FI119476B - Heterologisten proteiinien ilmentäminen heikennetyissä bakteereissa käyttämällä htrA-promoottoreita - Google Patents
Heterologisten proteiinien ilmentäminen heikennetyissä bakteereissa käyttämällä htrA-promoottoreita Download PDFInfo
- Publication number
- FI119476B FI119476B FI963016A FI963016A FI119476B FI 119476 B FI119476 B FI 119476B FI 963016 A FI963016 A FI 963016A FI 963016 A FI963016 A FI 963016A FI 119476 B FI119476 B FI 119476B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- vaccine composition
- htra
- promoter
- dna
- vaccine
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 21
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 10
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001167018 Aroa Species 0.000 claims description 5
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003864 humus Substances 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 47
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 22
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical group OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 101150006844 groES gene Proteins 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BUAQBZPEZUPDRF-RHQZKXFESA-N (2r,3r,4r,5r,6s)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2-hydroxy-7,8,9,10-tetrahydro-6h-benzo[c]chromen-3-yl)oxy]oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1C(CCCC1)=C1CO2 BUAQBZPEZUPDRF-RHQZKXFESA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-azaniumylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010033478 E coli K88 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 229920003134 Eudragit® polymer Polymers 0.000 description 1
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 101000867289 Glycine max Hsp70-Hsp90 organizing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000709704 Human poliovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000709727 Human poliovirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108010025915 Nitrite Reductases Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 101100364827 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) ahcY gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 101150081953 SAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 101150075115 hrtA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940076155 protein modulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
119476
He terologi st en proteiinien ilmentäminen heikennetyissä bakteereissa käyttämällä htrA-proraoottoreita Tämä keksintö koskee roko tekoostumuksia, jotka kä-5 sittävät heikennetyn bakteerin, joka sisältää DNA-rakenteen, joka käsittää indusoitavan promoottorin joka on toiminnallisesti liitetty DNA-sekvenssiin, joka koodaa yhtä tai useampaa heterolagista proteiinia.
Viime vuosina on syntynyt uusi sukupolvi eläviä 10 suun kautta annettavia salmonella-rokotteita, jotka perustuvat Salmonella-kantoihin, jotka on heikennetty muodostamalla ei-revertoituva mutaatio geeniin, joka on bakteerin aromaattisten aminohappojen biosynteesireitillä. Sellaiset kannat on kuvattu esimerkiksi EP-hakemusjulkaisussa 15 0 322 237. Edellä mainitut elävät suun kautta annettavat salmonella-rokotteet ovat lupaavia rokotteiksi ihmisen ja eläinten salmonellatautia vastaan, ja niitä voidaan myös käyttää tehokkaasti kantajina heterologisten antigeenien kuljettamiseksi immuunisysteemiin. Yhdistettyjä salmonella-20 rokotteita on käytetty virusten, bakteerien ja parasiittien . .·, antigeenien kuljettamiseksi, joka aiheuttaa sekretoriset, i · · humoraaliset ja soluvälitteiset immuunivasteet rekombinant- • · ... tiantigeeneja vastaan. Yhdistetyt salmonella-rokotteet ovat • · erittäin lupaavia käytettäväksi suun kautta annetuissa mo- * * * : ·* 25 nirokotteen yksittäisannoskuljetussysteemeissä (C. Hormaec- :.ί.: he et ai., FEMS Symposium numero 63, Plenum, New York, si- V*: vut 71 - 83, 1992 ) ,
Yhdistettyjen salmonella-rokotteiden kehityksessä on ratkaistava ongelmia. Suurin päämäärä on salmonella- • · :***; 30 rokotteessa olevan rekombinanttiantigeenin korkean tason ekspression aikaansaaminen niin, että se riittää im- • · * muunivasteen syntymiseksi. Vieraiden antigeenien korkeiden • · *···’ tasojen säätelemätön ekspressio voi kuitenkin olla myrkyl- : lista ja vaikuttaa solun elinkykyyn (I. Charles ja G. Dou- 35 gan, TIBTECH 8, sivut 117 - 121, 1990) , joka saa aikaan t · sen, että rokotteesta tulee tehoton tai että rekombinantti- 2 119476 DNA häviää. Tähän ongelmaan on kuvattu useita mahdollisia ratkaisuja, kuten ekspressio sellaisista plasmideista, jotka sisältävät keskeiset geenit, "on-off”-promoottorit tai viemällä vieraat geenit Salmonella-kromosomiin-5 Vaihtoehtoinen lähestymistapa edellä mainitun on gelman ratkaisemiseksi olisi sellaisen promoottorin käyttö, joka voidaan indusoida in vivo, ja eräs sellainen promoottori on E. coli -bakteerin nitriittireduktaasipromoottori nirB, joka indusoituu anaerobioosissa, Rokotekoostumukset, 10 jotka sisältävät bakteereita, jotka on transformoitu nirB-promoottorin sisältävillä rakenteilla, on kuvattu aikaisemmassa kansainvälisessä patent tihakemuksessairune PCT/GB93/01 617.
Esillä oleva keksintö koskee sellaisten DNA-15 rakenteiden valmistamista, jotka sisältävät erilaisen indusoituvan promoottorin, nimittäin htrA-geenin promoottorin, joka koodittaa stressillä indusoituvaa proteiinia.
Julkaisussa K. Johnson et ai.. Mol. Microbiol. 5: 401-7, 1991, ja sen viitteissä on kuvattu htrA-geeni ja se 20 on esimerkki geenistä, joka koodittaa lämpösokkiproteiinia, jota tuotetaan vasteena lämpötilan nousulle yli 42 °C:n.
* * · *’*. Sen mukaisesti keksintö esittää rokotekoostumusta, ·*·»« ]./ joka käsittää heikennetyn bakteerin, joka sisältää DNA- • · *···* rakenteen, joka käsittää htrA-promoottorin sekvenssin, joka ·· · : V 25 on toiminnallisesti liitetty DNA-sekvenssiin, joka koodaa yhtä tai useampaa heteralogista proteiinia, ja farmaseutti- • · * · sesti hyväksyttävän kantajan.
Eräässä suoritustavassa keksintö esittää tässä ai- •Yi emmin määritellyn rokotekoos tulituksen, jossa htrA-pr omoo t - .***. 30 torisekvenssi on toiminnallisesti liitetty DNA-sekvenssiin, f · joka koodittaa kahden tai useamman heterologisen proteiinin • * · *^#* fuusioproteiinia.
• · *···* Fuusion muodostavat proteiinit voidaan liittää yh- teen joustavalla sarana-alueella.
• · •\j 35 L-isänäkökohdassa DNA-rakenne, joka käsittää htrA- a · promoottorisekvenssin, voidaan toiminnallisesti liittää 3 119476 DNA-sekvenssiin, joka koodittaa ensimmäistä ja toista hete-rologista proteiinia, jossa ensimmäinen heterologinen proteiini on antigeeninen sekvenssi, joka sisältää tetanustoksiinin C-fragment in tai sen yhden tai useamman epitoopin.
5 Ensimmäinen ja toinen proteiini ovat suositeltavan- ti heterologisia proteiineja ja erikoisesti ne voivat olla polypeptidi-immunogeeneja; ne voivat olla esimerkiksi antigeenisiä sekvenssejä, jotka ovat peräisin viruksesta, bakteerista, homeesta, hiivasta tai parasiitistä. On erityisen 10 suositeltavaa, että ensimmäinen mainittu proteiini on antigeeninen sekvenssi, joka sisältää tetanustoksiinin C-frag-mentin tai sen epitoopit.
Toinen proteiini on suositeltavasta patogeenisen organismin antigeeninen determinantti. Antigeeninen deter-15 minantti voi esimerkiksi olla antigeeninen sekvenssi, joka on peräisin, viruksesta, bakteerista, homeesta, hiivasta tai parasiitistä.
Esimerkit virusten antigeenisistä sekvensseistä ensimmäiseksi ja/tai. toiseksi heterologiseksi proteiiniksi 20 ovat sekvenssit, jotka ovat peräisin sellaisesta ihmisen . immuunpuutosvirustyypistä (HIV), kuten HIV-1 tai HIV-2, Hl- • · * viruksen, esimerkiksi HIV-1 tai HIV-2, CD4-reseptorisitou- • · ... tumiskohdasta, hepatiitti A, B tai C -viruksesta, sellai- • · [“·* sesta ihmisen rinovirustyypistä, kuten tyyppi 2 tai tyyppi • · · ί ·* 25 14, herpes simplex -viruksesta, poliovirustyypistä 2 tai 3, suu- ja sorkkatauti viruksesta (FMDV), vesikauhuviruksesta, V ! rotaviruksesta, influenssaviruksesta, coxsackie-viruksesta, ihmisen papilloomaviruksesta (HPV), esimerkiksi tyypin 16 :Y: papi11oomaviruksen Ξ7-proteiinista ja fragmenteista, jotka • · ·***· 30 sisältävät E7-proteiinin tai sen epitoopit, ja apinan im- • # · muunipuutosviruksesta (SIV) .
· *·]/ Esimerkit bakteereista peräisin olevista antigee- • ’···* neista ovat ne, jotka ovat peräisin Bordetella pertussis [esim. P69-proteiini- ja filamentillinen hemagglutiniinian-:*·.· 35 tiqeeni (FHA) ], Vibrio cholerae, Bacillus anthracis ja E.
coli -antigeeneistä, kuten E. coli -bakteerin lämpölabii- 4 119476 lista toksiini B -proteiinin alayksiköstä (LT-B), E. coli -bakteerin K88-antigeenista ja enterotoksigeenisista E. coli -antigeeneistä. Muut antigeeniesimefkit sisältävät solu-pinta-antigeenin CD4, Schistosoma mansoni P28 -glutationi 5 S-transferaasi -antigeenit (P28-antigeenit} ja imumatojen, mykoplasmojen, sukkulamatojen, heisimatojen, Chlamydia trachomatis ja malariaparasiittien, esim. Plasmodium- tai Babesia-suvun parasiittien, esimerkiksi Plasmodium falciparum -parasiitin, antigeenit ja peptidit, jotka koodittavat 10 edellä mainittujen antigeenien iiranunogeenisiä epitooppeja. Erityiset antigeenit sisältävät täyspitkän Schistosoma mansoni P28 -antigeenin ja immunogeenisen P28 aa 115 - 131 -peptidin (joka sisältää sekä B- että T~solu~ epitoopin) oligomeerit (esim. 2-, 4- ja 8-meerit), ja ihmi-15 sen papilloomaviruksen E7-proteiinin, herpes simplex -antigeenit, suu- ja sorkkatautiviruksen antigeenit, apinan im-muunipuutosviruksen antigeenit ja difteriatoksiinin antigeenit, esim. difteriatoksiinin gangliosidia sitovan alueen.
20 Tässä käytettynä viitteet htrA-promoottoriin viit- . taavat promoottoriin itseensä tai sen osaan tai johdannai- ··· seen, 3 oka kykenee edistämään koodit tavan sekvenssin eks- * · pressiota. Suositeltava sekvenssi, ja joka sisältää htrA- .1” promoottorin, on: • · ·
: ·* 25 AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTA
m ♦ * · '*:<* (sekvenssi SEQ ID -numero 1) .
• »e V : Esillä olevan keksinnön mukaisissa rakenteissa DNA- sekvenssi voi koodittaa fuusioproteiinia, joka sisältää kaksi proteiinia tai useamman proteiinin, jossa vierekkäi- ·“*: 30 set proteiinit on erotettu sarana-alueella. Sarana-alue on ··· alue, jonka on suunniteltu edistämään sekä ensimmäisen että • · · toisen proteiinin toisistaan riippumatonta laskostumista • · *"*’ niin, että saadaan aikaan avaruudellinen ja temporaalinen erottuminen domeenien välille.
• « :*·.· 35 Sarana-alue on tyypillisesti sekvenssi, joka koo- • · dittaa sekvenssiä, jossa proliini- ja/tai glvsiiniaminohap- 5 119476 pojen suhteellinen osuus on korkea. Sarana-alue voi sisältää ainoastaan proliini- ja/tai glysiiniaminohappoja. Sarana-alue voi sisältää yhden tai useamman glysiini-proliini-dipepcidiyksikön.
5 Sarana-alue voi sisältää esimerkiksi korkeintaan noin 15 aminohappoa, esimerkiksi ainakin 4 ja suositeltavasta 6 - 14 aminohappoa aminohappomäärän ollessa sellainen, että se saa aikaan joustavuuden ensimmäisen ja toisen proteiinin välille.
10 Eräässä suoritustavassa sarana-alue voi vastata oleellisesti vasta-aineimmunoglobuliinin sarana-aluetta. Erityisesti IgG-vasta-aineiden sarana-alueet ovat proliini-rikkaita (T. E, Michaelson et ai., J, Biol., Chem. 252: 883-9, 1977), joiden on ajateltu muodostavat joustavan ni-15 velen antigeeniä sitovan ja häntädomeenin väliin.
Ilman, että halutaan sitoutua mihinkään teoriaan, proliinien ajatellaan muodostavan saranan jäykän osan ren-kaanmuotoisena rakenteena, koska tälle aminohapolle on ominaista, että se estää pyörimisen sen peptidisidoksen ympä-20 ri, joka liittää proliinijäännöksen viereiseen aminohappoon. Tämän ominaisuuden On ajateltu estävän sen, että pro- • · · ***. liini ja sen viereiset jäännökset muodostaisivat järjesty- ]..* neen alfaheliksi- tai beetajuoste-rakenteen. Glysiinin, yk- • · [···* sinkertaisimman aminohapon, jolla on hyvin rajoitetut stee- ί 25 riset vaatimukset, on ajateltu muodostavan joustavuuden.
Glysiinin on ajateltu toimivan saranan joustavana olkapää- • · · !,! ϊ nä. Glysiini voidaan subs tatuoida muilla aminohapoilla, erityisesti niillä, jotka eivät sisällä suuria sivuketjuja, ·*·*· kuten alaniinilla, seriinillä, asparagiinilla ja treonii- • · .···. 30 nilla.
• · ··· * Eräässä suositeltavassa suoritustavassa sarana-alue ··· • · · *·* ’ on neljän tai useamman aminohapon muodostama ketju, jolla ··· ♦ Ψ on sekvenssi • ·· 9 9 m 9 9 9 35 - [X]p-Pro- [Y]q-Pro - [Z] • · 6 119476 jossa Pro on proliini, X ja Y ovat kumpikin glysiini tai aminohappo, jolla on ei-kookas sivuketju, Z on mikä tahansa aminohappo, p on positiivinen kokonaisluku, q on positiivinen kokonaisluku 1 - 10 ja r on 0 tai positiivinen koko-5 naisluku, joka on suurempi kuin 0.
Sarana-alue voi olla erillinen alue, joka on hete-rologinen sekä ensimmäiselle että toiselle proteiinille, tai sen voi muodostaa ensimmäisen proteiinin karboksipään alue tai toisen proteiinin aminopään alue.
10 Suositeltavimmassa näkökohdassa esillä oleva kek sintö esittää rokotekoostumuksen, joka käsittää farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan ja heikennetyn bakteerin, joka sisältää DNA-molekyylin, joka käsittää htrA-pro-moottorin, joka on toiminnallisesti liitetty DNA-sekvens-15 siin, joka kooodaa ensimmäistä ja toista polypeptidi-immunogeeniä, jotka on liitetty yhteen sarana-alueella, jossa ensimmäinen polypeptidi-immunogeeni käsittää tetanus-toksiinin C-fragmentin tai sen epitoopit.
Lisänäkökohdassa DNA-rakenne käsittää htrA-promoot-20 torin liitettynä toiminnallisesti DNA:hän, joka koodittaa . ensimmäistä proteiinia, ja sen 3 '-päästä ulottuen DNA-sek- venssin, joka koodittaa sarana-aluetta, ;ja siitä alavirtaan • · t...( yhden tai useamman restriktioendonukleaasikohdan.
• * ,!*I Mainittu proteiini on suositeltavasta sellainen an- • · · * ·* 25 tigeeninen proteiini, joka tässä on aiemmin määritelty, ja t · « ‘»I* on erityisesti TetC-fragmentti tai sen epitooppi.
* · · V * Ensimmäisen ja toisen heterologisen proteiinin, jotka on liitetty yhteen sarana-alueella, stabiili ekspres- • · S.V sio voidaan saada aikaan in vivo. Heterologisia proteiineja i“*; 30 voidaan ekspressoida heikennetyssä bakteerissa, jota sitten ,···, voidaan käyttää rokotteena.
* · · l..m Heikennetty bakteeri voidaan valita Salmonella-, • · *·* Bordetella-, Vibrio-, Haemophilus-, Neisseria- ja Yersinia- • · · • suvuista. Heikennetty bakteeri voi vaihtoehtoisesti olla • * *,'·! 35 enterotoksigeeninen Escherichia coli -kanta. Erityisesti seuraavat lajit voidaan mainita: S. typhi - aiheuttaa ihmi- 7 119476 sen lavantaudin; S. typhimurium - aiheuttaa salmonellatau-din useissa eläinlajeissa; S. enteritidis - aiheuttaa ihmisillä ruokamyrkytyksen; s. choleraesuis - aiheuttaa sioissa salmoneliataudin; Bordetella pertussis -· aiheuttaa hinkuys-5 kän; Haemophilus influenzae - aiheuttaa aivokalvontulehduksen; Neisseria qohorrhoeae - aiheuttaa tippurin; ja Yersinia - aiheuttaa ruokamyrkytyksen.
Bakteerin heikentäminen voidaan saada aikaan ei-revertoituvalla mutaatiolla geenissä, joka ottaa osaa bak-10 teerin aromaattisten aminohappojen biosynteesireittiin. Ai nakin kymmenen geeniä ottaa osaa klorismaatin synteesiin, joka on aromaattisten aminohappojen biosynteettisen reitin haarautumiskohdan yhdiste. Useat näistä geeneistä sijaitsevat hyvin eri kohdilla bakteerigenomissa, esimerkiksi aroA 15 (5-enolipyruvyylisikimaatti-3-fosfaattisyntaasi), aroC (klo- rismaattisyntaasi), aroD (3-dihydrokinaattidehydrataasi) ja aroE (sikimaattidehydrogenaasi) . Mutaatio voi näin ollen tapahtua aroA-, aroC-, aroD- tai aroE-geenissä.
Suositeltavasti kuitenkin heikennetty bakteeri si-20 sältää ei-revertoituvan mutaation kummassakin kahdessa erillisessä geenissä, jotka ottavat osaa sen aromaattisten ami- * * · nohappojen biosynteesireitille, tai se sisältää ei-rever- *·§·· ]t>* toi tuvan mutaation sen aromaattisten aminohappojen biosyn- • · *··’ teettisellä reitillä ja ei-revertoituvan mutaation sellai- ·· · I V 25 sessa säätelygeenissä, kuten htrA, QmpR tai OsmC, Esimerkit sopivista heikennetyistä bakteereista on kuvattu esimerkiksi': si EP-hakemusjulkaisuissa 0 322 237 ja 0 400 958,
Heikennettyä bakteeria, joka sisältää keksinnön mu- ;*·*· kaisen DNA-rakenteen, voidaan käyttää rokotteena. Bakteerin • * .···, 30 ekspressoimia fuusioproteiineja (suositeltavasti oleelli- ··· sesti puhdistetussa muodossa) voidaan myös käyttää rokot- • · · * teiden valmistuksessa. Esimerkiksi puhdistetun TetC-P28- fuusioproteiinin on havaittu olevan immunogeeninen icses- ·’·*· sään. Keksintö esittää sen vuoksi lisänäkokohtanaan rokote- • · .’.J 35 koostumuksen, joka sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävän • » kantajan tai laimentimen ja aktiivisena aineksena tässä ai- 8 119476 emmin määritellyn mukaisen heikennetyn bakteerin tai fuu-sioproteiinin.
Rokote voi sisältää yhden tai useamman sopivan adjuvant in, 5 Rokote annetaan potilaalle suositeltavasti lyofili- soidussa muodossa, esimerkiksi kapselin muodossa, suun kautta antoa varten. Sellaiset kapselit voidaan valmistaa enteerisellä päällyksellä, joka sisältää esimerkiksi Eudra-git "S" -yhdistettä, Eudragit "L" -yhdistettä, selluloosa-10 asetaattia, selluloosa-asetaattiftalaattia tai hydroksipro-pyylimetyyliselluloosaa. Näitä kapseleita voidaan käyttää sellaisenaan tai vaihtoehtoisesti lyofilisoitu materiaali voidaan liuottaa uudelleen ennen antoa esim. suspensiona. Uudelleen liuotus tehdään suositeltavasti puskurissa sel-15 laisessa sopivassa pH:ssa, että varmistetaan organismien elinkyky. Heikennettyjen bakteerien ja rokotteen suojelemiseksi ruuansulatuskanavan happamuudelta annetaan suositeltavasta natriumbikarbonaattivalmistetta ennen kutakin roko-teantoa. Rokote voidaan vaihtoehtoisesti valmistaa parente-20 raalista antoa, nenän kautta tapahtuvaa antoa tai nisän- , .·. sisäistä antoa varten.
* · * ··· , βββ$· Rokotekoostumus sopeutetaan suositeltavasti lima- « « kalvon kautta tapahtuvaa kuljetusta varten, joka tapahtuu esim. suun kautta, nenän kautta tai keuhkoputken kautta ta- i · t * ·* 25 pahtuvalla annolla.
• · · *·ί·* Heikennettyä bakteeria, joka sisältää keksinnön mu- * ·· V : kaisen DNA-rakenteen, voidaan käyttää isännän, erikoisesti ihmisisännän, mutta myös mahdollisesti eläinisännän, taudin :V: ennakkotorjunnassa tai hoidossa. Mikro-organismin, erityi- ·***: 30 sesti patogeenin, aiheuttama infektio voidaan näin ollen ··· .h estää antamalla tehokas määrä keksinnön mukaista heikennet- • · · tyä bakteeria, Sitten bakteeri ekspressoi heterologista • · ***** proteiinia tai heterologisia proteiineja, jotka kykenevät I**]: saarnaan aikaan vasta-aineen muodostumisen mikro-organismia 35 vastaan. Kävtetty annosmäärä riippuu eri tekijöistä sisäl- 9 119476 cäen isännän koon ja painon, formuloidun rokotetyypin ja heterologisen proteiinin luonteen.
Esillä olevan keksinnön mukainen heikennetty bakteeri voidaan valmistaa transformoimalla heikennetty bak-5 teeri tässä aiemmin määritelyllä DNA-rakenteella. Mitä tahansa sopivaa transformaatiomenetelmää, kuten elektroporaa-tiota, voidaan käyttää-· Tällä tavalla voidaan saada aikaan heikennetty bakteeri, joka kykenee ekspressoimaan bakteerille heterologista proteiinia tai heterologisia proteiine-10 ja. Heikennetyn bakteerin viljelmää voidaan kasvattaa aerobisissa olosuhteissa. Näin valmistetaan riittävä määrä bakteeria rokoteformulaatiota varten niin, että samalla tapahtuu minimaalinen määrä heterologisen proteiinin ekspressiota.
15 Esitetään ekspressiovektori, jossa on sopivat tran skription ja translaation säätelyelementit, jotka sisältävät htrA-promoottorin lisäksi transkription terminaatiokoh-dan ja translaation aloitus- ja lopetuskodonit ja sopivan ribosomin sitoutumiskohdan, vektori sisältää tyypillisesti 20 replikaation aloituskohdan ja, jos halutaan, selektiömerk-kigeenin, kuten antibioottiresistenssigeenin. Vektori voi • · « ***. olla esimerkiksi plasmidi.
ΦΙΙΙ·
Keksintöä kuvataan nyt, mutta ei rajoiteta, seuraa-
• I
'·*·* villa esimerkeillä ja mukana seuraavilla kuvioilla, joissa: : V 25 kuvio 1 on kaaviokuva plasmidin pHTRAl, joka sisäl- tää htrA-promoottorin, rakentamisesta keksinnön yhden näkö- M· i,! : kohdan mukaisesti; kuvio 2 on kaaviokuva plasmidin pHTRA2, joka sisäl- ·*:*; tää htrA-promoottorin ja tetanustoksiinin C-fragmenttia · .***. 30 koodattavan DNA:n liitettynä sarana-alueeseen, rakentami- sesta; • · · *·^* kuvio 3 kuvaa plasmidin pTECH2 rakenteen; • 9 *···* kuvio 4 kuvaa välivaiheplasmidin pBD907 rakenteen; :*·*: kuvio 5 esittää plasmidin pHTRAl, joka on valmis- • · •\! 35 tettu kuvion 1 kaavion mukaisesti, rakenteen; • · 10 119476 kuvio 6 esittää tuoteplasmidin pHTRA2, joka on valmistettu kuvion 2 kaavion mukaisesti, rakenteen; kuviot 7A ja 7b kuvaavat lämpötilamuutosten vaikutukset nirB-, groE- ja hrtA-promoottoreihin; ja 5 kuvio 8 esittää IacZ-qeenin ekspression htrA-, nirB- ja groE- promoottoreista makrofaageissa.
Esimerkki 1 htrA-TetC-saranarakenteen valmistus
Kuten kuviosta 1 voidaan nähdä, lähtömateriaali 10 sellaisen vektorin valmistamiseksi, joka sisälsi htrA-pro-moottorin ja geenit, jotka koodittivat tetanustoksiinin C-fragmenttia, oli plasmidi pTETnirl5, jonka rakenne ja valmistus on kuvattu aiemmassa patenttihakemuksessamme PCT/GB93/01617 (julkaisunumero WO 94/03 615) ja siinä ole-15 vissa viitteissä, esim. julkaisussa WO-A-92 159 689.
Plasmidi pTETnirlS sisältää nirB-promoottorin liitettynä geeniin, joka koodittaa tetanustoksiinin C-fragmenttia (TetC), Kuten kuviossa 1 on kuvattu, plasmidi pTETnirlS digestoitiin Sacll- ja BamHI-entsyymeillä ja tu-20 loksena syntyneet 2,9 kp-.n ja 813 bp:p pituiset fragmentit . puhdistettiin geelissä. 2,9 kb:n pituinen fragmentti ligoi- • · · tiin 1,74 kb:n pituisen fragmentin kanssa, joka oli peräi- • · ... sin B, pertussis -bakteerin filamentillisen hemägglutinii- nin (FHA) geenistä fragmentin sekvenssin ollessa esitetty • · • ·1 25 sekvenssissä SEQ ID -numero 7. Tuloksena syntyneelle plas- **ϊ·1 midille annettiin nimi pBD907 ja plasmidin restriktiokartta Φ·· : on esitetty kuviossa 5. Välivaiheplasmidin pBD907 valmis tuksen tarkoitus oli poistaa TetC-fragmehtissa oleva EcoRI-iV: kohta niin, että nirB-promoottorisekvenssi voitiin korvata 30 htrA-promoottorisekvenssillä. Tämä saatiin aikaan digestoi- • tt "" #.j.t maila plasmidi pBD907 EcoRI- ja Bglll-entsyymeillä. Tulok- • · · sena syntynyt 4535 bp:n pituinen fragmentti puhdistettiin * · *·;·1 geelissä ja ligoi tiin seuraavien 55 bp:n pituisten oligo- • nukleotidien, jotka sisälsivät htrA-promoottorin, kanssa: ·1· : 35 t 1 · -1 · 11 119476
Oligo-1 S1 AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAWMITGAi.TGTGACGTACACaGCAATTTA (sekvenssi SEQ ID -numero 2).
Oli go-2 3' GATMGGCCTTGAAGCGCAATATTTTACTTACACTGGVTGTGTCGTTAAATCTAG
(sekvenssi SEQ ID -numero 3).
Se, että promoottori oli läsnä tuloksena syntyneessä välivaiheplasmidissa pINT, varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Sitten plasmidi pINT digestoitiin SacII- ja Bam-5 ΗΙ-entsyymeillä ja ligöitiin plasmidin pTETnirlS 813 bp:n pituiseen fragmenttiin niin, että muodostettiin plasmidi pHTRAl. Plasmidin pHTRÄl DNÄ-sekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 4; htrA-alueen, johon sisältyy 55 ensimmäistä emäsparia, sekvenssi on 10 AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTA (sekvenssi SEQ ID -numero 1).
Liittyen sekvenssiin SEQ ID -numero 4, GAACTT on -35 box -alue ja TCTGA on -10 box -alue. Emäspareissa 513 ; ·’; 15 ja 223.5, vastaavasti, on SacII- ja AlwNl-restriktiokohdat.
• · ·
Plasmidia pHTRAl käytettiin transformoimaan Salmo-• · .......
.··*, neliä typhimurium -kanta BRD50.9 {talletettu koodinumerolla NCTC 12716 12.10.1992) ja tuloksena syntynyt kanta, jolle * ‘ annettiin nimi BRD935, tarkistettiin TetC-fragmentin eks- • · · **j·’ 20 pression suhteen standardimenetelmin. Kanta BRD935 on tai- • φ · *·* * letettu kokoelmaan National Collection of Type Cultures,
Colindale, Yhdistynyt kuningaskunta, 27.1.1995, koodinume-0.: rolla 12883) .
Kuten kuviossa 2 on esitetty, plasmidia pHTRAl käy-.···. 25 tettiin valmistettaessa modifioitu rakenne, jossa "sarana- • · Φ alue" on läsnä TetC-fragmentin C-päässä. "Sarana-aluetta" • · edustava nukleotidisekvenssi saatiin plasmidista pTECH2, ·· · ϊ V jossa on sekvenssin SEQ ID -numero 5 mukainen DNA-sekvenssi • · ϊ#*·ϊ ja jossa on SacII- ja AlwNl-restriktiokohdat kohdissa 533 12 119476 ja 2304, vastaavasti. Tämän plasmidin rakennus on kuvattu aiemmassa patenttihakemuksessamme PCT/GB93/01 617.
Plasmidi pTECH2 sisältää nirB-promoottorialueen liitettynä tetanustoksiinin C-fragmenttiin, joka on liitet-5 ty 3'-päästään BamHI-restriktiokohdan välityksellä sarana-alueeseen, jota koodittaa Gly-Pro-Gly-Pro-toistojakso, yhdessä useiden restriktiokohtien kanssa, jotka sallivat li-säpolypeptidejä koodittavien geenien insertion. 1,7 kb:n pituinen fragmentti, joka koodittaa sarana-aluetta ja osaa 10 tetanustoksiinin C-fragmentin alueesta, poistettiin plasmi-dista pTECH2 digestoimalla SacII- ja AiwNl-entsyymeillä ja puhdistettiin. Tuloksena syntyneen fragmentin DNA-sekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 6.
Plasmidi pHTRAl, joka koodittaa htrA-promoottoria 15 ja tetanustoksiinin C-fragmenttia, mutta ei sisällä saranaa, digestoitiin SacII- ja AlwNl-entsyymeillä ja tuloksena syntynyt 2 kb:n pituinen fragmentti puhdistettiin geelissä.
1,7 kb:n pituinen fragmentti (SEQ ID -numero 6) plasmidista pTECH2 ja 2 kb:n pituinen fragmentti plasmidis-20 ta pHTRAl ligoitiin yhteen muodostaen plasmidi pHTRA2, joka : sisälsi htrA-promoottorin liitettynä toiminnallisesti te- ··· tanustoksiinin C-fragmentin geeniin, jossa on sen 3’-päässä .···. sarana-alue.
Heikennetty Salmonella typhimurium -kanta transfor- * I 25 moitiin vektorilla. pHTRA2 ja standardimenetelmin tapahtu- * · * neen selektion jälkeen eristettiin Salmonella-kanta • · · *·* * BRD1062, joka sisälsi plasmidin pHTRA2.
Plasmidi pHTRA2 toimii välimuotona sellaisten ra- * * V.: kenteiden valmistuksessa, jotka koodattavat fuusioproteii- φ · · ϊ,..: 30 nia, jossa proteiinit on liitetty yhteen sarana-alueella.
.···. Näin ollen aiemmassa patenttihakemuksessamme numero PCT/ • · "... GB93/01 617 kuvattujen menetelmien mukaisesti voidaan kloo- • * • ♦ nata lisäproteiineja sarana-alueen restriktioendonukle- • · • *.· aasikohtiin.
• « *. *: 3d 13 119476
Materiaalit ja menetelmät
Bakteerikannat E. coli HBlÖl -kantaa ja BRD509-kantaa [heikennetty S. typhimurium aroA aroD -kanta (talletettu koodinumerolla 5 NCTC 13716 12.10.1992)] käytettiin kaikissa kokeissa. Bakteerit kasvatettiin Luria-lihaliemessä (LB) tai LB- alustassa, joka kiinteytettiin 1,6 % w/v agarilla, joihin lisättiin sopivat antibiootit.
DNA-käsittelyt 10 Plasmidi-DNA puhdistettiin alkalilyysimenetelmällä (R. Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Katkaistut DNA-fragmentit puhdistettiin agargeeleistä menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Tautz ja Rentz (1983, "An 15 optimized freeze-squeeze method for the recovery of DNA fragments from agarose gels", Analytical Biochem., 132, 14 - 19) . Restriktioentsyymit hankittiin valmistajalta
Boehringer Mannheim, Saksa ja New England Biolabs, USA, ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.
20 DMA-sekvensointi DNA kaksoisjuostesekvensointia varten eristettiin * ♦ ·
***. menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Stephen et ai. (1990, A
Rapid Method for isolating High Quality Plasmid DNA Suit- !♦··* able for DNA Sequencing, Nucleic Acid Research, 18, numero : .* 25 24, sivu 7463). Sekvensointi suoritettiin käyttäen Se- ·.·.· quenase Version 2 -käyttöpakkausta (USB) ja sitä käytettiin • · · V · valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Oiigonukleotidit Nämä syntetisoitiin SAMl-oligonukleotidisyntetisoi- * .***. 30 jalla (Biolabs, UK) .
«··
Esimerkki 2 • · · htrA-lacz-rakenteen valmistus • · *·.·* htrA-promoottorin ominaisuuksia verrattiin kahden • ιπι · ·*♦*: muun indusoituvan promoottorin, nimittäin nirB- ja groE- • · •*.tj 35 promoottorin, kanssa.
• · 14 119476
IacZ-geenin j atkokloonaus nirB-, htrA- ja qroE-projooofctorin alavirtaan DNA-fragmentti, joka kooditti IacZ-geeniä, josta puuttui promoottori, puhdistettiin plasmidista pMACl871 5 (Pharmacia) käyttäen matalan sulamispisteen sisältävän aga-roosin menetelmää, jota seurasi plasmidin katkaisu Sali- ja BamHI-restriktioentsyymeillä (14). Plasmidit pTETnirlS (S.N. Chatfield et ai., Bio/Technology 10, 888 - 892) ja pTEThcrA-1, jotka sisälsivät nirB- ja htrA-promoottorit, 10 vastaavasti, digestoitiin Sali- ja BamHI-endonukleaaseilla ja puhdistettu IacZ-geeniä koodittava fragmentti kloonattiin lukuraamiin promoottoreista alavirtaan. Plasmidia pRZ-PES käytettiin mitattaessa S-galaktosidaasin (β-gal) ekspressiota groE-promoottorista. Flasmidi pRZ-ΡΕΞ sisältää E.
15 coli groE -operonin promoottorin ylävirtaan groES- ja lacZ-geeneistä. Se rakennettiin jatkokloonaamalla 2,1 kb pituinen EcoRI - Hindlll -fragmentti, joka sisälsi plasmidin pOF39 operonin [O. Fayet et ai., J. Bacteriol., 171, 1379 -1385 (1989)], plasmidiin pUC19. Sitten muodostettiin uusi 20 Bglll-kohta groES- ja groEL-geenien väliin käyttäen kohden- , *·. nettua mutageneesiä. EcoRI - Bglll -fragmentti, joka sisäl- * ί · * si groE-promoottorin ja groES- geenin, kloonattiin EcoRI - • ·
BamHl -katkaistuun promoottori tutkimusplasmidiin pKF5255 [P.F. Lambert et ai., J. Bacteriol., 162, 441 - 444 (1985)] • · · • ·* 25 niin, että saatiin plasmidi pRZ-PES. Plasmidit, jotka val- *·?·* niistettiin S. typhimurium LB5010 -kannassa (r_n,+) [L.R. Bul- ··· V * las et ai., J. Bacteriol., 256, 471 - 474 (1983)], vietiin sisään S. typhimurium -kantaan BRD915 (S. typhimurium :V: SL1344 htrA)[S.N. Chatfield et ai., Microbial Pathog. 12, 30 145 - 151 (1992)] käyttäen elektroporaatiota, Lac- ··· positiiviset rekombinantit seulottiin L-agar-mal joilla, • · · jotka sisälsivät ampisilliinia ja X-gal-yhdistettä.
• **;*' Ympäristöolosuhteiden muutosten vaikutus IacZ- • · s • ekspressioon 35 Bakteerikantoja, jotka sisälsivät rekombinantti- plasmidit, kasvatettiin yli yön L-lihsliemessä ravistellen 15 119476 30 °C:ssa. viljelmät laimennettiin 1:50 ja kasvun annettiin jatkua kolme tuntia lisää 30 °C:ssa, kunnes saavutettiin ODeoo-arvo 2,8; - 3,4. Kutakin viljelmää säilytettiin 0,2 ml 4 eC:ssa ja sitä käytettiin määritettäessä il-gal-aktii-5 visuuden perustaso. Sitten jäljelle jääneet osat viljelmiä muutettiin eri kasvuolosuhteisiin ja otettiin näytteitä aikapisteissä 0, 2, 4, 6 ja 24 tuntia, ellei toisin ole mainittu. Kussakin aikapisteessä määritettiin ODsoo-arvo ja bakteerit säilytettiin 4 °C:ssa, kunnes suoritettiin fi-gal-10 testi.
Ekspression mittaus infektoiduissa HEp-2-, Caco-2-ja THP 1 -makrofaagisolulinjoissa
Solut ympättiin tiheytenä, joka oli noin 105 solua/ kuoppa, 24-kuoppaisille maljoille ja niitä kasvatettiin yli 15 yön Dulbecco's modified Sagle's -alustassa ilman fenolipunaa (1CN Flow), johon oli lisätty 10 % (v/v) naudan sikiön seerumia ja 2 mM glutamiinia, 37 °C:ssa 5 % CCh-ilma- kehässä. Kudosviljelykuoppiin lisättiin 108 pesäkettä muodostavaa yksikköä yli yön kasvaneen viljelmän bakteeri-20 laimennosta ja niitä inkUboitiin 30 °C:ssa. Eri aikapis- . .·. teissä otettiin kudosviljelyalustästä näytteet solun ui- • t · koisten bakteerien β-gal-aktiivisuuden mittausta varten.
• •t·· • · ... Kunkin näytteen bakteerimäärät määritettiin elinkykyisten • « bakteerien laskennalla ja vastaava ODeoo-arvo määritettiin « · t • ·' 25 käyttäen standardisuoraa. Infektoituneet solut pestiin fos- faatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja niitä inku- ··« · boitiin yksi tunti lisää niin, että läsnä oli 200 mg genta- misiiixia/ml solun ulkoisten bakteerien tappamiseksi. Sen :*·*: jälkeen solut lyysattiin käyttäen steriiliä tislattua vettä • · 30 ja voimakasta pipetointia. Kunkin solulysaatin S-gal- aktiivisuus määritettiin. Kunkin lysaatin sisältämä baktee- »* f rimäärä määritettiin elinkykyisten bakteerien laskennalla ··· *..·* ja vastaavat ODeoo-arvot määritettiin käyttäen standar- :***: disuoraa.
• · • * -» r-
• · · Λ S
Φ · 16 119476
Tulokset
Ekspressio kustakin tähän tutkimukseen valitusta promoottorista on herkkä ympäristöolosuhteiden muutoksille. nirB-promoottorin on aiemmin osoitettu respondoivan anaero-5 bisuusmuutoksiin. Suoritettiin alkukokeet lacZ-ekspressio-tason arvioimiseksi kustakin promoottorista, jotka olivat samanlaisissa monikopioisissa plasmideissa Salmonella -rokotekannassa BRD915. Lämpöti1amuutosten vaikutukset eri promoottoreihin on esitetty kuviossa 7. Lämpötilamuutokset 10 30 °C:5ta 37 °C:seen (kuvio 7A) johtivat kohoamiseen β-gal- entsyymiyksiköiden määrässä, kun lacz-proteiinia ekspres-soitiin nirB- ja htrÄ-promoottoreista. Mitään merkittävää kohoamista β-gal-yksiköiden määrässä ei havaittu qroE-promoottorista. Lämpötilamuutos 30 °C:Sta 42 °C:seen johti 15 kohoamiseen β-gal-yksiköiden määrässä kaikista kolmesta promoottorista, β-gal-tason nousunopeus oli nopeampaa htrA-ja nirB-promoottoreista verrattuna groE-promoottoriin (kuvio 7B) . Lämpötilamuutokset 37 °C:sta 42 °C:seen johtivat sekä nirB- että htrA-promoottorien indusoitumiseen niin, 20 että kohtalaisempi kohoaminen β-gal-yksiköiden määrässä ta- . .*. pahtui groE-promoottorista (kuvio 70 - • · · β-gal-proteiinin ekspressio eri promoottoreista • · ... testattiin myös selektoimalla bakteerit, jotka olivat tun" • · ];··* keutuneet eukaryoottisiin soluihin. HEp-2-, Caco-2- ja THP~ ϊ ·* 25 1-makrofaagisolulinjat infektoitiin 10 bakteerilla ja nii- \i.: tä inkuboitiin 30 <C:ssa. β-gal-yksiköiden määrä, joka mi- ··· V : tattiin kolme tuntia HEp-2-solujen infektion jälkeen osoit ti, että lacZ-geenin ekspressio sekä htrA- että nirB-:V; promoottoreista oli merkittävästi tehostunut (kuvio 2). Mi- }***· 30 tään tunnistettavaa kohoamista ei kuitenkaan havaittu lacz- t·· .*. ekspressiossa qroE-promoottorista. Samanlaiset tulokset • · · *·[/ saatiin infektoiduissa Caco-2-soluissa (ei esitetty). Naii- • *···* le päinvastaisesta makrofaagien solunsisäisissä olosuh- ;*·*: teissä kaikki kolme promoottoria indusoituivat (kuvio 8) .
• · 35 nirB-promoottoriin vaikutettiin eniten ja groE-• * ~ promoottoriin vaikutettiin vähiten (kuvio 8) . Kun β-gal- 17 119476 yksiköiden määrä kummankin solulinjan solunulkoisessa alustassa määritettiin, mitään kohoamista entsyymiaktiivisuudessa ei havaittu (ei esitetty).
Koska kasvun makrofaagien sisällä havaittiin vai-5 kuttavan ekspressioon kaikista kolmesta promoottorista, niiden herkkyys vetyperoksidille, jota yleisesti löytyy makrofaagien fagosomeista, tutkittiin. Kun bakteereita in-kuboitiin 30 6C:ssa niin, että läsnä oli 100 μΜ vetyperoksidia, se ei johtanut mihinkään merkittävään vaikutukseen 10 groE- ja nirB-prorooottöreiden suhteen. Näille päinvastai-sesti, JS.- gal -yksiköiden taso kohosi htrA-promoottorista saavuttaen neljässä tunnissa tason, joka oli 10 yksikköä yli perustason. Tätä seurasi nopea aleneminen perustasolle kuudessa tunnissa (ei esitetty). lacZ-proteiinin konstitu-15 tiivinen ekspressio plasmidista pLK (M. Szabo et ai., J. Bacteriol., 174, 7245 - 7252) ei muuttunut merkittävästi missään ympäristöolosuhteen muutoksessa (ei esitetty).
Tässä tutkimuksessa käytettiin kolmea ympäristön säätelemää promoottoria IacZ-geenin ekspressoimiseksi eri-20 laisissa kasvuolosuhteissa. Promoottorit ovat edustajia . ,·, kolmesta indusoituvien bakteeripromoottorien ryhmästä: an- • · · aerobisesti indusoituva E. coli nirB -promoottori, oE- • * ( ( . · · 32 . » ... riippuvainen htrA-promoottori ja σ -riippuvainen groE- • · promoottori, Ekspressio nirB-promoottorista riippuu tran- • · · ϊ ·* 25 skriptiotekijästä FNR, joka sitoutuu kohtien -52 ja -30 vä- *.i,! liin transkription aloituskohdasta ylävirtaan. Joissain ta- V ί pauksissa FNR-riippuvaista transkriptiota moduloidaan yh dessä toisen transkriptiotekijän, NarL-tekijän, kanssa. Tässä käytetty plasmidi pTETnirlS sisältää kuitenkin aino- • * ;***· 30 astaan FNR-riippuvaisen sitoutumiskohdan.
• ·· ,*, Bakteerit respondoivat ympäristön stressiolosuhtei- • · · *;]t* siin muuttamalla nopeasti monien proteiinien synteesinope- • · **··* utta. Monissa tapauksissa muutosinduktio sopeuttaa nopeasti ·*·*: proteiinitasot uudelle jatkuvuustasolle. Tässä tutkimukses- • * 35 sa testasimme ympäristöolosuhteiden vaikutusta JS-gal- * * tasoon. Havaitsimme, että lämpötilamuutoksella oli suurempi 18 119476 vaikutus htrA-promoottoriin verrattuna qroE-promoottoriin. Tämä tulos on linjassa sen tosiasian kanssa, että in vivo htrA-promoottori indusoituu ennen qroE-promoottoria (joka on σ^'-riippuvainen) ja yhdessä o32-proteiinin kanssa oE-5 sisältävän RNA polymeraasin toimesta (11, 12). Yllättävästi ni rB-promoo t tor i tehostui myös kohonneessa lämpötilassa. Vaikka on mahdollista, että korkeassa lämpötilassa kasvualustan happikonsentraatio on alentunut se tosiasia, että lämpötilamuutos 30 °C:sta 37 °C:seen aiheuttaa nopean ko-10 hoamisen nirB-promoottorista ekspressoituneiden fi-gal- yksiköiden määrässä antaa ehdottaa, että FNR-proteiini, kuten muut stressiproteiinimodulaattorit, respondoi useisiin ympäristöstimuluksiin. Samalla tavalla htrA-promoottori indusoitui myös anaerobisisssa kasvuolosuhteissa ja sen vuok-15 si tuntuu siltä, että tätä promoottoria joko säädellään muilla tekijöillä kuin oE-tekijällä tai että oE-tekijä aktivoituu myös alhaisessa happipaineessa.
Jotta S. tvphimurium -bakteeri säilyttäisi virulent tisuutensa, bakteerin täytyy kyetä elämään maktofaagien 20 sisällä. Tämä eloonjäänti riippuu bakteerin kyvystä sietää t ... useita toksisia tappomekanismeja sisältäen vetyperoksidin • · · ***. tuoton. Toisin kuin E. coli htrA -mutanttien, S. typhimuri- |*f t« "" " um htrA -mutanttien ei ole aiemmin havaittu kuolevan koho- • · ]···’ neessa lämpötilassa, mutta mieluummin on havaittu, että ί V 25 niillä on heikentynyt kyky jäädä eloon merkittävissä vety- t ·.·.· peroksiditasoissa. Mielenkiintoisesti htrA-promoottori oli ϊ ainoa testatuista promoottoreista, jonka ekspressio kohosi vetyperoksidin läsnä ollessa.
·'·*· Solunsisaisen ympäristön vaikutuksen määrittämisek- · .*·*. 30 si ekspressiotasoa kustakin kolmesta eri promoottorista • · tutkittiin sen jälkeen, kun Salmonella, joka sisälsi testi- • · · V * plasmidit, oli mennyt sisään useisiin erilaisiin viljeltyi- hin eukaryoottisiin solulinjoihin. Bakteereja kasvatettiin in vitro ia niitä käytettiin .infektoimaan eukaryoottisolut • · ........
:\j 35 30 °C:ssa, koska lämpö tilamuutos 30 °C:Sta 37 °C:seen indu soi dramaattisesti sekä htrA- että nirB-promoottorit. Ha- 19 119476 vaitsimme, että samalla kun β-gal-ekspressiotaso sekä nirB-että htrA-promoottorista kohosi kaikissa testatuissa solu-linjoissa, qroE-promoottori indusoitui ainoastaan infek-toiduissa makrofaageissa.
5 • * · « < · ··* 9 • · ··· « » • · ··« • i « « · · • · * · *
« * I
• · · ··· 999 » « · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • 9 *·· * »I· • · « * · · 9 ♦ ·* * · • Φ ··· ·· · • · 9 • · • * 9 9 9 9 9 9 ·« • · 20 119476 sekvenssilista (Il GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) KAJE: MEOEVA HOLDINGS BV (3) STREET: CHURGEILL-LAAN 223 (C) CITY: AMSTERDAM (I) COUNTRY: TEE NETHERLANDS (F) POSTAL CODE (ZIP): 1070 ED Cix) TITLE OF INVENTION: VACCINES (iii) NUM3EH 0? SEQUENCES: 7 (iv) COMPUTER HEAD A3 LE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (3) COMMUTE?.: I3M ?C compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/KS-DOS
(D) SOFTWARE: Patsnrln Reisa.se #1.0, Version #1.25 (EDO) (vi ) PRIOR APPLICATION DATA: (A.) APPLICATION NUKSE?.: GB 9401795.1 . (3) FILING DATE: 31-JAN-1994 • · 1 • 1 · 1.2') INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: • · ... ( i) SEQUENCE CHAPACTEHISTIC5: • · ··". (A) LENGTH; 55 bass pairs • · • · , .·. (5) TYPE: nucleic aziz « ♦ · ·1· (C) STRANDEDNESS: sir.ria • · · (E) TOPOLOGY: linear « · • « I » I · ··« • · • · »·· « 1 · • · · • 1 · • · · • · • • •Φ ·· · • it • 1 • · · • · · * ·· • · 21 119476
(ii) MOLECULE TYPE: DNA {gnomicI (:::) HYPOTHETICAL: NO
(iii) ANTI-SENSE; NO (vi) ORIGINAL SOURCE ; (A) ORGANISM: Salmonella typhimuriua (Ik) FEATURE: (A) NAME/KEY: pramocsr (3) LOCATION: 1..S3 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO; 1: AATTCTATTC CGGAACTTCG cgttaxaaaa TGAATCTGAC GTACACAC-CA ATTTA S3 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO; 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH; 55 base pairs (3) TYRE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (::) MOLECULE TYPE; DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE: NO
** : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO: 2: ··· • · AATTCTATTC CC-GAACTTCG CGTTATAAAA TGAATGTGAC GTACACAGCA ATTTA 55 ·#·1 • ·1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *** t · · *** 1 (A) LENGTH: 35 bass pairs (S) TYPE: nucleic acid # · « · t (Cl STRAKDEDKESS: sincls * · • · ··· ·«· • · 1 4 4 4 * ··· • » • ♦ *·« · · » I » • 1 • · • · ·
• M • I
22 119476 (D) TOPOLOGY: linear (li) MOLECULE TYPE: DMA (csucmic)
(lii ) HYPOTHETICAL: NO (iiij ANTI-SENSE: YES
(si) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: GATAAGGCCT TGAAGCGCAA TATTTTACTT ACACTGCATG TGTCGTTAAA TCTAG 55 (2) INFORMATION FÖR SEQ ID NO; 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 3712 base pairs (3) TYPE: nucleic acid (C; STPANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY; circular (ii) MOLECULE TYPE: DNA (canomic) (iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE: NO (is! FEATURE: (A) ΝΑΗΞ/ΚΖΥ: iitrA promoter (3) LOCATION: 1..55 (12) FEATURE: • · » ***\ (A) ΝΑΝΕ/KEY: SacII restriction site (3) LOCATION: 5i3 ·1· ' ' • 1 *···1 (ix) FEATURE: ·· · • t · • ·1 (A) ΝΑΝΕ/KEY: Alwtf 1 restriction site • · · *·!·1 (3) LOCATION: 2235
»M
*·1 1 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO; 4: AATTCTATTC CSGAÄCTTC5 CGTTATAAAA TSAATCTSAC GTACACAGCA ATTTAGATCT 60 • · • · · • · · • · «»1 * ♦ • · ·2 Λ ··· • · t • « · ··· • · • I ·1» · · • 1 · 2 • « • 1 • · « · • ·♦ • 1 23 119476 TAA7CA7CCÄ O-GGr.Gr.CTT 7CTGATGAAA AACCTTGATT G7TG6S7CSA CAACGAAGAA 120
GACATCGATG TTATCCTSAA AAAGTCTACC ATTC7SÄACT TGGACÄ7CAA CAACGAXATT ISO
ATCTCCGACA TCTCTGGTTT CAACiCCTCT GTTA7CACAT ATCCAGATGC TCAA.TTGG7C· 240 CCtGGCATCÄ ACGGCÄAAGC TATCCäCCTG GTTAACAACG AATCTTCTGA AG7TATCGTC- 200 CACAAGGCCA 7GGACATCGA ATACAACGAC ATGTTCAACA ACTTCACCGT TAGCT'i’CTGG 360 CTGCGCGTTC CGAAAGTTTC TGCTTCCCAC CTGGAAO.G7 ACGGCAC7AA CGAGTACTCC 420 ATCATCAGCT CTATGAAGAA ACACTCCCTG TCCATCGGCT CTGGTTGG7C TGT7TCCCTG 480 AAGG5TAACA ACC7GATCTG GÄCTCTGAAA GÄC7CCGCGG GCGAAGTTCG TCAGATCACT 540 TTCCGCGACC TGCCGGACAA GTTCAACGCG TACCTGGCTA ACAAATGGGT TTTCATCAC? 600 ATCACTAACG ATCGTCTGTC TfCTGCTAAC C7GTACATCA ACGSCG7TCT GA7GGGC7CC 650 GCTGAAA7CA CTGGTC7S5G CGCTATCCGT GAGGACAACA ACATCÄCTC? TAAGCTGGAC 720 CC-TTGCAACA ACAACAACO. G7ACG7ATCC ATCGACAAGT TCCG7ATCT7 C7GCAAAGCA 780 C7GAACCCGA AAC-AGA7CGÄ AAAACTC-TAT ACCAGCtACC TGTCTATCAC CTTCCTCCGT 840 GAC77CTGGG GTAACCCGCT GCGTTACGAC ACCGAATAT? ACCTGATCCC GGTAGCTTCT S 00 AC-CTCTAAAG ACC-TTCAGCT GAÄAAACATC ACTGACTACA TGTACC7GAC CAACGCGCCG 950 TCCTACACTA ÄCGuiÄAACT GAACATCTAC TACCGACG7C TGTACAACGG CC7GAAAKC 1020
ATCATCAAAC GCTACACTCC GAACAACGAA A7CGATTC7T TCGTTAAATC TGGTGACTTC 10BO
A7CAAAC7GT ACGTTTCTTA CAACAACAAC GSACACA7CG TTGC-TTÄCCC GAAäGACGC-7 1140 AACC-CTTTCA ACAACCTGGA CAGÄATTCTG CG7GTTC-ST7 ACAACGCTCC GGGTA.TCCCG 1200 . CTCTACAAAA AAATGGAAGC TGTTAAACrG CGTGACCTGA AAACCTACTC 7GTTCAGCTG 1260 9 9 9 ··· ...,ϊ SAACTGTACG ACGACAAAAA CGCTTCTCTG GGTCTGC-TTG GTACCCACSA CGGTCAGA7C 1320 • · .···. G57AACGACC CGAACCGTGA CATCCTGATC GCTTC7AACT GGTACTTCSA CCACCTC-ÄAA 1380
• ^ I
··.·. GACAAAATCC TGGGTTGCGA C7GGTAC7TC GTTCCGACCG ATGAAGGTTG GÄCCAACGAC 1440 • ^9 ] ,·, TAAGGAICCG CTAGCCCSCC TAA7GA5CGG GC77TT7TTT CTCGGGCAGC GT7GGGTCC7 1500 • · ·
• ·· GCSCATGATC GTGCTCCTGT CG1TGAGGAC CCGGCITP.GGC TGGCGGGGTT 15öQ
* · · • · · GCC77ACTGG TTAKAGAAT GAäTCACCGA TACGCGAGC5 AACGTGAAGC GACTGCTGC: 1620 • · • · 4 • * · • · ··· • · • · ·*· ··· t « · • « · ··· * · * · ··· ftft · • · · • · • · • · 9 9 9 9 f· • · 24 119476 GCAAAACGTC "CGACCtC-Ä SCAACAACA." &AATGG7CT7 CGC-TTTCCC-: GTTTCGTAAA 1330 GTC7GGAAAC C-CSC-AAGTCA GCECTCTTCC C-CTTCCICGC TCAC7GAC7C GCTGCGCTCG 1740 GTCG7TCGC-C 7GCGGCGAGC GGTATCAGC? CäCTCAAAGG CGGTAATACG GTTA7CCACA 1300 GAATCAGGGG A7AACGCAGG AAAGAACATG TC-AGCAAAAG GCCAGC3AÄA GGICAGGAAC I860 CGTAAAAAGG CCC-GGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC 1920 AAAAATCGÄC GC7CAAGTCA GAGGXGSCGA AACCCGACAG GACTÄTAAAG ATäCCAGGCG 1980 TTTCCCCCTG GAAGC7CCCT CGTGCGCTCT CCTSTTCCGA CCC7GCCGC? TACCuC-ATAC 2040 CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGÄAGCG7G GCGCTrrCTC AAT6CICÄC5 CTGTAGGTAT 2100 CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG C7GGGCTGTG TGCACGAACC CCCCGTTCAG 2150 CCC5ACCC-CT GCGCC7TA7C CGG7AAC7AT CGTCTTGAGT CQACCCGG7 AAQ.CACGAC 2220 TTATCGCCAC rSGCAC-CAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAG3CGGT 2230 GCTACAGAGT TCnSAASTG GTGGCC7AAC 7ACGC-C7ACA C7AGAAGSAC AG7ATTTGGT 2340 ATCTGCGCTC 75C7GAAGCC AG7TACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGC7C TTGATCCGGC 2400 AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT 77TC-TT7C-CA AGGiGCAGAT 7ACSCGCAGA 2400 AAAAAAC-GAT CtCAAGAAGA 7CCTTTGA7C TT77C7ACGG GGTCTGACG- TCAG7GGAAC 2320 GAAAACTCAC GTTAAGGGAT T77GGTCA7G AGAT7ÄTCAA AAAGGATC7T CACCTAGATC -2530 CTTTtAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGÄC-TA AACTTGGTCT 2640 GACAGTTACC AAXSCTTAAT CAGTGAC-GCA CCTATCTCAC- CGA7CTG7C7 A.77TCGTTCA 2700 TCCATAGTTG CCTC-ACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG CTTACCATCT 2760
*:**: GGCCCCAG7G C7GCAA7GAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTA.TCAGCA 2B2Q
:***: ATAAACCAGC CAC-CCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAG7GGTC C7GCAAC7T7 ATCCGCC7CC 2380 ··· :***: ATCCAGTCTA ?"AATTG?TG CCGGGAAGCT AGAG7AAG7Ä GTTC3CCAC-T TAATAGTT75 2940 • · : CGCAACGT7G TTGGCATTGC TGCäGGCATC G7GGTG7CAC GCTCGTCSTT TGGTA7GGCT 3000 ··· ' ' TCATXGAGCT CCC-GTTCCCA ACC-ATCäAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT C-77G7GCAAA 3000 AAAGC5GTTA GC7C277CGG TCC7CCGA7C G7TG7CAGAA GTAAG77GGG CGCAGTGT7A 3220
: V: TCACTCA7C-G TTATGGCAGC ACTGCATAA.r TC7CTTACTG -7CA7GCO.rc CGIAAGA7GC 313C
• · ··» • · • · ··· • · · m · · • · · • · « · • 1 1 ·· · • · · • · • ♦ · • 1 1 • ·♦ • · 25 119476 77TTCTGTGA CTG57GAGTA CTCAACCAAG 7CATTC7GAG AATAGTGTAT GCSGCGÄCCG 32 4 ö agttgctctt gcccögcstc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag ÄACTTTAAAA 3300 G7GCTCÄTCA tTGGAAAACC- ??CT?CGGGG CGAAAACTCT CAAGGÄTCTT ACCGCTGTTS 3360 AGATCCAGTT CC-ATSTäACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TCTTACTTIC 3420 ACCäGCGTTT CTGGS7GAGC AAAAACAGGA AESCÄAAATÖ CCC-CAAAAAA C-GGAATAAGG 3480 GCGÄCACGGA AATGTTGAA7 ACTCATA.CTC TTCCTTTTTC AATATTÄTTG ÄAGCAiiTAT 3540 CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATÄCATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAÄACAAÄTA 3600 GGGGTTCCGC GCACA7TTCC CCC-AAAAGTG CCACC7GACG TCTAAGAAAC CVrTA.TTATC 3660 ATGACATTAA CCTATAAAAA TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTCGTC77CA AG 3112 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO: S: {i) SZQUZ'JCZ CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 3769 bass pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: circular (iij MOLECULE TYPE: DHA (geaeaic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (ill) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: TTCAGGTAAA TTTGAT5TAC ATCAAATGG? ACCCCTTGCT GAATCGTTAA GGTAGGCGGT 60 ··· AGGGCCCÄGA TCTTAATCAT CCACAGGAGA CTT7CTGÄTG AAAAACCTTG ATTC-TTGGGT 120 ·1 1 j CGACAACGAA GAAGACATCG ATGTTATCC? GAAAAAGTCT ACCATTCTGA ACTTGSACA? 180 :1i.: CAACAACGAT ATTATCTCCC- ACATCTCTGG TTTCAACTCC TCTGTTATCA CATATCCAGA 240 • · ·
*·1 1 TGCTCAATTG C-TGCCGC-GCA TCAACGGCAÄ A.GCTATCCAC CTGGTTAACA ACGAATCTTC 30C
TGAAC-TTÄTC GTGCACÄAGG CCATGGACA? CGAATACAAC GACATC-TTCA ACAACTTCAC 360 • » • · · ***** CGTTAGCTTC TGC-C7GCGCG TTCCGAAAGT TTETC-CTTCC CACCTGGAAC AGTACGGCAC 420 ··· • ♦ • · ··· ··♦ • · · · · ·· • ♦ • · ··♦ *· ♦ • · · • · • · · • · ♦ • ·· • # 26 119476 TAACGAGTAC TCCATCATCÄ OCT CT AT SAA GAAACACTCC CTG7CCATCC- CCTCTGGTTG 480 GTC7GTTTCC CTSAAGvGTA ACAACCTGAT CTGGACTCTG AAAGACTCCS CGGGCGAAGT 540 TCGTCAC-ATC ACTTTCCGCG ACCTGCCSGA CAAGTTCAAC GCGTACCTGC- CTAACAAATG 600 GSTTTTCATC XCTATCACTA ACGATCGTCT GTCTTCTGCT AACCTGTACA TCAACGGCGT 660 TCTGATG3GC TCCSC7GAAA TCACTGGTCT GGGCGCTATC CGTGAGGACA ACAACATCAC 720
TCT7AAC-CTG GACCGTTGCA AC4ACAACAA CCAGTACGTA TCCATCGACA AGTTCCGTAT 7 BO
CTTCTGCAAA GCACTGÄACC CGAAAGAGAT CGAAAAACTG TATACCAGCT ACCTGTCTAT 840 CACCTTCCTG CGTGACTTCT GGGGTAACCC GCTGCGTTAC GACACCGAAT ATTACCTGA? 900 CCCGGTAGCT TCTAGCTCTA AASACGTTCA GCTGAAAAAC ATCACTGACT ACATGTACCT 960 GÄCC5ACC-CG CCC-7CCTACA CTAACGGTAA ACTGAACATC TACTACCGAC G7CTGTACAA 1020
CGGCCTGÄAA TTCATCATCA AACGCTAXAC TCCGAACAAC C-AAATCGATT CTTTCGTTAA 10BO
ATC7GGTGAC TTCA7CAAAC TGTACGTTTC TTACÄACAAC AACGAAC&CA TCGTTGGTTA Π40 CCCGAAAGAC GGTAACGCTT TCAACAACCT GGACAGAATT CTGCGTGTTG GTTACAACGC 1200 TCCGGGTATC CCSCTGTACA AAAAJLATGGA AGCTGTTÄAA CTGCGTGACC TGAAAACCTA 1260 CTC7GTTCAG C7GAAAC7GT ACGACC-ACAA AAACC-CTTCT CTGGC-TCTGG TTGGTACCCA 1320 C.-ACC-GTCAG ÄTCGC-TÄACG ACCCGAACCE TGACATCCTG ATCGCTTCTA ACTGGTACTT 1360 QACCACCTG AAAGACAAAA TCCTGGGTTG CGACTGGTÄC TTCGTTCCGA CCGATGAAGG 1440 TTGGACCAAC GACGGGCCSG GGCCCTCTAG AGGÄ.TCCGAT A.TCAAGCTTA CTAGTTÄATG 1500 ATCCGCTAGC CCGCCTAATG ÄGCGGGCTTT TTTTTCTCGG GCAGCGTTGG GTCCTGGCCA 1560 • · · *·ί·1 CC-GGTGCGCA TGATCGTECT CCTGTCGTTG AG5ACCCGGC TAGGCTGGCG GGGTTGCCTT 162c * 1 ACTGC-TTAGC ASAATGÄÄTC ACCGATACGC GAGCGAACGT GAAGCGACTG CTGCTGCAAA 1680 ··· ACGTCTGCGA CCTGAGCAAC AACATGAATG GTCTTCGGTT TCCGTGTTTC G7AAAGTCTG 1740 ·· · Ϊ V C-AAACGCGGA AGTCAGCGCT CT7CCGCTTC CTCGCTCACT C-ACTCGCTGC GCTCGGTC3? JBQ0 TCGC-CTGCGG CGAGCGGTÄT CAGCTCACTC AAAGGCGC-TA ATACGGTTAT CCACAGAATC 1360 «·· * AGGGGA7AAC GCAGSAAAGA ACA7GTGAC-C AAAAGGCCAG CAAAAC-GCCA GGAACCGTAA 1320 AAAGGCCSCS T73C7KCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAC-C ATCACAÄAÄA 1980 • · • · · • · · t · ··· • 1 * « • · · • • · t • I t • · · ··· · • · «·· t • · · * · · • · • « · • · · • «· • 1 27 119476
TCGACGCTCA «S7CAGAGG7 GGCGAAACCC GACAGGAC7A TAAASAtACC AGSCGTTTCC 204C
CCCTGC-AAGC TCCGTCGiGG GC2CTCC7GT 7CGGACGC75 CCGCT7ACCS G.-.tACCTGTC 2-00 CGCCT7TC7C CGT7CGGGAA GCGTGGCGCT tTCTCAATGC TCACGCTC-TA GC-7ATCTCAG 2150 TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTG5G CTC-rGGGCAC C-AACCCCCCC- T7CAGCCCSA 2220 CCGCTGuGCC TTATCCGGTA ACTATCG7CT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTP.TC Z230 GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC 2340 AGASTTCTTG ÄAGTGGrGGC CTAACTACGG C7ACAC7AGA AGGAGAGTA7 TiGGTATCTG 2400 CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CC7TCGGAAA AAGÄG7TGGT ÄGCTCTTGA? CCGGCAAACA 2460 AACCACCGCT C-GTAGCGSTG GTTT7TTTGT T7GCAAGCÄG CAGAT7ACGC GCAC-AAAAAA 2520 AGGATCTCAA GAAGA7CC77 TGATCTTTTC 7ACGGGG7CT GACGCTCAGt GC-AACGSAAA 2380 C7CACG7TAA C-GC-ATTTTC-G TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATC77CACC7 AC-AGCCTTTT 2640 AAATTAfiASA 7GAAC-7T77A AATCAATCTA AAG7ATATAT GAGTAAAC7? GSTC7GACAG 2700 T7ACCAATGC TTAATCAGTC- AGGCACCTA7 CTCAC-CGA7C TG7CTA7TTC GTTGATCCA? 2760
AGTTGCCTGA CTCCCCGTCÖ TG7AGATÄAC 7ACGA7ACGG GäGGGCTTAC CA7G7GGCCC 232D
CAGTC-CTGCA A7GATACCGC GAGÄCCCACG C7CACCG5CT CCAGATT7AT CAGCAA7AAA 2030 CCASGCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG TGGTCGTGCA ACT7TATCCG CC7CGA7CCA 2340 GTCTAaTAAT TGTTGGCGGG AAGCTAGAGT AAG7AGTTCG CCAGTTÄÄTA GTTTGCGCAA 3000 CGTTGTTGCC ATTGCTGGÄG GCATCGTGST GTCACGCTCG TCGTTTGGTA TGGCTTCATT 3060 , CAC-CTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAG? TACATGATGC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC 3120 • GGJ’iAGCTCC T7CGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT 3180 • · ··· CATGGTTATG GCAGCACTGC ATAATTCTCT TACTGTCA7G CCATCCGTAA GATGCTTTTC 3240 • * « · *."! TGTC-ÄCTGGT GAGnCTCAA CCAAGTCATT CTGAGAAKfi TG7ATGCGGC GACGGAGTTG 3300 * · · • · C7C7TGCCCG GCGTCAACAC G3GATAATÄC CGCGCCACAT AGCAGÄACTT 7AAAAGTGG7 3360 • · · * · * CATCATTjGA AAACGtTCTT CGGGGCGAAA ACTCTGAAGC- A7C77ACCGC TGT7GAGA7C 3420 • · • · · * CAG77CGATG TAACCCACTC G7GCACCCAA C7GA77T7CA GCA7C77T7A CTT7CACSAG 3430 . . CGTT7CTGGG TZAGCAAAAA CA-SGAAGGCA AAATGCCGCA AAAAAGGG.-A 7AAGGGCGÄC 3540 • · · • · · • · ··· • ♦ • · ··· 9*9 • · ♦ • t » ··* m m 9 Φ 99* 9 9* 9 9 * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9* • · 28 119476 ACGSAAATG7 TC-aATACTCÄ TACTCTTCCT TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTÄTCAGGG 3600 TTATT5TCTC ATC-AGCGGAT ACATATITGA ACGTATITAG AAAAA.TAAAC AAATAGSGG? 3660 TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAC-TGCCACC TGACGTCTÄA GAAACCATTA TTATCATGAC 3720 ATTAACCTAT AAAAATAG5C GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTTCAAGAA 2769 (2) IH?0HMATI0N FOR SEQ 10 KO: 5: (i) SEQUENCE CHÄKACTEHiSTics: (A) LENGTH: 1756 base pairs f3) TYPE: nucleic acid fCj STRANDEDtfESS: double (0) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: ONA (ganontic) (iii) EYPCTHETICAL: HO (lii) ANTI-SENSE: ND M FRAGMENT TYPE: inrsnul (lx) FEATURE: (A) NAME/KEY: hir.ge region [3] LOCATION: 923,.934 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6: • · · *·ί·1 GGGCGAAGT7 CC-TCAGATCA CTTTCCGCGA CCTGCCGGAC ÄAGTTCAACG CGTACCTGSC 60 * ’ TAACAAATGG GTTTTCATCA CTATCACTAA CGATCGTCTG TCTTCTGCTA ACCTGTACAT 120 *·· • · *···' CAACC-GCGTT CTGATGGGCT CCGCTGAAAT CACTGGTCTG GGCGCTATCC GTGAGGÄCAA 100 ·· i ί CAÄCATC3C7 CTTAAGCTC-S ACCGTTGCAA CAACÄACAAC CAGTACGTAT CCATCGACAA 240 *·ϊ·1 GTTCCGTATC TTCTGCAAAG CACTGAACCC GAAÄGAGATC GAÄAAACTGT ATACCAGCTA 300 • · · • · · V 1 CCTC-TCTATC ACCTTCCTSC GTGACTTCTG GGGTAACCCG CTGCGTTACG ACACCGAATA 360 TTACCTGATC CGGGTAGCT? tTAGCTCTAA AOACGTTCAG CTGAAAAACA TCACTGACTA 420 * « « · *·1·1 CATGTACC7G ACCAACGCGC CG7CC7ACAC TAACGGTAAÄ CTGAACATCT ACTACCGACG 4B0 » ft · • ft • ft ··· ··· • · · • ft ft ft ft ft ft ft • ft ··· * ·« · • 1 · • ft • ft · • 1 ft • ·· • ft 1 1 9476 29 i i.iu_ A'^iw.C Gvjsci-i vsäaj^A . LAu-λ; u,---. wrw,λ<—- ui V. u «n1-cλτ-λ·.v rJLVTCcAcT- 54Ö
TTTCG7TAAA TC7GG7GACT TCATCAAAC7 G7ACG77TCT TACAACAACA. ACCAACACA7 SCO
CGT7GG7TAC CCGAAAGACS GTAACSCTt CAÄCÄACCTG GACAGAATTC TGCG7C-77GG 650 7TACAACGCT CCGGGTATCC CGCTG7ACAA AAAAATSGÄA 'GCTGTTAÄÄC TGCG7GACCT 720
GÄÄAACCTAC TCTGTTCAGC T&AAACTG7Ä CGACGACAAA JsACGCTTCTG 7GGG7CTGG7 7BO
TGGTACCCAC AACGG7CAGA TCGGTAACGA CCCGAACCGT C-ACATCC7CA TC5C7TCTAA 840 CTGSTACTTC AACCACC7GÄ AAGA.CAAA.4T CCTGGGTTGC C-ACTGGTACT TCG7TCCC-AC 900 CGATGAAGGT TC-GACCA4CG ACGGGCCGGG GCCCTCTAC-A GGATCCGATA TCAAGCTTAC 960 TAC-TTAÄTGA TC7C-CTÄGCC CGCCTAATGA GCGGGCTTT7 TTTTCTCGGG CAGCGTTGGG 1020 TCCTGGCCAC GGC-7GCGC-.7 GATCGTGCTC CTGTCGTTCA GGACCCGSC7 AGC-CTG5CGG 1080 GSTTGCCTTA C7GGT7AGCA GAATGAATCA CCGA7ACGCG AGCGAACC-TG AAGCGACTC-C 1140 TGCTGCArAA CG7CTGCGAC CTGAGCAACA ACATG&AiSG TCTTCGGTT? C7G7GTT7CG 1200 TAAAG7CTGG AAACGCGGAA G7CAGCGCTC TTCCGCTTCC TCGC7CACTG ACTCGC7SCG 1260 CTCGGTCG77 CGÖC7GCGC-C GAC-CGGTATC AC-CTCACTCA AAGGCGGTAA TACGGTTATG 1320 CÄCAGAATCA C-GGC-ATAACg CAGGAAAGAA CVTC-TGASCA ÄAAGGCCAGC AAAAGGCCVS .1380 GAACCGTAAA AAGGCCGCG? TGCTGGCGT7 TTTCCATAGG C7CCGCCCC7 CTGACGAGCA 1440 TCACAAAAAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTC- GCGAAACCCG ACAGGACTAT AAÄGÄTACCA 1500 C-GCGTTTCCC CC7GGAAGCT CCCTCGTGC5 CTCTCCTGTT CCGACCCTC-G CGCTTACCGG 1560 ATACCTGTCC GCCTTTCTCG CTTCGG5AAG CS7GSCGCT7 TCTCAA7GCT CACGCTGTAG 1620 "2Σ GTA.TCTCAGT TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC TG7GTGCACG AACCCCCCGT 1630 ·Φ· TCAGCCCGAC CGC7GCGCC? TATCCGGTAA C7ATCGTCT7 GSGTCCAACC CGGTAAGACA 1740 ·· · : 1,· CGACTTÄTCG CCACTGGCAG CAGCCA 1766 ·.·.· f 2) IhTQRMATICK FÖR SEQ ID KO: 7: ··· v ’ 1-1 SEvO-.VCE CrlAPACTSHZSTlCS: (A{ LiNC-TH: 1736 bass asirs • · • · · _ *.·.· Is, TY?H: r.u:iSi= acii ·#· • 9 • « ··· ··· • · « • · · ··· • 1 • · »·· ·· · • · · * · • · • · « • ·« 2 • · 30 119476 (DJ TOPOLOGYi linear (iij J!CL£C'JL£ ΓΥ?ΐ; OH A (canomic) (v) fäAG-EMT TYPE: inrernai (>:i) SEQUENCE DESCRIPTION: S EC ID HO: 7: GSCGGCCTAC GCGATTGACG GCACGSCGGC GGGCSCCATG TACGSCAAGG ACATCACCCT 60 GGTGTCCAGC GATTCAGGCC TG3SCGTGCG CCAC-CTCGGC AGCCTGTCCT CGCCATCGGC 120 CATCACCGTC- TCGTCGCAGG GCGAAATCC-C GCTGGGCGAC GCCACGGTCC AGCGCGGCCC 180 GCTCAGCCTC AAGGGCGCGG GGSTCGTGTC GGCCGGCAAA CTEGCCTCCG GGGGGSGC-GC 240 GGTC-AACGTC C-CGGGCC-GCG GGGCGGTGAA GATCGCGTCG GCCÄGCAGCG TTGGAAACCT 300 CGCGGTGCAA GGCGGCGGCA AGGTACAGGC CÄCGCTGTTG AATGCCGGGS GGACSTTGC? 360 GGTGTCGGC-C CGCCAGC-CCG 7CCÄGCTTGG CGCGGCGäGC AGCCGTCAGG CGCTGTCCGT 420 GAACGCGGGC C-C-CGCCCTCA AGGCGGACAA GCTGTCGGCG ACGCGACGGG TCSACGTC-GA 480
TGGCAAGCAE C-CCGTCGCGC TGGGGTCGGC CAGCAGCÄAT GCGCTGTCGG TGCGTGCCGG 54 C
CGGCGCCCTC AAC-GCGGGCA AGCTGTCGGC GACGGGGCGA CIGGACGTGG ACGGCAAGCA 600 GGCCGTCACC- CTGGGTTCGG 7TGCGAGCGA CGGTGCGCTC- TCG57AAGCG CTGGCGGAAA 660 CCTSCGGGCG AACGAATTGG TCTCCAC-TGC COACT7GTS GTGCGTGGGC &GCG5SAGG7 720 CC-CGCTGGAT GACGCTTCGA GCGCACC-CGC- CATGACCGTG GTTGCCGCAG GAGCGCIGSC 780 G5CCCGCUC CTGCAGTCCÄ AGGGCGCCÄ.7 CGGCGTACÄG GGTGGAGAGG CG3TCAGCG? 840 GGCCAACGCG AACÄGCGÄCG CGGAATTGCG CGTGCGCGGG CGCGGCCAGS TGGATCTGCA 900 CGÄCCTGÄGC GCAGCGCGCG GCGCGGATAT CTCCGGCGAG GGGCGCGTCA ATATCGSCC5 960 ***: TGCGCGCAGC GATAGCGATG TGAAGGTCTC CGGGCACGGC GCCTTGTCGA TCGATAGCAT 1020
• M
GACGGCCCTC G2TGCGATCG GCGTCCAG5C AGGCGGCAGC GTGTCGGCCA AGGATA7GCG 1080 • Φ · : 1.: CAGCCGTGGC GCCGTCACCG TCAC-CGGCGG CGC-CGCCGTC AACCTGGC-CG ATGTCCAG7C 1140 i.:.: C-C-ATGGGCAG GTCCGCGCCA CCAGCGCGGG CGCCA.TGA.CG GTGCGAGACG TCGCGC-CTGC 1200 • · « 5.1 5 CGCCGACCT7 C-CGCTGCAGG CGGGCGACGC GTTGCAGGCC GSSTTCCTC-A ÄATC55CCSG 1250 TGCCATC-ACC GTGAACGGGC GCSATGCCGT GCC-AC7GGAT GGCGCGC-.CG CGGGCGC-GCA 1320 • · • 1 · • 1 · • · # · · • · • · »I· ··« • ♦ · • · · M1 • · • · ··· ·1 · ♦ · · • · • · t * · • ·« • · 31 119476 ATTSCGSS7T 7CCAGCGACG GGCAGGCTC-C G77GGGCAGT CTCGCGGCCA AGSSCGAGCT 1380 GACGSTATCG C-CCGCC-CGCG CGGCGACCGT GC-CCGAGTTG AAGTCGCTG5 ACAACATCTC 1440 CG7SACGGGC C-GCGAACGCG TGTCGGTTCA GÄGCGTCAAC AGCGCS7CCA GGGTCGCCAT 1500 TTCGGCGCAC GGCGCGCTGG ATGTAGGCAA GGTTTCCGCC AAGAGCGGTA TCGGGCTCGA 1560 AGGCTGGGGC GCGGTCGGS.G CGGAC7CCCT CGGTTCCGAC GGCSCGATCA GCGTGTCCGG 1620 GCGCGATGCG GTCAGGGTCG A2C4AGCCCG CAGTCTTGCC GACATTTCGC TGGGGGCGGA 1680 AGGCC-GCGCC ACGCTGGGCG CGGTGGAGGC CGCCGGTTCG ATCGACGTGC GCGGCG 1735 • · 1 » · · • · · • · M» « · • · ·»· ·· t • · « • · • · • « · • · · «·· • · · • · · • 1 · • · I « · • · 1 • · • · · • · » « ··· • · · • · a a 1 · • ··· • · * · • · · • · · • · « · · • 1 · • 1· • ·
Claims (11)
1 1 9476 32
1. Rokotekoostumus, joka käsittää heikennetyn bakteerin, joka sisältää DNA-rakenteen, joka käsittää htrA- 5 promoottorisekvenssin toiminnallisesti liitettynä DNA-sek-venssiin, joka koodittaa yhtä tai useampaa heterologista proteiinia, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokotekoostumus, jossa htrA-promoottorisekvenssi on toiminnallisesti liitet- 10 ty DNA-sekvenssi in, joka koodittaa kahden tai useamman proteiinin fuusioproteiinia.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen rokotekoostumus, jossa fuusion muodostavat proteiinit on liitetty yhteen joustavalla sarana-alueella.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen rokotekoostumus, jolloin sarana-alue on neljän tai useamman aminohapon ketju, jolla on sekvenssi - [ X ] p-Pr o - [ Y ] q-Pr o - [ Z ] r- 20 , jossa Pro on proliini, X ja Y ovat kumpikin glysiini tai • « · .il;, aminohappo, jolla on ei-kookas sivuketju, Z on mikä tahansa • · ... aminohappo, p on positiivinen kokonaisluku, q on positiivi- * » ]”·* nen kokonaisluku, joka on 1 - 10 ja r on 0 tai positiivinen • · · • ·* 25 kokonaisluku, joka on suurempi kuin 0.
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 2, 3 ja 4 mu-·.· 1 kainen rokotekoostumus, jolloin htrA-promoottori on toimin nallisesti liitetty DNA-sekvenssiin, joka koodittaa ensim- :Υϊ mäistä ja toista heterologista proteiinia, jolloin ensim- • * ·***; 30 mainen heterologinen proteiini on antigeeninen sekvenssi, ··· joka käsittää tetanustoksiinin C-fragmentin tai sen yhden SIS tai useamman epitoopin. • · *···* 6. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen 9 :*·*: mukainen rokotekoostumus, joka on sopeutettu suun kautta • · ·*·.· 35 tai nenän kautta tapahtuvaa antoa varten. • · 33 119476
7. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen rokotekoostumus, jossa heikennetty bakteeri heikentyy sen nojalla, että sillä on ei-revertoituva mutaatio geenissä, joka on sen bakteerin aromaattisten aminohappojen 5 biosynteettisellä reitillä.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen rokotekoostumus, jolloin mainitulla heikennetyllä bakteerilla on lisäksi ei-revertoituva mutaatio htrA-geenissä.
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen rokotekoos-10 humus·, jossa heikennetty bakteeri sisältää ei ~ revert oi tuvan mutaation kummassakin kahdessa erillisessä geenissä, jotka ovat sen aromaattisten aminohappojen biosynteettisellä reitillä.
10. Patenttivaatimuksen 7, 8 tai 9 mukainen rokote- 15 koostumus, jolloin mainittu geeni tai kumpikin mainituista geeneistä aromaattisten aminohappojen biosynteettisellä reitillä valitaan aroA:sta, aroC:stä, aroD;stä ja aroE:stä.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen rokotekoostunnus, jolloin mainitut kaksi erillistä geeniä ovat aroA ja aroD, • · 1 « · · ··· • · • · · • · • 1 ··· ·· · • · · • · • ♦ • · · • · · ·♦· ··# • · · • · · • Λ * V 1 • ♦ · • · ··· « « ♦ ··· * · « • · · • · · m m • « • · · #♦ ♦ # · 1 • · • · · • i t • ·· • · 34 119476
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9401795 | 1994-01-31 | ||
| GB9401795A GB9401795D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Vaccines |
| PCT/GB1995/000196 WO1995020665A1 (en) | 1994-01-31 | 1995-01-31 | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters |
| GB9500196 | 1995-01-31 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI963016A0 FI963016A0 (fi) | 1996-07-30 |
| FI963016A FI963016A (fi) | 1996-09-25 |
| FI119476B true FI119476B (fi) | 2008-11-28 |
Family
ID=10749598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI963016A FI119476B (fi) | 1994-01-31 | 1996-07-30 | Heterologisten proteiinien ilmentäminen heikennetyissä bakteereissa käyttämällä htrA-promoottoreita |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0742829B1 (fi) |
| JP (1) | JP3731004B2 (fi) |
| KR (1) | KR100392916B1 (fi) |
| AT (1) | ATE254178T1 (fi) |
| AU (1) | AU701384B2 (fi) |
| BR (1) | BR9506666A (fi) |
| CA (1) | CA2182315C (fi) |
| CZ (1) | CZ285867B6 (fi) |
| DE (1) | DE69532109T2 (fi) |
| DK (1) | DK0742829T3 (fi) |
| ES (1) | ES2210283T3 (fi) |
| FI (1) | FI119476B (fi) |
| GB (1) | GB9401795D0 (fi) |
| HU (1) | HU222982B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ278930A (fi) |
| PL (1) | PL180091B1 (fi) |
| PT (1) | PT742829E (fi) |
| SK (1) | SK99696A3 (fi) |
| WO (1) | WO1995020665A1 (fi) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9720033D0 (en) * | 1997-09-19 | 1997-11-19 | Medeva Plc | Hepatitis B virus polypeptides |
| US20020168771A1 (en) * | 2001-05-08 | 2002-11-14 | Gamerman Gary Eric | Vectors having replication, immunogenicity and/or pathogenicity under stress promoter regulation and use thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68917126T2 (de) * | 1988-02-01 | 1995-02-02 | Praxis Biolog Inc | T-zellen-epitope als träger für einen konjugierten impfstoff. |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
| GB9007194D0 (en) * | 1990-03-30 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Live vaccines |
| CZ285118B6 (cs) * | 1991-03-05 | 1999-05-12 | The Wellcome Foundation Limited | Exprese rekombinačních proteinů v oslabených bakteriích |
| AU4719393A (en) * | 1992-07-31 | 1994-03-03 | Medeva Holdings B.V. | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
-
1994
- 1994-01-31 GB GB9401795A patent/GB9401795D0/en active Pending
-
1995
- 1995-01-31 EP EP95907080A patent/EP0742829B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 AU AU15415/95A patent/AU701384B2/en not_active Ceased
- 1995-01-31 DE DE69532109T patent/DE69532109T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 WO PCT/GB1995/000196 patent/WO1995020665A1/en active IP Right Grant
- 1995-01-31 BR BR9506666A patent/BR9506666A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-01-31 AT AT95907080T patent/ATE254178T1/de active
- 1995-01-31 PT PT95907080T patent/PT742829E/pt unknown
- 1995-01-31 CA CA002182315A patent/CA2182315C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 SK SK996-96A patent/SK99696A3/sk unknown
- 1995-01-31 HU HU9602084A patent/HU222982B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-01-31 KR KR1019960704245A patent/KR100392916B1/ko active IP Right Grant
- 1995-01-31 DK DK95907080T patent/DK0742829T3/da active
- 1995-01-31 ES ES95907080T patent/ES2210283T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 JP JP51995795A patent/JP3731004B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 CZ CZ962182A patent/CZ285867B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-01-31 NZ NZ278930A patent/NZ278930A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-01-31 PL PL95315670A patent/PL180091B1/pl unknown
-
1996
- 1996-07-30 FI FI963016A patent/FI119476B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100392916B1 (ko) | 2003-10-22 |
| PT742829E (pt) | 2004-04-30 |
| JPH09508276A (ja) | 1997-08-26 |
| BR9506666A (pt) | 1997-09-09 |
| CZ218296A3 (en) | 1996-10-16 |
| AU701384B2 (en) | 1999-01-28 |
| EP0742829B1 (en) | 2003-11-12 |
| GB9401795D0 (en) | 1994-03-23 |
| FI963016A0 (fi) | 1996-07-30 |
| JP3731004B2 (ja) | 2006-01-05 |
| HU222982B1 (hu) | 2004-01-28 |
| AU1541595A (en) | 1995-08-15 |
| KR970700770A (ko) | 1997-02-12 |
| CA2182315A1 (en) | 1995-08-03 |
| FI963016A (fi) | 1996-09-25 |
| HUT75734A (en) | 1997-05-28 |
| DE69532109D1 (de) | 2003-12-18 |
| WO1995020665A1 (en) | 1995-08-03 |
| PL180091B1 (pl) | 2000-12-29 |
| ATE254178T1 (de) | 2003-11-15 |
| ES2210283T3 (es) | 2004-07-01 |
| SK99696A3 (en) | 1997-01-08 |
| DK0742829T3 (da) | 2004-03-22 |
| CA2182315C (en) | 2005-11-15 |
| PL315670A1 (en) | 1996-11-25 |
| DE69532109T2 (de) | 2004-08-26 |
| EP0742829A1 (en) | 1996-11-20 |
| NZ278930A (en) | 1998-07-28 |
| HU9602084D0 (en) | 1996-09-30 |
| CZ285867B6 (cs) | 1999-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6680182B1 (en) | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria | |
| FI112090B (fi) | Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi | |
| Åvall-Jääskeläinen et al. | Surface display of foreign epitopes on the Lactobacillus brevis S-layer | |
| DK2705144T3 (da) | Polypeptid | |
| NO301844B1 (no) | DNA-molekyl som koder for en polypeptidanalog til S1-underenheten i Bordetella-eksotoksin, og fremgangsmåte for fremstilling av en proteinanalog til S1-underenheten i Bordetella-eksotoksin | |
| KR101408062B1 (ko) | Ｌ-아스파라기나아제 ⅱ 제조를 위한 재조합 숙주 | |
| Langford et al. | Cloning and molecular characterization of Cu, Zn superoxide dismutase from Actinobacillus pleuropneumoniae | |
| FI119476B (fi) | Heterologisten proteiinien ilmentäminen heikennetyissä bakteereissa käyttämällä htrA-promoottoreita | |
| EP0770138B1 (fr) | Vecteurs de criblage et/ou d'expression fonctionnels chez les mycobacteries | |
| CA2268033A1 (en) | Helicobacter pylori live vaccine | |
| CA2228719A1 (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumoniae | |
| US6783764B1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
| EP1518558B1 (en) | Vaccine against infection with Actinobacillus pleuropneumoniae comprising purified ApxIV toxin | |
| MXPA96003097A (es) | Vacunas | |
| WO1995020665A9 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters | |
| AU9170298A (en) | Clostridium toxin, and method for preparing immunogenic compositions | |
| JP2002119285A (ja) | マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を発現する豚丹毒菌および該菌による免疫化方法 | |
| AU2007201975B2 (en) | Clostridium Toxin and Method for Preparing Immunogenic Compositions | |
| AU2002301780B2 (en) | Clostridium toxin and method for preparing immunogenic compositions | |
| CN1153531A (zh) | 用htra启动子在减毒细菌中表达异源蛋白 | |
| Rehman | Analysis of the transfer region of the Streptomyces plasmid SCP2 | |
| Callison | Characterization and expression analysis of the Bartonella bacilliformis groES-EL operon | |
| MXPA98002798A (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumon | |
| JPH0915244A (ja) | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及びその試薬、並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 119476 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |