r* ' K v -12- trifugeerd in een continu werkende centrifuge en het eiwit uit de bovenstaande vloeistof neergeslagen door ammoniumsulfaatoplossing met een verzadiging van 75$.

De verkregen suspensie werd gecentrifugeerd en het sediment 5 werd na wassen met een fosfaatbuffer van pH 7,5 gezuiverd door een kolom gevuld met een ionenuitwisselende hars (dimethylammoniumethyl-cellulose).

Het eiwit werd geïsoleerd door de kolom te elueren met een natriumchloridegradiënt waarbij de opbrengst 80$ bedroeg.

8400365

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van een met difterie-^toxine verwant eiwit omvattende het kweken in een vloeibaar voedingsmedium met een concentratie aan ijzerionen van 0,05 ^jg/ml tot 0,5 ^jg/ml^bij een temperatuur van 30°C tot 40°C bij. een neutrale pH en onder aerobe 5 omstandigheden, van een micro.-organisme behorende tot Corynebacterium diphtherlae met twee mutantfagen die coderen voor het met het difte-rie^toxine verwante eiwit en geïntegreerd op een niet tandem wijze op de twee bevestigingsplaatsen van het bacteriele chromosoom.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het 10 kenmerk, dat het met het difteri&^toxine verwante eiwit CRM 45 eiwit is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, m e t het kenmerk, dat het micro-organisme de Cy (^45)Mg ATCC-39526 stam is met twee op een niet tandem^wijze in hun chromosomen ge- 15 integreerde β45 fagen.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat het met het difterie^toxine verwante eiwit het CRM 197 eiwit is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het 20kenmerk, dat het micro-organisme de Cy ( p197) ATCC-39255 stam is met twee op een niet tandem wijze in hun chromosomen geïntegreerde β 197 mutant fagen.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, m et het kenmerk, dat een vast voedingsmedium met een concentratie 25 aan anti^difterie^serum van 4 tot 12 U/ml gebruikt wordt voor het isoleren van het micro-organisme.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat de concentratie aan ijzerionen in het vloeibare voedingsmedium 0,1 yjg/ml bedraagt. 8400365